CN102869390A - 再生牙齿单元的制造方法 - Google Patents

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Abstract

在本发明公开的再生牙齿单元的制造方法中，再生牙胚在体内培养时，不会因空间或压力而限制牙齿的形状，并且能够控制牙齿的伸长。即使在牙齿的缺损部位较大的情况下，所述方法也能够进行再生牙齿的移植。本发明公开的一种方法包含在哺乳动物体内，在间隔构件内配置再生牙胚并培养的步骤。其中所述间隔构件具有能够防止所述哺乳动物体内的组织对所述再生牙胚施加过多压力、以及防止再生牙胚的伸长超过最大容许值的构造。而且，所述间隔构件具有能够使置于其内部的再生牙胚与间隔构件外部连通的构造。另外，公开的另一种方法包含在哺乳动物体内，在间隔构件内配置并培养多个再生牙胚的步骤。

Description

再生牙齿单元的制造方法
技术领域
本发明涉及可控制其大小及形状的再生牙齿单元的制造方法等。
背景技术
牙齿是一种具有最外层为牙釉质，内层为牙本质的硬组织，并于其内侧有产生牙本质的成牙质细胞，中心部为牙髓的器官。牙齿常会因龋齿或牙周病而缺损，而牙齿的有无大大影响外观及品尝食物的味道，因此为了保持健康或高质量的生活，目前正逐渐重视牙齿的再生技术。
牙齿是由胚胎期发育过程的诱导而形成，且是以多种细胞株为基础而构造的功能单位。因此，牙齿并非由成年人体内产生细胞株的干细胞如造血干细胞或间叶干细胞等干细胞的干细胞系统所发育，仅以目前再生医疗使用的干细胞移植(干细胞移植疗法)，无法再生牙齿。此外还研究了，通过鉴定出在牙齿发育过程中具有特定表达的基因，从而人为诱导牙胚的牙齿再生法，但仅通过特定基因，并无法完全地诱导牙齿的再生。
因此近年来开始研究用自牙胚分离得到的组织或细胞，再构建牙胚，将其培养后获得由牙齿与牙周组织所构成的再生牙齿单元，通过移植该再生牙齿单元至口腔内而获得再生牙齿的方法。
迄今为止，本发明的发明人发现通过使用间叶细胞和上皮细胞，其中这些细胞中至少一种细胞是来自牙胚的细胞，然后将实质上由间叶细胞形成的第1细胞团块与实质上由上皮细胞形成的第二细胞团块以紧密接触的方式，放置于由胶原蛋白凝胶等所形成的支持载体的内部，然后于支持载体的内部培养第1和第2细胞团块，可产生能有效诱导细胞分化和具有特定的细胞配置及方向性的再生牙胚或再生牙齿单元(例如参照专利文献1)。
另外还发现，利用口腔内上皮细胞或其初代培养细胞作为上皮细胞时(例如参照专利文献2)，利用来自羊膜的细胞作为间叶细胞时(例如参照专利文献3)，以及将全能干细胞经分化诱导后的细胞利用为间叶细胞时(例如参照专利文献4)，均可同样获得具有特定的细胞配置和取向的再生牙胚或再生牙齿单元。
进一步研究表明，制作再生牙胚时，通过调整再生牙胚所含牙釉结的数目，可控制形成的再生牙齿的数目(例如参照专利文献5)。
由于牙齿因部位或个人差异其大小或形状均有所不同，因此在制作再生牙胚或再生牙齿单元时，控制其大小或形状十分重要。特别是再生适合缺损牙齿部位的牙齿时，若制作出的牙齿不具有与缺损牙齿相同的大小及形状，则将无法发挥其必要的功能。
作为制作具有期望大小或形状的再生牙齿的方法，有人提出将含有形成牙乳头与牙本质的来自牙髓的间叶细胞，及有助于形成牙釉质的上皮细胞的牙胚细胞混合物，接种于通过固化由聚甘醇酸-聚醋酸共聚物等形成的生物可降解性的聚合物而形成的结构架上，再移植至动物体内的形成牙齿的方法。在该方法中，曾尝试使用一定形状的结构架，控制牙齿的形状。然而，由于再生牙齿来自由上皮细胞层与间叶细胞层所形成的牙胚，而牙胚的发育伴随着在上皮细胞层与间叶细胞层间所产生的长时间的上皮/间叶相互作用，而使用结构架无法获得充分的细胞间的相互作用，因此也有不希望使用结构架的意见(例如参照非专利文献1)。另外由于牙齿的形成速度比结构架的分解速度快，可以预料形成的牙齿可能会将结构架卷入，因此细胞配置及牙齿形状的再现性必然不高。
另一方面，制作再生牙齿单元时，亦可使用将再生牙胚移植至动物体内进行培养的方法。在体内进行培养时，由于可接受来自动物细胞的各种细胞激素的作用以及来自周围的营养供给，移植物易形成组织学上正常的组织，亦可加速牙齿及牙周组织的培养。体内移植，例如可以为目前广泛使用的肾被膜下移植。
然而将再生牙胚于例如肾被膜下等体内培养时，有时会因被膜压力及移植空间而限制再生牙齿的大小或形状。具体而言，再生牙胚受到来自侧面的压力，牙齿咬合面的形状容易被破坏。
另外在生物体内培养也难以控制牙齿的伸长。特别是再生牙齿长成超过所需的长度时，无法直接将其移植至颌骨上。
将再生牙胚在动物体内培养的方法中，由于几乎没有机械性的刺激，无法充分使牙周膜产生及发育。牙周膜具有维系牙根与牙槽骨的功能，以及减缓来自牙齿的压力、感觉牙齿咬合等功能，因此为使再生牙齿具有与原有的牙齿相同的功能，牙周膜是一个的重要因素。
先前技术文献
专利文献
专利文献1：国际公开第2006 129672号手册
专利文献2：特开2008-29756号公报
专利文献3：特开2008-206500号公报
专利文献4：特开2008-200033号公报
专利文献5：特开2008-29757号公报
非专利文献
非专利文献1：Hu et al.Tissue Engineering Volume 12，Number 8，2006，2069-2075
发明内容
[发明要解决的技术问题]
本发明的目的是解决于体内培养再生牙胚时所伴随的问题。具体而言，其目的在于提供一种即使在体内培养再生牙胚，也不会因压力及空间而限制牙齿形状，同时可控制牙齿伸长的方法。另一目的在于提供一种可于牙根周围形成充分的牙周膜的方法。另外，本发明的目的还在于提供一种即使牙齿缺损部位较大时，亦可移植再生牙齿的方法。
[解决问题的手段]
为解决上述问题，本发明的发明人经过反复研究发现在动物的体内培养再生牙胚时，通过将再生牙胚配置于间隔构件内，可防止来自所述生物体组织的压力所造成的变形，另外也可控制牙齿长度不会伸长到超过需要的长度。
另外本发明的发明人发现，在动物的体内培养再生牙胚时，通过自该动物的外部给予机械性的刺激，可使牙周膜在牙根周围充分生长发育。
本发明的发明人进一步发现，在动物体内培养再生牙胚时，通过将多个分别单独制备的再生牙胚并排培养，可获得包含多个再生牙胚或再生牙齿的再生牙齿单元，且可无需经过分离等步骤而直接将牙齿移植至较大的牙齿缺损部位。
亦即本发明涉及一种在哺乳动物的体内培养再生牙胚的再生牙齿单元的制造方法，其包含下述步骤：
准备间隔构件；
将在所述间隔构件内的所述再生牙胚配置于所述哺乳动物的体内；
在所述哺乳动物体内培养所述再生牙胚；
其中，
所述间隔构件具有可防止所述再生牙胚的伸长超过最大容许值的构造，且具有可使置于其内部的再生牙胚能够与间隔构件外部连通的构造。
在本发明的再生牙齿单元制造方法的一个实施方案中，所述哺乳动物为非人类的哺乳动物。
在本发明的再生牙齿单元制造方法的一个实施方案中，所述间隔构件进一步具有能够防止所述哺乳动物的体内组织对所述再生牙胚施加过多压力的构造。
在本发明的再生牙齿单元制造方法的一个实施方案中，其特征在于，
将所述再生牙胚置于所述间隔构件内并配置于所述哺乳动物体内的步骤，是能够使再生牙胚的未来为咬合面的部位配置在所述间隔构件的内壁附近，并面向所述间隔构件内壁，且使未来为根尖的部位配置为朝向所述间隔构件的所述内壁的相反方向的更大空间伸长的步骤。
在本发明的再生牙齿单元制造方法的一个实施方案中，
将所述再生牙胚置于所述间隔构件内并配置于所述哺乳动物体内进行培养的步骤，是以填满所述间隔构件内部的支持载体来支持所述再生牙胚的方式进行配置。
在本发明的再生牙齿单元制造方法的一个实施方案中，所述再生牙胚的培养及维持，是通过实质上由间叶细胞构成的第1细胞集合体，与实质上由上皮细胞构成的第2细胞集合体在支持载体内紧密接触配置而进行的，其中间叶细胞与上皮细胞至少一方需是来自牙胚。
在本发明的再生牙齿单元制造方法的另一个实施方案中，在培养所述再生牙胚时，进一步还包含自所述哺乳动物的外部给予机械性的刺激的步骤。
在本发明的再生牙齿单元制造方法的另一个实施方案中，所述机械性的刺激是大约20000Hz到大约40000Hz的振动。
在本发明的再生牙齿单元制造方法的一个实施方案中，所述间隔构件具有能够使再生牙齿单元发育成期望大小的再生牙齿单元的内部空间。
在本发明的再生牙齿单元制造方法的另一个实施方案中，所述间隔构件大致呈筒状，所述筒的高度比期望的再生牙齿单元的厚度大，且所述筒的内径约为再生牙齿单元长度的最大容许值。
在本发明的再生牙齿单元制造方法的另一个实施方案中，所述间隔构件呈圆筒状。
在本发明的再生牙齿单元制造方法的另一个实施方案中，所述再生牙胚由多个分别单独制备的再生牙胚组成。
在本发明的再生牙齿单元制造方法的另一个实施方案中，所述再生牙胚包含多个分别单独制备的再生牙胚，且在所述间隔构件内使多个分别单独制备的再生牙胚以相互邻接的方式配置。
在本发明的再生牙齿单元制造方法的另一个实施方案中，所述再生牙胚包含多个分别单独制备的再生牙胚，且使多个分别单独制备的再生牙胚在间隔构件内，以调整使各再生牙胚的未来为咬合面部位的中心，与未来为根尖部位的中心的连结轴线方向为大致平行的方式进行配置。
另外，根据本发明的另一个实施方案，本发明还涉及一种再生牙胚组合物，即通过将其配置于间隔构件内，在哺乳动物体内进行培养，以制造再生牙齿单元的再生牙胚组合物，其特征在于，所述间隔构件具有能够防止所述再生牙胚的伸长超过最大容许值，且使置于其内部的再生牙胚能够与间隔构件外部连通的构造。
在本发明的再生牙胚组合物的另一个实施方案中，其特征在于所述再生牙胚包含多个分别单独制备的再生牙胚。
另外，根据本发明的另一个实施方案，本发明还涉及一种间隔构件，即在哺乳动物体内，将再生牙胚置于其中进行培养以制造再生牙齿单元的间隔构件，其特征在于：具有能够防止所述再生牙胚的伸长超过最大容许值，且使置于其内部的再生牙胚能够与间隔构件外部连通的构造。
在本发明的间隔构件的另一个实施方案中，配置于所述间隔构件内部的再生牙胚包含多个分别单独制备的再生牙胚。
另外，根据本发明的另一个实施方案，本发明涉及一种方法，即一种包含在哺乳动物体内培养再生牙胚步骤的再生牙齿单元的制造方法，其中，
培养所述再生牙胚时，自所述哺乳动物外部给予机械性的刺激。
另外，在本发明的再生牙齿单元制造方法的另一个实施方案中，所述机械性的刺激是大约20000Hz到大约40000Hz的振动。
另外，在本发明的再生牙齿单元制造方法的另一个实施方案中，所述再生牙胚的培养及维持，是通过实质上由间叶细胞构成的第1细胞集合体，与实质上由上皮细胞构成的第2细胞集合体在支持载体内紧密接触配置而进行的，其中间叶细胞与上皮细胞至少一方需是来自牙胚。
另外，在本发明的再生牙齿单元制造方法的另一个实施方案中，所述再生牙胚包含多个分别单独制备的再生牙胚。
根据本发明的另一个实施方案，本发明还涉及一种动物缺损牙齿的修复方法，
其包含将再生牙齿单元移植至所述缺损部位的步骤，其中再生牙齿单元是用上述再生牙齿单元制造方法所制造的。
在本发明的动物缺损牙齿的修复方法的一个实施方案中，其中所述动物是非人类的哺乳动物。
在本发明的动物缺损牙齿的修复方法的一个实施方案中，其中所述再生牙齿单元包含调整齿冠-齿根方向为大致平行的多个牙齿。
另外，根据本发明的另一个实施方案，本发明还涉及一种再生牙齿单元，其是用上述的再生牙齿单元的制造方法所制造。
根据本发明另一个实施方案，本发明涉及一种再生牙齿单元，即为了修补动物口腔内缺损的牙齿，用上述再生牙齿单元的制造方法制造的、用以移植至缺损部位的再生牙齿单元。
在本发明的再生牙齿单元的另一个实施方案中，所述再生牙齿单元包含调整齿冠-齿根方向为大致平行的多个牙齿。
在本发明的再生牙齿单元的另一个实施方案中，所述再生牙齿单元包含调整齿冠-齿根方向为大致平行的、且牙周组织为一体化地形成的多个牙齿。
[发明的效果]
根据本发明，即使在动物的体内培养再生牙胚，亦不会受到来自所述动物的组织等的过多压力，能够使牙齿生长成自然的形状。另外亦可防止牙齿伸长到超过需要的长度。
另外根据本发明，即使在动物的体内培养再生牙胚，亦可获得具有充分的牙周膜组织的再生牙齿。
而且，根据本发明的一个实施方案，对于较大的骨头缺失部位，无需一次一颗的移植单个的再生牙齿，可一次移植包含多个再生牙齿的再生牙齿单元。此外，根据本发明另一个实施方案，由于含多个再生牙齿的牙槽骨是一体化地形成的，因此可整体地移植通过一体化的牙槽骨稳固支撑的一体化物，不会在移植时或移植后出现多个再生牙齿的方向参差不齐的问题。
附图说明
图1是根据本发明的再生牙齿单元制造方法，在配置于小鼠肾被膜下的间隔构件内进行培养的再生牙胚的照片。
图2是使用间隔构件制作的再生牙齿单元的显微CT影像。
图3是未使用间隔构件制作的再生牙齿单元的显微CT影像。
图4显示的是在CT影像上测定及计算的使用间隔构件制作的再生牙齿单元(控制)、未使用间隔构件制作的再生牙齿单元(非控制)、及天然牙齿的牙冠部的长径/短径比的结果。
图5显示的是在CT影像上测定的使用间隔构件制作的再生牙齿单元(控制)、及未使用间隔构件制作的再生牙齿单元(非控制)的长度。
图6是在体内培养再生牙胚同时给予机械性刺激制作的再生牙齿单元、与未给予刺激而制作的再生牙齿单元的HE染色照片。
图7显示的是在CT影像上测定的在体内培养再生牙胚同时给予机械性刺激而制作的再生牙齿单元，与未给予刺激而制作的再生牙齿单元的牙周膜的宽度。
图8显示的是将用本发明的方法制造的再生牙齿单元移植至颌骨的情形。
图9是将用本发明的方法制造的再生牙齿单元移植至颌骨后0天、第14天、第30天的CT影像。
图10是将用本发明的方法制造的再生牙齿单元移植至颌骨后第30天的HE染色照片。
图11是简要显示置于间隔构件内的再生牙胚配的状态的平面图及侧面图。
图12是显示置于间隔构件内的多个再生牙胚的状态的示意图。
图13是显示置于间隔构件内的多个再生牙胚的状态的实体照片。
图14是移植于肾被膜下60天后的含多颗牙齿的再生牙齿单元的实体照片。
图15是移植于肾被膜下60天后的含多颗牙齿的再生牙齿单元的CT影像。(a)为CT外观影像，(b)的左侧为齿列方向的CT剖面影像，(b)的右侧为颊舌方向的CT剖面影像。
图16是将含多颗牙的再生牙齿单元移植至口腔后第1天的CT影像。
具体实施方式
根据本发明牙齿制造方法的第一个实施方案，即一种包含在哺乳动物体内培养配置于间隔构件内的再生牙胚步骤的再生牙齿单元的制造方法，其特征在于：所述间隔构件具有能够防止所述非人类的哺乳动物的体内组织对所述再生牙胚施加过多压力、且防止所述再生牙胚的伸长超过最大容许值的构造，以及具有使置于其内部的再生牙胚能够与间隔构件外部连通的构造。这里的“能够连通”是指间隔构件内部与外部之间，可经由间隔构件，使营养物质及细胞激素等物质通过。亦即具有物质的供给通路。
本说明书中的“牙齿”是指具有连续的内部牙本质层及外部牙釉质层的组织，亦指具有牙冠或牙根且具备方向性的组织。牙齿的方向性可根据牙冠及牙根的位置而确定。可以基于形状及组织染色等直观地辨认牙冠及牙根。牙冠是指具有牙釉质层与牙本质层构造的部分，而牙根则不具有牙釉质层。
所属领域的技术人员可通过如组织染色等容易地确定出牙本质及牙釉质。另外，牙釉质可通过存在有成釉细胞而确定，而成釉细胞的存在则可通过有无牙釉蛋白来确认。另一方面，牙本质可通过存在有成牙质细胞而确定，而成牙质细胞的存在则可通过有无牙本质涎蛋白而确认。运用所属领域公知的方法例如原位杂交、抗体染色等，能够很容易地确认牙釉蛋白及牙本质涎蛋白。
本说明书中，“牙胚”是未来被定义为牙齿的牙齿的初期胚，即指牙齿发育阶段一般所使用的牙蕾期(Bud stage)至钟形期(Bell stage)，特别是指未发现有被视为牙齿硬组织特征的牙本质及牙釉质的蓄积的组织。另一方面，本说明书中，“牙芽”是指比“牙胚”发育阶段靠后的组织，即被视为牙齿硬组织特征的牙本质及牙釉质开始蓄积之后，至牙齿自牙龈萌发出并表现一般牙齿功能之前的阶段的组织。
本说明书中“再生牙胚”是指通过细胞培养技术，人工形成的牙胚。
本说明书中，“再生牙齿单元”是指由牙齿与支持牙齿的牙周组织所构成的单元，其是通过培养再生牙胚，使再生牙胚所含的各种细胞分化的结果所得。
再生牙齿单元中的牙齿部分，具有自上述牙芽至牙齿阶段的构造。另外，牙周组织包含牙周膜与牙槽骨。
换而言之，在哺乳动物的体内培养再生牙胚，可获得再生牙齿单元，将再生牙齿单元移植至口腔内并使其融合为一体，或萌出、成长即可获得再生牙齿。
本说明书中，间隔构件是指设置的一个能够覆盖再生牙胚的器具，从而在哺乳动物的体内培养再生牙胚时，能够使得再生牙胚的伸长不超过所需的长度。另外，所述间隔构件在例如肾被膜下等生物体内培养时，可起到防止再生牙胚受到膜的压力及来自生物体内的组织的过多压力的作用。只要能达到这些目的，所述间隔构件的形状可为任何一种形状。
亦即，只要能够确保允许具有期望的再生牙齿单元尺寸(主要为长度和厚度)的再生牙齿单元生长的内部空间，间隔构件的形状可为任意形状。再生牙齿单元的长度是指，自再生牙齿单元的牙齿部分的未来为咬合面的部位，至未来为牙根尖的部位的长度。当在未来为根尖的部位的周围形成牙周组织时，就是指到其前端(距离未来为咬合面部位最远的部位)的距离。再生牙齿单元长度的大概的最大容许值是指在哺乳动物的体内培养再生牙胚后，所获得的再生牙齿单元的长度的可被容许的最大值。所述大概的最大容许值可根据移植再生牙胚的对象及部位，由所属领域的技术人员适当地加以确定。再生牙齿单元的厚度一般是指再生牙齿单元牙冠部分的厚度，但当在未来为根尖的部位的周围形成牙周组织时，也可指具有牙周组织的部分的厚度。如同人类的牙齿，牙冠部的剖面一般并非为标准的正方形或长方形，而是通过长径与短径来规定。
根据常识，既然可一定程度地控制再生牙胚的伸长方向，因此在间隔构件的内部配置再生牙胚组合物时的再生牙胚组合物本身的方向，或者其在间隔构件内部的相对位置，可依照期望的伸长的方向任意调整。因此，为获得期望尺寸的再生牙胚，在设计间隔构件立体的大小时可考虑再生牙胚组合物伸长的方向。
一般而言，间隔构件的内部空间必须比期望的再生牙齿单元稍大些。换言之，间隔构件的内部空间，需具有防止再生牙齿单元伸长至超过最大容许值的作用。
以下针对间隔构件的形状为上下开口的圆筒状(环状的)的情况进行说明。根据本说明书所公开的内容，所属领域的技术人员能够较容易地设计具有期望形状的间隔构件。
形状为上下开口的圆筒状(环状的)时，通过上下的开口，可充分确保来自间隔构件外部的营养供给通路，从而能够形成再生牙齿单元。
另外，使用所述圆筒状(环状的)的间隔构件时，若将再生牙胚的伸长方向设定为圆筒环的横向(例如为圆筒径向)，则圆筒的纵向(亦即为圆筒的高度)，可按照能够获得期望的再生牙齿单元咬合面的厚度，并且不超过最大容许值的要求来设定。另外，为防止再生牙齿单元伸长至超过需要的长度，可将圆环的内径设定为期望的再生牙齿单元长度的大概的最大容许值。
在使用所述圆筒状的间隔构件时，若以环的内径方向作为伸长方向来配置再生牙胚，则纵向(高度方向)即为再生牙齿单元的牙冠宽度，筒的高度在培养人类牙齿时为例如3-15mm，优选为5-12mm，培养小鼠牙齿时为例如0.4-2.0mm，优选为0.6-1.8mm，其内径(内直径)在培养人类牙齿时为10-30mm，优选为15-26mm，培养小鼠牙齿时为0.9-2.0mm，优选为1.2-1.9mm。
进而在利用大致呈圆筒状的间隔构件时，通过将再生牙胚未来为咬合面的部位以面向间隔构件内壁的方式配置在内壁附近，且将未来为根尖的部位配置为朝向筒的内径方向，再生牙胚就不会受到来自生物体组织的过多的压力，且可防止再生牙胚伸长至超过需要的长度，并且能够与外部连通，可确保物质供给路径。
再生牙胚的咬合面不会因压力而损坏，能够以自然的形状生长，牙齿会沿筒的直径方向伸长，一般能够在到达相对的侧壁之前、或到达之后，在未达最大容许值的长度时停止伸长。
再生牙胚可通过间隔构件壁而避免来自筒的水平方向的压力，同时，通过间隔构件的上口及下口的边沿，一般也能避免来自上下方向的压力。
所属领域的技术人员在生物体内制造再生牙齿单元时，为达到本说明书期望的目的，或为达到一些情况下需要的其他目的，可不限于圆筒状，可使用任意的期望形状的间隔构件而不用局限于圆筒状。例如可以为那些具有椭圆或多角形底面的，或球状物来取代圆筒，但并不限定于此。
本发明的间隔构件具有能够使配置于其内部再生牙胚与间隔构件外部连通的构造。由于再生牙胚需要接受来自哺乳动物体内组织的营养等供给，或者受到动物细胞产生的细胞激素的作用，因此必须确保使这些物质到达间隔构件内的再生牙胚的供给路径。为了使其为可连通的构造，间隔构件的形状，可形成大小及个数不限的足够供给物质的孔。例如，在间隔构件为圆筒状时可以有一个局部大孔，在其为网状时可以有无数个遍及整个间隔构件的小孔。另外，如果间隔构件的材质是能够使物质渗透的材料，也可以没有孔。
本说明书中的哺乳动物并没有特别限定，只要能够在生物体内培养再生牙胚也可为非哺乳动物。例如可以为牛、马、猪、犬、猫、以及小鼠，优选为猪和小鼠，特别优选的是与牙胚组织为同种类的动物。当移植到与牙胚组织不同种的动物体内进行培养时，优选是使用改造得到的有免疫缺陷的动物。为使动物细胞的器官或组织尽可能的正常发育，作为体内适合生长的部位，优选是肾被膜下、肠系膜、皮下等。
移植后的培养时间因移植时牙齿的大小以及将要发育成的牙齿的大小而异，一般可为3天-400天。例如移植至肾被膜下时，虽然因依移植时牙胚的大小及需要再生的牙齿的大小而异，但优选是约为7天-60天。
对于间隔构件的材质并没有特别限定，只要具有能够防止来自体内组织的压力的充分的硬度即可，例如可为金、银、铁、铜、铝、聚乙烯、树脂、牙科用树脂、牙科粘固粉等。
另外，在本发明的再生牙齿单元的制造方法中，将再生牙胚配置于间隔构件内进行培养的步骤，优选的是通过在间隔构件内填满支持载体，再将再生牙胚配置于所述支持载体内进行的。
支持载体只要能满足能够使细胞在其内部进行培养即可，并没有特别限定，但优选的是例如凝胶状、纤维状、固体状的支持载体，通过使用这样的支持载体，可进一步防止体内的再生牙胚受到过多的压力。
本发明所使用的支持载体可举出例如胶原蛋白、琼脂糖胶、羧甲基纤维素、明胶、琼脂、水凝胶、CellMatrix(商品名)、Mebiolgel(商品名)、Matrigel(商品名)、弹性蛋白、纤维蛋白、层粘连蛋白(laminin)、细胞外基质混合物、聚乙醇酸(PGA)、聚乳酸(PLA)、乳酸/乙醇酸共聚物(PLGA)等。其中，优选的是具有适当的硬度及保持力的胶原蛋白、琼脂糖胶、羧甲基纤维素、明胶、琼脂、水凝胶、CellMatrix、Mebiolgel、Matrigel、细胞外基质混合物、弹性蛋白、纤维蛋白、层粘连蛋白。
例如可使用液态的支持载体，于其中放入再生牙胚后再将其硬化。例如，以胶原蛋白溶液填充满间隔构件内部，再在将再生牙胚放入胶原蛋白溶液中之后，通过在37℃的CO2恒温箱中进行培养，可使胶原蛋白凝胶化。接着，可将再生牙胚连同间隔构件一起，配置于哺乳动物体内进行培养。
另外，本发明的另一个实施方案是一种牙齿的制造方法，即包含在哺乳动物体内培养再生牙胚的步骤的牙齿的制造方法，其特征在于，在培养再生牙胚时，自哺乳动物的外部给予机械性的刺激。
通过给予的机械性的刺激，可促进再生牙齿单元的牙周膜的形成。机械性的刺激可举出例如震动、压迫、摩擦等，但并不局限于这些方式。例如可给予接近声波频率(例如约20000Hz-40000Hz)的震动。
如上所述，在本发明的使用间隔构件制造再生牙齿单元的方法中，优选的是在生物体内培养再生牙胚时，自哺乳动物的外部给予机械性的刺激。
接下来将说明本发明的方法中所使用的再生牙胚。
再生牙胚可以是那些由任一种方法制作得到的，例如它可以通过包含以下步骤的方法制作得到：使实质上由间叶细胞构成的第1细胞集合体，与实质上由上皮细胞构成的第2细胞集合体紧密接触，然后再在支持载体内部培养第1和第2细胞集合体。在本说明书中，为了方便区别两种细胞集合体，将实质上由间叶细胞构成的细胞集合体称为第1细胞集合体，但其实也可以将实质上由上皮细胞构成的细胞集合体称为第1细胞集合体，哪一个细胞集合体被称为第1细胞集合体并不重要。
本发明中“间叶细胞”是指来自间叶组织的细胞及培养该细胞所得的细胞，“上皮细胞”是指来自上皮组织的细胞及培养该细胞所得的细胞。
另外，本发明中“牙周组织”是指在牙齿的外层形成的牙槽骨和牙周膜。所属领域的技术人员可通过例如组织染色很容易地确定牙槽骨和牙周膜的形态。
“使实质上由间叶细胞构成的第1细胞集合体，与实质上由上皮细胞构成的第2细胞集合体紧密接触而配置”的步骤，例如可参照专利文献1至5，本说明书参照了该各个文献的公开内容并进行了组合概括。
上述的第1细胞集合体及第2细胞集合体，分别实质上仅由间叶细胞或仅由上皮细胞构成。“实质上仅由间叶细胞构成”在本发明中是指，一个细胞集合体可达到与仅由间叶细胞构成时一样的功能的、且尽量不含有形成间叶细胞以外的细胞的状态。“实质上仅由上皮细胞构成”的也是同样的情况。
细胞集合体是指细胞呈紧密接触的状态，可以是组织，也可以是由零散的细胞所制备的细胞团块。使用组织时，优点是可容易地获得细胞配置或形状正确的牙齿，但可获得的量有限。由于细胞团块也可以使用培养的细胞，相比之下较易获得，所以优选使用细胞团块。根据本发明的方法，即使使用细胞团块，也可获得细胞配置或形状正确的再生牙齿。
构成细胞集合体的间叶细胞和上皮细胞至少一方是来自牙胚。借此能够在体内再现细胞的配置，且能够有效地形成具有特定构造及方向性的牙齿。优选的是间叶细胞和上皮细胞两者均来自牙胚。就细胞分化阶段的幼小性及均质性而言，所述牙胚优选为来自牙蕾期至帽状期的牙胚。
也可使用来自体内其他间叶组织的细胞作为来自牙胚以外的间叶细胞。优选为不含血液细胞的骨髓细胞或间叶细胞，进一步优选为口腔内间叶细胞及颌骨内部的骨髓细胞、来自颅神经嵴细胞的间叶细胞、可分化成这些间叶细胞的间充质祖细胞及其干细胞等。使用来自羊膜的细胞作为间叶细胞的例子可参照专利文献3，使用由全能干细胞分化诱导的细胞的例子在专利文献4中有记载，通过全面地引用它们，在本说明书中对它们的公开内容进行了概括。
也可使用来自体内其他的上皮组织的细胞作为来自牙胚以外的上皮细胞。优选为皮肤或口腔黏膜或牙龈的上皮细胞，进一步优选为由诸如皮肤及黏膜等的未成熟的上皮原始细胞分化的例如角质化或错角化的上皮细胞，例如非角质化的上皮细胞及其干细胞等。使用口腔内上皮细胞及其初代培养细胞作为上皮细胞的例子可参考专利文献2，通过全面地引用，在本说明书中对它的公开内容进行了概括。
牙胚及其他组织可从哺乳动物的灵长类(例如人类、猴子)、有蹄类(例如猪、牛、马)、小型啮齿类哺乳动物(例如小鼠、大鼠、兔子)、以及犬、猫等各种动物的颌骨中采集。牙胚及组织的采集可直接使用通常使的采集组织的条件，在无菌状态下取出，再保存在适当的保存液中即可。另外，人类的牙胚的例子包括第3臼齿也就是所谓的智齿的牙胚以及胎儿牙胚。就利用自体组织而言，优选是使用智齿的牙胚。另外，使用小鼠牙胚时，优选是使用胎儿龄10天至16天的牙胚。
制备来自牙胚的间叶细胞和上皮细胞时，首先进行的是，将从周围组织分离的牙胚，按照形状分成牙胚间叶组织和牙胚上皮组织。此时为容易进行分离，可使用酶，例如分散酶(dispase)、胶原蛋白酶、胰蛋白酶等。
本发明中细胞团块是指聚集的来自间叶组织或上皮组织的细胞，可通过聚集分散间叶组织或上皮组织后获得的细胞，或聚集由该细胞初代或传代培养所得细胞而制备。
为了分散细胞，可使用例如分散酶、胶原蛋白酶、胰蛋白酶等酶。为获得足够的细胞数，在制备细胞团块前，对分散细胞进行初代或传代培养时，所用的培养基可使用通常用于培养动物细胞的培养基，例如可使用Dulbecco`s改良培养基(DMEM)等。为促进细胞增殖可添加血清，或血清替代物，例如FGF、EGF、PDGF等细胞增长因子或转铁蛋白等已知的血清成分。另外，添加血清时的浓度，可依据当时的培养状态适当地进行变更，但通常10％左右。有关细胞培养，可使用通常的培养条件，例如在约37℃的并具有5％的CO2浓度的恒温箱内进行培养。另外也可适当地添加链霉素等抗生素。
为使细胞聚集，例如可将细胞悬浮液进行离心处理。为了确保间叶细胞团块和上皮细胞团块在紧密接触时的细胞相互作用，优选的是分别使其保持高密度的状态。高密度状态是指一种具有与构成组织时相同密度的程度，例如为5×107个细胞/ml-1×109个细胞/ml，优选的是1×108个细胞/ml-1×109个细胞/ml，特别优选的是2×108个细胞/ml-8×108个细胞/ml。使细胞团块具有高密度的方法并没有特别限定，例如可通过将细胞离心处理后，使其聚集沉淀的方法进行。优选的是用离心处理的方法，因为离心分离作用能够很容易地形成高密度且不会破坏细胞活性。离心处理能够以可提供300×g-1200×g的离心力的旋转速度进行，优选是以500×g-1000×g的离心力离心分离3分钟-10分钟。低于300×g的离心处理，会有细胞密度无法充分提高的倾向，反之，高于1200×g的离心处理，则有可能使细胞受损。
通过离心分离制备高密度的细胞团块时，一般先在用作细胞离心分离的试管等容器内，配制好细胞悬浮液后，再进行分离，然后尽可能去除上清液，留下呈沉淀的细胞。此时，优选的是目标细胞以外的成份(例如培养基、缓冲液)小于等于细胞的量，特别优选的是不含目标细胞以外的成分。将这种高密度的细胞集合体以后述方法放入支持载体内使其紧密接触，细胞紧密的接触，能够有效地发挥细胞间的相互作用。
可以使用与上述配置于间隔构件内的支持载体一样的支持载体。为培养第1和第2细胞集合体所使用的支持载体，优选的是具有能够保持细胞集合体紧密接触的状态、不使细胞分散的保持力。紧密接触状态是指上述的高密度的间叶细胞和上皮细胞的细胞集合体，在间叶细胞和上皮细胞的接触面附近，也保持者相同程度的高密度状态。能够保持紧密接触状态的支持载体，例如在使用胶原蛋白时，为提供适当的硬度，所用的最终浓度为2mg/ml-3mg/ml，亦即根据JIS-K6503-1996方法(使用12.7mm直径的柱塞，测定下压4mm所需要的荷重)测得的能够形成120g-250g的凝胶强度的浓度。其他类型的支持载体，如果通过类似的评价方法测得具有近似的强度，也可作为本发明的支持载体优选使用。另外可通过混合1种或多种支持载体，也可获得具有相当于目标凝胶强度的硬度的支持载体。
将第1和第2细胞集合体配置于支持载体内的方法并没有特别限定，当细胞集合体为细胞团块时，例如上述通过离心分离得到的沉淀物，能够通过微量注射器等插入支持载体内进行配置。当细胞集合体为组织时，可通过使用注射器的针尖等将其配置于支持载体内的任意位置上。
本发明中，并未限制用支持载体使第1和第2细胞集合体紧密接触的方法，例如，可先将其中一种细胞集合体配置于支持载体内之后，再将另一种细胞集合体以压放在前述细胞集合体的上方的方式配置，从而使二者紧密接触。更具体地说，通过适当地变更支持载体内上述注射器针尖的位置，能够将一种细胞集合体压放在另一种细胞集合体上。当使用上皮组织或间叶组织作为细胞集合体时，优选的是，使该组织在原始牙胚中与间叶组织或上皮组织接触的面，与另一种细胞集合体接触。
另外优选的是，在配置后包含固化支持载体的步骤。这样能够使细胞进一步聚集而达到更高密度的状态。例如在使用胶原凝胶时，通过在培养温度下静置数分钟到数十分钟可进行固化。这种情况下，细胞集合体内细胞以外的成份越少，越可实现更高密度的状态。
本发明中，“在支持载体内部培养第1和第2细胞集合体的步骤”是例如专利文献1至4及特开2008-29757号公报所记载的内容，通过全面地引用这些文献，在本说明书对这些文献的公开内容进行了概括。
培养时间因配置于支持载体内部的细胞数、细胞集合体的状态、培养条件、动物种类等而异，所属领域的技术人员可适当地选择。为了能够使其在移植至口腔内时萌发成具有功能性的牙齿，优选是至少培养1天，更优选是3天或更长时间。
通过延长培养时间，可进一步促进再生牙胚的形成，诸如牙本质及牙釉质的蓄积、牙冠的形成、以及牙根的形成。为获得期望的状态，培养时间可以是例如6天以上、30天以上、50天以上、100天以上或300天以上，在培养过程中，也可改变培养基或培养条件。
在支持载体内部培养的步骤，可对仅包含第1和第2细胞集合体的支持载体进行培养，也可在存在其他动物细胞等情况下进行培养。
单独培养支持载体时，培养条件可使用通常用于培养动物细胞的条件。另外在培养时可添加来自哺乳动物的血清，亦可添加已知的能够有效促进这些细胞增殖与分化的各种细胞激素，例如这些细胞激素可以为FGF、BMP等。
就细胞集合体的气体交换或营养供给而言，以及不与其他动物细胞接触或混合、且能够使整个过程在体外进行的观点而言，优选的是在支持载体内部的培养，是一种器官培养。器官培养一般是使多孔性膜漂浮在适合动物细胞增殖的培养基上，再将包含第1和第2细胞集合体的支持载体装载在该膜上进行培养。此处所使用的多孔性膜优选的是具有大量的约0.3-5μm大小的孔，例如可以为Cell Culture Inserts(商品名)或IsoporeFilters(商品名)。
根据本发明的牙齿的制造方法，在哺乳动物的体内配置再生牙胚再进行培养前，优选的是先在体外对再生牙胚进行预培养。通过预培养能够使细胞间的结合和细胞间的相互作用更加强固，从而可缩短整个生长周期。
根据本发明的方法所得的牙齿，具有内侧为牙本质，外侧为牙釉质的牙齿所特有的细胞配置(构造)，优选的是具有牙尖(牙冠)和牙根位于正确的位置上的方向性，从而能够充分发挥牙齿的功能。因此，可被广泛利用为牙齿的替代物。另外，在为了阐明牙齿的发育过程的研究中，也可作为一个有用的研究工具使用。
而且，通过延长培养周期，除了牙齿本身以外，也能够形成在颌骨支持固定牙齿的诸如牙槽骨或牙周膜等牙周组织。这样可进一步提高移植后的牙齿的实用性。另外，亦可仅分离牙周组织加以利用。
[牙齿缺损部位的修复方法]
根据本发明的口腔内牙齿缺损部位的修复方法，其包含将以本发明的再生牙齿单元制造方法所制造的再生牙齿单元，移植到缺损部位的步骤。根据本方法，能够制造和移植适合缺损部位大小和形状的再生牙齿单元。
根据本发明的再生牙齿单元的制造方法，在体内培养再生牙胚时，由于牙齿在体内不会受到压力而破损，能够长成自然的形状，因此能够很容易制造适合缺损部位形状的牙齿。
另外，为移植到缺损部位，期望制作与缺损牙齿具有相同长度的再生牙齿，根据本发明的牙齿的制造方法，能够控制牙齿长度的最大值。当牙齿长度超过最大容许值时，无法直接移植该牙齿，而比最大容许值短时，则移植后能够使其生长为期望长度的再生牙齿。
根据本发明的口腔内牙齿缺损部位的修复方法，再生牙齿单元可在牙齿发育的任一个阶段进行移植。若已发现形成了牙冠，则优选的是，使牙冠配置在口腔内侧。若处于未发现形成牙冠的阶段时，则优选的是，使相当于牙冠部位的上皮细胞层或再生牙胚的上皮细胞层配置在口腔内侧。另外，再生牙胚的上皮间叶细胞层的开放部分，优选的是配置于口腔内侧的相反侧。这样，可使牙齿尖(牙冠)位于口腔内侧，与周围的牙齿具有同样的方向性。
缺损部位是指例如因拔牙等得到的、位于牙龈中的部位，并没有特别限定其形状。缺损部位和目标牙齿的种类并没有特别限定，只要能够嵌入再生牙胚或牙齿即可。
缺损部位一般位于颌骨、口腔的牙槽骨等。另外，牙齿的散失伴随着牙槽骨量的减少时，对于缺损部位，可通过临床所用的众所周知的嵌入植入物的方法如GTR法(引导组织再生：组织再生诱导法)，尝试促进牙周组织的再生。将牙胚或牙齿配置于孔部后，根据一般的处理方法，优选是进行缝合。
根据本发明的口腔内牙齿缺损部位修复的方法，优选的是，移植对象与提供制造牙齿使用的牙胚的动物是同种类的，进一步优选的是与提供牙胚的个体为同一个个体。动物例如可以为人类、牛、马、猪、犬、猫、小鼠等哺乳动物。优选的是非人类的哺乳动物。
作为本发明的另一个实施方案，再生牙胚可使用多个再生牙胚。优选的是，多个再生牙胚中的每个再生牙胚都是分别单独制备的再生牙胚。单独制备的再生牙胚是指为未来可形成单一牙齿而制备的再生牙胚。再生牙胚的制作方法如上所述。如专利文献1所记载的单独制备的再生牙胚，能够在制作包含多个个牙胚的再生牙胚后分离出来。然而，一般更优选的是，可如专利文献5中的记载，通过调节再生牙胚所含的牙釉节的数目，能够将其制作形成未来的单一牙齿。另外，所述单独制备的再生牙胚，可根据缺损部位的大小或将要再生的牙齿的大小适当地调节其大小而制作。例如在制作再生牙胚时，使所述间叶细胞集合体与所述上皮细胞集合体接触而配置时，可以使各细胞集合体大致形成圆柱状，这种情况下，通过控制该柱的轴向的接触长度，能够形成在单一方向上具有期望长度的牙齿。例如通过使所述间叶细胞集合体与所述上皮细胞集合体的接触长度，为期望的再生牙齿牙冠宽度的±25％，能够制作具有所述期望长度的再生牙齿。为在培养后能制作出具有期望大小和形状的再生牙齿，可以调节细胞集合体的长度等。通过依次配置如上所述的单独制备的再生牙胚并对其进行培养，能够制作包含多个再生牙齿的再生牙齿单元。优选的是，调整再生牙胚的未来为咬合面部位的中心与未来为根尖部位的中心的连结轴线方向为大致平行的配置。未来为咬合面部位的中心，与未来为根尖部位的中心的连结轴线方向，与再生牙齿的牙冠与牙根的连结轴线方向大概一致，本说明书中将该方向称为“牙冠-牙根方向”。通过调整该轴线方向为大致平行而配置，可获得含有与天生的牙齿具有相似的牙冠-牙根方向的多个牙齿的再生牙齿单元。另外，在配置多个再生牙胚时，优选的是将它们配置在同一平面上。通过配置在同一平面，能够获得齿列整齐的再生牙齿单元。另外，当希望齿列具有可以沿着牙龈曲线而排列的状态时，则可以不配置在同一平面上，而是配置在沿着牙龈曲线的曲面上。在配置多个再生牙胚时，并未特别限定再生牙齿及再生牙胚的数目，可以根据牙齿缺损部位的形状、大小或所期望的再生牙齿的颗数而选择，优选的是配置2-6颗，更优选的是配置2-4颗。
在依次配置多个再生牙胚时，优选的是，使再生牙胚彼此邻接而配置。使其邻接而配置是指再生牙胚彼此相互接触或几乎接触而配置。将再生牙胚配置为彼此邻接时，可获得齿列方向的牙齿间很小或没有空隙的再生牙齿单元。另外，将多个再生牙胚邻接配置并培养时，通过延长培养时间，可获得牙周组织相互连接而成为一体的形状的再生牙齿单元。因此，具有一体化形成的牙周组织的再生牙齿单元，可无需分离单个的再生牙齿，直接移植至牙齿缺损部位。如上所述的包含多个再生牙齿的一体化形成的再生牙齿单元，与一个个移植单个的再生牙齿单元的情形相比，能够使移植更简便，而且，一体化的牙周组织能够为单个的牙齿提供强固的支持。另外，一体化形成的包含多个再生牙齿的再生牙齿单元，与一个个移植单个的再生牙齿单元的情形相比，在移植时可无需担心移植时或移植后齿列方向的紊乱。
作为本发明的另一个实施方案，可将所述的多个再生牙胚配置于如上所述的间隔构件内并进行培养。所述间隔构件，如上所述，优选的是根据将要并排的再生牙胚的数目采用适当的形状。在排列多个再生牙胚时，优选的是，采用能够获得多个牙胚的齿列方向的牙冠的总宽度，或齿列方向的牙周组织的长度的形状。因此，使用筒状物为间隔构件时，优选使用接近椭圆或长方形的形状作为底面的筒状物。因此，通过使用间隔构件，制作包含多个再生牙齿的再生牙齿单元时，具有插入体内进行体内培养时，仍能够维持再生牙胚的排列状态的优点，例如，能够维持再生牙胚的方向或再生牙胚之间的间隔，以及再生牙胚的排列平面。
本说明书中所使用的用语，是为了说明特定的实施方案，并没有试图限定本发明。
本说明书中所使用的“包含”一词，除了根据上下文有明显不同的理解的情况以外，是指存在所述的事项(成分、步骤、要素、数字等)，且不排除存在其他的事项(成分、步骤、要素、数字等)。
只要没有特别的定义，在此所用的全部用语(包含技术用语和科学用语)，都与本发明所属技术领域的技术人员所广泛理解的意思是一样的。在此所用的用语，只要没有明示不同的定义，应解释为与本说明书及相关技术领域中一致的意思，不应被解释为理想化，或过度形式化的意思。
本发明的实施方案有时需参照示意图进行说明，在这种情况下，，为了能清楚地进行说明，示意图可能会被夸张地描绘。
使用第一、第二等用语是为了描述各种要素，应该理解这些要素并不被这些用语所限定。使用这些用语仅是为了将一种要素与其他要素区别开，例如可以将第一要素记作第二要素，同样的，可将第二要素记作第一要素，这样也未超出出本发明的范围。
[实施例]
以下，参照实施例针对本发明作更进一步的详细说明。然而，本发明可通过各种的实施例而具体化，不应被理解为被限定于这里所记载的实施例。
<实施例1：使用间隔构件在体内培养再生牙胚>
移植于肾被膜下时，为了避免肾被膜压力的影响，使用间隔构件进行再生牙胚的体内培养。
切断微量吸管尖(HRI-110NEW，Molecular Bio Products，SanDiego，CA，USA)以制作内径(内部直径)为1.3mm，高1.3mm的圆环状(筒状)的间隔构件，并在内部填满胶原蛋白溶液后使用。为了促进再生牙胚向牙根方向伸长，将再生牙胚配置为使其牙冠侧接近间隔构件的壁面，并于37℃的CO2保温箱(三洋电机，大阪，日本)中进行培养，使胶原蛋白凝胶硬化。接下来，将含有再生牙胚的间隔构件移植至7周大的C57BL/6小鼠的两侧肾被膜下。通过在肾脏被膜上切割2-3mm的切口，剥离肾被膜与肾实质，再在它们之间插入含再生牙胚的间隔构件来进行肾被膜下的移植。比较例是将器官培养7天的再生牙胚，在不不使用间隔构件情况下，移植至肾被膜下。移植时的照片如图1所示。另外，移植时间隔构件与再生牙胚的位置关系示意图如图11所示。
在移植3周后，拍摄了显微CT影像，并使用集成影像处理软件分析了影像数据。在牙冠部将最大径定义为长径，与长径垂直的最大径定义为短轴，并分别测量其长度，并计算其比例。
使用间隔构件进行培养的例子如图2所示，未使用间隔构件而进行培养的例子如图3所示。使用间隔构件培养的再生牙齿单元，接近正常牙齿的形态，反之未使用间隔构件培养的再生牙齿单元，长径相对于短径极其的长，为扁平形状。
对7例使用间隔构件培养的组(控制组)和未使用间隔构件培养的组(非控制组)的长短径进行了测量，长径/短径比的计算结果如图4(右侧)所示。使用间隔构件培养组(控制组：实施例)的再生牙齿单元的长径/短径比为1.46±0.16mm，未使用间隔构件培养的组(非控制组：比较例)为2.30±0.35mm。
图4(左侧)显示了对成年小鼠的下颌第一、第二、第三臼齿(M1、M2、M3)的牙冠部的被定义为长径的最大径、定义为短径的与长径垂直的最大径的测量结果，并显示了长径/短径比例的计算结果。M1、M2、M3的长径/短径比分别为1.61±0.05mm(n＝5)、1.09±0.04mm(n＝5)、1.12±0.04mm(n＝5)。
根据上述结果可知，体内培养时，未使用间隔构件的再生牙齿单元为扁平形状，而使用间隔构件的再生牙齿单元不会形成扁平形状，且二者的长径/短径比具有明显的不同。另外，体内培养时，使用间隔构件的再生牙齿单元的长径/短径比与天然牙齿的相当(Student’s t-test，*p＜0.0001)。
摘出移植至肾被膜下30天、第60天的再生牙齿单元，拍摄显微CT影像，使用集成影像处理软件分析并测定长度。在显微CT影像上测量牙齿的牙尖至根尖的长度，其中不包含形成牙槽骨的区域。
测量结果如图5所示。在未使用间隔构件的非控制组，牙尖-根尖在第30天的长度为1.07±0.20mm(n＝6)，第60天的长度为1.70±0.26mm(n＝6)，牙齿长度的有显著地增加。另一方面，在使用间隔构件的控制组，在第30天的长度为1.01±0.19mm(n＝13)，第60天为1.02±0.11mm(n＝10)，未发现长度因移植天数的增加而增加(Student’s-t test，*p＜0.0001)。
根据上述结果可知，体内培养再生牙胚时，通过使用间隔构件，可任意调节再生牙齿的长度。
<实施例2：给予机械性刺激的再生牙胚的体内培养>
按照实施例1的方法，使用间隔构件进行器官培养的再生牙胚随着间隔构件移植至肾被膜下，自移植至肾被膜下第7天开始给予机械性的刺激，即以声波电动牙刷(频率31,000Hz：Doltz(商标)，松下公司)在小鼠背部皮肤给予3.9×104Pa的压力(5分钟/天)。对照组没有给予机械性的刺激，在移植30天后将它们作为比较对象取出。
对取出的再生牙齿单元用与实施例1相同的方法拍摄显微CT影像，使用3D影像分析软件测定牙周膜腔的宽度(有时仅简称作“牙周膜的宽度”)。具体而言，3D影像上的再生牙齿单元的牙根表面与形成的牙槽骨的距离为牙周膜腔的宽度，在长径/短径的剖面图，分别测定6个点。然后将再生牙齿以4％的多聚甲醛(Paraformaldehyde：PFA)固定，再以10％乙二胺四乙酸(EDTA)脱钙，以石蜡包埋。然后，制作厚度为8μm的连续切片，并进苏木精-曙红(HE)染色，进行组织学评价。
组织学评价的结果如图6所示。图中B代表牙槽骨，D为牙本质，P为牙周膜，图中靠近字母P的线条表示牙周膜的宽度。另外图中右下角的比例尺表示100μm。给予刺激的组形成的牙周膜较无刺激的组要厚，并能够在牙周膜区域观察到细胞有规则的排列。
另外在CT影像上测定的牙周膜的宽度的结果如图7所示。有刺激组的牙周膜的宽度为108.5±30.6μm(n＝33)，无刺激组的牙周膜的宽度为68.7±14.1μm(n＝12)(Student’s-t test，*p＜0.0001)。
从上述结果可知，再生牙胚进行体内培养时，通过自外部给予机械性的刺激，可获得具有充分牙周膜组织的再生牙齿单元。
<实施例3：体内培养所得的再生牙齿单元的颌骨移植>
拔除4周大的C57BL/6小鼠下颌的第一臼齿，并给予3天治愈期。然后，在相同部位进行牙龈的切开与剥离，使用牙科用的微型马达(Viva-Mate Plus，中西公司，东京，日本)切削牙槽骨，形成近中远径1mm，颊舌径0.8mm的移植窝。
将按照实施例1，使用间隔构件在肾被膜下培养30天，并且按照实施例2，在培养期间给予机械性刺激所制作的再生牙齿单元，埋入颌骨移植窝内，并以8-0尼龙手术缝合线(Bearmedic，千叶，日本)缝合牙龈。
图8是显示的是形成的移植窝以及移植再生牙齿单元的情况。
在移植再生牙齿单元至小鼠后的0天、第14天、第30天，用与上述相同的方法进行显微CT摄影，并评价移植物与作为接受者的牙槽骨结合的情况。之后将含移植物的颌骨以4％PFA固定，再以10％蚁酸钠-柠檬酸盐脱钙溶液进行脱钙，以石蜡包埋后，制作厚度为8μm的连续切片，并以HE染色进行组织学评价。
图9为CT影像，图10为HE染色影像。
如图9所示，在移植第14天可发现移植物与接受者的下颌第二臼齿牙槽骨间有部分的结合，在移植第30天可发现移植物几乎完全与牙槽骨结合。图中箭头系表示再生牙齿单元。
如图10所示，在移植第30天的组织影像显示，再生牙齿与下颌第二臼齿的牙槽间隔的牙槽骨能够融合，并且再生牙齿单元通过与骨结合能够与移植部位的牙槽骨整合为一体。另外根据组织分析，尽管因移植会出现再生牙齿的牙髓一部分钙化的偶发症状(16例中有3例)，再生牙齿单元的牙周膜在移植后仍能维持，且未发现黏连(Dental ankylosis)(16例中0例)。图中箭头是表示通过骨结合而整合成一体，比例尺是表示100μm，BT代表再生牙齿，NT代表天然的下颌第二臼齿。自前述结果可知，根据本发明的制造方法所制造的再生牙齿单元，移植至颌骨后生长良好。
<实施例4：制作含有多个牙齿的再生牙齿单元>
以制作可移植至牙齿大型缺损部位的含有多个牙齿的再生牙齿单元为目的，将多个再生牙胚移植至肾被膜下，使用间隔构件进行体内培养。
切断微量吸管尖(HRI-110NEW，Molecular Bio Products，SanDiego，CA，USA)以形成筒状，筒的剖面形状为长径为3mm，短径为2mm，高度为1.3mm的圆角矩形，将其用作为间隔构件，并在内部填满胶原蛋白溶液后使用。使4个再生牙胚相互接触而配置，使筒的高度方向为未来的再生牙齿的厚度方向，圆角矩形的短径方向为牙齿的伸长方向，圆角矩形的长径方向为牙齿的齿列方向。此时为促进向牙根方向伸长，使再生牙胚的未来成为牙冠侧稍微接近间隔构件剖面的圆角矩形的一个长边侧壁面，并在37℃的CO2恒温箱(三洋电机，大阪，日本)中进行培养，使胶原蛋白硬化。在间隔构件内配置多个再生牙胚的状态的示意图如图12所示，其照片如图13所示。图12和图13是自筒的轴向观察所见的筒状间隔构件的图或照片。接下来，将含再生牙胚的间隔构件移植至7周大的C57BL/6小鼠的两侧肾被膜下。移植至肾被膜下是通过在肾被膜上切割5mm的切口，剥离肾被膜与肾实质，再在其间插入含多个再生牙胚的间隔构件而进行的。
移植至肾被膜下60天后，自肾脏取出，获得一个具有多个牙齿的块状多齿再生牙齿单元。肾被膜下移植60天后的多个牙齿的再生牙齿单元的实体照片如图14所示。显微CT(日本理学株式会社，东京，日本)分析时，能够观察到各牙齿周围的牙周腔膜、牙槽骨的牙槽间隔。移植至肾被膜下60天后的多个牙齿的再生牙齿单元的CT外观影像及CT剖面图如图15所示。由此可知，作为本发明的制造方法的一个实施方案，将分别能成长为单个牙齿的单个的牙胚进行配置和培养时，通过将其未来为咬合面的方向并排排列，能够获得一个处于这种状态的再生牙齿单元：与天然的牙齿一样，多颗单个牙齿的牙冠-牙根方向相同，且多颗牙齿能够排成一列形成齿列。另外，作为本发明的制造方法的一个实施方案，表明通过配置多个再生牙胚所制作的再生牙齿单元，其所含的多个牙齿具有正常的组织构造，且能够一体化地形成覆盖其牙根部分的牙槽骨。
<实施例5：含多齿的再生牙齿单元的无齿颌模型移植>
拔除4周大的C57BL/6小鼠下颌第一、第二以及第三臼齿，产生了一个无齿颚模型，并给予3天治愈期间。然后，在相同部位进行牙龈的切开与剥离，使用牙科用的微马达(Viva-Mate Plus，中西公司，东京，日本)切削牙槽骨，形成近中远径为3mm-4mm，颊舌径为1.2mm的移植窝。将在小鼠肾被膜下制作的再生牙齿单元，埋入颌骨移植窝内，并以8-0尼龙缝线(Bearmedic，千叶，日本)缝合牙龈。
对移植了含多个牙的再生牙齿单元的无齿颌模型小鼠进行显微CT摄影。含多个牙的再生牙齿单元移植至口腔内后第1天的CT影像如图16所示。通过观察本实施例，表明含多个牙的再生牙齿单元的牙槽骨与接受者的牙槽骨能够通过骨结合而整合成一体。
这表明，即使牙齿的缺损部位较大时，也能够一次移植适合其形状的含多个牙齿的再生牙齿单元，而移植的再生牙齿单元的牙周组织，与被移植的个体的颌骨显示有良好的骨结合。另外在移植后50天的CT影像上观察到，移植的再生牙齿单元的牙周组织，与被移植的个体的颌骨进行了骨整合。

Claims (29)

1.再生牙齿单元的制造方法，其是在哺乳动物体内培养再生牙胚以制造再生牙齿单元的方法，其包含以下步骤：
准备间隔构件；
将所述再生牙胚置于所述间隔构件内并配置于所述哺乳动物体内；
在所述哺乳动物体内培养所述再生牙胚；
其中，
所述间隔构件具有能够防止所述再生牙胚的伸长超过最大容许值、且使配置于其内部的再生牙胚能够与所述间隔构件的外部连通的构造。
2.如权利要求1所述的再生牙齿单元的制造方法，其中，所述哺乳动物是非人类的哺乳动物。
3.如权利要求1或2中任一项所述的再生牙齿单元的制造方法，其中，所述间隔构件进一步具有能够防止所述哺乳动物的体内的组织对所述再生牙胚施加过多压力的构造。
4.如权利要求1至3中任一项所述的再生牙齿单元的制造方法，其中，
将所述再生牙胚置于所述间隔构件内并配置于所述哺乳动物体内的步骤，是将所述再生牙胚的未来为咬合面的部位以面向所述间隔构件内壁的方式配置在所述间隔构件的内壁附近，且将未来为根尖的部位配置为朝向所述间隔构件的所述内壁的相反方向的更大空间伸长的步骤。
5.如权利要求1至4中任一项所述的再生牙齿单元的制造方法，其中，
将所述再生牙胚置于所述间隔构件内并配置于所述哺乳动物体内的步骤，是以填满所述间隔构件内部的支持载体来支持所述再生牙胚的方式进行配置。
6.如权利要求1至5中任一项所述的再生牙齿单元的制造方法，其中，所述再生牙胚的培养和维持，是通过实质上由间叶细胞构成的第1细胞集合体，与实质上由上皮细胞构成的第2细胞集合体在支持载体内部紧密接触配置而进行的，其中间叶细胞与上皮细胞至少一方是来自牙胚。
7.如权利要求1至6中任一项所述的再生牙齿单元的制造方法，其中，在培养所述再生牙胚时，进一步包含自所述哺乳动物的外部给予机械性的刺激的步骤。
8.如权利要求7的再生牙齿单元的制造方法，其中，所述机械性的刺激是大约20000Hz-大约40000Hz的振动。
9.如权利要求1所述的方法，其中，所述间隔构件具有能够产生期望大小的再生牙齿单元的内部空间。
10.如权利要求9所述的方法，其中，所述间隔构件大致呈筒状，所述筒的高度比期望的再生牙齿单元的厚度大，且所述筒的内径约为所述再生牙齿单元的长度的最大容许值。
11.如权利要求10所述的方法，其中所述间隔构件为圆筒状。
12.如权利要求1至11中任一项所述的再生牙齿单元的制造方法，其中，所述再生牙胚包含多个分别单独制备的再生牙胚。
13.如权利要求1至12中任一项所述的再生牙齿单元的制造方法，其中，所述再生牙胚包含多个分别单独制备的再生牙胚，且在所述间隔构件内使多个分别单独制备的再生牙胚以相互邻接的方式配置。
14.如权利要求1至13中任一项所述的再生牙齿单元的制造方法，其中，所述再生牙胚包含多个分别单独制备的再生牙胚，且使多个分别单独制备的再生牙胚在所述间隔构件内，以调整使各再生牙胚的未来为咬合面部位的中心，与未来为根尖部位的中心的连结轴线方向为大致平行的方式进行配置。
15.再生牙胚组合物，其用于通过置于间隔构件，在哺乳动物体内进行培养，以制造再生牙齿单元，其特征在于，所述间隔构件具有能够防止所述再生牙胚的伸长超过最大容许值，且使置于所述间隔构件内部的再生牙胚能够与所述间隔构件外部连通的构造。
16.如权利要求15所述的再生牙胚组合物，其中所述再生牙胚包含多个分别单独制备的再生牙胚。
17.间隔构件，其是用于在哺乳动物体内，将再生牙胚置于其中进行培养以制造再生牙齿单元的间隔构件，其特征在于，所述间隔构件具有能够防止所述再生牙胚的伸长超过最大容许值，且使置于其内部的再生牙胚能够与该间隔构件外部连通的构造。
18.如权利要求17所述的间隔构件，其中，配置于所述间隔构件内部的再生牙胚包含多个分别单独制备的再生牙胚。
19.再生牙齿单元的制造方法，其包含在哺乳动物体内，培养再生牙胚的步骤，其中，培养所述再生牙胚时，自所述哺乳动物外部给予机械性的刺激。
20.如权利要求19所述的再生牙齿单元的制造方法，其中，所述机械性的刺激是大约20000Hz-大约40000Hz的振动。
21.如权利要求19或20所述的再生牙齿单元的制造方法，其中，所述再生牙胚的培养和维持，是通过使实质上由间叶细胞构成的第1细胞集合体，与实质上由上皮细胞构成的第2细胞集合体在支持载体内部紧密接触配置而进行的，其中间叶细胞与上皮细胞至少一方是来自牙胚。
22.如权利要求19至21中任一项所述的再生牙齿单元的制造方法，其中所述再生牙胚包含多个分别单独制备的再生牙胚。
23.动物缺损牙齿的修复方法，其包含将根据权利要求第1-14、19-22中任一项所述的再生牙齿单元的制造方法所制造的再生牙齿单元，移植至所述缺损的部位的步骤。
24.如权利要求23的动物缺损牙齿的修复方法，其中所述动物是非人类的哺乳动物。
25.如权利要求23-24中任一项所述的动物缺损牙齿的修复方法，其中所述再生牙齿单元包含齿冠-齿根方向被调整为大致平行的多个牙齿。
26.再生牙齿单元，其是根据权利要求1-14、19-22中任一项的再生牙齿单元的制造方法所制造。
27.再生牙齿单元，其根据权利要求1-14、19-22中任一项的再生牙齿单元的制造方法而制造，用于移植至缺损部位以修复动物口腔内缺损的牙齿。
28.如权利要求26或27所述的再生牙齿单元，其包含齿冠-齿根方向被调整为大致平行的多个牙齿。
29.如权利要求26或27所述的再生牙齿单元，其包含齿冠-齿根方向被调整为大致平行的、且牙周组织为一体化地形成的多个牙齿。
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