WO2011096519A1 - 癌の治療及び／又は予防用医薬組成物 - Google Patents

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齋藤孝則
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    • C07K2317/734—Complement-dependent cytotoxicity [CDC]

Definitions

  • the present invention relates to a novel pharmaceutical use of an antibody against CAPRIN-1 or a fragment thereof as a therapeutic and / or prophylactic agent for cancer.
  • Cancer is a disease that occupies the top cause of all deaths, and the current treatment is a combination of radiation therapy and chemotherapy, mainly surgery. Despite the recent development of new surgical methods and the discovery of new anti-cancer drugs, the therapeutic results of cancer have not improved much except for some cancers. In recent years, advances in molecular biology and cancer immunology have identified antibodies that react specifically with cancer, cancer antigens that are recognized by cytotoxic T cells, genes that encode cancer antigens, There is an increasing expectation for a specific cancer therapy targeting cancer antigens (Non-patent Document 1).
  • Non-Patent Documents 4 to 4 9
  • clinical studies of cell therapy using immune cells that specifically react with cancer antigens and cancer-specific immunotherapy such as vaccines containing cancer antigens are being conducted targeting a part of them.
  • Cytoplasma-and promotion-associated protein 1 (CAPRIN-1) is expressed when quiescent normal cells are activated or undergo cell division, and also forms RNA and intracellular stress granules within the cell to transport mRNA It is an intracellular protein known to be involved in the control of translation.
  • CAPRIN-1 Cytoplasma-and promotion-associated protein 1
  • examples include GPI-anchored membrane protein 1 and Membrane component surface marker protein 1 (M11S1), and this protein is a cell membrane protein. There is a name as if it was known. These aliases originally originated from a report (Non-patent Document 10) that the gene sequence of CAPRIN-1 has a GPI-binding region and is expressed in colon cancer cells.
  • the CAPRIN-1 gene sequence is incorrect, and the CAPRIN-1 gene sequence currently registered in GenBank et al. Lacks one base, resulting in a frameshift resulting in a deletion of 80 amino acids from the C-terminus.
  • the resulting artifact (74 amino acids) is the GPI-binding portion in the previous report, and further there is a gene sequence error on the 5 ′ side, and 53 amino acids are deleted from the N-terminus (non-patent literature). 11). Further, it has been reported that the protein encoded by the gene sequence of CAPRIN-1 currently registered in GenBank et al. Is not a cell membrane protein (Non-patent Document 11).
  • Patent Documents 2 and 3 include the name M11S1, and CAPRIN-1 is one of the cell membrane proteins and is used as a target for antibody drugs. It is described that it can be used for treatment (there is no mention of treatment using an antibody against this protein in the Examples).
  • Non-Patent Document 11 from the time of filing of Patent Document 2 to the present, it has become common knowledge that CAPRIN-1 is not expressed on the cell surface, and CAPRIN-1 is a cell membrane protein. It is clear that the contents of Patent Documents 2 and 3 based only on false information that is not to be understood as technical common knowledge for those skilled in the art.
  • An object of the present invention is to identify a cancer antigen protein that is specifically expressed on the surface of a cancer cell, and to provide a use of an antibody targeting it as a therapeutic and / or prophylactic agent for cancer.
  • CAPRIN-1 having an amino acid sequence represented by an even sequence number among SEQ ID NOs: 2 to 30 based on the obtained gene and its human, bovine, horse, mouse, chicken homologous gene Antibodies against CAPRIN-1 were generated.
  • CAPRIN-1 is specifically expressed in breast cancer, brain tumor, leukemia, lymphoma, lung cancer, cervical cancer, bladder cancer, esophageal cancer, colon cancer, gastric cancer and kidney cancer cells, and one of CAPRIN-1 protein The part was specifically expressed on the cell surface of these cancer cells. And it discovered that the antibody with respect to the part expressed on the cell surface of each cancer cell of these CAPRIN-1 impaired the cancer cell which expresses CAPRIN-1, and came to complete this invention.
  • the present invention has the following features.
  • the present invention relates to an antibody comprising a heavy chain variable region comprising SEQ ID NOs: 39, 40 and 41 and a light chain variable region comprising SEQ ID NOs: 43, 44 and 45, and having immunological reactivity with a CAPRIN-1 protein
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for treating and / or preventing cancer, comprising a fragment thereof as an active ingredient.
  • the cancer is breast cancer, brain tumor, leukemia, lymphoma, lung cancer, cervical cancer, bladder cancer, esophageal cancer, colon cancer, stomach cancer or kidney cancer.
  • the antibody is a human antibody, a humanized antibody, a chimeric antibody, a single chain antibody, or a bispecific antibody.
  • the antibody against CAPRIN-1 used in the present invention damages cancer cells. Therefore, antibodies against CAPRIN-1 are useful for the treatment and prevention of cancer.
  • the antitumor activity of the antibody against the polypeptide having an even sequence number among SEQ ID NOs: 2 to 30 used in the present invention is, as described later, by examining the suppression of tumor growth in a cancer-bearing animal in vivo, or It can be evaluated by examining whether tumor cells expressing the polypeptide in vitro exhibit cytotoxic activity via immune cells or complement.
  • nucleotide sequences of the polynucleotides encoding the proteins consisting of the amino acid sequences of even numbers among SEQ ID NOs: 2 to 30 are respectively SEQ ID NOs: 1 to It is shown by the odd sequence number (namely, sequence number 1,3,5..27,29) among 29.
  • amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 6, 8, 10, 12, and 14 in the sequence listing disclosed by the present invention are derived from cancer-bearing dogs by the SEREX method using a dog testis tissue-derived cDNA library and the serum of a dog with breast cancer.
  • the amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 2 and 4 are human homologues (homologs), the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 16 is As the bovine homologous factor, the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 18 is the equine homologous factor, the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 20-28 is the mouse homologous factor, the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 30 is the It is an amino acid sequence of CAPRIN-1 isolated as a chicken homologous factor (see Example 1 described later). CAPRIN-1 is known to be expressed when quiescent normal cells are activated or undergo cell division.
  • CAPRIN-1 was known not to be expressed on the cell surface, this study revealed that a part of the CAPRIN-1 protein is expressed on the cell surface of various cancer cells. And has an immunological reactivity with a partial region of the CAPRIN-1 protein expressed on the cell surface of cancer cells, or specifically recognizes the region (that is, specifically binds to the region), It has been found that an antibody comprising a heavy chain variable region comprising SEQ ID NOs: 39, 40 and 41 and a light chain variable region comprising SEQ ID NOs: 43, 44 and 45 exhibits antitumor activity.
  • the antibody against CAPRIN-1 used in the present invention is a monoclonal antibody and may be any kind of antibody as long as it can exhibit antitumor activity.
  • a recombinant antibody such as a synthetic antibody or a multispecific antibody.
  • scFv single chain antibodies
  • human antibodies antibody fragments thereof such as Fab, F (ab ′) 2 , Fv and the like.
  • These antibodies and fragments thereof can also be prepared by methods known to those skilled in the art.
  • a test subject is a human, it is desirable that it is a human antibody or a humanized antibody in order to avoid or suppress rejection.
  • “specifically binds to a partial region of CAPRIN-1 protein” means that it specifically binds to a specific region of CAPRIN-1 protein and does not substantially bind to other protein parts. means.
  • the antitumor activity of the antibody that can be used in the present invention is determined by examining the suppression of tumor growth in cancer-bearing animals in vivo, or against tumor cells that express the polypeptide in vitro. Thus, it can be evaluated by examining whether or not it exhibits cytotoxic activity via immune cells or complement.
  • the subject who is the target of treatment and / or prevention of cancer in the present invention is a mammal such as a human, a pet animal, livestock, a sporting animal, etc., and a preferred subject is a human.
  • the protein or fragment thereof used as a sensitizing antigen for obtaining an antibody against CAPRIN-1 used in the present invention is used for the animal species from which it is derived, such as humans, dogs, cows, horses, mice, rats, and chickens. Not limited. However, it is preferable to select in consideration of compatibility with the parent cell used for cell fusion. In general, a protein derived from a mammal is preferable, and a protein derived from a human is particularly preferable. For example, when CAPRIN-1 is human CAPRIN-1, human CAPRIN-1 protein, a partial peptide thereof, cells expressing human CAPRIN-1 and the like can be used.
  • GenBank GenBank
  • FASTA Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402, 1997.
  • the base sequence or amino acid sequence of these ORFs or mature portions is 70% to 100%, preferably 80% to 100%, more preferably 90% to 100%, even more preferably 95% to 100%, such as 97% to 100%, 98% to 100%, 99% to 100% or 99.100%.
  • a target is a nucleic acid or protein consisting of a sequence having 5% to 100% sequence identity.
  • “% sequence identity” refers to the amino acid (or base) of two sequences when they are aligned (aligned) for maximum similarity with or without gaps. The percentage (%) of the same amino acid (or base) relative to the total number.
  • the CAPRIN-1 protein fragment has a length less than the total length of the protein from the amino acid length of the epitope (antigenic determinant), which is the smallest unit recognized by the antibody.
  • An epitope refers to a polypeptide fragment that has antigenicity or immunogenicity in a mammal, preferably a human, and its minimum unit consists of about 7 to 12 amino acids, such as 8 to 11 amino acids.
  • polypeptides including human CAPRIN-1 protein and partial peptides thereof are synthesized according to chemical synthesis methods such as Fmoc method (fluorenylmethyloxycarbonyl method) and tBoc method (t-butyloxycarbonyl method), for example.
  • Fmoc method fluorenylmethyloxycarbonyl method
  • tBoc method t-butyloxycarbonyl method
  • the polynucleotide encoding the above-mentioned polypeptide can be easily prepared by a known genetic engineering technique or a conventional method using a commercially available nucleic acid synthesizer.
  • DNA containing the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 is subjected to PCR using a pair of primers designed to amplify the nucleotide sequence described in SEQ ID NO: 1, using human chromosomal DNA or cDNA library as a template.
  • PCR reaction conditions can be set as appropriate.
  • the reaction is performed at 94 ° C. for 30 seconds (denaturation), and at 55 ° C. for 30 seconds.
  • the reaction process consisting of seconds to 1 minute (annealing) and 2 minutes (extension) at 72 ° C. is defined as one cycle.
  • the reaction can be performed at 72 ° C. for 7 minutes. It is not limited.
  • the PCR method, conditions, etc. are described in, for example, Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology, 3rd Edition, A compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology (1995), J ing.
  • probes and primers are prepared based on the nucleotide sequence and amino acid sequence information shown in SEQ ID NOs: 1 to 30 in the sequence listing in this specification, and a human or other cDNA library is screened using the probes and primers. By doing so, the desired DNA can be isolated.
  • the cDNA library is preferably prepared from cells, organs or tissues expressing a protein having an even sequence number among SEQ ID NOs: 2 to 30. Examples of such cells and tissues are cells or tissues derived from cancer or tumors such as testis, leukemia, breast cancer, lymphoma, brain tumor, lung cancer, colon cancer and the like.
  • the host cell may be any cell that can express the polypeptide.
  • prokaryotic cells include Escherichia coli
  • examples of eukaryotic cells include monkey kidney cells COS1, Chinese hamster ovary cells.
  • examples include, but are not limited to, mammalian cells such as CHO, human fetal kidney cell line HEK293, mouse fetal skin cell line NIH3T3, yeast cells such as budding yeast and fission yeast, silkworm cells, and Xenopus egg cells.
  • the expression vector When a prokaryotic cell is used as a host cell, the expression vector includes an origin, promoter, ribosome binding site, multicloning site, terminator, drug resistance gene, auxotrophic complementary gene, etc. that can be replicated in the prokaryotic cell. Is used. Examples of the expression vector for E. coli include pUC system, pBluescript II, pET expression system, pGEX expression system and the like.
  • a prokaryotic host cell is transformed with the vector, and the resulting transformant is cultured, the polypeptide encoded by the DNA is prokaryotic. It can be expressed in a host cell. At this time, the polypeptide can also be expressed as a fusion protein with another protein.
  • an expression vector for a eukaryotic cell having a promoter, a splicing region, a poly (A) addition site and the like is used as an expression vector.
  • expression vectors include pKA1, pCDM8, pSVK3, pMSG, pSVL, pBK-CMV, pBK-RSV, EBV vector, pRS, pcDNA3, pYES2, and the like.
  • pIND / V5-His pFLAG-CMV-2, pEGFP-N1, pEGFP-C1, etc.
  • a His tag eg (His) 6 to (His) 10
  • FLAG tag eg (His) 10
  • myc tag eg (His) 6 to (His) 10
  • the polypeptide can be expressed as a fusion protein to which various tags such as HA tag and GFP are added.
  • a well-known method such as electroporation, calcium phosphate method, liposome method, DEAE dextran method, microinjection, virus infection, lipofection, binding to a cell membrane-permeable peptide, etc. can be used. .
  • An antibody is usually a heteromultimeric glycoprotein comprising at least two heavy chains and two light chains. Apart from IgM, it is a heterotetrameric glycoprotein of about 150 kDa composed of two identical light (L) chains and two identical heavy (H) chains. Typically, each light chain is linked to the heavy chain by one disulfide covalent bond, but the number of disulfide bonds between the heavy chains of different immunoglobulin isotypes varies. Each heavy and light chain also has an intrachain disulfide bond. Each heavy chain has at one end a variable domain (VH region) followed by several constant regions. Each light chain has a variable domain (VL region) and one constant region at the opposite end.
  • VH region variable domain
  • VL region variable domain
  • the constant region of the light chain is aligned with the first constant region of the heavy chain, and the light chain variable domain is aligned with the variable domain of the heavy chain.
  • the variable domain of an antibody confers binding specificity on the antibody by exhibiting specific variability, in which a specific region is called a complementarity determining region (CDR).
  • CDR complementarity determining region
  • the relatively conserved portion of the variable region is called the framework region (FR).
  • the complete heavy and light chain variable domains each contain 4 FRs linked by 3 CDRs.
  • the three CDRs are called CDRH1, CDRH2, CDRH3 from the N-terminal in the heavy chain, and similarly called CDRL1, CDRL2, CDRL3 in the light chain.
  • CDRH3 is most important for the binding specificity of the antibody to the antigen.
  • the CDRs of each chain are held together in a state closer to the FR region, and contribute to the formation of an antigen binding site of the antibody together with the CDR from the other chain.
  • the constant region does not contribute directly to the binding of the antibody to the antigen, but is involved in various effector functions such as antibody-dependent cellular cytotoxicity (ADCC), phagocytosis through binding to Fc ⁇ receptors,
  • Figure 6 shows half-life / clearance rate through neonatal Fc receptor (FcRn), complement dependent cytotoxicity (CDC) through the C1q component of the complement cascade.
  • the anti-CAPRIN-1 antibody in the present invention means an antibody having immunological reactivity with the full length of a CAPRIN-1 protein or a fragment thereof.
  • immunological reactivity means the property of binding between an antibody and a CAPRIN-1 antigen in vivo, and damages the tumor through such binding (eg, death, suppression or regression). Function. That is, the antibody used in the present invention binds to the CAPRIN-1 protein and is a tumor such as leukemia, lymphoma, breast cancer, brain tumor, lung cancer, bladder cancer, cervical cancer, esophageal cancer, stomach cancer, kidney cancer, colon cancer, etc. If it can disturb, it does not matter.
  • the antibody is not particularly limited as long as it is a monoclonal antibody, and is a synthetic antibody, multispecific antibody, human antibody, humanized antibody, chimeric antibody, single chain antibody, antibody fragment (eg, Fab or F (ab ′)) 2 ).
  • the antibody may also be any class of immunoglobulin molecules, such as IgG, IgE, IgM, IgA, IgD and IgY, or any subclass, such as IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2, and the like.
  • the antibody may be further modified by glycosylation, acetylation, formylation, amidation, phosphorylation, PEGylation, or the like.
  • a breast cancer cell line SK-BR-3 expressing CAPRIN-1 is immunized by administering to a mouse, the spleen is extracted from the mouse, the cells are separated, and the cells are fused with mouse myeloma cells. From the obtained fused cells (hybridomas), a clone producing an antibody having a cancer cell growth inhibitory action is selected. It can be prepared by isolating a monoclonal antibody-producing hybridoma having cancer cell growth inhibitory action, culturing the hybridoma, and purifying the antibody from the culture supernatant by a general affinity purification method.
  • a hybridoma producing a monoclonal antibody can also be produced, for example, as follows.
  • an animal is immunized with a sensitizing antigen according to a known method.
  • a sensitizing antigen is injected into a mammal intraperitoneally or subcutaneously.
  • the sensitizing antigen is diluted to an appropriate amount with PBS (Phosphate-Buffered Saline), physiological saline, or the like, and mixed with an appropriate amount of an ordinary adjuvant, for example, Freund's complete adjuvant, if necessary, and emulsified.
  • PBS Phosphate-Buffered Saline
  • physiological saline or the like
  • an ordinary adjuvant for example, Freund's complete adjuvant, if necessary, and emulsified.
  • the mammal is dosed several times every 4-21 days.
  • an appropriate carrier can be used during immunization with the sensitizing antigen.
  • immune cells are collected from the mammal and subjected to cell fusion. Can be mentioned.
  • Mammalian myeloma cells are used as the other parent cells to be fused with the immune cells.
  • This myeloma cell is known in various known cell lines such as P3U1 (P3-X63Ag8U1), P3 (P3x63Ag8.653) (J. Immunol. (1979) 123, 1548-1550), P3x63Ag8U. 1 (Current Topics in Microbiology and Immunology (1978) 81, 1-7), NS-1 (Kohler. G. and Milstein, C. Eur. J. Immunol. (1976) 6, 511-511) (Margulies.
  • the cell fusion between the immune cell and myeloma cell is basically performed by a known method, for example, the method of Kohler and Milstein et al. (Kohler, G. and Milstein, C. Methods Enzymol. (1981) 73, 3-46. ) And the like.
  • the cell fusion is performed, for example, in a normal nutrient culture medium in the presence of a cell fusion promoter.
  • a cell fusion promoter for example, polyethylene glycol (PEG), Sendai virus (HVJ), or the like is used as the fusion promoter, and an auxiliary agent such as dimethyl sulfoxide can be added and used to increase the fusion efficiency as desired.
  • the usage ratio of immune cells and myeloma cells can be arbitrarily set.
  • the number of immune cells is preferably 1 to 10 times that of myeloma cells.
  • the culture solution used for the cell fusion for example, RPMI1640 culture solution suitable for growth of the myeloma cell line, MEM culture solution, and other normal culture solutions used for this kind of cell culture can be used.
  • Serum replacement fluid such as fetal calf serum (FCS) can be used in combination.
  • a predetermined amount of the immune cells and myeloma cells are mixed well in the culture medium, and a PEG solution (for example, an average molecular weight of about 1000 to 6000) preliminarily heated to about 37 ° C. is usually 30 to 60% (
  • the desired hybridoma is formed by adding at a concentration of w / v) and mixing.
  • cell fusion agents and the like that are undesirable for the growth of the hybridoma are removed by sequentially adding an appropriate culture medium and centrifuging to remove the supernatant.
  • the hybridoma thus obtained is selected by culturing in a normal selective culture solution, for example, a HAT culture solution (a culture solution containing hypoxanthine, aminopterin and thymidine). Culturing with the HAT culture solution is continued for a sufficient time (usually several days to several weeks) for cells other than the target hybridoma (non-fusion cells) to die. Subsequently, the usual limiting dilution method is performed, and the hybridoma producing the target antibody is screened and single-cloned.
  • a normal selective culture solution for example, a HAT culture solution (a culture solution containing hypoxanthine, aminopterin and thymidine). Culturing with the HAT culture solution is continued for a sufficient time (usually several days to several weeks) for cells other than the target hybridoma (non-fusion cells) to die. Subsequently, the usual limiting dilution method is performed, and the hybridoma producing the target antibody is screened
  • human lymphocytes such as human lymphocytes infected with EB virus are sensitized in vitro with proteins, protein-expressing cells or lysates thereof. Lymphocytes can be fused with human-derived myeloma cells having permanent mitotic activity, for example, U266 (Registration No. TIB196) to obtain a hybridoma that produces a human antibody having a desired activity (for example, cell growth inhibitory activity).
  • a desired activity for example, cell growth inhibitory activity
  • the hybridoma producing the monoclonal antibody thus produced can be subcultured in a normal culture solution and can be stored for a long time in liquid nitrogen.
  • a desired antigen or a cell expressing the desired antigen is used as a sensitizing antigen and immunized according to a normal immunization method, and the resulting immune cell is fused with a known parent cell by a normal cell fusion method. And can be prepared by screening monoclonal antibody-producing cells (hybridomas) by a normal screening method.
  • human antibody-producing mice for example, KM mice (Kirin Pharma / Medarex) and Xeno mice (Amgen) are known (for example, International Publication Nos. WO02 / 43478, WO02 / 092812, etc.).
  • fully human polyclonal antibodies can be obtained from blood.
  • spleen cells can be removed from the immunized mouse and a human monoclonal antibody can be prepared by a fusion method with myeloma cells.
  • the antigen can be prepared according to, for example, a method using animal cells (Japanese Patent Publication No. 2007-530068), a method using baculovirus (eg, International Publication No. WO 98/46777).
  • immunization may be performed by binding to an immunogenic macromolecule such as albumin.
  • a recombinant antibody produced by cloning an antibody gene from a hybridoma, incorporating it into an appropriate vector, introducing it into a host, and producing it using a gene recombination technique (for example, Carl, AK Borrebaeck, James, W. Larrick, THERAPEUTIC MONOCLONAL, ANTIBODIES, Published in the United KingdomMIMILLAN PUBLISHERS 19).
  • a gene recombination technique for example, Carl, AK Borrebaeck, James, W. Larrick, THERAPEUTIC MONOCLONAL, ANTIBODIES, Published in the United KingdomMIMILLAN PUBLISHERS 19.
  • V region an antibody variable region
  • DNA encoding the V region of the target antibody is obtained, it is ligated with DNA encoding the desired antibody constant region (C region) and incorporated into an expression vector.
  • DNA encoding the V region of the antibody may be incorporated into an expression vector containing DNA of the antibody C region. It is incorporated into an expression vector so as to be expressed under the control of an expression control region such as an enhancer or promoter.
  • host cells can be transformed with this expression vector to express the antibody.
  • the anti-CAPRIN-1 antibody of the present invention is a monoclonal antibody
  • the monoclonal antibody includes a human monoclonal antibody, a non-human animal monoclonal antibody (eg, mouse monoclonal antibody, rat monoclonal antibody, rabbit monoclonal antibody, chicken) Monoclonal antibodies) and chimeric monoclonal antibodies.
  • Monoclonal antibodies are obtained by culturing hybridomas obtained by fusion of spleen cells and myeloma cells from non-human mammals immunized with CAPRIN-1 protein (eg, mice, human antibody-producing mice, chickens, rabbits, etc.). Can be made.
  • a chimeric antibody is an antibody produced by combining sequences derived from different animals, for example, an antibody comprising a mouse antibody heavy chain, a light chain variable region and a human antibody heavy chain, a light chain constant region, and the like. is there.
  • a chimeric antibody can be prepared using a known method. For example, a DNA encoding an antibody V region and a DNA encoding a human antibody C region are ligated, incorporated into an expression vector, and introduced into a host. It is obtained by producing. In the examples described later, human-chicken chimera type monoclonal antibodies were prepared and their antitumor effects were confirmed.
  • These monoclonal antibodies comprise a heavy chain variable (VH) region having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 42 and a light chain variable (VL) region having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 46, wherein the sequence is located in the VH region.
  • VH heavy chain variable
  • VL light chain variable
  • CDR1 represented by the amino acid sequence of No. 39, CDR2 represented by the amino acid sequence of SEQ ID No. 40, and CDR3 represented by the amino acid sequence of SEQ ID No. 41 are included, and the VL region is represented by the amino acid sequence of SEQ ID No. 43.
  • CDR1 represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 44 and CDR3 represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 45 are included.
  • a humanized antibody is a modified antibody also called a reshaped human antibody.
  • Humanized antibodies are constructed by transplanting CDRs of antibodies from immunized animals into the complementarity determining regions of human antibodies. The general gene recombination technique is also known.
  • a DNA sequence designed to link a CDR of a mouse antibody or chicken antibody and a framework region (FR) of a human antibody was prepared so as to have an overlapping portion at the end. It is synthesized by PCR from several oligonucleotides. The obtained DNA is obtained by ligating with the DNA encoding the human antibody constant region, then incorporating it into an expression vector, introducing it into a host and producing it (European Patent Application Publication No. EP239400, International Publication No. WO96). No. 02576).
  • FR of a human antibody linked through CDR a complementarity determining region that forms a favorable antigen binding site is selected.
  • the amino acid of the framework region in the variable region of the antibody may be substituted so that the complementarity determining region of the reshaped human antibody forms an appropriate antigen binding site (Sato K. et al., Cancer Research). 1993, 53: 851-856). Moreover, you may substitute by the framework area
  • a region in which the complementarity determining region forms a favorable antigen binding site is selected. If necessary, the amino acid of the framework region in the variable region of the antibody may be substituted so that the complementarity determining region of the reshaped human antibody forms an appropriate antigen binding site (Sato K. et al., Cancer). Research 1993, 53: 851-856).
  • variable region e.g, FR
  • constant region amino acids in the variable region or constant region may be substituted with other amino acids.
  • Amino acid substitution is, for example, less than 15, less than 10, less than 8, less than 7, less than 6, less than 5, less than 4, less than 3, less than 2, or less than 2 amino acids, preferably 1 to 5 amino acids, more preferably 1 or 2 amino acids
  • the substituted antibody should be functionally equivalent to the unsubstituted antibody.
  • the substitution is preferably a conservative amino acid substitution, which is a substitution between amino acids with similar properties such as charge, side chain, polarity, aromaticity and the like.
  • Amino acids with similar properties include, for example, basic amino acids (arginine, lysine, histidine), acidic amino acids (aspartic acid, glutamic acid), uncharged polar amino acids (glycine, asparagine, glutamine, serine, threonine, cysteine, tyrosine), nonpolar It can be classified into sex amino acids (leucine, isoleucine, alanine, valine, proline, phenylalanine, tryptophan, methionine), branched chain amino acids (threonine, valine, isoleucine), aromatic amino acids (phenylalanine, tyrosine, tryptophan, histidine).
  • basic amino acids arginine, lysine, histidine
  • acidic amino acids aspartic acid, glutamic acid
  • uncharged polar amino acids glycine, asparagine, glutamine, serine, threonine, cysteine, tyrosine
  • modified antibody examples include antibodies bound to various molecules such as polyethylene glycol (PEG).
  • PEG polyethylene glycol
  • the substance to be bound is not limited. In order to obtain such a modified antibody, it can be obtained by chemically modifying the obtained antibody. These methods are already established in this field.
  • “functionally equivalent” means that the target antibody has the same biological or biochemical activity as the antibody of the present invention, specifically, a function of damaging a tumor, and is applied to humans. Sometimes refers to not essentially causing rejection. Examples of such activity include cell growth inhibitory activity or binding activity.
  • an antibody that recognizes the epitope of the CAPRIN-1 protein recognized by the anti-CAPRIN-1 antibody can be obtained by methods known to those skilled in the art.
  • the epitope of the CAPRIN-1 protein recognized by the anti-CAPRIN-1 antibody is determined by an ordinary method (eg, epitope mapping), and an antibody is produced using a polypeptide having the amino acid sequence contained in the epitope as an immunogen.
  • This method can be obtained by a method, a method of determining an epitope of an antibody prepared by a usual method, and selecting an antibody having the same epitope as the anti-CAPRIN-1 antibody.
  • epitope refers to a polypeptide fragment having antigenicity or immunogenicity in a mammal, preferably a human, and its minimum unit consists of about 7 to 12 amino acids, preferably 8 to 11 amino acids.
  • the affinity constant Ka (k on / k off ) of the antibody of the present invention is preferably at least 10 7 M ⁇ 1 , at least 10 8 M ⁇ 1 , at least 5 ⁇ 10 8 M ⁇ 1 , at least 10 9 M ⁇ 1 , At least 5 ⁇ 10 9 M ⁇ 1 , at least 10 10 M ⁇ 1 , at least 5 ⁇ 10 10 M ⁇ 1 , at least 10 11 M ⁇ 1 , at least 5 ⁇ 10 11 M ⁇ 1 , at least 10 12 M ⁇ 1 , or alternatively At least 10 13 M ⁇ 1 .
  • the antibody of the present invention can be conjugated with an antitumor agent.
  • the bond between the antibody and the antitumor agent is a group reactive with an amino group, carboxyl group, hydroxy group, thiol group, etc. (for example, succinate imidyl group, formyl group, 2-pyridyldithio group, maleimidyl group, alkoxycarbonyl group). , A hydroxy group, etc.).
  • antitumor agents include the following antitumor agents known in the literature, such as paclitaxel, doxorubicin, daunorubicin, cyclophosphamide, methotrexate, 5-fluorouracil, thiotepa, busulfan, improsulfan, piperosulfan, benzodopa (benzodopa) ), Carbocone, methredopa, uredopa, uretopa, altreamine, triethylenemelamine, triethylenephosphoramide, triethylenethiophosphoramide, trimethylolothramine , Camptothecin, bryostatin, calistatin ( allystatin), cryptophycin 1, cryptophycin 8, dolastatin, duocarmycin, eleuterbin, panclastatin, sarcodictin, spongestatin, chlorambucil, chloronaphazine, cholophosphamide, estram Ifosfamide, mechlore
  • a higher therapeutic effect can be obtained by co-administering the antibody of the present invention and an antitumor agent.
  • This technique can be applied to cancer patients expressing CAPRIN-1 either before or after surgery. In particular, after surgery, cancer recurrence and longer survival can be obtained for cancers expressing CAPRIN-1, which have been treated with an antitumor agent alone.
  • antitumor agents used in combination administration with the antibody of the present invention include the following antitumor agents known in the literature, such as paclitaxel, doxorubicin, daunorubicin, cyclophosphamide, methotrexate, 5-fluorouracil, thiotepa, Busulfan, Improsulfan, Piposulfan, Benzodopa, Carbocon, Metredopa, Uredopa, Alteramine, Triethylenemelamine, Triethylenephosphoramide, Triethylenethiophosphoramide Trimethylolomeramine, bratacin, bratacinone, camptocete , Bryostatin, callystatin, cryptophysin 1, cryptophycin 8, dolastatin, duocarmycin, eleuterbin, panclatistatin, sarcodictin, spongestatin, chloramphazine, chloronaphazine, cholophosphamide ( chlorophosphamide), estramustine, pac
  • the antibodies of the present invention include radioactive substances such as 211 At, 131 I, 125 I, 90 Y, 186 Re, 188 Re, 153 SM, 212 Bi, 32 P, 175 Lu, 176 Lu, which are known in the literature. It is also possible to combine isotopes. It is desirable that the radioisotope is effective for tumor treatment and diagnosis.
  • the antibody of the present invention is an antibody having immunological reactivity with CAPRIN-1, or an antibody that specifically binds to CAPRIN-1 and exhibits cytotoxic activity against cancer or tumor growth-inhibiting action It is.
  • the antibody should be an antibody having a structure such that little or no rejection is avoided in the subject animal to which it is administered.
  • examples of such antibodies include human antibodies, humanized antibodies, chimeric antibodies (eg, human-mouse chimeric antibodies), single chain antibodies, bispecific antibodies and the like when the target animal is human.
  • the heavy and light chain variable regions are derived from human antibodies, or the heavy and light chain variable regions are derived from non-human animal antibody complementarity determining regions (CDR1, CDR2 and CDR3).
  • a framework region derived from a human antibody, or the variable regions of the heavy and light chains are derived from a non-human animal antibody, and the constant regions of the heavy and light chains are human antibodies. It is a recombinant antibody that is derived from. Preferred antibodies are the previous two antibodies.
  • DNA encoding a monoclonal antibody against human CAPRIN-1 eg, human monoclonal antibody, mouse monoclonal antibody, rat monoclonal antibody, rabbit monoclonal antibody, chicken monoclonal antibody, etc.
  • DNA encoding the light chain variable region and heavy chain variable region of the antibody was prepared by RT-PCR method and the like, and Kabat EU numbering system (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Institute, 5th Ed. of Health, Bethesda, Md. (1991)) to determine the sequence or sequences of the CDR1, CDR2, CDR3 of the variable region of the light and heavy chains based on.
  • DNA encoding each of these variable regions or DNA encoding each CDR can be obtained using a gene recombination technique (Sambrook et al., Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press (1989)) or a DNA synthesizer. Make it.
  • the human monoclonal antibody-producing hybridoma is prepared by immunizing a human antibody-producing animal (eg, mouse) with human CAPRIN-1, and then fusing spleen cells excised from the immunized animal with myeloma cells. Can do.
  • DNA encoding the variable region and constant region of the light chain or heavy chain derived from a human antibody is prepared as necessary using a gene recombination technique or a DNA synthesizer.
  • the CDR coding sequence in the DNA encoding the variable region of the light chain or heavy chain derived from the human antibody is derived from a non-human animal (for example, mouse, rat, chicken, etc.) corresponding thereto.
  • a humanized antibody is encoded by preparing a DNA in which the CDR coding sequence of the antibody is replaced, and ligating the resulting DNA with a DNA encoding a constant region of a light chain or heavy chain derived from a human antibody, respectively. DNA can be produced.
  • DNA encoding the light chain or heavy chain variable region of an antibody derived from an animal other than a human is used.
  • a DNA encoding a chimeric antibody can be prepared by linking with a DNA encoding a region.
  • this antibody is an antibody in which a heavy chain variable region and a light chain variable region are linearly linked via a linker, DNA encoding the heavy chain variable region, DNA encoding the linker And a DNA encoding a light chain variable region can be combined to produce a DNA encoding a single chain antibody.
  • each of the heavy chain variable region and the light chain variable region is derived from a human antibody, or only the CDR is replaced by the CDR of an antibody derived from a non-human animal (eg, mouse, rat, chicken, etc.). Derived from human antibodies.
  • the linker consists of 12 to 19 amino acids, and examples thereof include 15 amino acids (G 4 S) 3 (G.-B. Kim et al., Protein Engineering Design and Selection 2007, 20 (9): 425-432). .
  • this antibody is an antibody that can specifically bind to two different epitopes, such as DNA encoding heavy chain variable region A, light chain variable region B.
  • DNA, DNA encoding heavy chain variable region B, and DNA encoding light chain variable region A are joined in this order (however, DNA encoding light chain variable region B and DNA encoding heavy chain variable region B) Are linked via a DNA encoding a linker as described above), whereby a DNA encoding a bispecific antibody can be prepared.
  • each of the heavy chain variable region and the light chain variable region is derived from a human antibody, or only the CDR is replaced by the CDR of an antibody derived from a non-human animal (eg, mouse, rat, chicken, etc.). Derived from human antibodies.
  • Recombinant DNA produced as described above is incorporated into one or more appropriate vectors, introduced into host cells (eg, mammalian cells, yeast cells, insect cells, etc.), and (co) expressed
  • host cells eg, mammalian cells, yeast cells, insect cells, etc.
  • a recombinant antibody can be prepared (PJ Delves., ANTIBODY PRODUCTION ESSENTIAL TECHNIQUES., 1997 WILEY, P. Shepherd and C. Dean. SNT. W. Gododing., Monoclonal Antibodies: principals and practices., 1993 ACADEMI PRESS).
  • the antibody of the present invention produced by the above method comprises an antibody comprising a heavy chain variable region comprising SEQ ID NOs: 39, 40 and 41 and a light chain variable region comprising SEQ ID NOs: 43, 44 and 45 (eg, SEQ ID NO: 42 The heavy chain variable region and the light chain variable region of SEQ ID NO: 46).
  • amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 39, 40 and 41 are CDR1, CDR2 and CDR3 of the chicken antibody heavy chain variable region, and the amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 43, 44 and 45 are respectively lighter than the chicken antibody. CDR1, CDR2 and CDR3 of the chain variable region.
  • humanized antibody, chimeric antibody, single chain antibody or bispecific antibody of the present invention is, for example, the following antibody.
  • variable region of the heavy chain comprises the amino acid sequence of SEQ ID NOs: 39, 40 and 41 and the amino acid sequence of the framework region derived from a human antibody
  • variable region of the light chain comprises the amino acids of SEQ ID NOs: 43, 44 and 45
  • An antibody comprising the sequence and the amino acid sequence of the framework region derived from a human antibody for example, an antibody comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 42 in the heavy chain variable region and the amino acid sequence of SEQ ID NO: 46 in the light chain variable region).
  • variable region of the heavy chain comprises the amino acid sequence of SEQ ID NOs: 39, 40 and 41 and the amino acid sequence of the framework region derived from a human antibody
  • constant region of the heavy chain comprises the amino acid sequence derived from a human antibody
  • light chain variable region comprises the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 43, 44 and 45 and the human antibody-derived framework region
  • the light chain constant region comprises the human antibody-derived amino acid sequence
  • variable region of the heavy chain comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 42
  • constant region of the heavy chain comprises the amino acid sequence derived from a human antibody
  • variable region of the light chain comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 46
  • constant region of the light chain comprises an amino acid sequence derived from a human antibody
  • human IgG1 heavy chain constant region has registration number J00228, human IgG2 Registration number J00230 for the heavy chain constant region, registration number X03604 for the human IgG3 heavy chain constant region, registration number K01316 for the human IgG4 heavy chain constant region, registration numbers V00557, X64135, X64133, etc. for the human light chain kappa constant region
  • sequences such as registration numbers X64132 and X64134 can be referred to.
  • the above antibody preferably has cytotoxic activity, and can thereby exert an antitumor effect.
  • a hybridoma capable of producing another human antibody or non-human animal antibody (eg, mouse antibody) against human CAPRIN-1 is prepared, and the monoclonal antibody produced by the hybridoma is recovered, and immunological binding to human CAPRIN-1 and It is determined whether or not the antibody is the target antibody using the cytotoxic activity as an index. After identifying the target monoclonal antibody-producing hybridoma, DNAs encoding the variable regions of the heavy and light chains of the target antibody were prepared from the hybridoma and sequenced as described above. Use for production.
  • the antibody of the present invention has the specificity of specifically recognizing CAPRIN-1, one or several (preferably in the framework region sequence and / or constant region sequence of each antibody described above, preferably There may be 1 or 2) amino acid substitutions, deletions or additions.
  • several means 2 to 5, preferably 2 or 3.
  • the present invention further provides DNA encoding the antibody of the present invention, DNA encoding the heavy chain or light chain of the antibody, or DNA encoding the variable region of the heavy chain or light chain of the antibody.
  • DNA includes, for example, a DNA encoding a heavy chain variable region including a base sequence encoding the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 39, 40 and 41, and a base sequence encoding the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 43, 44 and 45 DNA encoding the light chain variable region, and the like.
  • complementarity determining regions (CDRs) encoded by the DNA of these sequences are regions that determine the specificity of the antibody
  • sequences that encode other regions of the antibody May be a sequence derived from another antibody.
  • other antibodies include antibodies derived from organisms other than humans, but those derived from humans are preferable from the viewpoint of reducing side effects. That is, in the above DNA, the regions encoding the heavy chain and light chain framework regions and the constant regions preferably include a base sequence encoding a corresponding amino acid sequence derived from a human antibody.
  • DNA encoding the antibody of the present invention is, for example, a DNA encoding a heavy chain variable region containing a base sequence encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 42, and a region encoding a light chain variable region DNA containing the base sequence encoding the amino acid sequence of No. 46.
  • an example of the base sequence encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 42 is the base sequence of SEQ ID NO: 49.
  • An example of the base sequence encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 46 is the base sequence of SEQ ID NO: 50.
  • the region encoding each heavy chain and light chain constant region includes a base sequence encoding a corresponding amino acid sequence derived from a human antibody.
  • the DNA of the present invention can be obtained, for example, by the above method or the following method.
  • total RNA is prepared from a hybridoma related to the antibody of the present invention using a commercially available RNA extraction kit, and cDNA is synthesized by reverse transcriptase using a random primer or the like.
  • the cDNA encoding the antibody is amplified by a PCR method using oligonucleotides having conserved sequences as primers.
  • the sequence encoding the constant region can be obtained by amplifying a known sequence by the PCR method.
  • the base sequence of DNA can be determined by a conventional method by incorporating it into a sequencing plasmid or phage.
  • the anti-tumor effect of the anti-CAPRIN-1 antibody used in the present invention on CAPRIN-1-expressing cancer cells is considered to occur by the following mechanism.
  • ADCC Effector cell antibody-dependent cytotoxicity
  • CDC complement-dependent cytotoxicity
  • the activity of the anti-CAPRIN-1 antibody used in the present invention is evaluated by the above-mentioned ADCC activity or CDC activity against cancer cells expressing CAPRIN-1 in vitro as specifically shown in the Examples below. It can be evaluated by measuring.
  • the anti-CAPRIN-1 antibody used in the present invention binds to the CAPRIN-1 protein on cancer cells and exhibits an antitumor action due to the above activity, and thus is considered useful for the treatment or prevention of cancer. That is, the present invention provides a pharmaceutical composition for treating and / or preventing cancer comprising an anti-CAPRIN-1 antibody as an active ingredient.
  • the anti-CAPRIN-1 antibody is used for the purpose of administering it to the human body (antibody treatment), it is preferable to use a human antibody or a humanized antibody in order to reduce immunogenicity.
  • the binding constant (affinity constant) Ka (k on / k off ) is preferably at least 10 7 M ⁇ 1 , at least 10 8 M ⁇ 1 , at least 5 ⁇ 10 8 M as the high binding affinity.
  • ⁇ Binding to antigen-expressing cells The ability of an antibody to bind to CAPRIN-1 can be identified using binding assays such as those described in the Examples, such as ELISA, Western blotting, immunofluorescence and flow cytometry analysis.
  • Antibodies that recognize CAPRIN-1 are inoculated with tissue obtained from patients during surgery or cell lines expressing CAPRIN-1 naturally or after transfection by immunohistochemistry in a manner well known to those skilled in the art To test for reactivity with CAPRIN-1 from tissues obtained from animals bearing xenograft tissue, using paraformaldehyde or acetone-fixed frozen sections or paraformaldehyde-embedded tissue sections Can do.
  • an antibody reactive to CAPRIN-1 can be stained by various methods. For example, it can be visualized by reacting horseradish peroxidase-conjugated goat anti-mouse antibody or goat anti-chicken antibody.
  • the target of the pharmaceutical composition for the treatment and / or prevention of cancer of the present invention is not particularly limited as long as it is a cancer (cell) expressing the CAPRIN-1 gene.
  • tumor and cancer refer to malignant neoplasms and are used interchangeably.
  • the target cancer in the present invention is a cancer expressing a gene encoding a CAPRIN-1 protein having an amino acid sequence having an even sequence number among SEQ ID NOs: 2 to 30, preferably breast cancer, brain tumor, Leukemia, lung cancer, lymphoma, mastocytoma, renal cancer, cervical cancer, bladder cancer, esophageal cancer, stomach cancer and colon cancer.
  • These specific cancers include, for example, breast cancer, complex breast cancer, malignant mixed breast tumor, intraductal papillary carcinoma, lung adenocarcinoma, squamous cell carcinoma, small cell carcinoma, large cell carcinoma, neuroepithelial tissue Tumor glioma, ventricular ependymoma, neuronal tumor, fetal neuroectodermal tumor, schwannoma, neurofibroma, meningioma, chronic lymphocytic leukemia, lymphoma, gastrointestinal type Lymphoma, gastrointestinal lymphoma, small to medium cell lymphoma, cecal cancer, ascending colon cancer, descending colon cancer, transverse colon cancer, sigmoid colon cancer, rectal cancer are included, but are not limited thereto.
  • mammals for example, mammals including primates, pet animals, domestic animals, sport animals and the like, and humans, dogs and cats are particularly preferable.
  • the antibody used in the present invention when used as a pharmaceutical composition, it can be formulated by methods known to those skilled in the art. For example, it can be used parenterally in the form of a sterile solution with water or other pharmaceutically acceptable liquid, or an injection of suspension.
  • a pharmacologically acceptable carrier or medium specifically, sterile water or physiological saline, vegetable oil, emulsifier, suspension, surfactant, stabilizer, flavoring agent, excipient, vehicle, preservative
  • a pharmaceutical preparation by combining with a binder or the like as appropriate and mixing in a unit dosage form generally required for pharmaceutical practice. The amount of active ingredient in these preparations is such that an appropriate dose within the indicated range can be obtained.
  • a sterile composition for injection can be formulated in accordance with normal pharmaceutical practice using a vehicle such as distilled water for injection.
  • Aqueous solutions for injection include, for example, isotonic solutions containing physiological saline, glucose and other adjuvants such as D-sorbitol, D-mannose, D-mannitol and sodium chloride.
  • Suitable solubilizers such as Alcohols, specifically ethanol, polyalcohols such as propylene glycol, polyethylene glycol, nonionic surfactants such as polysorbate 80 (TM), HCO-60 may be used in combination.
  • oily liquid examples include sesame oil and soybean oil, which may be used in combination with benzyl benzoate or benzyl alcohol as a solubilizing agent.
  • oily liquid examples include sesame oil and soybean oil, which may be used in combination with benzyl benzoate or benzyl alcohol as a solubilizing agent.
  • buffer for example, phosphate buffer, sodium acetate buffer, a soothing agent, for example, procaine hydrochloride, stabilizer, for example, benzyl alcohol, phenol, antioxidant.
  • the prepared injection solution is usually filled into a suitable ampoule.
  • Administration is oral or parenteral, preferably parenteral administration. Specific examples include injection, nasal administration, pulmonary administration, and transdermal administration. As an example of the injection form, it can be administered systemically or locally by, for example, intravenous injection, intramuscular injection, intraperitoneal injection, subcutaneous injection, or the like.
  • the administration method can be appropriately selected depending on the age, weight, sex, symptoms, etc. of the patient.
  • the dosage of the pharmaceutical composition containing the antibody or the polynucleotide encoding the antibody can be selected, for example, in the range of 0.0001 mg to 1000 mg per kg body weight. Alternatively, for example, the dose can be selected in the range of 0.001 to 100,000 mg / body per patient, but is not necessarily limited to these values.
  • the dose and administration method vary depending on the weight, age, sex, symptoms, etc. of the patient, but can be appropriately selected by those skilled in the art.
  • Cancer preferably breast cancer, brain tumor, leukemia, lung cancer, lymphoma, mastocytoma, renal cancer, cervical cancer, bladder cancer, by administering to a subject the above pharmaceutical composition containing the antibody of the present invention or a fragment thereof, Esophageal cancer, stomach cancer and colon cancer can be treated and / or prevented.
  • a method for treating and / or preventing cancer comprising administering the pharmaceutical composition of the present invention to a subject in combination with an antitumor agent or a pharmaceutical composition containing an antitumor agent as exemplified above.
  • the antibody or fragment thereof of the present invention and the antitumor agent can be administered to a subject simultaneously or separately.
  • any pharmaceutical composition may be earlier or later, and the administration interval, dosage, administration route and frequency of administration can be appropriately selected by a specialist.
  • Another pharmaceutical dosage form to be administered at the same time includes, for example, a pharmaceutical composition obtained by mixing the antibody of the present invention or a fragment thereof and an antitumor agent in a pharmacologically acceptable carrier (or medium) and formulating it. Shall be included. Further, for any of the above pharmaceutical compositions and dosage forms containing an antitumor agent, the formulation, formulation, administration route, dose, cancer, etc. for the pharmaceutical composition and dosage form containing the antibody of the present invention The explanation can be applied.
  • the present invention also provides a combination pharmaceutical product for treating and / or preventing cancer comprising the pharmaceutical composition of the present invention and a pharmaceutical composition comprising the antitumor agent as exemplified above.
  • the present invention also provides a pharmaceutical composition for treating and / or preventing cancer comprising the antibody of the present invention or a fragment thereof and an antitumor agent together with a pharmacologically acceptable carrier.
  • the present invention further provides the following polypeptides and DNAs related to the above-mentioned antibodies.
  • polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 46, and a DNA comprising the base sequence of SEQ ID NO: 50 encoding the polypeptide.
  • polypeptides and DNA can be prepared using gene recombination techniques as described above.
  • an antibody comprising a heavy chain variable region comprising SEQ ID NOs: 39, 40 and 41 and a light chain variable region comprising SEQ ID NOs: 43, 44 and 45, and having immunological reactivity with a CAPRIN-1 protein or A pharmaceutical composition for treating and / or preventing cancer, comprising the fragment as an active ingredient.
  • cancer is breast cancer, brain tumor, leukemia, lymphoma, lung cancer, mastocytoma, kidney cancer, cervical cancer, esophageal cancer, stomach cancer, bladder cancer or colon cancer.
  • An antibody comprising a heavy chain variable region comprising SEQ ID NOs: 39, 40 and 41 and a light chain variable region comprising SEQ ID NOs: 43, 44 and 45, and having immunological reactivity with a CAPRIN-1 protein.
  • the antibody according to (4) above which is a human antibody, a humanized antibody, a chimeric antibody, a single chain antibody or a bispecific antibody.
  • a combined pharmaceutical for treatment and / or prevention of cancer comprising the pharmaceutical composition according to any one of (1) to (3) above and a pharmaceutical composition containing an antitumor agent.
  • the method includes administering to a subject the pharmaceutical composition according to any one of (1) to (3) above, or the antibody or fragment thereof according to any of (3) to (5) above.
  • a method for the treatment and / or prevention of cancer which comprises using in combination with each pharmaceutical composition of the combination drug according to (6) above in a subject.
  • RNA was extracted from testicular tissue of a healthy dog by acid guanidinium-phenol-chloroform method (Acid guanidinium-phenol-chloroform method), PolyA RNA was purified using Oligotex-dT30 mRNA purification Kit (Takara Shuzo) according to the protocol attached to the kit.
  • a dog testis cDNA phage library was synthesized using the obtained mRNA (5 ⁇ g).
  • the cDNA phage library was prepared using cDNA Synthesis Kit, ZAP-cDNA Synthesis Kit, ZAP-cDNA GigapackIII Gold Clonig Kit (manufactured by STRATAGENE) according to the protocol attached to the kit.
  • the size of the prepared cDNA phage library was 7.73 ⁇ 10 5 pfu / ml.
  • the membrane was recovered, immersed in TBS (10 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl pH 7.5) containing 0.5% nonfat dry milk, and shaken at 4 ° C. overnight to suppress nonspecific reaction.
  • TBS 10 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl pH 7.5
  • This filter was reacted with serum of a patient dog diluted 500 times at room temperature for 2 to 3 hours.
  • the serum pretreatment method is as follows. Specifically, ⁇ ZAP Express phage into which no foreign gene was inserted was infected with host E. coli (XL1-Blue MRF ′), and then cultured overnight at 37 ° C. on NZY plate medium. Next, a buffer of 0.2 M NaHCO 3 pH 8.3 containing 0.5 M NaCl was added to the plate and allowed to stand at 4 ° C. for 15 hours, and then the supernatant was recovered as an E. coli / phage extract. Next, the recovered E.
  • coli / phage extract was passed through an NHS-column (GE Healthcare Bio-Science) to immobilize the protein derived from E. coli / phage.
  • Serum dog serum was passed through and reacted with this protein-immobilized column, and antibodies adsorbed to E. coli and phage were removed from the serum.
  • the serum fraction passed through the column was diluted 500 times with TBS containing 0.5% nonfat dry milk, and this was used as an immunoscreening material.
  • phagemid host Escherichia coli prepared to have an absorbance OD 600 of 1.0 and 10 ⁇ l of the purified phage solution were mixed and reacted at 37 ° C. for 15 minutes, and 50 ⁇ l was treated with ampicillin (final concentration 50 ⁇ g / ml).
  • SOLR phagemid host Escherichia coli
  • the purified plasmid was analyzed for the full-length insert sequence by the primer walking method using the T3 primer shown in SEQ ID NO: 31 and the T7 primer shown in SEQ ID NO: 32.
  • the gene sequences described in SEQ ID NOs: 5, 7, 9, 11, and 13 were obtained by this sequence analysis.
  • the homology search program BLAST search http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/
  • BLAST search http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/
  • sequence identity of this gene with the gene encoding the human homologous factor was 94% for the nucleotide sequence and 98% for the amino acid sequence in the region translated into protein.
  • the base sequences of human homologous factors are shown in SEQ ID NOs: 1 and 3, and the amino acid sequences are shown in SEQ ID NOs: 2 and 4.
  • sequence identity of the obtained canine gene with the gene encoding the bovine homologous factor was 94% for the nucleotide sequence and 97% for the amino acid sequence in the region translated into protein.
  • the base sequence of the bovine homologous factor is shown in SEQ ID NO: 15, and the amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 16.
  • sequence identity between the gene encoding the human homologous factor and the gene encoding the bovine homologous factor was 94% in the base sequence and 93-97% in the amino acid sequence in the region translated into the protein.
  • sequence identity with the gene which codes the equine homologous factor of the acquired canine gene was the base sequence 93% and the amino acid sequence 97% in the area
  • the base sequence of the equine homologous factor is shown in SEQ ID NO: 17, and the amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 18.
  • sequence identity between the gene encoding the human homologous factor and the gene encoding the equine homologous factor was 93% nucleotide sequence and 96% amino acid sequence in the region translated into protein.
  • sequence identity of the obtained canine gene with the gene encoding the mouse homologous factor was 87 to 89% of the base sequence and 95 to 97% of the amino acid sequence in the region translated into the protein.
  • the nucleotide sequence of the mouse homologous factor is shown in SEQ ID NO: 19, 21, 23, 25, 27, and the amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 20, 22, 24, 26, 28.
  • the sequence identity between the gene encoding the human homologous factor and the gene encoding the mouse homologous factor was 89-91% of the base sequence and 95-96% of the amino acid sequence in the region translated into the protein.
  • the sequence identity of the acquired canine gene with the gene encoding the chicken homologous factor was 82% for the nucleotide sequence and 87% for the amino acid sequence in the region translated into protein.
  • the base sequence of the chicken homologous factor is shown in SEQ ID NO: 29, and the amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 30.
  • the sequence identity between the gene encoding the human homologous factor and the gene encoding the chicken homologous factor was 81 to 82% of the base sequence and 86% of the amino acid sequence in the region translated into the protein.
  • the above gene-specific primers are 206 to 632 in the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 5 (canine CAPRIN-1 gene) and 698 to 1124 in the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 (human CAPRIN-1 gene). It was intended to amplify the base region.
  • GAPDH specific primers (described in SEQ ID NOs: 35 and 36) were also used. As a result, as shown in FIG. 1, strong expression was observed in testis in healthy dog tissues, while expression was observed in canine breast cancer and adenocarcinoma tissues.
  • the expression of the human homologous factor of the obtained gene was also confirmed, it was found only in the testis that the expression was confirmed in normal tissues as in the canine CAPRIN-1 gene, but in cancer cells, breast cancer, brain tumor, leukemia Expression was detected in many types of cancer cell lines such as lung cancer and esophageal cancer cell lines, and in particular, expression was confirmed in many breast cancer cell lines. From this result, it was confirmed that CAPRIN-1 was not expressed in normal tissues other than testis, but was expressed in many cancer cells, particularly in breast cancer cell lines.
  • reference number 1 on the vertical axis indicates the expression pattern of the gene identified above, and reference number 2 indicates the expression pattern of the GAPDH gene as a comparative control.
  • Each organ was cut in PBS and fixed at reflux overnight with 0.1 M phosphate buffer (pH 7.4) containing 4% paraformaldehyde (PFA). The reflux solution is discarded, and the tissue surface of each organ is rinsed with PBS.
  • a PBS solution containing 10% sucrose is placed in a 50 ml centrifuge tube, and each tissue is placed therein and shaken at 4 ° C. for 2 hours using a rotor. That ’s it.
  • the solution was replaced with a PBS solution containing 20% sucrose, allowed to stand at 4 ° C. until the tissue subsided, then replaced with a PBS solution containing 30% sucrose, and allowed to stand at 4 ° C. until the tissue subsided.
  • the tissue was removed and the necessary part was cut out with a scalpel.
  • an OCT compound manufactured by Tissue Tek
  • Cryomold is placed on dry ice and rapidly frozen, then sliced into 10-20 ⁇ m using a cryostat (LEICA) and air-dried with a hair dryer for 30 minutes together with the slide glass, and the sliced tissue is placed.
  • a slide glass was prepared.
  • an operation of replacing PBS-T every 5 minutes in a staining bottle filled with PBS-T (physiological saline containing 0.05% Tween 20) was performed three times.
  • the mouse tissue was MOM mouse Ig blocking reagent (manufactured by VECTASTAIN), and the dog tissue was PBS containing 10% FBS.
  • Each -T solution was placed and allowed to stand at room temperature for 1 hour on a moist chamber.
  • a monoclonal antibody (monoclonal antibody # 1) against CAPRIN-1 having the heavy chain variable region of SEQ ID NO: 42 and the light chain variable region of SEQ ID NO: 46, which reacts with the surface of the cancer cell prepared in Example 4, is blocked.
  • the solution prepared at 10 ⁇ g / ml was put on and left in a moist chamber at 4 ° C.
  • MOM biotin-labeled anti-IgG antibody manufactured by VECTASTAIN
  • MOM biotin-labeled anti-IgG antibody diluted 250-fold with a blocking solution was placed and allowed to stand in a moist chamber for 1 hour at room temperature.
  • avidin-biotin ABC reagent manufactured by VECTASTAIN was placed and allowed to stand at room temperature for 5 minutes in a moist chamber.
  • a DAB coloring solution (DAB 10 mg + 30% H 2 O 2 10 ⁇ l / 0.05 M Tris-HCl (pH 7.6) 50 ml) was placed on it and placed in a moist chamber at room temperature for 30 minutes. Let sit for a minute. After rinsing with distilled water, a hematoxylin reagent (manufactured by DAKO) was placed and allowed to stand at room temperature for 1 minute, and then rinsed with distilled water. Each of the 70%, 80%, 90%, 95%, and 100% ethanol solutions was sequentially placed for 1 minute, and then allowed to stand overnight in xylene.
  • DAB coloring solution (DAB 10 mg + 30% H 2 O 2 10 ⁇ l / 0.05 M Tris-HCl (pH 7.6) 50 ml) was placed on it and placed in a moist chamber at room temperature for 30 minutes. Let sit for a minute. After rinsing with distilled water, a hematoxylin reagent (manufacture
  • the slide glass was taken out and sealed with Glycergel Mounting Medium (manufactured by DAKO) and then observed.
  • Glycergel Mounting Medium manufactured by DAKO
  • CAPRIN-1 was slightly expressed in cells in the salivary gland, kidney, colon, and stomach tissues, but was not observed on the cell surface, and in tissues derived from other organs. No expression was observed.
  • the monoclonal antibody # 1 that reacts with the surface of the cancer cell prepared in Example 4 was put on a solution prepared at 10 ⁇ g / ml with a PBS-T solution containing 5% FBS, and was left still overnight at 4 ° C. in a moist chamber. After washing with PBS-T three times for 10 minutes, an appropriate amount of Peroxidase Labeled Polymer Conjugated (manufactured by DAKO) was dropped, and the mixture was allowed to stand at room temperature for 30 minutes in a moist chamber.
  • DAKO Peroxidase Labeled Polymer Conjugated
  • CAPRIN-1 was strongly expressed in esophageal cancer, colon cancer, rectal cancer, lung cancer, renal cancer, bladder cancer and cervical cancer.
  • Example 2 Production of Novel Human Cancer Antigen Protein
  • a recombinant protein of human homologous gene was produced by the following method. For PCR, 1 ⁇ l of a cDNA whose expression by RT-PCR method was confirmed from various tissue and cell cDNAs prepared in Example 1 and two kinds of primers containing SacI and XhoI restriction enzyme cleavage sequences (described in SEQ ID NOs: 37 and 38).
  • the purified DNA fragment was ligated to a cloning vector PCR-Blunt (manufactured by Invitrogen). After transforming this into E. coli, the plasmid was recovered, and it was confirmed by sequencing that the amplified gene fragment matched the target sequence.
  • a plasmid corresponding to the target sequence was treated with SacI and XhoI restriction enzymes, purified with QIAquick Gel Extraction Kit, and then inserted into an expression vector pET30a (manufactured by Novagen) for Escherichia coli treated with SacI and XhoI restriction enzymes. . By using this vector, a His-tagged recombinant protein can be produced. This plasmid was transformed into E.
  • the cells were suspended in phosphate buffered saline and subjected to ultrasonic crushing on ice.
  • the E. coli sonication solution was centrifuged at 6000 rpm for 20 minutes, and the resulting supernatant was used as a soluble fraction and the precipitate was used as an insoluble fraction.
  • the soluble fraction was added to a nickel chelate column (carrier: Chelating Sepharose (trademark) Fast Flow (GE HealthCare), column volume 5 ml, equilibration buffer 50 mM hydrochloric acid buffer (pH 8.0)) prepared according to a conventional method.
  • the unadsorbed fraction was washed with 50 mM hydrochloric acid buffer (pH 8.0) and 20 mM imidazole-containing 20 mM phosphate buffer (pH 8.0), which is 10 times the column volume, and immediately, 100 mM imidazole-containing 20 mM.
  • Six beds were eluted with a phosphate buffer (pH 8.0).
  • the elution fraction of 100 mM imidazole-containing 20 mM phosphate buffer (pH 8.0) whose elution of the target protein was confirmed by Coomassie staining was applied to a strong anion exchange column (carrier: Q Sepharose (trademark) Fast Flow (GE Healthcare), column volume. 5 ml of 20 mM phosphate buffer (pH 8.0) as an equilibration buffer was added. The unadsorbed fraction was washed with 20 mM phosphate buffer (pH 7.0) 10 times the column volume and 200 mM sodium chloride-containing 20 mM phosphate buffer (pH 7.0). Five bed elution was performed with sodium-containing 20 mM phosphate buffer (pH 7.0) to obtain a purified fraction of each protein having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2.
  • Example 3 Production of Chicken Monoclonal Antibody to CAPRIN-1 300 ⁇ g of the antigen protein (human CAPRIN-1) shown in SEQ ID NO: 2 prepared in Example 2 was mixed with an equal volume of Freund's complete adjuvant, and this was treated with chicken 1 Antigen solution per wing was used. Immunization was completed by administering the antigen solution into the abdominal cavity of a 7-week-old chicken and administering it 7 times every 4 weeks. Each spleen removed 4 days after the last immunization was crushed between two sterilized glass slides, washed with PBS (-) (manufactured by Nissui), centrifuged at 1500 rpm for 10 minutes, and the supernatant was obtained.
  • PBS -
  • the removal operation was repeated 3 times to obtain spleen cells.
  • the obtained spleen cells were mixed with chicken myeloma cells deficient in the light chain, which were established from chickens using the avian reticuloendotheliosis virus, at a ratio of 5: 1, and 37 ° C. was mixed therewith.
  • a PEG solution prepared by mixing 200 ⁇ l of IMDM medium containing 10% FBS and 800 ⁇ l of PEG 1500 (manufactured by Boehringer) was added and allowed to stand for 5 minutes for cell fusion.
  • the cells were suspended in 300 ml of IMDM medium (HAT selective medium) containing 10% FBS to which 2% equivalent of Gibco's HAT solution was added. 100 ⁇ l per well of (made) was seeded on 30 plates. By culturing under conditions of 37 ° C. and 5% CO 2 for 7 days, a hybridoma in which spleen cells and chicken myeloma cells were fused was obtained.
  • IMDM medium HAT selective medium
  • FBS Gibco's HAT solution
  • Hybridomas were selected using as an index the binding affinity of the antibody produced by the prepared hybridomas to the CAPRIN-1 protein.
  • 100 ⁇ l of 1 ⁇ g / ml of the CAPRIN-1 protein solution prepared in Example 2 was added per well of a 96-well plate and allowed to stand at 4 ° C. for 18 hours. Each well was washed 3 times with PBS-T, and then added with 400 ⁇ l of 0.5% Bovine Serum Albumin (BSA) solution (manufactured by Sigma) per well and allowed to stand at room temperature for 3 hours.
  • BSA Bovine Serum Albumin
  • hybridomas were added to the plate so that the number was 0.5 per well of the 96-well plate and cultured. One week later, hybridomas forming a single colony in the well were observed. The cells in these wells were further cultured, and hybridomas were selected using the binding affinity of the antibody produced by the cloned hybridomas to the CAPRIN-1 protein as an index. 100 ⁇ l of 1 ⁇ g / ml of the CAPRIN-1 protein solution prepared in Example 2 was added per well of a 96-well plate and allowed to stand at 4 ° C. for 18 hours. After washing each well 3 times with PBS-T, 400 ⁇ l of 0.5% BSA solution was added per well and allowed to stand at room temperature for 3 hours.
  • Example 4 Characterization of Selected Antibody (1) Cloning of Variable Region Gene of Anti-CAPRIN-1 Monoclonal Antibody A monoclonal antibody that reacts with the cell surface of breast cancer cells expressing CAPRIN-1 selected in Example 3 is produced. MRNA is extracted from a chicken-derived hybridoma strain, and the heavy chain variable (VH) region and the light chain variable (VH) region of this antibody (by a RT-PCR method using primers specific for the chicken FR1-derived sequence and the chicken FR4-derived sequence ( VL) region genes were obtained.
  • VH heavy chain variable
  • VH light chain variable
  • mRNA was extracted from two mouse-derived hybridoma strains producing monoclonal antibodies that react with the cell surface of breast cancer cells expressing CAPRIN-1, and primers specific to the mouse FR1-derived sequence and the mouse FR4-derived sequence were used.
  • the heavy chain variable (VH) region and light chain variable (VL) region genes of each antibody were obtained by the RT-PCR method used.
  • the genes were cloned into pCR2.1 vector (Invitrogen) for sequencing.
  • the PCR method is used for chicken antibody heavy chain gene variable region, chicken antibody light chain gene variable region, mouse antibody heavy chain The gene variable region and mouse antibody light chain gene variable region were each amplified.
  • a primer specific for the chicken heavy chain FR1 sequence and a primer specific for the chicken heavy chain FR4 sequence were used.
  • a primer specific for the chicken light chain FR1 sequence and a primer specific for the chicken light chain FR4 were used to obtain the gene for the VL region.
  • a primer specific for the mouse heavy chain FR1 sequence, a primer specific for the mouse heavy chain FR4 sequence and a primer specific for the mouse light chain FR1 sequence and the mouse light chain Primers specific for FR4 were used.
  • Each PCR product obtained above was electrophoresed on an agarose gel, and the DNA bands of the VH region and VL region were excised.
  • the DNA fragment was obtained using a QIAquick Gel purification kit (manufactured by QIAGEN) according to the attached protocol.
  • Each purified DNA was cloned into the pCR2.1 vector using a TA cloning kit (Invitrogen).
  • the ligated vector was transformed into DH5 competent cell (manufactured by TOYOBO) according to a conventional method.
  • Ten clones of each transformant were cultured overnight at 37 ° C. in a medium (100 ⁇ g / ml ampicillin), and then each plasmid DNA was purified using Qiaspin Miniprep kit (manufactured by QIAGEN).
  • the gene sequence encoding the heavy chain variable region of the obtained chicken-derived monoclonal antibody is represented by SEQ ID NO: 49 and the amino acid sequence thereof is SEQ ID NO: 42, and the gene sequence encoding the light chain variable region is represented by SEQ ID NO: 50.
  • the sequence is shown in SEQ ID NO: 46.
  • monoclonal antibody # 1 consists of a heavy chain variable region of SEQ ID NO: 42 and a light chain variable region of SEQ ID NO: 46, of which CDRs 1 to 3 in the heavy chain variable region are SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: It was confirmed that CDRs 1 to 3 in the light chain variable region consisted of amino acid sequences of SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, and SEQ ID NO: 45, respectively.
  • both ends of the gene amplified fragment of the light chain variable region of chicken monoclonal antibody # 1 represented by SEQ ID NO: 46 were purified after restriction enzyme treatment, purified from the chicken antibody-derived leader sequence containing SEQ ID NO: 51 and SEQ ID NO: 53
  • the human IgG1 L chain constant region containing was inserted into the already inserted pcDNA3.1 / myc-His (Invitrogen) vector according to a conventional method.
  • the above recombinant vector into which the heavy chain variable region of chicken monoclonal antibody # 1 represented by SEQ ID NO: 42 was inserted, and the light chain variable region of chicken monoclonal antibody # 1 represented by SEQ ID NO: 46 were inserted.
  • the above recombinant vector was introduced into CHO-K1 cells (obtained from Riken Cell Bank). Specifically, 2 ⁇ 10 5 CHO-K1 cells cultured in Ham's F12 medium (manufactured by Invitrogen) containing 1 ml of 10% FBS per well of a 12-well culture plate were added with PBS ( ⁇ ).
  • the CHO-K1 cell introduced with the above recombinant vector was seeded at 0.5 per well of the well plate, and human-chicken chimera antibody # 1 having the variable region of chicken monoclonal antibody # 1 (# A cell line stably producing 1) was prepared.
  • the prepared cell line was cultured for 5 days using 30 ml of OptiCHO medium (manufactured by Invitrogen) without serum at 5 ⁇ 10 5 cells / ml in a 150 cm 2 flask to obtain a culture supernatant containing # 1.
  • both ends of the gene amplified fragment of the heavy chain variable region of chicken monoclonal antibody # 1 represented by SEQ ID NO: 42 were treated with restriction enzymes and purified to obtain a chicken antibody-derived leader sequence and mouse IgG1 heavy chain constant region. It was inserted into a pcDNA4 / myc-His (manufactured by Invitrogen) vector that had already been inserted according to a conventional method. Further, both ends of the gene amplified fragment of the light chain variable region of chicken monoclonal antibody # 1 shown in SEQ ID NO: 46 were purified after restriction treatment, and the chicken antibody-derived leader sequence and mouse IgG1 L chain constant region were already present.
  • mice-chicken chimeric antibody # 1 was obtained by culturing for 5 days using 30 ml of OptiCHO medium (manufactured by Invitrogen) containing 5 ⁇ 10 5 cells / ml and no serum.
  • the same operation as described above was performed using a culture supernatant of CHO-K1 cells into which no antibody gene had been introduced and a culture medium for hybridoma culture, and used as a negative control.
  • the cells to which the antibody # 1 was added had a fluorescence intensity of 20% or more higher than that of the control.
  • SK-BR-3 showed an increase in fluorescence intensity of 4900% and MDA-MB-231V showed an increase of 5000%. This confirmed that the CAPRIN-1 protein was expressed on the cell membrane surface of the human cancer cell line.
  • the enhancement rate of the fluorescence intensity is represented by the increase rate of the average fluorescence intensity (MFI value) in each cell, and was calculated by the following calculation formula.
  • the cells were washed three times with RPMI 1640 medium containing 10% FBS, and 5 ⁇ 10 3 cells were added per well of a 96-well V-bottom plate to obtain target cells.
  • the above purified antibody was added to a final concentration of 1 ⁇ g / ml, and 2.5 ⁇ 10 5 lymphocytes separated from human peripheral blood according to a conventional method were added, followed by 37 ° C., 5% CO 2.
  • the cells were cultured for 4 hours under these conditions. After the culture, the amount of chromium 51 in the culture supernatant released from the damaged cancer cells was measured, and the ADCC activity against the cancer cells by the anti-CAPRIN-1 antibody was calculated. Negative control was prepared by adding PBS instead of antibody or isotype control antibody.
  • antibody # 1 showed a cytotoxic activity of 30% or more against MDA-MB-157 (see FIG. 2).
  • the activities of the negative control added PBS and the isotype control antibody added were 1.1% and 2.0%, respectively.
  • other cancer cells glioma cell lines T98G, U373, lung cancer cell lines A549, QG56, kidney cancer cell lines Caki-1, ACHN, cervical cancer cell line SW756, bladder cancer cell line T24, esophageal cancer cell line
  • ADCC activity of antibody # 1 against KYSE180 gastric cancer cell lines MNK28, MNK45, colorectal cancer cell line SW480, leukemia cell line AML5 and lymphoma cell line Ramos, 16.4% against T98G (isotype control is 1 .2%), 23.1% for U373 (3.2% for isotype control), 36.1% for A549 (3.0% for isotype control), 33.5% for QG56 ( Isotype control is 0.5%) and 28
  • the suspension was suspended in RPMI medium containing 50% of the rabbit serum prepared above, and 5 ⁇ 10 3 pieces were added per well of a 96-well V-bottom plate.
  • # 1 obtained in the above (5) was added so that the final concentration was 1 ⁇ g / ml, and the cells were cultured at 37 ° C. under 5% CO 2 for 4 hours.
  • the amount of chromium 51 in the culture supernatant released from the damaged tumor cells was measured, and the CDC activity against MDA-MB-231V was calculated.
  • the antibody # 1 showed a CDC activity of 25% or more. Therefore, it was revealed that # 1 can also damage cancer cells expressing CAPRIN-1 by CDC activity.
  • Example 5 Anti-tumor effect of anti-CAPRIN-1 antibody # 1 in vivo in mouse
  • the antibody used was obtained by column purification of the culture supernatant of each cell producing # 1 as described above.
  • the antitumor effect of antibody # 1 was examined using tumor-bearing mice transplanted with a mouse-derived cancer cell line expressing CAPRIN-1. 20 ⁇ 10 5 4T1 cells (purchased from ATCC) are transplanted subcutaneously into the back of 20 Balb / c mice (manufactured by Japan SLC) until the cancer grows to a size of about 5 mm in diameter. I let you. Among them, the antibody # 1 was intraperitoneally administered to 10 cancer-bearing mice at 200 ⁇ g (200 ⁇ l) per mouse.
  • the same amount of antibody was administered to the peritoneal cavity of each cancer-bearing mouse 3 times in total for 2 days, the size of the cancer was measured every day, and the antitumor effect was observed.
  • the remaining 10 tumor-bearing mice were administered PBS ( ⁇ ) instead of the antibody, and this was used as a control group.
  • the study group administered with antibody # 1 against CAPRIN-1 regressed to about 55% on the 4th day when the tumor volume at the start of antibody administration was 100%.
  • the cancer regressed to about 32% on the 6th day and about 7% on the 8th day, and the cancer regressed almost completely by the 10th to 14th days (see FIG.
  • the cancer increased to about 170%, 270%, 440%, and 670% on the 4th, 6th, 8th, and 11th days, respectively. (See FIG. 3). From this result, it was shown that the obtained antibody # 1 exerted a strong antitumor effect in vivo against cancer cells expressing CAPRIN-1.
  • the size of the cancer was calculated by using a formula of major axis ⁇ minor axis ⁇ minor axis ⁇ 0.5.
  • the antibody of the present invention is useful for the treatment and / or prevention of cancer.

Abstract

　この発明は、癌細胞の表面に特異的に発現する癌抗原タンパク質を同定し、それを標的とした抗体の、癌の治療及び／又は予防剤としての用途、具体的には、配列番号３９、４０及び４１を含む重鎖可変領域と配列番号４３、４４及び４５を含む軽鎖可変領域とを含み、かつ、ＣＡＰＲＩＮ－１タンパク質と免疫学的反応性を有する抗体又はそのフラグメントを有効成分として含むことを特徴とする、癌の治療及び／又は予防のための医薬組成物を提供する。

Description

癌の治療及び／又は予防用医薬組成物
　本発明は、ＣＡＰＲＩＮ－１に対する抗体又はそのフラグメントの、癌の治療及び／又は予防剤等としての新規な医薬用途に関する。
　癌は全死亡原因の第一位を占める疾患であり、現在行われている治療は手術療法を主体に放射線療法と化学療法を組み合わせたものである。近年の新しい手術法の開発や新たな抗癌剤の発見にも関わらず、一部の癌を除いて、癌の治療成績はあまり向上していないのが現状である。近年、分子生物学や癌免疫学の進歩によって、癌に特異的に反応する抗体類、細胞障害性Ｔ細胞により認識される癌抗原類、癌抗原をコードする遺伝子類などが同定されており、癌抗原類をターゲットにした特異的癌治療法への期待が高まっている（非特許文献１）。
　癌治療法においては、副作用を軽減するため、その抗原として認識されるペプチド、ポリペプチド又はタンパク質は、正常細胞にはほとんど存在せず、癌細胞に特異的に存在していることが望ましい。１９９１年、ベルギー国Ｌｕｄｗｉｇ研究所のＢｏｏｎらは自己癌細胞株と癌反応性Ｔ細胞を用いたｃＤＮＡ発現クローニング法によりＣＤ８陽性Ｔ細胞が認識するヒトメラノーマ抗原ＭＡＧＥ１を単離した（非特許文献２）。その後、癌患者の生体内で自己の癌に反応して産生される抗体が認識する腫瘍抗原を遺伝子の発現クローニングの手法を取り入れて同定する、ＳＥＲＥＸ（ｓｅｒｏｌｏｇｉｃａｌ　ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ａｎｔｉｇｅｎｓ　ｂｙ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｃｌｏｎｉｎｇ）法が報告され（非特許文献３及び特許文献１）、この方法により、正常細胞にはほとんど発現がなく、癌に特異的に発現するいくつかの癌抗原が単離されている（非特許文献４～９）。さらに、その一部をターゲットにして、癌抗原に特異的に反応する免疫細胞を用いた細胞療法や、癌抗原を含むワクチンなどの癌特異的免疫療法の臨床試験が実施されている。
　一方、近年、癌細胞上の抗原タンパク質を標的にした、癌を治療するための各種抗体医薬が世の中に台頭してきた。癌特異的治療薬として一定の薬効が得られ注目されているが、標的となる抗原タンパク質の大部分は正常細胞にも発現するものであり、抗体投与の結果、癌細胞だけでなく、抗原が発現する正常細胞も障害されてしまい、その結果生じる副作用が問題になっている。したがって、癌細胞表面に特異的に発現する癌抗原を同定し、それを標的とした抗体を医薬品として使用することができれば、より副作用の少ない抗体医薬による治療が可能になると期待される。
　Ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ－ａｎｄ　ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｅｄ　ｐｒｏｔｅｉｎ　１（ＣＡＰＲＩＮ－１）は、休止期の正常細胞が活性化や細胞分裂を起こす際に発現し、また細胞内でＲＮＡと細胞内ストレス顆粒を形成してｍＲＮＡの輸送、翻訳の制御に関与することなどが知られている細胞内タンパク質である。一方で、ＣＡＰＲＩＮ－１には色々な別名が存在しており、その一例としてＧＰＩ－ａｎｃｈｏｒｅｄ　ｍｅｍｂｒａｎｅ　ｐｒｏｔｅｉｎ　１やＭｅｍｂｒａｎｅ　ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ　ｓｕｒｆａｃｅ　ｍａｒｋｅｒ　１　ｐｒｏｔｅｉｎ　（Ｍ１１Ｓ１）などがあり、あたかも本タンパク質が細胞膜タンパク質であることが知られていたかのような名称がある。これらの別名は、元々、ＣＡＰＲＩＮ－１の遺伝子配列が、ＧＰＩ結合領域を有し、大腸癌細胞に発現する膜タンパク質であるとする報告（非特許文献１０）に由来するが、後にこの報告でのＣＡＰＲＩＮ－１の遺伝子配列は誤りであり、現在ＧｅｎＢａｎｋ等に登録されているＣＡＰＲＩＮ－１の遺伝子配列が１塩基欠損することによりフレームシフトが起きることでＣ末端から８０アミノ酸が欠損し、その結果生じるａｒｔｉｆａｃｔ（７４アミノ酸）が前報告でのＧＰＩ結合部分であり、さらに５’側にも遺伝子配列のエラーがあり、Ｎ末端から５３アミノ酸が欠損していることが報告されている（非特許文献１１）。また、現在ＧｅｎＢａｎｋ等に登録されているＣＡＰＲＩＮ－１の遺伝子配列がコードするタンパク質は細胞膜タンパク質ではないことが報告されている（非特許文献１１）。
　なお、ＣＡＰＲＩＮ－１が細胞膜タンパク質であるとする非特許文献１０の報告に基づき、特許文献２及び３には、Ｍ１１Ｓ１の名称で、ＣＡＰＲＩＮ－１が細胞膜タンパク質の１つとして抗体医薬の標的として癌治療に使用されうることが記載されている（実施例には本タンパク質に対する抗体を用いた治療に関する記載は一切ない）。しかし、非特許文献１１の報告の通り、特許文献２の出願当時から現在まで、ＣＡＰＲＩＮ－１は細胞表面には発現していないものであることが通説になっており、ＣＡＰＲＩＮ－１が細胞膜タンパク質であるという誤った情報のみに基づく特許文献２及び３の内容は、当業者の技術常識として理解されるべきものでないことは明らかである。
米国特許第５６９８３９６号 ＵＳ２００８／００７５７２２ ＷＯ２００５／１００９９８
秋吉毅，「癌と化学療法」、１９９７年、第２４巻、ｐ５５１－５１９（癌と化学療法社、日本） Ｂｒｕｇｇｅｎ　Ｐ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｓｃｉｅｎｃｅ，　２５４：１６４３－１６４７（１９９１） Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ，　９２：１１８１０－１１８１３（１９９５） Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，７２：９６５－９７１（１９９７） Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．，　５８：１０３４－１０４１（１９９８） Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，２９：６５２－６５８（１９９８） Ｉｎｔ．Ｊ．Ｏｎｃｏｌ．，１４：７０３－７０８（１９９９） Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．，　５６：４７６６－４７７２（１９９６） Ｈｕｍ．　Ｍｏｌ．　Ｇｅｎｅｔ６：３３－３９，　１９９７ Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．，　２７０：２０７１７－２０７２３，　１９９５ Ｊ．　Ｉｍｍｕｎｏｌ．，　１７２：２３８９－２４００，　２００４
　本発明の目的は、癌細胞の表面に特異的に発現する癌抗原タンパク質を同定し、それを標的とした抗体の、癌の治療及び／又は予防剤としての用途を提供することである。
　本発明者らは、鋭意研究の結果、イヌの精巣組織由来ｃＤＮＡライブラリーと乳癌患犬の血清を用いたＳＥＲＥＸ法により、担癌生体由来の血清中に存在する抗体と結合するタンパク質をコードするｃＤＮＡを取得し、取得した遺伝子及びそのヒト、ウシ、ウマ、マウス、ニワトリ相同性遺伝子を基にして、配列番号２～３０のうち偶数の配列番号で示されるアミノ酸配列を有するＣＡＰＲＩＮ－１及びそれらＣＡＰＲＩＮ－１に対する抗体を作製した。そしてＣＡＰＲＩＮ－１が乳癌、脳腫瘍、白血病、リンパ腫、肺癌、子宮頸癌、膀胱癌、食道癌、大腸癌、胃癌及び腎臓癌細胞に特異的に発現していること、そしてＣＡＰＲＩＮ－１タンパク質の一部がそれら癌細胞の細胞表面に特異的に発現していることを見出した。そして、それらＣＡＰＲＩＮ－１の各癌細胞の細胞表面に発現する部分に対する抗体が、ＣＡＰＲＩＮ－１を発現する癌細胞を障害することを見出し、本発明を完成させるに至った。
　したがって、本発明は、以下の特徴を有する。
　本発明は、配列番号３９、４０及び４１を含む重鎖可変領域と配列番号４３、４４及び４５を含む軽鎖可変領域とを含み、かつ、ＣＡＰＲＩＮ－１タンパク質と免疫学的反応性を有する抗体又はそのフラグメントを有効成分として含むことを特徴とする、癌の治療及び／又は予防のための医薬組成物を提供する。
　その実施形態において、上記癌は、乳癌、脳腫瘍、白血病、リンパ腫、肺癌、子宮頸癌、膀胱癌、食道癌、大腸癌、胃癌もしくは腎臓癌である。
　別の実施形態において、上記抗体は、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、単鎖抗体、又は二重特異抗体である。
　本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願2010-023452号の明細書及び／又は図面に記載される内容を包含する。
　本発明で用いられるＣＡＰＲＩＮ－１に対する抗体は、癌細胞を障害する。したがって、ＣＡＰＲＩＮ－１に対する抗体は癌の治療や予防に有用である。
ＣＡＰＲＩＮ－１タンパク質をコードする遺伝子の、正常組織及び腫瘍細胞株での発現パターンを示す図である。参照番号１；ＣＡＰＲＩＮ－１タンパクをコードする遺伝子の発現パターン、参照番号２；ＧＡＰＤＨ遺伝子の発現パターンを示す。 癌細胞の細胞表面に反応するＣＡＰＲＩＮ－１に対するモノクローナル抗体＃１による、ＣＡＰＲＩＮ－１を発現する乳癌細胞株ＭＤＡ－ＭＢ－１５７に対する細胞障害性を示す図である。参照番号３；＃１のＣＡＰＲＩＮ－１に対するモノクローナル抗体を添加したときの活性、参照番号４；抗体の代わりにＰＢＳを添加したときの活性を示す。 癌細胞の細胞表面に反応するＣＡＰＲＩＮ－１に対するモノクローナル抗体＃１の、ＣＡＰＲＩＮ－１を発現するマウス乳癌細胞株４Ｔ１が移植されたＢａｌｂ／ｃマウスに対する抗腫瘍効果を示す図である。参照番号５；＃１のＣＡＰＲＩＮ－１に対するモノクローナル抗体を投与されたマウスの腫瘍の大きさを、参照番号６；抗体の代わりにＰＢＳを投与されたマウスの腫瘍の大きさを示す。
　本発明で用いられる配列番号２～３０のうち偶数の配列番号のポリペプチドに対する抗体の抗腫瘍活性は、後述するように、生体内で担癌動物に対する腫瘍増殖の抑制を調べることによって、あるいは、生体外で該ポリペプチドを発現する腫瘍細胞に対して、免疫細胞又は補体を介した細胞障害活性を示すか否かを調べることによって評価することができる。
　なお、配列番号２～３０のうち偶数の配列番号（すなわち、配列番号２，４，６・・２８，３０）のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドの塩基配列はそれぞれ、配列番号１～２９のうち奇数の配列番号（すなわち、配列番号１，３，５・・２７，２９）に示されている。
　本発明が開示する配列表の配列番号６、８、１０、１２及び１４で示されるアミノ酸配列は、イヌ精巣組織由来ｃＤＮＡライブラリーと乳癌患犬の血清を用いたＳＥＲＥＸ法により、担癌犬由来の血清中に特異的に存在する抗体と結合するポリペプチドとして、また配列番号２及び４で示されるアミノ酸配列は、そのヒト相同因子（ホモログ）として、配列番号１６で示されるアミノ酸配列は、そのウシ相同因子として、配列番号１８で示されるアミノ酸配列は、そのウマ相同因子として、配列番号２０～２８で示されるアミノ酸配列は、そのマウス相同因子として、配列番号３０で示されるアミノ酸配列は、そのニワトリ相同因子として単離された、ＣＡＰＲＩＮ－１のアミノ酸配列である（後述の実施例１参照）。ＣＡＰＲＩＮ－１は、休止期の正常細胞が活性化や細胞分裂を起こす際に発現することが知られている。
　ＣＡＰＲＩＮ－１は、細胞表面には発現しないことが知られていたが、本検討により、ＣＡＰＲＩＮ－１タンパク質の一部が各種癌細胞の細胞表面に発現することが明らかになった。そして、癌細胞の細胞表面に発現するＣＡＰＲＩＮ－１タンパク質の一部の領域と免疫学的反応性を有する、あるいは該領域を特異的に認識する（すなわち、該領域と特異的に結合する）、配列番号３９、４０及び４１を含む重鎖可変領域と配列番号４３、４４及び４５を含む軽鎖可変領域とを含む抗体が、抗腫瘍活性を示すことが明らかになった。
　本発明で用いられる上記ＣＡＰＲＩＮ－１に対する抗体は、モノクローナル抗体であり、抗腫瘍活性を発揮しうる限りいかなる種類の抗体であってもよく、例えば、組換え抗体、例えば合成抗体、多重特異性抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、単鎖抗体（ｓｃＦｖ）など、ヒト抗体、それらの抗体フラグメント、例えばＦａｂやＦ（ａｂ’）２、Ｆｖなどを含む。これらの抗体及びそのフラグメントは、また当業者に公知の方法により調製することが可能である。また、被験者がヒトである場合には、拒絶反応を回避もしくは抑制するためにヒト抗体又はヒト化抗体であることが望ましい。
　ここで、「ＣＡＰＲＩＮ－１タンパク質の一部の領域と特異的に結合する」とは、ＣＡＰＲＩＮ－１タンパク質の特定領域に特異的に結合し、それ以外のタンパク質部分と実質的に結合しないことを意味する。
　本発明で用いることができる抗体の抗腫瘍活性は、後述するように、生体内で担癌動物に対する腫瘍増殖の抑制を調べることによって、あるいは、生体外で該ポリペプチドを発現する腫瘍細胞に対して、免疫細胞又は補体を介した細胞障害活性を示すか否かを調べることによって評価することができる。
さらにまた、本発明における癌の治療及び／又は予防の対象である被験者は、ヒト、ペット動物、家畜類、競技用動物などの哺乳動物であり、好ましい被験者は、ヒトである。
　以下に、本発明に関する抗原の作製、抗体の作製、並びに医薬組成物について説明する。
　＜抗体作製用抗原の作製＞
本発明で用いられるＣＡＰＲＩＮ－１に対する抗体を取得するための感作抗原として使用されるタンパク質又はその断片は、ヒト、イヌ、ウシ、ウマ、マウス、ラット、ニワトリなど、その由来となる動物種に制限されない。しかし細胞融合に使用する親細胞との適合性を考慮して選択することが好ましく、一般的には、哺乳動物由来のタンパク質が好ましく、特にヒト由来のタンパク質が好ましい。例えば、ＣＡＰＲＩＮ－１がヒトＣＡＰＲＩＮ－１の場合、ヒトＣＡＰＲＩＮ－１タンパク質やその部分ペプチド、ヒトＣＡＰＲＩＮ－１を発現する細胞などを用いることができる。
　ヒトＣＡＰＲＩＮ－１及びそのホモログの塩基配列及びアミノ酸配列は、例えばＧｅｎＢａｎｋ（米国ＮＣＢＩ）にアクセスし、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡなどのアルゴリズム（Ｋａｒｌｉｎ　ａｎｄ　Ａｌｔｓｃｈｕｌ，　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ，　９０：５８７３－５８７７，１９９３；　Ａｌｔｓｃｈｕｌ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．　２５：３３８９－３４０２，　１９９７）を利用することによって入手することができる。
　本発明では、ヒトＣＡＰＲＩＮ－１の塩基配列（配列番号１もしくは３）又はアミノ酸配列（配列番号２もしくは４）を基準とした場合、これらのＯＲＦ又は成熟部分の塩基配列又はアミノ酸配列と７０％～１００％、好ましくは８０％～１００％、より好ましくは９０％～１００％、さらに好ましくは９５％～１００％、例えば９７％～１００％、９８％～１００％、９９％～１００％又は９９．５％～１００％の配列同一性を有する配列からなる核酸又はタンパク質がターゲットになる。ここで、「％配列同一性」は、２つの配列を、ギャップを導入してか又はギャップを導入しないで、最大の類似度となるようにアラインメント（整列）したとき、アミノ酸（又は塩基）の総数に対する同一アミノ酸（又は塩基）のパーセンテージ（％）を意味する。
　ＣＡＰＲＩＮ－１タンパク質の断片は、抗体が認識する最小単位であるエピトープ（抗原決定基）のアミノ酸長から、該タンパク質の全長未満の長さを有する。エピトープは、哺乳動物、好ましくはヒトにおいて、抗原性又は免疫原性を有するポリペプチド断片を指し、その最小単位は、約７～１２アミノ酸、例えば８～１１アミノ酸、からなる。
　上記した、ヒトＣＡＰＲＩＮ－１タンパク質やその部分ペプチドを含むポリペプチドは、例えば、Ｆｍｏｃ法（フルオレニルメチルオキシカルボニル法）、ｔＢｏｃ法（ｔ―ブチルオキシカルボニル法）等の化学合成法に従って合成することができる（日本生化学会編、生化学実験講座１、タンパク質の化学ＩＶ、化学修飾とペプチド合成、東京化学同人（日本）、１９８１年）。また、各種の市販のペプチド合成機を利用して常法により合成することもできる。また、公知の遺伝子工学的手法（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ，　第２版，　Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　（１９８９），　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ、Ａｕｓｕｂｅｌら，　Ｓｈｏｒｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，　第３版，　Ａ　ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ　ｏｆ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｆｒｏｍ　Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　（１９９５），　Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　Ｓｏｎｓなど）を用いて、上記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを調製し、該ポリヌクレオチドを発現ベクターに組み込んで宿主細胞に導入し、該宿主細胞中でポリペプチドを生産させることにより、目的とするポリペプチドを得ることができる。
　上記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、公知の遺伝子工学的手法や市販の核酸合成機を用いた常法により、容易に調製することができる。例えば、配列番号１の塩基配列を含むＤＮＡは、ヒト染色体ＤＮＡ又はｃＤＮＡライブラリーを鋳型として使用し、配列番号１に記載した塩基配列を増幅できるように設計した一対のプライマーを用いてＰＣＲを行うことにより調製することができる。ＰＣＲの反応条件は適宜設定することができ、例えば、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ（例えばＴａｑポリメラーゼ、Ｐｆｕポリメラーゼなど）及びＭｇ２＋含有ＰＣＲバッファーを用いて、９４℃で３０秒間（変性）、５５℃で３０秒～１分間（アニーリング）、７２℃で２分間（伸長）からなる反応行程を１サイクルとして、例えば３０サイクル行った後、７２℃で７分間反応させる条件などを挙げることができるが、これに限定されない。ＰＣＲの手法、条件等については、例えばＡｕｓｕｂｅｌら，　Ｓｈｏｒｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，　第３版，　Ａ　ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ　ｏｆ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｆｒｏｍ　Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　（１９９５），　Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　Ｓｏｎｓ（特に第１５章）に記載されている。
　また、本明細書中の配列表の配列番号１～３０に示される塩基配列及びアミノ酸配列の情報に基づいて、適当なプローブやプライマーを調製し、それを用いてヒトなどのｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより、所望のＤＮＡを単離することができる。ｃＤＮＡライブラリーは、配列番号２～３０のうち偶数の配列番号のタンパク質を発現している細胞、器官又は組織から作製することが好ましい。そのような細胞や組織の例は、精巣、白血病、乳癌、リンパ腫、脳腫瘍、肺癌、大腸癌などの癌又は腫瘍に由来する細胞又は組織である。上記したプローブ又はプライマーの調製、ｃＤＮＡライブラリーの構築、ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニング、並びに目的遺伝子のクローニングなどの操作は当業者に既知であり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ，　第２版，　Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　（１９８９）、Ａｕｓｂｅｌら（上記）等に記載された方法に準じて行うことができる。このようにして得られたＤＮＡから、ヒトＣＡＰＲＩＮ－１タンパク質やその部分ペプチドをコードするＤＮＡを得ることができる。
　上記宿主細胞としては、上記ポリペプチドを発現可能な細胞であればいかなるものであってもよく、原核細胞の例としては大腸菌など、真核細胞の例としてはサル腎臓細胞ＣＯＳ１、チャイニーズハムスター卵巣細胞ＣＨＯ等の哺乳動物細胞、ヒト胎児腎臓細胞株ＨＥＫ２９３、マウス胎仔皮膚細胞株ＮＩＨ３Ｔ３、出芽酵母、分裂酵母等の酵母細胞、カイコ細胞、アフリカツメガエル卵細胞などが挙げられるが、これらに限定されない。
　宿主細胞として原核細胞を用いる場合、発現ベクターとしては、原核細胞中で複製可能なオリジン、プロモーター、リボソーム結合部位、マルチクローニングサイト、ターミネーター、薬剤耐性遺伝子、栄養要求性相補遺伝子、等を有する発現ベクターを用いる。大腸菌用発現ベクターとしては、ｐＵＣ系、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ、ｐＥＴ発現システム、ｐＧＥＸ発現システムなどが例示できる。上記ポリペプチドをコードするＤＮＡをこのような発現ベクターに組み込み、該ベクターで原核宿主細胞を形質転換したのち、得られた形質転換体を培養すれば、前記ＤＮＡがコードしているポリペプチドを原核宿主細胞中で発現させることができる。この際、該ポリペプチドを、他のタンパク質との融合タンパク質として発現させることもできる。
　宿主細胞として真核細胞を用いる場合、発現ベクターとしては、プロモーター、スプライシング領域、ポリ（Ａ）付加部位等を有する真核細胞用発現ベクターを用いる。そのような発現ベクターとしては、ｐＫＡ１、ｐＣＤＭ８、ｐＳＶＫ３、ｐＭＳＧ、ｐＳＶＬ、ｐＢＫ－ＣＭＶ、ｐＢＫ－ＲＳＶ、ＥＢＶベクター、ｐＲＳ、ｐｃＤＮＡ３、ｐＹＥＳ２等が例示できる。上記と同様に、上記ポリペプチドをコードするＤＮＡをこのような発現ベクターに組み込み、該ベクターで真核宿主細胞を形質転換したのち、得られた形質転換体を培養すれば、前記ＤＮＡがコードしているポリペプチドを真核宿主細胞中で発現させることができる。発現ベクターとしてｐＩＮＤ／Ｖ５－Ｈｉｓ、ｐＦＬＡＧ－ＣＭＶ－２、ｐＥＧＦＰ－Ｎ１、ｐＥＧＦＰ－Ｃ１等を用いた場合には、Ｈｉｓタグ（例えば（Ｈｉｓ）６～（Ｈｉｓ）１０）、ＦＬＡＧタグ、ｍｙｃタグ、ＨＡタグ、ＧＦＰなど各種タグを付加した融合タンパク質として、上記ポリペプチドを発現させることができる。
　発現ベクターの宿主細胞への導入は、電気穿孔法、リン酸カルシウム法、リポソーム法、ＤＥＡＥデキストラン法、マイクロインジェクション、ウイルス感染、リポフェクション、細胞膜透過性ペプチドとの結合、等の周知の方法を用いることができる。
　宿主細胞から目的のポリペプチドを単離精製するためには、公知の分離操作を組み合わせて行うことができる。例えば尿素などの変性剤や界面活性剤による処理、超音波処理、酵素消化、塩析や溶媒分別沈殿法、透析、遠心分離、限外ろ過、ゲルろ過、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、等電点電気泳動、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、アフニティークロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー等が挙げられるが、これらに限定されない。
　＜抗体の構造＞
　抗体は通常少なくとも２本の重鎖及び２本の軽鎖を含むヘテロ多量体糖タンパク質である。ＩｇＭは別として、２本の同一の軽（Ｌ）鎖及び２本の同一の重（Ｈ）鎖で構成される約１５０ｋＤａのヘテロ四量体糖タンパク質である。典型的には、それぞれの軽鎖は１つのジスルフィド共有結合により重鎖に連結されているが、種々の免疫グロブリンアイソタイプの重鎖間のジスルフィド結合の数は変動する。それぞれの重鎖及び軽鎖は、また鎖内ジスルフィド結合も有する。それぞれの重鎖は一方の端に可変ドメイン（ＶＨ領域）を有し、それにいくつかの定常領域が続く。それぞれ軽鎖は可変ドメイン（ＶＬ領域）を有し、その反対の端に１つの定常領域を有する。軽鎖の定常領域は重鎖の最初の定常領域と整列しており、かつ軽鎖可変ドメインは重鎖の可変ドメインと整列している。抗体の可変ドメインは特定の領域が相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる特定の可変性を示して抗体に結合特異性を付与する。可変領域の相対的に保存されている部分はフレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれている。完全な重鎖及び軽鎖の可変ドメインはそれぞれ３つのＣＤＲにより連結された４つのＦＲを含む。３つのＣＤＲは重鎖ではそのＮ末から順にＣＤＲＨ１，ＣＤＲＨ２，ＣＤＲＨ３、同様に軽鎖ではＣＤＲＬ１，ＣＤＲＬ２，ＣＤＲＬ３と呼ばれている。抗体の抗原への結合特異性には、ＣＤＲＨ３が最も重要である。また、各鎖のＣＤＲはＦＲ領域によって近接した状態で一緒に保持され、他方の鎖からのＣＤＲと共に抗体の抗原結合部位の形成に寄与する。定常領域は抗体が抗原に結合することに直接寄与しないが、種々のエフェクター機能、例えば、抗体依存性細胞性細胞障害活性（ＡＤＣＣ）への関与、Ｆｃγ受容体への結合を介した食作用、新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）を介した半減期／クリアランス速度、補体カスケードのＣ１ｑ構成要素を介した補体依存性細胞障害（ＣＤＣ）を示す。
　＜抗体の作製＞
　本発明における抗ＣＡＰＲＩＮ－１抗体とは、ＣＡＰＲＩＮ－１タンパク質の全長又はその断片と免疫学的反応性を有する抗体を意味する。
　ここで、「免疫学的反応性」とは、生体内で抗体とＣＡＰＲＩＮ－１抗原とが結合する特性を意味し、このような結合を介して腫瘍を障害（例えば、死滅、抑制又は退縮）する機能、が発揮される。すなわち、本発明で使用される抗体は、ＣＡＰＲＩＮ－１タンパク質と結合して腫瘍、例えば白血病、リンパ腫、乳癌、脳腫瘍、肺癌、膀胱癌、子宮頸癌、食道癌、胃癌、腎臓癌、大腸癌などを障害することができるならば、その種類を問わない。
　本発明では、抗体は、モノクローナル抗体であれば特に限定されず、合成抗体、多重特異性抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、単鎖抗体、抗体フラグメント（例えばＦａｂやＦ（ａｂ’）２）であってもよい。また、抗体は、免疫グロブリン分子の任意のクラス、例えばＩｇＧ，ＩｇＥ，ＩｇＭ，ＩｇＡ，ＩｇＤ及びＩｇＹ、又は任意のサブクラス、例えばＩｇＧ１，ＩｇＧ２，ＩｇＧ３，ＩｇＧ４，ＩｇＡ１，ＩｇＡ２などである。
　抗体はさらに、グリコシル化の他に、アセチル化、ホルミル化、アミド化、リン酸化、又はペグ（ＰＥＧ）化などによって修飾されていてもよい。
　以下に、種々のモノクローナル抗体の作製例を示す。
　例えば、ＣＡＰＲＩＮ－１を発現する乳癌細胞株ＳＫ－ＢＲ－３などをマウスに投与して免疫し、同マウスより脾臓を抽出し、細胞を分離の上、該細胞とマウスミエローマ細胞とを融合させ、得られた融合細胞（ハイブリドーマ）の中から、癌細胞増殖抑制作用を持つ抗体を産生するクローンを選択する。癌細胞増殖抑制作用を持つモノクローナル抗体産生ハイブリドーマを単離し、当該ハイブリドーマを培養し、培養上清から一般的なアフィニティ精製法により抗体を精製することで、調製することが可能である。
　モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、例えば以下のようにしても作製することができる。まず、公知の方法にしたがって、感作抗原を動物に免疫する。一般的方法として、感作抗原を哺乳動物の腹腔内又は皮下に注射することにより行われる。具体的には、感作抗原をＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ－Ｂｕｆｆｅｒｅｄ　Ｓａｌｉｎｅ）や生理食塩水等で適当量に希釈、懸濁したものに所望により通常のアジュバント、例えばフロイント完全アジュバントを適量混合し、乳化後、哺乳動物に４～２１日毎に数回投与する。また、感作抗原免疫時に適当な担体を使用することもできる。
　このように哺乳動物を免疫し、血清中に所望の抗体レベルが上昇するのを確認した後に、哺乳動物から免疫細胞を採取し、細胞融合に付すが、好ましい免疫細胞としては、特に脾細胞が挙げられる。
　前記免疫細胞と融合される他方の親細胞として、哺乳動物のミエローマ細胞を用いる。このミエローマ細胞は、公知の種々の細胞株、例えば、Ｐ３Ｕ１（Ｐ３－Ｘ６３Ａｇ８Ｕ１）、Ｐ３（Ｐ３ｘ６３Ａｇ８．６５３）（Ｊ．　Ｉｍｍｕｎｏｌ．　（１９７９）１２３，　１５４８－１５５０）、Ｐ３ｘ６３Ａｇ８Ｕ．１（Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｔｏｐｉｃｓ　ｉｎ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　（１９７８）８１，　１－７）、ＮＳ－１（Ｋｏｈｌｅｒ．　Ｇ．　ａｎｄ　Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，　Ｃ．　Ｅｕｒ．　Ｊ．　Ｉｍｍｕｎｏｌ．　（１９７６）６，　５１１－５１９）、ＭＰＣ－１１（Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ．　Ｄ．Ｈ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｃｅｌｌ　（１９７６）８，　４０５－４１５）、ＳＰ２／０（Ｓｈｕｌｍａｎ，　Ｍ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｎａｔｕｒｅ　（１９７８）２７６，　２６９－２７０）、ＦＯ（ｄｅＳｔ．　Ｇｒｏｔｈ，　Ｓ．Ｆ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｊ．　Ｉｍｍｕｎｏｌ．　Ｍｅｔｈｏｄｓ　（１９８０）３５，　１－２１）、Ｓ１９４（Ｔｒｏｗｂｒｉｄｇｅ，　Ｉ．Ｓ．　Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．　（１９７８）１４８，　３１３－３２３）、Ｒ２１０（Ｇａｌｆｒｅ，　Ｇ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｎａｔｕｒｅ　（１９７９）２７７，　１３１－１３３）等が好適に使用される。
　前記免疫細胞とミエローマ細胞との細胞融合は、基本的には公知の方法、たとえば、ケーラーとミルステインらの方法（Ｋｏｈｌｅｒ，　Ｇ．　ａｎｄ　Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，　Ｃ．　Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ．　（１９８１）７３，　３－４６）等に準じて行うことができる。
　より具体的には、前記細胞融合は、例えば細胞融合促進剤の存在下に通常の栄養培養液中で実施される。融合促進剤としては、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、センダイウイルス（ＨＶＪ）等が使用され、更に所望により融合効率を高めるためにジメチルスルホキシド等の補助剤を添加使用することもできる。
　免疫細胞とミエローマ細胞との使用割合は任意に設定することができる。例えば、ミエローマ細胞に対して免疫細胞を１～１０倍とするのが好ましい。前記細胞融合に用いる培養液としては、例えば、前記ミエローマ細胞株の増殖に好適なＲＰＭＩ１６４０培養液、ＭＥＭ培養液、その他、この種の細胞培養に用いられる通常の培養液が使用可能であり、さらに、牛胎児血清（ＦＣＳ）等の血清補液を併用することもできる。
　細胞融合は、前記免疫細胞とミエローマ細胞との所定量を前記培養液中でよく混合し、予め３７℃程度に加温したＰＥＧ溶液（例えば平均分子量１０００～６０００程度）を通常３０～６０％（ｗ／ｖ）の濃度で添加し、混合することによって目的とするハイブリドーマを形成する。続いて、適当な培養液を逐次添加し、遠心して上清を除去する操作を繰り返すことによりハイブリドーマの生育に好ましくない細胞融合剤等を除去する。
　このようにして得られたハイブリドーマは、通常の選択培養液、例えばＨＡＴ培養液（ヒポキサンチン、アミノプテリン及びチミジンを含む培養液）で培養することにより選択される。上記ＨＡＴ培養液での培養は、目的とするハイブリドーマ以外の細胞（非融合細胞）が死滅するのに十分な時間（通常、数日～数週間）継続する。ついで、通常の限界希釈法を実施し、目的とする抗体を産生するハイブリドーマのスクリーニング及び単一クローニングを行う。
　また、ヒト以外の動物に抗原を免疫して上記ハイブリドーマを得る他に、ヒトリンパ球、例えばＥＢウイルスに感染したヒトリンパ球をｉｎ　ｖｉｔｒｏでタンパク質、タンパク質発現細胞又はその溶解物で感作し、感作リンパ球をヒト由来の永久分裂能を有するミエローマ細胞、例えばＵ２６６（登録番号ＴＩＢ１９６）と融合させ、所望の活性（例えば、細胞増殖抑制活性）を有するヒト抗体を産生するハイブリドーマを得ることもできる。
　このようにして作製されるモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、通常の培養液中で継代培養することが可能であり、また、液体窒素中で長期保存することが可能である。
　すなわち、所望の抗原や所望の抗原を発現する細胞を感作抗原として使用して、これを通常の免疫方法にしたがって免疫し、得られる免疫細胞を通常の細胞融合法によって公知の親細胞と融合させ、通常のスクリーニング法により、モノクローナルな抗体産生細胞（ハイブリドーマ）をスクリーニングすることによって作製できる。
　ここで、ヒト抗体産生マウスとしては、例えばＫＭマウス（キリンファーマ／Ｍｅｄａｒｅｘ）及びＸｅｎｏマウス（Ａｍｇｅｎ）が知られている（例えば、国際公開第ＷＯ０２／４３４７８号、同第ＷＯ０２／０９２８１２号など）。このようなマウスをＣＡＰＲＩＮ－１タンパク質又はその断片で免疫するときには、完全ヒトポリクローナル抗体を血液から得ることができる。また、免疫後のマウスから脾臓細胞を取出し、ミエローマ細胞との融合法によりヒト型モノクローナル抗体を作製することができる。
　抗原の調製は、例えば、動物細胞を用いた方法（特表２００７－５３００６８）やバキュロウイルスを用いた方法（例えば、国際公開第ＷＯ９８／４６７７７号など）などに準じて行うことができる。抗原の免疫原性が低い場合には、アルブミン等の免疫原性を有する巨大分子と結合させ、免疫を行えばよい。
　さらにまた、抗体遺伝子をハイブリドーマからクローニングし、適当なベクターに組み込んで、これを宿主に導入し、遺伝子組換え技術を用いて産生させた遺伝子組換え型抗体を用いることができる（例えば、Ｃａｒｌ，　Ａ．Ｋ．　Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ，　Ｊａｍｅｓ，　Ｗ．　Ｌａｒｒｉｃｋ，　ＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣ　ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ　ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ，　Ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ　ｉｎ　ｔｈｅ　Ｕｎｉｔｅｄ　Ｋｉｎｇｄｏｍ　ｂｙ　ＭＡＣＭＩＬＬＡＮ　ＰＵＢＬＩＳＨＥＲＳ　ＬＴＤ，　１９９０参照）。具体的には、ハイブリドーマのｍＲＮＡから逆転写酵素を用いて抗体の可変領域（Ｖ領域）のｃＤＮＡを合成する。目的とする抗体のＶ領域をコードするＤＮＡが得られれば、これを所望の抗体定常領域（Ｃ領域）をコードするＤＮＡと連結し、これを発現ベクターへ組み込む。又は、抗体のＶ領域をコードするＤＮＡを、抗体Ｃ領域のＤＮＡを含む発現ベクターへ組み込んでもよい。発現制御領域、例えば、エンハンサー、プロモーターの制御のもとで発現するよう発現ベクターに組み込む。次に、この発現ベクターにより宿主細胞を形質転換し、抗体を発現させることができる。
　本発明の抗ＣＡＰＲＩＮ－１抗体は、モノクローナル抗体であることを特徴とするが、モノクローナル抗体には、ヒトモノクローナル抗体、非ヒト動物モノクローナル抗体（例えばマウスモノクローナル抗体、ラットモノクローナル抗体、ウサギモノクローナル抗体、ニワトリモノクローナル抗体など）、キメラ型モノクローナル抗体などが含まれる。モノクローナル抗体は、ＣＡＰＲＩＮ－１タンパク質を免疫した非ヒト哺乳動物（例えば、マウス、ヒト抗体産生マウス、ニワトリ、ウサギなど）からの脾細胞とミエローマ細胞との融合によって得られたハイブリドーマを培養することによって作製されうる。キメラ型抗体は、異なる動物由来の配列を組み合わせて作製される抗体であり、例えば、マウス抗体の重鎖、軽鎖の可変領域とヒト抗体の重鎖、軽鎖の定常領域からなる抗体などである。キメラ抗体の作製は公知の方法を用いて行うことができ、例えば、抗体Ｖ領域をコードするＤＮＡとヒト抗体Ｃ領域をコードするＤＮＡとを連結し、これを発現ベクターに組み込んで宿主に導入し産生させることにより得られる。後述の実施例では、ヒト－ニワトリキメラ型モノクローナル抗体が作製され、抗腫瘍効果が確認された。これらのモノクローナル抗体は、配列番号４２のアミノ酸配列を有する重鎖可変（ＶＨ）領域と、配列番号４６のアミノ酸配列を有する軽鎖可変（ＶＬ）領域とを含み、ここで、該ＶＨ領域に配列番号３９のアミノ酸配列で表されるＣＤＲ１、配列番号４０のアミノ酸配列で表されるＣＤＲ２及び配列番号４１のアミノ酸配列で表されるＣＤＲ３が含まれ、該ＶＬ領域に配列番号４３のアミノ酸配列で表されるＣＤＲ１、配列番号４４のアミノ酸配列で表されるＣＤＲ２及び配列番号４５のアミノ酸配列で表されるＣＤＲ３が含まれる。
　ヒト化抗体は、再構成（ｒｅｓｈａｐｅｄ）ヒト抗体とも称される改変抗体である。ヒト化抗体は、免疫動物由来の抗体のＣＤＲを、ヒト抗体の相補性決定領域へ移植することによって構築される。その一般的な遺伝子組換え手法も知られている。
　具体的には、例えばマウス抗体やニワトリ抗体のＣＤＲとヒト抗体のフレームワーク領域（ｆｒａｍｅｗｏｒｋ　ｒｅｇｉｏｎ；　ＦＲ）を連結するように設計したＤＮＡ配列を、末端部にオーバーラップする部分を有するように作製した数個のオリゴヌクレオチドからＰＣＲ法により合成する。得られたＤＮＡを、ヒト抗体定常領域をコードするＤＮＡと連結し、次いで発現ベクターに組み込んで、これを宿主に導入し産生させることにより得られる（欧州特許出願公開第ＥＰ２３９４００号、国際公開第ＷＯ９６／０２５７６号参照）。ＣＤＲを介して連結されるヒト抗体のＦＲは、相補性決定領域が良好な抗原結合部位を形成するものが選択される。必要に応じ、再構成ヒト抗体の相補性決定領域が適切な抗原結合部位を形成するように抗体の可変領域におけるフレームワーク領域のアミノ酸を置換してもよい（Ｓａｔｏ　Ｋ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　１９９３，　５３：　８５１－８５６）。また、様々なヒト抗体由来のフレームワーク領域に置換してもよい（国際公開第ＷＯ９９／５１７４３号参照）。
　ＣＤＲを介して連結されるヒト抗体のフレームワーク領域は、相補性決定領域が良好な抗原結合部位を形成するものが選択される。必要に応じ、再構成ヒト抗体の相補性決定領域が適切な抗原結合部位を形成するように、抗体の可変領域におけるフレームワーク領域のアミノ酸を置換してもよい（Ｓａｔｏ　Ｋ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　１９９３，　５３：　８５１－８５６）。
　キメラ抗体やヒト化抗体を作製した後に、可変領域（例えば、ＦＲ）や定常領域中のアミノ酸を他のアミノ酸で置換等してもよい。
　アミノ酸の置換は、例えば１５未満、１０未満、８以下、７以下、６以下、５以下、４以下、３以下、又は２以下のアミノ酸、好ましくは１～５アミノ酸、より好ましくは１又は２アミノ酸、の置換であり、置換抗体は、未置換抗体と機能的に同等であるべきである。置換は、保存的アミノ酸置換が望ましく、これは、電荷、側鎖、極性、芳香族性などの性質の類似するアミノ酸間の置換である。性質の類似したアミノ酸は、例えば、塩基性アミノ酸（アルギニン、リジン、ヒスチジン）、酸性アミノ酸（アスパラギン酸、グルタミン酸）、無電荷極性アミノ酸（グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、システイン、チロシン）、無極性アミノ酸（ロイシン、イソロイシン、アラニン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、メチオニン）、分枝鎖アミノ酸（トレオニン、バリン、イソロイシン）、芳香族アミノ酸（フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、ヒスチジン）などに分類しうる。
　抗体修飾物としては、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の各種分子と結合した抗体を挙げることができる。本発明の抗体修飾物においては、結合される物質は限定されない。このような抗体修飾物を得るには、得られた抗体に化学的な修飾を施すことによって得ることができる。これらの方法はこの分野において既に確立されている。
　ここで「機能的に同等」とは、対象となる抗体が本発明の抗体と同様の生物学的あるいは生化学的活性、具体的には腫瘍を障害する機能、を有すること、ヒトへの適用時に拒絶反応を本質的に起こさないことなどを指す。このような活性としては、例えば、細胞増殖抑制活性、あるいは結合活性を例示することができる。
　あるポリペプチドと機能的に同等なポリペプチドを調製するための、当業者によく知られた方法としては、ポリペプチドに変異を導入する方法が知られている。例えば、当業者であれば、部位特異的変異誘発法（Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ－Ｇｏｔｏｈ，　Ｔ．　ｅｔ　ａｌ．，　（１９９５）　Ｇｅｎｅ　１５２，　２７１－２７５、Ｚｏｌｌｅｒ，　ＭＪ．，　ａｎｄ　Ｓｍｉｔｈ，　Ｍ．　（１９８３）　Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ．　１００，　４６８－５００、Ｋｒａｍｅｒ，　Ｗ．　ｅｔ　ａｌ．，　（１９８４）　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．　１２，　９４４１－９４５６、Ｋｒａｍｅｒ，　Ｗ．　ａｎｄ　Ｆｒｉｔｚ，　ＨＪ．，　（１９８７）　Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ．　１５４，　３５０－３６７、Ｋｕｎｋｅｌ，　ＴＡ．，　（１９８５）　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ．　８２，　４８８－４９２、Ｋｕｎｋｅｌ　（１９８８）　Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ．　８５，　２７６３－２７６６）などを用いて、本発明の抗体に適宜変異を導入することにより、該抗体と機能的に同等な抗体を調製することができる。
　上記抗ＣＡＰＲＩＮ－１抗体が認識するＣＡＰＲＩＮ－１タンパク質のエピトープを認識する抗体は、当業者に公知の方法により得ることが可能である。例えば、抗ＣＡＰＲＩＮ－１抗体が認識するＣＡＰＲＩＮ－１タンパク質のエピトープを通常の方法（例えば、エピトープマッピングなど）により決定し、該エピトープに含まれるアミノ酸配列を有するポリペプチドを免疫原として抗体を作製する方法や、通常の方法で作製された抗体のエピトープを決定し、抗ＣＡＰＲＩＮ－１抗体とエピトープが同じ抗体を選択する方法などにより得ることができる。ここで、「エピトープ」は、哺乳動物、好ましくはヒトにおいて、抗原性又は免疫原性を有するポリペプチド断片を指し、その最小単位は、約７～１２アミノ酸、好ましくは８～１１アミノ酸からなる。
　本発明の抗体の親和定数Ｋａ（ｋｏｎ／ｋｏｆｆ）は、好ましくは、少なくとも１０７Ｍ－１、少なくとも１０８Ｍ－１、少なくとも５×１０８Ｍ－１、少なくとも１０９Ｍ－１、少なくとも５×１０９Ｍ－１、少なくとも１０１０Ｍ－１、少なくとも５×１０１０Ｍ－１、少なくとも１０１１Ｍ－１、少なくとも５×１０１１Ｍ－１、少なくとも１０１２Ｍ－１、あるいは、少なくとも１０１３Ｍ－１である。
　本発明の抗体は、抗腫瘍剤とコンジュゲートすることができる。抗体と抗腫瘍剤との結合は、アミノ基、カルボキシル基、ヒドロキシ基、チオール基などと反応性の基（例えば、コハク酸イミジル基、ホルミル基、２－ピリジルジチオ基、マレイイミジル基、アルコキシカルボニル基、ヒドロキシ基など）をもつスペーサーを介して行うことができる。
　抗腫瘍剤の例は、文献等で公知の下記の抗腫瘍剤、すなわち、パクリタキセル、ドキソルビシン、ダウノルビシン、シクロホスファミド、メトトレキサート、５－フルオロウラシル、チオテパ、ブスルファン、インプロスルファン、ピポスルファン、ベンゾドーパ（ｂｅｎｚｏｄｏｐａ）、カルボコン、メツレドーパ（ｍｅｔｕｒｅｄｏｐａ）、ウレドーパ（ｕｒｅｄｏｐａ）、アルトレートアミン（ａｌｔｒｅｔａｍｉｎｅ）、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホラミド、トリエチレンチオホスホラミド（ｔｒｉｅｔｈｉｌｅｎｅｔｈｉｏｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｅ）、トリメチローロメラミン（ｔｒｉｍｅｔｈｙｌｏｌｏｍｅｌａｍｉｎｅ）、ブラタシン、ブラタシノン、カンプトセシン、ブリオスタチン、カリスタチン（ｃａｌｌｙｓｔａｔｉｎ）、クリプトフィシン１、クリプトフィシン８、ドラスタチン、ズオカルマイシン、エレウテロビン、パンクラチスタチン、サルコジクチン（ｓａｒｃｏｄｉｃｔｙｉｎ）、スポンジスタチン、クロランブシル、クロロナファジン（ｃｈｌｏＲＮＡｐｈａｚｉｎｅ）、コロホスファミド（ｃｈｏｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシドヒドロクロリド、メルファラン、ノベンビチン（ｎｏｖｅｍｂｉｃｈｉｎ）、フェネステリン（ｐｈｅｎｅｓｔｅｒｉｎｅ）、プレドニムスチン（ｐｒｅｄｎｉｍｕｓｔｉｎｅ）、トロフォスファミド（ｔｒｏｆｏｓｆａｍｉｄｅ）、ウラシルマスタード、カルムスチン、クロロゾトシン（ｃｈｌｏｒｏｚｏｔｏｃｉｎ）、フォテムスチン（ｆｏｔｅｍｕｓｔｉｎｅ）、ロムスチン、ニムスチン、ラニムスチン、カリケアマイシン（ｃａｌｉｃｈｅａｍｉｃｉｎ）、ダイネマイシン、クロドロネート、エスペラマイシン、アクラシノマイシン、アクチノマイシン、オースラマイシン（ａｕｔｈｒａｍｙｃｉｎ）、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン（ｃａｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎ）、カラビシン（ｃａｒａｂｉｃｉｎ）、カルミノマイシン、カルジノフィリン（ｃａｒｚｉｎｏｐｈｉｌｉｎ）、クロモマイシン、ダクチノマイシン、デトルビシン（ｄｅｔｏｒｂｉｃｉｎ）、６－ジアゾ－５－オキソ－Ｌ－ノルロイシン、アドリアマイシン（ＡＤＲＩＡＭＹＣＩＮ）、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マーセロマイシン（ｍａｒｃｅｌｌｏｍｙｃｉｎ）、マイトマイシンＣ、マイコフェノール酸（ｍｙｃｏｐｈｅｎｏｌｉｃ　ａｃｉｄ）、ノガラマイシン（ｎｏｇａｌａｍｙｃｉｎ）、オリボマイシン（ｏｌｉｖｏｍｙｃｉｎｓ）、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン（ｐｏｔｆｉｒｏｍｙｃｉｎ）、ピューロマイシン、ケラマイシン（ｑｕｅｌａｍｙｃｉｎ）、ロドルビシン（ｒｏｄｏｒｕｂｉｃｉｎ）、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン（ｔｕｂｅｒｃｉｄｉｎ）、ウベニメクス、ジノスタチン（ｚｉｎｏｓｔａｔｉｎ）、ゾルビシン（ｚｏｒｕｂｉｃｉｎ）、デノプテリン（ｄｅｎｏｐｔｅｒｉｎ）、プテロプテリン（ｐｔｅｒｏｐｔｅｒｉｎ）、トリメトレキセート（ｔｒｉｍｅｔｒｅｘａｔｅ）、フルダラビン（ｆｌｕｄａｒａｂｉｎｅ）、６－メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニン、アンシタビン、アザシチジン（ａｚａｃｉｔｉｄｉｎｅ）、６－アザウリジン（ａｚａｕｒｉｄｉｎｅ）、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン（ｅｎｏｃｉｔａｂｉｎｅ）、フロキシウリジン（ｆｌｏｘｕｒｉｄｉｎｅ）；アンドロゲン類、例えばカルステロン（ｃａｌｕｓｔｅｒｏｎｅ）、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトン（ｔｅｓｔｏｌａｃｔｏｎｅ）、アミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタン、フロリン酸（ｆｒｏｌｉｎｉｃ　ａｃｉｄ）、アセグラトン、アルドホスファミドグリコシド、アミノレブリン酸、エニルウラシル、アムサクリン（ａｍｓａｃｒｉｎｅ）、ベストラブシル（ｂｅｓｔｒａｂｕｃｉｌ）、ビサントレン（ｂｉｓａｎｔｒｅｎｅ）、エダトラキセート（ｅｄａｔｒａｘａｔｅ）、デフォファミン（ｄｅｆｏｆａｍｉｎｅ）、デメコルシン（ｄｅｍｅｃｏｌｃｉｎｅ）、ジアジコン（ｄｉａｚｉｑｕｏｎｅ）、エルフォルニチン　（ｅｌｆｏｒｎｉｔｈｉｎｅ）、酢酸エリプチニウム（ｅｌｌｉｐｔｉｎｉｕｍ）、エポチロン（ｅｐｏｔｈｉｌｏｎｅ）、エトグルシド（ｅｔｏｇｌｕｃｉｄ）、レンチナン、ロニダミン（ｌｏｎｉｄａｍｉｎｅ）、メイタンシン（ｍａｙｔａｎｓｉｎｅ）、アンサミトシン（ａｎｓａｍｉｔｏｃｉｎｅ）、ミトグアゾン（ｍｉｔｏｇｕａｚｏｎｅ）、ミトキサントロン、モピダンモール（ｍｏｐｉｄａｎｍｏｌ）、ニトラエリン（ｎｉｔｒａｅｒｉｎｅ）、ペントスタチン、フェナメット（ｐｈｅｎａｍｅｔ）、ピラルビシン、ロソキサントロン（ｌｏｓｏｘａｎｔｒｏｎｅ）、ポドフィリン酸（ｐｏｄｏｐｈｙｌｌｉｎｉｃ　ａｃｉｄ）、２－エチルヒドラジド、プロカルバジン、ラゾキサン（ｒａｚｏｘａｎｅ）、リゾキシン、シゾフィラン、スピロゲルマニウム（ｓｐｉｒｏｇｅｒｍａｎｉｕｍ）、テニュアゾン酸（ｔｅｎｕａｚｏｎｉｃ　ａｃｉｄ）、トリアジコン（ｔｒｉａｚｉｑｕｏｎｅ）、ロリジン（ｒｏｒｉｄｉｎｅ）Ａ、アングイジン（ａｎｇｕｉｄｉｎｅ）、ウレタン、ビンデシン、ダカーバジン、マンノムスチン（ｍａｎｎｏｍｕｓｔｉｎｅ）、ミトブロニトール、ミトラクトール（ｍｉｔｏｌａｃｔｏｌ）、ピポブロマン（ｐｉｐｏｂｒｏｍａｎ）、ガシトシン（ｇａｃｙｔｏｓｉｎｅ）、ドキセタキセル、クロランブシル、ゲムシタビン（ｇｅｍｃｉｔａｂｉｎｅ）、６－チオグアニン、メルカプトプリン、シスプラチン、オキサリプラチン、カルボプラチン、ビンブラスチン、エトポシド、イホスファミド、マイトキサントロン、ビンクリスチン、ビノレルビン、ノバントロン（ｎｏｖａｎｔｒｏｎｅ）、テニポシド、エダトレキセート（ｅｄａｔｒｅｘａｔｅ）、ダウノマイシン、アミノプテリン、キセローダ（ｘｅｌｏｄａ）、イバンドロナート（ｉｂａｎｄｒｏｎａｔｅ）、イリノテカン、トポイソメラーゼインヒビター、ジフルオロメチロールニチン（ＤＭＦＯ）、レチノイン酸、カペシタビン（ｃａｐｅｃｉｔａｂｉｎｅ）、並びにそれらの薬学的に許容可能な塩又は誘導体を包含する。
　また、本発明の抗体と、抗腫瘍剤を併用投与することで、より高い治療効果を得ることができる。本手法は、ＣＡＰＲＩＮ－１が発現している癌患者に対して、外科的手術前後どちらにおいても適応できる。特に手術後に、従来抗腫瘍剤単独で処置されていたＣＡＰＲＩＮ－１が発現している癌に対して、より高い癌再発防止や生存期間の延長が得られる。
　本発明の抗体との併用投与に用いられる抗腫瘍剤の例は、文献等で公知の下記の抗腫瘍剤、すなわち、パクリタキセル、ドキソルビシン、ダウノルビシン、シクロホスファミド、メトトレキサート、５－フルオロウラシル、チオテパ、ブスルファン、インプロスルファン、ピポスルファン、ベンゾドーパ（ｂｅｎｚｏｄｏｐａ）、カルボコン、メツレドーパ（ｍｅｔｕｒｅｄｏｐａ）、ウレドーパ（ｕｒｅｄｏｐａ）、アルトレートアミン（ａｌｔｒｅｔａｍｉｎｅ）、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホラミド、トリエチレンチオホスホラミド（ｔｒｉｅｔｈｉｌｅｎｅｔｈｉｏｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｅ）、トリメチローロメラミン（ｔｒｉｍｅｔｈｙｌｏｌｏｍｅｌａｍｉｎｅ）、ブラタシン、ブラタシノン、カンプトセシン、ブリオスタチン、カリスタチン（ｃａｌｌｙｓｔａｔｉｎ）、クリプトフィシン１、クリプトフィシン８、ドラスタチン、ズオカルマイシン、エレウテロビン、パンクラチスタチン、サルコジクチン（ｓａｒｃｏｄｉｃｔｙｉｎ）、スポンジスタチン、クロランブシル、クロロナファジン（ｃｈｌｏＲＮＡｐｈａｚｉｎｅ）、コロホスファミド（ｃｈｏｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシドヒドロクロリド、メルファラン、ノベンビチン（ｎｏｖｅｍｂｉｃｈｉｎ）、フェネステリン（ｐｈｅｎｅｓｔｅｒｉｎｅ）、プレドニムスチン（ｐｒｅｄｎｉｍｕｓｔｉｎｅ）、トロフォスファミド（ｔｒｏｆｏｓｆａｍｉｄｅ）、ウラシルマスタード、カルムスチン、クロロゾトシン（ｃｈｌｏｒｏｚｏｔｏｃｉｎ）、フォテムスチン（ｆｏｔｅｍｕｓｔｉｎｅ）、ロムスチン、ニムスチン、ラニムスチン、カリケアマイシン（ｃａｌｉｃｈｅａｍｉｃｉｎ）、ダイネマイシン、クロドロネート、エスペラマイシン、アクラシノマイシン、アクチノマイシン、オースラマイシン（ａｕｔｈｒａｍｙｃｉｎ）、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン（ｃａｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎ）、カラビシン（ｃａｒａｂｉｃｉｎ）、カルミノマイシン、カルジノフィリン（ｃａｒｚｉｎｏｐｈｉｌｉｎ）、クロモマイシン、ダクチノマイシン、デトルビシン（ｄｅｔｏｒｂｉｃｉｎ）、６－ジアゾ－５－オキソ－Ｌ－ノルロイシン、アドリアマイシン（ＡＤＲＩＡＭＹＣＩＮ）、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マーセロマイシン（ｍａｒｃｅｌｌｏｍｙｃｉｎ）、マイトマイシンＣ、マイコフェノール酸（ｍｙｃｏｐｈｅｎｏｌｉｃ　ａｃｉｄ）、ノガラマイシン（ｎｏｇａｌａｍｙｃｉｎ）、オリボマイシン（ｏｌｉｖｏｍｙｃｉｎｓ）、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン（ｐｏｔｆｉｒｏｍｙｃｉｎ）、ピューロマイシン、ケラマイシン（ｑｕｅｌａｍｙｃｉｎ）、ロドルビシン（ｒｏｄｏｒｕｂｉｃｉｎ）、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン（ｔｕｂｅｒｃｉｄｉｎ）、ウベニメクス、ジノスタチン（ｚｉｎｏｓｔａｔｉｎ）、ゾルビシン（ｚｏｒｕｂｉｃｉｎ）、デノプテリン（ｄｅｎｏｐｔｅｒｉｎ）、プテロプテリン（ｐｔｅｒｏｐｔｅｒｉｎ）、トリメトレキセート（ｔｒｉｍｅｔｒｅｘａｔｅ）、フルダラビン（ｆｌｕｄａｒａｂｉｎｅ）、６－メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニン、アンシタビン、アザシチジン（ａｚａｃｉｔｉｄｉｎｅ）、６－アザウリジン（ａｚａｕｒｉｄｉｎｅ）、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン（ｅｎｏｃｉｔａｂｉｎｅ）、フロキシウリジン（ｆｌｏｘｕｒｉｄｉｎｅ）、カルステロン（ｃａｌｕｓｔｅｒｏｎｅ）、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトン（ｔｅｓｔｏｌａｃｔｏｎｅ）、アミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタン、フロリン酸（ｆｒｏｌｉｎｉｃ　ａｃｉｄ）、アセグラトン、アルドホスファミドグリコシド、アミノレブリン酸、エニルウラシル、アムサクリン（ａｍｓａｃｒｉｎｅ）、ベストラブシル（ｂｅｓｔｒａｂｕｃｉｌ）、ビサントレン（ｂｉｓａｎｔｒｅｎｅ）、エダトラキセート（ｅｄａｔｒａｘａｔｅ）、デフォファミン（ｄｅｆｏｆａｍｉｎｅ）、デメコルシン（ｄｅｍｅｃｏｌｃｉｎｅ）、ジアジコン（ｄｉａｚｉｑｕｏｎｅ）、エルフォルニチン　（ｅｌｆｏｒｎｉｔｈｉｎｅ）、酢酸エリプチニウム（ｅｌｌｉｐｔｉｎｉｕｍ）、エポチロン（ｅｐｏｔｈｉｌｏｎｅ）、エトグルシド（ｅｔｏｇｌｕｃｉｄ）、レンチナン、ロニダミン（ｌｏｎｉｄａｍｉｎｅ）、メイタンシン（ｍａｙｔａｎｓｉｎｅ）、アンサミトシン（ａｎｓａｍｉｔｏｃｉｎｅ）、ミトグアゾン（ｍｉｔｏｇｕａｚｏｎｅ）、ミトキサントロン、モピダンモール（ｍｏｐｉｄａｎｍｏｌ）、ニトラエリン（ｎｉｔｒａｅｒｉｎｅ）、ペントスタチン、フェナメット（ｐｈｅｎａｍｅｔ）、ピラルビシン、ロソキサントロン（ｌｏｓｏｘａｎｔｒｏｎｅ）、ポドフィリン酸（ｐｏｄｏｐｈｙｌｌｉｎｉｃ　ａｃｉｄ）、２－エチルヒドラジド、プロカルバジン、ラゾキサン（ｒａｚｏｘａｎｅ）、リゾキシン、シゾフィラン、スピロゲルマニウム（ｓｐｉｒｏｇｅｒｍａｎｉｕｍ）、テニュアゾン酸（ｔｅｎｕａｚｏｎｉｃ　ａｃｉｄ）、トリアジコン（ｔｒｉａｚｉｑｕｏｎｅ）、ロリジン（ｒｏｒｉｄｉｎｅ）Ａ、アングイジン（ａｎｇｕｉｄｉｎｅ）、ウレタン、ビンデシン、ダカーバジン、マンノムスチン（ｍａｎｎｏｍｕｓｔｉｎｅ）、ミトブロニトール、ミトラクトール（ｍｉｔｏｌａｃｔｏｌ）、ピポブロマン（ｐｉｐｏｂｒｏｍａｎ）、ガシトシン（ｇａｃｙｔｏｓｉｎｅ）、ドキセタキセル、クロランブシル、ゲムシタビン（ｇｅｍｃｉｔａｂｉｎｅ）、６－チオグアニン、メルカプトプリン、シスプラチン、オキサリプラチン、カルボプラチン、ビンブラスチン、エトポシド、イホスファミド、マイトキサントロン、ビンクリスチン、ビノレルビン、ノバントロン（ｎｏｖａｎｔｒｏｎｅ）、テニポシド、エダトレキセート（ｅｄａｔｒｅｘａｔｅ）、ダウノマイシン、アミノプテリン、キセローダ（ｘｅｌｏｄａ）、イバンドロナート（ｉｂａｎｄｒｏｎａｔｅ）、イリノテカン、トポイソメラーゼインヒビター、ジフルオロメチロールニチン（ＤＭＦＯ）、レチノイン酸、カペシタビン（ｃａｐｅｃｉｔａｂｉｎｅ）、並びにそれらの薬学的に許容可能な（公知の）塩又は（公知の）誘導体を包含する。上記の内、特にシクロホスファミド、パクリタキセル、ドキセタキセル、ビノレルビンが好ましく用いられる。
　あるいは、本発明の抗体には、文献等で公知の、２１１Ａｔ、１３１Ｉ、１２５Ｉ、９０Ｙ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１５３ＳＭ、２１２Ｂｉ、３２Ｐ、１７５Ｌｕ、１７６Ｌｕなどの放射性同位体を結合することも可能である。放射性同位体は、腫瘍の治療や診断のために有効なものが望ましい。
　本発明の抗体は、ＣＡＰＲＩＮ－１と免疫学的反応性を有する抗体、あるいは、ＣＡＰＲＩＮ－１と特異的に結合する抗体であって、癌に対する細胞障害活性、又は腫瘍増殖抑制作用、を示す抗体である。該抗体は、それを投与する対象動物において拒絶反応がほとんど又はまったく回避されるような構造をもつ抗体であるべきである。そのよう抗体としては、例えば対象動物がヒトである場合、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体（例えばヒト－マウスキメラ抗体）、単鎖抗体、二重特異性抗体などが挙げられる。これらの抗体は、重鎖及び軽鎖の可変領域がヒト抗体由来のものであるか、あるいは、重鎖及び軽鎖の可変領域が非ヒト動物抗体由来の相補性決定領域（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３）とヒト抗体由来のフレームワーク領域からなるものであるか、あるいは、重鎖及び軽鎖の可変領域が非ヒト動物抗体由来のものであり、かつ、重鎖及び軽鎖の定常領域がヒト抗体由来のものである組換え型抗体である。好ましい抗体は、前２つの抗体である。
　これらの組換え型抗体は、次のようにして作製することができる。ハイブリドーマなどの抗体産生細胞からヒトＣＡＰＲＩＮ－１に対するモノクローナル抗体（例えば、ヒトモノクローナル抗体、マウスモノクローナル抗体、ラットモノクローナル抗体、ウサギモノクローナル抗体、ニワトリモノクローナル抗体など）をコードするＤＮＡをクローニングし、これを鋳型にして該抗体の軽鎖可変領域及び重鎖可変領域をコードするＤＮＡをＲＴ－ＰＣＲ法等により作製し、Ｋａｂａｔ　ＥＵ　ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ　ｓｙｓｔｅｍ（Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ　ｏｆ　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｏｆ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，　５ｔｈＥｄ．　Ｐｕｂｌｉｃ　Ｈｅａｌｔｈ　Ｓｅｒｖｉｃｅ，　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ　ｏｆ　Ｈｅａｌｔｈ，　Ｂｅｔｈｅｓｄａ，　Ｍｄ．　（１９９１））に基づいて軽鎖及び重鎖の各可変領域の配列又は各ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３の配列を決定する。
　さらに、これらの各可変領域をコードするＤＮＡ又は各ＣＤＲをコードするＤＮＡを、遺伝子組換え技術（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ　（１９８９））又はＤＮＡ合成機を用いて作製する。ここで、上記ヒトモノクローナル抗体産生ハイブリドーマは、ヒト抗体産生動物（例えば、マウス）にヒトＣＡＰＲＩＮ－１を免疫したのち、該免疫動物から切除した脾細胞とミエローマ細胞とを融合させることによって作製することができる。これとは別に、必要に応じて、遺伝子組換え技術又はＤＮＡ合成機を用いてヒト抗体由来の軽鎖又は重鎖の可変領域及び定常領域をコードするＤＮＡを作製する。
　ヒト化抗体の場合には、ヒト抗体由来の軽鎖又は重鎖の可変領域をコードするＤＮＡ中のＣＤＲコーディング配列を、それらに対応する、ヒト以外の動物（例えばマウス、ラット、ニワトリなど）由来の抗体のＣＤＲコーディング配列と置換したＤＮＡを作製し、それによって得られたＤＮＡをそれぞれ、ヒト抗体由来の軽鎖又は重鎖の定常領域をコードするＤＮＡと連結することによって、ヒト化抗体をコードするＤＮＡを作製することができる。
　キメラ抗体の場合には、ヒト以外の動物（例えばマウス、ラット、ニワトリなど）由来の抗体の軽鎖又は重鎖の可変領域をコードするＤＮＡをそれぞれ、ヒト抗体由来の軽鎖又は重鎖の定常領域をコードするＤＮＡと連結することによって、キメラ抗体をコードするＤＮＡを作製することができる。
　単鎖抗体の場合には、この抗体は重鎖可変領域と軽鎖可変領域とをリンカーを介して直線状に連結された抗体であり、重鎖可変領域をコードするＤＮＡ、リンカーをコードするＤＮＡ、及び軽鎖可変領域をコードするＤＮＡを結合することによって単鎖抗体をコードするＤＮＡを作製することができる。ここで、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域はいずれも、ヒト抗体由来のものであるか、あるいは、ＣＤＲのみヒト以外の動物（例えばマウス、ラット、ニワトリなど）由来の抗体のＣＤＲによって置換されたヒト抗体由来のものである。また、リンカーは、１２～１９アミノ酸からなり、例えば１５アミノ酸の（Ｇ４Ｓ）３（Ｇ．　－Ｂ．　Ｋｉｍら，Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　Ｄｅｓｉｇｎ　ａｎｄ　Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ　２００７，　２０（９）：　４２５－４３２）が挙げられる。
　二重特異性抗体（ｄｉａｂｏｄｙ）の場合には、この抗体は２つの異なるエピトープと特異的に結合可能な抗体であり、例えば重鎖可変領域ＡをコードするＤＮＡ、軽鎖可変領域ＢをコードするＤＮＡ、重鎖可変領域ＢをコードするＤＮＡ、及び軽鎖可変領域ＡをコードするＤＮＡをこの順序で結合する（ただし、軽鎖可変領域ＢをコードするＤＮＡと重鎖可変領域ＢをコードするＤＮＡとは上記のようなリンカーをコードするＤＮＡを介して結合される。）ことによって二重特異性抗体をコードするＤＮＡを作製することができる。ここで、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域はいずれも、ヒト抗体由来のものであるか、あるいは、ＣＤＲのみヒト以外の動物（例えばマウス、ラット、ニワトリなど）由来の抗体のＣＤＲによって置換されたヒト抗体由来のものである。
　上記のようにして作製された組換えＤＮＡを、１つ又は複数の適当なベクターに組み込み、これを宿主細胞（例えば、哺乳動物細胞、酵母細胞、昆虫細胞など）に導入し、（共）発現させることによって組換え型抗体を作製することができる（Ｐ．Ｊ．　Ｄｅｌｖｅｓ．，　ＡＮＴＩＢＯＤＹ　ＰＲＯＤＵＣＴＩＯＮ　ＥＳＳＥＮＴＩＡＬ　ＴＥＣＨＮＩＱＵＥＳ．，　１９９７　ＷＩＬＥＹ、Ｐ．　Ｓｈｅｐｈｅｒｄ　ａｎｄ　Ｃ．　Ｄｅａｎ．，　Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．，　２０００　ＯＸＦＯＲＤ　ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ　ＰＲＥＳＳ；　Ｊ．Ｗ．　Ｇｏｄｉｎｇ．，　Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：　ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ　ａｎｄ　ｐｒａｃｔｉｃｅ．，　１９９３　ＡＣＡＤＥＭＩＣ　ＰＲＥＳＳ）。
　上記の方法によって作製される本発明の抗体は、配列番号３９、４０及び４１を含む重鎖可変領域と配列番号４３、４４及び４５を含む軽鎖可変領域とを含む抗体（例えば、配列番号４２の重鎖可変領域及び配列番号４６の軽鎖可変領域で構成される抗体）。
　ここで、配列番号３９、４０及び４１に示すアミノ酸配列は、ニワトリ抗体重鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３であり、また、配列番号４３、４４及び４５に示すアミノ酸配列はそれぞれ、ニワトリ抗体軽鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３である。
　また、本発明のヒト化抗体、キメラ抗体、単鎖抗体又は二重特異性抗体は、例えば以下の抗体である。
　（ｉ）重鎖の可変領域が配列番号３９、４０及び４１のアミノ酸配列及びヒト抗体由来のフレームワーク領域のアミノ酸配列を含み、かつ、軽鎖の可変領域が配列番号４３、４４及び４５のアミノ酸配列及びヒト抗体由来のフレームワーク領域のアミノ酸配列を含む抗体（例えば、重鎖可変領域に配列番号４２のアミノ酸配列を含み、かつ、軽鎖可変領域に配列番号４６のアミノ酸配列を含む抗体）。
　（ｉｉ）重鎖の可変領域が配列番号３９、４０及び４１のアミノ酸配列及びヒト抗体由来のフレームワーク領域のアミノ酸配列を含み、かつ、重鎖の定常領域がヒト抗体由来のアミノ酸配列を含み、並びに、軽鎖の可変領域が配列番号４３、４４及び４５のアミノ酸配列及びヒト抗体由来のフレームワーク領域のアミノ酸配列を含み、かつ、軽鎖の定常領域がヒト抗体由来のアミノ酸配列を含んでなる抗体（例えば、重鎖の可変領域が配列番号４２のアミノ酸配列を含み、かつ、重鎖の定常領域がヒト抗体由来のアミノ酸配列を含む、並びに、軽鎖の可変領域が配列番号４６のアミノ酸配列を含み、かつ、軽鎖の定常領域がヒト抗体由来のアミノ酸配列を含んでなる抗体）。
　なお、ヒト抗体重鎖及び軽鎖の定常領域及び可変領域の配列は、例えばＮＣＢＩ（米国：ＧｅｎＢａｎｋ、ＵｎｉＧｅｎｅなど）から入手可能であり、例えばヒトＩｇＧ１重鎖定常領域については登録番号Ｊ００２２８、ヒトＩｇＧ２重鎖定常領域については登録番号Ｊ００２３０、ヒトＩｇＧ３重鎖定常領域については登録番号Ｘ０３６０４、ヒトＩｇＧ４重鎖定常領域については登録番号Ｋ０１３１６、ヒト軽鎖κ定常領域については登録番号Ｖ００５５７、Ｘ６４１３５、Ｘ６４１３３など、ヒト軽鎖λ定常領域については登録番号Ｘ６４１３２、Ｘ６４１３４などの配列を参照することができる。
　上記抗体は、好ましくは、細胞障害活性を有しており、これによって抗腫瘍効果を発揮することができる。
　また、上記抗体における重鎖及び軽鎖の可変領域やＣＤＲの特定の配列は、単に例示を目的としたものであり、特定の配列に限定されないことは明らかである。ヒトＣＡＰＲＩＮ－１に対する別のヒト抗体又は非ヒト動物抗体（例えばマウス抗体）を産生しうるハイブリドーマを作製し、ハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体を回収し、ヒトＣＡＰＲＩＮ－１との免疫学的結合性及び細胞障害活性を指標として目的の抗体であるか否かを判定する。それによって目的のモノクローナル抗体産生ハイブリドーマを識別したのち、上記のとおり、該ハイブリドーマから目的の抗体の重鎖及び軽鎖の可変領域をコードするＤＮＡを作製し配列決定し、該ＤＮＡを別の抗体の作製のために利用する。
　さらに本発明の上記抗体は、ＣＡＰＲＩＮ－１を特異的に認識するという特異性を有する限り、上記各抗体の特にフレームワーク領域の配列及び／又は定常領域の配列において、１若しくは数個（好ましくは、１若しくは２個）のアミノ酸の置換、欠失又は付加があってもよい。ここで数個とは、２～５個、好ましくは２個又は３個を意味する。
　本発明はさらに、本発明の上記抗体をコードするＤＮＡ、あるいは、上記抗体の重鎖又は軽鎖をコードするＤＮＡ、あるいは、上記抗体の重鎖又は軽鎖の可変領域をコードするＤＮＡも提供する。そのようなＤＮＡは、例えば、配列番号３９、４０及び４１のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む重鎖可変領域をコードするＤＮＡ、配列番号４３、４４及び４５のアミノ酸配列をコードする塩基配列含む軽鎖可変領域をコードするＤＮＡ、などを含む。
　これらの配列のＤＮＡによってコードされる相補性決定領域（ＣＤＲ）は、抗体の特異性を決定する領域であるため、抗体のそれ以外の領域（すなわち、定常領域及びフレームワーク領域）をコードする配列は他の抗体由来の配列であってもよい。ここで他の抗体とはヒト以外の生物由来の抗体も含むが、副作用低減の観点からはヒト由来のものが好ましい。すなわち、上記のＤＮＡでは、重鎖及び軽鎖の各フレームワーク領域及び各定常領域をコードする領域がヒト抗体由来の対応アミノ酸配列をコードする塩基配列を含むことが好ましい。
　さらに、本発明の抗体をコードするＤＮＡの別の例は、例えば、配列番号４２のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む重鎖可変領域をコードするＤＮＡ、軽鎖可変領域をコードする領域が配列番号４６のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含むＤＮＡなどである。ここで、配列番号４２のアミノ酸配列をコードする塩基配列の例は、配列番号４９の塩基配列である。また、配列番号４６のアミノ酸配列をコードする塩基配列の例は、配列番号５０の塩基配列である。これらのＤＮＡでも、重鎖及び軽鎖の各定常領域をコードする領域がヒト抗体由来の対応アミノ酸配列をコードする塩基配列を含むことが好ましい。
　本発明のＤＮＡは、例えば上記の方法又は以下の方法で得ることができる。まず、本発明の抗体に関わるハイブリドーマから、市販のＲＮＡ抽出キットを用いて全ＲＮＡを調製し、ランダムプライマー等を用いて逆転写酵素によりｃＤＮＡを合成する。次いで既知のマウス抗体重鎖遺伝子及び軽鎖遺伝子の各可変領域において、それぞれ保存されている配列のオリゴヌクレオチドをプライマーに用いたＰＣＲ法によって、抗体をコードするｃＤＮＡを増幅させる。定常領域をコードする配列については、既知の配列をＰＣＲ法で増幅することによって得ることができる。ＤＮＡの塩基配列は、配列決定用プラスミド又はファージに組み込むなどして、常法により決定することができる。
　本発明で用いられる抗ＣＡＰＲＩＮ－１抗体によるＣＡＰＲＩＮ－１発現癌細胞に対する抗腫瘍効果は、以下の機序により起こると考えられる。
　ＣＡＰＲＩＮ－１発現細胞のエフェクター細胞抗体依存的細胞障害性（ＡＤＣＣ）、及びＣＡＰＲＩＮ－１発現細胞の補体依存的細胞障害性（ＣＤＣ）。
　したがって、本発明で用いられる抗ＣＡＰＲＩＮ－１抗体の活性評価は、以下実施例に具体的に示されるように、生体外でＣＡＰＲＩＮ－１を発現する癌細胞に対して上記ＡＤＣＣ活性又はＣＤＣ活性を測定することで評価することができる。
　本発明で用いられる抗ＣＡＰＲＩＮ－１抗体は、癌細胞上のＣＡＰＲＩＮ－１タンパク質と結合し、上記活性によって、抗腫瘍作用を示すことから、癌の治療あるいは予防に有用であると考えられる。すなわち本発明は、抗ＣＡＰＲＩＮ－１抗体を有効成分とする、癌の治療及び／又は予防のための医薬組成物を提供する。抗ＣＡＰＲＩＮ－１抗体を人体に投与する目的（抗体治療）で使用する場合には、免疫原性を低下させるため、ヒト抗体やヒト化抗体にすることが好ましい。
　なお、抗ＣＡＰＲＩＮ－１抗体と癌細胞表面上のＣＡＰＲＩＮ－１タンパク質との結合親和性が高い程、抗ＣＡＰＲＩＮ－１抗体による、より強い抗腫瘍活性が得られる。したがって、ＣＡＰＲＩＮ－１タンパク質と高い結合親和性を有する抗ＣＡＰＲＩＮ－１抗体を獲得できれば、より強い抗腫瘍効果が期待でき、癌の治療及び／又は予防を目的とした医薬組成物として適応することが可能になる。高い結合親和性として、前述したように、結合定数（親和定数）Ｋａ（ｋｏｎ／ｋｏｆｆ）が、好ましくは、少なくとも１０７Ｍ－１、少なくとも１０８Ｍ－１、少なくとも５×１０８Ｍ－１、少なくとも１０９Ｍ－１、少なくとも５×１０９Ｍ－１、少なくとも１０１０Ｍ－１、少なくとも５×１０１０Ｍ－１、少なくとも１０１１Ｍ－１、少なくとも５×１０１１Ｍ－１、少なくとも１０１２Ｍ－１、あるいは、少なくとも１０１３Ｍ－１であることが望ましい。
　＜抗原発現細胞への結合＞
　抗体がＣＡＰＲＩＮ－１に結合する能力は、実施例で述べられるようなたとえばＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロット法、免疫蛍光及びフローサイトメトリー分析などを用いた結合アッセイを利用して特定することができる。
　＜免疫組織化学染色＞
　ＣＡＰＲＩＮ－１を認識する抗体は、当業者に周知の方法での免疫組織化学により、外科手術の間に患者から得た組織や、自然に又はトランスフェクション後にＣＡＰＲＩＮ－１を発現する細胞系を接種した異種移植組織を担持する動物から得た組織から、パラホルムアルデヒド又はアセトン固定した凍結切片又はパラホルムアルデヒドで固定したパラフィン包埋した組織切片を使用して、ＣＡＰＲＩＮ－１との反応性に関して試験することができる。
　免疫組織化学染色のため、ＣＡＰＲＩＮ－１に対して反応性のある抗体を、様々な方法で染色させることができる。例えば、ホースラディッシュペルオキシダーゼ複合ヤギ抗マウス抗体やヤギ抗ニワトリ抗体を反応させることにより、可視化することができる。
　＜医薬組成物＞
　本発明の癌の治療及び／又は予防のための医薬組成物の標的は、ＣＡＰＲＩＮ－１遺伝子を発現する癌（細胞）であれば特に限定されない。
　本明細書で使用される「腫瘍」及び「癌」という用語は、悪性新生物を意味し、互換的に使用される。
　本発明において対象となる癌としては、配列番号２～３０のうち偶数の配列番号のアミノ酸配列を有するＣＡＰＲＩＮ－１タンパク質をコードする遺伝子を発現している癌であり、好ましくは、乳癌、脳腫瘍、白血病、肺癌、リンパ腫、肥満細胞腫、腎癌、子宮頸癌、膀胱癌、食道癌、胃癌及び大腸癌である。
　これらの特定の癌には、例えば、乳腺癌、複合型乳腺癌、乳腺悪性混合腫瘍、乳管内乳頭状腺癌、肺腺癌、扁平上皮癌、小細胞癌、大細胞癌、神経上皮組織性腫瘍である神経膠腫、脳室上衣腫、神経細胞性腫瘍、胎児型の神経外胚葉性腫瘍、神経鞘腫、神経線維腫、髄膜腫、慢性型リンパ球性白血病、リンパ腫、消化管型リンパ腫、消化器型リンパ腫、小～中細胞型リンパ腫、盲腸癌、上行結腸癌、下行結腸癌、横行結腸癌、Ｓ状結腸癌、直腸癌が包含されるが、これらに限定されない。
　また、対象となる好ましい被験者は、哺乳動物であり、例えば霊長類、ペット動物、家畜類、競技用動物などを含む哺乳動物であり、特にヒト、イヌ及びネコが好ましい。
　本発明で用いられる抗体を医薬組成物として用いる場合には、当業者に公知の方法で製剤化することが可能である。例えば、水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、又は懸濁液剤の注射剤の形で非経口的に使用できる。例えば、薬理学上許容される担体もしくは媒体、具体的には、滅菌水や生理食塩水、植物油、乳化剤、懸濁剤、界面活性剤、安定剤、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、結合剤などと適宜組み合わせて、一般に認められた製薬実施に要求される単位用量形態で混和することによって製剤化することが考えられる。これら製剤における有効成分量は指示された範囲の適当な用量が得られるようにするものである。
　注射のための無菌組成物は注射用蒸留水のようなベヒクルを用いて通常の製剤実施に従って処方することができる。
　注射用の水溶液としては、例えば生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液、例えばＤ－ソルビトール、Ｄ－マンノース、Ｄ－マンニトール、塩化ナトリウムが挙げられ、適当な溶解補助剤、例えばアルコール、具体的にはエタノール、ポリアルコール、例えばプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、非イオン性界面活性剤、例えばポリソルベート８０（ＴＭ）、ＨＣＯ－６０と併用してもよい。
　油性液としてはゴマ油、大豆油があげられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールと併用してもよい。また、緩衝剤、例えばリン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液、無痛化剤、例えば、塩酸プロカイン、安定剤、例えばベンジルアルコール、フェノール、酸化防止剤と配合してもよい。調製された注射液は通常、適当なアンプルに充填させる。
　投与は、経口又は非経口であり、好ましくは非経口投与であり、具体的には、注射剤型、経鼻投与剤型、経肺投与剤型、経皮投与型などが挙げられる。注射剤型の例としては、例えば、静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、皮下注射などにより全身又は局部的に投与することができる。
　また、患者の年齢、体重、性別、症状などにより適宜投与方法を選択することができる。抗体又は抗体をコードするポリヌクレオチドを含有する医薬組成物の投与量としては、例えば、一回につき体重１ｋｇあたり０．０００１ｍｇから１０００ｍｇの範囲で選ぶことが可能である。あるいは、例えば、患者あたり０．００１～１０００００ｍｇ／ｂｏｄｙの範囲で投与量を選ぶことができるが、これらの数値に必ずしも制限されるものではない。投与量、投与方法は、患者の体重、年齢、性別、症状などにより変動するが、当業者であれば適宜選択することが可能である。
　本発明の抗体又はそのフラグメントを含む上記の医薬組成物を被験者に投与することによって癌、好ましくは、乳癌、脳腫瘍、白血病、肺癌、リンパ腫、肥満細胞腫、腎癌、子宮頸癌、膀胱癌、食道癌、胃癌及び大腸癌を治療及び／又は予防することができる。
　さらに、本発明の医薬組成物を、上で例示したような抗腫瘍剤又は抗腫瘍剤を含む医薬組成物と組み合わせて、被験者に併用投与することを含む、癌の治療及び／又は予防方法も本発明に包含される。本発明の抗体又はそのフラグメントと抗腫瘍剤は、同時に、あるいは、別々に被験者に投与されうる。別々に投与する場合には、いずれの医薬組成物が先であっても又は後であってもよく、それらの投与間隔、投与量、投与経路及び投与回数は、専門医によって適宜選択されうる。同時に投与する別の医薬剤型には、例えば、本発明の抗体又はそのフラグメントと抗腫瘍剤を、薬理学上許容される担体（もしくは媒体)中で混合し製剤化して得られる医薬組成物も包含されるものとする。また、抗腫瘍剤を含有する上記医薬組成物及び剤型のいずれに対しても、本発明の抗体を含有する医薬組成物及び剤型についての処方、製剤化、投与経路、用量、癌などの説明を適用しうる。
　したがって、本発明は、本発明の医薬組成物と、上で例示したような抗腫瘍剤を含む医薬組成物とを含む、癌の治療及び／又は予防のための組み合わせ医薬品も提供する。
　また、本発明は、本発明の抗体又はそのフラグメントと抗腫瘍剤とを、薬理学上許容される担体とともに含む、癌の治療及び／又は予防のための医薬組成物も提供する。
　＜ポリペプチド及びＤＮＡ＞
　本発明は更に、上記抗体に関わる以下のポリペプチド及びＤＮＡも提供する。
　（ｉ）配列番号４２のアミノ酸配列を含むポリペプチド、及び該ポリペプチドをコードする配列番号４９の塩基配列を含むＤＮＡ。
　（ｉｉ）配列番号４６のアミノ酸配列を含むポリペプチド、及び該ポリペプチドをコードする配列番号５０の塩基配列を含むＤＮＡ。
　（ｉｉｉ）配列番号３９、４０及び４１に示すアミノ酸配列からなる群から成る、重鎖ＣＤＲポリペプチド、及び該ポリペプチドをコードするＤＮＡ。
　（ｉｖ）配列番号４３、４４及び４５に示すアミノ酸配列からなる群から成る、軽鎖ＣＤＲポリペプチド、及び該ポリペプチドをコードするＤＮＡ。
　これらのポリペプチド及びＤＮＡは、上記のとおり、遺伝子組換え技術を用いて作製することができる。
　＜本発明の要約＞
　上で説明した本発明を以下に要約する。
　（１）配列番号３９、４０及び４１を含む重鎖可変領域と配列番号４３、４４及び４５を含む軽鎖可変領域とを含み、かつ、ＣＡＰＲＩＮ－１タンパク質と免疫学的反応性を有する抗体又はそのフラグメントを有効成分として含むことを特徴とする、癌の治療及び／又は予防のための医薬組成物。
　（２）前記癌が乳癌、脳腫瘍、白血病、リンパ腫、肺癌、肥満細胞腫、腎癌、子宮頸癌、食道癌、胃癌、膀胱癌もしくは大腸癌である、上記（１）に記載の医薬組成物。
　（３）前記抗体が、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、単鎖抗体又は二重特異性抗体である、上記（１）又は（２）に記載の医薬組成物。
　（４）配列番号３９、４０及び４１を含む重鎖可変領域と配列番号４３、４４及び４５を含む軽鎖可変領域とを含み、かつ、ＣＡＰＲＩＮ－１タンパク質と免疫学的反応性を有する抗体。
　（５）ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、単鎖抗体又は二重特異性抗体である、上記（４）に記載の抗体。
　（６）上記（１）～（３）のいずれかに記載の医薬組成物と、抗腫瘍剤を含む医薬組成物とを含んでなる、癌の治療及び／又は予防のための組み合わせ医薬品。
　（７）上記（１）～（３）のいずれかに記載の医薬組成物、あるいは、上記（３）～（５）のいずれかに記載の抗体又はそのフラグメントを、被験者に投与することを含む、癌の治療及び／又は予防方法。
　（８）被験者において上記（６）に記載の組み合わせ医薬品の各医薬組成物を併用することを含む、癌の治療及び／又は予防方法。
　以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明するが、本発明の範囲はこれらの具体例によって制限されないものとする。
　実施例１　ＳＥＲＥＸ法による新規癌抗原タンパクの同定
　（１）ｃＤＮＡライブラリーの作製
　健常な犬の精巣組織から酸グアニジウム－フェノール－クロロホルム法（Ａｃｉｄ　ｇｕａｎｉｄｉｕｍ－Ｐｈｅｎｏｌ－Ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ法）により全ＲＮＡを抽出し、Ｏｌｉｇｏｔｅｘ－ｄＴ３０　ｍＲＮＡ　ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（宝酒造社製）を用いてキット添付のプロトコールに従ってポリＡ　ＲＮＡを精製した。
　この得られたｍＲＮＡ（５μｇ）を用いてイヌ精巣ｃＤＮＡファージライブラリーを合成した。ｃＤＮＡファージライブラリーの作製にはｃＤＮＡ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　Ｋｉｔ，　ＺＡＰ－ｃＤＮＡ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　Ｋｉｔ，　ＺＡＰ－ｃＤＮＡ　ＧｉｇａｐａｃｋＩＩＩ　Ｇｏｌｄ　Ｃｌｏｎｉｇ　Ｋｉｔ　（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）を用い、キット添付のプロトコールに従ってライブラリーを作製した。作製したｃＤＮＡファージライブラリーのサイズは７．７３×１０５ｐｆｕ／ｍｌであった。
　（２）血清によるｃＤＮＡライブラリーのスクリーニング
　上記作製したイヌ精巣ｃＤＮＡファージライブラリーを用いて、イムノスクリーニングを行った。具体的にはΦ９０×１５ｍｍのＮＺＹアガロースプレートに２２１０クローンとなるように宿主大腸菌（ＸＬ１－Ｂｌｕｅ　ＭＲＦ’）に感染させ、４２℃、３～４時間培養し、溶菌斑（プラーク）を作らせ、ＩＰＴＧ（イソプロピル－β－Ｄ－チオガラクトシド）を浸透させたニトロセルロースメンブレン（Ｈｙｂｏｎｄ　Ｃ　Ｅｘｔｒａ：　ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ　Ｂｉｏ－Ｓｃｉｎｅｃｅ社製）でプレートを３７℃で４時間覆うことによりタンパク質を誘導・発現させ、メンブレンにタンパク質を転写した。その後メンブレンを回収し０．５％脱脂粉乳を含むＴＢＳ（１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ，　１５０ｍＭ　ＮａＣｌ　ｐＨ７．５）に浸し４℃で一晩振盪することによって非特異反応を抑制した。このフィルターを５００倍希釈した患犬血清と室温で２～３時間反応させた。
　上記患犬血清としては、乳癌の患犬より採取した血清を用いた。これらの血清は－８０℃で保存し、使用直前に前処理を行った。血清の前処理方法は、以下の方法による。すなわち、外来遺伝子を挿入していないλ　ＺＡＰ　Ｅｘｐｒｅｓｓファージを宿主大腸菌（ＸＬ１－Ｂｌｕｒｅ　ＭＲＦ’）に感染させた後、ＮＺＹプレート培地上で３７℃、一晩培養した。次いで０．５Ｍ　ＮａＣｌを含む０．２Ｍ　ＮａＨＣＯ３　ｐＨ８．３のバッファーをプレートに加え、４℃で１５時間静置後、上清を大腸菌／ファージ抽出液として回収した。次に、回収した大腸菌／ファージ抽出液をＮＨＳ－カラム（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ　Ｂｉｏ－Ｓｃｉｅｎｃｅ社製）に通液して、大腸菌・ファージ由来のタンパク質を固定化した。このタンパク固定化カラムに患犬血清を通液・反応させ、大腸菌及びファージに吸着する抗体を血清から取り除いた。カラムを素通りした血清画分は、０．５％脱脂粉乳を含むＴＢＳにて５００倍希釈し、これをイムノスクリーニング材料とした。
　かかる処理血清と上記融合タンパク質をブロットしたメンブレンをＴＢＳ－Ｔ（０．０５％　Ｔｗｅｅｎ２０／ＴＢＳ）にて４回洗浄を行った後、二次抗体として０．５％脱脂粉乳を含むＴＢＳにて５０００倍希釈を行ったヤギ抗イヌＩｇＧ（Ｇｏａｔ　ａｎｔｉ　Ｄｏｇ　ＩｇＧ－ｈ＋Ｉ　ＨＲＰ　ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ：　ＢＥＴＨＹＬ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）を、室温１時間反応させ、ＮＢＴ／ＢＣＩＰ反応液（Ｒｏｃｈｅ社製）を用いた酵素発色反応により検出し、発色反応陽性部位に一致するコロニーをΦ９０×１５ｍｍのＮＺＹアガロースプレート上から採取し、ＳＭ緩衝液（１００ｍＭ　ＮａＣｌ、１０ｍＭ　ＭｇＣｌＳＯ４、５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、０．０１％ゼラチン　ｐＨ７．５）５００μｌに溶解させた。発色反応陽性コロニーが単一化するまで上記と同様の方法で、二次、三次スクリーニングを繰り返し、血清中のＩｇＧと反応する３０９４０個のファージクローンをスクリーニングして、５個の陽性クローンを単離した。
　（３）単離抗原遺伝子の相同性検索
　上記方法により単離した５個の陽性クローンを塩基配列解析に供するため、ファージベクターからプラスミドベクターに転換する操作を行った。具体的には宿主大腸菌（ＸＬ１－Ｂｌｕｅ　ＭＲＦ’）を吸光度ＯＤ６００が１．０となるよう調製した溶液２００μｌと、精製したファージ溶液２５０μｌさらにＥｘＡｓｓｉｓｔ　ｈｅｌｐｅｒ　ｐｈａｇｅ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）１μｌを混合した後３７℃で１５分間反応後、ＬＢ培地を３ｍｌ添加し３７℃で２．５～３時間培養を行い、直ちに７０℃の水浴にて２０分間保温した後、４℃、１０００×ｇ、１５分間遠心分離を行い上清をファージミド溶液として回収した。次いでファージミド宿主大腸菌（ＳＯＬＲ）を吸光度ＯＤ６００が１．０となるよう調製した溶液２００μｌと、精製したファージ溶液１０μｌを混合した後３７℃で１５分間反応させ、５０μｌをアンピシリン（終濃度５０μｇ／ｍｌ）含有ＬＢ寒天培地に播き３７℃一晩培養した。トランスフォームしたＳＯＬＲのシングルコロニーを採取し、アンピシリン（終濃度５０μｇ／ｍｌ）含有ＬＢ培地３７℃にて培養後、ＱＩＡＧＥＮ　ｐｌａｓｍｉｄ　Ｍｉｎｉｐｒｅｐ　Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を使って目的のインサートを持つプラスミドＤＮＡを精製した。
　精製したプラスミドは、配列番号３１に記載のＴ３プライマーと配列番号３２に記載のＴ７プライマーを用いて、プライマーウォーキング法によるインサート全長配列の解析を行った。このシークエンス解析により配列番号５，７，９，１１，１３に記載の遺伝子配列を取得した。この遺伝子の塩基配列及びアミノ酸配列（配列番号６，８，１０，１２，１４）を用いて、相同性検索プログラムＢＬＡＳＴサーチ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／）を行い既知遺伝子との相同性検索を行った結果、得られた５個の遺伝子全てがＣＡＰＲＩＮ－１をコードする遺伝子であることが判明した。５個の遺伝子間の配列同一性は、タンパク質に翻訳される領域において塩基配列１００％、アミノ酸配列９９％であった。この遺伝子のヒト相同因子をコードする遺伝子との配列同一性は、タンパク質に翻訳される領域において、塩基配列９４％、アミノ酸配列９８％であった。ヒト相同因子の塩基配列を配列番号１，３に、アミノ酸配列を配列番号２，４に示す。また、取得したイヌ遺伝子のウシ相同因子をコードする遺伝子との配列同一性は、タンパク質に翻訳される領域において、塩基配列９４％、アミノ酸配列９７％であった。ウシ相同因子の塩基配列を配列番号１５に、アミノ酸配列を配列番号１６に示す。なお、ヒト相同因子をコードする遺伝子とウシ相同因子をコードする遺伝子との配列同一性は、タンパク質に翻訳される領域において、塩基配列９４％、アミノ酸配列９３～９７％であった。また、取得したイヌ遺伝子のウマ相同因子をコードする遺伝子との配列同一性は、タンパク質に翻訳される領域において、塩基配列９３％、アミノ酸配列９７％であった。ウマ相同因子の塩基配列を配列番号１７に、アミノ酸配列を配列番号１８に示す。なお、ヒト相同因子をコードする遺伝子とウマ相同因子をコードする遺伝子との配列同一性は、タンパク質に翻訳される領域において、塩基配列９３％、アミノ酸配列９６％であった。また、取得したイヌ遺伝子のマウス相同因子をコードする遺伝子との配列同一性は、タンパク質に翻訳される領域において、塩基配列８７～８９％、アミノ酸配列９５～９７％であった。マウス相同因子の塩基配列を配列番号１９，２１，２３，２５，２７に、アミノ酸配列を配列番号２０，２２，２４，２６，２８に示す。なお、ヒト相同因子をコードする遺伝子とマウス相同因子をコードする遺伝子との配列同一性は、タンパク質に翻訳される領域において、塩基配列８９～９１％、アミノ酸配列９５～９６％であった。また、取得したイヌ遺伝子のニワトリ相同因子をコードする遺伝子との配列同一性は、タンパク質に翻訳される領域において、塩基配列８２％、アミノ酸配列８７％であった。ニワトリ相同因子の塩基配列を配列番号２９に、アミノ酸配列を配列番号３０に示す。なお、ヒト相同因子をコードする遺伝子とニワトリ相同因子をコードする遺伝子との配列同一性は、タンパク質に翻訳される領域において、塩基配列８１～８２％、アミノ酸配列８６％であった。
　（４）各組織での遺伝子発現解析
　上記方法により得られた遺伝子に対しイヌ及びヒトの正常組織及び各種細胞株における発現をＲＴ－ＰＣＲ法により調べた。逆転写反応は以下の通り行なった。すなわち、各組織５０～１００ｍｇ及び各細胞株５～１０×１０６個の細胞からＴＲＩＺＯＬ試薬（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて添付のプロトコールに従い全ＲＮＡを抽出した。この全ＲＮＡを用いてＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ　Ｆｉｒｓｔ－Ｓｔｒａｎｄ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　Ｓｙｓｔｅｍ　ｆｏｒ　ＲＴ－ＰＣＲ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）により添付のプロトコールに従いｃＤＮＡを合成した。ＰＣＲ反応は、取得した遺伝子特異的なプライマー（配列番号３３及び３４に記載）を用いて以下の通り行った。すなわち、逆転写反応により調製したサンプル０．２５μｌ、上記プライマーを各２μＭ、０．２ｍＭ各ｄＮＴＰ、０．６５ＵのＥｘＴａｑポリメラーゼ（宝酒造社製）となるように各試薬と添付バッファーを加え全量を２５μｌとし、Ｔｈｅｒｍａｌ　Ｃｙｃｌｅｒ（ＢＩＯ　ＲＡＤ社製）を用いて、９４℃－３０秒、６０℃－３０秒、７２℃－３０秒のサイクルを３０回繰り返して行った。なお、上記遺伝子特異的プライマーは、配列番号５の塩基配列（イヌＣＡＰＲＩＮ－１遺伝子）中の２０６番～６３２番及び配列番号１の塩基配列（ヒトＣＡＰＲＩＮ－１遺伝子）中の６９８番～１１２４番塩基の領域を増幅するものであった。比較対照のため、ＧＡＰＤＨ特異的なプライマー（配列番号３５及び３６に記載）も同時に用いた。その結果、図１に示すように、健常なイヌ組織では精巣に強い発現が見られ、一方イヌ乳癌及び腺癌組織で発現が見られた。さらに、取得した遺伝子のヒト相同因子の発現を併せて確認したところ、イヌＣＡＰＲＩＮ－１遺伝子と同様、正常組織で発現が確認できたのは精巣のみだったが、癌細胞では乳癌、脳腫瘍、白血病、肺癌、食道癌細胞株など、多種類の癌細胞株で発現が検出され、特に多くの乳癌細胞株で発現が確認された。この結果から、ＣＡＰＲＩＮ－１は精巣以外の正常組織では発現が見られず、一方、多くの癌細胞で発現しており、特に乳癌細胞株に発現していることが確認された。
　なお、図１中、縦軸の参照番号１は、上記で同定した遺伝子の発現パターンを、参照番号２は、比較対照であるＧＡＰＤＨ遺伝子の発現パターンを示す。
　（５）免疫組織化学染色
　（５）－１　マウス及びイヌ正常組織におけるＣＡＰＲＩＮ－１の発現
　マウス（Ｂａｌｂ／ｃ、雌）及びイヌ（ビーグル犬、雌）をエーテル麻酔下及びケタミン／イソフルラン麻酔下で放血させ、開腹後、各臓器（胃、肝臓、眼球、胸腺、筋肉、骨髄、子宮、小腸、食道、心臓、腎臓、唾液腺、大腸、乳腺、脳、肺、皮膚、副腎、卵巣、膵臓、脾臓、膀胱）をそれぞれＰＢＳの入った１０ｃｍディッシュに移した。ＰＢＳ中で各臓器を切り開き、４％　ｐａｒａｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ（ＰＦＡ）を含む０．１Ｍ　リン酸緩衝液（ｐＨ７．４）で一晩還流固定した。還流液を捨て、ＰＢＳで各臓器の組織表面をすすぎ、１０％ショ糖を含むＰＢＳ溶液を５０ｍｌ容の遠心チューブに入れ、その中に各組織を入れて４℃で２時間ローターを用いて振とうした。２０％ショ糖を含むＰＢＳ溶液に入れ替え、４℃で組織が沈むまで静置後、３０％ショ糖を含むＰＢＳ溶液に入れ替え、４℃で組織が沈むまで静置した。組織を取り出し、必要な部分を手術用メスで切りだした。次に、ＯＣＴコンパウンド（Ｔｉｓｓｕｅ　Ｔｅｋ社製）をかけて組織表面になじませた後、クライオモルドに組織を配置した。ドライアイスの上にクライオモルドをおいて急速凍結させた後、クライオスタット（ＬＥＩＣＡ社製）を用いて１０～２０μｍに薄切し、スライドガラスごとヘアードライアーで３０分間風乾し、薄切組織がのったスライドガラス作製した。次にＰＢＳ－Ｔ（０．０５％　Ｔｗｅｅｎ２０を含む生理食塩水）を満たした染色瓶に入れて５分ごとにＰＢＳ－Ｔを入れ替える操作を３回行った。切片周囲の余分な水分をキムワイプでふき取り、ＤＡＫＯＰＥＮ（ＤＡＫＯ社製）で囲んだ後、ブロッキング液として、マウス組織はＭＯＭマウスＩｇブロッキング試薬（ＶＥＣＴＡＳＴＡＩＮ社製）を、イヌ組織は１０％　ＦＢＳを含むＰＢＳ－Ｔ溶液をそれぞれのせ、モイストチャンバー上で室温で１時間静置した。次に、実施例４で作製した癌細胞表面に反応する、配列番号４２の重鎖可変領域と配列番号４６の軽鎖可変領域を有するＣＡＰＲＩＮ－１に対するモノクローナル抗体（モノクローナル抗体＃１）をブロッキング液で１０μｇ／ｍｌに調製した溶液をのせ、モイストチャンバー内において４℃下で一晩静置した。ＰＢＳ－Ｔで１０分間３回洗浄を行った後、ブロッキング液で２５０倍に希釈したＭＯＭビオチン標識抗ＩｇＧ抗体（ＶＥＣＴＡＳＴＡＩＮ社製）をのせ、モイストチャンバー内において室温で１時間静置した。ＰＢＳ－Ｔで１０分間３回洗浄を行った後、アビジンービオチンＡＢＣ試薬（ＶＥＣＴＡＳＴＡＩＮ社製）をのせ、モイストチャンバー内で室温で５分間静置した。ＰＢＳ－Ｔで１０分間３回洗浄を行った後、ＤＡＢ発色液（ＤＡＢ　１０ｍｇ＋３０％　Ｈ２Ｏ２　１０μｌ／０．０５Ｍ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．６）５０ｍｌ）をのせ、モイストチャンバー内で室温で３０分間静置した。蒸留水でリンスし、ヘマトキシリン試薬（ＤＡＫＯ社製）を載せて室温で１分間静置後、蒸留水でリンスした。７０％、８０％、９０％、９５％、１００％の各エタノール溶液に順番に１分間ずつ入れた後、キシレン中で一晩静置した。スライドガラスを取り出し、Ｇｌｙｃｅｒｇｅｌ　Ｍｏｕｎｔｉｎｇ　Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＡＫＯ社製）で封入後、観察を行った。その結果、ＣＡＰＲＩＮ－１は、唾液腺、腎臓、結腸、胃の各組織において細胞内で僅かに発現が認められたが、細胞表面での発現は認められず、また、その他の臓器由来の組織では全く発現が認められなかった。
　（５）－２　イヌ乳癌組織におけるＣＡＰＲＩＮ－１の発現
　病理診断で悪性乳癌と診断されたイヌの凍結された乳癌組織１０８検体を用いて、上述と同様の方法で凍結切片スライド作製及び実施例４で作製したモノクローナル抗体＃１を用いた免疫組織化学染色を行った。その結果、ＣＡＰＲＩＮ－１は１０８検体中１００検体（９２．５％）で発現が確認され、特に異型度の高い癌細胞表面に強く発現していた。
　（５）－３　ヒト乳癌組織におけるＣＡＰＲＩＮ－１の発現
　パラフィン包埋されたヒト乳癌組織アレイ（ＢＩＯＭＡＸ社製）の乳癌組織１８８検体を用いて、免疫組織化学染色を行った。ヒト乳癌組織アレイを６０℃で３時間処理後、キシレンを満たした染色瓶に入れて５分ごとにキシレンを入れ替える操作を３回行った。次にキシレンの代わりにエタノール及びＰＢＳ－Ｔで同様の操作を行った。０．０５％　Ｔｗｅｅｎ２０を含む１０ｍＭ　クエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）を満たした染色瓶にヒト乳癌組織アレイを入れ、１２５℃で５分間処理後、室温で４０分以上静置した。切片周囲の余分な水分をキムワイプでふき取り、ＤＡＫＯＰＥＮで囲み、Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ　Ｂｌｏｃｋ（ＤＡＫＯ社製）を適量滴下した。室温で５分間静置後、ＰＢＳ－Ｔを満たした染色瓶に入れて５分ごとにＰＢＳ－Ｔを入れ替える操作を３回行った。ブロッキング液として、１０％　ＦＢＳを含むＰＢＳ－Ｔ溶液をのせ、モイストチャンバー内において室温で１時間静置した。次に実施例４で作製した癌細胞表面に反応するモノクローナル抗体＃１を、５％　ＦＢＳを含むＰＢＳ－Ｔ溶液で１０μｇ／ｍｌに調製した溶液をのせ、モイストチャンバー内で４℃で一晩静置し、ＰＢＳ－Ｔで１０分間３回洗浄を行った後、Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ　Ｌａｂｅｌｌｅｄ　Ｐｏｌｙｍｅｒ　Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ（ＤＡＫＯ社製）適量滴下し、モイストチャンバー内において室温で３０分間静置した。ＰＢＳ－Ｔで１０分間３回洗浄を行った後、ＤＡＢ発色液（ＤＡＫＯ社製）をのせ、室温で１０分程度静置した後、発色液を捨て、ＰＢＳ－Ｔで１０分間３回洗浄を行った後、蒸留水でリンスし、７０％、８０％、９０％、９５％、１００％の各エタノール溶液に順番に１分間ずつ入れた後、キシレン中で一晩静置した。スライドガラスを取り出し、Ｇｌｙｃｅｒｇｅｌ　Ｍｏｕｎｔｉｎｇ　Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＡＫＯ社製）で封入後、観察を行った。その結果、ＣＡＰＲＩＮ－１は全乳癌組織１８８検体の内、１３８検体（７３％）で強い発現が認められた。
　（５）－４　ヒト悪性脳腫瘍におけるＣＡＰＲＩＮ－１の発現
　パラフィン包埋されたヒト悪性脳腫瘍組織アレイ（ＢＩＯＭＡＸ社製）の悪性脳腫瘍組織２４７検体を用いて、上述（５）－３と同様の方法で実施例４で作製したモノクローナル抗体＃１を用いた免疫組織化学染色を行った。その結果、ＣＡＰＲＩＮ－１は全悪性脳腫瘍組織２４７検体の内、２２７検体（９２％）で強い発現が認められた。
　（５）－５　ヒト乳癌転移リンパ節におけるＣＡＰＲＩＮ－１の発現
　パラフィン包埋されたヒト乳癌転移リンパ節組織アレイ（ＢＩＯＭＡＸ社製）の乳癌転移リンパ節組織１５０検体を用いて、上述（５）－３と同様の方法で実施例４で作製したモノクローナル抗体＃１を用いた免疫組織化学染色を行った。その結果、ＣＡＰＲＩＮ－１は全乳癌転移リンパ節組織１５０検体の内、１３６検体（９０％）で強い発現が認められた。すなわち、乳癌から転移した癌組織においてもＣＡＰＲＩＮ－１は強く発現することが判った。
　（５）－６　ヒト各種癌組織におけるＣＡＰＲＩＮ－１の発現
　パラフィン包埋されたヒト各種癌組織アレイ（ＢＩＯＭＡＸ社製）の検体を用いて、上述と同様の方法で実施例４で作製したモノクローナル抗体＃１を用いた免疫組織化学染色を行った。その結果、ＣＡＰＲＩＮ－１は食道癌、結腸癌、直腸癌、肺癌、腎癌、膀胱癌及び子宮頸癌で強い発現が認められた。
　実施例２　ヒト新規癌抗原タンパクの作製
　（１）組換えタンパク質の作製
　実施例１で取得した配列番号１の遺伝子を基に、以下の方法にてヒト相同遺伝子の組換えタンパク質を作製した。ＰＣＲは、実施例１で作製した各種組織・細胞ｃＤＮＡよりＲＴ－ＰＣＲ法による発現が確認できたｃＤＮＡを１μｌ、ＳａｃＩ及びＸｈｏＩ制限酵素切断配列を含む２種類のプライマー（配列番号３７及び３８に記載）を各０．４μＭ，　０．２ｍＭ　ｄＮＴＰ，　１．２５ＵのＰｒｉｍｅＳＴＡＲ　ＨＳポリメラーゼ（宝酒造社製）となるように各試薬と添付バッファーを加え全量を５０μｌとし、Ｔｈｅｒｍａｌ　Ｃｙｃｌｅｒ（ＢＩＯ　ＲＡＤ社製）を用いて、９８℃－１０秒、６８℃－２．５分のサイクルを３０回繰り返すことにより行った。なお、上記２種類のプライマーは、配列番号２のアミノ酸配列全長をコードする領域を増幅するものであった。ＰＣＲ後、増幅されたＤＮＡを１％アガロースゲルにて電気泳動し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ　Ｇｅｌ　Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて約２．１ｋｂｐのＤＮＡ断片を精製した。
　精製したＤＮＡ断片をクローニングベクターＰＣＲ－Ｂｌｕｎｔ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）にライゲーションした。これを大腸菌に形質転換後プラスミドを回収し、増幅された遺伝子断片が目的配列と一致することをシークエンスで確認した。目的配列と一致したプラスミドをＳａｃＩ及びＸｈｏＩ制限酵素で処理し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ　Ｇｅｌ　Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔで精製後、目的遺伝子配列を、ＳａｃＩ、ＸｈｏＩ制限酵素で処理した大腸菌用発現ベクターｐＥＴ３０ａ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）に挿入した。このベクターの使用によりＨｉｓタグ融合型の組換えタンパク質が産生できる。このプラスミドを発現用大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換し、１ｍＭ　ＩＰＴＧによる発現誘導を行うことで目的タンパク質を大腸菌内で発現させた
　（２）組換えタンパク質の精製
　上記で得られた、配列番号１の遺伝子を発現するそれぞれの組換え大腸菌を３０μｇ／ｍｌ　カナマイシン含有ＬＢ培地にて６００ｎｍでの吸光度が０．７付近になるまで３７℃で培養後、イソプロピル－β－Ｄ－１－チオガラクトピラノシド終濃度が１ｍＭとなるよう添加し、３７℃で４時間培養した。その後４８００ｒｐｍで１０分間遠心し集菌した。この菌体ペレットをリン酸緩衝化生理食塩水に懸濁し、さらに４８００ｒｐｍで１０分間遠心し菌体の洗浄を行った。
　この菌体をリン酸緩衝化生理食塩水に懸濁し、氷上にて超音波破砕を行った。大腸菌超音波破砕液を６０００ｒｐｍで２０分間遠心分離し、得られた上清を可溶性画分、沈殿物を不溶性画分とした。
　可溶性画分を、定法に従って調整したニッケルキレートカラム（担体：Ｃｈｅｌａｔｉｎｇ　Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）Ｆａｓｔ　Ｆｌｏｗ（ＧＥ　ＨｅａｌｔｈＣａｒｅ社）、カラム容量５ｍｌ、平衡化緩衝液５０ｍＭ　塩酸緩衝液（ｐＨ８．０））に添加した。未吸着画分をカラム容量の１０倍量の５０ｍＭ　塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）と２０ｍＭ　イミダゾール含有２０ｍＭ　リン酸緩衝液（ｐＨ８．０）にて洗浄操作を行った後、直ちに、１００ｍＭ　イミダゾール含有２０ｍＭ　リン酸緩衝液（ｐＨ８．０）にて６ベッド溶出した。クマシー染色によって目的タンパク質の溶出を確認した１００ｍＭ　イミダゾール含有２０ｍＭ　リン酸緩衝液（ｐＨ８．０）溶出画分を強陰イオン交換カラム（担体：Ｑ　Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）Ｆａｓｔ　Ｆｌｏｗ（ＧＥ　ＨｅａｌｔｈＣａｒｅ社）、カラム容量５ｍｌ、平衡化緩衝液としての２０ｍＭ　リン酸緩衝液（ｐＨ８．０））に添加した。未吸着画分をカラム容量の１０倍量の２０ｍＭ　リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）と２００ｍＭ　塩化ナトリウム含有２０ｍＭ　リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）にて洗浄操作を行った後、直ちに、４００ｍＭ　塩化ナトリウム含有２０ｍＭ　リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）にて５ベッド溶出を行い、配列番号２に示されるアミノ酸配列を有する各タンパク質の精製画分を得た。
　上記方法によって得られた各精製標品のうち、２００μｌを１ｍｌの反応用緩衝液（２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－Ｈｃｌ，　５０ｍＭ　ＮａＣｌ，　２ｍＭ　ＣａＣｌ２　ｐＨ７．４）に分注を行った後、エンテロキナーゼ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）２μｌ添加した後、室温にて一晩静置、反応を行い、Ｈｉｓタグを切断し、Ｅｎｔｅｒｏｋｉｎａｓｅ　Ｃｌｅａｖａｇｅ　Ｃａｐｔｕｒｅ　Ｋｉｔ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）を用いて添付プロトコールに従って精製を行った。次に、上記方法によって得られた精製標品１．２ｍｌを、限外ろ過ＮＡＮＯＳＥＰ　１０Ｋ　ＯＭＥＧＡ（ＰＡＬＬ社製）を用いて、生理用リン酸緩衝液（日水製薬社製）置換した後、ＨＴタフリンアクロディスク０．２２μｍ（ＰＡＬＬ社製）にて無菌ろ過を行い、これを以下の実験に用いた。
　実施例３　ＣＡＰＲＩＮ－１に対するニワトリモノクローナル抗体の作製
　実施例２で調製した配列番号２に示される、抗原タンパク質（ヒトＣＡＰＲＩＮ－１）３００μｇを等量のフロイントの完全アジュバントと混合し、これをニワトリ１羽当たりの抗原溶液とした。抗原溶液を７週齢のニワトリの腹腔内に投与後、４週間毎に７回投与を行い免疫を完了した。最後の免疫から４日後に摘出したそれぞれの脾臓を滅菌した２枚のスライドガラスに挟んで擦り潰し、ＰＢＳ（－）（日水社製）を用いて洗浄し１５００ｒｐｍで１０分間遠心して上清を除去する操作を３回繰り返して脾臓細胞を得た。得られた脾臓細胞と鳥類細網内皮症ウイルスを用いてニワトリから形質転換法により樹立した、軽鎖が欠損しているニワトリミエローマ細胞とを５：１の比率にて混和し、そこに３７℃に加温した１０％　ＦＢＳを含むＩＭＤＭ培地２００μｌとＰＥＧ１５００（ベーリンガー社製）８００μｌを混和して調製したＰＥＧ溶液を加えて５分間静置して細胞融合を行った。１７００ｒｐｍで５分間遠心し、上清を除去後、Ｇｉｂｃｏ社製のＨＡＴ溶液を２％当量加えた１０％　ＦＢＳを含むＩＭＤＭ培地（ＨＡＴ選択培地）３００ｍｌで細胞を懸濁し、９６穴プレート（ヌンク社製）の１ウェル当たり１００μｌずつ、プレート３０枚に播種した。７日間、３７℃、５％　ＣＯ２の条件で培養することで、脾臓細胞とニワトリミエローマ細胞が融合したハイブリドーマを得た。
　作製したハイブリドーマが産生する抗体のＣＡＰＲＩＮ－１タンパクに対する結合親和性を指標にハイブリドーマを選抜した。実施例２で調製したＣＡＰＲＩＮ－１タンパク溶液１μｇ／ｍｌを９６穴プレート１ウェル当たりに１００μｌ添加し、４℃にて１８時間静置した。各ウェルをＰＢＳ－Ｔで３回洗浄後、０．５％　Ｂｏｖｉｎｅ　Ｓｅｒｕｍ　Ａｌｂｕｍｉｎ（ＢＳＡ）溶液（シグマ社製）を１ウェル当たり４００μｌ添加して室温にて３時間静置した。溶液を除いて、１ウェル当たり４００μｌのＰＢＳ－Ｔでウェルを３回洗浄後、上記で得られたハイブリドーマの各培養上清を１ウェル当たり１００μｌ添加し、室温にて２時間静置した。ＰＢＳ－Ｔで各ウェルを３回洗浄した後、ＰＢＳで５０００倍に希釈したＨＲＰ標識抗ニワトリＩｇＹ抗体（ＳＩＧＭＡ社製）を１ウェル当たり１００μｌ添加して室温にて１時間静置した。ＰＢＳ－Ｔでウェルを３回洗浄した後、ＴＭＢ基質溶液（Ｔｈｅｒｍｏ社製）を１ウェル当たり１００μｌ添加して１５～３０分間静置して発色反応を行った。発色後、１規定硫酸を１ウェル当たり１００μｌ添加して反応を停止させ吸光度計を用いて４５０ｎｍと５９５ｎｍの吸光度値を測定した。その結果、吸光度値が高かった抗体を産生するハイブリドーマを複数個選抜した。
　選抜したハイブリドーマを９６穴プレート１ウェル当たりに０．５個となるようにプレートに添加し培養した。１週間後、ウェル中に単一のコロニーを形成しているハイブリドーマが観察された。それらウェルの細胞をさらに培養して、クローニングされたハイブリドーマが産生する抗体のＣＡＰＲＩＮ－１タンパクに対する結合親和性を指標にハイブリドーマを選抜した。実施例２で調製したＣＡＰＲＩＮ－１タンパク溶液１μｇ／ｍｌを９６穴プレート１ウェル当たりに１００μｌ添加し、４℃にて１８時間静置した。各ウェルをＰＢＳ－Ｔで３回洗浄後、０．５％　ＢＳＡ溶液を１ウェル当たり４００μｌ添加して室温にて３時間静置した。溶液を除いて、１ウェル当たり４００μｌのＰＢＳ－Ｔでウェルを３回洗浄後、上記で得られたハイブリドーマの各培養上清を１ウェル当たり１００μｌ添加し、室温にて２時間静置した。ＰＢＳ－Ｔで各ウェルを３回洗浄後、ＰＢＳで５０００倍に希釈したＨＲＰ標識抗ニワトリＩｇY抗体（ＳＩＧＭＡ社製））を１ウェル当たり１００μｌ添加して室温にて１時間静置した。ＰＢＳ－Ｔでウェルを３回洗浄した後、ＴＭＢ基質溶液（Ｔｈｅｒｍｏ社製）を１ウェル当たり１００μｌ添加して１５～３０分間静置して発色反応を行った。発色後、１規定硫酸を１ウェル当たり１００μｌ添加して反応を停止させ吸光度計を用いて４５０ｎｍと５９５ｎｍの吸光度値を測定した。その結果、ＣＡＰＲＩＮ－１タンパクに反応性を示すモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ株を複数個得た。
　次にそれらモノクローナル抗体の内、ＣＡＰＲＩＮ－１が発現する乳癌細胞の細胞表面に反応性を示すものを選抜した。具体的には、５×１０５個のヒト乳癌細胞株ＭＤＡ－ＭＢ－２３１Ｖを１．５ｍｌ容のミクロ遠心チューブにて遠心分離し、これに上記各ハイブリドーマの培養上清１００μｌを添加し、氷上で１時間静置した。ＰＢＳで洗浄した後、０．１％　ＦＢＳを含むＰＢＳで３０倍希釈したＦＩＴＣ標識ヤギ抗ニワトリＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体（ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈ社製）を添加し、氷上で１時間静置した。ＰＢＳで洗浄後、ベクトンディッキンソン株式会社のＦＡＣＳキャリバーにて蛍光強度を測定した。一方、上記と同様の操作を、ハイブリドーマ培養用培地を用いて行い、コントロールのサンプルとした。その結果、コントロールに比べて蛍光強度が強い、すなわち、ＣＡＰＲＩＮ－１を発現する乳癌細胞の細胞表面に反応するモノクローナル抗体１個（モノクローナル抗体＃１）を選抜した。
　実施例４　選抜した抗体の特徴付け
　（１）抗ＣＡＰＲＩＮ－１モノクローナル抗体の可変領域遺伝子のクローニング
　実施例３で選抜した、ＣＡＰＲＩＮ－１を発現する乳癌細胞の細胞表面に反応するモノクローナル抗体を産生するニワトリ由来ハイブリドーマ株から、ｍＲＮＡを抽出し、ニワトリＦＲ１由来配列及びニワトリＦＲ４由来の配列に特異的なプライマーを使用したＲＴ－ＰＣＲ法により、本抗体の重鎖可変（ＶＨ）領域及び軽鎖可変（ＶＬ）領域の遺伝子を取得した。また、ＣＡＰＲＩＮ－１を発現する乳癌細胞の細胞表面に反応するモノクローナル抗体を産生するマウス由来ハイブリドーマ株２株から、ｍＲＮＡを抽出し、マウスＦＲ１由来配列及びマウスＦＲ４由来の配列に特異的なプライマーを使用したＲＴ－ＰＣＲ法により、各抗体の重鎖可変（ＶＨ）領域及び軽鎖可変（ＶＬ）領域の遺伝子を取得した。配列決定のために、それら遺伝子をｐＣＲ２．１ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）にクローニングした。
　（１）－１　ＲＴ－ＰＣＲ
１０６個の各ハイブリドーマ株から、Ｈｉｇｈ　Ｐｕｒｅ　ＲＮＡ　Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ社製）を用いて全ＲＮＡを抽出した後、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔＩＩ　１ｓｔ　ｓｔｒａｎｄ　ｃＤＮＡ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　Ｋｉｔ（Ｔａｋａｒａ社製）を用いてｃＤＮＡを合成した。これら操作は各キットの添付プロトコールに従って行った。
　合成したｃＤＮＡを鋳型としＫＯＤ－Ｐｌｕｓ－ＤＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ(ＴＯＹＯＢＯ社製)を用いて、常法に従い、ＰＣＲ法にて、ニワトリ抗体重鎖遺伝子可変領域及びニワトリ抗体軽鎖遺伝子可変領域、マウス抗体重鎖遺伝子可変領域及びマウス抗体軽鎖遺伝子可変領域をそれぞれ増幅した。
　ニワトリ抗体のＶＨ領域の遺伝子取得のために、ニワトリ重鎖ＦＲ１配列に特異的なプライマー及びニワトリ重鎖ＦＲ４配列に特異的なプライマーを使用した。またＶＬ領域の遺伝子取得のために、ニワトリ軽鎖ＦＲ１配列に特異的なプライマー及びニワトリ軽鎖ＦＲ４に特異的なプライマーを使用した。マウス抗体のＶＨ及びＶＬ領域の遺伝子取得も同様に、マウス重鎖ＦＲ１配列に特異的なプライマー、マウス重鎖ＦＲ４配列に特異的なプライマー及びマウス軽鎖ＦＲ１配列に特異的なプライマー及びマウス軽鎖ＦＲ４に特異的なプライマーを使用した。
　上記で得られた各ＰＣＲ産物を用いてアガロースゲルにて電気泳動を行い、ＶＨ領域及びＶＬ領域それぞれのＤＮＡバンドを切り出した。ＤＮＡ断片はＱＩＡｑｕｉｃｋ　Ｇｅｌ　ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いてその添付プロトコールに従って行った。精製した各ＤＮＡはＴＡクローニングキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いてｐＣＲ２．１ベクターにクローニングした。連結したベクターをＤＨ５・コンピテントセル（ＴＯＹＯＢＯ社製）に定法に従い形質転換を行った。各形質転換体それぞれ１０クローンを培地（１００μｇ／ｍｌアンピシリン）で３７℃一晩培養後、各プラスミドＤＮＡをＱｉａｓｐｉｎ　Ｍｉｎｉｐｒｅｐ　ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて精製した。
　（１）－２　配列決定
　上記で得られた各プラスミド中のＶＨ領域及びＶＬ領域の遺伝子配列解析は、Ｍ１３フォワードプライマー（配列番号４７）及びＭ１３リバースプライマー（配列番号４８）を用いて、蛍光シーケンサー（ＡＢＩ社製ＤＮＡシーケンサー３１３０ＸＬ）により、ＡＢＩ社製のビッグダイターミネーターＶｅｒ３．１サイクルシーケンシングキットを用いて、その添付プロトコールに従い行った。その結果、各々の遺伝子配列が決定された（各々１０クローンで一致）。
　得られたニワトリ由来モノクローナル抗体の重鎖可変領域をコードする遺伝子配列を配列番号４９に及びそのアミノ酸配列を配列番号４２に、並びに軽鎖可変領域をコードする遺伝子配列を配列番号５０に及びそのアミノ酸配列を配列番号４６に示す。
　すなわち、モノクローナル抗体＃１は配列番号４２の重鎖可変領域と配列番号４６の軽鎖可変領域から成り、そのうち、重鎖可変領域中のＣＤＲ１～３がそれぞれ配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１のアミノ酸配列から成り、軽鎖可変領域中のＣＤＲ１～３がそれぞれ配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５のアミノ酸配列から成ることが確認された。
　（２）ヒト－ニワトリキメラ組換え抗体及びマウス－ニワトリキメラ抗体の作製
　上記（１）で得られた、配列番号４２で示されるニワトリモノクローナル抗体＃１の重鎖可変領域の遺伝子増幅断片の両端を制限酵素処理した後精製し、配列番号５１を含むニワトリ抗体由来のリーダー配列と配列番号５２を含むヒトＩｇＧ１のＨ鎖定常領域を既に挿入済みのｐｃＤＮＡ４／ｍｙｃ－Ｈｉｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）ベクターへ常法に従って挿入した。また、配列番号：４６で示されるにニワトリモノクローナル抗体＃１の軽鎖可変領域の遺伝子増幅断片の両端を制限酵素処理した後精製し、配列番号５１を含むニワトリ抗体由来のリーダー配列と配列番号５３を含むヒトＩｇＧ１のＬ鎖定常領域を既に挿入済みのｐｃＤＮＡ３．１／ｍｙｃ－Ｈｉｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）ベクターへ常法に従って挿入した。
　次に、配列番号４２で示されるニワトリモノクローナル抗体＃１の重鎖可変領域が挿入された上記組換えベクターと、配列番号：４６で示されるニワトリモノクローナル抗体＃１の軽鎖可変領域が挿入された上記組換えベクターをＣＨＯ－Ｋ１細胞（理研セルバンクより入手）に導入した。具体的には、１２穴培養プレートの１ウェル当たりに１ｍｌの１０％ＦＢＳを含むＨａｍ’ｓＦ１２培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）で培養された２×１０５個のＣＨＯ－Ｋ１細胞をＰＢＳ（－）で洗浄したのちに、１ウェル当たり１ｍｌの１０％ＦＢＳを含むＨａｍ’ｓＦ１２培地を新たに加えたウェルに３０μｌのＯｐｔｉＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）に溶解した上記各ベクター２５０ｎｇとＰｏｌｙｆｅｃｔ　ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ　ｒｅａｇｅｎｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）３０μｌとを混合したものを添加した。上記組換えベクターを導入したＣＨＯ－Ｋ１細胞を、２００μｇ／ｍｌゼオシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）並びに２００μｇ／ｍｌジェネチシン（Ｒｏｃｈｅ社製）を添加した１０％ＦＢＳを含むＨａｍ’ｓＦ１２培地で培養したのち、９６ウェルプレートの１ウェル当たりに０．５個となるように上記組換えベクターを導入したＣＨＯ－Ｋ１細胞を播種して、ニワトリモノクローナル抗体＃１の可変領域を有するヒト－ニワトリキメラ抗体＃１（＃１）を安定的に産生する細胞株を作製した。作製した細胞株を１５０ｃｍ２フラスコを用いて５×１０５個／ｍｌで血清を含まないＯｐｔｉＣＨＯ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）３０ｍｌを用いて５日間培養し、＃１を含む培養上清を得た。
　同様にして、配列番号４２で示されるニワトリモノクローナル抗体＃１の重鎖可変領域の遺伝子増幅断片の両端を制限酵素処理した後精製し、ニワトリ抗体由来のリーダー配列とマウスＩｇＧ１のＨ鎖定常領域を既に挿入済みのｐｃＤＮＡ４／ｍｙｃ－Ｈｉｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）ベクターへ常法に従って挿入した。また、配列番号４６で示されるにニワトリモノクローナル抗体＃１の軽鎖可変領域の遺伝子増幅断片の両端を制限酵素処理した後精製し、ニワトリ抗体由来のリーダー配列とマウスＩｇＧ１のＬ鎖定常領域を既に挿入済みのｐｃＤＮＡ３．１／ｍｙｃ－Ｈｉｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）ベクターへ常法に従って挿入した。これらを上記と同様にＣＨＯ－Ｋ１細胞に導入してニワトリモノクローナル抗体＃１の可変領域を有するマウス－ニワトリキメラ抗体＃１を安定的に産生する細胞株を作製し、これを１５０ｃｍ２フラスコを用いて５×１０５個／ｍｌで血清を含まないＯｐｔｉＣＨＯ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）３０ｍｌを用いて５日間培養し、マウス－ニワトリキメラ抗体＃１を含む培養上清を得た。
　（３）抗ＣＡＰＲＩＮ－１抗体＃１を用いた各種癌細胞表面でのＣＡＰＲＩＮ－１の発現
　次にＣＡＰＲＩＮ－１遺伝子の発現が確認された乳癌細胞株７種（ＭＤＡ－ＭＢ－１５７，Ｔ４７Ｄ，ＭＲＫ－ｎｕ－１，ＭＤＡ－ＭＢ－２３１Ｖ，ＢＴ２０，ＳＫ－ＢＲ－３，ＤＡ－ＭＢ－２３１Ｔ）及びその他の乳癌細胞株３種（ＭＤＡ－ＭＢ－２３１Ｃ，ＭＣＦ－７，ＺＲ７５－１）、グリオーマ細胞株５種（Ｔ９８Ｇ，ＳＮＢ１９，Ｕ２５１，Ｕ８７ＭＧ，Ｕ３７３）、腎臓癌細胞株４種（Ｃａｋｉ－１，Ｃａｋｉ－２，Ａ４９８，ＡＣＨＮ）、胃癌細胞株２種（ＭＮＫ２８，ＭＮＫ４５）、大腸癌細胞株５種（ＨＴ２９，ＬｏＶｏ，Ｃａｃｏ２，ＳＷ４８０，ＨＣＴ１１６）、肺癌細胞株３種（Ａ５４９、ＱＧ５６、ＰＣ８）、白血病細胞株４種（ＡＭＬ５，Ｎａｍａｌｗａ、ＢＤＣＭ、ＲＰＩ１７８８）、リンパ腫細胞株１種（Ｒａｍｏｓ）、子宮頸癌細胞株１種（ＳＷ７５６）、膀胱癌細胞株１種（Ｔ２４）及び食道癌細胞株１種（ＫＹＳＥ１８０）について、上記（２）で得られた＃１を含むＣＨＯ－Ｋ１細胞の培養上清を用いて、各細胞の細胞表面上でのＣＡＰＲＩＮ－１タンパク質の発現を調べた。各細胞株それぞれ１０６細胞を１．５ｍｌ容のミクロ遠心チューブにて遠心分離した。上記（２）で得られた＃１を含むＣＨＯ－Ｋ１細胞の培養上清（１００μｌ）を添加し、氷上で１時間静置した。ＰＢＳで洗浄した後、０．１％　ＦＢＳを含むＰＢＳで５００倍希釈したＦＩＴＣ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体（ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈ社製）及びＦＩＴＣ標識抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を添加し、氷上で１時間静置した。ＰＢＳで洗浄後、ベクトンディッキンソン株式会社のＦＡＣＳキャリバーにて蛍光強度を測定した。一方、上記と同様の操作を、抗体遺伝子が導入されていないＣＨＯ－Ｋ１細胞の培養上清並びにハイブリドーマ培養用の培地を用いて行い、陰性コントロールとした。その結果、＃１の抗体を添加された細胞は、コントロールに比べて、いずれも蛍光強度が２０％以上強かった。具体的な例を挙げると、ＳＫ－ＢＲ－３が４９００％、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１Ｖが５０００％の蛍光強度の増強を示した。このことから、上記ヒト癌細胞株の細胞膜表面上にＣＡＰＲＩＮ－１タンパクが発現していることが確認された。なお、上記蛍光強度の増強率は、各細胞における平均蛍光強度（ＭＦＩ値）の増加率にて表され、以下の計算式により算出した。
　平均蛍光強度の増加率（蛍光強度の増強率）（％）＝（（抗ヒトＣＡＰＲＩＮ－１抗体を反応させた細胞のＭＦＩ値）－（コントロールＭＦＩ値））÷（コントロールＭＦＩ値）×１００。
　（４）抗ＣＡＰＲＩＮ－１抗体＃１の癌細胞に対する抗腫瘍効果（ＡＤＣＣ活性）
　次に、ＣＡＰＲＩＮ－１に対する抗体＃１の癌細胞に対する細胞障害活性（ＡＤＣＣ活性）を評価した。上記（２）で得た＃１を産生する細胞培養上清をＨｉｔｒａｐ　ＰｒｏｔｅｉｎＡ　ＳｅｐｈａｒｏｓｅＦＦ（ＧＥヘルスケア社製）を用いて精製し、ＰＢＳ（－）に置換して０．２２μｍのフィルター（ミリポア社製）で濾過したものを活性測定用の抗体として用いた。１０６個のヒト乳癌細胞株ＭＤＡ－ＭＢ－１５７を５０ｍｌ容の遠心チューブに集め、１００μＣｉのクロミウム５１を加え３７℃で２時間インキュベートした。その後１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地で３回洗浄し、９６穴Ｖ底プレート１穴あたり５×１０３個ずつ添加して標的細胞とした。これに、上記精製抗体を最終濃度が１μｇ／ｍｌとなるよう添加し、さらにヒト末梢血から常法に従って分離したリンパ球を２．５×１０５個添加して、３７℃、５％　ＣＯ２の条件下で４時間培養した。培養後、障害を受けた癌細胞から放出される培養上清中のクロミウム５１の量を測定し、抗ＣＡＰＲＩＮ－１抗体による癌細胞に対するＡＤＣＣ活性を算出した。陰性コントロールには抗体の代わりにＰＢＳを添加したもの、アイソタイプコントロール抗体を添加したものを用いた。その結果、＃１の抗体は、ＭＤＡ－ＭＢ－１５７に対して３０％以上の細胞障害活性を示した（図２参照）。なお、陰性コントロールであるＰＢＳを添加したもの、アイソタイプコントロール抗体を添加したものの活性は、それぞれ１．１％、２．０％であった。同様にして、他の癌細胞、グリオーマ細胞株Ｔ９８Ｇ、Ｕ３７３、肺癌細胞株Ａ５４９、ＱＧ５６、腎臓癌細胞株Ｃａｋｉ－１、ＡＣＨＮ、子宮頸癌細胞株ＳＷ７５６、膀胱癌細胞株Ｔ２４、食道癌細胞株ＫＹＳＥ１８０、胃癌細胞株ＭＮＫ２８、ＭＮＫ４５、大腸癌細胞株ＳＷ４８０、白血病細胞株ＡＭＬ５及びリンパ腫細胞株Ｒａｍｏｓに対する抗体＃１のＡＤＣＣ活性を調べた結果、Ｔ９８Ｇに対して、１６．４％（アイソタイプコントロールは１．２％）、Ｕ３７３に対して２３．１％（アイソタイプコントロールは３．２％）、Ａ５４９に対して３６．１％（アイソタイプコントロールは３．０％）、ＱＧ５６に対して３３．５％（アイソタイプコントロールは０．５％）、Ｃａｋｉ－１に対して２８．３％（アイソタイプコントロールは２．６％）、ＡＣＨＮに対して２５．１％（アイソタイプコントロールは１．６％）、ＳＷ７５６に対して２７．９％（アイソタイプコントロールは２．２％）、Ｔ２４に対して２５．８％（陰性コントロールは２．０％）、ＫＹＳＥ１８０に対して、２６．７％（アイソタイプコントロールは３．０％）、ＭＮＫ２８に対して２１．５％（アイソタイプコントロールは１．９％）、ＭＮＫ４５に対して２３．０％（アイソタイプコントロールは３．０％）、ＳＷ４８０に対して、２４．０％（アイソタイプコントロールは１．８％）、ＡＭＬ５に対して８．３％（アイソタイプコントロールは１．８％）及びＲａｍｏｓに対して８．０％（アイソタイプコントロールは２．２％）の活性を示した。以上の結果より、取得した抗ＣＡＰＲＩＮ－１抗体＃１は、ＣＡＰＲＩＮ－１を発現する各種ヒト癌細胞を障害することが示された。
　（５）抗ＣＡＰＲＩＮ－１抗体＃１の癌細胞に対する抗腫瘍効果（ＣＤＣ活性）
　次に、ＣＡＰＲＩＮ－１に対する抗体＃１の癌細胞に対する細胞障害活性（ＣＤＣ活性）を評価した。ウサギから採血した血液をエッペンドルフチューブに入れ、室温で６０分間、静置した後３０００ｒｐｍで５分間、遠心分離することで、ＣＤＣ活性測定用の血清を調製した。ヒト乳癌細胞であるＭＤＡ－ＭＢ－２３１Ｖを１０６個を５０ｍｌ容の遠心チューブに集め、１００μＣｉのクロミウム５１を加え３７℃で２時間インキュベートした後、１０％　ＦＢＳを含むＲＰＭＩ培地で３回洗浄した。その後上記で調製したウサギ血清を５０％含むＲＰＭＩ培地で懸濁し、９６穴Ｖ底プレート１穴あたり５×１０３個ずつ添加した。これに上述（５）で得た＃１を最終濃度が１μｇ／ｍｌとなるよう添加して、３７℃、５％　ＣＯ２の条件下で４時間培養した。培養後、障害を受けた腫瘍細胞から放出される培養上清中のクロミウム５１の量を測定し、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１Ｖに対するＣＤＣ活性を算出した。その結果、＃１の抗体は、２５％以上のＣＤＣ活性を示した。したがって、＃１は、ＣＤＣ活性によっても、ＣＡＰＲＩＮ－１を発現する癌細胞を障害することができることが明らかになった。
　実施例５　マウス生体内における抗ＣＡＰＲＩＮ－１抗体＃１の抗腫瘍効果
　次に、取得したＣＡＰＲＩＮ－１に対する抗体＃１の担癌マウス生体内における抗腫瘍効果を評価した。使用した抗体は上記と同様に、＃１を産生する各細胞の培養上清をカラム精製したものを用いた。
　ＣＡＰＲＩＮ－１を発現するマウス由来の癌細胞株を移植した担癌マウスを用いて、＃１の抗体の抗腫瘍効果を検討した。２０匹のＢａｌｂ／ｃマウス（日本ＳＬＣ社製）の背部皮下に、１匹あたり５×１０５個の４Ｔ１細胞（ＡＴＣＣより購入）を移植し、癌が直径５ｍｍ程度の大きさになるまで成長させた。その内、１０匹の担癌マウスに対して、＃１の抗体を１匹あたり２００μｇ（２００μｌ）ずつ、腹腔内投与した。その後、２日間計３回、同量の抗体を各担癌マウスの腹腔に投与し、毎日癌の大きさを計測し、抗腫瘍効果を観察した。一方、残り１０匹の担癌マウスに対して、抗体の代わりにＰＢＳ（－）を投与し、これをコントロール群とした。抗腫瘍効果の観察の結果、ＣＡＰＲＩＮ－１に対する抗体＃１を投与した検討群は、癌が抗体投与開始時の腫瘍体積を１００％とした場合に、４日目には５５％程度にまで退縮し、６日目には３２％程度、８日目には７％程度にまで癌が退縮し、１０～１４日目までには癌はほぼ完全に退縮した（図３参照）。一方、ＰＢＳ（－）を投与したコントロール群では、４日目、６日目、８日目、１１日目にはそれぞれ、約１７０％、２７０％、４４０％、６７０％にまで癌が増大した（図３参照）。この結果から、取得した＃１の抗体は、ＣＡＰＲＩＮ－１を発現する癌細胞に対して、生体内で強い抗腫瘍効果を発揮することが示された。なお、癌の大きさは、長径×短径×短径×０．５の計算式を用いて、体積を算出した。
　本発明の抗体は、癌の治療及び／又は予防のため有用である。
　本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
　配列番号３１～３８、４７、４８：プライマー

Claims (8)

  1. 　配列番号３９、４０及び４１を含む重鎖可変領域と配列番号４３、４４及び４５を含む軽鎖可変領域とを含み、かつ、ＣＡＰＲＩＮ－１タンパク質と免疫学的反応性を有する抗体又はそのフラグメントを有効成分として含むことを特徴とする、癌の治療及び／又は予防のための医薬組成物。
  2. 　前記癌が乳癌、脳腫瘍、白血病、リンパ腫、肺癌、肥満細胞腫、腎癌、子宮頸癌、食道癌、胃癌、膀胱癌もしくは大腸癌である、請求項１に記載の医薬組成物。
  3. 　前記抗体が、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、単鎖抗体又は二重特異性抗体である、請求項１又は２に記載の医薬組成物。
  4. 　配列番号３９、４０及び４１を含む重鎖可変領域と配列番号４３、４４及び４５を含む軽鎖可変領域とを含み、かつ、ＣＡＰＲＩＮ－１タンパク質と免疫学的反応性を有する抗体。
  5. 　ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、単鎖抗体又は二重特異性抗体である、請求項４に記載の抗体。
  6. 　請求項１～３のいずれか１項に記載の医薬組成物と、抗腫瘍剤を含む医薬組成物とを含んでなる、癌の治療及び／又は予防のための組み合わせ医薬品。
  7. 　請求項１～３のいずれか１項に記載の医薬組成物、あるいは、請求項３～５のいずれか１項に記載の抗体又はそのフラグメントを、被験者に投与することを含む、癌の治療及び／又は予防方法。
  8. 　被験者において請求項６に記載の組み合わせ医薬品の各医薬組成物を併用することを含む、癌の治療及び／又は予防方法。
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