WO2011125425A1 - 再生歯ユニットの製造方法 - Google Patents

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WO2011125425A1
WO2011125425A1 PCT/JP2011/056007 JP2011056007W WO2011125425A1 WO 2011125425 A1 WO2011125425 A1 WO 2011125425A1 JP 2011056007 W JP2011056007 W JP 2011056007W WO 2011125425 A1 WO2011125425 A1 WO 2011125425A1
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regenerated
regenerated tooth
spacer
germ
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孝 辻
一久 中尾
正充 大島
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株式会社オーガンテクノロジーズ
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Definitions

  • the present invention relates to a method for manufacturing a regenerative tooth unit whose size and shape can be controlled.
  • a tooth is an organ having a hard tissue of enamel in the outermost layer and dentin in the inner layer, and further having odontoblasts producing dentin inside and a pulp in the center. Teeth may be lost due to dental caries or periodontal disease, but the presence or absence of teeth greatly affects the appearance and taste of food, and interest in tooth regeneration technology is maintained to maintain health and maintain a high quality of life. Is growing. Teeth are functional units formed by the induction of developmental processes in the fetal period and constructed by multiple cell types.
  • teeth are not generated by a stem cell system in which cell types are generated from stem cells such as hematopoietic stem cells and mesenchymal stem cells in adults, but only by stem cell transfer currently being promoted by regenerative medicine (stem cell transfer) Teeth cannot regenerate teeth. To identify tooth regeneration by identifying genes that are specifically expressed during the development of teeth and artificially inducing tooth germs, but only by identifying genes, it completely induces tooth regeneration. It is not possible.
  • the present inventors have used mesenchymal cells and epithelial cells, and at least one of these cells is a tooth germ-derived cell, and inside a support carrier made of collagen gel or the like.
  • the first cell aggregate consisting essentially of mesenchymal cells and the second cell aggregate consisting essentially of epithelial cells are placed in contact with each other to support the first and second cell aggregates It has been found that by culturing inside the carrier, cell differentiation is effectively induced, and a regenerated tooth embryo or a regenerated tooth unit having a specific cell arrangement and direction can be produced (for example, see Patent Document 1). .
  • Teeth vary in size and form depending on the part and individual, so it is important to control the size and form when producing regenerated tooth embryos and regenerated tooth units. In particular, when regenerating a tooth suitable for the site of the lost tooth, the necessary function cannot be exhibited unless a tooth having the same size and shape as the lost tooth is produced.
  • a dental germ cell mixture containing a dental pulp-derived mesenchymal cell that forms a tooth papilla and dentin and an epithelial cell that contributes to enamel formation
  • a biodegradable polymer composed of a glycolic acid-polyacetic acid copolymer or the like is seeded in a solidified scaffold and transplanted into an animal body to form a tooth.
  • an attempt is made to control the shape of the teeth by using a scaffold of a predetermined shape.
  • regenerated teeth are derived from a tooth germ composed of an epithelial cell layer and a mesenchymal cell layer, and the tooth germ grows while undergoing temporal epithelial-mesenchymal interaction that occurs between the epithelial cell layer and the mesenchymal cell layer.
  • the use of the scaffold is not desirable because a sufficient cell-cell interaction cannot be obtained when the scaffold is used (see, for example, Non-Patent Document 1).
  • the rate at which teeth are formed is faster than the time at which the scaffold breaks down, teeth that involve the scaffold may be formed, and the reproducibility of cell placement and tooth shape is not necessarily high. It is expected that.
  • a method in which a regenerated tooth embryo is transplanted into an animal body and cultured is also used.
  • animal cells are affected by various cytokines, and nutrients are also supplied from the surroundings. Therefore, the graft tends to form histologically normal tissues, and teeth and periodontal tissues can be cultured. You can also speed up.
  • transplantation in vivo for example, subrenal transplantation is widely used.
  • the size and form of the regenerated tooth may be limited due to the relationship between the pressure of the coating and the transplantation space.
  • the regenerated tooth germ receives pressure from the side surface, and the occlusal surface of the tooth tends to be crushed.
  • it is difficult to control the extension of teeth in culture in vivo. In particular, if it grows beyond the required length, the regenerated teeth cannot be transplanted directly into the jawbone.
  • the periodontal ligament has a function to connect the root and the alveolar bone, a function to relieve pressure from the tooth, a function to feel chewing, etc., so that the regenerated tooth performs the same function as the original tooth It is an important element.
  • An object of the present invention is to solve the problems associated with the cultivation of regenerated tooth embryos in vivo. Specifically, it is possible to provide a method in which the shape of a tooth is not limited by pressure or space even when the regenerated tooth germ is cultured in vivo, and the extension of the tooth can be controlled. It is an object of the present invention to provide a method for forming a periodontal ligament. It is another object of the present invention to provide a method that enables transplantation of regenerative teeth even when a missing tooth portion is large.
  • the present inventors have arranged the regenerated tooth germ in a spacer when cultivating the regenerated tooth germ in the living body of the animal. It has been found that deformation due to pressure can be prevented and the length of the teeth can be controlled so as not to extend beyond the required length. Further, the present inventors have found that the periodontal ligament develops sufficiently around the root of the tooth by applying mechanical stimulation from the outside of the animal when the regenerated tooth germ is cultured in the body of the animal.
  • the present inventors when cultivating a regenerated tooth germ in an animal's body, arranges a plurality of regenerative tooth germs prepared individually and cultures them, thereby regenerating tooth including a plurality of regenerated tooth germs or regenerated teeth. It has been found that a unit can be obtained and can be directly transplanted to a large tooth defect site without separation or the like.
  • the present invention is a method for producing a regenerated tooth unit for culturing a regenerated tooth germ in a mammal's living body, and includes the following steps: Preparing a spacer; Placing the regenerated tooth germ in the mammal in the spacer; Culturing the regenerated tooth germ in the mammal in vivo; here,
  • the spacer is configured to prevent the regenerative tooth germ from extending beyond the maximum allowable value, and the regenerative tooth germ disposed inside can communicate with the outside of the spacer. It relates to a manufacturing method.
  • the mammal is a non-human mammal.
  • the spacer further has a configuration capable of preventing excessive pressure from being applied to the regenerated tooth germ from a tissue in the mammal. It is characterized by.
  • the step of arranging the regenerated tooth germ in the mammal in the spacer Place the part that will become the future occlusal surface of the regenerated tooth germ so that it faces the inner wall of the spacer, and the part that will become the apex of the future will extend toward a wider space in the direction opposite to the inner wall of the spacer. It is the process arrange
  • the step of arranging the regenerated tooth germ in the living body of the mammal within the spacer is characterized in that the regenerated tooth germ is supported by a support carrier that fills the spacer.
  • the regenerated tooth embryo is substantially composed of a first cell aggregate substantially composed of mesenchymal cells and epithelial cells. The second cell aggregate is placed in contact with the support carrier and cultured and maintained, and at least one of mesenchymal cells and epithelial cells is derived from a tooth germ.
  • the method further comprises a step of applying mechanical stimulation from the outside of the mammal when the regenerated tooth embryo is cultured.
  • the mechanical stimulation is a vibration of about 20000 Hz to about 40000 Hz.
  • the spacer has an internal space that can generate a regenerated tooth unit having a desired regenerated tooth unit size. .
  • the spacer is substantially cylindrical, the height of the cylinder is larger than the thickness of the desired regenerated tooth unit, and the inner diameter of the cylinder is The length of the regenerative tooth unit is approximately the maximum allowable value.
  • the spacer is cylindrical.
  • the regenerated tooth germ includes a plurality of regenerated tooth germs individually prepared.
  • the regenerated tooth germ includes a plurality of regenerated tooth germs individually prepared, and a plurality of regenerated tooth germs individually prepared in the spacer Are arranged adjacent to each other.
  • the regenerated tooth germ includes a plurality of regenerated tooth germs individually prepared, and a plurality of regenerated tooth germs individually prepared in the spacer Are arranged such that the direction of the axis connecting the center of the part to be the future occlusal surface of each regenerative tooth germ and the center of the part to be the future apex is aligned substantially in parallel.
  • the present invention provides a regenerated tooth germ composition for producing a regenerated tooth unit that is placed in a spacer and cultured in a living body of a mammal.
  • the spacer is configured to prevent the regenerated tooth germ from extending beyond the maximum permissible value, and the regenerated tooth germ disposed therein can communicate with the outside of the spacer.
  • the present invention relates to a regenerated tooth germ composition.
  • the regenerated tooth germ includes a plurality of regenerated tooth germs prepared individually.
  • the present invention provides a spacer for producing a regenerated tooth unit by placing a regenerated tooth germ in a living body of a mammal and culturing the regenerated tooth unit.
  • the present invention relates to a spacer characterized in that the regenerated tooth germ can be prevented from extending beyond the maximum allowable value, and the regenerated tooth germ disposed inside can communicate with the outside of the spacer.
  • the regenerated tooth germ disposed inside the spacer includes a plurality of individually regenerated tooth germs.
  • the present invention provides a method for producing a regenerated tooth unit comprising a step of culturing a regenerated tooth embryo in a mammal's living body,
  • the present invention relates to a method for applying mechanical stimulation from the outside of the mammal when culturing the regenerated tooth germ.
  • the mechanical stimulation is a vibration of about 20000 Hz to about 40000 Hz.
  • the regenerated tooth embryo is substantially composed of a first cell aggregate substantially composed of mesenchymal cells and an epithelial cell.
  • the second cell aggregate is closely placed and cultured and maintained in a support carrier, and at least one of mesenchymal cells and epithelial cells is derived from a tooth germ
  • the regenerated tooth germ includes a plurality of regenerated tooth germs individually prepared.
  • the present invention provides a method for repairing a missing tooth in an animal, The present invention relates to a method including the step of transplanting the regenerated tooth unit produced by the method for producing a regenerated tooth unit into the defect.
  • the animal is a non-human mammal.
  • the regenerated tooth unit includes a plurality of teeth whose crown-root directions are aligned substantially in parallel.
  • the present invention relates to a regenerated tooth unit manufactured by the method for manufacturing a regenerated tooth unit.
  • the present invention provides a regeneration manufactured by the above-described method for manufacturing a regenerative tooth unit for transplanting a missing tooth in an oral cavity of an animal to a defective part. Tooth unit.
  • the regenerative tooth unit includes a plurality of teeth whose crown-root directions are aligned substantially in parallel.
  • the regenerative tooth unit includes a plurality of teeth whose crown-root directions are aligned substantially in parallel, and the periodontal tissue is integrally formed.
  • the tooth even when the regenerated tooth embryo is cultured in an animal's living body, the tooth can be grown in a natural shape without receiving excessive pressure from the animal's tissue or the like. It is also possible to prevent the teeth from extending more than necessary. Furthermore, according to the present invention, a regenerated tooth having a sufficient periodontal ligament tissue can be obtained even if the regenerated tooth germ is cultured in an animal body. Furthermore, according to one aspect of the present invention, it is possible to transplant a regenerative tooth unit including a plurality of regenerated teeth at a time without transplanting individual regenerated tooth units one by one to a large bone defect site. it can.
  • the alveolar bone of a plurality of regenerative teeth is integrally formed, the direction of the plurality of regenerative teeth does not vary during or after transplantation, and is firmly supported by the integral alveolar bone. Can be transplanted as a single unit.
  • FIG. 1 is a photograph showing a state in which a regenerated tooth embryo is cultured in vivo in a spacer placed under the kidney capsule of a mouse according to the method for producing a regenerated tooth unit of the present invention.
  • FIG. 2 is a micro CT image of a regenerated tooth unit produced using a spacer.
  • FIG. 3 is a micro CT image of a regenerated tooth unit produced without using a spacer.
  • Fig. 4 shows the CT image of the major axis / minor axis ratio of a regenerated tooth unit (control) made using a spacer, a regenerated tooth unit (uncontrolled) made without a spacer, and a natural tooth crown. ⁇ Show the calculated results.
  • FIG. 1 is a photograph showing a state in which a regenerated tooth embryo is cultured in vivo in a spacer placed under the kidney capsule of a mouse according to the method for producing a regenerated tooth unit of the present invention.
  • FIG. 2 is a micro
  • FIG. 5 shows the results of measuring the length of a regenerative tooth unit (control) produced using a spacer and the regenerative tooth unit (non-control) produced without a spacer on a CT image.
  • FIG. 6 is an HE-stained image of a regenerated tooth unit produced by in vivo culture of a regenerated tooth germ while applying mechanical stimulation, and a regenerated tooth unit produced without applying stimulation.
  • FIG. 7 shows the results of measuring on the CT images the width of the periodontal ligament of a regenerated tooth unit produced by in vivo culture of a regenerated tooth embryo while applying mechanical stimulation and the regenerated tooth unit produced without applying stimulation. is there.
  • FIG. 6 is an HE-stained image of a regenerated tooth unit produced by in vivo culture of a regenerated tooth germ while applying mechanical stimulation, and a regenerated tooth unit produced without applying stimulation.
  • FIG. 8 shows a state where the regenerative tooth unit manufactured by the method of the present invention is transplanted to the jawbone.
  • FIG. 9 shows CT images on the 0th, 14th, and 30th days after the regenerative tooth unit manufactured by the method of the present invention is transplanted into the jawbone.
  • FIG. 10 is an HE-stained image on the 30th day after the regenerative tooth unit manufactured by the method of the present invention is transplanted into the jawbone.
  • FIG. 11 is a plan view and a side view schematically showing a state in which the regenerated tooth germ is arranged in the spacer.
  • FIG. 12 is a schematic view showing a state in which a plurality of regenerated tooth germs are arranged in the spacer.
  • FIG. 13 is an entity photograph in a state where a plurality of regenerated tooth germs are arranged in the spacer.
  • FIG. 14 is an entity photograph of a multi-tooth regenerative tooth unit 60 days after subrenal transplantation.
  • FIG. 15 is a CT image of a multi-tooth regenerative tooth unit 60 days after subrenal transplantation.
  • A shows a CT appearance image
  • the left side is a CT cross-sectional image in the dentition direction
  • (b) right side is a CT cross-sectional image in the buccal tongue direction.
  • FIG. 16 is a CT image on the first day after transplanting a multi-tooth regenerative tooth unit into the oral cavity.
  • a first aspect of the method for producing a tooth according to the present invention is a method for producing a regenerative tooth unit including a step of placing and culturing a regenerative tooth embryo in a living body of a mammal, wherein the spacer comprises: It is configured to prevent excessive pressure from being applied to the regenerated tooth germ from the tissue in the living body of the non-human mammal, and the regenerative tooth germ extends beyond the maximum allowable value, and is disposed inside It is characterized in that the regenerative tooth germ can communicate with the outside of the spacer.
  • communicateable means that a substance such as a nutrient substance or cytokine can pass through the spacer between the inside and the outside of the spacer, that is, has a substance supply path. .
  • teeth refers to a tissue having a dentin layer on the inside and an enamel layer on the outside in a continuous manner, and means a tissue having a directivity having a crown and a root.
  • the directionality of teeth can be specified by the arrangement of crowns and roots.
  • the crown and root can be visually confirmed based on the shape and tissue staining.
  • the crown refers to a portion having a layer structure of enamel and dentin, and there is no enamel layer in the tooth root.
  • Dentin and enamel can be easily identified morphologically by those skilled in the art by tissue staining or the like. Enamel can be identified by the presence of enamel blasts, and the presence of enamel blasts can be confirmed by the presence or absence of amelogenin. On the other hand, dentin can be identified by the presence of odontoblasts, and the presence of odontoblasts can be confirmed by the presence or absence of dentin sialoprotein. Confirmation of amelogenin and dentin sialoprotein can be easily carried out by methods well known in the art, and examples thereof include in situ hybridization and antibody staining.
  • the term “dental embryo” refers to an early embryo of a tooth that has been determined to become a future tooth, from the Bud stage that is commonly used in the developmental stage of the tooth to the bell stage ( (Bell stage) refers to a tissue in which accumulation of dentin and enamel, which is a feature of a dental hard tissue, is not recognized.
  • the term “dental bud” in this specification refers to a tissue after the stage of “dental germ”, and from the stage where accumulation of dentin and enamel, which are characteristic of the hard tissue of the tooth, has started, It refers to the tissue at the stage prior to erupting from and generally expressing the functions of teeth.
  • “regenerated tooth germ” refers to a tooth germ artificially formed by a cell culture technique.
  • the “regenerated tooth unit” refers to a unit composed of teeth and periodontal tissues that support the teeth, obtained as a result of culturing regenerated tooth germs and differentiating various cells contained in the regenerated tooth germs.
  • the tooth portion in the regenerative tooth unit has the above-described structure from the tooth bud to the tooth.
  • the periodontium includes periodontal ligament and alveolar bone. That is, when a regenerated tooth embryo is cultured in a mammal, a regenerated tooth unit is obtained, and a regenerated tooth is obtained by transplanting the regenerated tooth unit into the oral cavity and engrafting it, or erupting and growing it.
  • the spacer is a device arranged to cover the regenerated tooth germ for the purpose of preventing the regenerated tooth germ from extending more than necessary when the regenerated tooth germ is cultured in the living body of a mammal. means.
  • the spacer can play a role of preventing the regenerated tooth germ from receiving an excessive pressure from the pressure of the coating or tissue in the living body.
  • the shape of the spacer may be any shape as long as these objects are achieved.
  • the spacer may have any shape as long as it can secure an internal space in which a regenerated tooth unit having a desired regenerated tooth unit size (mainly length and thickness) can be generated.
  • the length of the regenerated tooth unit refers to the length from the future occlusal surface to the future root apex in the tooth portion of the regenerated tooth unit. When periodontal tissue is formed around the site that will become the apex in the future, this means the distance to the tip (the site farthest from the site that will become the occlusal surface in the future).
  • the substantially maximum allowable value of the length of the regenerated tooth unit means the maximum value permitted as the length of the regenerated tooth unit obtained after culturing the regenerated tooth embryo in the mammal's living body.
  • the approximate maximum permissible value can be appropriately determined by those skilled in the art depending on the target or site where the regenerated tooth germ is subsequently transplanted.
  • the thickness of the regenerative tooth unit generally refers to the thickness of the crown portion of the regenerative tooth unit. If a periodontal tissue is formed around the site that will become the root apex in the future, the periodontal tissue is present. The thickness of a part may be said.
  • the cross-section of the crown is usually not a perfect square or rectangle, but rather is defined by a major and minor axis.
  • the direction of extension of the regenerated tooth germ can be controlled to some extent. Therefore, the direction of the regenerated tooth germ composition itself when placing the regenerated tooth germ composition inside the spacer, The relative position can be arbitrarily adjusted with the intention of the desired direction of extension. Therefore, the three-dimensional size of the spacer can be designed in consideration of the extension direction of the regenerated tooth germ composition so that a desired size can be obtained.
  • the internal space of the spacer should be larger than the desired regenerated tooth unit. In other words, the internal space of the spacer serves to prevent the regenerated tooth unit from extending beyond the maximum allowable value.
  • the shape of the spacer is a cylindrical shape (ring shape) whose top and bottom are open.
  • a nutrient supply path from the outside of the spacer is sufficiently secured through the upper and lower release parts, and a regenerative tooth unit can be formed.
  • the longitudinal direction of the cylinder ie, the height of the cylinder
  • the inner diameter of the ring may be set with the intention of a substantially maximum allowable length of the regenerative tooth unit in order to prevent the regenerative tooth unit from extending more than necessary.
  • the regenerative tooth germ when such a cylindrical spacer is used, when the regenerative tooth germ is arranged so that the radial direction of the ring is the extension direction and the longitudinal direction (height direction) is the width of the crown of the regenerative tooth unit
  • the height of the tube is, for example, 3-15 mm when cultivating human teeth, preferably 5-12 mm, and 0.4-2.0 mm, preferably 0.6 when culturing mouse teeth. -1.8 mm
  • the inner diameter (inner diameter) is 10-30 mm when cultivating human teeth, preferably 15-26 mm, 0.9-2.0 mm when cultivating mouse teeth, Preferably it is set to 1.2-1.9 mm.
  • the future occlusal surface of the regenerated tooth germ is disposed so as to face the inner wall, very close to the inner wall of the spacer, and becomes the future apex.
  • the regenerated tooth germ does not receive excessive pressure from the tissue in the living body, prevents the regenerated tooth germ from extending more than necessary, and can communicate with the outside.
  • the material supply channel can be secured.
  • the occlusal surface of the regenerative tooth germ can grow into a natural shape without being crushed by pressure, and the teeth extend in the diameter direction of the tube, generally before or after reaching the opposite wall
  • the extension can be stopped with a length less than the maximum allowable value.
  • the pressure from the horizontal direction of the cylinder can be avoided by the spacer wall, and the pressure from the vertical direction can be almost avoided by the upper and lower ends of the spacer.
  • the person skilled in the art is not limited to the cylindrical shape, and in order to achieve the desired purpose defined in the present specification, or to achieve other purposes that may be required in some cases, the regenerative tooth unit in vivo.
  • Any desired shaped spacer can be used in the manufacture of
  • the bottom surface may be an ellipse, a polygonal shape, a spherical shape, or the like, but is not limited thereto.
  • the spacer of the present invention has a configuration in which the regenerated tooth germ arranged inside can communicate with the outside of the spacer.
  • Regenerated tooth germs are supplied with nutrients from tissues in the body of mammals and are affected by cytokines produced by animal cells, so these substances reach the regenerated tooth germs in the spacer. This is because it is necessary to secure a supply channel. Since it is possible to communicate with each other, a hole sufficient to supply a substance can be formed regardless of the size and number of spacers. For example, it may have a partly large hole like a cylinder, or may have a lot of small holes like a mesh for the entire spacer. In addition, as long as the material of the spacer is a material that can permeate the substance, the spacer may not have a hole.
  • the mammal is not particularly limited as long as the regenerated tooth germ can be cultured in vivo, but may be a non-human mammal. Examples thereof include cattle, horses, pigs, dogs, cats, and mice, preferably pigs and mice. Moreover, it is especially preferable that it is the same seed
  • the culture period after transplantation varies depending on the size of the teeth at the time of transplantation and the size of the teeth to be generated, but can be generally 3 days to 400 days.
  • the culture period after transplantation varies depending on the size of the teeth at the time of transplantation and the size of the teeth to be generated, but can be generally 3 days to 400 days.
  • it is preferably about 7 to 60 days.
  • the material of the spacer is not particularly limited as long as it has sufficient hardness against pressure from tissue in the living body, such as gold, silver, iron, copper, aluminum, polyethylene, resin, dental resin, Examples include dental cement.
  • the step of placing and cultivating the regenerated tooth germ in the spacer is performed by filling the spacer with a support carrier and placing the regenerated tooth germ in the support carrier.
  • the support carrier is not particularly limited as long as cells can be cultured therein, but for example, a gel, fiber, or solid is preferable. By using such a support carrier, a regenerated tooth is further obtained in vivo. It can prevent excessive pressure on the embryo.
  • Examples of the support carrier used in the present invention include collagen, agarose gel, carboxymethylcellulose, gelatin, agar, hydrogel, cell matrix (trade name), meviol gel (trade name), matrigel (trade name), elastin, fibrin, Examples include laminin, extracellular matrix mixture, polyglycolic acid (PGA), polylactic acid (PLA), and lactic acid / glycolic acid copolymer (PLGA).
  • collagen, agarose gel, carboxymethylcellulose, gelatin, agar, hydrogel, cell matrix, meviol gel, matrigel, extracellular matrix mixture, elastin, fibrin, and laminin having appropriate hardness and holding power are preferable.
  • the support carrier may be liquid and hardened after the regenerated tooth germ is placed.
  • collagen can be gelled by filling the inside of the spacer with a collagen solution, placing a regenerated tooth germ in the collagen solution, and culturing in a CO 2 incubator at 37 ° C. Next, the regenerated tooth germ can be placed in the mammal's living body together with the spacer and cultured.
  • Another aspect of the present invention is a method for producing a tooth including a step of culturing a regenerated tooth germ in a mammal's living body, and when cultivating the regenerated tooth germ, mechanical stimulation is performed from the outside of the mammal. It is characterized by giving. By applying mechanical stimulation, the formation of periodontal ligament in the regenerative tooth unit is promoted.
  • the mechanical stimulus include, but are not limited to, vibration, compression, friction, and the like.
  • vibration having a frequency equivalent to a sound wave for example, about 20000 Hz to 40000 Hz).
  • the regenerated tooth germ may be prepared by any method.
  • the regenerated tooth embryo is substantially composed of a first cell aggregate substantially composed of mesenchymal cells and an epithelial cell. It can be produced by a method comprising a step of arranging two cell aggregates in close contact and a step of culturing the first and second cell aggregates inside a support carrier.
  • a cell aggregate substantially composed of mesenchymal cells is referred to as a first cell aggregate.
  • the substantially constructed cell aggregate can also be referred to as the first cell aggregate, and it does not matter which is called the first cell aggregate.
  • a “mesenchymal cell” means a cell derived from a mesenchymal tissue and a cell obtained by culturing the cell
  • an “epithelial cell” means a cell derived from an epithelial tissue and a cell thereof. It means the resulting cell.
  • periodontal tissue refers to alveolar bone and periodontal ligament formed mainly in the outer layer of the tooth. The alveolar bone and periodontal ligament can be easily identified morphologically by those skilled in the art by tissue staining or the like.
  • the first cell aggregate and the second cell aggregate are substantially composed of only mesenchymal cells or epithelial cells, respectively.
  • “Substantially composed only of mesenchymal cells” means that in the present invention, a certain cell aggregate performs the same function as when composed of only mesenchymal cells, This refers to a state that contains as little as possible cells other than cells that become systemic cells. The same applies to the case of “substantially only epithelial cells”.
  • the cell aggregate refers to a state in which the cells are in close contact, and may be a tissue or a cell aggregate prepared from discrete cells. Using tissue has the advantage that it is easy to obtain teeth with the correct cell arrangement and shape, but the amount available can be limited. Cell aggregates are preferable because they are relatively easy to obtain because cultured cells can also be used. According to the method of the present invention, it is possible to obtain a regenerative tooth having a correct cell arrangement and shape even if a cell aggregate is used.
  • At least one of the mesenchymal cells and epithelial cells constituting the cell aggregate is derived from a tooth germ.
  • the mesenchymal cells and epithelial cells are derived from tooth germ.
  • the tooth germ is preferably one in the saddle stage to the cap stage.
  • mesenchymal cells derived from other than the tooth germ cells derived from other mesenchymal tissues in the living body can also be used.
  • bone marrow cells and mesenchymal cells that do not contain blood cells more preferably oral mesenchymal cells, bone marrow cells in the jawbone, mesenchymal cells derived from head neural crest cells, and these mesenchymal cells
  • mesenchymal progenitor cells and stem cells that can be differentiated into systemic cells.
  • Patent Document 3 An example of using an amnion-derived cell as a mesenchymal cell is described in Patent Document 3, and an example of using a cell in which differentiation of a totipotent stem cell is induced is described in Patent Document 4, the disclosure of which is generally incorporated herein by reference. Incorporated.
  • epithelial cells derived from other than tooth germ cells derived from other epithelial tissues in the living body can also be used.
  • epithelial cells of the skin and oral mucosa and gingiva more preferably immature epithelial progenitor cells that can differentiate into differentiated, eg, keratinized or keratinized epithelial cells, such as skin and mucous membranes,
  • differentiated eg, keratinized or keratinized epithelial cells
  • non-keratinized epithelial cells and stem cells thereof for example, non-keratinized epithelial cells and stem cells thereof.
  • Tooth germs and other tissues include mammalian primates (eg, humans, monkeys, etc.), ungulates (eg, pigs, cows, horses, etc.), small mammalian rodents (eg, mice, rats, rabbits, etc.) In addition, it can be collected from jawbones of various animals such as dogs and cats.
  • the conditions usually used for the collection of tissues may be applied as they are, and they may be taken out in a sterile state and stored in an appropriate preservation solution.
  • Examples of human tooth germs include fetal tooth germs as well as third molars, so-called wisdom tooth germs, but it is preferable to use wisdom tooth germs from the viewpoint of use of autologous tissue. In the case of a mouse, it is preferable to use a tooth germ having a fetal age of 10 to 16 days.
  • Preparation of mesenchymal cells and epithelial cells from tooth germ is performed by first separating tooth germ isolated from surrounding tissue into tooth germ mesenchymal tissue and tooth germ epithelial tissue according to the shape.
  • an enzyme may be used for easy separation. Examples of the enzyme include dispase, collagenase, trypsin and the like.
  • the cell aggregate in the present invention means an aggregate of cells derived from mesenchymal tissue or epithelial tissue, a cell obtained by dispersing mesenchymal tissue or epithelial tissue apart, or the primary or subculture of the cell. It can be prepared by aggregating cells obtained by culture.
  • the culture medium used for the culture is generally a medium used for culturing animal cells, such as Dulbecco. Modified Eagle's medium (DMEM) or the like can be used. Serum for promoting cell growth may be added, or as a substitute for serum, cell growth factors such as FGF, EGF, and PDGF, and known serum components such as transferrin may be added. In addition, although the density
  • the cell suspension may be centrifuged.
  • the cell aggregates of mesenchymal cells and epithelial cells are preferably kept in a high density state so as to ensure cell interaction when they are brought into close contact.
  • the high density state means that the density is equivalent to the density at the time of composing the tissue. For example, 5 ⁇ 10 7 pieces / ml to 1 ⁇ 10 9 pieces / ml, preferably 1 ⁇ 10 8 pieces / ml. 1 ⁇ 10 9 cells / ml, most preferably 2 ⁇ 10 8 cells / ml to 8 ⁇ 10 8 cells / ml.
  • the method for increasing the density of the cell aggregate is not particularly limited, and for example, it can be performed by a method in which cells are aggregated and precipitated by centrifugation. Centrifugation is preferable because it can be easily densified without impairing cell activity. Centrifugation may be performed for 3 to 10 minutes at a rotational speed that applies a centrifugal force of 300 ⁇ g to 1200 ⁇ g, preferably 500 ⁇ g to 1000 ⁇ g. Centrifugation lower than 300 ⁇ g tends to prevent the cell density from becoming sufficiently high, while centrifugation higher than 1200 ⁇ g may damage cells.
  • the cell suspension When preparing high-density cell agglomerates by centrifugation, the cell suspension is usually prepared in a tube or other container used to centrifuge cells, and then centrifuged to obtain a precipitate. The supernatant may be removed as much as possible while leaving the cells. At this time, it is preferable that components other than the target cell (for example, a culture solution, a buffer solution, etc.) are equal to or less than the volume of the cell, and most preferable that the component other than the target cell is not included. If such a high-density cell aggregate is brought into close contact within the support carrier by the method described later, the cells come into close contact with each other, and cell-cell interactions are effectively exhibited.
  • components other than the target cell for example, a culture solution, a buffer solution, etc.
  • the same support carrier as that arranged in the spacer described above can be used. It is preferable that the support used for the purpose of culturing the first and second cell aggregates has a holding force capable of maintaining the adhesion state of the cell aggregates without the cells being dispersed.
  • the close contact state means that the above-described high-density mesenchymal cell and epithelial cell aggregates maintain the same high density near the contact surface between mesenchymal cells and epithelial cells. Means the state.
  • the support carrier capable of maintaining the close contact state is a final concentration of 2 mg / ml to 3 mg / ml, that is, a method according to JIS-K6503-1996 (pressing 4 mm with a 12.7 mm diameter plunger) Use at a concentration that results in a jelly strength of 120 g to 250 g depending on the load required to provide a suitable hardness.
  • Other types of support carriers are also preferably used as the support carrier of the present invention if they have the same strength by the same evaluation method.
  • the method of disposing the first and second cell aggregates in the support carrier is not particularly limited.
  • the cell aggregate is a cell aggregate
  • the precipitate obtained by the above-mentioned centrifugation is collected with a microsyringe or the like. It can be placed in a support carrier.
  • the cell aggregate is a tissue, it can be placed at any position in the support carrier using the tip of a syringe needle or the like.
  • the method for arranging the first and second cell aggregates in close contact with the support carrier is not particularly limited.
  • the other cell aggregate is By arranging so as to press against it, both can be brought into close contact with each other. More specifically, one cell aggregate can be pressed against the other cell aggregate by appropriately changing the position of the tip of the syringe needle in the support carrier.
  • an epithelial tissue or mesenchymal tissue is used as a cell aggregate, the surface of the original tooth germ in contact with the mesenchymal tissue or epithelial tissue is used as the other cell aggregate. It is preferable to arrange so that it contacts. It is also preferable to provide a step of solidifying the support carrier after the placement.
  • a cell can further aggregate and it can be set as a higher density state.
  • a cell can be solidified by allowing it to stand for several minutes to several tens of minutes at the culture temperature. At this time, the smaller the components other than the cells in the cell aggregate, the higher the density state is realized.
  • the culture period varies depending on the number of cells arranged in the support carrier, the state of the cell aggregate, the culture conditions, the animal species, etc., and can be appropriately selected by those skilled in the art.
  • it is preferably cultured for at least one day, and more preferably three days or more.
  • the formation of reconstructed tooth germs can be further promoted, such as the accumulation of dentin and enamel, the formation of crowns, and the formation of roots.
  • the culture may be performed for 6 days or more, 30 days or more, 50 days or more, 100 days or more, or 300 days or more, and the medium and culture conditions may be changed during the culture. it can.
  • the support carrier enclosing the first and second cell aggregates may be cultured alone, or may be cultured in the presence of other animal cells or the like.
  • the culture conditions can be those used for culturing general animal cells.
  • mammal-derived serum may be added to the culture, and various cellular factors known to be effective for the growth and differentiation of these cells may be added. Examples of such cellular factors include FGF and BMP.
  • organ culture generally, a porous membrane is floated on a medium suitable for the growth of animal cells, and a support carrier containing the first and second cell aggregates is placed on the membrane and cultured.
  • the porous membrane used here preferably has a large number of pores of about 0.3 to 5 ⁇ m, and examples thereof include a cell culture insert (trade name) and an isopore filter (trade name). .
  • the regenerated tooth germ is pre-cultured in vitro before the regenerated tooth germ is placed and cultured in the living body of the mammal. Pre-culture can further strengthen the binding between cells and the interaction between cells, and as a result, the overall growth period can be shortened.
  • the tooth obtained by the method according to the present invention has a tooth-specific cell arrangement (structure) of dentin on the inside and enamel on the outside, and preferably the tooth tip (crown) and root are positioned correctly. It also has the directionality it has, and fulfills its function as a tooth sufficiently. Therefore, it can be widely used as a substitute for teeth. It can also be used as a useful research tool for research to elucidate the developmental process of teeth.
  • periodontal tissues such as alveolar bone and periodontal ligament that support and fix the teeth on the jawbone can be formed.
  • the utility of the teeth after transplantation can be further enhanced. It is also possible to use only the periodontal tissue separately.
  • deletion part in the oral cavity which concerns on this invention includes the process of transplanting the regeneration tooth unit manufactured with the manufacturing method of the regeneration tooth unit which concerns on this invention to a defect
  • the maximum tooth length is set. Can be controlled. If the tooth length exceeds the maximum allowable value, the tooth cannot be transplanted as it is, but if it is shorter than the maximum allowable value, it can be grown after transplantation to obtain a regenerated tooth of a desired length. Is possible.
  • a regenerated tooth unit may be transplanted at any stage of tooth development. If the formation of a crown is already recognized, it is preferable to arrange the crown so that it is inside the oral cavity. In the case where the formation of the crown is not recognized, it is preferable to arrange the epithelial cell layer corresponding to the crown or the epithelial cell layer of the regenerated dental embryo so as to be inside the oral cavity. It is also preferable to arrange the regenerated dental embryo so that the open part of the epithelial / mesenchymal cell layer is on the side opposite to the oral cavity. Thereby, the front-end
  • the missing part means a part provided in the gingiva by tooth extraction or the like, and the shape is not particularly limited.
  • the location of the defect and the type of target tooth are not particularly limited.
  • the defect is usually located in the jaw bone, the alveolar bone of the oral cavity, or the like.
  • a known method used clinically for implant implantation such as GTR method (guided tissue regeneration) for the defect site. The method may attempt to promote regeneration of periodontal tissue. After placing the tooth germ or tooth in the hole, it is preferable to perform suturing or the like according to a normal process.
  • the transplant target is the same species as the animal from which the tooth germ used for tooth production is extracted, and the same individual as the individual from which the tooth germ is removed. More preferably. Examples of animals include mammals including humans, cows, horses, pigs, dogs, cats, mice and the like. A non-human mammal is also preferred.
  • a plurality of regenerated tooth germs can be used as regenerated tooth germs.
  • the plurality of regenerated tooth germs are preferably regenerated tooth germs in which each regenerated tooth germ is individually prepared.
  • the individually prepared regenerated tooth germ refers to a regenerated tooth germ prepared so as to form a single tooth in the future.
  • the method for producing the regenerated tooth embryo is as described above.
  • Separately prepared regenerative tooth germs can be separated after producing regenerated tooth germs containing a plurality of tooth germs, as described in Patent Document 1, for example.
  • each cell aggregate can be formed into a substantially columnar shape, In some cases, teeth having a desired length in one direction can be formed by controlling the axial contact length of the column.
  • the regenerated tooth having the desired length is used. Can be produced.
  • the length and the like of the cell aggregate can be adjusted so as to have a desired regenerated tooth size and shape.
  • a regenerated tooth unit including a plurality of regenerated teeth is produced by arranging and culturing the regenerated tooth embryos individually prepared as described above. It is preferable that the regenerative tooth germ is arranged so that the directions of the axes connecting the center of the future occlusal surface and the center of the future root apex are substantially parallel.
  • the direction of the axis that connects the center of the future occlusal surface and the center of the future apex and the direction of the axis that connects the crown and root of the regenerative tooth are generally the same. This direction is sometimes referred to as “crown-root direction”.
  • a regenerative tooth unit including a plurality of teeth aligned in the crown-root direction can be obtained in the same manner as the natural teeth.
  • regeneration tooth germ it is preferable to arrange
  • the dentition When it is desired that the dentition is aligned along the gum curve, it may be arranged on a curved surface along the gum curve instead of on a flat surface.
  • the number of regenerated teeth or regenerated tooth germs is not particularly limited, and can be selected according to the shape / size of the tooth defect site, or the desired number of regenerated teeth, Preferably, 2 to 6, more preferably 2 to 4 can be arranged.
  • a regenerated tooth unit having no or small gaps between teeth in the dentition direction can be obtained.
  • a regenerated tooth unit having a shape in which periodontal tissues are combined and integrated with each other can be obtained as the culture period becomes longer.
  • the regenerated tooth unit in which the periodontal tissue is integrally formed can be transplanted as it is to the tooth defect site without being separated for each regenerated tooth.
  • the regenerative tooth unit including a plurality of regenerative teeth and formed integrally is easier to implant than the case where each individual regenerated tooth unit is transplanted one by one, and the individual teeth are integrated into the periodontal tissue. It can be supported more firmly.
  • a regenerative tooth unit that includes a plurality of regenerative teeth and is integrally formed can be transplanted without worrying that the direction of the dentition is disturbed during or after transplantation, as compared with the case where individual regenerative tooth units are implanted one by one. Can do.
  • the plurality of regenerated tooth germs can be placed in a spacer and cultured as described above.
  • the spacer is the same as described above, and preferably has an appropriate shape according to the number of regenerated tooth germs to be arranged.
  • the total tooth crown width in the dentition direction or the length of periodontal tissue in the dentition direction is obtained. Therefore, when a spacer on the cylinder is used, it is preferable to use a cylinder whose bottom surface is a shape close to an ellipse or a rectangle.
  • Embodiments of the present invention may be described with reference to schematic diagrams, but in the case of schematic diagrams, they may be exaggerated for clarity of explanation.
  • terms such as first, second, etc. are used to represent various elements, it is understood that these elements should not be limited by those terms. These terms are only used to distinguish one element from another, for example, the first element is referred to as the second element, and similarly, the second element is the first element. Can be made without departing from the scope of the present invention.
  • Example 1 In vivo culture of regenerated tooth germ using spacer>
  • a micropipette tip HRI-110NEW, Molecular Bio Products, San Diego, CA, USA
  • HRI-110NEW Molecular Bio Products, San Diego, CA, USA
  • the inside was filled with a collagen solution.
  • the regenerated tooth germ is placed so that the crown side is close to the wall surface of the spacer to promote extension in the root direction, cultured in a 37 ° C CO 2 incubator (Sanyo Electric, Osaka, Japan), and the collagen gel is hardened. It was.
  • a spacer containing regenerated tooth germ was transplanted under the bilateral renal capsule of 7-week-old C57BL / 6 mice. Transplantation under the kidney capsule was performed by making an incision of 2 to 3 mm in the kidney capsule, peeling the kidney capsule and the kidney parenchyma, and inserting a spacer containing a regenerated tooth germ between them.
  • FIG. 2 shows an example of culture using a spacer
  • FIG. 3 shows an example of culture without using a spacer.
  • the regenerated tooth unit cultured using a spacer has a form close to that of a normal tooth, while the regenerated tooth unit cultured without using a spacer has a flat shape with an extremely long major axis with respect to a minor axis.
  • FIG. 4 shows the results of measuring the major axis / minor axis ratio and measuring the major axis / minor axis ratio for each of seven cases of a group cultured with a spacer (control group) and a group cultured without a spacer (non-control group).
  • the major axis / minor axis ratio of the regenerated tooth unit was 1.46 ⁇ 0.16 mm in the group cultured with the spacer (control group: Example), and the group cultured without the spacer (non-control group: comparison) Example) was 2.30 ⁇ 0.35 mm.
  • the maximum diameter at the crown of the lower first, second, and third molars (M1, M2, M3) of an adult mouse is defined as the major axis
  • the maximum diameter orthogonal to the major axis is defined as the minor axis.
  • the results obtained by measuring the ratio of major axis / minor axis are also shown.
  • the regenerated tooth unit on the 30th and 60th day after subrenal transplantation was removed, and the length was measured by micro CT imaging and analysis using integrated image processing software.
  • the length from the cusp of the tooth to the apex was measured without including the alveolar bone region formed on the micro CT image.
  • the results are shown in FIG.
  • Example 2 In vivo culture of regenerated tooth embryos subjected to mechanical stimulation>
  • a sonic electric toothbrush (frequency 31, (000 Hz: Doltz (trademark), Panasonic) was pressed against the back skin of the mouse at a pressure of 3.9 ⁇ 10 4 Pa (5 minutes / day).
  • the control group was not mechanically stimulated, and was extracted after the 30-day transplant period for comparison.
  • the extracted regenerative tooth unit is subjected to micro CT imaging in the same manner as in Example 1, and the width of the periodontal ligament cavity (sometimes simply referred to as “periodontal ligament width”) is obtained using three-dimensional image analysis software. Measured. Specifically, on the three-dimensional image, the distance between the root surface of the regenerated tooth unit and the formed alveolar bone was taken as the width of the periodontal ligament cavity, and 6 points were measured on each of the cross sections of the major axis and minor axis. Thereafter, the regenerated teeth were fixed with 4% paraformaldehyde (PFA), decalcified with 10% ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), and embedded in paraffin.
  • PFA paraformaldehyde
  • EDTA ethylenediaminetetraacetic acid
  • FIG. 1 B is the alveolar bone
  • D is the dentin
  • P is the periodontal ligament
  • the bar next to the letter P in the figure indicates the width of the periodontal ligament.
  • the scale bar at the lower right in the figure indicates 100 ⁇ m.
  • the periodontal ligament of the stimulated group was formed thicker than the unstimulated group, and regular arrangement of cells in the periodontal ligament region was observed.
  • the result of having measured the periodontal ligament width on CT image is shown in FIG.
  • Example 3 Jaw bone transplantation of regenerated tooth unit obtained by in vivo culture>
  • the mandibular first molars of 4 week old C57BL / 6 mice were extracted and a healing period of 3 days was provided. Thereafter, gingival incision and detachment of the same part were performed, and the alveolar bone was cut using a dental micromotor (Viva-Mate Plus, Nakanishi, Tokyo, Japan), and transplanted with a near-centrifuge diameter of 1 mm and a buccal tongue diameter of 0.8 mm A fossa was formed.
  • a dental micromotor Viva-Mate Plus, Nakanishi, Tokyo, Japan
  • Example 1 a regenerated tooth unit that was cultured under a renal capsule with a spacer for 30 days according to Example 1 and mechanically stimulated during the culture according to Example 2 was implanted in the jaw bone graft fossa, and 8- Gingival suture was performed with 0 nylon suture thread (Bearmedic, Chiba, Japan).
  • FIG. 8 shows the formation of the graft fossa and the transplantation of the regenerative tooth unit.
  • the mice transplanted with the regenerative tooth unit were subjected to micro CT imaging on the 0th, 14th, and 30th days of transplantation by the same method as described above, and the binding between the graft and the recipient's alveolar bone was evaluated.
  • FIG. 9 shows a CT image
  • FIG. 10 shows an HE-stained image.
  • FIG. 9 shows a CT image
  • FIG. 10 shows an HE-stained image.
  • the arrow indicates the regenerative tooth unit.
  • the intercisternal septal alveolar bone of the regenerated tooth and the mandibular second molar is fused, and the regenerative tooth unit is connected to the alveolar bone at the transplantation site via bone bonding.
  • the possibility of engrafting was shown. Histological analysis revealed that calcification was observed in a portion of the regenerated dental pulp as an accident due to transplantation (3 of 16 cases), but the periodontal ligament of the regenerated tooth unit was maintained after transplantation, and bone adhesion Was not observed (0 of 16 cases).
  • arrows indicate engraftment by bone bonding
  • scale bars indicate 100 ⁇ m
  • BT indicates regenerated teeth
  • NT indicates natural mandibular second molars.
  • Example 4 Production of a multi-tooth regenerative tooth unit>
  • in vivo transplantation of a plurality of regenerated tooth germs was performed using a spacer in subrenal capsule transplantation.
  • a micropipette tip (HRI-110 New Molecular Bio Products, San Diego, Ca, USA) is cut into a cylindrical shape, and the cross-sectional shape of the cylinder is formed into a rounded square with a major axis of 3 mm, a minor axis of 2 mm, and a height of 1.3 mm. This was used as a spacer and filled with a collagen solution.
  • the height direction of the tube is the thickness direction of the future regenerated tooth
  • the minor axis direction of the rounded square is the tooth extension direction
  • the major axis direction of the rounded square is the tooth row direction.
  • Two regenerative tooth germs were placed in contact with each other. At that time, in order to promote extension in the tooth root direction, the future crown side of the regenerated tooth germ is placed slightly closer to one wall surface corresponding to the long side of the rounded quadrangle of the spacer cross section, and the CO 2 at 37 degrees.
  • the collagen gel was hardened with an incubator (Sanyo Electric, Osaka, Japan). About the state which has arrange
  • FIG. 12 and 13 are views or photographs of the cylindrical spacer viewed from the axial direction of the cylinder.
  • a spacer containing regenerated tooth germ was transplanted under the bilateral renal capsule of 7-week-old C57BL / 6 mice. Transplantation under the kidney capsule was performed by making a 5 mm incision in the kidney capsule, peeling the kidney capsule and kidney parenchyma, and inserting a spacer containing a plurality of regenerated tooth germs between them.
  • the kidney was removed 60 days after transplantation under the renal capsule, a large number of multiple tooth units having a plurality of teeth were obtained.
  • An entity photograph is shown in FIG. 14 about the multi-tooth unit 60 days after the subrenal transplantation.
  • FIG. 15 shows a T appearance image and a CT cross-sectional image of a multi-tooth unit 60 days after transplantation under the renal capsule. From this, as one aspect of the production method of the present invention, a plurality of individual regenerative tooth germs that grow into a single tooth are arranged and cultured in the same direction as the future occlusal surface. Regarding teeth, it was shown that regenerative tooth units can be obtained in which the crown-root direction is aligned in one direction as in the case of natural teeth and a plurality of teeth are arranged in a row so as to form a dentition.
  • a regenerative tooth unit produced by arranging a large number of regenerated tooth germs has a plurality of teeth having a normal tissue structure, and the root portion thereof is It was shown that the alveolar bone was integrally formed to cover.
  • Example 5 Transplantation of a multi-tooth unit into an edentulous jaw model>
  • the mandibular first, second, and third molars were extracted from 4-week-old C57BL / 6 mice to create an edentulous jaw model and provided with a 3-day healing period. Thereafter, gingival incision and detachment of the same part were performed, and the alveolar bone was cut using a dental micromotor (Viva-Mate Plus, Nakanishi, Tokyo, Japan), with a near-centrifuge diameter of 3 to 4 mm and a cheek tongue diameter of 1.2 mm. An implant fovea was formed.
  • a dental micromotor Viva-Mate Plus, Nakanishi, Tokyo, Japan
  • the regenerated tooth unit produced under the mouse kidney capsule was embedded in the jawbone fossa and gingival suture was performed with 8-0 nylon suture thread (Bearmedic, Chiba, Japan).
  • Micro CT imaging was performed on an edentulous jaw model mouse transplanted with multiple tooth units.
  • a CT image on the first day after intraoral transplantation of a multi-tooth unit is shown in FIG.
  • the observation of the present example suggested engraftment due to osseous coupling between the multiple tooth unit alveolar bone and the recipient alveolar bone.
  • a regenerative tooth unit including a plurality of teeth matching the shape can be transplanted at once, and transplanted with the periodontal tissue of the transplanted regenerative tooth unit. It was suggested that the solid jawbone is well-bonded. Further, in the CT image on the 50th day after transplantation, bone engraftment was observed between the periodontal tissue of the transplanted regenerative tooth unit and the transplanted solid jawbone.

Abstract

【課題】本発明は、再生歯胚を生体内で培養しても圧力やスペースによって歯の形状が制限されず、且つ、歯の伸長も制御できる方法を提供することを課題とする。また、歯の欠損部位が大型である場合にも再生歯の移植を可能にする方法を提供することを課題とする。【解決手段】本発明は、哺乳動物の生体内で、スペーサー内に再生歯胚を配置して培養する工程を含む再生歯ユニットの製造方法であって、前記スペーサーは、前記哺乳動物の生体内の組織から前記再生歯胚に過剰な圧力がかかることと、前記再生歯胚が最大許容値以上に伸長することとを防止可能な構成であり、且つ、内部に配置された再生歯胚がスペーサー外部と連通可能な構成である、方法を提供する。また、哺乳動物の生体内で、スペーサー内に複数の再生歯胚を配置して培養する工程を含む再生歯ユニットの製造方法を提供する。

Description

再生歯ユニットの製造方法
　本発明は、大きさ及び形状を制御可能な再生歯ユニットの製造方法等に関する。
　歯は、最外層にエナメル質、その内層に象牙質という硬組織を有し、さらにその内側に象牙質を産生する象牙芽細胞、中心部に歯髄を有する器官である。歯は、齲蝕や歯周病によって失われることがあるが、歯の有無は外見や食べ物の味覚に大きく影響し、また健康維持や質の高い生活を維持するため、歯の再生技術への関心が高まっている。
　歯は、胎児期の発生過程の誘導によって形成され、複数の細胞種によって構築された機能単位である。そのため、歯は、成体内の造血幹細胞や間葉系幹細胞のような幹細胞から細胞種が発生する幹細胞システムによって発生するのではなく、現在、再生医療によって進められている幹細胞の移入のみ（幹細胞移入療法）では歯を再生することはできない。歯の発生過程で特異的に発現する遺伝子を同定し、歯胚を人為的に誘導することによる歯の再生も検討されているが、遺伝子を特定しただけでは、歯の再生を完全に誘導することはできない。
　そこで、近年、単離された歯胚由来の組織や細胞を用いて歯胚を再構成し、これを培養して歯と歯周組織からなる再生歯ユニットを得て、当該再生歯ユニットを移植することによって口腔内に再生歯を得る方法が検討されている。
　本発明者らは、これまでに、間葉系細胞と上皮系細胞を用いて、これらの細胞のうちの少なくともいずれか一方を歯胚由来の細胞とし、コラーゲンゲルなどからなる支持担体の内部に、間葉系細胞から実質的になる第１の細胞凝集塊と、上皮系細胞から実質的になる第２の細胞凝集塊を接触させて配置し、第１及び第２の細胞凝集塊を支持担体の内部で培養することによって、細胞の分化が効果的に誘導され、特有の細胞配置と方向性を備えた再生歯胚や再生歯ユニットを作製できることを見出した（例えば、特許文献１参照）。
　また、口腔内上皮細胞やその初代培養細胞を上皮系細胞として利用した場合（例えば、特許文献２参照）、羊膜由来細胞を間葉系細胞として利用した場合（例えば、特許文献３参照）、全能性幹細胞を分化誘導した細胞を間葉系細胞として利用した場合（例えば、特許文献４参照）にも、同様に特有の細胞配置と方向性を備えた再生歯胚や再生歯ユニットが得られることを示した。
　さらに、再生歯胚作製時に、再生歯胚に含まれるエナメル結節の数を調整することにより、形成される再生歯の数を制御できること（例えば、特許文献５参照）を示した。
　歯は部位や個人差によって大きさや形態が異なるので、再生歯胚や再生歯ユニットを作製する際には大きさや形態を制御することが重要である。特に喪失した歯の部位に適合する歯を再生する場合、喪失した歯と同等の大きさ及び形態を有する歯を作製しないと、必要とされる機能が発揮できない。
　所望の大きさや形状を有する再生歯の作製方法としては、歯乳頭や象牙質を形成する歯髄由来の間葉系細胞とエナメル形成に寄与する上皮系細胞とを含む歯胚の細胞混合物を、ポリグリコール酸－ポリ酢酸共重合体等からなる生分解性ポリマーを固化させたスキャフォールドに播種し、動物の体内に移植して歯を形成する方法も提案されている。この方法では、所定の形状のスキャフォールドを使用することによって、歯の形状を制御することが試みられている。しかしながら、再生歯は、上皮細胞層と間葉細胞層からなる歯胚に由来しており、歯胚は上皮細胞層と間葉細胞層間でおこる経時的な上皮・間葉相互作用をしながら成長するところ、スキャフォールドを用いると十分な細胞間相互作用が得られなくなるため、スキャフォールドの使用が望ましくないとの意見もある（例えば、非特許文献１参照）。また、スキャフォールドが分解する時間よりも、歯が形成される速度が速いことから、スキャフォールドを巻き込んだ歯が形成される可能性もあり、細胞配置や歯の形状の再現性が必ずしも高くないことが予想される。
　ところで、再生歯ユニットを作製する際、再生歯胚を動物の生体内に移植して培養する方法も用いられる。生体内で培養すると、動物細胞から各種サイトカイン等の作用を受け、また周囲から栄養も供給されるため、移植片が組織学的に正常な組織を形成しやすく、歯及び歯周組織の培養を早めることもできる。生体内の移植としては、例えば腎皮膜下移植が広く用いられている。
　しかしながら、再生歯胚を、例えば、腎皮膜下等の生体内で培養すると、皮膜の圧力や移植スペースの関係から再生歯の大きさや形態が制限されることがある。具体的には、再生歯胚が側面から圧力を受け、歯の咬合面がつぶれた形状になりやすい。
　また、生体内での培養では、歯の伸長の制御も困難である。特に、必要とする長さ以上に成長してしまうと、そのまま再生歯を顎骨に移植することができない。
　また、再生歯胚を動物の生体内で培養する方法では、機械的な刺激が少ないため、歯根膜の発生と発達が不十分になることが予測される。歯根膜は、歯根と歯槽骨を繋ぐ機能や、歯からの圧力を緩和する機能、噛み応えを感じさせる機能等を有するものであり、再生歯がもとの歯と同等の機能を果たすために重要な要素である。
国際公開第２００６／１２９６７２号パンフレット 特開２００８－２９７５６号公報 特開２００８－２０６５００号公報 特開２００８－２０００３３号公報 特開２００８－２９７５７号公報
Ｈｕ　ｅｔ　ａｌ．　Ｔｉｓｓｕｅ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　Ｖｏｌｕｍｅ　１２，Ｎｕｍｂｅｒ　８，２００６，２０６９－２０７５
　本発明は、再生歯胚の生体内での培養に伴う問題点を解決することを課題とする。具体的には、再生歯胚を生体内で培養しても圧力やスペースによって歯の形状が制限されず、且つ、歯の伸長も制御できる方法を提供すること、また、歯根の周囲に十分な歯根膜が形成される方法を提供することを課題とする。また、歯の欠損部位が大型である場合にも再生歯の移植を可能にする方法を提供することを課題とする。
　本発明者らは、上記課題を解決するために研究を重ねた結果、再生歯胚を動物の生体内で培養する際、スペーサー内に再生歯胚を配置することによって、当該生体の組織からの圧力による変形を防止することができ、また、必要な長さ以上に伸長しないよう歯の長さを制御できることを見出した。
　また、本発明者らは、再生歯胚を動物の生体内で培養する際、当該動物の外部から機械的刺激を与えることにより、歯根の周囲に歯根膜が十分に発達することを見出した。
　さらに、本発明者らは、再生歯胚を動物の生体内で培養する際、個別に調製された複数の再生歯胚を並べて培養することによって、複数の再生歯胚ないし再生歯を含む再生歯ユニットを得ることができ、分離等をせずにそのまま歯の大型欠損部位へ移植できることを見出した。
　即ち、本発明は、哺乳動物の生体内において再生歯胚を培養する再生歯ユニットの製造方法であって、下記工程を含み、
　スペーサーを準備する工程、
　前記再生歯胚を前記スペーサー内において前記哺乳動物の生体内に配置する工程、
　前記再生歯胚を前記哺乳動物の生体内において培養する工程、
　ここで、
　前記スペーサーは、前記再生歯胚が最大許容値以上に伸長することを防止可能な構成であり、且つ、内部に配置された再生歯胚がスペーサー外部と連通可能な構成である、
製造方法に関する。
　ここで、本発明の再生歯ユニットの製造方法の一実施態様においては、前記哺乳動物が、非ヒト哺乳動物であることを特徴とする。
　本発明の再生歯ユニットの製造方法の一実施態様においては、前記スペーサーは、さらに、前記哺乳動物の生体内の組織から前記再生歯胚に過剰な圧力がかかることを防止可能な構成であることを特徴とする。
　本発明の再生歯ユニットの製造方法の一実施態様においては、
　前記再生歯胚を前記スペーサー内において前記哺乳動物の生体内に配置する工程は、
　再生歯胚の将来咬合面になる部位が前記スペーサーの内壁付近に面するように配置し、且つ将来根尖になる部位が前記スペーサーの当該内壁とは反対方向のより広い空間に向けて伸長するように配置する工程であることを特徴とする。
　本発明の再生歯ユニットの製造方法の一実施態様においては、
　前記再生歯胚を前記スペーサー内において前記哺乳動物の生体内に配置する工程は、前記スペーサー内を満たす支持担体によって前記再生歯胚が支持されるように配置されることを特徴とする。
　本発明の再生歯ユニットの製造方法の一実施態様においては、前記再生歯胚は、間葉系細胞で実質的に構成される第１の細胞集合体と、上皮細胞で実質的に構成される第２の細胞集合体を密着させて支持担体内部に配置されて培養・維持されたものであり、間葉系細胞と上皮細胞の少なくともいずれか一方が歯胚由来であることを特徴とする。
　本発明の再生歯ユニットの製造方法の別の一実施態様においては、前記再生歯胚を培養する際、前記哺乳動物の外部から機械的刺激を与える工程をさらに含むことを特徴とする。
　本発明の再生歯ユニットの製造方法の別の一実施態様においては、前記機械的刺激は、約２００００Ｈｚ～約４００００Ｈｚの振動であることを特徴とする。
　本発明の再生歯ユニットの製造方法の一実施態様においては、前記スペーサーは、所望の再生歯ユニットのサイズを有する再生歯ユニットを発生させることができる内部空間を有するものであることを特徴とする。
　本発明の再生歯ユニットの製造方法の別の一実施態様においては、前記スペーサーは略筒状であって、該筒の高さが、所望の再生歯ユニットの厚みより大きく、該筒の内径が、再生歯ユニットの長さの略最大許容値であることを特徴とする。
　本発明の再生歯ユニットの製造方法の別の一実施態様においては、前記スペーサーが、円筒状であることを特徴とする。
　本発明の再生歯ユニットの製造方法の別の一実施態様においては、前記再生歯胚が個別に調製された複数の再生歯胚を含むことを特徴とする。
　本発明の再生歯ユニットの製造方法の別の一実施態様においては、前記再生歯胚が個別に調製された複数の再生歯胚を含み、前記スペーサー内において個別に調製された複数の再生歯胚を互いに隣接させて配置することを特徴とする。
　本発明の再生歯ユニットの製造方法の別の一実施態様においては、前記再生歯胚が個別に調製された複数の再生歯胚を含み、前記スペーサー内において個別に調製された複数の再生歯胚を、各再生歯胚の将来咬合面になる部位の中心と将来根尖になる部位の中心とを結んだ軸線の方向を略並行にそろえて配置することを特徴とする。
　また、本発明のさらに別の態様によれば、本発明は、哺乳動物の生体内において、スペーサー内において配置され、培養することにより再生歯ユニットを製造するための再生歯胚組成物であって、前記スペーサーは前記再生歯胚が最大許容値以上に伸長することを防止可能な構成であり、且つ、内部に配置された再生歯胚がスペーサー外部と連通可能な構成であることを特徴とする再生歯胚組成物に関する。
　本発明の再生歯胚組成物の別の一実施態様においては、前記再生歯胚が個別に調製された複数の再生歯胚を含むことを特徴とする。
　また、本発明のさらに別の態様によれば、本発明は、哺乳動物の生体内において再生歯胚をその中にいれて培養することにより再生歯ユニットを製造するためのスペーサーであって、前記再生歯胚が最大許容値以上に伸長することを防止可能な構成であり、且つ、内部に配置された再生歯胚がスペーサー外部と連通可能な構成であることを特徴とするスペーサーに関する。
　本発明のスペーサーの別の一実施態様においては、前記スペーサーの内部に配置された再生歯胚が、個別に調製された複数の再生歯胚を含むことを特徴とする。
　また、本発明のさらに別の態様によれば、本発明は、哺乳動物の生体内で再生歯胚を培養する工程を含む再生歯ユニットの製造方法であって、
　前記再生歯胚を培養する際、前記哺乳動物の外部から機械的刺激を与える、方法に関する。
　また、本発明の再生歯ユニットの製造方法の別の一実施態様において、前記機械的刺激は、約２００００Ｈｚ～約４００００Ｈｚの振動であることを特徴とする。
　また、本発明の再生歯ユニットの製造方法の別の一実施態様において、前記再生歯胚は、間葉系細胞で実質的に構成される第１の細胞集合体と、上皮細胞で実質的に構成される第２の細胞集合体を密着させて支持担体内部に配置されて培養・維持されたものであり、間葉系細胞と上皮細胞の少なくともいずれか一方が歯胚由来であることを特徴とする。
　また、本発明の再生歯ユニットの製造方法の別の一実施態様において、前記再生歯胚が個別に調製された複数の再生歯胚を含むことを特徴とする方法。
　また、本発明のさらに別の態様によれば、本発明は、動物の欠損した歯の修復方法であって、
　上記再生歯ユニットの製造方法で製造された再生歯ユニットを、前記欠損部に移植する工程を含む、方法に関する。
　本発明の動物の欠損した歯の修復方法の一実施態様において、前記動物が非ヒト哺乳動物であることを特徴とする。
　本発明の動物の欠損した歯の修復方法の一実施態様において、前記再生歯ユニットが、歯冠－歯根方向が略並行にそろった複数の歯を含むことを特徴とする。
　また、本発明のさらに別の態様によれば、本発明は、上記再生歯ユニットの製造方法で製造された再生歯ユニットに関する。
　また、本発明のさらに別の態様によれば、本発明は、動物の口腔内の欠損した歯を修復するために欠損部に移植するための、上記再生歯ユニットの製造方法で製造された再生歯ユニットに関する。
　本発明の再生歯ユニットの別の一実施態様において、前記再生歯ユニットは、歯冠－歯根方向が略並行にそろった複数の歯を含むことを特徴とする。
　本発明の再生歯ユニットの別の一実施態様において、前記再生歯ユニットは、歯冠－歯根方向が略並行にそろった複数の歯を含み、歯周組織が一体として形成されていることを特徴とする。
　本発明によれば、再生歯胚を動物の生体内で培養しても、当該動物の組織等から過剰な圧力を受けることなく、自然な形に歯を成長させることができる。また、歯が必要以上に伸長するのも防ぐことができる。
　さらに、本発明によれば、再生歯胚を動物の生体内で培養しても、十分な歯根膜組織を有する再生歯を得ることができる。
　さらに、本発明の一態様によれば、骨の大型欠損部位に対して、個別の再生歯ユニットを一本ずつ移植することなく、複数の再生歯を含む再生歯ユニットを一度に移植することができる。さらに、本発明の一態様によれば、複数の再生歯の歯槽骨が一体として形成されるため、移植時ないし移植後に複数の再生歯の方向がばらつくことなく、一体の歯槽骨により強固に支えられた一体のものとして移植することができる。
図１は、本発明の再生歯ユニット製造方法に従い、マウスの腎皮膜下に配置したスペーサー内で再生歯胚の生体内培養を行う様子を示す写真である。 図２は、スペーサーを用いて作製した再生歯ユニットのマイクロＣＴ画像である。 図３は、スペーサーを用いないで作製した再生歯ユニットのマイクロＣＴ画像である。 図４は、スペーサーを用いて作製した再生歯ユニット（制御）、スペーサーなしで作製した再生歯ユニット（非制御）、及び天然歯の歯冠部の長径／短径比を、ＣＴ画像上で測定・算出した結果を示す。 図５は、スペーサーを用いて作製した再生歯ユニット（制御）、及びスペーサーなしで作製した再生歯ユニット（非制御）の長さをＣＴ画像上で測定した結果を示す。 図６は、機械的刺激を与えながら再生歯胚を生体内培養して作製した再生歯ユニットと、刺激を与えずに作製した再生歯ユニットのＨＥ染色像である。 図７は、機械的刺激を与えながら再生歯胚を生体内培養して作製した再生歯ユニットと、刺激を与えずに作製した再生歯ユニットの歯根膜の幅をＣＴ画像上で測定した結果である。 図８は、本発明の方法で製造した再生歯ユニットを顎骨移植した様子を示す。 図９は、本発明の方法で製造した再生歯ユニットを顎骨移植した後、０日、１４日、３０日目のＣＴ画像である。 図１０は、本発明の方法で製造した再生歯ユニットを顎骨移植した後、３０日目のＨＥ染色像である。 図１１は、スペーサー内に再生歯胚を配置した状態を模式的に示した平面図及び側面図である。 図１２は、スペーサー内に、複数の再生歯胚を配置した状態の模式図である。 図１３は、スペーサー内に、複数の再生歯胚を配置した状態の実体写真である。 図１４は、腎皮膜下移植６０日後の多数歯再生歯ユニットの実体写真である。 図１５は、腎皮膜下移植６０日後の多数歯再生歯ユニットのＣＴ画像である。（ａ）はＣＴ外観像を示し、（ｂ）左側は、歯列方向のＣＴ断面像であり、（ｂ）右側は、頬舌方向のＣＴ断面画像である。 図１６は、多数歯再生歯ユニットを口腔内に移植後１日目のＣＴ画像である。
　本発明に係る歯の製造方法の第一の態様は、哺乳動物の生体内で、スペーサー内に再生歯胚を配置して培養する工程を含む再生歯ユニットの製造方法であって、スペーサーは、非ヒト哺乳動物の生体内の組織から再生歯胚に過剰な圧力がかかることと、再生歯胚が最大許容値以上に伸長することとを防止可能な構成であり、且つ、内部に配置された再生歯胚がスペーサー外部と連通可能な構成であることを特徴とする。なお、ここで、「連通可能」とは、スペーサーの内部と外部との間で、スペーサーを通じて、栄養物質やサイトカイン等の物質が通り抜け可能であること、すなわち、物質の供給路を有することをいう。
　本明細書において、「歯」とは、内側に象牙質及び外側にエナメル質の層を連続して備えた組織をいい、歯冠や歯根を有する方向性を備えた組織を意味する。歯の方向性は歯冠や歯根の配置によって特定することができる。歯冠や歯根は、形状や組織染色などに基づいて目視にて確認することができる。歯冠とは、エナメル質と象牙質の層構造を有する部分をいい、歯根にはエナメル質の層は存在しない。
　象牙質及びエナメル質は、当業者が、組織染色などによって形態的に容易に特定することができる。また、エナメル質は、エナメル芽細胞の存在によって特定することができ、エナメル芽細胞の存在は、アメロジェニンの有無によって確認することができる。一方、象牙質は、象牙芽細胞の存在によって特定することができ、象牙芽細胞の存在は、デンチンシアロプロテインの有無によって確認することができる。アメロジェニン及びデンチンシアロプロテインの確認は、この分野で周知の方法によって容易に実施することができ、例えば、ｉｎ　ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、抗体染色等を挙げることができる。
　本明細書において「歯胚」とは、将来歯になることが決定付けられた歯の初期胚であり、歯の発生ステージで一般的に用いられる蕾状期（Ｂｕｄ　ｓｔａｇｅ）から鐘状期（Ｂｅｌｌ　ｓｔａｇｅ）までの段階のものを指し、特に歯の硬組織としての特徴である象牙質、エナメル質の蓄積が認められない組織である。一方、本明細書において「歯芽」とは、「歯胚」の段階より後の組織を指し、歯の硬組織の特徴である象牙質、エナメル質の蓄積が始まった段階から、歯が歯肉から萌出して一般的に歯としての機能を発現する前の段階の組織をいう。
　本明細書において「再生歯胚」とは、細胞培養技術により人工的に形成した歯胚をいう。
　本明細書において「再生歯ユニット」とは、再生歯胚を培養し、再生歯胚に含まれる各種細胞を分化させた結果得られる、歯と歯を支持する歯周組織からなるユニットをいう。
　再生歯ユニットにおける歯の部分は、上述した歯芽から歯の段階の構成を有している。また、歯周組織は、歯根膜と歯槽骨を含む。
　すなわち、再生歯胚を哺乳動物の生体内で培養すると再生歯ユニットが得られ、再生歯ユニットを口腔内に移植して生着させる、または萌出、成長させることにより再生歯が得られる。
　本明細書において、スペーサーとは、哺乳動物の生体内で再生歯胚を培養する際に、再生歯胚が必要以上に伸長しないことを目的として、再生歯胚を覆うように配置される器具を意味する。また、スペーサーは、例えば、腎皮膜下等の生体内で培養する場合においては、皮膜の圧力や生体内の組織から過剰な圧力を再生歯胚が受けないようにする役割を果たすことができる。スペーサーの形状は、これらの目的が達成される限りどのような形状であってもよい。
　すなわち、スペーサーの形状は、所望の再生歯ユニットのサイズ（主には、長さと厚み）を有する再生歯ユニットを発生させることができる内部空間を確保できるものであればよい。再生歯ユニットの長さとは、再生歯ユニットの歯の部分において将来咬合面となる部位から将来根尖となる部位までの長さをいう。将来根尖となる部位のまわりに歯周組織が形成されている場合は、その先端（将来咬合面となる部位から最も遠い部位）までの距離を意味する。再生歯ユニットの長さの略最大許容値とは、哺乳動物の生体内で再生歯胚を培養した後に得られる再生歯ユニットの長さとして許容される最大値程度を意味する。当該略最大許容値は、再生歯胚がその後移植される対象や部位によって当業者が適宜決定することができる。再生歯ユニットの厚みは、一般には、再生歯ユニットの歯冠部の厚みをいうが、将来根尖となる部位のまわりに、歯周組織が形成されている場合には、歯周組織のある部分の厚みをいうこともある。人間の歯がそうであるように、歯冠部の断面は、通常、完全な正方形でも長方形でもなく、むしろ長径と短径によって規定される。
　従来の知見から、再生歯胚の伸長の方向は、相当程度、制御可能であるため、スペーサー内部において、再生歯胚組成物を配置する際の再生歯胚組成物自体の方向や、スペーサー内部における相対的位置を、望ましい伸長の方向を意図して、任意に調整することができる。したがって、所望のサイズが得られるように、再生歯胚組成物の伸長の方向を考慮して、スペーサーの３次元の大きさを設計することができる。
　一般的には、スペーサーの内部空間は、所望の再生歯ユニットよりも大きいものでなければならない。換言すれば、スペーサーの内部空間は、再生歯ユニットが、最大許容値以上に伸長することを防止する役割を果たすことになる。
　以下において、スペーサーの形状を、上下が開いた円筒状（リング状）とする場合について説明する。もっとも、当業者であれば、本明細書の開示等に基づき、所望の形状を有するスペーサーをデザインすることは、容易になし得るであろう。
　このような上下が開いた円筒状（リング状）とする場合には、上下の解放部を通じて、スペーサー外部からの栄養供給路も十分に確保され、再生歯ユニットの形成が可能となる。
　また、そのような円筒状（リング状）のスペーサーを用いる場合、再生歯胚の伸長方向を円筒リングの横方向（すなわち、円筒の径方向）とすると、円筒の縦方向（すなわち、円筒の高さ）は、所望の再生歯ユニットの咬合面の厚みを得られるように、また、最大許容値を超えないように、設定すればよい。また、リングの内径は、再生歯ユニットが必要以上に伸長するのを防ぐため、再生歯ユニットの長さの略最大許容値を意図して設定すればよい。
　このような円筒状のスペーサーを用いる場合に、リングの径方向を伸長方向として、縦方向（高さ方向）を再生歯ユニットの歯冠の幅となるように、再生歯胚を配置する場合には、筒の高さは、例えば、ヒトの歯を培養する場合は３－１５ｍｍ、好ましくは５－１２ｍｍとし、マウスの歯を培養する場合は０．４－２．０ｍｍ、好ましくは０．６－１．８ｍｍとし、その内径（内直径）は、ヒトの歯を培養する場合は１０－３０ｍｍ、好ましくは１５－２６ｍｍとし、マウスの歯を培養する場合は、０．９－２．０ｍｍ、好ましくは１．２－１．９ｍｍとする。
　さらに、略円筒状のスペーサーを利用する場合には、再生歯胚の将来咬合面になる部位を、スペーサーの内壁のごく近くに、内壁に面するように配置し、且つ、将来根尖になる部位を筒の径方向に向かうように配置することによって、再生歯胚が、生体内の組織から過剰な圧力を受けず、再生歯胚が必要以上に伸長するのを防ぎ、且つ外部と連通可能で物質供給路を確保できる。
　再生歯胚の咬合面は、圧力によってつぶされることなく自然な形状に成長することができ、歯は筒の直径方向に伸長し、一般に、反対側の壁に到達する前に、または、到達後、最大許容値未満の長さで伸長を止めることができる。
　再生歯胚は、筒の水平方向からの圧力をスペーサーの壁によって回避することができるとともに、上下方向からの圧力をスペーサーの上端及び下端によってほとんど回避することができる。
　当業者であれば、円筒状に限らず、本明細書で規定した所望の目的を達成すべく、または、その他、場合によって必要とされる他の目的を達成すべく、生体内において再生歯ユニットの製造において任意の所望の形状のスペーサーを用いることができる。例えば、円筒の代わりに底面が楕円や多角形のものや、球状のもの等が挙げられるが、これらに限定されない。
　本発明のスペーサーは、内部に配置された再生歯胚が、スペーサーの外部と連通可能な構成となっている。再生歯胚は、哺乳動物の生体内の組織から栄養等の供給を受けたり、動物細胞が産生するサイトカインの作用を受けたりするため、これらの物質がスペーサー内の再生歯胚に到達するための供給路を確保する必要があるからである。連通可能であるために、スペーサーの形状として、大小、個数を問わず、物質の供給に足る孔を形成することができる。例えば、筒状のように部分的に大きな孔を有するものであってよく、また、スペーサー全体について、メッシュのように小さな孔を多数有するものであってもよい。また、スペーサーの材質が物質の透過可能なものであれば、孔があるものでなくてもよい。
　本明細書において哺乳動物とは、生体内で再生歯胚を培養することができる限り特に限定されないが、非ヒト哺乳動物であってもよい。例えば、ウシ、ウマ、ブタ、イヌ、ネコ、マウスを挙げることができ、好ましくは、ブタ、マウスである。また、歯胚組織と同一の種であることが特に好ましい。歯胚組織と同一の種でない動物に移植して培養する場合は、免疫不全に改変した動物を用いることが好ましい。生体内成育に好適な生体部位としては、動物細胞の器官や組織をできる限り正常に発生させるために、腎皮膜下、腸間膜、皮下等が好ましい。
　移植後の培養期間は、移植時の歯の大きさと発生させる歯の大きさによって異なるが、一般に３日～４００日とすることができる。例えば、腎皮膜下に移植する場合、移植する歯胚の大きさと再生させる歯の大きさによっても異なるが、７日～６０日程度が好ましい。
　スペーサーの材質は特に限定されず、生体内の組織からの圧力に対して十分な硬性を有するものであればよく、例えば、金、銀、鉄、銅、アルミニウム、ポリエチレン、樹脂、歯科用レジン、歯科用セメント等が挙げられる。
　また、本発明に係る再生歯ユニットの製造方法では、スペーサー内に再生歯胚を配置して培養する工程が、スペーサー内を支持担体で満たし、該支持担体内に再生歯胚を配置して行われることが好ましい。
　支持担体は、内部で細胞の培養が可能なものであれば特に限定されないが、例えば、ゲル状、繊維状、固体状のものが好ましく、かかる支持担体を用いることによって、さらに生体内で再生歯胚に過剰な圧力がかかるのを防ぐことができる。
　本発明で用いられる支持担体としては、例えば、コラーゲン、アガロースゲル、カルボキシメチルセルロース、ゼラチン、寒天、ハイドロゲル、セルマトリクス（商品名）、メビオールゲル（商品名）、マトリゲル（商品名）、エラスチン、フィブリン、ラミニン、細胞外マトリクス混合物、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、乳酸／グリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ）等を挙げることができる。中でも、適切な硬さや保持力を有するコラーゲン、アガロースゲル、カルボキシメチルセルロース、ゼラチン、寒天、ハイドロゲル、セルマトリクス、メビオールゲル、マトリゲル、細胞外マトリクス混合物、エラスチン、フィブリン、ラミニンが好ましい。
　例えば、支持担体は液状のものを用い、再生歯胚を配置した後に硬化させてもよい。例えば、スペーサー内部をコラーゲン溶液で満たし、コラーゲン溶液内に再生歯胚を配置した後、３７℃のＣＯ２インキュベーター内で培養することにより、コラーゲンをゲル化させることができる。次いで、再生歯胚をスペーサーごと哺乳動物の生体内に配置して培養を行うことができる。
　また、本発明の別の態様は、哺乳動物の生体内で再生歯胚を培養する工程を含む歯の製造方法であって、再生歯胚を培養する際、哺乳動物の外部から機械的刺激を与えることを特徴とする。
　機械的刺激を与えることによって、再生歯ユニットにおける歯根膜の形成が促進される。機械的刺激とは、例えば、振動、圧迫、摩擦等が挙げられるがこれらに限定されない。例えば、音波程度の周波数（例えば、２００００Ｈｚ～４００００Ｈｚ程度）の振動を与えることが好ましい。
　上述した、本発明に係るスペーサーを用いる再生歯ユニットの製造方法において、再生歯胚を生体内で培養する際、哺乳動物の外部から機械的刺激を与えることも好ましい。
　次に、本発明の方法に用いられる再生歯胚について説明する。
　再生歯胚はどのような方法で作製したものであってもよいが、例えば、間葉系細胞で実質的に構成される第１の細胞集合体と、上皮細胞で実質的に構成される第２の細胞集合体を密着させて配置する工程と、第１及び第２の細胞集合体を支持担体の内部で培養する工程と、を含む方法によって作製することができる。なお、本明細書において、２つの細胞集合体を区別するために、便宜上、間葉系細胞で実質的に構成される細胞集合体の方を第１の細胞集合体と呼んだが、上皮細胞で実質的に構成される細胞集合体の方を第１の細胞集合体と呼ぶこともでき、いずれを第１の細胞集合体と呼ぶか否かは重要ではない。
　本発明において「間葉系細胞」は、間葉組織由来の細胞及びその細胞を培養して得られる細胞を意味し、「上皮系細胞」は、上皮組織由来の細胞及びその細胞を培養して得られる細胞を意味する。
　また、本発明において「歯周組織」とは、歯の主として外層に形成された歯槽骨及び歯根膜をいう。歯槽骨及び歯根膜は、当業者が、組織染色などによって形態的に容易に特定することができる。
　「間葉系細胞で実質的に構成される第１の細胞集合体と、上皮細胞で実質的に構成される第２の細胞集合体を密着させて配置する工程」は、例えば、特許文献１乃至５に記載されており、それら各文献の開示は全体として本明細書に参照として組み込まれる。
　上記第１の細胞集合体と第２の細胞集合体は、それぞれ実質的に間葉系細胞のみ、又は上皮系細胞のみで構成されている。「実質的に間葉系細胞のみで構成されている」とは、本発明において、ある細胞集合体が間葉系細胞のみから構成されている場合と同じ機能を果たすことを意味し、間葉系細胞となる細胞以外のものをできるだけ含まない状態をいう。「実質的に上皮系細胞のみからなる」という場合も同様である。
　ここで、細胞集合体とは、細胞が密着した状態をいい、組織であっても、ばらばらの細胞から調製された細胞凝集塊であってもよい。組織を用いれば、細胞配置や形状の正しい歯が得られやすいという利点があるが、入手できる量に制約がある場合もある。細胞凝集塊は、培養細胞も用いることができるので、比較的入手しやすく好ましい。本発明に係る方法によれば、細胞凝集塊を用いても、細胞配置や形状の正しい再生歯を得ることができる。
　細胞集合体を構成する間葉系細胞及び上皮系細胞は、少なくともいずれか一方を歯胚由来とする。これにより、生体内での細胞配置を再現して特有の構造及び方向性を有する歯を効果的に形成することができる。間葉系細胞及び上皮系細胞がいずれも歯胚由来であることがより好ましい。当該歯胚は、細胞の分化段階の幼若性と均質性の観点から、蕾状期から帽状期のものであることが好ましい。
　歯胚以外に由来する間葉系細胞として、生体内の他の間葉系組織に由来する細胞を用いることもできる。好ましくは、血液細胞を含まない骨髄細胞や間葉系細胞、さらに好ましくは口腔内間葉系細胞や顎骨の内部の骨髄細胞、頭部神経堤細胞に由来する間葉系細胞、これらの間葉系細胞に分化しうる間葉系前駆細胞やその幹細胞等である。間葉系細胞として、羊膜由来細胞を用いる例が特許文献３に、全能性幹細胞を分化誘導した細胞を用いる例が特許文献４に記載されており、その開示は全体として本明細書に参照として組み込まれる。
　歯胚以外に由来する上皮系細胞として、生体内の他の上皮系組織に由来する細胞を用いることもできる。好ましくは、皮膚や口腔内の粘膜や歯肉の上皮系細胞、さらに好ましくは皮膚や粘膜などの分化した、例えば角化した、あるいは錯角化した上皮系細胞に分化しうる未熟な上皮系前駆細胞、例えば非角化上皮系細胞やその幹細胞等である。口腔内上皮細胞やその初代培養細胞を上皮系細胞として用いる例が特許文献２に記載されており、その開示は全体として本明細書に参照として組み込まれる。
　歯胚及び他の組織は、哺乳動物の霊長類（例えばヒト、サルなど）、有蹄類（例えばブタ、ウシ、ウマなど）、小型哺乳類のげっ歯類（例えばマウス、ラット、ウサギなど）のほか、イヌ、ネコなど種々の動物の顎骨等から採取することができる。歯胚及び組織の採取は、通常、組織の採取で用いられる条件をそのまま適用すればよく、無菌状態で取り出し、適当な保存液に保存すればよい。なお、ヒトの歯胚としては、第３大臼歯いわゆる親知らずの歯胚のほか、胎児歯胚を挙げることができるが、自家組織の利用の観点から、親知らずの歯胚を用いることが好ましい。また、マウスの場合、胎児齢１０日から１６日の歯胚を用いることが好ましい。
　歯胚からの間葉系細胞及び上皮系細胞の調製は、まず周囲の組織から単離された歯胚を、形状に従って、歯胚間葉組織及び歯胚上皮組織に分離することによって行われる。この際、分離を容易に行うため酵素を用いてもよい。酵素としては、ディスパーゼ、コラーゲナーゼ、トリプシン等を挙げることができる。
　本発明における細胞凝集塊は、間葉組織または上皮組織に由来する細胞が凝集したものを意味し、間葉組織又は上皮組織をばらばらに分散させて得た細胞、あるいは当該細胞の初代または継代培養によって得た細胞を凝集させて調製することができる。
　細胞を分散させるためには、ディスパーゼ、コラーゲナーゼ、トリプシン等の酵素を用いてもよい。十分な細胞数を得るために、細胞凝集塊を調製する前に分散した細胞の初代または継代培養を行う場合、培養に用いられる培地としては、一般に動物細胞の培養に用いられる培地、例えばダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）等を用いることができる。細胞の増殖を促進するための血清を添加するか、あるいは血清に代替するものとして、例えばＦＧＦ、ＥＧＦ、ＰＤＧＦ等の細胞増殖因子やトランスフェリン等の既知血清成分を添加してもよい。なお、血清を添加する場合の濃度は、そのときの培養状態によって適宜変更することができるが、通常１０％前後とすることができる。細胞の培養には、通常の培養条件、例えば約３７℃の温度で５％ＣＯ２濃度のインキュベーター内での培養が適用される。また、適宜、ストレプトマイシン等の抗生物質を添加したものであってもよい。
　細胞を凝集させるためには、例えば、細胞懸濁液を遠心処理すればよい。間葉系細胞及び上皮系細胞の細胞凝集塊は、両者を密着させたときに確実に細胞相互作用するよう、それぞれを高密度の状態にしておくことが好ましい。高密度の状態とは、組織を構成する際の密度と同等程度であることをいい、例えば、５×１０７個／ｍｌ～１×１０９個／ｍｌ、好ましくは１×１０８個／ｍｌ～１×１０９個／ｍｌ、最も好ましくは２×１０８個／ｍｌ～８×１０８個／ｍｌである。細胞凝集塊を高密度にする方法は特に限定されないが、例えば、細胞を遠心処理によって凝集させ沈殿化する方法によって行うことができる。遠心処理は細胞の活性を損なわずに簡便に高密度化できるため好ましい。遠心処理は、３００×ｇ～１２００×ｇ、好ましくは５００×ｇ～１０００×ｇの遠心力を与える回転数で３分間～１０分間行えばよい。３００×ｇよりも低い遠心処理では、細胞密度を十分に高くできなくなる傾向があり、一方、１２００×ｇよりも高い遠心処理では、細胞が損傷を受ける場合がある。
　遠心分離によって高密度の細胞凝集塊を調製する場合には、通常、細胞の遠心分離をするために用いられるチューブ等の容器に細胞の懸濁液を調製してから遠心分離を行い、沈殿物としての細胞を残して上清をできるだけ除去すればよい。このとき、目的とする細胞以外の成分（例えば、培養液、緩衝液等）は、細胞の容量と等量以下であることが好ましく、目的とする細胞以外の成分を含まないことが最も好ましい。このような高密度の細胞集合体を後述する方法により支持担体内で密着させれば、細胞が緊密に接触し、細胞間相互作用が効果的に発揮される。
　支持担体としては、上述したスペーサー内に配置される支持担体と同じものを使用することができる。第１及び第２の細胞集合体を培養する目的で用いられる支持担体は、細胞が分散することなく、細胞集合体の密着状態を保持可能な保持力を備えていることが好ましい。密着した状態とは、上述した高密度の間葉系細胞及び上皮系細胞の細胞集合体が、間葉系細胞と上皮系細胞の接触面付近においても同程度の高さの密度を維持している状態を意味する。密着状態を保持可能な支持担体は、例えば、コラーゲンの場合、最終濃度２ｍｇ／ｍｌ～３ｍｇ／ｍｌの濃度、即ちＪＩＳ－Ｋ６５０３－１９９６に準拠した方法（１２．７ｍｍ径のプランジャーで４ｍｍ押し下げるのに必要な荷重として測定）によって１２０ｇ～２５０ｇのゼリー強度となる濃度での使用が適切な硬さを提供する。他の種類の支持担体においても、同様の評価方法によって同様の強度があれば本発明の支持担体として好ましく用いられる。また１種又は複数種の支持担体を混合することによって、目的とするゼリー強度に相当する硬さの支持担体を得てもよい。
　第１及び第２の細胞集合体を支持担体内に配置する方法は特に限定されないが、細胞集合体が細胞凝集塊である場合は、例えば上述した遠心分離で得られる沈殿物をマイクロシリンジ等で支持担体内に挿入して配置することができる。細胞集合体が組織である場合には、シリンジの針の先端などを用いて支持担体内の任意に位置に配置することができる。
　本発明において第１と第２の細胞集合体を支持担体に密着させて配置する方法は特に限定されないが、例えば、一方の細胞集合体を支持担体内に配置したあと、他方の細胞集合体をそれに押しつけるように配置することによって、両者を密着させることができる。より具体的には、支持担体内において上記シリンジの針の先端の位置を適宜変更することで一方の細胞集合体を他方の細胞集合体に押し付けることが可能である。なお、細胞集合体として上皮系組織又は間葉系組織を用いる場合には、当該組織が元々の歯胚において間葉系組織又は上皮系組織と接触していた面を、他方の細胞集合体に接触するように配置することが好ましい。
　また、配置した後に、支持担体を固化する工程を設けることも好ましい。これにより、細胞がさらに凝集して、より高密度な状態とすることができる。例えば、コラーゲンゲルの場合、培養温度下で数分～数十分間静置することによって固化することができる。このとき、細胞集合体内に細胞以外の成分が少なければ少ないほど、より高密度な状態が実現される。
　本発明における、「第１及び第２の細胞集合体を支持担体の内部で培養する工程」は、例えば、特許文献１乃至４及び特開２００８－２９７５７号公報に記載されており、それら各文献の開示は全体として本明細書に参照として組み込まれる。
　培養期間は、支持担体内部に配置された細胞数、細胞集合体の状態、培養の条件、動物種等によって異なり、当業者が適宜選択することができる。口腔内に移植した際に機能的な歯として萌出するためには、少なくとも１日培養することが好ましく、３日以上がより好ましい。
　培養期間を長くすることによって、象牙質及びエナメル質の蓄積、歯冠の形成、及び歯根の形成のように、再構成歯胚の形成をより進行させることができる。所望の状態を得るために、例えば、６日以上、３０日以上、５０日以上、１００日以上、又は３００日以上培養してもよく、培養の途中で、培地や培養条件を変更することもできる。
　支持担体内部における培養工程は、第１及び第２の細胞集合体を内包する支持担体を単独で培養してもよく、他の動物細胞等の存在下で培養してもよい。
　支持担体を単独で培養する場合、培養条件は、一般的な動物細胞の培養に用いられる条件とすることができる。また、培養には、哺乳動物由来の血清を添加してもよく、またこれらの細胞の増殖や分化に有効であることが知られている各種細胞因子を添加してもよい。このような細胞因子としては、ＦＧＦ、ＢＭＰ等を挙げることができる。
　細胞集合体のガス交換や栄養供給の観点、及び他の動物細胞との接触・混入がなく、且つ全工程をｉｎ　ｖｉｔｒｏで行うことができるという観点から、支持担体内部における培養を、器官培養とすることが好ましい。器官培養では、一般に、動物細胞の増殖に適した培地上に多孔性の膜をフロートさせ、その膜上に第１及び第２の細胞集合体を内包する支持担体を載置して培養を行う。ここで用いられる多孔性の膜は、０．３～５μｍ程度の孔を多数有するものであることが好ましく、例えば、セルカルチャーインサート（商品名）やアイソポアフィルター（商品名）を挙げることができる。
　本発明に係る歯の製造方法では、哺乳動物の生体内に再生歯胚を配置して培養する前に、再生歯胚を生体外で前培養することも好ましい。前培養によって細胞間の結合、及び細胞間相互作用をより強固にすることができ、その結果、全体の成育期間を短縮することができる。
　本発明に係る方法によって得られる歯は、内側に象牙質、外側にエナメル質という歯特有の細胞配置（構造）を有するものであり、好ましくは、歯の先端（歯冠）と歯根を正しい位置に有する方向性も備えたものであり、歯としての機能を十分に果たすものである。従って、歯の代替物として広く利用することが可能である。また、歯の発生過程を解明するための研究に有用なリサーチツールとして用いることもできる。
　さらに、培養期間を延長することによって、歯そのものに加え、歯を顎骨上で支持し固定化する歯槽骨や歯根膜などの歯周組織も形成させることができる。これにより、移植後の歯の実用性をさらに高めることができる。また、歯周組織のみを分離して利用することも可能である。
［歯の欠損部の修復方法］
　本発明に係る口腔内の歯の欠損部の修復方法は、本発明に係る再生歯ユニットの製造方法で製造された再生歯ユニットを欠損部に移植する工程を含む。本方法によれば、欠損部の大きさ及び形状に適合する再生歯ユニットを製造し移植することが可能である。
　本発明に係る再生歯ユニットの製造方法によれば、再生歯胚を生体内で培養する際、歯が生体内で圧力を受けてつぶれることがなく、自然な形状に成長させることができるので、欠損部に適合した形状の歯を製造しやすい。
　また、欠損部に移植するためには、欠損した歯と同じ長さを有する再生歯を作製することが望ましいところ、本発明に係る歯の製造方法によれば、歯の長さの最大値を制御することができる。歯の長さが最大許容値を超えている場合、その歯をそのまま移植することができないが、最大許容値より短ければ、移植してから成長させて所望の長さの再生歯を得ることが可能である。
　本発明に係る口腔内の歯の欠損部の修復方法においては、再生歯ユニットとして、歯の発生のどの段階にあるものを移植してもよい。すでに歯冠の形成が認められていれば歯冠が口腔内側となるように配置することが好ましい。歯冠の形成が認められない段階の場合には、歯冠相当部の上皮細胞層又は再成歯胚の上皮細胞層を口腔内側となるように配置することが好ましい。また、再成歯胚の上皮・間葉細胞層の開放部分が口腔内側とは反対側となるように配置することも好ましい。これにより、歯の先端部（歯冠）が、口腔内側となり、周囲の歯と同様の方向性をもたせることができる。
　欠損部とは、抜歯等により歯肉に設けられた部分を意味し、形状に特に制限はない。再生した歯胚又は歯を埋設可能である限り、欠損場所、目的とする歯の種類は特に限定されない。
　欠損部は、通常、顎骨、口腔の歯槽骨などに位置する。また歯の喪失に伴って歯槽骨量が低下している場合には、欠損部位に対してＧＴＲ法（ｇｕｉｄｅｄ　ｔｉｓｓｕｅ　ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ：組織再生誘導法）など、インプラントの埋設のために臨床で用いられる公知の方法により歯周組織の再生を促そうとしてもよい。歯胚または歯を孔部へ配置した後は、通常の処理に従って、縫合等を行うことが好ましい。
　本発明に係る口腔内の歯の欠損部の修復方法では、移植対象を、歯の製造に用いた歯胚を摘出した動物と同種とすることが好ましく、歯胚を摘出した個体と同一個体とすることがさらに好ましい。動物としては、ヒト、ウシ、ウマ、ブタ、イヌ、ネコ、マウス等を含む哺乳動物を挙げることができる。非ヒト哺乳動物とすることも好ましい。
　本発明の別の実施態様としては、再生歯胚として、複数の再生歯胚を用いることができる。複数の再生歯胚は、各再生歯胚が個別に調製された再生歯胚であることが好ましい。個別に調製された再生歯胚とは、将来単一の歯を形成するように調製された再生歯胚をいう。再生歯胚の作製方法は、上記の通りである。個別に調製された再生歯胚とは、例えば特許文献１に記載されているように、複数歯胚を含む再生歯胚を作製してから分離することもできる。しかし、一般により好ましくは、例えば特許文献５及において記載されているように、再生歯胚に含まれるエナメル結節の数を調節することにより、将来単一の歯を形成するように作製することができる。また、前記個別に調製された再生歯胚は、欠損部の大きさや再生させる歯の大きさにより、適宜その大きさを調節して作製することができる。例えば、再生歯胚を作製する際に、前記間葉系細胞集合体と前記上皮系細胞集合体とを接触させて配置する際、それぞれの細胞集合体を略柱状に形成することができ、その場合に、その柱の軸方向の接触長さを制御することによって、一方向に所望の長さを有する歯を形成できる。例えば、前記間葉系細胞集合体と前記上皮系細胞集合体との接触長さを、所望の再生歯の歯冠の幅の±２５％とすることによって、当該所望の長さを有する再生歯を作製することができる。培養の結果、所望の再生歯の大きさ、形状をそなえるように、細胞集合体の長さ等を調節して作製することができる。上記のようにして個別に調製された再生歯胚を並べて配置し培養することによって複数の再生歯を含む再生歯ユニットを作製する。再生歯胚は、将来咬合面になる部位の中心と将来根尖になる部位の中心とを結んだ軸線の方向を略並行にそろえて配置することが好ましい。将来咬合面になる部位の中心と将来根尖になる部位の中心とを結んだ軸線の方向と、再生歯の歯冠と歯根とを結んだ軸線の方向とは概ね一致し、本明細書において、この方向を「歯冠－歯根方向」と呼ぶことがある。この軸線の方向を略並行に揃えて配置することにより、生来の歯と同様に、歯冠―歯根方向のそろった複数の歯を含む再生歯ユニットを得ることができる。また、複数の再生歯胚を配置する場合には、一平面上に配置することが好ましい。一平面上に配置することにより、歯列の整った再生歯ユニットを得ることができる。なお、歯列が歯茎のカーブに沿って整列した状態にしたい場合には、平面上ではなく、歯茎のカーブに沿った曲面上に配置することもできる。再生歯胚を複数配置する場合、再生歯ないし再生歯胚の本数は特に限定されず、歯の欠損部位の形状・大きさ、または、所望の再生歯の本数に応じて選択することができ、好ましくは、２～６本、より好ましくは、２～４本配置することができる。
　複数の再生歯胚を並べて配置する際には、再生歯胚同士を隣接させて配置することが好ましい。隣接させて配置するとは、再生歯胚を互いに接触またはほぼ接触させて配置することをいう。再生歯胚同士を隣接させて配置させると、歯列方向の歯の間の隙間がない又は小さい再生歯ユニットを得ることができる。また、複数の再生歯胚を隣接させて配置し、培養した場合、培養期間が長くなると、歯周組織が互いに結合し一体となった形状の再生歯ユニットを得ることができる。このように、歯周組織が一体として形成された再生歯ユニットは、再生歯ごとに分離することなく、そのまま歯の欠損部位に移植することができる。このように複数の再生歯を含み一体として形成された再生歯ユニットは、個別の再生歯ユニットを一つずつ移植する場合に比べ、移植を簡便にし、また、個々の歯を一体の歯周組織により強固に支えることができる。また、複数の再生歯を含み一体として形成された再生歯ユニットは、個別の再生歯ユニットを一つずつ移植する場合に比べ、移植時又は移植後に歯列の方向が乱れる心配なく、移植することができる。
　本発明の別の実施態様としては、前記複数の再生歯胚を、上述したようにスペーサー内に配置して培養することもできる。スペーサーについては、上記と同様であり、並べる再生歯胚の数に応じて適切な形状とすることが好ましい。複数の再生歯胚を並べる場合には、複数歯胚の歯列方向の歯冠の幅の合計値または歯列方向の歯周組織の長さが得られるような形状とすることが好ましい。そのため、スペーサーとして筒上のものを用いる場合には、楕円または長方形に近い形状を底面とするような筒を用いることが好ましい。複数の再生歯を含む再生歯ユニットを作製する場合に、スペーサーを用いることによって、整列された再生歯胚の状態、すなわち、再生歯胚の方向や再生歯胚同士の間隔、及び、再生歯胚の並ぶ平面を維持したまま、生体内に挿入して生体内培養をすることができるという利点がある。
　なお、本明細書において用いられる用語は、特定の実施態様を説明するために用いられるのであり、発明を限定する意図ではない。
　また、本明細書において用いられる「含む」との用語は、文脈上明らかに異なる理解をすべき場合を除き、記述された事項（部材、ステップ、要素、数字など）が存在することを意図するものであり、それ以外の事項（部材、ステップ、要素、数字など）が存在することを排除しない。
　異なる定義が無い限り、ここに用いられるすべての用語（技術用語及び科学用語を含む。）は、本発明が属する技術の当業者によって広く理解されるのと同じ意味を有する。ここに用いられる用語は、異なる定義が明示されていない限り、本明細書及び関連技術分野における意味と整合的な意味を有するものとして解釈されるべきであり、理想化され、又は、過度に形式的な意味において解釈されるべきではない。
　本発明の実施態様は模式図を参照しつつ説明される場合があるが、模式図である場合、説明を明確にするために、誇張されて表現されている場合がある。
　第一の、第二のなどの用語が種々の要素を表現するために用いられるが、これらの要素はそれらの用語によって限定されるべきではないことが理解される。これらの用語は一つの要素を他の要素と区別するためのみに用いられているのであり、例えば、第一の要素を第二の要素と記し、同様に、第二の要素は第一の要素と記すことは、本発明の範囲を逸脱することなく可能である。
　以下において、本発明を、実施例を参照してより詳細に説明する。しかしながら、本発明はいろいろな態様により具現化することができ、ここに記載される実施例に限定されるものとして解釈されてはならない。
<実施例１：スペーサーを用いた再生歯胚の生体内培養>
　腎皮膜下移植において腎皮膜の圧力の影響を回避する目的で、スペーサーを用いて再生歯胚の生体内培養を行った。
　マイクロピペットチップ（ＨＲＩ－１１０ＮＥＷ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏ　Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，ＳａｎＤｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）を内径（内直径）１．３ｍｍ、高さ１．３ｍｍになるようリング状（筒状）に切断してスペーサーを作製し、内部にコラーゲン溶液を満たして使用した。再生歯胚は、歯根方向への伸長を促すためスペーサーの壁面に歯冠側を近接させるよう配置し、３７℃のＣＯ２インキュベーター（三洋電機，大阪，日本）で培養し、コラーゲンゲルを硬化させた。次に、再生歯胚を含むスペーサーを７週齢Ｃ５７ＢＬ／６マウスの両側腎皮膜下に移植した。腎皮膜下への移植は、腎臓皮膜に２～３ｍｍの切開を入れ、腎臓皮膜と腎臓実質を剥離し、その間に再生歯胚を含むスペーサーを挿入することにより行った。比較例として、７日間器官培養した再生歯胚を、スペーサーを用いずに腎皮膜下に移植した。移植時の写真を図１に示す。また、移植時のスペーサーと再生歯胚の位置関係の模式図を図１１に示す。
　移植３週間後に、マイクロＣＴ撮影を行い、画像データは統合画像処理ソフトを用いて解析した。歯冠部における最大径を長径とし、長径と直交する最大径を短径と定義し、それぞれの長さを計測し、その比率を算出した。
　スペーサーを用いて培養した例を図２に、用いないで培養した例を図３に示す。スペーサーを用いて培養した再生歯ユニットは、正常歯に近い形態である一方、スペーサーを用いないで培養した再生歯ユニットは、長径が短径に対して極端に長く、扁平な形状であった。
　スペーサーを用いて培養した群（制御群）及びスペーサーを用いないで培養した群（非制御群）の各７例について長径と短径を計測し、長径／短径比を求めた結果を図４（右側）に示す。再生歯ユニットの長径／短径比は、スペーサーを用いて培養した群（制御群：実施例）では１．４６±０．１６ｍｍであり、スペーサーを用いないで培養した群（非制御群：比較例）では２．３０±０．３５ｍｍであった。
　図４（左側）には、成獣マウスの下顎第一、第二、第三臼歯（Ｍ１、Ｍ２、Ｍ３）の歯冠部における最大径を長径とし、長径と直交する最大径を短径と定義して測定し、長径／短径比を求めた結果も示す。Ｍ１、Ｍ２、Ｍ３の長径／短径比は、それぞれ、１．６１±０．０５（ｎ＝５）、１．０９±０．０４（ｎ＝５）、１．１２±０．０４（ｎ＝５）であった。
　以上より、スペーサーを用いずに生体内培養した再生歯ユニット形状が扁平となるのに対し、スペーサーを用いて生体内培養した再生歯ユニットは、形状が扁平にならず、両者の長径／短径比は有意差があること、また、スペーサーを用いて生体内培養した再生歯ユニットの長径／短径比は天然の歯と同等になることが確認された（Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ－ｔ検定、＊ｐ<０．０００１）。
　また腎皮膜下移植３０日、６０日目の再生歯ユニットを摘出し、マイクロＣＴ撮影、並びに統合画像処理ソフトによる解析を行って長さを測定した。マイクロＣＴ画像上で形成された歯槽骨の領域を含めず、歯の咬頭から根尖までの長さを計測した。
　結果を図５に示す。スペーサーを用いない非制御群においては咬頭－根尖長が３０日目に１．０７±０．２０ｍｍ（ｎ＝６）であったところ、６０日目には１．７０±０．２６ｍｍ（ｎ＝６）となっており、有意に歯の長さが増加していた。一方、スペーサーによる制御群では、３０日目で１．０１±０．１９ｍｍ（ｎ＝１３）、６０日目で１．０２±０．１１ｍｍ（ｎ＝１０）と、移植日数による歯の長さの増加は認められなかった（Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ－ｔ検定、＊ｐ<０．０００１）。
　以上より、スペーサーを用いて再生歯胚を生体内培養すると、再生歯の長さを任意に調節できることが明らかになった。
<実施例２：機械的刺激を与えた再生歯胚の生体内培養>
　実施例１の方法に従って、スペーサーを用いて器官培養を行った再生歯胚をスペーサーごと腎皮膜下に移植し、機械的刺激として、腎皮膜下移植後７日目から音波電動歯ブラシ（周波数３１，０００Ｈｚ：Ｄｏｌｔｚ（商標）、パナソニック）をマウス背部皮膚に３．９×１０４Ｐａの圧力にて圧接した（５分間／日）。コントロール群には機械的刺激を与えず、３０日間の移植期間後に摘出して比較対象とした。
　摘出した再生歯ユニットは実施例１と同様の方法でマイクロＣＴ撮影を行い、三次元画像解析ソフトウェアを用いて歯根膜腔の幅（単に、「歯根膜の幅」と呼ぶこともある。）を計測した。具体的には、三次元画像上で再生歯ユニットの歯根表面と形成された歯槽骨との距離を歯根膜腔の幅とし、長径・短径における断面において、それぞれ６点ずつ計測した。その後、再生歯を４％パラフォルムアルデヒド（Ｐａｒａｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ：ＰＦＡ）にて固定し、１０％エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）にて脱灰し、パラフィン包埋した。その後、厚さ８マイクロメートルの連続切片を作製し、ヘマトキシリン・エオジン（ＨＥ）染色を行い、組織学的評価を行った。
　組織学的評価の結果を図６に示す。図中、Ｂは歯槽骨、Ｄは象牙質、Ｐは歯根膜を示し、図中のＰの文字の隣のバーが歯根膜の幅を示す。なお、図中の右下のスケールバーは１００μｍを示す。有刺激群の歯根膜は、無刺激群より厚く形成され、歯根膜領域の細胞の規則的な配列が認められた。
　またＣＴ画像上で歯根膜の幅を計測した結果を図７に示す。有刺激群の歯根膜の幅は、１０８．５±３０．６μｍ（ｎ＝３３）であり、無刺激群の歯根膜の幅は、６８．７±１４．１μｍ（ｎ＝１２）であった（Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ－ｔ検定、＊ｐ<０．０００１）。
　以上の結果から、再生歯胚を生体内培養する際に、外部から機械的な刺激を与えることにより、十分な歯根膜組織を有する再生歯ユニットが得られることが判明した。
<実施例３：生体内培養によって得られた再生歯ユニットの顎骨移植>
　４週齢Ｃ５７ＢＬ／６マウスの下顎第一臼歯を抜歯し、３日間の治癒期間を設けた。その後、同部の歯肉切開・剥離を行い、歯科用マイクロモーター（Ｖｉｖａ－Ｍａｔｅ　Ｐｌｕｓ，ナカニシ，東京，日本）を用いて歯槽骨を切削し、近遠心径１ｍｍ、頬舌径０．８ｍｍの移植窩を形成した。
　実施例１に従って、スペーサーを用いて３０日間腎皮膜下で培養し、且つ、実施例２に従って培養中に機械的刺激を加えて作製した再生歯ユニットを、顎骨移植窩に埋入し、８－０ナイロン縫合糸（ベアーメディック，千葉，日本）で歯肉縫合した。
　図８に移植窩の形成、及び再生歯ユニットの移植の様子を示す。
　再生歯ユニットを移植したマウスは移植０日、１４日、３０日目に前述と同様の方法にてマイクロＣＴ撮影を行い、移植片とレシピエントの歯槽骨における結合を評価した。その後、移植片を含む顎骨を４％ＰＦＡにて固定し、１０％ギ酸‐クエン酸ナトリウム脱灰液にて脱灰し、パラフィン包埋した後に、厚さ８μｍの連続切片を作製し、ＨＥ染色にて組織学的評価を行った。
　図９にＣＴ画像、図１０にＨＥ染色像を示す。
　図９に示すとおり、移植１４日目には移植片とレシピエントの下顎第二臼歯歯槽骨間に部分的な結合が認められ、移植３０日目にはほぼ全周にわたり骨結合が認められた。図中、矢印は再生歯ユニットを示す。
　図１０に示すとおり、移植３０日目の組織像では、再生歯と下顎第二臼歯との槽間中隔歯槽骨が融合しており、再生歯ユニットが骨結合を介して移植部位の歯槽骨に生着している可能性が示された。また組織解析より、移植による偶発症として再生歯歯髄の一部に石灰化が認められた（１６例中３例）ものの、再生歯ユニットの歯根膜は移植後も維持されており、骨性癒着は認められなかった（１６例中０例）。図中、矢印は骨結合による生着を示し、スケールバーは１００μｍを示し、ＢＴは再生歯を、ＮＴは天然下顎第二臼歯を示す。　以上より、本発明の製造方法で製造された再生歯ユニットは、顎骨に移植すると良好に生着することが示された。
<実施例４：多数歯再生歯ユニットの作製>
　歯の大型欠損に対して移植可能な多数歯再生歯ユニットを作製する目的で、腎皮膜下移植においてスペーサーを用いて複数の再生歯胚の生体内培養を行った。
　マイクロピペットチップ（ＨＲＩ‐１１０Ｎｅｗ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏ　Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，ＳａｎＤｉｅｇｏ，Ｃａ，ＵＳＡ）を筒状に切断し、筒の断面形状が長径３ｍｍ・短径２ｍｍ・高さ１．３ｍｍの角丸四角形になるように成形してこれをスペーサーとして用い、その内部にコラーゲン溶液を満たして使用した。筒の高さ方向が将来の再生歯の厚み方向となるように、また、角丸四角形の短径方向が歯の伸長方向、角丸四角形の長径方向が歯の歯列方向となるように４つの再生歯胚を互いに接触させて配置した。その際、歯根方向への伸長を促すためスペーサー断面の角丸四角形の長辺にあたるうちの一方の壁面に再生歯胚の将来歯冠になる側をやや近接させて配置し、３７度のＣＯ２インキュベーター（三洋電機，大阪，日本）でコラーゲンゲルを硬化させた。スペーサー内に複数の再生歯胚を配置した状態について、模式図を図１２に示し、その写真を図１３に示す。図１２及び図１３は、筒状のスペーサーを筒の軸方向から見た図または写真である。次に、再生歯胚を含むスペーサーを７週齢Ｃ５７ＢＬ／６マウスの両側腎皮膜下に移植した。腎皮膜下への移植は、腎臓皮膜に５ｍｍの切開を入れ、腎臓皮膜と腎臓実質を剥離し、その間に複数の再生歯胚を含むスペーサーを挿入することにより行った。
　腎皮膜下移植６０日後に、腎臓から摘出したところ、複数の歯をもつ一塊の多数歯ユニットが得られた。腎皮膜下移植６０日後の多数歯ユニットについて、実体写真を図１４に示す。マイクロＣＴ（リガク，東京，日本）にて解析したところ、各々の歯の周囲に歯根膜腔、歯槽骨の槽間中隔が認められた。腎皮膜下移植６０日後の多数歯ユニットについて、Ｔ外観像及びＣＴ断面像を図１５に示す。このことから、本発明の製造方法の一態様として、それぞれ単一の歯に成長する個別の再生歯胚を、将来咬合面となる方向を揃えて配置して培養することにより、複数の個別の歯について、生来の歯と同様に歯冠－歯根方向が一方向にそろい、かつ、複数の歯が歯列を形成するように一列に並んだ状態の再生歯ユニットを得られることが示された。また、本発明の製造方法の一態様として、多数の再生歯胚を配置して作製された再生歯ユニットは、複数の歯が正常な組織構造を有して存在し、かつ、その歯根部分を覆うように歯槽骨が一体として形成されていることが示された。
<実施例５：多数歯ユニットの無歯顎モデルへの移植>
　４週齢Ｃ５７ＢＬ／６マウスの下顎第一、第二、及び、第三臼歯を抜歯し、無歯顎モデルを作製し、３日間の治癒期間を設けた。その後、同部の歯肉切開・剥離を行い、歯科用マイクロモーター（Ｖｉｖａ－Ｍａｔｅ　Ｐｌｕｓ，ナカニシ，東京，日本）を用いて歯槽骨を切削し、近遠心径３～４ｍｍ、頬舌径１．２ｍｍの移植窩を形成した。マウス腎臓皮膜下で作製した再生歯ユニットを、顎骨移植窩に埋入し、８－０ナイロン縫合糸（ベアーメディック，千葉，日本）で歯肉縫合した。
　多数歯ユニットを移植した無歯顎モデルマウスについてマイクロＣＴ撮影を行った。多数歯ユニットの口腔内移植後１日目のＣＴ画像を図１６に示す。本実施例の観察により多数歯ユニット歯槽骨とレシピエント歯槽骨との骨性結合による生着が示唆された。
　これにより、歯の欠損部位が大型である場合にも、その形状に適合する複数歯を含む再生歯ユニットを一度に移植できることが示され、移植された再生歯ユニットの歯周組織と移植された固体の顎骨とが良好に骨結合することが示唆された。また、移植後５０日目のＣＴ画像において、移植された再生歯ユニットの歯周組織と移植された固体の顎骨との骨の生着が観察された。

Claims (29)

  1. 　哺乳動物の生体内において再生歯胚を培養する再生歯ユニットの製造方法であって、下記工程を含み、
    　スペーサーを準備する工程、
    　前記再生歯胚を前記スペーサー内において前記哺乳動物の生体内に配置する工程、
    　前記再生歯胚を前記哺乳動物の生体内において培養する工程、
    　ここで、
    　前記スペーサーは、前記再生歯胚が最大許容値以上に伸長することを防止可能な構成であり、且つ、内部に配置された再生歯胚がスペーサー外部と連通可能な構成である、
    製造方法。
  2. 　請求項１に記載の再生歯ユニットの製造方法であって、前記哺乳動物が、非ヒト哺乳動物であることを特徴とする製造方法。
  3. 　請求項１又は請求項２のいずれかに記載の再生歯ユニットの製造方法であって、前記スペーサーは、さらに、前記哺乳動物の生体内の組織から前記再生歯胚に過剰な圧力がかかることを防止可能な構成であることを特徴とする製造方法。
  4. 　請求項１～請求項３のいずれか一項に記載の再生歯ユニットの製造方法であって、
    　前記再生歯胚を前記スペーサー内において前記哺乳動物の生体内に配置する工程は、再生歯胚の将来咬合面になる部位が前記スペーサーの内壁付近に面するように配置し、且つ将来根尖になる部位が前記スペーサーの当該内壁とは反対方向のより広い空間に向けて伸長するように配置する工程であることを特徴とする製造方法。
  5. 　請求項１～４のいずれか一項に記載の再生歯ユニットの製造方法であって、
    　前記再生歯胚を前記スペーサー内において前記哺乳動物の生体内に配置する工程は、前記スペーサー内を満たす支持担体によって前記再生歯胚が支持されるように配置されることを特徴とする製造方法。
  6. 　請求項１～請求項５のいずれか一項に記載の再生歯ユニットの製造方法であって、前記再生歯胚は、間葉系細胞で実質的に構成される第１の細胞集合体と、上皮細胞で実質的に構成される第２の細胞集合体を密着させて支持担体内部に配置されて培養・維持されたものであり、間葉系細胞と上皮細胞の少なくともいずれか一方が歯胚由来であることを特徴とする方法。
  7. 　請求項１～請求項６のいずれか一項に記載の再生歯ユニットの製造方法であって、前記再生歯胚を培養する際、前記哺乳動物の外部から機械的刺激を与える工程をさらに含むことを特徴とする製造方法。
  8. 　請求項７に記載の再生歯ユニットの製造方法であって、前記機械的刺激は、約２００００Ｈｚ～約４００００Ｈｚの振動であることを特徴とする製造方法。
  9. 　前記スペーサーは、所望の再生歯ユニットのサイズを有する再生歯ユニットを発生させることができる内部空間を有するものである、請求項１に記載の方法。
  10. 　前記スペーサーは略筒状であって、該筒の高さが、所望の再生歯ユニットの厚みより大きく、該筒の内径が、再生歯ユニットの長さの略最大許容値である、請求項９に記載の方法。
  11. 　前記スペーサーが、円筒状である、請求項１０に記載の方法。
  12. 　請求項１～請求項１１のいずれか一項に記載の再生歯ユニットの製造方法であって、前記再生歯胚が個別に調製された複数の再生歯胚を含むことを特徴とする方法。
  13. 　請求項１～請求項１２のいずれか一項に記載の再生歯ユニットの製造方法であって、前記再生歯胚が個別に調製された複数の再生歯胚を含み、前記スペーサー内において個別に調製された複数の再生歯胚を互いに隣接させて配置することを特徴とする方法。
  14. 　請求項１～請求項１３のいずれか一項に記載の再生歯ユニットの製造方法であって、前記再生歯胚が個別に調製された複数の再生歯胚を含み、前記スペーサー内において個別に調製された複数の再生歯胚を、各再生歯胚の将来咬合面になる部位の中心と将来根尖になる部位の中心とを結んだ軸線の方向を略並行にそろえて配置することを特徴とする方法。
  15. 　哺乳動物の生体内において、スペーサー内において配置され、培養することにより再生歯ユニットを製造するための再生歯胚組成物であって、前記スペーサーは前記再生歯胚が最大許容値以上に伸長することを防止可能な構成であり、且つ、内部に配置された再生歯胚がスペーサー外部と連通可能な構成であることを特徴とする再生歯胚組成物。
  16. 　請求項１５に記載の再生歯胚組成物において、前記再生歯胚が個別に調製された複数の再生歯胚を含むことを特徴とする再生歯胚組成物。
  17. 　哺乳動物の生体内において再生歯胚をその中にいれて培養することにより再生歯ユニットを製造するためのスペーサーであって、前記再生歯胚が最大許容値以上に伸長することを防止可能な構成であり、且つ、内部に配置された再生歯胚がスペーサー外部と連通可能な構成であることを特徴とするスペーサー。
  18. 　請求項１７に記載のスペーサーであって、前記スペーサーの内部に配置された再生歯胚が、個別に調製された複数の再生歯胚を含むことを特徴とするスペーサー。
  19. 　哺乳動物の生体内で再生歯胚を培養する工程を含む再生歯ユニットの製造方法であって、前記再生歯胚を培養する際、前記哺乳動物の外部から機械的刺激を与える、方法。
  20. 　請求項１９に記載の再生歯ユニットの製造方法であって、前記機械的刺激は、約２００００Ｈｚ～約４００００Ｈｚの振動であることを特徴とする方法。
  21. 　請求項１９または請求項２０に記載の再生歯ユニットの製造方法であって、前記再生歯胚は、間葉系細胞で実質的に構成される第１の細胞集合体と、上皮細胞で実質的に構成される第２の細胞集合体を密着させて支持担体内部に配置されて培養・維持されたものであり、間葉系細胞と上皮細胞の少なくともいずれか一方が歯胚由来であることを特徴とする方法。
  22. 　請求項１９～請求項２１のいずれか一項に記載の再生歯ユニットの製造方法であって、前記再生歯胚が個別に調製された複数の再生歯胚を含むことを特徴とする方法。
  23. 　動物の欠損した歯の修復方法であって、
    　請求項１～請求項１４、請求項１９～請求項２２のいずれか一項に記載の再生歯ユニットの製造方法で製造された再生歯ユニットを、前記欠損した部位に移植する工程を含む、方法。
  24. 　請求項２３に記載の動物の欠損した歯の修復方法であって、前記動物が非ヒト哺乳動物であることを特徴とする方法。
  25. 　請求項２３～請求項２４のいずれか一項に記載の動物の欠損した歯の修復方法であって、前記再生歯ユニットが、歯冠－歯根方向が略並行にそろった複数の歯を含むことを特徴とする方法。
  26. 　請求項１～請求項１４、請求項１９～請求項２２のいずれかに記載の再生歯ユニットの製造方法で製造された再生歯ユニット。
  27. 　動物の口腔内の欠損した歯を修復するために欠損部に移植するための、請求項１～請求項１４、請求項１９～請求項２２のいずれかに記載の再生歯ユニットの製造方法で製造された再生歯ユニット。
  28. 　請求項２６または請求項２７に記載の再生歯ユニットであって、歯冠－歯根方向が略並行にそろった複数の歯を含むことを特徴とする再生歯ユニット。
  29. 　請求項２６または請求項２７に記載の再生歯ユニットであって、歯冠－歯根方向が略並行にそろった複数の歯を含み、歯周組織が一体として形成されていることを特徴とする再生歯ユニット。
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