JPH02247605A - レーザ走査蛍光顕微鏡 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） この発明は、収束レーザ光により蛍光試料を走査すると
ともに励起された蛍光試料からの蛍光を検出して試料の
顕微画像を得るレーザ走査蛍光顕微鏡に関し、特に、試
料の厚み方向の画像を採取するための改良された手法お
よび蛍光のエネルギー収集効率の改良に関する。

（従来の技術とその問題点） 蛍光顕微鏡は現在、生物学、医学、半導体産業等多くの
分野で一般的に使用されており、分解能が高く、コント
ラストがよいこと及び定量測定に適していることなどか
ら、これまでの透過型の生物顕微鏡や電子顕微鏡に置き
替わり、あるいはまたこれらを補う測定装置として多用
されつつある。

又、試料の照明において、コヒーレント光であるレーザ
光のコヒーレンシイの欠点を走査という概念で打破し、
逆にレーザ光の利点を生かして散乱光の影響がない高コ
ントラスト、高分解能を実現するレーザ走査蛍光顕微鏡
が最近、顕微測定に用いられようとしている。

第１図には一般に使用されている一様照明落射型蛍光顕
微鏡の光学系の原理図を示す、蛍光顕微鏡は、特に微小
な構造を譚察することが多いため、通常の生物顕微鏡に
比べて、より高い分解能が求められ、また、励起された
蛍光（１）の微弱光測定になるので、これの高いエネル
ギー収集効率をもつことが望まれている。

蛍光顕微鏡の分解能は、対物レンズ（２）の開口数（Ｎ
ｕｓ＋ｅｒｉｃｉｌ　Ａｐｅｒｔｕｒｅ　；以下、ＮＡ
と記載することがある）と蛍光（１）の波長で決まる回
折限界によって制限される。すなわち、より高い空間分
解能を得る（より細かい構造を結像する）ためには、■
対物レンズ（２）の開口数をより大きくするか、■より
短い波長の蛍光を利用しなければならない、しかしなが
ら、蛍光波長は、被測定対象・試料（３）の物質によっ
て決定され、装置側では選択はできない、他方、対物レ
ンズ（２）の開口数は、乾燥系レンズでは無限に大きい
レンズを用いても１が最大であり、たとえ油浸系レンズ
を用いても高々１．５程度である。

しかも、問題となるのは、回折限界が分解能を決定する
という従来からの公式は一試料がある特定の面内にのみ
分布している場合に限られているということである。試
料（３）に厚みがある場合は、分解能は回折限界よりは
るかに劣る。これは、７オ一カス面近傍の面の試料の構
造のデイフォーカス像が７オーカス像に重−畳するため
である。

より高い分解を求めるためには、より大きい開口数をも
つ対物レンズを使用することが考えられるが、しかしこ
れにより焦点深度はより浅くなり、７オ一カ人面以外の
デイフォーカスの影響は大きくなり、結果として像の分
解能を低下させてしまう、すなわち、分解能を上げるた
めに対物レンズの開口数を大きくすると、７オ一カス面
以外からのボケが入り、分解能が低下するという相反し
た問題が生じる。

結局、デイ７を一カスの影響を受けないためには、試料
の厚さ以上の焦点深度をもつ対物レンズを用いる必要が
あり、その対物レンズの開口数で分解能は決定される。

しかし、焦点深度を深くするためには対物レンズの開口
数は小さくする必要があり、試料が厚くなると、分解能
は低下することになる。高分解能と長焦点深度とは相矛
盾する要求であることは、よく知られたことである。無
限に薄い試料に対してのみ、上述の回折限界が分解能を
決定する。しかし、総ての試料は厚みをもりているので
、分解能はこれより小さくなる。

蛍光顕微鏡に要求されるもうひとつの重要な点は蛍光の
エネルギー収集効率である。このエネルギー収集効率は
、対物レンズの開口数によって決まり、それが大きけれ
ば大かいほど、高いエネルギー収集効率が得られ、ＳＮ
比のよい良質な蛍光画像を得ることができる。しかし、
厚みのある試料を観察するためには、上に述べたように
、深い焦点深度が必要であり、開口数をボさくしなけれ
ばならず、結局、エネルギー収集効率を犠牲にすること
になる。

本発明は、厚みのある試料の深さ方向（厚み方向、奥行
き方向）の像の分解能に関する対物レンズの上記問題、
及び対物レンズに関連するエネルギー収集効率の上記問
題を解決することを課題とする。

（問題点を解決するための手段） 本発明に係る第１の発明は、収束レーザ光により蛍光試
料を走査するとともに励起された蛍光試料からの蛍光を
検出して試料の顕微画像を得るレーザ走査蛍光顕微鏡に
おいて、励起光学系の光路中に、レーザ光束を輪帯光束
にする手段を備えたことを基本的な特徴とするものであ
る。

第２の発明は、共焦点型のレーザ走査蛍光顕微鏡におい
て、蛍光を検出する光電検出器の被露光面の面積を可変
する手段を備えたことを基本的な特徴とするものである
。

（本発明の理論的背景） 光学系の結像特性を解析する場合、光学的伝達閏１（Ｏ
ＴＦ）を用いる。ＯＴＦは、光学系の空間周波数応答を
表し、強度の点像分布関数の２次元７−リエ変換で与え
られる。この値が大きいほど、周波数応答がよいことを
意味する。

以下では、比較のため、第１図に示した一様照明落射型
蛍光顕微鏡の３次元ＯＴＦを示すとともに、第２図のレ
ーザ走査蛍光顕微鏡（共焦点型）の３次元ＯＴＦを示し
、次に、共焦点型のレーザ走査蛍光顕微＃！（第２図）
において蛍光を検出する検出器面積をパラメータに含む
新規に導出された３次元ＯＴＦを示して検討を行い、最
後に第９図に示される。Ｗｈ起先光学系輪帯瞳を用いた
レーザ走査蛍光顕微鏡の３次元結像特性・新規に導出さ
れた３次元ＯＴＦを示して検討を行う。

−明　　　刑 この顕微鏡では、面積をもつ光源（４）からの光束をグ
イククイックミラー（５）で反射し、対物レンズ（２）
により蛍光試料（３）を−様に照明し、励起された蛍光
試料（３）からの蛍光発光（１）を対物レンズ（２）に
より像検出器（６）でＧＣＣＤカメラやフイ・ピースを
通して目視するなどして）観測する。

試料（３）での強度分布が一様になるように照明されて
いるので、照明光の空間分布を考慮する必要はなく、光
学系全体としては蛍光物体をインコーヒレント発光体と
みてこの発光の結像特性のみを扱えばよい、３次元０Ｔ
ＦＳＨ（ρ、り）は（１）式％式％ ］ ρ：　Ｘ方向（光軸に垂直な面内方向）の空間周波数μ
の絶対値１声１゜ η：　光軸方向（２方向）の空間周波数。

λ：　蛍光波長。

Ａ：　対物レンズのＦナンバー ヴ　レー 第２図に光学系の原理図を示す、この顕微鏡では、点光
源（２４）を試料（２３）に結像させ、結像点からの蛍
光（２１）を対物レンズ（２２）により点検出器（２６
）で計測する１画像化のため、点光源（２４）と点検出
器（２６）をＸ−Ｙ走査する。理想的な点検出器を用い
ると、焦、貞位置からの蛍光のみを検出でき、焦点から
外れた位置からの蛍光は検出されない。

従って、ピントがはずれた像はボケるのではなく、その
コントラストを失って観測されない。３次元の試料（２
３）の２方向の一断面のみがシャープに観測される。

ここでは、十分に小さい検出器（２６）をもつものとし
て、この顕微鏡の３次元ＯＴＦを与える。

この光学系は、−様照明落射型蛍光顕微鏡とは異な９、
試料は一様に照明されない。ただし、結像光学系は、−
様照明落射型蛍光顕微鏡の光学系と等価である。従って
、この光学系による強度の３次元点像分布関敗ｈ（ｘ、
ｚ）と、点光源による強度分布の積で与えられる６点光
源による強度分布もまた、先の式）１　（ｘ＋ｚ）で与
えられるので、この光学系による強度の３次元点像分布
関数Ｊ（ｔ＋ｚ）は次式で与えられる。

ｈ＋（ｙ＋ｚ）＝［ｈ（ｙ、ｚ）］Ｘ［ｂ（ｙ、ｚ）］
　　　−（２）実領域での積は、周波数領域でのフンポ
リエージタンに対応しているので、共焦点型のレーザ走
査蛍光顕微鏡の３次元ＯＴＦ、Ｈｅ（ρ、？）は（３）
式で与えられる。なお、本はコンボリューシａンを表し
、Ｈ（ρ、り）は（１）式でのｈ（ｘ＋ｚ）の７−リエ
変換で与えられたものである。

Ｈｅ（ρ、η）＝［Ｈ（Ｐ、り）１本［Ｈ（ρ、η）］
　・・・・・・（３） （３）式と上記（１）の３次元ＯＴＦを計算した結果を
第３図に示す、同図（ａ）は−様照明系、（ｂ）は共焦
点型レーザ走査蛍光顕微鏡の光学系のものである。

ρは面内方向の空間周波数を表し、りは奥行方向の空間
周波数を表している。縦軸は各周波数に対する３次元Ｏ
ＴＦの値をｌｏｇスケールで示しており、各空間周波数
に対する応答を表している。

第３図より、共焦点型レーザ走査蛍光顕微鏡は、−様照
明落射型蛍光顕微鏡に比べて、奥行方向（η方向）の空
間周波数帯域が２倍、面内方向（ρ方向）の空間周波数
帯域が１．７倍になっていることがわかる、また、（ａ
）では、η軸に近づくほど、奥行方向の空間周波数帯域
が狭くなっており、η軸上では原点しか値をもっていな
い、従って、−様照明落射型蛍光顕微鏡は、奥行方向の
みに構造の変化をもつ試料に対しては全く分解をもたな
い。

例えば、面内に構造の変化をもたない薄い膜状の試料を
一様照明落射型蛍光顕微鏡で観察した場合、試料の位置
も（２座標）厚みも知ることはできない。

他方、（ｂ）には（ａ）のような原点付近の欠落は見ら
れない、従って、レーザ走査蛍光顕微鏡は奥行方向のみ
に構造の変化をもつ試料に対しでも分解をもつことがわ
かる。

をパーメータと　る３　元ＯＴＦ 共焦点型のレーザ走査蛍光顕微鏡では、第４図に示すよ
うに、光電子増倍管や半導体充電検出器（２８ｄ）の前
に、ピンホール（２６ｐ）の開口を有するアパーチャ（
２６ａｐ）が設けられ、ピンホール（２６ｐ）が検出光
量を制限している。

ここで、７パーチヤ（２６ａρ）をピンホール（２６ｐ
）以外の円形開口とする０円形間口の半径をパラメータ
として、この３次元ＯＴＦを導出する。

検出器の面積を変えても、励起光学系は影響を受けない
ため、結像光学系についてのみ考究すればよい。

試料からの蛍光による強度の３次元点像分布関数ｈ　（
ｘ、ｚ）は、対物レンズの瞳関数Ｐ（μ）を用いて次式
で与えられる。

ｈ（ｘｅｚ）＝ＩｆＰ（声）ｅｘｐ（−ｉ　ｙ＾ｚｊｌ
　”＋２ｙ　ｉ声Ｘ）ｄ”ｕ　Ｘｅｘｐ（：’ｒ　ｉｚ
／λ）Ｉ’　　・（４）レーザ走査顕微鏡では、第５図
のように、検出器を走査することによって像を得ている
ので、結像光学系における強度の３次元点像分布関数ｈ
ｚ（＋ｃｔｚ）は、（４）式と、円形開口の形状を表す
関数ｒｌ（Ｉｘｌ／２ａ）とのコンポリニーシーンで与
えられる。

ここで、ａは円形開口の半径である。

ｈ　ｉ（ｔ＋ｚ）＝　ｈ　（ｒ＋ｚ）＊■（ｌｘｌ／２
ａ）　　　　−（５）ここで、検出器の面積が十分に小
さいとする（ａ→０）とｎはデルタ関数になり、（５）
式は（６）式で与えられる。第５図（ｂ）はこの場合の
走査（ｓｃａｎ）の状態を模式的に示している。

ｈ　ｚ（ｘｅｚ）＝　ｂ　（ｘｅｚ）車δ（ｙ）　　　
　　　　−（６）励起光の強度分布を考慮すると、全体
の光学系による強度の３次元点像分布関数は、先にも述
べたように、結像光学系による強度の３次元点像分布関
数ｈ２と、点光源による強度分布の積で与えられる。従
って全体の光学系による強度の３次元点像分布関敗り、
ｌは、 ｈ　＊（ｙ＊Ｚ）＝　　ｈ　（ｙ＋ｚ）Ｘ［ｈ　（Ｘｔ
Ｚ）京　ｎ（ｈｒｌ／２ａ）］・・・（７） で与えられる。

（７）式を３次元７−リエ変換することにより、検出器
面積をパラメータとした３次元ＯＴＦ、Ｈ，（ρ、り）
を得る。ここでＨ（ｌｙｌ　／２ａ）ノア　−ＩＪ　工
変換は（８）式で与えられ、 ％ｎ（＋ｘ＋／ｚａｏ＝　Ｊ　、（２πａｌＪＩ）／π
ａｌ＋ｊ’・・・（８） ただし、Ｊ、は第１種ベッセル関数であり、ρ＝Ｉｊｌ
ｌとして、この３次元ＯＴ　Ｆ、　Ｈａ（ρ、＋７）は
（９）式で与えられることになる。

Ｈａ（ρ、り）＝Ｈ（ρ、＋７）本［Ｈ（ρｔ＋７）−
Ｊｌ（２πａρ）／πａｐ］　　・・・（９）この（９
）式に基づいて、検出器面積をパラメータとして３次元
ＯＴＦの計算を行った。結果を第６図に示す、ｐは面内
方向（ｒ）の空間周波数を表し、りは奥行方向（ｚ）の
空間周波数を表す０図化した縦軸は、各空間周波数成分
における３次元ＯＴＦの値をｌｏｇスケールで示してい
る。計算に用いたパラメータは次の通りである。

励起波長：　　４８８ｎｍ　　（Ａｒレーザ）蛍光波長
：　　５２０ｎ曽 レンズのＦナンバー：　　Ｏ，Ｓ（ドライレンズの場合
ＮＡ＝０．７） 第６図（ａ）ｔ（ｂ）＋（ｃ）、（ｄ）は下記の条件に
よる。

（ａ）・・・　ａ→０　　（共焦点型）（ｂ）・・・　
ａ＝励起光によるエアリディスクの半径（４２５ｎｍ） （ｃ）・・・　ａ＝励起光によるエアリディスクの半径
の２倍の牛、径（８５０ｎｍ） （ｄ）・・・　＠−４００（−様照明落射型蛍光顕微鏡
）なお、円形開口の半径ａの値は、円形開口な試斜面に
投影したときの値であり、実際では、この円形開口の半
径は（ａＸ顕微鏡の倍率）となる。また、エアリディス
クとは、第７図に示すように、励起光によって試料面に
つくられるエアリパターンの最初の暗リングの内側を指
す。

第６図より、検出器の面積を、その半径がエアリディス
クと同じ、または、エアリディスクの２倍まで広げた場
合、その３次元ＯＴＦがη軸上で値をもち、３次元分解
能をもっていることがわかる。このような光学系は、−
様照明落射型蛍光顕微鏡が全（分解をもたなかった２方
向のみに構造の変化をもつ試料に対しても分解をもつ、
特に検出器の面積がエアリディスクと同じである場合は
、半径がエアリディスクの２倍である場合と比べて、２
倍の奥行分解能をもち、共焦点型に近い分解能を示して
いる。また、エネルギー収集効率は共焦点型に比べはる
かに高くなる。

また、第６図（ｅ）、（ｃｌ）では、面内方向の空間周
波数成分が低い場合、つまりη軸付近で奥行方向の空間
周波数帯域幅が狭くなっている。すなわち面内の構造に
よって奥行方向の分解能が影響を受けている。しかし、
第６図（ｂ）には、同図（Ｃ）、（ｄ）に見られるよう
な原点付近の欠落部分は殆ど存在しない、従って、検出
器の天外さがエネルギー収集と同じである場合は、面内
の構造によって奥行分解能が影響を受けることはほとん
どない。

に　　　　　いた３　元 第８図に示すような、輪帯瞳（ａｎｎｕｌａｒ　ｐｕｐ
ｉｌ）は、低い空間周波数成分の光をカットし、一定の
空間周波数以上の光を通すことができる。

第９図に励起光学系にこの輪帯＠（アパーチャ（９８）
で形成）を用いた光学系の原理図を示す、　（９４）は
点光源（レーザ）、（９７）はレンズ、（９８）はアパ
ーチャでレーザ光束を輪帯光束にする。この輪帯光束（
９９）は、グイクロイックミラー（９５）により反射さ
れ、対物レンズ（９２）で収束されて、３次元試料（９
３）上に結像される。励起された試料からの蛍光（９１
）は対物レンズ（９２）で収集され、検出器（９６）に
より検出される。

この光学系において、点光源による試料面での強度分布
ＩＪｘ＋ｚ）は、輪帯瞳の瞳関数Ｐａ（μ）を用いて次
式で与えられる。

ｈ　ａｐ（ｘ＊ｚ）＝　ｉ丁Ｐａｐ（ｊｌ　）ｅｘｐ（
−ｉπλｚ／ｕ＋２πｉ、ｍｙ）ｄ２μＸｅｘｐ（２π
ｉｚ／λ）１２・・・（１０） ここで、輪帯瞳の瞳関数は次式により定義される。

上記（１０）式を３次元７−リエ変換し、瞳関数を代入
すると次式（１１）を得る。ただしρ＝１μｍである。

Ｈａｐ（ρ曾η）＝（１／λ２ρ＾ｎａｘ）ｒｅｅｔ［
４１’７１λ＾”ｏ＋ａｘ／（１−（八ｗａｘ／＾ｗｉ
ｎ）”月ＸＲｅ１［１−（λρ＾１ｍａＸ一方、蛍光物
体からの発光による強度の３次元点像分布関数の３次元
７−リエ変換は、先に示した通り、次式で与えられる。

Ｈ（ρ、η）ＸＪ＋（２ｘａＰ）／ｙａρ　　　・（１
２）ただし、Ｊｌは第１種ベッセル関数を表し、Ｈ（ρ
。

ＴＩ）は（１）式で与えられる。

従って、励起光学系に輪帯瞳を用いた全体の光学系の３
次元ＯＴ　Ｆ、Ｈａｐａ（ρ、Ｖ）は次の（１３）式％
式％ ］ ρは面内方向の空間周波数を表し、ηは奥行方向の空間
周波数を表す、第１０図は各空間周波数成分に対する３
次元ＯＴＦの値を１０１１スケールで表示している。

計算に用いたパラメータは次の通りである。

励起波長：　　４８８ｎｍ　　（Ａｒレーザ）蛍光波長
：　　５２０ｎ輪 Ａｍａｘ　　：　　　０，５ Ａｍｉｎ　　：　　　０．５５ 第１０図（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）は下記の条件
による。

（ａ）・・・　ａ→０　　（共焦点型）（ｂ）・・・　
ａ＝ｍ起光によるエアリディスクの半径（４２５ｎ醜） （ｅ）・・・　ａ＝励起光によるエアリディスクの半径
の２倍の半径（８５０ｎ論） （ｄ）・・・　＠−４００ 尚、実際の円形開口の半径は、先に述べたのと同様に、
ａＸ（顕微鏡の倍率）である。

また、表１．に輪帯瞳を励起光学系に用いた場合と用い
ていない場合における面内方向の分解能を示す、ＪＩｌ
ｌち、分解限界を示している。

第１０図より、励起光学系に輸帯瞳を用いた光学系は、
り方向の空間周波数帯域幅が一様に狭く、深い焦点深度
をもつことがわかる。検出器の面積を大きくすると、焦
点深度は深くなる。一方、面内方向の空間周波数帯域は
、検出器の面積を大きくしても奥行方向の空間周波数帯
域幅はど減少しない、従って、励起光学系に輪帯瞳を用
いると、面内方向の分解を高く保ちつつ、かつ焦点深度
を深くできると考えられる。

励起光学系に輸帯瞳を用いた光学系は、輪帯瞳を用いて
いない光学系に比べて、検出器の面積によらず高い面内
分解能をもっことが表１よりわかる。ただし、励起光学
系に輪帯瞳を用いると、奥行方向の空間周波数帯域が狭
くなるので、正しくは、り＝０付近においてのみ高い面
方向分解能をもつというべきであろう。つまり奥行方向
に構造の変化をもたない試料に対して、輪帯瞳を用いて
励起を行うと、高い分解が得られることがわかる。

即ち、奥行方向に構造をもたない（２方向に構造が変化
しない）試料を円形瞳を用いて励起すると、７す−カス
面の分解は高いが、フォーカス面以外の像がボケで残っ
ているので、結局７オ一カス面の徽鑵な構造は詳細に観
測しえない、ｆ＠方、同じ試料を、輪帯瞳を眉いて励起
すると、７オ一カス面の分解は、円形瞳を用いて励起し
た場合に比べて若干低くなるが、焦点深度が深いために
デフォーカスが起こらない、従って、奥行方向に構造を
もたないような試料の観察には、輪帯瞳を用いて励起し
たほうがより高い分解を得ることができる。

第６図（円形瞳による励起法）と第１０図（輪帯瞳によ
る励起法）を比較すると、円形硅励起法では、検出器前
の開口を広げると、３次元ＯＴＦが８の字状になってゆ
く（焦点はずれ像がボケで広がることに対応）のに対し
、輪帯瞳励起法では、３次元ＯＴＦが棒状であり、２軸
方向の空間周波数帯域が円形瞳励起法の場合より狭いこ
とから、焦点深度が深く、かつ焦点はずれ像はボケるの
ではな（強度を下げてゆく（消える）ことが確認できる
。

−様照明落射型蛍光顕微ｆ！ｔＣｔ１４６図（ｄ）に対
応）や共焦点型レーザ走査蛍光顕微鏡（＃＆６図（ａ）
に対応）において、焦点深度を深くする（り軸方向に対
して３次元ＯＴＦの幅をせまくする）ためには、対物レ
ンズの開口数を小さくＬようとするが、それは２輪方向
の帯域も比例して狭めることとなり、結果的に分解能を
低下させてしまう、また、対物レンズの開口数を小さく
すると、対物レンズを通過できる蛍光の光量は減少する
ので、微弱光測定においてこの方法は致命的であるが、
しかしそれ以外に方法はない。

ところが、レーザ走査蛍光顕微鏡の励起光学系に輪帯瞳
を設けると、その３次元ＯＴＦは、第１０図（ｄ）に示
されるように、ｌ方向には十分狭いにもかかわらず、ｌ
方向に円形瞳励起法（第６図（ｄ））よりむしろ広帯域
な結像特性をもち、高分解でがつ長焦点深度を同時に実
現することができる。

（実施例） １’＄１１図に実施例を示す、落射型蛍光顕微鏡（３０
）を利用したものであろ、光源は、波長４８８ｎｍのＡ
ｒレーザ（３１）でＳ　ｐｅｃｔｒａ　−ｐＨｙｓｉｃ
ｓ社製・１６１Ｂである。蛍光の検出は、（株）日本電
気製・Ｔｌ−２３ＡのＣＯＤカメラ（３２）により行っ
ている。

ＣＯＤカノラ（３２）を連結でｂるように、倍率を１〜
２．２５に可変できるリレーレンズ（３３）を使用して
いる。試料（３４）は中央部に開口のある上下動可能な
ステージ台（３５）に載置する。試料（３４）としては
、スライドガラスに蛍光塗料を一様に塗布したものを用
いている。

（３８）はレーザ光の径を拡大するビームエクスパング
ーであり、収束レンｘ’（３Ｂ）は、このレーザ光束を
顕微鏡（３０）の視野絞りの位置に収束させる。

収束光は、グイクロイックミラー（３９）に向かい、こ
こで反射され、対物レンズ（４０）に向かい、対物レン
ズ（４０）によって試料（３４）上に結像する。試料（
３４）は、この光源の結像スポットにより励起され、蛍
光を発する。試料（３４）からの蛍光は、対物レンズ（
４０）を通り、５１０ｎｍのグイクロイックミラー（３
９）、吸収フィルタ（４１）によって５２０ｎｍ以下の
波長をもつ光波成分をカットされた後、リレーレンズ（
３３）を通り、鏡胴上部の結像位置に取り付けたＣＣＤ
カメラ（３２）の受光面上に結像される。なお、対物レ
ンズ（４０）は、倍率２０倍、ＮＡは０．５のものを用
いている。＊た、レンズ（３８）の焦点距離は２５０ｍ
ｍである。

ＣＣＤカメう（３２）の受光面で受光された蛍光パター
ンは、このＣＣＤカメラ（３２）により読み出され、ア
ナログビデオ信号として、画像取り込み装置（５１）に
入力され、ここで６ビツトのディジタル信号に変換され
た後、７レームメモリに格納される１画像データは、画
像取り込み装置（５１）とコンピュータ（５２）の間を
直結するＤＭＡバスを介して、コンヒλ−タ（５２）へ
転送される。コンピュータ（５２）で処理されたｉｉｌ
像データは、デイスプレィモニタ（５３）に映出される
。実施例においては、画像取り込み装置（５１）は（株
）シバツク製・ＶＭＯＩ　Ｂ　１７レームグフパーを用
い、コンビエータ（５２）には（株）ＤＥＣ製・ミニコ
ンピユータ・Ｍ　１ｃｒｏ　Ｖ　ＡＸ■を使用している
。

実施例において、検出器面積による奥行分解能、及びエ
ネルギー収集効率への影響は、画像処理に基づいて検証
している。試料（３４）を２方向に１０μｍずつずらし
ながら、７枚のｉｉＩ像（総画素２５６Ｘ２５６）を収
集した。こうして得られた２５６Ｘ２５６の２次元デー
タ上に、各面積をもつ検出器をシェミレートして、面積
の異なる各検出器がらの出力強度を計算した０例えば、
ピンホールならば、画像内で最も強度の大きい１点（１
画素）の強度を出力強度としてとｒ）（第１２図（ａ）
）、ある面積をもつ検出器からの出力強度は、画像内の
対応する領域内の画素の強度の和をとっている（第１２
図（ｂ）、（ｅ）、（ｄ））、この計算処理等はコンピ
ュータ（５２）により行った。なお、第１２図（ａ）は
ピンホールの場合、（ｂ）はエアリディスク対応の場合
、（ｃ）はその半径がエアリディスクの半径の２倍の場
合、（ｄ）は大面積とした場合を構成的に示しでいる。

１１３図は上記の実験結果をプロットしたもので、２方
向の距離に対する検出器からの出力強度の変化を表して
いる。

ＰＩＳ１３図（ａ）は、横軸に７オ一カス位置を０とし
たときの２座標、縦軸に出力強度をプロットしている。

検出器の面積が小さくなると、強度が落ちていることが
わかる１例えば、ピンホールを用いた場合には、検出さ
れる蛍光エネルギーは非常に小さい。

一方、第１３図（ｂ）は、横軸に７オ一カス位置に対す
る座標、縦軸にそれぞれの検出器面積について、７オ一
カス位置における出力強度で規格化した値をプロットし
ている。検出器の面積が小さくなるに従って出力強度は
速やかに減衰している。

十分に大きな検出器を仮定した場合、出力強度はほとん
ど変化していない。

この例で用いた試料のように奥行方向のみに構造の変化
をもつ試料に対して、−様照明落射型蛍光顕微鏡は全く
分解をもたな、かった、上記の結果から、検出器の面積
を十分に大きくすると、このような試料に対する分解は
失われてしまうが、検出器をエアリディスクと同じ大き
さにするか、検出器の半径をエアリディスクの半径の２
倍にした場合、２方向のみに構造の変化をもった試料に
対しても分解をもち、３次元分解能を有していることが
わかる。ピンホールを泪いた場合に比べて、エアリディ
スクと同じ大かさの検出器を用いた場合は約３０％、検
出器の半径がエアリディスクの半径の２倍のものを用い
た場合は約７０％の奥行分解能が減少している。この結
果より、検出器の面積をピンホールからエアリディスク
と同じ大きさまで広げでも奥行分解能は約３０％減少す
るだけであり、しかもピンホールを用いた場合に比べて
エネルギー収集効率を相当に高くすることができる。

なお、検出器の受光面積を制限するために、実施例のよ
うにＣＯＤカメラ（３２）をもちい、画像処理を行う以
外に、簡単には、蛍光の結像位置に所定の受光面をもつ
光電検出器を設置し、この前に所定の開口をもつアパー
チャを設けるとより１．開口の大きさを可変したい場合
、簡便には、開口径を少しずつ変えた開口を円板の周辺
部に円周に沿って配列したターレット円板７パーチヤ（
６０）を設ける。

また、＃１１図では、走査のメカニズムを省略している
が、走査は、ビーム走査またはステージ走査のよく知ら
れたいずれの手法によって行ってよい、ビーム走査の場
合、ガルバノミラ−１共振がルパノミラー、ポリゴンミ
ラー、タービン駆動ポリゴンミラー、ＡＯ偏向器、ホロ
グラムスキャナーなどのうちいずれかを用いたものとす
る。また、ステージ走査では、ステッピングモータ、ピ
エゾ素子、ボイスコイル等のいずれかを用いた手法を採
用する。

第１１図の実施例において、励起光学系に輪帯瞳を形成
する場合、簡単には、レーザ（３１）からグイクロイッ
クミラー（３９）の間に、レーザ光束を輪帯光束にする
輪帯開口アパーチャ（７０）を設置する。

ビームエクスパングー（３６）の後でも、レンズ（３８
）の後ろのいずれでもよい。また、グイクロイックミラ
ー０３９の反射面を輪帯状にしておいてらよい、さらに
、より簡単には、レンズ（３８）、（３８）に中心を光
軸に一致させた遮光円形マスクを貼付してもよい。

第１４図、第１５図は輸帯開ロアパーチャ（７０）を設
けたとき、試料がどのように観測されるかを模式的に示
したものである。試料の深さ方向（２方向）の焦点深度
内に円形物体、方形物体、三角状物体、があるとした場
合である。

＄１４図において、２の方形物体面に合焦したとき、共
焦点型レーザ走査蛍光顕微鏡（アパーチャなし）では、
第１５図（ａ）のように、その方形物体のみ鮮明な画像
を得ることができ、１の円形物体や３の三角状物体はそ
の情報が全く欠落する。しかし、輪帯アパーチャ（７０
）を用いると、第１５図（ｂ）のように、１，２．３す
べての断面における物体の像、しかもコントラストのよ
い鮮明な像が同時に観測される。深い焦点深度内の総て
の新面像がボケの重畳なくシャープに一覧（透視平面図
的）に観測することが可能である。

上記の説明は、レーザ走査蛍光顕微鏡に関し、蛍光試料
を対象とするものであったが、ここに開示したこの発明
に係る各種の手法は、レーザ走査でラマン散乱を利用す
る顕微鏡にも全く同様に適用でき、同等の効果を期待で
きるものであり、本発明の手法をラマン散８し利用の顕
微鏡に応用することができる。

（発明の効果） 以上のように、励起を輪帯光束で行う第１の発明よれば
、奥行き分解能を高く保持したままで焦点深度を深くす
ることかで島る。従って、対物レンズのＮＡを大きくす
る、すなわち大径化することが可能になり、これにより
蛍光のエネルギー収集効率を高くすることができる。ま
た、試料の深さ方向で焦点深度範囲内の明るい像を一覧
的（透視平面図的）に得ることができる。さらに、共焦
点型であると、デフォーカス像の影響がなくなるので、
深い焦点深度の範囲の試料像を、高分解能でかつバック
グラウンドのない高コントラストの状態で一覧的（透視
平面図的）に得ることができる。

蛍光を検出する検出器面積をピンホール以外の所定の面
積にもで忽る第２の発明によれば、高い奥行き分解能と
合わせて高いエネルギー収集効率を得ることかで柊、Ｓ
Ｎ比が高くかつ３次元分解能にも優れた高性能の蛍光顕
微鏡を実現することができる。

【図面の簡単な説明】

第１図は一様照明落射型蛍光顕微鏡の光学系の原理図、
第２図は共焦点型レーザ走査蛍光顕微鏡の光学系の原理
図、第３図は（ａ）、（ｂ）はそれぞれ３次元ＯＴＦを
示す図、第４図は点検出の説明図、第５図（ａ）、（ｂ
）は検出器の走査（ｓｃａｎ）の説明図、第６図（ａ）
ｌ（ｂ）−（ｃ）ｌ（ｄ）はそれぞれ異なる検出器面積
による３次元ＯＴＦ示す図、第７図はエアリディスクの
説明図、＄８図は輪帯瞳の説明図、第９図は輪帯瞳を用
いた共焦点型レーザ走査蛍光顕微鏡の光学系の原理図、
第１０図（ａ）、（ｂ）−（ｃ）、（ｄ）はそれぞれ異
なる検出器面積による３次元ＯＴＦを示す図、第１１図
は実施例を示す図、第１２図（ａ）。 （ｂ）＝（ｃ）、（ｄ）はそれぞれシュミレートした検
出器面積を模式的に示す図、第１３図（ａ）、（ｂ）は
実施例を用いて行った結果をプロットした蛍光強度のグ
ラフ、第１４図は試料の模式的な断面を示す図、第１５
図（ａ）、（ｂ）はそれぞれ共焦点型レーザ走査蛍光顕
微鏡と実施例の顕微鏡における観測される画像の相違を
模式的に示した説明図である。 ３１・・・レーザ、３２・、・ＣＣＤカメラ、３４・・
・蛍光試料、４０・・・対物レンズ、６０・・・開口面
積を可変するアパーチャ、７０・・・輪帯開口をもつ７
パーチヤ。 第４図 （点碩戯） 第６図 のνイス゛ 第１０図 ｆ’（＝＝） （ａ） と！シホーｌし くｂ）エアリテンズクのサイズ゛ （ｅ）２Ｘエアリテンスクのブタ′ （ｄ）　　太きｈｈｓの場合 （点械獣） ｚＪ （ａ） ２−軸 （ｂ） 第１４図 Ｚ（虜壱オ向） 第１５図 （ａ） （ｂ）

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、収束レーザ光により蛍光試料を走査するとともに励
   起された蛍光試料からの蛍光を検出して試料の顕微画像
   を得るレーザ走査蛍光顕微鏡において、 励起光学系の光路中に、レーザ光束を輪帯光束にする手
   段を備えたことを特徴とするレーザ走査蛍光顕微鏡。 ２、共焦点型である請求項１記載のレーザ走査蛍光顕微
   鏡。 ３、蛍光を検出する光電検出器の被露光面に近接させて
   、ピンホールを含んで開口の大きさを可変して設定可能
   な手段を設けた請求項１または２記載のレーザ走査蛍光
   顕微鏡。 ４、共焦点型のレーザ走査蛍光顕微鏡において、蛍光を
   検出する光電検出器の被露光面の面積を可変する手段を
   備えたことを特徴とするレーザ走査蛍光顕微鏡。 ５、励起光学系の光路中に、レーザ光束を輪帯光束にす
   る手段をさらに備えた請求項４記載のレーザ走査蛍光顕
   微鏡。