WO2011125370A1 - 観察装置及び観察方法 - Google Patents

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WO2011125370A1
WO2011125370A1 PCT/JP2011/052543 JP2011052543W WO2011125370A1 WO 2011125370 A1 WO2011125370 A1 WO 2011125370A1 JP 2011052543 W JP2011052543 W JP 2011052543W WO 2011125370 A1 WO2011125370 A1 WO 2011125370A1
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light
image
observation
incoming light
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朋信 渡邉
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Osaka University NUC
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    • G—PHYSICS
    • G02—OPTICS
    • G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
    • G02B21/00—Microscopes
    • G02B21/0004—Microscopes specially adapted for specific applications
    • G02B21/002—Scanning microscopes
    • G02B21/0024—Confocal scanning microscopes (CSOMs) or confocal "macroscopes"; Accessories which are not restricted to use with CSOMs, e.g. sample holders
    • G02B21/008—Details of detection or image processing, including general computer control
    • G—PHYSICS
    • G02—OPTICS
    • G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
    • G02B21/00—Microscopes
    • G02B21/36—Microscopes arranged for photographic purposes or projection purposes or digital imaging or video purposes including associated control and data processing arrangements
    • G02B21/365—Control or image processing arrangements for digital or video microscopes

Definitions

  • the present invention relates to an observation apparatus and an observation method for observing an observation object based on incoming light coming from the observation object.
  • the wavelength of the fluorescence emitted from the object to be observed is different from the wavelength of the excitation light, only the fluorescence can be extracted with a filter or the like to obtain a two-dimensional tomographic image.
  • a scanning fluorescence microscope there is a confocal optical microscope that acquires a two-dimensional tomographic image.
  • the object to be observed is laser-scanned along the two-dimensional tomographic plane to obtain point light coming from the object to be observed. Since a two-dimensional tomographic image composed only of images in focus can be acquired, an image with less blur can be generated and the object to be observed can be observed (Patent Documents 1 and 2).
  • the object to be observed is laser-scanned along the two-dimensional tomographic plane to acquire point light coming from the object to be observed. It is necessary to strictly synchronize the spotlight acquisition timing. As a result, the observation apparatus requires expensive and highly accurate synchronization means. Furthermore, since the object to be observed is laser-scanned along the two-dimensional tomographic plane, the time for acquiring the two-dimensional tomographic image of the object to be observed is limited by the scanning time.
  • the present invention has been made in view of the above problems, and an object of the present invention is to obtain a clear image in which blur is eliminated from two-dimensional tomographic image information obtained using incoming light arriving from an object to be observed.
  • An object of the present invention is to provide an observation apparatus and an observation method.
  • an observation apparatus is an observation apparatus that observes the object to be observed based on incoming light coming from the object to be observed.
  • a conversion unit that converts the incoming light into a second converted light by a second pupil function, the first converted light, and the second converted light, and relates to the object to be observed.
  • An image information generation unit that generates image information.
  • Image information related to the observation object is generated.
  • the converted light converted with different pupil functions has different intensity distributions.
  • different intensity distributions are overlapped or the difference between different intensity distributions is taken, the difference between the peak intensity and other intensities becomes clearer, and the spread of the intensity distribution of incoming light coming from the observed object is suppressed. I can do it.
  • the observation apparatus further includes a pupil function changing unit that changes at least one of the first pupil function and the second pupil function. For example, even when image information that is not suitable for observation is obtained by combining the first pupil function and the second pupil function, at least one of the first pupil function and the second pupil function is appropriately changed. Then, an image having a desired resolution with less blur can be obtained.
  • the conversion unit includes a first conversion unit that converts the incoming light with the first pupil function, and a second that converts the incoming light with the second pupil function. Including a conversion unit. That is, the conversion unit includes separate first conversion unit and second conversion unit. As a result, the incoming light can be simultaneously converted into the first converted light and the second converted light, and image information with less blur can be generated quickly and reliably.
  • the conversion unit includes a reflective member or a transmissive member.
  • the reflection type member and the transmission type member can be easily obtained at low cost as ready-made products. Therefore, the incoming light can be converted into the first converted light and the second converted light, respectively, with an inexpensive configuration without requiring a special configuration as the conversion unit.
  • the observation apparatus further includes a focal position changing unit that changes the focal position of the incoming light.
  • the change of the focal position of the incoming light can be realized by changing the optical path length to the focal point of the incoming light, whereby the spread of the intensity distribution of the incoming light coming from the object to be observed can be changed.
  • a focal position changing unit that changes the focal position of the incoming light.
  • the first pupil function and the second pupil function are two-dimensional donut-shaped functions having an inner ring and an outer ring, and the first conversion unit and the first pupil function
  • the 2 conversion unit causes a region surrounded by each inner ring and outer ring to function as a non-shielding region of the first pupil function and the second pupil function.
  • the conversion unit can block the incoming light that has arrived outside the donut-shaped outer ring, and the influence of spherical aberration caused by the optical system of the observation apparatus is reduced, improving the optical axis resolution. I can do it.
  • the conversion unit can block incoming light that has arrived in the inner area of the donut-shaped inner ring, and can eliminate the influence of noisy light that has arrived in the inner area of the donut-shaped inner ring. it can. As a result, a clearer image can be obtained.
  • the value of the ratio between the diameter of the inner ring and the diameter of the outer ring is 1/6 to 4/5. If the value of the ratio between the inner ring diameter and the outer ring diameter is within this range, the spread of the intensity distribution of the incoming light coming from the object can be reliably suppressed. As a result, it is possible to obtain a clear image in which blur is eliminated from the two-dimensional tomographic image information obtained using the incoming light coming from the object to be observed.
  • an observation method is an observation method for observing the object to be observed based on incoming light coming from the object to be observed, and the first method uses the first pupil function for the incoming light.
  • An image relating to the object to be observed based on the conversion step of converting into the converted light and converting the incoming light into the second converted light with a second pupil function, the first converted light, and the second converted light.
  • an image information generation step for generating information.
  • the same operational effects as the above-described observation apparatus of the present invention are exhibited. That is, according to the observation method of the present invention, based on the first converted light obtained by converting the incoming light arriving from the observation object by the first pupil function and the second converted light converted by the second pupil function, Image information related to the observation object is generated.
  • the converted light converted with different pupil functions has different intensity distributions. When different intensity distributions are overlapped or the difference between different intensity distributions is taken, the difference between the peak intensity and other intensities becomes clearer, and the spread of the intensity distribution of incoming light coming from the observed object is suppressed. I can do it. As a result, it is possible to obtain a clear image in which blur is eliminated from the two-dimensional tomographic image information obtained using the incoming light coming from the object to be observed.
  • the observation method of the present invention further includes a pupil function changing step of changing at least one of the first pupil function and the second pupil function. For example, even when image information that is not suitable for observation is obtained by combining the first pupil function and the second pupil function, at least one of the first pupil function and the second pupil function is appropriately changed. Then, an image having a desired resolution with less blur can be obtained.
  • the conversion step includes a first conversion step of converting the incoming light with the first pupil function, and a second of converting the incoming light with the second pupil function. Conversion step. That is, as the conversion step, separate first conversion step and second conversion step are executed. As a result, the incoming light can be simultaneously converted into the first converted light and the second converted light, and image information with less blur can be generated quickly and reliably.
  • the observation method of the present invention further includes a focal position changing step of changing the focal position of the incoming light by the conversion step.
  • the change of the focal position of the incoming light can be realized by changing the optical path length to the focal point of the incoming light, and thereby the spread of the intensity distribution of the incoming light coming from the object to be observed can be changed.
  • an image having a desired resolution with less blur can be obtained by changing the focal position of the incoming light. .
  • an observation apparatus is an observation apparatus that observes the object to be observed based on the incoming light coming from the object to be observed, and has an intensity of the incoming light of at least 1
  • a conversion unit that converts the incoming light into converted light by modulating with two pupil functions
  • an image information generation unit that generates image information relating to the object to be observed based on the converted light, the at least one pupil
  • the function has a shielding area and a non-shielding area arranged around the shielding area.
  • an observation method is an observation method for observing the object to be observed based on incoming light coming from the object to be observed, wherein the intensity of the incoming light is set to at least one. Including a conversion step of converting the incoming light into converted light by modulating with a pupil function, and an image information generation step of generating image information relating to the object to be observed based on the converted light.
  • the at least one pupil function has a shielding area and a non-shielding area arranged around the shielding area.
  • the observation apparatus and the observation method of the present invention it is possible to shield incoming light that has arrived at a shielding area inside the non-shielding area, thereby eliminating the influence of noisy light arriving at the shielding area. . As a result, it is possible to obtain a clear image in which blur is eliminated from the two-dimensional tomographic image information obtained using the incoming light coming from the object to be observed.
  • FIG. 1 It is a schematic diagram of the observation apparatus which concerns on Embodiment 1 of this invention.
  • the observation device in which all pixels absorb light in the second conversion unit and all pixels reflect light in the first conversion unit, it is a diagram showing a point image distribution of fluorescent beads, (a) It is a figure which shows the point image distribution of a XZ plane, (b) And (c) is a graph which shows the point image distribution of a X-axis direction and a Z-axis direction, respectively.
  • FIG. 6 is a diagram showing point distributions of fluorescent beads in an observation apparatus in which all pixels absorb light in the second conversion unit and various donut-shaped pupil functions are given to the first conversion unit;
  • a pupil function a point image distribution in the XZ plane, a graph showing the point image distribution in the X-axis direction, and a graph showing the point image distribution in the Z-axis direction are shown.
  • It is a conceptual diagram of the image which an image information generation part acquires.
  • FIG. 7 is a diagram showing a point image distribution of fluorescent beads in an observation device given a function
  • (a) is a diagram showing a point image distribution on an XZ plane
  • (b) and (c) are X axis axes, respectively. It is a graph which shows the point image distribution of a direction and a Z-axis direction.
  • FIG. 6 is a diagram showing a point image distribution of fluorescent beads after the focal length of incoming light is changed by movement of the second conversion unit with respect to the observation device obtained as a result shown in FIG.
  • FIG. 6 is a diagram showing point image distributions on the ⁇ Z plane
  • (b) and (c) are graphs showing point image distributions in the X-axis direction and the Z-axis direction, respectively.
  • a first doughnut-shaped pupil function having an outer ring diameter of 1040 ⁇ m and an inner ring diameter of 832 ⁇ m is provided to the first converter
  • a donut-shaped second pupil having an outer ring diameter of 624 ⁇ m and an inner ring diameter of 208 ⁇ m is provided to the second converter.
  • FIG. 7 is a diagram showing a point image distribution of fluorescent beads in an observation device given a function
  • (a) is a diagram showing a point image distribution on an XZ plane
  • (b) and (c) are X axis axes, respectively. It is a graph which shows the point image distribution of a direction and a Z-axis direction.
  • (A) is a figure which shows a 1st pupil function and its point image distribution
  • (b) is a figure which shows a 2nd pupil function and its point image distribution
  • (c) is a 1st pupil function and a 2nd pupil. It is a figure which shows the difference with a function, and the difference of these point image distributions.
  • (A) is a schematic diagram showing that light is not shielded, and (b) is a diagram showing a point image distribution on the XZ plane.
  • (A) is a figure which shows a 1st pupil function
  • (b) is a figure which shows the point image distribution of a XZ plane.
  • (A) is a figure which shows a 2nd pupil function
  • (b) is a figure which shows the point image distribution of a XZ plane.
  • (A) is a graph which shows the point image distribution of the X-axis direction in the case shown to FIG.9 (b), FIG.10 (b), and FIG.11 (b),
  • (b) is FIG.9 (b).
  • FIG. 12 is a graph showing a point image distribution in the Z-axis direction in the case shown in FIGS. 10 (b) and 11 (b).
  • (A) is a figure which shows the difference of the point image distribution shown to FIG.10 (b) and FIG.11 (b), (b) and (c) are the X-axis direction and Z-axis direction of (a), respectively. It is a graph which shows point image distribution.
  • (A) is a figure which shows the point image distribution after changing the focal distance of incoming light with respect to the observation apparatus with which the result shown to Fig.13 (a) was obtained, (b) and (c). 4 is a graph showing point image distributions in the X-axis direction and the Z-axis direction of FIG.
  • (A) is a diagram showing a point image distribution on the XZ plane
  • (b) to (d) are diagrams showing point image distributions obtained by digital image processing.
  • (A) is a figure which shows the difference of the point image distribution shown to Fig.15 (a) and FIG.15 (b), (b) and (c) are the X-axis direction and Z-axis direction of (a), respectively. It is a graph which shows point image distribution.
  • (A) is a figure which shows the difference of the point image distribution shown to Fig.15 (a) and FIG.15 (d), (b) and (c) are the X-axis direction and Z-axis direction of (a), respectively. It is a graph which shows point image distribution.
  • FIG. 20 is a graph showing a fluorescence intensity distribution in a cross section of a portion indicated by a dotted line in FIG.
  • (a) is a graph showing a fluorescence intensity distribution of an image observed by the observation apparatus 100
  • (b) is a conventional fluorescence microscope. It is a graph which shows the fluorescence intensity distribution of the image observed by.
  • (A) is a figure which shows the image observed with the conventional fluorescence microscope
  • (b) is a figure which shows the image observed with the observation apparatus 100 in Example 2.
  • FIG. It is a graph which shows the fluorescence intensity distribution in the cross section of the location shown by the dotted line in Fig.22 (a) and FIG.22 (b).
  • (A) is a figure which shows the image obtained by digital image processing
  • (b) is an enlarged view of the area
  • (c) was shown with the broken line of (b).
  • (A) is a figure which shows the image obtained by digital image processing
  • (b) is an enlarged view of the area
  • (c) was shown with the broken line of (b).
  • (A) is a figure which shows the image obtained by digital image processing
  • (b) is an enlarged view of the area
  • (c) was shown with the broken line of (b).
  • (A) is a figure which shows the image observed with the observation apparatus 100 in Example 3
  • (b) is an enlarged view of the area
  • (c) is a figure of (b).
  • (A)-(g) is a figure which shows the image observed with the observation apparatus 100 in Example 4 in each different time. It is a schematic diagram which shows the time change of the fluorescence intensity distribution from the cadherin observed with the observation apparatus 100 in Example 4.
  • FIG. 1 is a schematic diagram of an observation apparatus 100 according to Embodiment 1 of the present invention.
  • the observation apparatus 100 observes the observation object 1 based on the incoming light 2 coming from the observation object 1.
  • the observation apparatus 100 includes an optical system 102, a conversion unit 104 that converts incoming light 2 into first converted light using a first pupil function, and converts incoming light into second converted light using a second pupil function, and image information.
  • a generation unit 106, a pupil function changing unit 108, and a focal position changing unit 110 are provided.
  • the pupil function changing unit 108 and the focus position changing unit 110 may be referred to as the function changing unit 108 and the position changing unit 110, respectively.
  • the optical system 102 is provided after the imaging surface of the fluorescence microscope 3.
  • the optical system 102 includes a slit 102a for limiting the field of view disposed on the imaging surface, a first relay lens 102b, a second relay lens 102c for relaying a real image on the imaging surface to the image information generation unit 106, and
  • the image transmitted by the first mirror 102d, the first polarization beam splitter 102e for dividing the incoming light 2 into two for each polarization component, and the first relay lens 102b and the second relay lens 102c are sent to the image information generation unit 106.
  • the second polarization beam splitter 102g for dividing the polarization image into two parts and the divided image are combined again.
  • the optical system 102 is not limited to the configuration illustrated in FIG. 1 as long as the incoming light 2 can be guided to the conversion unit 104 and the converted light can be guided to the image information generation unit 106.
  • the combination and arrangement of the relay lens, mirror, and polarization beam splitter are arbitrary.
  • a relay optical system including two lenses 102b and 102c and a relay optical system including 102f and 102i or 102j are used in order to transmit a real image acquired by the fluorescence microscope 3 to the image information generation unit 106.
  • a relay optical system including two lenses 102b and 102c and a relay optical system including 102f and 102i or 102j are used. And through.
  • a relay optical system including two lenses is used.
  • an optical system using a single lens can be used.
  • the lens 102b is disposed above the first polarizing beam splitter 102e.
  • the conversion unit 104 includes a first conversion unit 104a that converts the incoming light 2 with a first pupil function, and a second conversion unit 104b that converts the incoming light 2 with a second pupil function.
  • the pupil function is a function having light phase and intensity parameters. Note that when the incoming light 2 is fluorescent, the light is incoherent, so the pupil function is a function having a parameter of light intensity.
  • the pupil function is represented by the reflectance at the light receiving surface of the conversion unit.
  • the converted light converted with different pupil functions has different intensity distributions. When different intensity distributions are overlapped or the difference between the different intensity distributions is taken, the difference between the peak intensity and the other intensity becomes clearer.
  • the 1st conversion part 104a and the 2nd conversion part 104b are arrange
  • the first conversion unit 104a and the second conversion unit 104b include, for example, a reflective member.
  • a reflective liquid crystal mirror array is used as the reflective member.
  • the image information generation unit 106 uses the first converted light obtained by converting the incoming light 2 by the first pupil function and the second converted light obtained by converting the incoming light by the second pupil function to obtain image information related to the object 1 to be observed. Is generated.
  • the image information generation unit 106 processes the acquired image information, and an image information acquisition unit 106a that acquires image information related to the observation object 1 based on the intensity distribution of the first converted light and the intensity distribution of the second converted light. And an image information processing unit 106b.
  • the function changing unit 108 changes at least one of the first pupil function given to the first converting unit 104a and the second pupil function given to the second converting unit 104b.
  • the function change unit 108 outputs a signal so that the pupil function is changed to at least one of the first conversion unit 104a and the second conversion unit 104b.
  • the function changing unit 108 applies a voltage to the first conversion unit 104a and the second conversion unit 104b.
  • the pupil function can be changed by controlling the tilt of the liquid crystal molecules.
  • the position changing unit 110 changes the focal position of the incoming light 2.
  • the position changing unit 110 can move the focal position of the incoming light 2 in the optical axis direction.
  • the position changing unit 110 can move the fifth relay lens 102m in the optical axis direction.
  • the incoming light 2 that has passed through the slit 102a is decomposed into two polarization components of a longitudinal wave and a transverse wave by the first polarization beam splitter 102e. Longitudinal light is applied to the first converter 104a, and transverse light is applied to the second converter 104b.
  • the longitudinal wave light applied to the first conversion unit 104a is two-dimensionally phase-modulated to the polarization component and reflected as first converted light converted by the first pupil function applied to the first conversion unit 104a. To do.
  • the transverse wave light irradiated to the second conversion unit 104b is reflected as second converted light that is two-dimensionally given phase modulation to the polarization component and converted by the second pupil function applied to the second conversion unit 104b. .
  • the first conversion unit 104a and the second conversion unit 104b are arranged at the position of the optical pupil, the first conversion unit 104a and the second conversion unit 104b are arranged by the two-dimensional distribution of the parts phase-modulated by the first conversion unit 104a and the second conversion unit 104b.
  • the pupil function of the optical system composed of the first relay lens 102b and the second relay lens 102c is determined.
  • the image acquired by the fluorescence microscope 3 passes through the second relay lens 102c, forms an image once, and is further transmitted to the image information generation unit 106 by the subsequent optical system, and is received by the light receiving surface of the image information acquisition unit 106a. Imaged.
  • the light that has passed through the third relay lens 102f is again divided into two by the second polarization beam splitter 102g according to the polarization component.
  • the two lights pass through the fourth relay lens 102k and the fifth relay lens 102m, are combined by the third polarization beam splitter 102h, and are transmitted to the image information acquisition unit 106a.
  • the image information acquisition unit 106a is, for example, a CCD camera.
  • the first conversion unit 104a and the second conversion unit 104b a reflective liquid crystal mirror array having a pixel size of 10.4 ⁇ m, a number of pixels of 1400 horizontal, and 1050 vertical is used.
  • an epi-illumination fluorescence microscope was used as the fluorescence microscope 3
  • an objective lens having a numerical aperture of 1.45 and a magnification of 60 times was selected as the objective lens.
  • the magnification of the relay optical composed of the first relay lens 102b and the second relay lens 102c is 5 times.
  • FIG. 2 is a diagram showing a point image distribution of fluorescent beads in the observation apparatus 100 in which all pixels absorb light in the second conversion unit 104b and all pixels reflect light in the first conversion unit 104a. It is.
  • the first conversion unit 104a is used, and the optical path including the second conversion unit 104b is not used. Under the above conditions, the phase was shifted by ⁇ / 4 in all the microarrays of the first conversion unit 104a, and fluorescent beads having a diameter of 100 nm were measured.
  • FIG. 2 (a) shows the point image distribution of fluorescent beads in the XZ plane.
  • the horizontal axis indicates the horizontal axis (X axis), and the vertical axis indicates the optical axis (Z axis).
  • the first conversion unit 104a is unshielded at all positions on the light receiving surface, which means that each pixel reflects light on the light receiving surface of the first conversion unit 104a.
  • FIG. 2B shows a point image distribution in the X-axis direction.
  • the horizontal axis indicates the X-axis position, and the vertical axis indicates the light intensity.
  • the point image distribution in the X-axis direction indicates the horizontal resolution of the microscope. Point images emitted from points smaller than the diffraction limit approximately follow a Gaussian distribution.
  • the resolution of the microscope is defined by the half width of the point image distribution shown in FIG.
  • the horizontal resolution was 225 nm.
  • FIG. 2C shows a point image distribution in the Z-axis direction.
  • the horizontal axis indicates the Z-axis position, and the vertical axis indicates the light intensity.
  • the point image distribution in the Z-axis direction indicates the optical axis resolution of the microscope.
  • the point image distribution emitted from a point smaller than the diffraction limit theoretically follows a Gaussian distribution even in the Z-axis direction.
  • the distribution deviates from the Gaussian distribution due to the spherical aberration of the optical system forming the image.
  • Spherical aberration causes a reduction in the optical axis resolution of the microscope.
  • the optical axis resolution was 1472 nm.
  • FIG. 3 is a diagram showing a point image distribution of fluorescent beads in the observation apparatus 100 in which all pixels absorb light in the second conversion unit 104b and various donut-shaped pupil functions are given to the first conversion unit 104a. is there.
  • a region surrounded by the donut-shaped inner ring and outer ring functions as a non-shielding region for the pupil function.
  • the inner ring and the outer ring have a substantially circular shape, and the diameter of the circumference corresponding to the outer ring is larger than the diameter of the circumference corresponding to the inner ring.
  • the pupil function can be changed by changing the phase of the area surrounded by the inner ring and the outer ring, or changing the transmittance and the reflectance of the surrounded area.
  • the degree of phase change in the enclosed region is ⁇ / 4.
  • a pupil indicates the shape of a given pupil function
  • PSF Point Spread Function
  • the horizontal axis indicates the X-axis position
  • the vertical axis indicates the light intensity
  • the horizontal axis indicates the Z axis position
  • the vertical axis indicates the light intensity.
  • FIG. 3A shows a point image distribution of fluorescent beads in the observation apparatus 100 in which the first conversion unit 104a is provided with a donut-shaped pupil function having an inner ring diameter of 208 ⁇ m and an outer ring diameter of 832 ⁇ m.
  • FIG. 3B shows a point image distribution of fluorescent beads in the observation device 100 in which the first conversion unit 104a is provided with a donut-shaped pupil function having an inner ring diameter of 208 ⁇ m and an outer ring diameter of 1040 ⁇ m.
  • FIG. 3C shows a point image distribution of fluorescent beads in the observation device 100 in which the first conversion unit 104a is provided with a donut-shaped pupil function having an inner ring diameter of 208 ⁇ m and an outer ring diameter of 1248 ⁇ m.
  • FIG. 3A shows a point image distribution of fluorescent beads in the observation apparatus 100 in which the first conversion unit 104a is provided with a donut-shaped pupil function having an inner ring diameter of 208 ⁇ m and an outer ring diameter of 832
  • FIG. 3D shows a point image distribution of fluorescent beads in the observation device 100 in which the first conversion unit 104a is provided with a donut-shaped pupil function having an inner ring diameter of 416 ⁇ m and an outer ring diameter of 1040 ⁇ m.
  • FIG. 3E shows a point image distribution of fluorescent beads in the observation device 100 in which a donut-shaped pupil function having an inner ring diameter of 624 ⁇ m and an outer ring diameter of 1040 ⁇ m is given to the first converter 104a.
  • FIG. 3F shows the point image distribution of fluorescent beads in the observation device 100 in which the first conversion unit 104a is provided with a donut-shaped pupil function having an inner ring diameter of 832 ⁇ m and an outer ring diameter of 1040 ⁇ m.
  • the value of the ratio between the diameter of the doughnut-shaped inner ring and the diameter of the outer ring is in the range of 1/6 to 4/5.
  • the optical axis resolution is improved by providing the conversion unit 104 with a donut-shaped pupil function. It is considered that the effect of spherical aberration is reduced by the donut-shaped pupil function.
  • the donut-shaped pupil function light is shielded at a portion (center portion) defined inside the inner ring, and light is not substantially shielded at a portion (surrounding portion) defined by a region between the outer ring and the inner ring.
  • the reflected light intensity of the portion defined inside the inner ring is substantially zero, and the reflected light intensity of the portion defined in the region between the outer ring and the inner ring is approximately 1 (normalized by the maximum value). )).
  • wheel is zero.
  • the incoming light 2 is converted into converted light by the conversion unit 104 modulating the intensity of the incoming light 2.
  • the first and second conversion units 104a and 104b an arbitrary pupil function can be realized by appropriately adjusting the reflectance of each pixel on the light receiving surface.
  • the point image distribution corresponds to the power spectrum of the Fourier transform of the pupil function
  • the portion corresponding to the inner side of the inner ring in the above-described donut-shaped pupil function corresponds to the low frequency component of the point image distribution. Yes. Therefore, the resolution can be improved by removing the light in this portion.
  • the horizontal resolution was 233 nm and the optical axis resolution was 942 nm.
  • improving the optical axis resolution indicates the same effect as that of the confocal microscope, and thus means that a fluorescence tomographic image can be acquired.
  • FIG. 4 is a conceptual diagram of an image acquired by the image information generation unit 106.
  • Different pupil functions may be given to each of the first conversion unit 104a and the second conversion unit 104b. Therefore, the image information generation unit 106 can acquire an image based on the converted light converted by two different pupil functions (first pupil function and second pupil function) as one image.
  • images provided with two different pupil functions are arranged in parallel on the top and bottom or the left and right of the image, and can be acquired as one image. .
  • Image F 1 denotes an image based on the converted light is converted by the first conversion unit 104a
  • the image F 2 shows an image based on the converted light is converted by the second conversion unit 104b.
  • image F 1, F 2 of the XY plane in FIG. 4 shows image F 1, F 2 of the XY plane in FIG. 4, the image F 1, F 2 is X-axis, the optical axis as well as Y-axis direction (Z-axis) also have a direction component Yes.
  • the images F 1 and F 2 having components in the XYZ directions are acquired by moving the objective lens of the fluorescence microscope 3 in the optical axis (Z axis) direction.
  • Image information processing unit 106b adds the image information acquisition unit images F obtained by 106a 1 and the image F 2, may be subtracted or multiplied.
  • a donut-shaped pupil function having an outer diameter of 1040 ⁇ m and an inner diameter of 208 ⁇ m is given to the first converter 104a
  • a donut-shaped pupil function having an outer diameter of 1040 ⁇ m and an inner diameter of 832 ⁇ m is given to the second converter 104b.
  • the point image distribution in the image F 1 is the distribution shown in FIG. 3B
  • the point image distribution in the image F 2 is the distribution shown in FIG.
  • Image information processing unit 106b divides one image obtained from the image information acquisition unit 106a in the image F 1 and image F 2, adds the image F 1 and image F 2, subtracted or multiplied, new A single image can be created.
  • the unit of the result of addition or subtraction indicates the light intensity, but the unit of the result of multiplication does not indicate the light intensity. However, the result of multiplication corresponds to the light intensity. For this reason, even when the first pupil function and the second pupil function are equal, the result of multiplication can be used.
  • the optical path length of the optical system passing through the second conversion unit 104b moves the second conversion unit 104b by minute changes, by multiplying the image F 1 and image F 2, to improve the resolution Can do.
  • an image related to the object to be observed 1 based on the first converted light obtained by converting the incoming light 2 using the first pupil function and the second converted light converted using the second pupil function.
  • the converted light reflected by different pupil functions has different intensity distributions. When different intensity distributions are overlapped or the difference between different intensity distributions is taken, the difference between the peak intensity and other intensities becomes clearer, and the spread of the intensity distribution of incoming light coming from the observed object is suppressed. I can do it. As a result, it is possible to obtain a clear image in which blur is eliminated from the two-dimensional tomographic image information obtained using the incoming light coming from the object to be observed.
  • the conversion unit 104 includes a first conversion unit 104a and a second conversion unit 104b. That is, the conversion unit 104 includes separate first conversion unit 104a and second conversion unit 104b. As a result, the incoming light 2 can be converted into the first converted light and the second converted light at the same time, and image information with less blur can be generated quickly and reliably.
  • FIG. 5 gives the first converter 104a a donut-shaped first pupil function (see FIG. 3B) having an outer ring diameter of 1040 ⁇ m and an inner ring diameter of 208 ⁇ m, and the outer diameter of the outer ring is given to the second converter 104b.
  • Image information was generated based on the intensity difference (subtraction) between the first converted light converted by the first pupil function and the second converted light converted by the second pupil function.
  • FIG. 5A shows a point image distribution in the XZ plane.
  • the horizontal axis indicates the horizontal axis
  • the vertical axis indicates the optical axis.
  • FIG. 5B shows a point image distribution in the X-axis direction.
  • the horizontal axis indicates the X-axis position
  • the vertical axis indicates the light intensity.
  • FIG. 5C shows a point image distribution in the Z-axis direction.
  • the horizontal axis indicates the Z-axis position, and the vertical axis indicates the light intensity.
  • the distribution function has a Laplacian filter-like shape.
  • the Laplacian filter has an effect of making an image edge (boundary) stand out in image processing.
  • FIG. 5C shows that the edge stands out in the Z-axis direction although it is asymmetrical in the vertical direction along the Z-axis.
  • the first pupil function and the second pupil function are donut-shaped functions having an inner ring and an outer ring, and the first conversion unit 104a and the second conversion unit 104b have their respective inner and outer rings.
  • the region surrounded by is made to function as a non-shielding region of the first pupil function and the second pupil function. Accordingly, it is possible to prevent reflection of the incoming light 2 arriving at a region outside the donut-shaped outer ring in the conversion unit 104. As a result, the influence of spherical aberration due to the optical system of the observation apparatus 100 is reduced, and the optical axis resolution can be improved.
  • reflection of incoming light that has arrived in a region inside the donut-shaped inner ring of the conversion unit 104 can be prevented. Therefore, it is possible to eliminate the influence of noisy light that has arrived in the region inside the donut-shaped inner ring. As a result, a clearer image can be obtained.
  • FIG. 6 is a diagram showing the point image distribution of the fluorescent beads after the focal length of the incoming light 2 is changed by the movement of the second conversion unit 104b.
  • a first donut-shaped pupil function (see FIG. 3B) having an outer ring diameter of 1040 ⁇ m and an inner ring diameter of 208 ⁇ m is given to the first converter 104a, and an outer ring diameter of 1040 ⁇ m is given to the second converter 104b.
  • a donut-shaped second pupil function (see FIG. 3F) having a diameter of 832 ⁇ m is given.
  • the focal length of the light was changed by 200 nm by moving the second conversion unit 104b to slightly change the optical path length of the optical system passing through the second conversion unit 104b.
  • the position changing unit 110 can also change the focal length by moving the fifth relay lens 102m in the optical axis direction. After moving the focal length, image information is generated based on a difference (subtraction) in intensity between the first converted light converted by the first pupil function and the second converted light converted by the second pupil function.
  • FIG. 6A shows the point image distribution in the XZ plane.
  • the horizontal axis indicates the horizontal axis, and the vertical axis indicates the optical axis.
  • FIG. 6B shows a point image distribution in the X-axis direction.
  • the horizontal axis indicates the X-axis position, and the vertical axis indicates the light intensity.
  • FIG. 6C shows a point image distribution in the Z-axis direction.
  • the horizontal axis indicates the Z-axis position, and the vertical axis indicates the light intensity. Comparing FIG. 6C with FIG. 5C, it is vertically symmetrical along the Z axis, and shows that the edge is more prominent in the Z axis direction.
  • the horizontal resolution is 222 nm and the optical axis resolution is 702 nm.
  • the optical axis resolution in FIG. 6 was improved about twice as compared with the example described with reference to FIG. Further, the horizontal resolution was equivalent.
  • the function changing unit 109 can change at least one of the first pupil function and the second pupil function. For example, even when image information that is not suitable for observation is obtained by combining the first pupil function and the second pupil function, at least one of the first pupil function and the second pupil function is appropriately changed. Then, an image having a desired resolution with less blur can be obtained.
  • the focal position of the incoming light 2 can be changed by the position changing unit 110.
  • Changing the focal position of the incoming light 2 corresponds to changing the optical path length to the focal point of the incoming light 2. Therefore, the spread of the intensity distribution of the incoming light 2 can be changed. As a result, even when it is difficult to obtain a sufficient resolution only by combining the first pupil function and the second pupil function, an image having a desired resolution with less blur can be obtained by changing the focal position of the incoming light. .
  • observation device 100 is not limited to moving the fifth relay lens 102m in the optical axis direction by the position changing unit 110 as long as the focal position of the incoming light 2 can be changed.
  • the focal position of the incoming light 2 can be changed by moving the first conversion unit 104a or the second conversion unit 104b by the position changing unit 110.
  • FIG. 7 shows a first doughnut-shaped pupil function having an outer ring diameter of 1040 ⁇ m and an inner ring diameter of 832 ⁇ m for the first converter 104a, and an outer ring diameter of 624 ⁇ m and an inner ring diameter of 208 ⁇ m for the second converter 104b. It is a figure which shows the point image distribution of a fluorescent bead in the observation apparatus 100 which gave the donut-shaped 2nd pupil function.
  • the focal length of the second converted light by the second conversion unit 104b was changed to slightly change the optical path length of the optical system.
  • the position changing unit 110 moves the fifth relay lens 102m in the optical axis direction, thereby changing the focal length of the second converted light by the second converting unit 104b. After moving the focal length, image information is generated based on a difference (subtraction) in intensity between the first converted light converted by the first pupil function and the second converted light converted by the second pupil function.
  • FIG. 7A shows the point image distribution in the XZ plane.
  • the horizontal axis indicates the horizontal axis, and the vertical axis indicates the optical axis.
  • FIG. 7B shows a point image distribution in the X-axis direction.
  • the horizontal axis indicates the X-axis position, and the vertical axis indicates the light intensity.
  • FIG. 7C shows a point image distribution in the Z-axis direction.
  • the horizontal axis indicates the Z-axis position, and the vertical axis indicates the light intensity.
  • the function change unit 108 can change at least one of the first pupil function and the second pupil function by applying a voltage to the first conversion unit 104a and the second conversion unit 104b, for example. That is, the point image distribution in the images F 1 and F 2 can be changed, and the focal lengths of the first and second converted lights forming the images F 1 and F 2 are changed. Calculation of each image information is possible. Therefore, various point image distribution images can be acquired by the combination.
  • the effect of edge detection along the optical axis direction as is symmetrical up and down along the Z-axis to adjust the focal position for obtaining an image F 2 by the second conversion unit 104b.
  • the optical axis resolution was 744 nm, and the edge detection ability in the optical axis direction was lower than that shown in FIG.
  • the horizontal resolution is 170 nm, which exceeds the diffraction limit. If a decrease in resolution in the optical axis direction is allowed, the first converter 104a gives a donut-shaped pupil function having an outer ring diameter of 1248 ⁇ m and an inner ring diameter of 832 ⁇ m, and the second converter 104b has an outer ring diameter of 624 ⁇ m.
  • the optical axis resolution is improved to 962 nm and the horizontal resolution is increased to 142 nm.
  • the observer can specify a point image distribution that is optimal for the object to be observed 1. Further, the point image distribution can be optimally designated by changing the magnification and numerical aperture of the objective lens.
  • the value of the ratio between the diameter of the inner ring of the donut shape and the diameter of the outer ring is 1/6 to 4/5. If the value of the ratio between the diameter of the inner ring of the donut and the diameter of the outer ring is in this range, the spread of the intensity distribution of the incoming light 2 can be reliably suppressed. As a result, it is possible to obtain a clear image in which blur is eliminated from the two-dimensional tomographic image information obtained by using the incoming light 2.
  • FIG. 8A shows the first pupil function and the point image distribution.
  • a region where light is not substantially shielded is shown in white.
  • the non-shielding region is represented by a substantially circular shape.
  • the horizontal axis indicates the number of pixel units in the CCD camera.
  • the light intensity distribution substantially follows a Gaussian distribution.
  • the half width corresponds to the resolution, and here, the half width of the graph is 8.8.
  • FIG. 8B shows the second pupil function and the point image distribution.
  • the non-shielding region is shown in white.
  • the non-shielding region is represented by a substantially circular shape.
  • the non-shielding region of the second pupil function is smaller than that of the first pupil function.
  • Such a second pupil function can be said to be an apodization of the first pupil function.
  • FIG. 8C shows the difference between the first pupil function and the second pupil function and the difference between these point image distributions.
  • a region 8a indicates a region that is a non-shielding region in both the first pupil function and the second pupil function
  • a region 8b is a light of the first pupil function and the second pupil function.
  • a region with different shielding is shown
  • a region 8c shows a region that is a shielding region in both the first pupil function and the second pupil function.
  • the full width at half maximum is 7.0. Thus, the resolution can be improved by the difference between the point image distributions of different pupil functions.
  • the observation apparatus 100 can obtain a clear image from one frame image, and the temporal resolution of the observation apparatus 100 depends on the resolution of the image information generation unit 106.
  • the observation apparatus 100 can acquire a 500 Hz image.
  • the observation apparatus 100 has a time resolution several tens to several hundreds times that of a so-called scanning fluorescence microscope, and the observation apparatus 100 is preferably used for observing a biological material, for example.
  • a 60 ⁇ objective lens is used as the objective lens in the fluorescence microscope 3, but the magnification of the objective lens is not particularly limited.
  • a 150 ⁇ objective lens may be used.
  • FIG. 9A shows a schematic diagram in a state where light is not shielded. Such a state is realized, for example, by setting the reflectance to be the maximum value in all the pixels of the reflective liquid crystal mirror array.
  • FIG. 9B shows a point image distribution on the XZ plane when a shielding area (non-shielding area) is set as shown in FIG. 9A. Also here, an object to be observed having a size smaller than the diffraction limit of the microscope (for example, a fluorescent bead having a diameter of 100 nm) was used.
  • Fig. 10 (a) shows the first pupil function.
  • the first pupil function is a donut-shaped function defined by the inner ring and the outer ring.
  • a region between the inner ring and the outer ring does not block light, whereas a region surrounded by the inner ring and a region outside the outer ring block light.
  • the diameter of the circumference that defines the inner ring is 104 ⁇ m, and the diameter of the circumference that defines the outer ring is 312 ⁇ m.
  • FIG. 10B shows a point image distribution in the case of the first pupil function.
  • FIG. 11 (a) shows the second pupil function.
  • the second pupil function is also a donut-shaped function defined by the inner ring and the outer ring. Even in the second pupil function, the region between the inner ring and the outer ring does not block light, whereas the region surrounded by the inner ring and the region outside the outer ring block light.
  • the diameter of the circumference defining the inner ring is 312 ⁇ m, and the diameter of the circumference defining the outer ring is 624 ⁇ m.
  • FIG. 11B shows a point image distribution in the case of the second pupil function.
  • FIG. 12 (a) shows the point image distributions in the X-axis direction of FIGS.
  • the peak intensity of light is relatively high.
  • the horizontal resolution is 226 nm.
  • the peak intensity is lowered by setting the donut-shaped pupil function.
  • FIG. 12B shows the point image distributions in the Z-axis direction of FIGS. 9B, 10B, and 11B, respectively, with reference numerals 9b, 10b, and 11b.
  • the peak intensity of light is relatively high.
  • the optical axis resolution is 940 nm. Note that the peak intensity decreases as the shielding area increases.
  • the position indicating the peak intensity deviates from zero due to the setting of the donut-shaped pupil function.
  • FIG. 13A shows the difference between the point image distributions of the first and second pupil functions.
  • the horizontal axis represents the X axis
  • the vertical axis represents the Z axis.
  • FIG. 13B shows the point image distribution in the X direction
  • FIG. 13C shows the point image distribution in the Z direction.
  • the resolution in the horizontal direction is 147 nm
  • the resolution in the optical axis direction is 525 nm.
  • FIG. 13B and FIG. 13C show the point image distribution when light is not shielded by reference numeral 9b.
  • the resolution in the horizontal direction and the optical axis direction can be improved by the difference between the point image distributions of different pupil functions.
  • the horizontal resolution and the vertical resolution can be further improved by changing the focal position of the incoming light.
  • FIG. 14A shows the difference in the point image distribution obtained by appropriately moving the fourth and fifth relay lenses 102k and 102m in the observation apparatus 100 shown in FIG.
  • FIG. 14B shows the point image distribution in the X direction
  • FIG. 14C shows the point image distribution in the Z direction.
  • the resolution in the horizontal direction is 108 nm
  • the resolution in the optical axis direction is 463 nm.
  • the point image distribution when light is not blocked is indicated by reference numeral 9b.
  • the difference between the point image distributions of different pupil functions in the observation apparatus 100 is similar to digital image processing (digital high-pass filter), but according to the observation apparatus 100, the resolution (particularly the optical axis resolution) is higher than that of digital image processing. ) Can be further improved.
  • Gaussian filter processing is performed as digital image processing.
  • FIG. 15A shows the point image distribution on the XZ plane
  • FIGS. 15B to 15D show the point image distributions after the digital image processing.
  • FIG. 15B shows the result of performing Gaussian filter processing with a standard deviation of 2 pixels
  • FIG. 15C shows the intensity of the point image distribution of Gaussian filter processing with a standard deviation of 2 pixels in half
  • FIG. 15D shows the result of Gaussian filter processing with a standard deviation of 5 pixels.
  • FIG. 16A is a diagram showing the difference between the point image distribution shown in FIG. 15A and the point image distribution shown in FIG. 15B, and FIG. 16B and FIG. These show the point image distributions of the X axis and Z axis in FIG.
  • the resolution in the horizontal direction is 104 nm, and the resolution in the optical axis direction is 613 nm.
  • a point image distribution not subjected to digital image processing is indicated by reference numeral 15a for comparison.
  • FIG. 17A is a diagram showing the difference between the point image distribution shown in FIG. 15A and the point image distribution shown in FIG. 15D
  • FIG. 17B and FIG. These show the point image distributions of the X axis and Z axis in FIG.
  • the resolution in the horizontal direction is 157 nm
  • the resolution in the optical axis direction is 809 nm.
  • a point image distribution not subjected to digital image processing is indicated by reference numeral 15a for comparison. Even when digital image processing is performed with a relatively high standard deviation, the resolution of both the horizontal axis and the optical axis can be improved.
  • FIG. 18A is a diagram showing a difference between the point image distribution shown in FIG. 15A and the point image distribution shown in FIG. 15C
  • FIG. 18B and FIG. Respectively show the point image distributions of the X-axis and the Z-axis in FIG.
  • the resolution in the horizontal direction is 181 nm
  • the resolution in the optical axis direction is 730 nm.
  • a point image distribution not subjected to digital image processing is indicated by reference numeral 15a for comparison. In this way, by reducing the intensity of light to be subtracted from the original point image distribution, it is possible to prevent the tail of the point image distribution obtained by subtraction from becoming negative.
  • the resolution of the point image distribution can also be improved by digital image processing.
  • the difference in the point image distribution by the observation apparatus 100 is the same as that of such digital image processing, but is not actually the same. This is because a two-dimensional process is performed in digital image processing, whereas a three-dimensional process is performed in the observation apparatus 100, and aberrations exist in an actual optical system, and are not necessarily limited. The reason is considered not to be linear.
  • the resolution can be further improved.
  • FIG. 19 is a schematic diagram of an observation apparatus 200 according to Embodiment 2 of the present invention.
  • the observation apparatus 200 observes the observation object 1 based on the incoming light 2 coming from the observation object 1.
  • the observation apparatus 200 includes an optical system 202, a conversion unit 204 that converts the incoming light 2 into first converted light using a first pupil function, and converts the incoming light into second converted light using a second pupil function, and image information.
  • a generation unit 106, a function change unit 108, and a position change unit 110 are provided.
  • the optical system 202 is provided after the imaging plane of the fluorescence microscope 3.
  • the optical system 202 includes a slit 102a, a first relay lens 102b, a second relay lens 102c and a first mirror 102d, a first polarizing beam splitter 102e, a fifth relay lens 102m, a mirror 102j, and a beam splitter 202h. Is provided.
  • the constituent elements other than the beam splitter 202h and the conversion unit 204 provided in the optical system 202 have the same functions as the corresponding constituent elements included in the observation apparatus 100 described in the first embodiment. Is omitted.
  • the polarizing beam splitter 202h returns the optical path divided by the polarizing beam splitter 102e to one optical path.
  • the optical system 202 is not limited to the configuration illustrated in FIG. 19 as long as the incoming light 2 can be guided to the conversion unit 204 and the converted light can be guided to the image information generation unit 106.
  • the combination and arrangement of the relay lens, mirror, and polarization beam splitter are arbitrary.
  • a relay optical system including two lenses 102b, 102c, or 102m is used as a relay system for transmitting a real image acquired by the fluorescence microscope 3 to the image information generation unit 106.
  • a single lens is used.
  • An optical system may be employed.
  • the conversion unit 204 includes a third conversion unit 204a that converts the incoming light 2 with the first pupil function, and a fourth conversion unit 204b that converts the incoming light 2 with the second pupil function.
  • the 3rd conversion part 204a and the 4th conversion part 204b are arrange
  • transmissive members are used as the third conversion unit 204a and the fourth conversion unit 204b.
  • the transmissive member is a transmissive liquid crystal array.
  • image information related to the object to be observed 1 is generated based on the first converted light obtained by converting the incoming light 2 by the first pupil function and the second converted light converted by the second pupil function. . Therefore, the spread of the intensity distribution of the incoming light 2 can be suppressed. As a result, it is possible to obtain a clear image in which blur is eliminated from the two-dimensional tomographic image information obtained by using the incoming light 2.
  • a member that converts the incoming light 2 into the first converted light with the first pupil function and converts the incoming light 2 into the second converted light with the second pupil function may be a transmission type member instead of a reflective type member. Good.
  • the reflection type member and the transmission type member can be easily obtained at low cost as ready-made products. Therefore, the incoming light can be converted into the first converted light and the second converted light, respectively, with an inexpensive configuration without requiring a special configuration as the conversion unit.
  • the conversion unit may be a DMD (Digital Micromirror Device).
  • the DMD is an element in which micro-size mirrors are spread. By controlling the mirror in two states of on / off, the reflection direction of light can be adjusted, and a difference in brightness can be produced. By switching the state of each mirror at high speed, gradation can be realized by time division.
  • the number of conversion units is not limited to two.
  • the first conversion unit converts the incoming light 2 into the first converted light using the first pupil function
  • the second The conversion unit converts the incoming light 2 into the second converted light using the second pupil function
  • the third conversion unit converts the incoming light 2 into the third converted light using the third pupil function.
  • the image information generation unit generates image information related to the object to be observed based on the first converted light, the second converted light, and the third converted light.
  • the conversion unit converts the incoming light 2 into the first converted light with the first pupil function, and then changes the pupil function given to the conversion unit by the function changing unit into the second pupil function. After the function changing unit changes to the second pupil function, the converting unit converts the incoming light 2 into the second converted light using the second pupil function.
  • the image information generation unit generates image information related to the object to be observed based on the first converted light and the second converted light.
  • the following experiment was performed.
  • an observation object in which a HeLa cell line was fixed on a slide glass with formalin was observed.
  • a fluorescent dye (phalloidin obtained by crosslinking Alexa 488) was added to the object to be observed. Phalloidin binds to actin fibers, and intracellular actin fibers are stained with a fluorescent dye crosslinked to phalloidin.
  • the object to be observed was irradiated with light having a wavelength of 488 nm, and fluorescence of 510 nm or more coming from the object to be observed was observed.
  • the objective lens an objective lens having a magnification of 150 times with a numerical aperture of 1.45 was selected.
  • the magnification of the relay optics composed of the first relay lens 102b and the second relay lens 102c is twice.
  • the first converter 104a is provided with a donut-shaped first pupil function having an outer ring diameter of 728 ⁇ m and an inner ring diameter of 104 ⁇ m
  • the second converter 104b is provided with a donut-shaped first pupil function having an outer ring diameter of 520 ⁇ m and an inner ring diameter of 104 ⁇ m.
  • a two-pupil function was given to obtain a difference image between the images F 1 and F 2 .
  • FIG. 20 is a diagram showing an image observed by this example and an image observed by a conventional fluorescence microscope. It is the image which observed the actin fiber in the cell with the observation apparatus 100.
  • FIG. FIG. 20A shows a difference image between the image F 1 and the image F 2 observed according to the present embodiment.
  • FIG. 20B shows an image observed with a conventional fluorescence microscope. In both cases, actin fibers fluorescently labeled by Alexa 488 are confirmed. 20A and 20B are compared, it can be confirmed that the background light of the image of FIG. 20A is reduced and the actin fibers can be observed more clearly.
  • FIG. 21 is a graph showing the fluorescence intensity distribution in the cross-sectional portion indicated by the dotted line in FIG. Figure 21 (a) shows the intensity distribution of the obtained cross-sectional portion from the difference image to which the present embodiment the image F 1 are observed by the examples and the image F 2 (see FIG. 20 (a)).
  • FIG. 21B shows an intensity distribution of a cross-sectional portion obtained from an image (see FIG. 20B) observed with a conventional fluorescence microscope. By this example, it can be confirmed that the contrast of the fluorescence microscope image is improved.
  • a donut-shaped first pupil function having an outer ring diameter of 416 ⁇ m and an inner ring diameter of 104 ⁇ m is given to the first converter 104a
  • a donut having an outer ring diameter of 624 ⁇ m and an inner ring diameter of 312 ⁇ m is given to the second converter 104b. It gives a second pupil function of the shape, and obtains the difference image of the image F 1 and image F 2.
  • FIG. 22 is a diagram showing an image observed by this example and an image observed by a conventional fluorescence microscope. It is the image which observed the actin fiber in the cell with the observation apparatus 100.
  • FIG. FIG. 22A shows an image observed with a conventional fluorescence microscope
  • FIG. 22B shows a difference image between the images F 1 and F 2 observed in this example. In both cases, actin fibers fluorescently labeled by Alexa 488 are confirmed. Comparing FIG. 22 (a) and FIG. 22 (b), it can be confirmed that the background light of the image of FIG. 22 (b) is reduced and the actin fibers can be observed more clearly.
  • FIG. 23 shows the fluorescence intensity distribution in the cross-sectional portion shown by the dotted lines in FIG. 22 (a) and FIG. 22 (b). By this example, it can be confirmed that the contrast of the fluorescence microscope image is improved.
  • FIG. 24 (a) shows an image observed with a conventional fluorescence microscope.
  • FIG. 24B shows an enlarged view of the region surrounded by the broken line in FIG. 24A
  • FIG. 24C shows the fluorescence intensity distribution in the broken line part in FIG.
  • FIG. 25A shows an image obtained by performing digital image processing on an image observed with a conventional fluorescence microscope. This image was obtained by the difference between the original image and an image obtained by a Gaussian filter having a standard deviation of 2 pixels.
  • FIG. 25B shows an enlarged view of the region surrounded by the broken line in FIG. 25A
  • FIG. 25C shows the fluorescence intensity distribution in the broken line part in FIG.
  • FIG. 25C shows the fluorescence intensity distribution shown in FIG. 24C together with reference numeral 24c.
  • a Gaussian filter improves the contrast ratio.
  • FIG. 26 (a) shows an image obtained by performing digital image processing on an image observed with a conventional fluorescence microscope. This image was obtained by the difference between the original image and an image obtained by a Gaussian filter having a standard deviation of 5 pixels.
  • FIG. 26B shows an enlarged view of a region surrounded by a broken line in FIG. 26A
  • FIG. 26C shows a fluorescence intensity distribution in a broken line part in FIG.
  • the fluorescence intensity distribution shown in FIG. 24 (c) is also indicated by reference numeral 24c.
  • a Gaussian filter improves the contrast ratio.
  • FIG. 27A shows an image observed with the observation apparatus 100.
  • FIG. 27B shows an enlarged view of a region surrounded by a broken line in FIG. 27A
  • FIG. 27C shows a fluorescence intensity distribution in a broken line part in FIG. 27B.
  • FIG. 27C also shows the fluorescence intensity distribution shown in FIG.
  • the contrast ratio is improved by the observation apparatus 100. As can be understood from the comparison between FIG. 27C, FIG. 25C, and FIG. 26C, the observation apparatus 100 was able to further improve the contrast ratio as compared with the digital image processing. .
  • FIG. 28A shows an image of cadherin observed with the observation apparatus 100 at a certain time.
  • 28 (b), FIG. 28 (c), FIG. 28 (d), FIG. 28 (e), FIG. 28 (f), and FIG. 28 (g) are respectively 20 ms and 40 ms with reference to FIG. 28 (a).
  • Images after 60 ms, 80 ms, 120 ms, and 240 ms are shown.
  • FIGS. 28 (a) to 28 (f) cadherin detachment was observed.
  • FIG. 29 shows the time change of the light intensity distribution in the portion indicated by the broken line in FIG.
  • 0 ms, 40 ms, 50 ms, 54 ms, 56 ms, 58 ms, 60 ms, 120 ms, and 240 ms respectively indicate fluorescence intensity distributions with 0 ms as a reference time.
  • the cadherin divergence could also be grasped from the temporal change in the fluorescence intensity distribution.
  • the observation apparatus and observation method according to the present invention can be widely used in the field of image generation using an optical microscope. Further, by incorporating the observation apparatus and observation method according to the present invention into an optical microscope, the added value of the optical microscope itself is increased, and it can be widely used in the field of optical microscopes.

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Abstract

　被観察物１から到来する到来光２に基づいて被観察物１を観察する観察装置１００は、到来光２を第１瞳関数で第１変換光に変換し、かつ到来光２を第２瞳関数で第２変換光に変換する変換部１０４と、到来光２を第１瞳関数によって変換した第１変換光と、到来光を第２瞳関数によって変換した第２変換光とに基づいて、被観察物１に関する画像情報を生成する画像情報生成部１０６とを備える。第２瞳関数は第１瞳関数とは異なることが好ましい。

Description

観察装置及び観察方法
　本発明は、被観察物から到来する到来光に基づいて被観察物を観察する観察装置及び観察方法に関する。
　光学顕微鏡を用いる場合、被観察物に光を照射し、被観察物から到来する到来光（反射光、透過光又は蛍光等）をレンズによって結像させて被観察物を観察する。到来光として蛍光を用いる蛍光顕微鏡には、非走査型と走査型とがある。非走査型蛍光顕微鏡では、特定の波長の光（励起光）だけを被観察物に照射し被観察物が発する蛍光をレンズで結像させて被観察物を観察する。被観察物が発する蛍光の波長は励起光の波長とは異なるため、フィルタなどで蛍光のみを取り出し、２次元断層画像を得ることができる。走査型蛍光顕微鏡には、２次元断層画像を取得するものとして、共焦点光学型顕微鏡がある。共焦点光学型顕微鏡では、被観察物に対し２次元断層面に沿ってレーザー走査し、被観察物から到来する点光を取得する。焦点が合致した画像からのみ構成される２次元断層画像を取得し得るため、ボケの少ない画像を生成し被観察物を観察しえる（特許文献１、２）。
米国特許第５５８７８３２号公報 特許第３６３４３４３号公報
　しかし、非走査型蛍光顕微鏡によって取得した２次元断層画像では、焦点が合致した画像と焦点が合致しない画像とが重なって見える。焦点位置までの光路長と非焦点位置までの光路長とが異なるにも拘らず、同一断層面の画像として観察するからである。従って、厚みのある被観察物を観察する場合、被観察画像を示す画像にはボケが多く含まれる。その結果、ボケを排除した鮮明な画像を得ることができない。
　また、走査型蛍光顕微鏡では、被観察物に対し２次元断層面に沿ってレーザー走査し、被観察物から到来する点光を取得するため、ボケの少ない画像を生成するためには走査タイミングと点光取得タイミングとを厳格に同期させなければならない。その結果、観察装置において、高額で高精度な同期手段を必要とする。更に、被観察物に対し２次元断層面に沿ってレーザー走査するため、被観察物の２次元断層画像取得時間は走査時間に律速となる。
　本発明は、上記課題に鑑みてなされたものであり、その目的は、被観察物から到来する到来光を利用して得た２次元断層画像情報からボケを排除した鮮明な画像を得ることができる観察装置及び観察方法を提供することにある。
　上記課題を解決するために、本発明に係る観察装置は、被観察物から到来する到来光に基づいて前記被観察物を観察する観察装置であって、前記到来光を第１瞳関数で第１変換光に変換し、かつ前記到来光を第２瞳関数で第２変換光に変換する変換部と、前記第１変換光と、前記第２変換光とに基づいて、前記被観察物に関する画像情報を生成する画像情報生成部とを備える。
　背景技術の項目で説明したように、従来の非走査型蛍光顕微鏡によって取得した２次元断層画像では、焦点が合致した画像と焦点が合致しない画像とが重なって見える。従って、厚みのある被観察物を観察する場合、被観察画像を示す画像にはボケが多く含まれる。その結果、ボケを排除した鮮明な画像を得ることができない。また、従来の走査型蛍光顕微鏡では、被観察物に対し２次元断層面に沿ってレーザー走査し、被観察物から到来する点光を取得するため、ボケの少ない画像を生成するためには走査タイミングと点光取得タイミングとを厳格に同期させなければならない。その結果、観察装置において、高額で高精度な同期手段を必要とする。更に、被観察物に対し、２次元断層画像取得時間は走査時間に律速となる。
　一方、本発明の観察装置によれば、被観察物から到来する到来光を第１瞳関数によって変換した第１変換光と、第２瞳関数によって変換した第２変換光とに基づいて、被観察物に関する画像情報を生成する。例えば、異なる瞳関数で変換された変換光は、異なった強度分布を有する。異なった強度分布を重ね合わせたり、異なった強度分布の差分をとったりすると、ピーク強度とその他の強度との差がより明確になり、被観察物から到来する到来光の強度分布の広がりを抑えることが出来る。その結果、被観察物から到来する到来光を利用して得た２次元断層画像情報からボケを排除した鮮明な画像を得ることができる。
　本発明の観察装置の好適な態様によれば、前記第１瞳関数と前記第２瞳関数とのうちの少なくとも一方を変更する瞳関数変更部を更に備える。例えば、第１瞳関数と第２瞳関数との組み合わせによって、ボケが多く観察に適さない画像情報を得た場合でも、第１瞳関数と第２瞳関数とのうちの少なくとも一方を適切に変更すれば、ボケの少ない所望の分解能を有する画像を得ることができる。
　本発明の観察装置の好適な態様によれば、前記変換部は、前記到来光を前記第１瞳関数で変換する第１変換部と、前記到来光を前記第２瞳関数で変換する第２変換部とを含む。すなわち、変換部は、別々の第１変換部と第２変換部とで構成される。その結果、到来光の第１変換光及び第２変換光への変換を同時に行うことができ、ボケの少ない画像情報を迅速且つ確実に効率よく生成し得る。
　本発明の観察装置の好適な態様によれば、前記変換部は、反射型部材又は透過型部材を含む。反射型部材及び透過型部材は、既製品として容易に安価で入手し得る。従って、変換部として特別な構成を必要とすることなく、安価な構成で、到来光を第１変換光及び第２変換光に夫々変換することができる。
　本発明の観察装置の好適な態様によれば、前記到来光の焦点位置を変更する焦点位置変更部を更に備える。例えば、到来光の焦点位置の変更は、到来光の焦点までの光路長を変化させることによって実現でき、これにより、被観察物から到来する到来光の強度分布の広がりを変更することが出来る。その結果、第１瞳関数と第２瞳関数との組み合わせのみでは十分な分解能を得難い場合でも、到来光の焦点位置を変更することによって、ボケの少ない所望の分解能を有する画像を得ることができる。
　本発明の観察装置の好適な態様によれば、前記第１瞳関数及び前記第２瞳関数は、互いに内輪と外輪とを有する二次元ドーナツ形状の関数であり、前記第１変換部及び前記第２変換部は、夫々の内輪と外輪とで囲まれる領域を前記第１瞳関数及び前記第２瞳関数の非遮蔽領域として機能させる。この場合、変換部において、ドーナツ形状の外輪よりも外側の領域に到来した到来光を遮蔽することが出来、観察装置の光学系に起因する球面収差の影響が低減され、光軸分解能を向上させることが出来る。更に、変換部において、ドーナツ形状の内輪よりも内側の領域に到来した到来光を遮蔽することが出来、ドーナツ形状の内輪よりも内側の領域に到来したノイズの多い光の影響を排除することができる。その結果、更に鮮明な画像を得ることができる。
　本発明の観察装置の好適な態様によれば、前記二次元ドーナツ形状の関数において、前記内輪の径と前記外輪の径との比の値は、１／６～４／５である。内輪の径と外輪の径との比の値がこの程度の範囲であれば、被観察物から到来する到来光の強度分布の広がりを確実に抑えることが出来る。その結果、被観察物から到来する到来光を利用して得た２次元断層画像情報からボケを排除した鮮明な画像を得ることができる。
　上記課題を解決するため、本発明に係る観察方法は、被観察物から到来する到来光に基づいて前記被観察物を観察する観察方法であって、前記到来光を第１瞳関数で第１変換光に変換し、かつ前記到来光を第２瞳関数で第２変換光に変換する変換ステップと、前記第１変換光と、前記第２変換光とに基づいて、前記被観察物に関する画像情報を生成する画像情報生成ステップとを包含する。
　本発明に係る観察方法によれば、上述した本発明の観察装置と同様の作用効果を奏する。すなわち、本発明の観察方法によれば、被観察物から到来する到来光を第１瞳関数によって変換した第１変換光と、第２瞳関数によって変換した第２変換光とに基づいて、被観察物に関する画像情報を生成する。例えば、異なる瞳関数で変換された変換光は、異なった強度分布を有する。異なった強度分布を重ね合わせたり、異なった強度分布の差分をとったりすると、ピーク強度とその他の強度との差がより明確になり、被観察物から到来する到来光の強度分布の広がりを抑えることが出来る。その結果、被観察物から到来する到来光を利用して得た２次元断層画像情報からボケを排除した鮮明な画像を得ることができる。
　本発明の観察方法の好適な態様によれば、前記第１瞳関数と前記第２瞳関数とのうちの少なくとも一方を変更する瞳関数変更ステップを更に包含する。例えば、第１瞳関数と第２瞳関数との組み合わせによって、ボケが多く観察に適さない画像情報を得た場合でも、第１瞳関数と第２瞳関数とのうちの少なくとも一方を適切に変更すれば、ボケの少ない所望の分解能を有する画像を得ることができる。
　本発明の観察方法の好適な態様によれば、前記変換ステップは、前記到来光を前記第１瞳関数で変換する第１変換ステップと、前記到来光を前記第２瞳関数で変換する第２変換ステップとを含む。すなわち、変換ステップとして、別々の第１変換ステップと第２変換ステップとを実行する。その結果、到来光の第１変換光及び第２変換光への変換を同時に行うことができ、ボケの少ない画像情報を迅速且つ確実に効率よく生成し得る。
　本発明の観察方法の好適な態様によれば、変換ステップによる前記到来光の焦点位置を変更する焦点位置変更ステップを更に包含する。到来光の焦点位置の変更は、到来光の焦点までの光路長を変化することによって実現でき、これにより、被観察物から到来する到来光の強度分布の広がりを変更することが出来る。その結果、第１瞳関数と第２瞳関数との組み合わせのみでは十分な分解能を得難い場合でも、到来光の焦点位置を変更することによって、ボケの少ない所望の分解能を有する画像を得ることができる。
　また、上記課題を解決するために、本発明に係る観察装置は、被観察物から到来する到来光に基づいて前記被観察物を観察する観察装置であって、前記到来光の強度を少なくとも１つの瞳関数で変調することによって前記到来光を変換光に変換する変換部と、前記変換光に基づいて前記被観察物に関する画像情報を生成する画像情報生成部とを備え、前記少なくとも１つの瞳関数は、遮蔽領域と、前記遮蔽領域の周囲に配置された非遮蔽領域とを有する。
　また、上記課題を解決するため、本発明に係る観察方法は、被観察物から到来する到来光に基づいて前記被観察物を観察する観察方法であって、前記到来光の強度を少なくとも１つの瞳関数で変調することによって前記到来光を変換光に変換する変換ステップと、前記変換光に基づいて前記被観察物に関する画像情報を生成する画像情報生成ステップとを包含し、前記変換ステップにおいて、前記少なくとも１つの瞳関数は、遮蔽領域と、前記遮蔽領域の周囲に配置された非遮蔽領域とを有する。
　本発明の観察装置および観察方法によれば、非遮蔽領域よりも内側の遮蔽領域に到来した到来光を遮蔽し、これにより、遮蔽領域に到来するノイズの多い光の影響を排除することができる。その結果、被観察物から到来する到来光を利用して得た２次元断層画像情報からボケを排除した鮮明な画像を得ることができる。
本発明の実施形態１に係る観察装置の模式図である。 第２変換部においてすべての画素が光を吸収し、第１変換部においてすべての画素が光を反射するようにした観察装置において、蛍光ビーズの点像分布を示す図であり、（ａ）はＸ－Ｚ平面の点像分布を示す図であり、（ｂ）および（ｃ）は、それぞれＸ軸方向およびＺ軸方向の点像分布を示すグラフである。 第２変換部においてすべての画素が光を吸収するとともに、第１変換部に様々なドーナツ形状の瞳関数を与えた観察装置において、蛍光ビーズの点像分布を示す図であり、（ａ）～（ｆ）のそれぞれにおいて、瞳関数、Ｘ－Ｚ平面の点像分布、Ｘ軸方向の点像分布を示すグラフ、および、Ｚ軸方向の点像分布を示すグラフを示す。 画像情報生成部が取得する画像の概念図である。 第１変換部に外輪の直径が１０４０μｍ、内輪の直径が２０８μｍのドーナツ形状の第１瞳関数を与え、第２変換部に外輪の直径が１０４０μｍ、内輪の直径が８３２μｍのドーナツ形状の第２瞳関数を与えた観察装置において、蛍光ビーズの点像分布を示す図であり、（ａ）はＸ－Ｚ平面の点像分布を示す図であり、（ｂ）および（ｃ）は、それぞれＸ軸方向およびＺ軸方向の点像分布を示すグラフである。 図５に示した結果の得られた観察装置に対して、第２変換部の移動によって到来光の焦点距離を変更した後の蛍光ビーズの点像分布を示す図であり、（ａ）はＸ－Ｚ平面の点像分布を示す図であり、（ｂ）および（ｃ）は、それぞれＸ軸方向およびＺ軸方向の点像分布を示すグラフである。 第１変換部に外輪の直径が１０４０μｍ、内輪の直径が８３２μｍのドーナツ形状の第１瞳関数を与え、第２変換部に外輪の直径が６２４μｍ、内輪の直径が２０８μｍのドーナツ形状の第２瞳関数を与えた観察装置において、蛍光ビーズの点像分布を示す図であり、（ａ）はＸ－Ｚ平面の点像分布を示す図であり、（ｂ）および（ｃ）は、それぞれＸ軸方向およびＺ軸方向の点像分布を示すグラフである。 （ａ）は第１瞳関数とその点像分布を示す図であり、（ｂ）は第２瞳関数とその点像分布を示す図であり、（ｃ）は第１瞳関数と第２瞳関数との差分およびこれらの点像分布の差分を示す図である。 （ａ）は光が遮蔽されていないことを示す模式図であり、（ｂ）はＸ－Ｚ平面の点像分布を示す図である。 （ａ）は第１瞳関数を示す図であり、（ｂ）はＸ－Ｚ平面の点像分布を示す図である。 （ａ）は第２瞳関数を示す図であり、（ｂ）はＸ－Ｚ平面の点像分布を示す図である。 （ａ）は、図９（ｂ）、図１０（ｂ）および図１１（ｂ）に示した場合のＸ軸方向の点像分布を示すグラフであり、（ｂ）は、図９（ｂ）、図１０（ｂ）および図１１（ｂ）に示した場合のＺ軸方向の点像分布を示すグラフである。 （ａ）は図１０（ｂ）および図１１（ｂ）に示した点像分布の差分を示す図であり、（ｂ）および（ｃ）は、それぞれ（ａ）のＸ軸方向およびＺ軸方向の点像分布を示すグラフである。 （ａ）は図１３（ａ）に示した結果の得られた観察装置に対して到来光の焦点距離を変化させた後の点像分布を示す図であり、（ｂ）および（ｃ）は、それぞれ（ａ）のＸ軸方向およびＺ軸方向の点像分布を示すグラフである。 （ａ）はＸ－Ｚ平面の点像分布を示す図であり、（ｂ）～（ｄ）はデジタル画像処理によって得られた点像分布を示す図である。 （ａ）は図１５（ａ）と図１５（ｂ）に示した点像分布の差分を示す図であり、（ｂ）および（ｃ）は、それぞれ（ａ）のＸ軸方向およびＺ軸方向の点像分布を示すグラフである。 （ａ）は図１５（ａ）と図１５（ｄ）に示した点像分布の差分を示す図であり、（ｂ）および（ｃ）は、それぞれ（ａ）のＸ軸方向およびＺ軸方向の点像分布を示すグラフである。 （ａ）は図１５（ａ）と図１５（ｃ）に示した点像分布の差分を示す図であり、（ｂ）および（ｃ）は、それぞれ（ａ）のＸ軸方向およびＺ軸方向の点像分布を示すグラフである。 本発明の実施形態２に係る観察装置の模式図である。 （ａ）は実施例１において観察装置１００で観察された画像を示す図であり、（ｂ）は従来の蛍光顕微鏡で観察された画像を示す図である。 図２０に点線で示した箇所の断面における蛍光強度分布を示すグラフであり、（ａ）は観察装置１００で観察された画像の蛍光強度分布を示すグラフであり、（ｂ）は従来の蛍光顕微鏡で観察された画像の蛍光強度分布を示すグラフである。 （ａ）は従来の蛍光顕微鏡で観察された画像を示す図であり、（ｂ）は実施例２において観察装置１００で観察された画像を示す図である。 図２２（ａ）および図２２（ｂ）に点線で示した箇所の断面における蛍光強度分布を示すグラフである。 （ａ）はデジタル画像処理で得られた画像を示す図であり、（ｂ）は（ａ）の破線で囲まれた領域の拡大図であり、（ｃ）は（ｂ）の破線で示した箇所の断面における蛍光強度分布を示すグラフである。 （ａ）はデジタル画像処理で得られた画像を示す図であり、（ｂ）は（ａ）の破線で囲まれた領域の拡大図であり、（ｃ）は（ｂ）の破線で示した箇所の断面における蛍光強度分布を示すグラフである。 （ａ）はデジタル画像処理で得られた画像を示す図であり、（ｂ）は（ａ）の破線で囲まれた領域の拡大図であり、（ｃ）は（ｂ）の破線で示した箇所の断面における蛍光強度分布を示すグラフである。 （ａ）は実施例３において観察装置１００で観察された画像を示す図であり、（ｂ）は（ａ）の破線で囲まれた領域の拡大図であり、（ｃ）は（ｂ）の破線で示した箇所の断面における蛍光強度分布を示すグラフである。 （ａ）～（ｇ）は実施例４においてそれぞれ異なる時刻に観察装置１００で観察された画像を示す図である。 実施例４における観察装置１００で観察されたカドヘリンからの蛍光強度分布の時間変化を示す模式図である。
　図面を参照して、本発明の観察装置及び観察方法に関する実施形態を説明する。ただし、本発明は以下の実施形態に限定されるものではない。
　［実施形態１］
　図１は、本発明の実施形態１に係る観察装置１００の模式図である。観察装置１００は、被観察物１から到来する到来光２に基づいて被観察物１を観察する。観察装置１００は、光学系１０２と、到来光２を第１瞳関数で第１変換光に変換し、かつ到来光を第２瞳関数で第２変換光に変換する変換部１０４と、画像情報生成部１０６と、瞳関数変更部１０８と、焦点位置変更部１１０とを備える。なお、本明細書において、瞳関数変更部１０８および焦点位置変更部１１０をそれぞれ、関数変更部１０８および位置変更部１１０と呼ぶことがある。
　光学系１０２は、蛍光顕微鏡３の結像面以降に設けられている。光学系１０２は、結像面に配置された視野を限定するためのスリット１０２ａと、結像面の実像を画像情報生成部１０６にリレーするための第１リレーレンズ１０２ｂ、第２リレーレンズ１０２ｃ及び第１ミラー１０２ｄと、到来光２を偏光成分別に二つに分けるための第１偏光ビームスプリッタ１０２ｅと、第１リレーレンズ１０２ｂ及び第２リレーレンズ１０２ｃにより伝達された像を画像情報生成部１０６に伝達するための第３リレーレンズ１０２ｆ、第４リレーレンズ１０２ｋ、第５リレーレンズ１０２ｍ、第２ミラー１０２ｉ及び第３ミラー１０２ｊと、第１リレーレンズ１０２ｂ及び第２リレーレンズ１０２ｃにより伝達された像を偏光成分別に二つに分けるための第２偏光ビームスプリッタ１０２ｇと、分けられた像を再度結合させるための第３偏光ビームスプリッタ１０２ｈとを備える。
　尚、光学系１０２は、到来光２を変換部１０４に導き、変換光を画像情報生成部１０６に導くことができる限りは、図１に示された構成に限定されない。例えば、リレーレンズ、ミラー、偏光ビームスプリッタの組み合わせ、配置は任意である。本実施形態１では、蛍光顕微鏡３により取得された実像を画像情報生成部１０６へ伝達するために、２枚のレンズ１０２ｂ、１０２ｃから成るリレー光学系と、１０２ｆと１０２ｉあるいは１０２ｊから成るリレー光学系とを介する。本実施形態では、２枚のレンズからなるリレー光学系を用いたが、１枚のレンズによる光学系を採用し得る。なお、レンズ１０２ｂは、第１偏光ビームスプリッタ１０２ｅよりも上方に配置される。
　変換部１０４は、到来光２を第１瞳関数で変換する第１変換部１０４ａと、到来光２を第２瞳関数で変換する第２変換部１０４ｂとを含む。一般に、瞳関数は光の位相と強度のパラメータを有する関数である。なお、到来光２が蛍光である場合、光がインコヒーレントであるため、瞳関数は、光の強度のパラメータを有する関数となる。ここでは、瞳関数は、変換部の受光面での反射率で表される。異なる瞳関数で変換された変換光は、異なった強度分布を有する。異なった強度分布を重ね合わせたり、異なった強度分布の差分をとったりすると、ピーク強度とその他の強度との差がより明確になる。第１変換部１０４ａと第２変換部１０４ｂとは、第１リレーレンズ１０２ｂの光学瞳の位置（即ち焦点距離の位置）に配置される。第１変換部１０４ａと第２変換部１０４ｂとは、例えば、反射型部材を含む。ここでは、反射型部材として反射型液晶ミラーアレイが用いられている。
　画像情報生成部１０６は、到来光２を第１瞳関数によって変換した第１変換光と、到来光を第２瞳関数によって変換した第２変換光とに基づいて、被観察物１に関する画像情報を生成する。画像情報生成部１０６は、第１変換光の強度分布と第２変換光の強度分布とに基づいて被観察物１に関する画像情報を取得する画像情報取得部１０６ａと、取得した画像情報を処理する画像情報処理部１０６ｂとを備える。
　関数変更部１０８は、第１変換部１０４ａに与えられた第１瞳関数と第２変換部１０４ｂに与えられた第２瞳関数とのうちの少なくとも一方を変更する。関数変更部１０８は、第１変換部１０４ａと第２変換部１０４ｂとのうちの少なくとも一方に対して、瞳関数が変更するよう信号を出力する。例えば、第１変換部１０４ａと第２変換部１０４ｂとが反射型液晶ミラーアレイである場合は、関数変更部１０８は、第１変換部１０４ａと第２変換部１０４ｂとに電圧を印加することで液晶分子の傾きを制御し、瞳関数を変更することが出来る。
　位置変更部１１０は、到来光２の焦点位置を変更する。例えば、位置変更部１１０は到来光２の焦点位置を光軸方向に移動させ得る。ここでは、位置変更部１１０は第５リレーレンズ１０２ｍを光軸方向に移動させ得る。
　以下、図１を参照して被観察物１から到来した到来光２の光路を説明する。スリット１０２ａを通った到来光２は、第１偏光ビームスプリッタ１０２ｅにより、縦波と横波との二つの偏光成分に分解される。縦波光は、第１変換部１０４ａに照射され、横波光は、第２変換部１０４ｂに照射される。
　第１変換部１０４ａに照射された縦波光には、二次元的に偏光成分に位相変調が与えられ、第１変換部１０４ａに与えられた第１瞳関数によって変換された第１変換光として反射する。第２変換部１０４ｂに照射された横波光は、二次元的に偏光成分に位相変調が与えられ、第２変換部１０４ｂに与えられた第２瞳関数によって変換された第２変換光として反射する。即ち、第１偏光ビームスプリッタ１０２ｅにより分解された縦波光と横波光のうち、第１変換部１０４ａと第２変換部１０４ｂとにより位相変調された部分のみが、第１偏光ビームスプリッタ１０２ｅを通り、第２リレーレンズ１０２ｃ及び第１ミラー１０２ｄにより、画像情報生成部１０６へと伝達される。第１変換部１０４ａと第２変換部１０４ｂとは、光学瞳の位置に配置されているので、第１変換部１０４ａと第２変換部１０４ｂとによって位相変調された部位の二次元分布により、第１リレーレンズ１０２ｂ及び第２リレーレンズ１０２ｃからなる光学系の瞳関数が決定される。
　蛍光顕微鏡３により取得された像は、第２リレーレンズ１０２ｃを通り、一旦結像し、さらに後の光学系により、画像情報生成部１０６へと伝達され、画像情報取得部１０６ａの受光面にて結像される。第３リレーレンズ１０２ｆを通った光は、第２偏光ビームスプリッタ１０２ｇにより、再度、偏光成分に従い２つに分割される。二つの光はそれぞれ、第４リレーレンズ１０２ｋ、第５リレーレンズ１０２ｍを通り、第３偏光ビームスプリッタ１０２ｈにより結合され、画像情報取得部１０６ａへと伝達される。画像情報取得部１０６ａは、例えばＣＣＤカメラである。
　ここでは、第１変換部１０４ａと第２変換部１０４ｂとして、画素の大きさが１０．４μｍで、画素数が横１４００、縦１０５０の反射型液晶ミラーアレイを用いた。また、蛍光顕微鏡３として、落射型蛍光顕微鏡を用い、対物レンズとして、開口数１．４５の６０倍の倍率の対物レンズを選択した。第１リレーレンズ１０２ｂ及び第２リレーレンズ１０２ｃからなるリレー光学の倍率は５倍である。
　図２は、第２変換部１０４ｂにおいてすべての画素が光を吸収し、第１変換部１０４ａにおいてすべての画素が光を反射するようにした観察装置１００において、蛍光ビーズの点像分布を示す図である。変換部１０４における瞳関数の修飾と点像分布との相関を調べるために、第１変換部１０４ａのみを用い、第２変換部１０４ｂを含む光路は用いていない。上記条件において、第１変換部１０４ａの全ての微小アレイにおいて位相をπ／４移動させ、直径１００ｎｍの蛍光ビーズを計測した。
　図２（ａ）は、Ｘ－Ｚ平面における蛍光ビーズの点像分布を示す。横軸は水平軸（Ｘ軸）を示し、縦軸は光軸（Ｚ軸）を示す。第１変換部１０４ａは受光面全ての位置において非遮蔽であり、このことは、第１変換部１０４ａの受光面において各画素が光を反射することを意味する。図２（ｂ）は、Ｘ軸方向の点像分布を示す。横軸はＸ軸位置を示し、縦軸は光の強度を示す。Ｘ軸方向の点像分布は、顕微鏡の水平分解能を示す。回折限界よりも小さな点から発せられた点像は、近似的にガウス分布に従う。顕微鏡の分解能は、図２（ｂ）に示す点像分布の半値幅で定義される。観察装置１００によれば、水平分解能は、２２５ｎｍであった。図２（ｃ）は、Ｚ軸方向の点像分布を示す。横軸はＺ軸位置を示し、縦軸は光の強度を示す。Ｚ軸方向の点像分布は、顕微鏡の光軸分解能を示す。回折限界よりも小さな点から発せられた点像分布は、Ｚ軸方向においても、理論的には、近似的にガウス分布に従う。しかしながら、図２（ｃ）に示すように、像を形成する光学系の球面収差により、ガウス分布から外れた分布を示す。球面収差が顕微鏡の光軸分解能の低下を引き起こす。観察装置１００によれば、光軸分解能は、１４７２ｎｍであった。
　図３は、第２変換部１０４ｂにおいてすべての画素が光を吸収し、第１変換部１０４ａに様々なドーナツ形状の瞳関数を与えた観察装置１００において、蛍光ビーズの点像分布を示す図である。図３においては、ドーナツ形状の内輪と外輪とで囲まれる領域が瞳関数の非遮蔽領域として機能する。ここで、内輪および外輪はほぼ円周形状であり、外輪に対応する円周の直径は内輪に対応する円周の直径よりも大きい。なお、瞳関数は、内輪と外輪とで囲まれる領域の位相を変更したり、囲まれる領域の透過度、反射度を変更したりすることによって、変化させることができる。例えば、囲まれる領域の位相の変更度合いは、π／４である。図３において、瞳は、与えた瞳関数の形状を示し、ＰＳＦ（Ｐｏｉｎｔ　Ｓｐｒｅａｄ　Ｆｕｎｃｔｉｏｎ：点像分布関数）は、Ｘ－Ｚ平面における点像分布を示す。図２と同様にＸ軸における点像分布を示す図において、横軸はＸ軸位置を示し、縦軸は光の強度を示す。図２と同様にＺ軸における点像分布を示す図において、横軸はＺ軸位置を示し、縦軸は光の強度を示す。
　図３（ａ）は、第１変換部１０４ａに、内輪の直径が２０８μｍ、外輪の直径が８３２μｍであるドーナツ形状の瞳関数を与えた観察装置１００において、蛍光ビーズの点像分布を示す。図３（ｂ）は、第１変換部１０４ａに、内輪の直径が２０８μｍ、外輪の直径が１０４０μｍであるドーナツ形状の瞳関数を与えた観察装置１００において、蛍光ビーズの点像分布を示す。図３（ｃ）は、第１変換部１０４ａに、内輪の直径が２０８μｍ、外輪の直径が１２４８μｍであるドーナツ形状の瞳関数を与えた観察装置１００において、蛍光ビーズの点像分布を示す。図３（ｄ）は、第１変換部１０４ａに、内輪の直径が４１６μｍ、外輪の直径が１０４０μｍであるドーナツ形状の瞳関数を与えた観察装置１００において、蛍光ビーズの点像分布を示す。図３（ｅ）は、第１変換部１０４ａに、内輪の直径が６２４μｍ、外輪の直径が１０４０μｍであるドーナツ形状の瞳関数を与えた観察装置１００において、蛍光ビーズの点像分布を示す。図３（ｆ）は、第１変換部１０４ａに、内輪の直径が８３２μｍ、外輪の直径が１０４０μｍであるドーナツ形状の瞳関数を与えた観察装置１００において、蛍光ビーズの点像分布を示す。図３（ａ）～図３（ｆ）で示す例では、ドーナツ形状の内輪の径と外輪の径との比の値は、１／６～４／５の範囲である
　変換部１０４にドーナツ形状の瞳関数を与えることによって、光軸分解能が向上する。ドーナツ形状の瞳関数により、球面収差の影響が軽減されるからと考えられる。ドーナツ形状の瞳関数では、内輪の内側に規定される部分（中央部分）において光が遮蔽され、外輪と内輪の間の領域で規定される部分（周囲部分）において光が実質的に遮蔽されない。例えば、瞳関数は、内輪の内側に規定される部分の反射光強度はほぼゼロであり、外輪と内輪の間の領域で規定される部分の反射光強度はほぼ１（最大値で規格化したもの）となるように設定される。なお、外輪の外側に規定される部分の光強度（ここでは、反射光強度）はゼロである。このように、変換部１０４が到来光２の強度を変調することによって到来光２は変換光に変換される。
　なお、第１、第２変換部１０４ａ、１０４ｂとして反射型液晶ミラーアレイを用いる場合、受光面における各画素の反射率を適切に調整することにより、任意の瞳関数を実現することができる。また、点像分布は、瞳関数のフーリエ変換のパワースペクトルに対応しているといえ、上述したドーナツ形状の瞳関数における内輪の内側に対応する部分は点像分布の低周波成分に対応している。このため、この部分の光を取り除くことにより、分解能を向上させることができる。
　例えば、外輪の直径が１０４０μｍ、内輪の直径が２０８μｍのドーナツ形状の瞳関数（図３（ｂ）参照）を与えた場合には、水平分解能２３３ｎｍ、光軸分解能は９４２ｎｍであった。瞳関数として適切なドーナツ形状を与えることにより、水平分解能を低下させることなく、光軸分解能を向上させることが可能である。光学顕微鏡において、光軸分解能を向上させることは、共焦点顕微鏡と同等の効果を示すことであり、従って、蛍光断層画像を取得できることを意味する。
　図４は、画像情報生成部１０６が取得する画像の概念図である。第１変換部１０４ａと第２変換部１０４ｂとの各々に異なる瞳関数を与え得る。従って、画像情報生成部１０６には、二つの異なる瞳関数（第１瞳関数と第２瞳関数）によって変換した変換光に基づく画像が、一つの画像として取得され得る。スリット１０２ａによって視野を最適に調整し、二つの光路を調整することで、画像の上下、あるいは、左右に、二つの異なる瞳関数を与えられた画像が並列に並び、一つの画像として取得され得る。
　画像Ｆ１は第１変換部１０４ａによって変換した変換光に基づく画像を示し、画像Ｆ２は第２変換部１０４ｂによって変換した変換光に基づく画像を示す。なお、図４にはＸＹ平面の画像Ｆ１、Ｆ２を示しているが、画像Ｆ１、Ｆ２はＸ軸、Ｙ軸方向だけでなく光軸（Ｚ軸）方向の成分も有している。ＸＹＺ方向の成分を有する画像Ｆ１、Ｆ２は蛍光顕微鏡３の対物レンズを光軸（Ｚ軸）方向に移動させて取得される。
　画像情報処理部１０６ｂは、画像情報取得部１０６ａにより取得された画像Ｆ１および画像Ｆ２を加算、減算又は乗算し得る。例えば、第１変換部１０４ａには、外径１０４０μｍ、内径２０８μｍのドーナツ形状の瞳関数を与え、第２変換部１０４ｂには、外径１０４０μｍ、内径８３２μｍのドーナツ形状の瞳関数を与える。画像Ｆ１における点像分布は、図３（ｂ）に示す分布となり、画像Ｆ２における点像分布は、図３（ｆ）に示す分布となる。画像情報処理部１０６ｂが、画像情報取得部１０６ａから得られた一枚の画像を画像Ｆ１と画像Ｆ２とに分割し、画像Ｆ１と画像Ｆ２とを加算、減算あるいは乗算し、新しい一枚の画像を作成できる。なお、加算または減算の結果の単位は光強度を示すが、乗算の結果の単位は光強度を示さない。ただし、乗算の結果は光強度に対応している。このため、第１瞳関数と第２瞳関数が等しい場合でも、乗算の結果を利用することができる。例えば、第２変換部１０４ｂを移動させて第２変換部１０４ｂを通過する光学系の光路長を微小変化させて、画像Ｆ１と画像Ｆ２とを乗算することで、分解能の向上を図ることができる。
　本実施形態の観察装置１００によれば、到来光２を第１瞳関数によって変換した第１変換光と、第２瞳関数によって変換した第２変換光とに基づいて、被観察物１に関する画像情報を生成する。異なった瞳関数で反射された変換光は、異なった強度分布を有する。異なった強度分布を重ね合わせたり、異なった強度分布の差分をとったりすると、ピーク強度とその他の強度との差がより明確になり、被観察物から到来する到来光の強度分布の広がりを抑えることが出来る。その結果、被観察物から到来する到来光を利用して得た２次元断層画像情報からボケを排除した鮮明な画像を得ることができる。さらに、観察装置１００によれば、変換部１０４は、第１変換部１０４ａと第２変換部１０４ｂとを含む。すなわち、変換部１０４は、別々の第１変換部１０４ａと第２変換部１０４ｂとで構成される。その結果、到来光２の第１変換光及び第２変換光への変換を同時に行うことができ、ボケの少ない画像情報を迅速且つ確実に効率よく生成し得る。
　図５は、第１変換部１０４ａに外輪の直径が１０４０μｍ、内輪の直径が２０８μｍのドーナツ形状の第１瞳関数（図３（ｂ）参照）を与え、第２変換部１０４ｂに外輪の直径が１０４０μｍ、内輪の直径が８３２μｍのドーナツ形状の第２瞳関数（図３（ｆ）参照）を与えた観察装置１００において、蛍光ビーズの点像分布を示す図である。第１瞳関数によって変換した第１変換光と、第２瞳関数によって変換した第２変換光との強度の差分（減算）に基づいて、画像情報を生成した。
　図５（ａ）は、Ｘ－Ｚ平面における点像分布を示す。横軸は水平軸を示し、縦軸は光軸を示す。図５（ｂ）は、Ｘ軸方向の点像分布を示す。横軸はＸ軸位置を示し、縦軸は光の強度を示す。図５（ｃ）は、Ｚ軸方向の点像分布を示す。横軸はＺ軸位置を示し、縦軸は光の強度を示す。図５（ｃ）において、分布関数は、ラプラシアンフィルタ様の形状を示した。ラプラシアンフィルタは、画像処理において、画像のエッジ（境界）を際立たせる効果がある。図５（ｃ）は、Ｚ軸に沿って上下に非対称ではあるが、Ｚ軸方向においてエッジが際立つことを示す。
　観察装置１００によれば、第１瞳関数及び第２瞳関数は、互いに内輪と外輪とを有するドーナツ形状の関数であり、第１変換部１０４ａ及び第２変換部１０４ｂは、夫々の内輪と外輪とで囲まれる領域を第１瞳関数及び第２瞳関数の非遮蔽領域として機能させる。従って、変換部１０４のうち、ドーナツ形状の外輪よりも外側の領域に到来した到来光２の反射を妨げることが出来る。その結果、観察装置１００の光学系に起因する球面収差の影響が低減され、光軸分解能を向上させることが出来る。更に、変換部１０４のうち、ドーナツ形状の内輪よりも内側の領域に到来した到来光の反射を妨げることが出来る。従って、ドーナツ形状の内輪よりも内側の領域に到来したノイズの多い光の影響を排除することができる。その結果、更に鮮明な画像を得ることができる。
　図６は、第２変換部１０４ｂの移動によって到来光２の焦点距離を変更した後の蛍光ビーズの点像分布を示す図である。第１変換部１０４ａに外輪の直径が１０４０μｍ、内輪の直径が２０８μｍのドーナツ形状の第１瞳関数（図３（ｂ）参照）を与え、第２変換部１０４ｂに外輪の直径が１０４０μｍ、内輪の直径が８３２μｍのドーナツ形状の第２瞳関数（図３（ｆ）参照）を与えている。第２変換部１０４ｂを移動させて第２変換部１０４ｂを通過する光学系の光路長を微小変化させて、光の焦点距離を２００ｎｍ変更した。なお、位置変更部１１０は、第５リレーレンズ１０２ｍを光軸方向に移動させることによっても焦点距離を変更できる。焦点距離を移動後、第１瞳関数によって変換した第１変換光と、第２瞳関数によって変換した第２変換光との強度の差分（減算）に基づいて、画像情報を生成した。
　図６（ａ）は、Ｘ－Ｚ平面における点像分布を示す。横軸は水平軸を示し、縦軸は光軸を示す。図６（ｂ）は、Ｘ軸方向の点像分布を示す。横軸はＸ軸位置を示し、縦軸は光の強度を示す。図６（ｃ）は、Ｚ軸方向の点像分布を示す。横軸はＺ軸位置を示し、縦軸は光の強度を示す。図６（ｃ）を図５（ｃ）と比較すると、Ｚ軸に沿って上下に対称であり、Ｚ軸方向においてエッジがより際立つことを示す。水平分解能は２２２ｎｍであり、光軸分解能は７０２ｎｍである。図６における光軸分解能は、図２を参照して説明した例と比べ約２倍向上していた。また、水平分解能に対しては、同等であった。
　観察装置１００では、関数変更部１０９によって第１瞳関数と第２瞳関数とのうちの少なくとも一方を変更することが出来る。例えば、第１瞳関数と第２瞳関数との組み合わせによって、ボケが多く観察に適さない画像情報を得た場合でも、第１瞳関数と第２瞳関数とのうちの少なくとも一方を適切に変更すれば、ボケの少ない所望の分解能を有する画像を得ることができる。
　また、観察装置１００では、位置変更部１１０によって到来光２の焦点位置を変更することが出来る。到来光２の焦点位置を変更することは、到来光２の焦点までの光路長を変化させることに対応する。従って、到来光２の強度分布の広がりを変更することが出来る。その結果、第１瞳関数と第２瞳関数との組み合わせのみでは十分な分解能を得難い場合でも、到来光の焦点位置を変更することによって、ボケの少ない所望の分解能を有する画像を得ることができる。
　なお、観察装置１００では、到来光２の焦点位置を変更し得さえすれば、位置変更部１１０によって第５リレーレンズ１０２ｍを光軸方向に移動させることに限定されない。例えば、位置変更部１１０によって第１変換部１０４ａ又は第２変換部１０４ｂを移動することで到来光２の焦点位置を変更し得る。
　図７は、第１変換部１０４ａに外輪の直径が１０４０μｍ、内輪の直径が８３２μｍのドーナツ形状の第１瞳関数を与え、第２変換部１０４ｂに外輪の直径が６２４μｍ、内輪の直径が２０８μｍのドーナツ形状の第２瞳関数を与えた観察装置１００において、蛍光ビーズの点像分布を示す図である。第２変換部１０４ｂによる第２変換光の焦点距離を変更し、光学系の光路長を微小変化させた。位置変更部１１０が第５リレーレンズ１０２ｍを光軸方向に移動させることによって第２変換部１０４ｂによる第２変換光の焦点距離を変更した。焦点距離を移動後、第１瞳関数によって変換した第１変換光と、第２瞳関数によって変換した第２変換光との強度の差分（減算）に基づいて、画像情報を生成した。
　図７（ａ）は、Ｘ－Ｚ平面における点像分布を示す。横軸は水平軸を示し、縦軸は光軸を示す。図７（ｂ）は、Ｘ軸方向の点像分布を示す。横軸はＸ軸位置を示し、縦軸は光の強度を示す。図７（ｃ）は、Ｚ軸方向の点像分布を示す。横軸はＺ軸位置を示し、縦軸は光の強度を示す。
　関数変更部１０８は、例えば第１変換部１０４ａ及び第２変換部１０４ｂに電圧を印加することによって、第１瞳関数と第２瞳関数とのうちの少なくとも一方を変更することが出来る。すなわち、画像Ｆ１と画像Ｆ２における点像分布を変化させることができ、かつ、画像Ｆ１と画像Ｆ２をそれぞれ形成する第１、第２変換光の焦点距離を変化させた上で、それぞれの画像情報の演算が可能である。従って、その組み合わせにより、様々な点像分布の画像を取得できる。
　光軸方向に沿ったエッジ検出の効果が、Ｚ軸に沿って上下に対称であるように、第２変換部１０４ｂによって画像Ｆ２を得るための焦点位置を調整する。上記条件では、光軸分解能は７４４ｎｍであり、図６に示した条件と比べると、光軸方向におけるエッジ検出能が低くなった。しかしながら、水平分解能は１７０ｎｍとなり、回折限界を超える。光軸方向の分解能の低下を許容すれば、第１変換部１０４ａでは、外輪の径１２４８μｍ、内輪の径８３２μｍのドーナツ形状の瞳関数を与え、第２変換部１０４ｂでは、外輪の径６２４μｍ、内輪の径２０８μｍのドーナツ形状の瞳関数を与え、画像Ｆ１と画像Ｆ２の差分画像を取得することにより、光軸分解能は９６２ｎｍ、水平分解能は１４２ｎｍにまで向上する。観察者が、被観察物１に応じて最適になるような点像分布を指定し得る。また、対物レンズの倍率や開口数を変更することにより、点像分布を最適に指定し得る。
　ここでは、ドーナツ形状の内輪の径と外輪の径との比の値は、１／６～４／５である。ドーナツ形状の内輪の径と外輪の径との比の値がこの程度の範囲であれば、到来光２の強度分布の広がりを確実に抑えることが出来る。その結果、到来光２を利用して得た２次元断層画像情報からボケを排除した鮮明な画像を得ることができる。
　次に、図８を参照して、観察装置１００による分解能の向上を説明する。図８（ａ）に、第１瞳関数と点像分布を示す。第１瞳関数において、光が実質的に遮蔽されない領域（非遮蔽領域）を白で示している。第１瞳関数において非遮蔽領域はほぼ円状で表される。
　点像分布を示すグラフにおいて、横軸は、ＣＣＤカメラにおける画素の単位数を示している。グラフから理解されるように、光の強度分布はほぼガウス分布に従う。グラフにおいて半値幅は分解能に相当しており、ここでは、グラフの半値幅は８．８である。
　図８（ｂ）に、第２瞳関数と点像分布を示す。第２瞳関数において、非遮蔽領域を白で示している。また、第２瞳関数においても非遮蔽領域はほぼ円状で表される。ただし、第２瞳関数の非遮蔽領域は、第１瞳関数と比べて小さい。このような第２瞳関数は、第１瞳関数をアポダイゼーション化したものといえる。図８（ｂ）において非遮蔽領域の大きさが低減することにより、光のピーク強度が低減するだけでなく、光の分解能も低減することになる。ここでは、点像分布を示しグラフの半値幅は１５．７である。
　図８（ｃ）に、第１瞳関数と第２瞳関数の差分と、これらの点像分布の差分を示す。図８（ｃ）において、領域８ａは、第１瞳関数と第２瞳関数の両方において非遮蔽領域となる領域を示しており、領域８ｂは、第１瞳関数と第２瞳関数で光の遮蔽の異なる領域を示しており、領域８ｃは、第１瞳関数と第２瞳関数の両方において遮蔽領域となる領域を示している。図８（ｃ）に示した点像分布のグラフにおいて半値幅は７．０である。このように、異なる瞳関数の点像分布の差分により、分解能を向上させることができる。
　また、観察装置１００では、１フレームの画像から鮮明な画像を得ることができ、観察装置１００の時間分解能は、画像情報生成部１０６の分解能に依存する。例えば、観察装置１００は５００Ｈｚの画像を取得することができる。このように、観察装置１００は、いわゆる走査型蛍光顕微鏡の数十倍から数百倍の時間分解能を有しており、観察装置１００は、例えば生体材料の観察に好適に用いられる。
　なお、上述した説明では、蛍光顕微鏡３において対物レンズとして６０倍の対物レンズを用いていたが、対物レンズの倍率は特に限定されない。例えば、１５０倍の対物レンズを用いてもよい。
　以下、図９から図１４を参照して１５０倍の対物レンズを用いた結果を説明する。図９（ａ）に、光が遮蔽されない状態の模式図を示す。このような状態は、例えば、反射型液晶ミラーアレイのすべての画素において反射率が最大値を示すように設定することによって実現される。図９（ｂ）に、図９（ａ）に示したように遮蔽領域（非遮蔽領域）が設定された場合のＸ‐Ｚ平面の点像分布を示す。ここでも、被観察物として、顕微鏡の回折限界よりも小さいサイズの被観察物（例えば、直径１００ｎｍの蛍光ビーズ）を用いた。
　図１０（ａ）に第１瞳関数を示す。第１瞳関数は内輪および外輪で規定されるドーナツ形状の関数である。第１瞳関数では、内輪と外輪との間の領域は光を遮蔽しないのに対して、内輪で囲まれる領域、および、外輪よりも外側の領域は光を遮蔽する。なお、内輪を規定する円周の直径は１０４μｍであり、外輪を規定する円周の直径は３１２μｍである。図１０（ｂ）に、第１瞳関数の場合の点像分布を示す。
　図１１（ａ）に第２瞳関数を示す。第２瞳関数も内輪および外輪で規定されるドーナツ形状の関数である。第２瞳関数でも、内輪と外輪との間の領域は光を遮蔽しないのに対して、内輪で囲まれる領域、および、外輪よりも外側の領域は光を遮蔽する。なお、内輪を規定する円周の直径は３１２μｍであり、外輪を規定する円周の直径は６２４μｍである。図１１（ｂ）に、第２瞳関数の場合の点像分布を示す。
　図１２（ａ）に、図９（ｂ）、図１０（ｂ）および図１１（ｂ）のＸ軸方向の点像分布をそれぞれ符号９ｂ、１０ｂ、１１ｂに示す。遮蔽領域がない場合、光のピーク強度は比較的高い。この場合、水平分解能は２２６ｎｍである。また、ドーナツ形状の瞳関数が設定されることによってピーク強度は低下する。
　図１２（ｂ）に、図９（ｂ）、図１０（ｂ）、図１１（ｂ）のＺ軸方向の点像分布をそれぞれ符号９ｂ、１０ｂ、１１ｂに示す。遮蔽領域がない場合、光のピーク強度は比較的高い。この場合、光軸分解能は９４０ｎｍである。なお、遮蔽領域が大きいほど、ピーク強度は低下する。なお、ここでは、ドーナツ形状の瞳関数の設定により、ピーク強度を示す位置がゼロからずれる。
　図１３（ａ）に、第１、第２瞳関数の点像分布の差分を示す。図１３（ａ）では、横軸にＸ軸を示し、縦軸にＺ軸を示す。図１３（ｂ）にＸ方向の点像分布を示し、図１３（ｃ）にＺ方向の点像分布を示す。水平方向の分解能は１４７ｎｍであり、光軸方向の分解能は５２５ｎｍである。なお、参考のために、図１３（ｂ）および図１３（ｃ）には光が遮蔽されない場合の点像分布を符号９ｂで示している。このように、異なる瞳関数の点像分布の差分により、水平方向および光軸方向の分解能を向上させることができる。
　また、上述したように、到来光の焦点位置を変更することにより、水平分解能および垂直分解能をさらに向上させることができる。
　図１４（ａ）に、図１に示した観察装置１００において第４、第５リレーレンズ１０２ｋ、１０２ｍを適宜移動させることによって得られた点像分布の差分を示す。図１４（ｂ）にＸ方向の点像分布を示し、図１４（ｃ）にＺ方向の点像分布を示す。水平方向の分解能は１０８ｎｍであり、光軸方向の分解能は４６３ｎｍである。参考のために、図１４（ｂ）および図１４（ｃ）には光が遮蔽されない場合の点像分布を符号９ｂで示している。このように、到来光の焦点位置を調整することにより、水平方向および光軸方向の分解能をさらに向上させることができる。
　なお、観察装置１００における異なる瞳関数の点像分布の差分は、デジタル画像処理（デジタルハイパスフィルタ）に似ているが、観察装置１００によれば、デジタル画像処理と比べて分解能（特に光軸分解能）をさらに改善することができる。以下、図１５から図１８を参照して、観察装置１００における点像分布の差分とデジタル画像処理との違いを説明する。ここでは、デジタル画像処理としてガウシアンフィルタ処理を行っている。
　図１５（ａ）に、Ｘ－Ｚ平面の点像分布を示し、図１５（ｂ）～図１５（ｄ）は、デジタル画像処理を行った後の点像分布を示す。図１５（ｂ）は標準偏差が２画素のガウシアンフィルタ処理を行った結果であり、図１５（ｃ）は標準偏差が２画素のガウシアンフィルタ処理の点像分布の強度を半分にしたものであり、図１５（ｄ）は標準偏差が５画素のガウシアンフィルタ処理を行った結果である。
　図１６（ａ）は、図１５（ａ）に示した点像分布と図１５（ｂ）に示した点像分布との差分を示す図であり、図１６（ｂ）および図１６（ｃ）は、それぞれ図１６（ａ）のＸ軸およびＺ軸の点像分布を示す。水平方向の分解能は１０４ｎｍであり、光軸方向の分解能は６１３ｎｍである。なお、図１６（ｂ）および図１６（ｃ）において、比較のために、デジタル画像処理の行われてない点像分布を符号１５ａに示している。比較的小さい標準偏差でデジタル画像処理を行うことにより、水平軸および光軸の両方の分解能が向上している。
　図１７（ａ）は、図１５（ａ）に示した点像分布と図１５（ｄ）に示した点像分布との差分を示す図であり、図１７（ｂ）および図１７（ｃ）は、それぞれ図１７（ａ）のＸ軸およびＺ軸の点像分布を示す。水平方向の分解能は１５７ｎｍであり、光軸方向の分解能は８０９ｎｍである。図１７（ｂ）および図１７（ｃ）でも、比較のために、デジタル画像処理の行われてない点像分布を符号１５ａに示している。比較的高い標準偏差でデジタル画像処理を行う場合でも、水平軸および光軸の両方の分解能の向上を図ることができる。
　図１８（ａ）は、図１５（ａ）に示した点像分布と図１５（ｃ）に示した点像分布との差分を示す図であり、図１８（ｂ）および図１８（ｃ）は、それぞれ図１８（ａ）のＸ軸およびＺ軸の点像分布を示す。水平方向の分解能は１８１ｎｍであり、光軸方向の分解能は７３０ｎｍである。図１８（ｂ）および図１８（ｃ）でも、比較のために、デジタル画像処理の行われてない点像分布を符号１５ａに示している。このように、元の点像分布からの減算する光の強度を低減させることにより、減算によって得られた点像分布の裾が負になることを抑制することができる。
　以上のように、デジタル画像処理によっても、点像分布の分解能を向上させることができる。なお、理論的には、観察装置１００による点像分布の差分はこのようなデジタル画像処理と同一であるが、実際には、同一ではない。これは、デジタル画像処理では２次元的な処理が行われるのに対して、観察装置１００では３次元的な処理が行われること、および、実際の光学系には収差が存在しており、必ずしも線形を示さないことが理由と考えられる。図１６～図１８と、図１２および図１３との比較から理解されるように、観察装置１００によれば、分解能（特に光軸方向の分解能）をさらに改善することができる。
　［実施形態２］
　図１９は、本発明の実施形態２に係る観察装置２００の模式図である。観察装置２００は、被観察物１から到来する到来光２に基づいて被観察物１を観察する。観察装置２００は、光学系２０２と、到来光２を第１瞳関数で第１変換光に変換し、かつ到来光を第２瞳関数で第２変換光に変換する変換部２０４と、画像情報生成部１０６と、関数変更部１０８と、位置変更部１１０とを備える。光学系２０２は、蛍光顕微鏡３の結像面以降に設けられている。光学系２０２は、スリット１０２ａと、第１リレーレンズ１０２ｂ、第２リレーレンズ１０２ｃ及び第１ミラー１０２ｄと、第１偏光ビームスプリッタ１０２ｅと、第５リレーレンズ１０２ｍと、ミラー１０２ｊと、ビームスプリッタ２０２ｈとを備える。
　光学系２０２に備えられるビームスプリッタ２０２ｈと、変換部２０４以外の各構成要素は、実施形態１で説明した観察装置１００に含まれた対応する各構成要素と同様の機能を有するので、これらの説明を省略する。
　偏光ビームスプリッタ２０２ｈは、偏光ビームスプリッタ１０２ｅにより分割された光路を一つの光路に戻す。尚、光学系２０２は、到来光２を変換部２０４に導き、変換光を画像情報生成部１０６に導くことができる限りは、図１９に示された構成に限定されない。例えば、リレーレンズ、ミラー、偏光ビームスプリッタの組み合わせ、配置は任意である。ここでは、蛍光顕微鏡３により取得された実像を画像情報生成部１０６へ伝達するためのリレー系として、２枚のレンズ１０２ｂ、１０２ｃあるいは１０２ｍから成るリレー光学系を用いたが、１枚のレンズによる光学系を採用し得る。
　変換部２０４は、到来光２を第１瞳関数で変換する第３変換部２０４ａと、到来光２を第２瞳関数で変換する第４変換部２０４ｂとを含む。第３変換部２０４ａと第４変換部２０４ｂとは、第１リレーレンズ１０２ｂの光学瞳の位置（即ち焦点距離の位置）に配置される。変換部２０４において、第３変換部２０４ａと第４変換部２０４ｂとして透過型部材が用いられている。ここでは、透過型部材は透過型液晶アレイである。
　観察装置２００によれば、到来光２を第１瞳関数によって変換した第１変換光と、第２瞳関数によって変換した第２変換光とに基づいて、被観察物１に関する画像情報を生成する。従って、到来光２の強度分布の広がりを抑えることが出来る。その結果、到来光２を利用して得た２次元断層画像情報からボケを排除した鮮明な画像を得ることができる。
　以上、図１から図１９を参照して、観察装置１００、観察装置２００を説明した。到来光２を第１瞳関数で第１変換光に変換し、かつ到来光２を第２瞳関数で第２変換光に変換する部材として、反射型部材ではなく、透過型部材を用いてもよい。反射型部材及び透過型部材は、既製品として容易に安価で入手し得る。従って、変換部として特別な構成を必要とすることなく、安価な構成で到来光を第１変換光及び第２変換光に夫々変換することができる。また、変換部は、ＤＭＤ（Ｄｉｇｉｔａｌ　Ｍｉｃｒｏｍｉｒｒｏｒ　Ｄｅｖｉｃｅ）で有り得る。ＤＭＤは、マイクロサイズのミラーを敷き詰めた素子である。ミラーをｏｎ／ｏｆｆの２状態で制御することで光の反射方向を調節し，明暗の差を生じさせることができる。各ミラーの状態を高速に切り替えることにより時分割で階調性を実現し得る。
　なお、上述した説明では、到来光を変換光に変換する変換部は２つ設けられたが、変換部は２つに限定されない。変換部は３つ以上あってもよい。例えば、変換部が３つ（第１変換部、第２変換部、第３変換部）の場合、第１変換部は到来光２を第１瞳関数で第１変換光に変換し、第２変換部は到来光２を第２瞳関数で第２変換光に変換し、第３変換部は到来光２を第３瞳関数で第３変換光に変換する。この場合、画像情報生成部は、第１変換光、第２変換光及び第３変換光に基づいて、被観察物に関する画像情報を生成する。
　あるいは、変換部は１つであってもよい。この場合、変換部は到来光２を第１瞳関数で第１変換光に変換した後、関数変更部によって変換部に与えられた瞳関数を第２瞳関数に変更する。関数変更部が第２瞳関数に変更した後、変換部は到来光２を第２瞳関数で第２変換光に変換する。画像情報生成部は、第１変換光及び第２変換光に基づいて、被観察物に関する画像情報を生成する。
　生体被観察物の観察に対する観察装置１００の有効性を確認するため、以下の実験を行った。本実施例では、ＨｅＬａ細胞株をホルマリンによりスライドガラスに固定した被観察物を観察した。蛍光色素（アレクサ４８８を架橋したファロイジン）を被観察物に加えた。ファロイジンは、アクチン繊維に結合し、細胞内のアクチン繊維はファロイジンに架橋された蛍光色素により染色される。被観察物を波長４８８ｎｍの光で照射し、被観察物から到来する５１０ｎｍ以上の蛍光を観察した。対物レンズとして、開口数１．４５の１５０倍の倍率の対物レンズを選択した。第１リレーレンズ１０２ｂと第２リレーレンズ１０２ｃとからなるリレー光学の倍率は２倍である。第１変換部１０４ａには、外輪の直径７２８μｍ、内輪の直径１０４μｍのドーナツ形状の第１瞳関数を与え、第２変換部１０４ｂには、外輪の直径５２０μｍ、内輪の直径１０４μｍのドーナツ形状の第２瞳関数を与え、画像Ｆ１と画像Ｆ２の差分画像を取得した。
　図２０は、本実施例により観察された画像と従来の蛍光顕微鏡により観察された画像とを示す図である。細胞内におけるアクチン繊維を観察装置１００により観察した画像である。図２０（ａ）は、本実施例により観察された画像Ｆ１と画像Ｆ２の差分画像を示す。図２０（ｂ）は、従来の蛍光顕微鏡で観察された画像を示す。双方ともに、アレクサ４８８により蛍光標識されたアクチン繊維が確認される。図２０（ａ）および図２０（ｂ）を比較すると、図２０（ａ）の画像の背景光が低減されており、アクチン繊維がより鮮明に観察できる事が確認できる。
　図２１は、図２０に点線で示した断面部分における蛍光強度分布を示すグラフである。図２１（ａ）は、本実施例により観察された画像Ｆ１と画像Ｆ２の差分画像（図２０（ａ）参照）から得られた断面部分の強度分布を示す。図２１（ｂ）は、従来の蛍光顕微鏡で観察された画像（図２０（ｂ）参照）から得られた断面部分の強度分布を示す。本実施例により、蛍光顕微鏡像のコントラストが向上していることが確認できる。
　瞳関数を除いて実施例１と同様に、ＨｅＬａ細胞株をホルマリンによりスライドガラスに固定した被観察物を観察した。ここでは、第１変換部１０４ａには、外輪の直径４１６μｍ、内輪の直径１０４μｍのドーナツ形状の第１瞳関数を与え、第２変換部１０４ｂには、外輪の直径６２４μｍ、内輪の直径３１２μｍのドーナツ形状の第２瞳関数を与え、画像Ｆ１と画像Ｆ２の差分画像を取得した。
　図２２は、本実施例により観察された画像と従来の蛍光顕微鏡により観察された画像とを示す図である。細胞内におけるアクチン繊維を観察装置１００により観察した画像である。図２２（ａ）に従来の蛍光顕微鏡で観察された画像を示し、図２２（ｂ）に本実施例において観察された画像Ｆ１と画像Ｆ２の差分画像を示す。双方ともに、アレクサ４８８により蛍光標識されたアクチン繊維が確認される。図２２（ａ）および図２２（ｂ）を比較すると、図２２（ｂ）の画像の背景光が低減されており、アクチン繊維がより鮮明に観察できる事が確認できる。
　図２３に、図２２（ａ）、図２２（ｂ）に点線で示した断面部分における蛍光強度分布を示す。本実施例により、蛍光顕微鏡像のコントラストが向上していることが確認できる。
　従来の蛍光顕微鏡で観察された画像、デジタル画像処理によって得られた画像および観察装置１００で観察された画像の比較を行った。ここでも、被観察物および観察装置１００は実施例１、２と同様であった。
　図２４（ａ）に、従来の蛍光顕微鏡で観察された画像を示す。図２４（ｂ）に、図２４（ａ）の破線で囲まれた領域の拡大図を示し、図２４（ｃ）に、図２４（ｂ）の破線部分の蛍光強度分布を示す。
　図２５（ａ）に、従来の蛍光顕微鏡で観察された画像に対してデジタル画像処理を行うことによって得られた画像を示す。この画像は、元の画像と、標準偏差が２画素のガウシアンフィルタによって得られた画像との差分によって得られた。図２５（ｂ）に、図２５（ａ）の破線で囲まれた領域の拡大図を示し、図２５（ｃ）に、図２５（ｂ）の破線部分の蛍光強度分布を示す。図２５（ｃ）には、図２４（ｃ）に示した蛍光強度分布を符号２４ｃとして併せて示している。ガウシアンフィルタにより、コントラスト比が向上した。
　図２６（ａ）に、従来の蛍光顕微鏡で観察された画像に対してデジタル画像処理を行うことによって得られた画像を示す。この画像は、元の画像と、標準偏差が５画素のガウシアンフィルタによって得られた画像との差分によって得られた。図２６（ｂ）に図２６（ａ）の破線で囲まれた領域の拡大図を示し、図２６（ｃ）に図２６（ｂ）の破線部分の蛍光強度分布を示す。なお、図２６（ｃ）には、図２４（ｃ）に示した蛍光強度分布を符号２４ｃとして併せて示している。ガウシアンフィルタにより、コントラスト比が向上した。
　図２７（ａ）に、観察装置１００で観察された画像を示す。図２７（ｂ）に図２７（ａ）の破線で囲まれた領域の拡大図を示し、図２７（ｃ）に図２７（ｂ）の破線部分の蛍光強度分布を示す。図２７（ｃ）にも、図２４（ｃ）に示した蛍光強度分布を符号２４ｃとして併せて示している。観察装置１００により、コントラスト比が向上した。なお、図２７（ｃ）と図２５（ｃ）、図２６（ｃ）との比較から理解されるように、観察装置１００により、デジタル画像処理と比べてコントラスト比をさらに改善することができた。
　観察装置１００を用いて、細胞膜上の量子ドットで染色されたカドヘリンの乖離を観察した。図２８（ａ）に、ある時刻において観察装置１００で観察されたカドヘリンの画像を示す。図２８（ｂ）、図２８（ｃ）、図２８（ｄ）、図２８（ｅ）、図２８（ｆ）、図２８（ｇ）に、それぞれ図２８（ａ）を基準として、２０ｍｓ、４０ｍｓ、６０ｍｓ、８０ｍｓ、１２０ｍｓ、２４０ｍｓ後の画像を示す。図２８（ａ）～図２８（ｆ）に示すように、カドヘリンの乖離が観察された。
　図２９に、図２８（ａ）の破線で示した部分における光強度分布の時間変化を示す。図２９において、０ｍｓ、４０ｍｓ、５０ｍｓ、５４ｍｓ、５６ｍｓ、５８ｍｓ、６０ｍｓ、１２０ｍｓ、２４０ｍｓはそれぞれ、０ｍｓを基準時刻とした蛍光強度分布を示す。蛍光強度分布の時間変化からも、カドヘリンの乖離を把握することができた。
　本発明による観察装置及び観察方法は、光学顕微鏡を用いた画像生成の分野において、広く利用可能である。又、本発明による観察装置及び観察方法を光学顕微鏡に組み込むことによって、光学顕微鏡そのものの付加価値を高めることになり、光学顕微鏡分野に広く利用可能である。
　１　　　　被観察物
　２　　　　到来光
　１００　　観察装置
　１０４　　変換部
　１０４ａ　第１変換部
　１０４ｂ　第２変換部
　１０６　　画像情報生成部
　１０８　　瞳関数変更部
　１１０　　焦点位置変更部
　２００　　観察装置
　２０４　　変換部
　２０４ａ　第３変換部
　２０４ｂ　第４変換部

 

Claims (15)

  1. 　被観察物から到来する到来光に基づいて前記被観察物を観察する観察装置であって、
    　前記到来光を第１瞳関数で第１変換光に変換し、かつ前記到来光を第２瞳関数で第２変換光に変換する変換部と、
    　前記第１変換光と、前記第２変換光とに基づいて、前記被観察物に関する画像情報を生成する画像情報生成部と
    　を備えた観察装置。
  2. 　前記第１瞳関数と前記第２瞳関数とのうちの少なくとも一方を変更する瞳関数変更部を更に備えた、請求項１に記載の観察装置。
  3. 　前記変換部は、反射型部材又は透過型部材を含む、請求項１または２に記載の観察装置。
  4. 　前記第２瞳関数は、前記第１瞳関数とは異なる、請求項１から３の何れか一項に記載の観察装置。
  5. 　前記到来光の焦点位置を変更する焦点位置変更部を更に備えた、請求項１から４の何れか一項に記載の観察装置。
  6. 　前記変換部は、
    　前記到来光を前記第１瞳関数で変換する第１変換部と、
    　前記到来光を前記第２瞳関数で変換する第２変換部と
    　を含む、
    　請求項１から５の何れか一項に記載の観察装置。
  7. 　前記第１瞳関数及び前記第２瞳関数は、互いに内輪と外輪とを有する二次元ドーナツ形状の関数であり、
    　前記第１変換部及び前記第２変換部は、夫々の内輪と外輪とで囲まれる領域を、前記第１瞳関数及び前記第２瞳関数の非遮蔽領域として機能させる、請求項６に記載の観察装置。
  8. 　前記二次元ドーナツ形状の関数において、前記内輪の径と前記外輪の径との比の値は、１／６～４／５である、請求項７に記載の観察装置。
  9. 　前記変換部は、前記到来光の強度を変調することによって前記到来光を前記第１変換光および前記第２変換光に変換する、請求項１から８の何れか一項に記載の観察装置。
  10. 　被観察物から到来する到来光に基づいて前記被観察物を観察する観察方法であって、
    　前記到来光を第１瞳関数で第１変換光に変換し、かつ前記到来光を第２瞳関数で第２変換光に変換する変換ステップと、
    　前記第１変換光と、前記第２変換光とに基づいて、前記被観察物に関する画像情報を生成する画像情報生成ステップと
    　を包含する観察方法。
  11. 　前記第１瞳関数と前記第２瞳関数とのうちの少なくとも一方を変更する瞳関数変更ステップを更に包含する、請求項１０に記載の観察方法。
  12. 　前記変換ステップは、
    　前記到来光を前記第１瞳関数で変換する第１変換ステップと、
    　前記到来光を前記第２瞳関数で変換する第２変換ステップと
    　を含む、請求項１０又は請求項１１に記載の観察方法。
  13. 　前記変換ステップにおいて、前記第２瞳関数は、前記第１瞳関数とは異なる、請求項１０から１２の何れか一項に記載の観察装置。
  14. 　前記到来光の焦点位置を変更する焦点位置変更ステップを更に包含する、請求項１０から請求項１３の何れか一項に記載の観察方法。
  15. 　前記変換ステップにおいて、前記到来光の強度を変調することによって前記到来光を前記第１変換光および前記第２変換光に変換する、請求項１０から１４の何れか一項に記載の観察装置。

     
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