BR112012019098B1 - anticorpo, composição farmacêutica, combinação farmacêuticae usos de um anticorpo, de uma composição farmacêutica e de uma combinação farmacêutica - Google Patents

Abstract

COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, COMBINAÇÃO FARMACÊUTICA E MÉTODO PARA O TRATAMENTO E/OU PREVENÇÃO DE UM CÂNCER E ANTICORPO. DE ACORDO COM A PRESENTE INVENÇÃO, UMA PROTEÍNA ANTÍGENO DO CÂNCER QUE É ESPECIFICAMENTE EXPRESSA SOBRE AS SUPERFÍCIES DE CÉLULAS CANCEROSAS FOI IDENTIFICADA E, PORTANTO, É FORNECIDO O USO DE ANTICORPO DIRECIONADO CONTRA A PROTEÍNA ANTÍGENO DO CÂNCER. ESPECIFICAMENTE, A PRESENTE INVENÇÃO FORNECE UMA COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA PARA O TRATAMENTO E/OU PREVENÇÃO DE UM CÂNCER, QUE COMPREENDE UM ANTICORPO COMPREENDENDO UMA REGIÃO VARIÁVEL DE CADEIA PESADA QUE COMPREENDE AS SEQ ID NOS: 39, 40 E 41 E UMA REGIÃO VARIÁVEL DE CADEIA LEVE QUE COMPREENDE AS SEQ ID NOS: 43, 44 E 45 OU UM FRAGMENTO DESTAS COMO INGREDIENTE ATIVO E POSSUINDO REATIVIDADE IMUNOLÓGICA COM UMA PROTEÍNA CAPRIN-1.

Description

[001] A presente invenção refere-se a uma nova utilização farmacêutica de um anticorpo contra CAPRIN-1 ou fragmento do mesmo, tal como um agente para tratar e/ou prevenir um câncer.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[002] O câncer é a principal causa de morte. A terapia realizada atualmente compreende principalmente a terapia cirúrgica em combinação com a radioterapia e quimioterapia. Apesar do desenvolvimento de novos procedimentos cirúrgicos e a revelação de novos agentes anticâncer nos últimos anos, com exceção de alguns tipos de cânceres, os resultados de tratar não têm melhorado. Recentes avanços na biologia molecular ou imunologia do câncer levaram a identificação de anticorpos que reagem especificamente com o câncer, antígenos de cânceres que são reconhecidos pelas células T citotóxicas, genes que codificam antígenos do câncer e similares. A demanda por terapias específicas direcionadas contra antígenos do câncer está aumentando (literatura não patentária 1).

[003] Na terapia do câncer, é desejável que os peptídeos, polipeptídeos ou proteínas reconhecidas como antígenos estejam quase ausentes em células normais, mas presentes especificamente nas células cancerosas, a fim de aliviar os efeitos colaterais. Em 1991, Boon, et al. (Instituto Ludwig Para Pesquisa do Câncer na Bélgica) isolaram um antígeno de melanoma humano MAGE1 reconhecido pelas células T CD8-positivas por um método de clonagem por expressão de cDNA utilizando uma linhagem de células autólogas de câncer e células T reativas ao câncer (Literatura não patentária 2). Posteriormente, foi descrito o método SEREX (identificação sorológica de antígenos pela clonagem de expressão recombinante), que compreendia a identificação de antígenos tumorais reconhecidos pelos anticorpos que são produzidos in vivo em resposta ao câncer autólogo de um câncer do próprio paciente por uma técnica de clonagem da expressão gênica (Literatura não patentária 3 e Literatura Patentária 1). Com a utilização deste método, alguns antígenos do câncer, que quase nunca são expressos nas células normais, mas que são expressos especificamente em células cancerosas, foram isolados (Literaturas não patentárias 4-9). Além disso, foram realizados ensaios clínicos baseados em terapias com células direcionadas contra alguns antígenos de câncer utilizando imunócitos especificamente reativos aos antígenos de câncer ou com imunoterapias câncer-específicas com vacinas ou similares contendo antígenos de câncer.

[004] Por outro lado, nos últimos anos surgiram em todo o mundo diversos medicamentos de anticorpos que têm como alvo proteínas antigênicas em células cancerosas para tratamento do câncer. Os medicamentos de anticorpos exibem alguns efeitos farmacológicos como agentes terapêuticos câncer-específicos e, desse modo, atraem a atenção. No entanto, a maioria das proteínas antígenos usadas como alvo para o anticorpo também são expressas em células normais, de modo que não apenas as células cancerosas, mas também as células normais que expressam tais antígenos são danificadas como resultado da administração dos anticorpos. Os efeitos colaterais resultantes são motivo de preocupação. Portanto, espera-se que a identificação de antígenos para o câncer que são especificamente expressos na superfície de uma célula cancerosa e o uso de anticorpos direcionados aos antígenos do câncer como produtos farmacêuticos irão realizar tratamento com medicamentos de anticorpos com efeitos colaterais mais baixos.

[005] A Proteína associada a proliferação citoplasmática 1 (CAPRIN-1) é expressa quando as células normais na fase de repouso são ativadas ou submetidas a divisão celular, e ela é uma proteína intracelular conhecida por formar grânulos de estresse intracelulares com RNA dentro das células, de modo a estar envolvida no transporte de mRNA e regulação da tradução. Entretanto, existem muitos outros nomes que representam a CAPRIN- 1, tal como a proteína de membrana ancorada a GPI 1 ou proteína marcadora de superfície do componente membrana 1 (M11S1), como se tais proteínas fossem conhecidas por serem proteínas da membrana celular. Estes nomes foram originados a partir de um relato de que a sequência do gene de CAPRIN- 1 é uma proteína de membrana que possui uma região de ligação a GPI e é expressa em células de câncer colorretal (Literatura não patentária 10). No entanto, a sequência genética da CAPRIN-1 fornecida neste relatório foi mais tarde revelada como errada. Em seguida foi relatado que a deleção de um único nucleotídeo na sequência do gene CAPRIN-1 registrado no GenBank ou banco similar provoca uma mudança no quadro, de modo que 80 aminoácidos são perdidos a partir da extremidade C-terminal, o que resulta na geração de um artefato (74 aminoácidos), que corresponde à porção de ligação a GPI no relatório anterior, e, adicionalmente, outro erro também está presente a 5' da sequência gênica, de modo que 53 aminoácidos foram perdidos a partir da extremidade N-terminal (Literatura não patentária 11). Também foi relatado recentemente que a proteína codificada pela sequência gênica de CAPRIN-1 registrada no GenBank ou banco similar não é uma proteína de membrana celular (Literatura não patentária 11).

[006] Além disso, com base no relatório da literatura não patentária 10 de que a CAPRIN-1 é uma proteína da membrana celular, as literaturas patentárias 2 e 3 descrevem que a CAPRIN-1 (como uma proteína de membrana celular), sob o nome de M11S1, pode ser usada como alvo de um medicamento de anticorpo na terapia do câncer, apesar de não descreverem exemplos práticos de tratamento usando um anticorpo contra a proteína. No entanto, conforme relatado na literatura não patentária 11, acredita-se desde o depósito da literatura patentária 2 até a presente data de que a CAPRIN-1 não é expressa sobre a superfície de uma célula. O conteúdo das literaturas patentárias 2 e 3, com base apenas nas informações incorretas de que CAPRIN-1 é uma proteína de membrana celular não deve ser claramente entendido como conhecimento geral comum para os técnicos hábeis no assunto.

LITERATURA DO ESTADO DA TÉCNICA LITERATURA PATENTÁRIA

[007] Literatura Patentária 1: Patente US 5.698.396

[008] Literatura Patentária 2: US2008/0075722

[009] Literatura patentária 3: WO2005/100998.

LITERATURA NÃO PATENTÁRIA

[010] Literatura Não patentária 1: Tsuyoshi Akiyoshi, “Gan To Kagaku-Ryoho (Cancer and Chemotherapy),” 1997, Vol. 24, págs 551-519 (Cancer and Chemotherapy Publishers, Inc., Japão).

[011] Literatura Não Patentária 2: Bruggen P. et al., Science, 254:1643-1647 (1991).

[012] Literatura Não Patentária 3: Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92:11810-11813 (1995).

[013] Literatura Não Patentária 4: Int. J. Cancer, 72:965-971 (1997).

[014] Literatura Não Patentária 5: Cancer Res., 58:1034-1041 (1998).

[015] Literatura Não Patentária 6: Int. J. Cancer, 29:652-658 (1998).

[016] Literatura Não Patentária 7: Int. J. Oncol., 14:703-708 (1999).

[017] Literatura Não Patentária 8: Cancer Res., 56:4766-4772 (1996).

[018] Literatura Não Patentária 9: Hum. Mol. Genet 33-39, 1997.

[019] Literatura Não Patentária 10: J. Biol Chem., 270:20717-20723, 1995.

[020] Literatura Não Patentária 11: J. Immunol., 172:2389-2400, 2004.

DESCRIÇÃO RESUMIDA DA INVENÇÃO PROBLEMAS S SEREM RESOLVIDOS PELA INVENÇÃO

[021] Os objetos da presente invenção são de identificar uma proteína antígeno do câncer que é especificamente expressa sobre a superfície de uma célula de câncer e fornecer o uso de um anticorpo direcionado contra a proteína antígeno do câncer como um agente para tratar e/ou prevenir um câncer.

MODOS PARA RESOLVER OS PROBLEMAS

[022] Como resultado de intensivos estudos, os presentes inventores obtiveram agora um cDNA que codifica uma proteína que se liga a um anticorpo existentes no soro de cães com câncer da mama pelo método SEREX utilizando duas bibliotecas de cDNA preparadas a partir de tecidos de testículo de cão e soro de cães com câncer de mama. Os inventores prepararam adicionalmente proteínas CAPRIN-1 que tem as sequências de aminoácidos de numeração par das SEQ ID NOS: 2 até 30 e anticorpos contra tais proteínas CAPRIN-1 com base no gene de cão obtido e os genes homólogos correspondentes em humano, bovino, cavalo, camundongo, e frango. Desse modo, os inventores da presente invenção revelaram agora que a CAPRIN-1 é especificamente expressa no câncer de mama, tumor cerebral, leucemia, linfoma, câncer de pulmão, câncer de colo uterino, câncer de bexiga, câncer de esôfago, câncer colorretal, câncer gástrico, e câncer de células renais, e que uma porção da proteína CAPRIN-1 é especificamente expressa sobre a superfície de cada célula cancerosa. Os inventores verificaram agora que um anticorpo ou anticorpos contra a porção da CAPRIN-1 expressa sobre a superfície de cada célula cancerosa é/são citotóxicos para as células de câncer expressando a CAPRIN-1. Com base nestes achados, a presente invenção tal como descrita abaixo foi concluída.

[023] A presente invenção tem as seguintes características.

[024] A presente invenção fornece uma composição farmacêutica para tratar e/ou prevenir um câncer, compreendendo um anticorpo que compreende uma região variável de cadeia pesada compreendendo SEQ ID NOS: 39, 40 e 41; e uma região variável de cadeia leve compreendendo SEQ ID NOS: 43, 44, e 45 ou um fragmento das mesmas como ingrediente ativo que tem uma reatividade imunológica com uma proteína CAPRIN-1.

[025] Em um exemplo de realização, o câncer acima é câncer da mama, tumor cerebral, leucemia, linfoma, câncer de pulmão, câncer de colo do útero, câncer de bexiga, câncer de esôfago, câncer colorretal, câncer gástrico ou câncer renal.

[026] Em outro exemplo de realização, o anticorpo acima é um anticorpo humano, anticorpo humanizado, anticorpo quimérico, anticorpo com cadeia única ou anticorpo biespecífico.

[027] Esta descrição inclui parte ou a totalidade do conteúdo conforme divulgado na descrição e/ou desenhos do pedido de patente japonês N° 2010-023452, que é uma literatura do estado da técnica do presente pedido.

EFEITOS DA INVENÇÃO

[028] O anticorpo contra CAPRIN-1 usado na presente invenção é citotóxico para células de câncer. Dessa forma, o anticorpo contra CAPRIN-1 é útil para tratar ou prevenir cânceres.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[029] A Fig. 1 exibe os padrões de expressão de genes codificantes de proteínas CAPRIN-1 em tecidos normais e em linhagens de células tumorais. A Referência N° 1 indica os padrões de expressão de genes codificantes de proteínas CAPRIN-1, e a Referência N° 2 indica os padrões de expressão de genes GAPDH.

[030] A Fig. 2 mostra a citotoxicidade de um anticorpo monoclonal anti-CAPRIN-1 #1 (que é reativo com as superfícies de células cancerosas) contra a linhagem de células de câncer de mama MDA-MB-157 que expressam CAPRIN-1. A Referência N° 3 indica a atividade exibida quando o anticorpo monoclonal anti-CAPRIN-1 #1 foi adicionado. A Referência N° 4 indica a atividade exibida quando foi adicionado PBS em vez dos anticorpos.

[031] A Fig. 3 exibe os efeitos antitumorais do anticorpo monoclonal anti-CAPRIN-1 #1 (que é reativo com a superfície de células de câncer) contra camundongos Balb/c nos quais a linhagem de células de câncer de mama de camundongo 4T1 que expressa CAPRIN-1 foi transplantada. A Referência N° 5 indica o tamanho do tumor de um camundongo ao qual o anticorpo monoclonal anti-CAPRIN-1 #1 foi administrado. A Referência N° 6 indica que o tamanho do tumor de um camundongo ao qual se administrou PBS em vez dos anticorpos.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA PRESENTE INVENÇÃO

[032] A atividade antitumoral de um anticorpo contra um polipeptídeo representado por qualquer uma das sequências de numeração par de SEQ ID NOS: 2 a 30 utilizada na presente invenção pode ser avaliada examinando a supressão do crescimento do tumor in vivo, em animais com câncer, ou, avaliando se o anticorpo exibe citotoxicidade via imunócitos ou complemento para as células tumorais que expressam o polipeptídeo in vitro, tal como descrito mais adiante.

[033] No contexto, as sequências nucleotídicas de polinucleotídeos codificantes de proteínas que compreendem as sequências de aminoácidos de numeração par (ou seja, SEQ ID NOS: 2, 4, 6, ..., 28, 30) das SEQ ID NOS: 2 a 30 são representadas pelas sequências de numeração ímpar (ou seja, SEQ ID NOS: 1, 3, 5, ..., 27, 29) das SEQ ID NOS: 1 a 29.

[034] As sequências de aminoácidos que são representadas pelas SEQ ID NOS: 6, 8, 10, 12 e 14 na Listagem de Sequências divulgadas na presente invenção são as sequências de aminoácidos da CAPRIN-1 isoladas como polipeptídeos que se ligam especificamente a anticorpos existentes no soro de um cão com o câncer, através do método SEREX usando uma biblioteca de cDNA a partir de tecido testicular de cão e o soro de um cão com câncer de mama. As sequências de aminoácidos representadas pelas SEQ ID NOS: 2 e 4 são as sequências de aminoácidos da CAPRIN-1 isoladas como homólogos humano. A sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 16 é a sequência de aminoácidos da CAPRIN-1 isolada na forma de um homólogo de gado. A sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 18 é a sequência de aminoácidos da CAPRIN-1 isolada na forma de um homólogo de cavalo. As sequências de aminoácidos representadas pelas SEQ ID NOS: 20 a 28 são as sequências de aminoácidos da CAPRIN-1 isoladas como homólogos de camundongo. A sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 30 é a sequência de aminoácidos da CAPRIN-1 isolada como um homólogo de frango (vide o Exemplo 1 descrito mais adiante). A CAPRIN-1 é conhecida por ser expressa quando as células normais, na fase de repouso são ativadas ou suscitam a divisão celular.

[035] Sabia-se que a CAPRIN-1 não era expressa sobre superfícies celulares. No entanto, como resultado do exame pelos inventores da presente invenção, foi agora revelado que uma porção da proteína CAPRIN-1 é expressa sobre as superfícies de células de vários tipos de câncer. Assim, foi revelado que um anticorpo com reatividade imunológica com uma região parcial de uma proteína CAPRIN-1 que é expressa na superfície de células de câncer ou que reconhece especificamente a região (isto é, que se liga especificamente à região) e que compreende uma região variável de cadeia pesada compreendendo a SEQ ID NO: 39, 40, e 41 e uma região variável de cadeia leve compreendendo a SEQ ID NO: 43, 44, e 45 exibe atividade antitumoral.

[036] O anticorpo anti-CAPRIN-1 descrito acima utilizado na presente invenção pode ser qualquer tipo de anticorpo monoclonal, contanto que ele possa exibir atividade antitumoral. Exemplos de tal anticorpo incluem anticorpos recombinantes, tal como um anticorpo sintético, um anticorpo multiespecífico, um anticorpo humanizado, um anticorpo quimérico e um anticorpo com cadeia única (scFv), um anticorpo humano, e fragmentos destes anticorpos, tais como Fab, F(ab')2, e Fv. Estes anticorpos e fragmentos dos mesmos podem ser preparados por métodos conhecidos pelos técnicos hábeis no assunto. Além disso, quando um sujeito é um ser humano, anticorpos humanos ou anticorpos humanizados são desejados, a fim de evitar ou suprimir a rejeição.

[037] O termo “se liga especificamente a uma região parcial de uma proteína CAPRIN-1”, conforme utilizado no presente, significa que “o anticorpo se liga especificamente a uma região específica de uma proteína CAPRIN-1 sem se ligar substancialmente a outras porções da proteína que não seja tal região”.

[038] A atividade antitumoral de um anticorpo que pode ser utilizado na presente invenção pode ser avaliada, conforme descrito abaixo pela análise in vivo da supressão do crescimento tumoral em animais com câncer, ou, avaliando se o dito anticorpo exibe ou não uma atividade de citotoxicidade in vitro, a qual é mediada por imunócitos ou complemento, em células tumorais que expressam o polipeptídeo.

[039] Além disso, exemplos de sujeito para tratar e/ou prevenir um câncer da presente invenção, incluem mamíferos, tais como seres humanos, animais de estimação, animais domésticos e animais para competição. Um sujeito preferido é um humano.

[040] A preparação de antígenos, anticorpos e composições farmacêuticas relacionadas com a presente invenção estão descritas abaixo.

PREPARAÇÃO DE ANTÍGENOS PARA A PREPARAÇÃO DE ANTICORPO

[041] As proteínas ou fragmentos das mesmas para serem utilizados como antígenos de sensibilização para a obtenção dos anticorpos anti- CAPRIN-1 utilizados na presente invenção podem ser derivados de qualquer espécie animal, sem limitação particular, tais como humanos, cães, gado, cavalos, camundongos, ratos, e frangos. No entanto, as proteínas ou fragmentos das mesmas são preferencialmente selecionados tendo em consideração a compatibilidade com as células parentais utilizadas para a fusão celular. Em geral, as proteínas derivadas de mamíferos são as preferidas e, em particular, são preferidas proteínas derivadas de humanos. Por exemplo, quando a CAPRIN-1 é a CAPRIN-1 humana, podem ser utilizados; a proteína CAPRIN-1 humana, um peptídeo parcial da mesma, ou células expressando a CAPRIN-1 humana.

[042] As sequências de nucleotídeos e as sequências de aminoácidos da CAPRIN-1 humana e homólogos da mesma podem ser obtidas acessando o GenBank (NCBI, EUA) e utilizando um algoritmo como o BLAST ou FASTA (Karlin e Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci USA, 90:5873-5877 1993; Altschul et al, Nucleic Acids Res, 25:3389-3402, 1997).

[043] Na presente invenção, com base na sequência de nucleotídeos (SEQ ID NO: 1 ou 3), ou a sequência de aminoácidos (SEQ ID NO: 2 ou 4) da CAPRIN-1 humana, um ácido nucleico alvo ou proteína alvo compreende uma sequência com cerca de 70% a 100%, preferencialmente de 80% a 100%, mais preferencialmente de 90% a 100%, ainda mais preferencialmente de 95% a 100% (por exemplo, 97% a 100%, 98% a 100%, 99% a 100%, ou 99,5% a 100%) de identidade de sequência com a sequência de nucleotídeos ou sequência de aminoácidos do ORF ou porção madura da CAPRIN-1 humana. Conforme utilizado no presente, o termo “% de identidade de sequência” refere-se a uma percentagem (%) de aminoácidos (ou nucleotídeos) idênticos em relação ao número total de aminoácidos (ou nucleotídeos) quando duas sequências são alinhadas para alcançar a maior similaridade com ou sem a introdução de gaps (lacunas).

[044] O comprimento de um fragmento da proteína CAPRIN-1 varia a partir do comprimento de aminoácidos de um epítopo (determinante antigênico), que é a unidade mínima reconhecida por um anticorpo, até um comprimento menor do que o comprimento total da proteína. O termo “epítopo” refere-se a um fragmento de polipeptídeo que tem antigenicidade ou imunogenicidade em mamíferos, preferencialmente em seres humanos, e a unidade mínima do epítopo consiste em cerca de 7 a 12 aminoácidos (por exemplo, de 8 a 11 aminoácidos).

[045] Os polipeptídeos compreendendo a proteína CAPRIN-1 humana ou os peptídeos parciais da proteína mencionados acima podem ser sintetizados por um método de síntese química, tais como o método Fmoc (método fluorenilmetiloxicarbonila) ou o método tBoc (método t-butiloxicarbonila) (Editado por pela Sociedade Japonesa de Bioquímica, Seikagaku Jikken Koza (Biochemical Experimental Lecture Series) 1, Protein Chemistry IV, Chemical Modification and Peptide Synthesis, TOKYO KAGAKU DOZIN (Japão), 1981). Alternativamente, os polipeptídeos mencionados acima também podem ser sintetizados por meio de métodos convencionais utilizando vários sintetizadores de peptídeos disponíveis comercialmente. Além disso, com a utilização de técnicas conhecidas de engenharia genética (por exemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning, 2a Edição, Current Protocols in Molecular Biology (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology, 3a Edição, A compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology (1995), John Wiley & Sons), um polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo acima é preparado e, em seguida, incorporado em um vetor de expressão, que é subsequentemente introduzido em uma célula hospedeira a fim de produzir um polipeptídeo de interesse na célula hospedeira, e em seguida, é feita a recuperação deste polipeptídeo.

[046] Os polinucleotídeos codificantes dos polipeptídeos acima podem ser facilmente preparados por técnicas conhecidas da engenharia genética ou por técnicas convencionais usando um sintetizador de ácido nucleico comercialmente disponível. Por exemplo, o DNA compreendendo a sequência nucleotídica de SEQ ID NO: 1 pode ser preparado por PCR, utilizando um DNA cromossômico humano ou biblioteca de cDNA como um molde (template), e um par de primers desenhados para serem capazes de amplificar a sequência de nucleotídeos representada pela SEQ ID NO: 1. As condições de PCR podem ser determinadas adequadamente. Por exemplo, as condições de PCR compreendem a realização de 30 ciclos do ciclo de reação: desnaturação a 94 °C durante 30 segundos; anelamento a 55 °C por 30 segundos a 1 minuto, e extensão a 72 °C durante 2 minutos, utilizando uma DNA polimerase termostável (por exemplo, Taq polimerase ou Pfu-polimerase) e tampão de PCR contendo Mg2+, seguida pela reação a 72 °C durante 7 minutos. Entretanto, as condições de PCR não são limitadas ao exemplo acima. As técnicas de PCR, condições, e etc, são descritas em Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology, 3a Edição, A compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology (1995), John Wiley & Sons (especialmente o Capítulo 15).

[047] Além disso, com base na sequência de nucleotídeos e nas informações da sequência de aminoácidos representadas pelas SEQ ID NOS: 1 a 30 na Listagem de Sequências descrita na presente invenção, são preparadas sondas ou primers apropriados e, em seguida, uma biblioteca de cDNA de um humano ou similar é triada usando os mesmos, de modo que o DNA desejado pode ser isolado. Uma biblioteca de cDNA é construída de preferência a partir de células, órgãos ou tecidos que expressam proteínas que tem as sequências de números pares de SEQ ID NOS: 2 a 30. Exemplos de tais células ou tecidos incluem células ou tecidos derivados do testículo, cânceres ou tumores, tais como leucemia, câncer da mama, linfomas, tumores de cérebro, câncer de pulmão, câncer colorretal, e similares. Os procedimentos tais como a preparação de sondas ou primers, a construção de uma biblioteca de cDNA, a triagem de uma biblioteca de cDNA e clonagem de genes alvo são conhecidos por uma pessoa perita na técnica e tais procedimentos podem ser realizados por meio dos métodos descritos em Sambrook et al. Molecular Cloning, 2a Edição, Current Protocols in Molecular Biology (1989), Ausbel et al., (acima), e etc. O DNA que codifica a proteína CAPRIN-1 humana ou um peptídeo parcial da mesma pode ser obtido a partir do DNA obtido dessa forma.

[048] As células hospedeiras podem ser de qualquer tipo celular, contanto que elas possam expressar o polipeptídeo mencionado acima. Os exemplos de células procarióticas incluem, mas não estão limitadas a, E. coli e similares. Exemplos de células eucarióticas incluem, mas não estão limitadas a, células de mamíferos, tais como células de rim de macaco (COS1) e células de ovário de hamster chinês (CHO), a linhagem de células de rim fetal humano (HEK293), linhagem de células fetais da pele de camundongos (NIH3T3), células de levedura como a levedura de brotamento e levedura, células de bicho-da- seda, e oócitos de Xenopus.

[049] Quando as células procarióticas são usadas como células hospedeiras, um vetor de expressão utilizado na presente invenção inclui uma origem replicável dentro de células procariotas, um promotor, um sítio de ligação ao ribossomo, um sítio de clonagem múltipla, um terminador, um gene de resistência à droga, um gene auxotrófico complementar, e etc. Exemplos de vetor de expressão para Escherichia coli incluem um vetor baseado no pUC, pBluescript II, um sistema de expressão pET, e um sistema de expressão pGEX. DNA codificante do polipeptídeo acima é incorporado em tal vetor de expressão, as células hospedeiras procariotas são transformadas com o vetor, as células transformadas assim obtidas são cultivadas, e, desse modo, o polipeptídeo codificado pelo DNA pode ser expresso em células hospedeiras procarióticas. Neste momento, o polipeptídeo também pode ser expresso como uma proteína de fusão com outra proteína.

[050] Quando células eucarióticas são utilizadas como células hospedeiras, um vetor de expressão utilizado na presente invenção é um vetor de expressão para células eucarióticas, que contém um promotor, uma região de splicing, um sítio de adição de poli(A), e similares. Exemplos de tais vetores de expressão incluem pKa1, pCDM8, pSVK3, pMSG, pSVL, pBK-CMV, pBK- RSV, vetor EBV, pRS, pcDNA3, e pYES2. De uma maneira semelhante ao que foi descrito acima, o DNA codificante do polipeptídeo acima é incorporado em tal vetor de expressão, as células hospedeiras eucarióticas são transformadas com o vetor, as células transformadas obtidas dessa forma são cultivadas, e, desse modo, o polipeptídeo codificado pelo DNA pode ser expresso em células hospedeiras eucarióticas. Quando o pIND/V5-His, pFLAG-CMV-2, pEGFP-N1, pEGFP-C1 ou similar é utilizado como um vetor de expressão, o polipeptídeo acima pode ser expresso como uma proteína de fusão ao qual um marcador (tag), tal como o marcador His (por exemplo, (His)6-(His)10), marcador FLAG, marcador myc, marcador HA ou GFP, foi adicionado.

[051] Para a introdução de um vetor de expressão em células hospedeiras, pode ser empregado um método conhecido, tal como a eletroporação, o método de fosfato de cálcio, o método de lipossoma, método de DEAE dextrano, microinjeção, infecção viral, lipofecção, e a ligação a um peptídeo permeável à membrana celular.

[052] O polipeptídeo de interesse pode ser isolado e purificado a partir de células hospedeiras por uma combinação de processos de separação conhecidos. Exemplos de tais processos de separação conhecidos incluem, mas não estão limitados a, tratar com um agente desnaturante, tal como ureia ou um tensoativo; ultrassonicação; digestão enzimática; precipitação por salificação (salting-out) ou fracionamento e precipitação com solvente; diálise; centrifugação; ultrafiltração; filtração em gel; SDS-PAGE; focalização isoelétrica; cromatografia de troca iônica; cromatografia de interação hidrofóbica, cromatografia de afinidade e cromatografia de fase reversa.

ESTRUTURA DO ANTICORPO

[053] Um anticorpo é uma glicoproteína heteromultimérica que geralmente contém pelo menos duas cadeias pesadas e duas cadeias leves. Anticorpos que não são da classe IgM são glicoproteínas heterotetraméricas de cerca de 150-kDa, compostas de duas cadeias leves (L) idênticas e duas cadeias pesadas (H) idênticas. Normalmente, cada cadeia leve está conectada a uma cadeia pesada por meio de uma ligação covalente simples de dissulfeto, entretanto, o número de ligações de dissulfeto entre as cadeias pesada varia dentre os diferentes isotipos de imunoglobulinas. Cada cadeia pesada ou cadeia leve também tem uma ligação de dissulfeto intracadeia. Cada cadeia pesada tem um domínio variável (região VH) em uma extremidade seguida por várias regiões constantes. Cada cadeia leve possui um domínio variável (região VL), e tem uma região constante em uma extremidade oposta a outra extremidade. A região constante de uma cadeia leve está alinhada com a primeira região constante de uma cadeia pesada, e um domínio variável de cadeia leve está alinhado com um domínio variável de cadeia pesada. A região específica de um domínio variável de anticorpo exibe variabilidade específica que é referida como região determinante de complementaridade (CDR), de modo que ela confere especificidade de ligação ao anticorpo. Uma porção de uma região variável, que é relativamente conservada, é referida como uma região de arcabouço (FR) (ou região estrutural - framework). A cadeia pesada completa e os domínios variáveis de cadeia leve contêm separadamente quatro FRs ligadas por meio de três CDRs. As três CDRs de uma cadeia pesada são referidas como CDRH1, CDRH2, e CDRH3, nesta ordem a partir da extremidade N-terminal. Da mesma forma, no caso de uma cadeia leve, as CDRLs são referidas como CDRL1, CDRL2 e CDRL3. O CDRH3 é o mais importante para a especificidade de ligação de um anticorpo a um antígeno. Além disso, as CDRs de cada cadeia são mantidas juntas em um estado adjacente entre si devido às regiões FR, contribuindo para a formação do sítio de ligação ao antígeno do anticorpo juntamente com as CDRs da outra cadeia. A região constante não contribui diretamente com a ligação de um anticorpo a um antígeno, mas apresenta várias funções efetoras, tais como participação do anticorpo na citotoxicidade mediada por células dependente de anticorpo (ADCC), fagocitose por meio de ligação a um receptor FCY, a taxa de meia-vida/depuração através do receptor Fc neonatal (FcRn) e citotoxicidade dependente de complemento (CDC), através de um componente C1q da cascata do sistema complemento.

PREPARAÇÃO DE ANTICORPO

[054] O termo “anticorpo anti-CAPRIN-1”, conforme utilizado no presente, refere-se a um anticorpo com reatividade imunológica a uma proteína CAPRIN-1 de comprimento total ou um fragmento da mesma.

[055] Conforme utilizado na presente invenção, o termo “reação imunológica” refere-se à propriedade de ligação in vivo de um anticorpo a um antígeno CAPRIN-1. Através de tal ligação in vivo, a função de prejudicar o tumor (por exemplo, a morte, supressão, ou degeneração) é exibida. Especificamente, um anticorpo utilizado na presente invenção pode ser qualquer tipo de anticorpo, desde que este se ligue a uma proteína CAPRIN-1 de modo a ser capaz de danificar o tumor, tal como uma leucemia, linfoma, câncer de mama, tumor cerebral, câncer de pulmão, câncer de bexiga, câncer de colo uterino, câncer de esôfago, câncer gástrico, câncer renal ou câncer colorretal.

[056] Na presente invenção, os exemplos de um anticorpo incluem, mas não estão particularmente limitados a, anticorpos contanto seja: um anticorpo monoclonal, um anticorpo sintético, um anticorpo multiespecífico, um anticorpo humano, um anticorpo humanizado, um anticorpo quimérico, um anticorpo com cadeia única, e um fragmento de anticorpo (por exemplo, Fab e F(ab')2). Além disso, o anticorpo pode ser uma molécula de imunoglobulina de qualquer classe, tal como IgG, IgE, IgM, IgA, IgD ou IgY, ou de qualquer subclasse, como IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2.

[057] O anticorpo pode ser adicionalmente modificado por glicosilação, acetilação, formilação, amidação, fosforilação, peguilação (PEG) e/ou similares.

[058] Exemplos da preparação de diversos anticorpos monoclonais estão descritos abaixo.

[059] Quando o anticorpo é um anticorpo monoclonal, por exemplo, a linhagem celular de câncer de mama SK-BR-3 expressando CAPRIN-1 é administrada a um camundongo para a imunização, o baço do camundongo é removido, as células são separadas e, em seguida, as células e células de mieloma de camundongo são fundidas. Dentre as células de fusão assim obtidas (hibridomas), um clone de produção de um anticorpo que possui o efeito de suprimir a proliferação de células cancerosas é selecionado. Um hibridoma que produz um anticorpo monoclonal que tem o efeito de suprimir a proliferação de células cancerosas é isolado, o hibridoma é cultivado e, em seguida, um anticorpo é purificado a partir do sobrenadante da cultura por purificação de afinidade geral, de forma que o anticorpo pode ser preparado.

[060] O hibridoma que produz um anticorpo monoclonal pode também ser preparado conforme descrito abaixo, por exemplo. Em primeiro lugar, um animal é imunizado com um antígeno sensibilizante de acordo com um método conhecido. Um método geral é realizado pela injeção de um antígeno sensibilizante a um mamífero por via intraperitoneal ou por via subcutânea. Especificamente, um antígeno sensibilizante é diluído com PBS (solução salina tamponada com fosfato), solução salina, ou similar em uma quantidade adequada, seguido pela suspensão. O resultante é então misturado com uma quantidade adequada de um adjuvante geral, conforme necessário, tal como o adjuvante completo de Freund. Após a emulsificação, a solução foi administrada a um mamífero por várias vezes a cada 4 a 21 dias. Além disso, um veículo adequado também pode ser utilizado após a imunização com um antígeno sensibilizante.

[061] Um mamífero é imunizado conforme descrito acima. Após a confirmação de um aumento no nível do anticorpo desejado no soro, as células imunizadas são coletadas do mamífero e, em seguida, submetidas à fusão celular. As células imunizadas preferíveis são particularmente os esplenócitos.

[062] Células de mieloma de mamíferos são utilizadas como outras células parentais para serem fundidas com as células imunizadas. Como células de mieloma, várias linhagens de células conhecidas são preferencialmente empregadas, tais como; P3U1 (P3-X63Ag8U1), P3 (P3x63Ag8. 653) (J. Immunol. (1979) 123, 1548-1550), P3x63Ag8U.1 (Current Topics in Microbiology and Immunology (1978) 81, 1-7), NS-1 (Kohler. G. e Milstein, C. Eur. J. Immunol. (1976) 6, 511-519), MPC-11 (Margulies. D. H. et al., Cell (1976) 8, 405-415), SP2/0 (Shulman, M. et al., Nature (1978) 276, 269-270), FO (deSt. Groth, S. F. et al., J. Immunol. Methods (1980) 35, 1-21), S194 (Trowbridge, I. S. J. Exp. Med. (1978) 148, 313-323), e R210 (Galfre, G. et al., Nature (1979) 277, 131-133).

[063] A fusão entre a célula imunizada e a célula de mieloma pode ser realizada basicamente de acordo com um método conhecido, por exemplo, tal como a técnica de Kohler e Milstein (Kohler, G. e Milstein, C., Methods Enzymol. (1981) 73, 3-46).

[064] Mais especificamente, a fusão celular acima é realizada, por exemplo, na presença de um acelerador da fusão celular em um meio nutriente convencional. Como acelerador de fusão, é utilizado o polietilenoglicol (PEG), o vírus Sendai (HVJ), ou similar. Se desejado, um agente auxiliar, tal como dimetilsulfóxido, pode ser adicionado e utilizado de modo a aumentar a eficiência de fusão.

[065] A relação de células imunizadas e células de mieloma a ser utilizada na presente invenção pode ser estabelecida arbitrariamente. Por exemplo, o número de células imunizadas que são preferencialmente utilizadas é de uma a dez vezes o número de células de mieloma. Como meio de cultura a ser utilizado para a fusão celular referido acima, pode ser utilizado um meio de cultura RPMI1640 adequado para a proliferação da linhagem de células de mieloma referida acima, um meio de cultura MEM, e outros meios de cultura normalmente utilizados para este tipo de cultura de células. Além disso, o líquido que é suplementar ao soro, tal como o soro bovino fetal (SBF), pode ser utilizado em conjunto com o mesmo.

[066] A fusão celular pode ser realizada pela mistura de quantidades predeterminadas das células imunizadas acima e células de mieloma no meio de cultura referido, e uma solução PEG (por exemplo, tem um peso molecular médio variando de cerca de 1000 a 6000), pré-aquecida a cerca de 37 °C é adicionada normalmente e uma concentração de 30% a 60% (p/v) e misturada, formando assim uma cultura contendo hibridomas de interesse. Em seguida, um meio de cultura apropriado é sucessivamente adicionado à cultura assim obtida, que é então centrifugado para remover o sobrenadante, e este processo é repetido para remover o agente de fusão celular ou similar, que não é preferível para o crescimento de hibridomas.

[067] Os hibridomas assim obtidos são cultivados por seleção em um meio de cultura de seleção habitual (por exemplo, um meio de cultura HAT contendo hipoxantina, aminopterina e timidina). A cultura nesse meio de cultura HAT continua durante um período de tempo suficiente (geralmente vários dias a várias semanas), de modo que as células (células não fundidas) que não são do hibridoma desejado morrem. Subsequentemente, são realizadas a triagem e a clonagem simples do hibridoma que produz um anticorpo de interesse utilizando o método de diluição limitante geral.

[068] Os hibridomas acima são obtidos pela imunização de um animal não humano com um antígeno. Além deste método, os hibridomas que produzem um anticorpo humano que tem atividade desejada (por exemplo, atividade de supressão da proliferação celular) podem também ser obtidos in vitro pela sensibilização de linfócitos humanos, tais como os linfócitos humanos que foram infectados com o vírus EB, com uma proteína, uma célula expressando proteína, ou um lisado da mesma, seguindo-se da fusão dos linfócitos sensibilizados com células de mieloma de origem humana que tem uma capacidade de divisão permanentemente, tal como a U266 (n° de acesso: TIB196).

[069] O hibridoma assim preparado que produz um anticorpo monoclonal de interesse pode ser repicado em meio de cultura geral e pode ser armazenado em nitrogênio líquido por um longo período de tempo.

[070] Especificamente, um hibridoma pode ser preparado pela imunização por um método de imunização geral utilizando, como um antígeno sensibilizante, um antígeno desejado ou uma célula que expressa o antígeno desejado, fundindo a célula imunizada assim obtida com uma célula parental conhecida por um método geral de fusão celular, e, em seguida, e feita a triagem de uma célula produtora de anticorpos monoclonais (por exemplo, um hibridoma) por um método de triagem geral.

[071] Como camundongo produtor de anticorpos humanos, um camundongo KM (Kirin Pharma/Medarex) e um camundongo Xeno (Amgen) são conhecidos (por exemplo, Publicações de Pedido de Patente Internacional WO 02/43478 e WO 02/092812), por exemplo. Quando tal camundongo é imunizado com a proteína CAPRIN-1 ou um fragmento dela, um anticorpo policlonal humano completo pode ser obtido a partir do sangue. Além disso, os esplenócitos são coletados a partir do camundongo imunizado e, em seguida, um anticorpo monoclonal tipo humano pode ser preparado por meio de um método para a fusão com células de mieloma.

[072] Um antígeno pode ser preparado de acordo com um método utilizando células animais (Publicação da Patente JP (Kohyo) N°. 2007-530068) ou baculovírus (por exemplo, Publicação Internacional WO98/46777), por exemplo. Quando um antígeno tem baixa imunogenicidade, o antígeno pode ser ligado a uma macromolécula que possui imunogenicidade, tal como a albumina, e, em seguida, a imunização é realizada.

[073] Adicionalmente, um gene de anticorpo é clonado a partir do referido hibridoma e depois incorporado em um vetor apropriado. O vetor é então introduzido dentro de um hospedeiro, e, em seguida, o anticorpo geneticamente recombinado produzido pelo uso de técnicas de recombinação gênica pode ser utilizado (por exemplo, vide Carl, A.K. Borrebaeck, James, W. Larrick, THERAPEUTIC MONOCLONAL ANTIBODIES, publicado no Reino Unido por MACMILLAN PUBLISHERS LTD, 1990). Especificamente, o cDNA de uma região variável (região V) de um anticorpo é sintetizado a partir do mRNA do hibridoma usando uma transcriptase reversa. Quando o DNA codificante da região V de um anticorpo de interesse pode ser obtido, o DNA é ligado ao DNA codificante da região constante (região C) do anticorpo desejado, e, em seguida, o produto da fusão resultante é incorporado em um vetor de expressão. Alternativamente, O DNA codificante da região V de um anticorpo pode ser incorporado em um vetor de expressão contendo o DNA para a região C de um anticorpo. Neste momento, o DNA pode ser incorporado em um vetor de expressão de modo que ele seja expresso sob o controle das regiões de controle da expressão, tal como um facilitador (enhancer) e promotor. Em seguida, as células hospedeiras são transformadas com o vetor de expressão, de modo que o anticorpo possa ser expresso.

[074] O anticorpo anti-CAPRIN-1 da presente invenção é caracterizado por ser um anticorpo monoclonal. Exemplos de um anticorpo monoclonal humano incluem anticorpos monoclonais, anticorpos monoclonais de animais não humanos (por exemplo, um anticorpo monoclonal de camundongo, um anticorpo monoclonal de rato, um anticorpo monoclonal de coelho e um anticorpo monoclonal de frango), e anticorpos monoclonais quiméricos. Um anticorpo monoclonal pode ser preparado pelo cultivo de um hibridoma obtido pela fusão de células do baço (esplenócitos) a partir de um mamífero não humano (por exemplo, um camundongo, um camundongo produtor de anticorpos humanos, um frango ou coelho) imunizado com uma proteína CAPRIN-1, com uma célula de mieloma. Um anticorpo quimérico é preparado pela combinação de sequências a partir de diferentes animais, tais como uma cadeia pesada de anticorpo compreendendo e regiões variáveis de cadeia pesada e cadeia leve de um anticorpo de camundongo e as regiões constantes de cadeia pesada e cadeia leve de um anticorpo humano. Um anticorpo quimérico pode ser preparado utilizando um método conhecido. Por exemplo, um anticorpo quimérico pode ser obtido pela ligação do DNA codificante de uma região V de anticorpo a um DNA codificante de uma região C de anticorpo humano, incorporando o produto de fusão resultante em um vetor de expressão e, em seguida, introduzindo o vetor em um hospedeiro para a produção do anticorpo quimérico. Nos Exemplos descritos mais adiante, anticorpos monoclonais quiméricos humano-frango foram preparados e, portanto, os seus efeitos antitumorais foram confirmados. Estes anticorpos monoclonais compreendem uma região variável de cadeia pesada (VH) que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 42 e uma região variável de cadeia leve (VL) que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 46, em que a região VH compreende a CDR1 representada pela sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 39, a CDR2 representada pela sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 40, e a CDR3 representada pela sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 41, e a região VL compreende a CDR1 representada pela a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 43, a CDR2 representada pela sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 44, e a CDR3 representada pela sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 45.

[075] Um anticorpo humanizado é um anticorpo modificado que também é referido como anticorpo humano remodelado. Um anticorpo humanizado pode ser construído por meio do transplante de CDRs de um anticorpo a partir de um animal imunizado para as regiões de determinação de complementaridade de um anticorpo humano. As técnicas gerais de recombinação gênica também são conhecidas.

[076] Especificamente, as sequências de DNA concebidas para ter cada uma das CDRs de um anticorpo de camundongo ou frango ligada a cada uma das regiões do arcabouço (framework) (FRs) de um anticorpo humano são sintetizadas pelo método da PCR a partir de diversos oligonucleotídeos, que são preparados de modo a ter porções de sobreposição em suas porções terminais, por exemplo. Um anticorpo humanizado pode ser obtido ligando o DNA obtido dessa forma a um DNA codificante da região constante de um anticorpo humano, incorporando o produto da fusão resultante em um vetor de expressão, introduzindo o vetor em um hospedeiro e, dessa forma, fazendo com que o hospedeiro produza o produto gênico (vide a Publicação de Patente Europeia N° 239.400 e a Publicação Internacional WO 96/02576). Como FRs de um anticorpo humano, as quais estão ligadas por meio de CDRs, as FRs que permitem a formação de um sítio de ligação ao antígeno com boas regiões determinantes da complementaridade são selecionadas. Se for necessário, para a formação de um sítio de ligação ao antígeno que tem as regiões determinantes de complementaridade apropriadas de um anticorpo humano remodelado, os aminoácidos das regiões de arcabouço de uma região variável do anticorpo podem ser substituídos (Sato, K. et al., Cancer Research de 1993, 53: 851-856). Além disso, os aminoácidos de FRs podem ser substituídos por aqueles das regiões de arcabouço de diferentes anticorpos humanos (vide a Publicação Internacional de Patente WO 99/51743).

[077] Como regiões do arcabouço (frameworks - FRs) de um anticorpo humano, que estão ligadas por meio de CDRs, são selecionadas as FRs que permitem a formação de um sítio de ligação ao antígeno com boas regiões determinantes da complementaridade. Se for necessário, para a formação de um sítio de ligação ao antígeno que tem as regiões determinantes de complementaridade apropriadas de um anticorpo humano remodelado, os aminoácidos das regiões de arcabouço de uma região variável do anticorpo podem ser substituídos (Sato, K. et al., Cancer Research de 1993, 53: 851-856).

[078] Após a preparação de um anticorpo quimérico ou um anticorpo humanizado, os aminoácidos nas regiões variáveis (por exemplo, FR) ou na região constante podem ser substituídos por outros aminoácidos.

[079] A substituição de aminoácidos é a substituição de, por exemplo, menos do que 15, menos do que 10, 8 ou menos, 7 ou menos, 6 ou menos, 5 ou menos, 4 ou menos, 3 ou menos ou 2 ou menos aminoácidos e é, preferencialmente, uma substituição de 1 a 5 aminoácidos, e mais preferencialmente de 1 ou 2 aminoácidos. Um anticorpo substituído deve ser funcionalmente equivalente a um anticorpo não substituído. A substituição é, desejavelmente, uma substituição conservadora de aminoácido(s) entre os aminoácidos que possuem propriedades análogas, tais como carga elétrica, cadeia lateral, polaridade, aromaticidade. Aminoácidos que tem propriedades análogas podem ser classificados, por exemplo, em aminoácidos básicos (lisina, arginina e histidina), aminoácidos ácidos (ácido aspártico e ácido glutâmico), aminoácidos polares não carregados (glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, cisteína e tirosina), aminoácidos apolares (leucina, isoleucina, alanina, valina, prolina, fenilalanina, triptofano e metionina), aminoácidos de cadeia ramificada (treonina, valina e isoleucina) e aminoácidos aromáticos (fenilalanina, tirosina, triptofano e histidina).

[080] Exemplos de um produto anticorpo modificado inclui anticorpos ligados a diversas moléculas tal como polietilenoglicol (PEG). As substâncias a serem ligadas no produto de anticorpo modificado da presente invenção não são limitadas. Tal produto de anticorpo modificado pode ser obtido submetendo o anticorpo assim obtido à modificação química. Os métodos para isso já foram estabelecidos no estado da técnica.

[081] Conforme usado na presente, o “equivalente funcional” refere-se a um anticorpo que possui uma atividade biológica ou bioquímica semelhante ao do anticorpo da presente invenção e, especificamente, refere-se a um anticorpo sujeito que possui a função de prejudicar o tumor essencialmente sem causar rejeição após a sua aplicação a um humano, por exemplo. Um exemplo de tal atividade inclui a atividade de suprimir a proliferação celular ou atividade de ligação.

[082] Como método bem conhecido pelos técnicos hábeis na técnica da preparação de um polipeptídeo funcionalmente equivalente a um polipeptídeo, um método para a introdução de mutações em um polipeptídeo é conhecido. Por exemplo, o técnicos hábeis no assunto podem preparar um anticorpo funcionalmente equivalente ao anticorpo da presente invenção pela introdução apropriada de um mutação no anticorpo utilizando a mutagênese sítio-dirigida (Hashimoto-Gotoh, T. et al., (1995) Gene 152, 271-275; Zoller, MJ., e Smith, M. (1983) Methods Enzymol. 100, 468-500; Kramer, W. et al., (1984) Nucleic Acids Res. 12, 9441-9456; Kramer, W. e Fritz, HJ., (1987) Methods Enzymol. 154, 350-367; Kunkel, TA., (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82, 488-492; Kunkel (1988) Methods Enzymol. 85, 2763-2766).

[083] Um anticorpo que reconhece um epítopo de uma proteína CAPRIN-1 reconhecido pelo anticorpo anti-CAPRIN-1 acima pode ser obtido por um método conhecido pelos técnicos do assunto. Por exemplo, tal anticorpo pode ser obtido por meio de um método que envolve a determinação de um epítopo de uma proteína CAPRIN-1 reconhecido por um anticorpo anti-CAPRIN- 1, por um método geral (por exemplo, mapeamento de epítopos) e em seguida a preparação de um anticorpo usando um polipeptídeo que tem uma sequência de aminoácidos contida no epítopo como um imunógeno, ou um método que envolve a determinação de um epítopo de tal anticorpo preparado por um método geral, e, em seguida, é feita a seleção de um anticorpo que tem o epítopo idêntico ao de um anticorpo anti-CAPRIN-1. Conforme utilizado no presente, o termo “epítopo” refere-se a, em um mamífero e preferencialmente em um humano, um fragmento de polipeptídeo com antigenicidade ou imunogenicidade. A unidade de dimensão mínima do mesmo consiste em cerca de 7 a 12 aminoácidos, e preferencialmente de 8 a 11 aminoácidos.

[084] A constante de afinidade Ka (Kon/Koff) do anticorpo da presente invenção é preferivelmente de pelo menos 107 M-1, pelo menos 108 M1, pelo menos 5x108 M-1, pelo menos 109 M-1, pelo menos 5x109 M-1, pelo menos 1010 M-1, pelo menos 5x1010 M-1, pelo menos 1011 M-1, pelo menos 5x1011 M-1, pelo menos 1012 M-1 ou pelo menos 1013 M-1.

[085] O anticorpo da presente invenção pode ser conjugado com um agente antitumoral. A conjugação do anticorpo com um agente antitumoral pode ser realizada por meio de um espaçador que possui um grupo reativo com um grupo amina, um grupo carboxila, um grupo hidroxila, um grupo tiol ou semelhantes (por exemplo, um grupo de succinato de succinimidila, um grupo formila, um grupo 2-piridiltio, um grupo maleimidila, um grupo alcóxi carbonila e um grupo hidroxila).

[086] Exemplos de agentes antitumorais incluem os seguintes agentes antitumorais conhecidos na literatura e similares, tais como paclitaxel, doxorubicina, daunorubicina, ciclofosfamida, metotrexato, 5-fluorouracila, tiotepa, busulfano, improsulfano, piposulfano, benzodopa, carboquona, meturedopa, uredopa, altretamina, trietilenemelamina, trietilenefosforamida, trietiilenetiofosforamida, trimetilolomelamina, bulatacina, bulatacinona, camptotecina, briostatina, calistatina, criptoficina 1, criptoficina 8, dolastatina, duocarmicina, eleuterobina, pancratistatina, sarcodictina, espongistatina, clorambucila, clornafazina, colofosfamida, estramustina, ifosfamida, mecloretamina, oxido cloridrato de mecloretamina, melfalano, novembicina, fenesterina, prednimustina, trofosfamida, mostardas de uracila carmustina, clorozotocina, fotemustina, lomustina, nimustina, ranimustina, caliceamicina, dinemicina, clodronato, esperamicina, aclacinomicina, actinomicina, autramicina, azaserina, bleomicina, cactinomicina, carabicina, carminomicina, carzinofilina, cromomicina, dactinomicina, detorbicina, 6-diazo-5-oxo-L-norleucina, adriamicina, epirubicina, esorubicina, idarubicina, marcelomicina, mitomicina C, ácido micofenólico, nogalamicina, olivomicinas, peplomicina, potfiromicina, puromicina, quelamicina, rodorubicina, estreptonigrina, estreptozocina, tubercidina, ubenimex, zinostatina, zorubicina, denopterina, pteropterina, trimetrexato, fludarabina, 6-mercaptopurina, tiamiprina, tioguanina, ancitabina, azacitidina, 6-azauridina, carmofur, citarabina, dideoxiuridina, doxifluridina, enocitabina, floxuridina, andrógenos (por exemplo, a calusterona, propionato de dromostanolona, epitiostanol, mepitiostano e testolactona), aminoglutetimida, mitotana, trilostana, ácido frolínico, aceglatona, aldofosfamida glicosida, ácido aminolevulínico, eniluracila, amsacrina, bestrabucila, bisantreno, edatraxato, defofamina, demecolcina, diaziquona, elfornitina, acetato de eliptinio, epotilona, etoglucídeo, lentinano, lonidamina, maitansina, ansamitocina, mitoguazona, mitoxantrona, mopidanmol, nitraerina, pentostatina, fenamet, pirarubicina, losoxantrona, ácido podofilínico, 2-etil-hidrazida, procarbazina, razoxano, rhizoxina, scizofilano, espirogermânio, ácido tenuazônico, triaziquona, roridina A, anguidina, uretano, vindesina, dacarbazina, manomustina, mitobronitol, mitolactol, pipobromano, gacitosina, docetaxel, clorambucila, gemcitabina, 6- tioguanina, mercaptopurina, cisplatina, oxaliplatina, carboplatina, vinblastina, etoposida, ifosfamida, mitoxantrona, vincristina, vinorelbina, novantrona, teniposida, edatrexato, daunomicina, aminopterina, xeloda, ibandronato, irinotecano, inibidor da topoisomerase, difluorometilornitina (DMFO), ácido retinoico e capecitabina, e sais farmaceuticamente aceitáveis e derivados dos mesmos.

[087] Pela administração do anticorpo da presente invenção em combinação com um agente antitumoral, efeitos terapêuticos ainda maiores podem ser obtidos. Esta técnica é aplicável antes e após a cirurgia de um paciente com câncer com expressão de CAPRIN-1. Especialmente após a cirurgia, uma prevenção mais eficaz de recorrências do câncer ou um período de sobrevida prolongado podem ser obtidos contra o câncer que expressa CAPRIN-1, que foi tratado de forma convencional com um agente antitumoral sozinho.

[088] Exemplos de agentes antitumorais a serem administrados em combinação com o anticorpo da presente invenção incluem os seguintes agentes antitumorais conhecidos na literatura prévia ou similares, como paclitaxel, doxorubicina, daunorubicina, ciclofosfamida, metotrexato, 5-fluorouracila, tiotepa, busulfano, improsulfano, piposulfano, benzodopa, carboquona, meturedopa, uredopa, altretamina, trietilenemelamina, trietilenefosforamida, trietiilenetiofosforamida, trimetilolomelamina, bulatacina, bulatacinona, camptotecina, briostatina, calistatina, criptoficina 1, criptoficina 8, dolastatina, duocarmicina, eleuterobina, pancratistatina, sarcodictina, espongistatina, clorambucila, clornafazina, colofosfamida, estramustina, ifosfamida, mecloretamina, oxido cloridrato de mecloretamina, melfalano, novembicina, fenesterina, prednimustina, trofosfamida, mostardas de uracila carmustina, clorozotocina, fotemustina, lomustina, nimustina, ranimustina, caliceamicina, dinemicina, clodronato, esperamicina, aclacinomicina, actinomicina, autramicina, azaserina, bleomicina, cactinomicina, carabicina, carminomicina, carzinofilina, cromomicina, dactinomicina, detorbicina, 6-diazo-5-oxo-L-norleucina, adriamicina, epirubicina, esorubicina, idarubicina, marcelomicina, mitomicina C, ácido micofenólico, nogalamicina, olivomicinas, peplomicina, potfiromicina, puromicina, quelamicina, rodorubicina, estreptonigrina, estreptozocina, tubercidina, ubenimex, zinostatina, zorubicina, denopterina, pteropterina, trimetrexato, fludarabina, 6-mercaptopurina, tiamiprina, tioguanina, ancitabina, azacitidina, 6-azauridina, carmofur, citarabina, dideoxiuridina, doxifluridina, enocitabina, floxuridina, calusterona, propionato de dromostanolona, epitiostanol, mepitiostano, testolactona, aminoglutetimida, mitotana, trilostana, ácido frolínico, aceglatona, aldofosfamida glicosida, ácido aminolevulínico, eniluracila, amsacrina, bestrabucila, bisantreno, edatraxato, defofamina, demecolcina, diaziquona, elfornitina, acetato de eliptinio, epotilona, etoglucídeo, lentinano, lonidamina, maitansina, ansamitocina, mitoguazona, mitoxantrona, mopidanmol, nitraerina, pentostatina, fenamet, pirarubicina, losoxantrona, ácido podofilínico, 2-etil-hidrazida, procarbazina, razoxano, rhizoxina, scizofilano, espirogermânio, ácido tenuazônico, triaziquona, roridina A, anguidina, uretano, vindesina, dacarbazina, manomustina, mitobronitol, mitolactol, pipobromano, gacitosina, docetaxel, clorambucila, gemcitabina, 6-tioguanina, mercaptopurina, cisplatina, oxaliplatina, carboplatina, vinblastina, etoposida, ifosfamida, mitoxantrona, vincristina, vinorelbina, novantrona, teniposida, edatrexato, daunomicina, aminopterina, xeloda, ibandronato, irinotecano, inibidor da topoisomerase, difluorometilornitina (DMFO), ácido retinóico e capecitabina, e sais (conhecidos) farmaceuticamente aceitáveis ou derivados (conhecidos) dos mesmos. Dos exemplos referidos acima, particularmente a ciclofosfamida, paclitaxel, docetaxel e vinorelbina são preferencialmente utilizados.

[089] Alternativamente, um isótopo radioativo conhecido na literatura prévia ou similar, tal como At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Lu175 ou Lu176, pode ser ligado ao anticorpo da presente invenção. Um radioisótopo desejado é eficaz para tratamento ou diagnóstico de tumor.

[090] O anticorpo da presente invenção é um anticorpo que possui reatividade imunológica com a CAPRIN-1, ou um anticorpo que se liga especificamente a CAPRIN-1, que exibe uma atividade citotóxica contra o câncer ou efeito de supressão sobre o crescimento tumoral. O anticorpo deve ter uma estrutura de modo que a rejeição seja quase ou completamente evitada em um animal sujeito ao qual o anticorpo é administrado. Exemplos de tal anticorpo incluem, quando o animal sujeito é um humano, um anticorpo humano, um anticorpo humanizado, um anticorpo quimérico (por exemplo, anticorpo quimérico humano-camundongo), um anticorpo com cadeia única e um anticorpo biespecífico. Estes anticorpos são: anticorpos recombinantes nos quais as regiões variáveis de cadeia pesada e cadeia leve são de um anticorpo humano; anticorpos recombinantes nos quais as regiões variáveis de cadeia pesada e de cadeia leve compreendem as regiões determinantes de complementaridade (CDRs) (CDR1, CDR2 e CDR3) a partir de um anticorpo de animal não humano; e as regiões de arcabouço (framework) de um anticorpo humano; ou anticorpos recombinantes nos quais as regiões variáveis de cadeia pesada e cadeia leve são de um anticorpo de animal não humano; e as regiões constantes de cadeia pesada e cadeia leve são de um anticorpo humano. Os anticorpos preferidos são os primeiros dois anticorpos mencionados.

[091] Estes anticorpos recombinantes podem ser preparados da seguinte forma pela clonagem do DNA que codifica um anticorpo monoclonal humano anti-CAPRIN-1 (por exemplo, um anticorpo monoclonal humano, um anticorpo monoclonal de camundongo, um anticorpo monoclonal de rato, um anticorpo monoclonal de coelho, ou anticorpo monoclonal de frango) a partir de uma célula produtora de anticorpo, tal como um hibridoma, preparando o DNA codificante de uma região variável de cadeia leve e uma região variável de cadeia pesada do anticorpo por um método de RT-PCR utilizando o mesmo como molde, e em seguida, determinando a sequência de cada região variável de cadeia leve e cadeia pesada ou cada sequência da CDR1, CDR2 e CDR3 com base no sistema de numeração EU de Kabat (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5aEd. Public Health Service, National Institute of Health, Bethesda, Md. (1991)).

[092] Além disso, o DNA codificante de cada uma das regiões variáveis ou DNA codificante de cada CDR é preparado usando técnicas de recombinação gênica (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)) ou um sintetizador de DNA. Na presente invenção, o hibridoma produtor de anticorpos monoclonais humanos pode ser preparado pela imunização de um animal produtor de anticorpos humanos (por exemplo, um camundongo) com a CAPRIN-1 humana, seguido pela fusão das células do baço retirados do animal previamente imunizado com as células de mieloma. Alternativamente, DNAs codificantes de uma região variável de cadeia leve e uma região constante de cadeia pesada de um anticorpo humano são preparados conforme necessário, utilizando técnicas de recombinação gênica ou utilizando um sintetizador de DNA.

[093] No caso de anticorpo humanizado, o DNA é preparado pela substituição de uma sequência codificante de CDR no DNA que codifica uma região variável de cadeia leve ou cadeia pesada derivada de um anticorpo humano, com uma sequência codificante de CDR correspondente aquela de um anticorpo derivado de um animal não humano (por exemplo, um camundongo, um rato, ou frango) e, em seguida, ligando o DNA obtido dessa forma a um DNA codificante de uma região constante de cadeia leve ou cadeia pesada derivada de um anticorpo humano. Assim, o DNA codificante do anticorpo humanizado pode ser preparado.

[094] No caso do anticorpo quimérico, o DNA codificante de um anticorpo quimérico pode ser preparado pela ligação do DNA codificante de uma região variável de cadeia leve ou cadeia pesada de um anticorpo de um animal não humano (por exemplo, um camundongo, um rato, ou frango) ao DNA codificante de uma região constante de cadeia leve ou de cadeia pesada de um anticorpo humano.

[095] No caso do anticorpo com cadeia única, este anticorpo é um anticorpo preparado pela ligação de forma linear da região variável de cadeia pesada a uma região variável de cadeia leve por meio de um ligante (linker). Assim, o DNA codificante de um anticorpo com cadeia única pode ser preparado pela ligação do DNA codificante de uma região variável de cadeia pesada, e um DNA codificante de um ligante, e um DNA codificante de uma região variável de cadeia leve. Na presente invenção, uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve são ambas de um anticorpo humano, ou, apenas as CDRs são substituídas por CDRs de um anticorpo proveniente de um animal não humano (por exemplo, um camundongo, um rato, e um frango), embora as outras regiões sejam originadas de um anticorpo humano. Além disso, o ligante (linker) possui 12 a 19 aminoácidos, e exemplos do mesmo, incluem (G4S)3 que tem 15 aminoácidos (Kim, GB. et al., Protein Engineering Design and Selection 2007, 20 (9): 425-432).

[096] No caso de anticorpo biespecífico (diacorpo), este anticorpo é capaz de se ligar especificamente a dois epítopos diferentes. Por exemplo, o DNA codificante de um anticorpo biespecífico pode ser preparado pela ligação do DNA codificante de uma região variável de cadeia pesada “A”, um DNA codificante de uma região variável de cadeia leve “B”, um DNA codificante de uma região variável de cadeia pesada “B”, e um DNA codificante de uma região variável de cadeia leve “A”, nesta ordem (neste caso, o DNA codificante de uma região variável de cadeia leve “B” está ligado ao DNA codificante de uma região variável de cadeia pesada “B” por meio do DNA codificante do ligante (linker) acima). Neste caso, uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve são ambas de um anticorpo humano, ou, apenas as CDRs são substituídas por CDRs de um anticorpo proveniente de um animal não humano (por exemplo, um camundongo, um rato, ou um frango), embora as outras regiões sejam originadas de um anticorpo humano.

[097] O DNA recombinante preparado acima é incorporado a um ou uma variedade de vetores, este vetores são introduzidos em células hospedeiras (por exemplo, células de mamíferos, leveduras ou células de inseto), em seguida, é causada a (co)expressão, de modo que o anticorpo recombinante pode ser preparado (PJ Delves, ANTIBODY PRODUCTION ESSENTIAL TECHNIQUES, 1997 WILEY; P. Shepherd e C. Dean., Monoclonal Antibodies, 2000 OXFORD UNIVERSITY PRESS; J.W. Goding., Monoclonal Antibodies: principles and practice, 1993 ACADEMIC PRESS).

[098] Exemplos do anticorpo da presente invenção preparado pelo método acima inclui um anticorpo que compreende uma região variável de cadeia pesada compreendendo a SEQ ID NOS: 39, 40, e 41 e uma região variável de cadeia leve compreendendo a SEQ ID NOS: 43, 44, e 45 (por exemplo, anticorpo compreende a região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 42 e a região variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 46).

[099] As sequências de aminoácidos representadas pelas SEQ ID NOS: 39, 40, e 41 são CDR1, CDR2 e CDR3 de uma região variável de cadeia pesada de anticorpo de frango. Também, as sequências de aminoácidos representadas pelas SEQ ID NOS: 43, 44, e 45 são CDR1, CDR2 e CDR3 de uma região variável de cadeia leve de anticorpo de frango, respectivamente.

[100] Além disso, o anticorpo humanizado, anticorpo quimérico, anticorpo com cadeia única ou anticorpo biespecífico da presente invenção é o anticorpo a seguir, por exemplo: (i) um anticorpo em que a região variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NOS: 39, 40, e 41 e as sequências de aminoácidos das regiões de arcabouço (framework) de um anticorpo humano, e, uma região variável de cadeia leve compreende as sequências de aminoácidos de SEQ ID NOS: 43, 44, e 45 e as sequências de aminoácidos das regiões de arcabouço (framework) de um anticorpo humano (por exemplo, o anticorpo em que a região variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 42, e a região variável de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 46; e (ii) um anticorpo em que a região variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NOS: 39, 40, e 41, e as sequências de aminoácidos das regiões arcabouço (framework) de um anticorpo humano; e uma região constante de cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos de um anticorpo humano; e uma região variável de cadeia leve compreendendo as sequências de aminoácidos de SEQ ID NOS: 43, 44, e 45; e as sequências de aminoácidos das regiões de arcabouço (framework) de um anticorpo humano e uma região constante de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos de um anticorpo humano (por exemplo, o anticorpo, em que a região variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 42, e a região constante de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de um anticorpo humano, bem como uma região variável de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 46, e uma região constante de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos de um anticorpo humano).

[101] Além disso, as sequências de cadeia pesada de anticorpo humano e as regiões constantes de cadeia leve e as regiões variáveis, podem ser obtidas a partir do NCBI (por exemplo, nos EUA: GenBank, Unigene), por exemplo. Por exemplo, a sequência com o número de acesso J00228 pode ser referida para uma região constante de cadeia pesada de IgG1 humana, a sequência com o número de acesso J00230 pode ser referida como uma região constante de cadeia pesada de IgG2 humana, a sequência com o número de acesso X03604 pode ser referida como uma região constante de cadeia pesada de IgG3 humana, a sequência com o número de acesso K01316 pode ser referida como uma região constante de cadeia pesada de IgG4 humana, as sequências com os números de acesso V00557, X64135, X64133, e outras semelhantes podem ser referidas como regiões constantes de cadeia leve K humanas, e as sequências com os números de acessos X64132, X64134, e similares, podem ser referidas como as regiões constantes de cadeia leve À humanas.

[102] Os anticorpos referidos acima possuem, preferivelmente, uma atividade citotóxica e, desse modo, podem exibir efeitos antitumorais.

[103] Além disso, as sequências específicas de regiões variáveis de cadeia pesada e de cadeia leve ou CDRs nos anticorpos acima são dadas apenas para fins ilustrativos, e, portanto, não estão claramente limitadas a essas sequências específicas. Um hibridoma capaz de produzir outro anticorpo humano ou anticorpo de animal não humano (por exemplo, um anticorpo de camundongo) contra a CAPRIN-1 humana é preparado, um anticorpo monoclonal que é produzido pelo hibridoma é coletado, e, em seguida, é determinado se o anticorpo é o não o anticorpo desejado tendo como indicadores a propriedade de ligação imunológica com a CAPRIN-1 humana e atividade citotóxica. Após a identificação de um hibridoma que produz o anticorpo monoclonal alvo desta forma, o DNA codificante da região variável de cadeia pesada e cadeia leve do anticorpo alvo é preparado a partir do hibridoma conforme descrito acima, e o sequenciamento é realizado, e, em seguida, o DNA é usado para a preparação de outro anticorpo.

[104] Além disso, no anticorpo da presente invenção acima, a sequência de cada um dos anticorpos mencionados acima, e particularmente a sequência da região de arcabouço (framework) e/ou a sequência da região constante pode ter uma substituição, uma deleção ou uma adição de um ou vários (de preferência, 1 ou 2) aminoácidos, desde que mantenha a especificidade de reconhecimento específico da CAPRIN-1. Neste caso, o termo “diversos” significa de 2 a 5, e preferencialmente 2 ou 3.

[105] A presente invenção fornece ainda um DNA codificante do anticorpo da presente invenção citado acima, ou, um DNA codificante da cadeia pesada ou cadeia leve do anticorpo acima, ou um DNA codificante da região variável de cadeia pesada ou cadeia leve do anticorpo acima. Exemplos de tais DNAs incluem, o DNA codificante de uma região variável de cadeia pesada compreendendo as sequências de nucleotídeos codificantes das sequências de aminoácidos de SEQ ID NOS: 39, 40, e 41, e o DNA codificante de uma região variável de cadeia leve compreendendo as sequências de nucleotídeos codificantes das sequências de aminoácidos de SEQ ID NOS: 43, 44, e 45.

[106] As regiões determinantes de complementaridade (CDRs) codificadas pelas sequências de DNA são regiões para a determinação da especificidade do anticorpo. Portanto, as sequências codificantes de regiões em um anticorpo que não sejam as CDRs (mais especificamente, uma região constante e uma região do arcabouço (framework)) podem ser de outros anticorpos. Na presente invenção, exemplos de tais “outros anticorpos” incluem anticorpos derivados de organismos não humanos, e são preferencialmente derivados de humanos visando a redução dos efeitos colaterais. Assim, no caso do DNA acima, as regiões codificantes de cada região do arcabouço (framework) e cada região de contato de cadeias pesadas e leves compreendem, preferencialmente, as sequências de nucleotídeos que codificam sequências de aminoácidos correspondentes de um anticorpo humano.

[107] Outros exemplos de alternativos de DNA codificante do anticorpo da presente invenção incluem o DNA que codifica uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência nucleotídica que codifica a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 42 e um DNA no qual a região codificante de uma região variável de cadeia leve compreende a sequência nucleotídica que codifica a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 46. Nesse caso, um exemplo da sequência de nucleotídeos que codifica a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 42 é a sequência nucleotídica de SEQ ID NO: 49. Além disso, um exemplo da sequência de nucleotídeos que codifica a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 46 é a sequência nucleotídica de SEQ ID NO: 50. Nestes DNAs, as regiões codificantes de cada região constante de cadeias pesada e leve compreendem, preferivelmente, as sequências nucleotídicas que codificam as sequências de aminoácidos correspondentes de um anticorpo humano.

[108] O DNA da presente invenção pode ser obtido pelos métodos acima ou pelo seguinte método. Em primeiro lugar, o RNA total é preparado a partir de um hibridoma relacionado ao anticorpo da presente invenção utilizando um kit comercial de extração de RNA, em seguida o cDNA e é sintetizado com uma transcriptase reversa utilizando primersaleatórios ou similares. Subsequentemente, o cDNA que codifica um anticorpo é amplificado por de um método de PCR utilizando como primers os oligonucleotídeos de sequências conservadas em cada região variável de genes conhecidos de cadeias pesada e leve de anticorpo de camundongo. A sequência codificante de uma região constante pode ser obtida pela amplificação de uma sequência conhecida pelo método da PCR. A sequência de nucleotídeos de DNA pode ser determinada por um método convencional tal como a inserção do mesmo dentro de um plasmídeo ou um fago para o sequenciamento.

[109] Um anticorpo anti-CAPRIN-1 a ser utilizado na presente invenção é considerado um anticorpo que exiba efeitos antitumorais contra células de câncer que expressam CAPRIN-1 através do seguinte mecanismo:

[110] Atividade de citotoxicidade dependente de anticorpo (ADCC) de células efetoras contra células que expressam CAPRIN-1, e a citotoxicidade dependente de complemento (CDC) contra células que expressam CAPRIN-1.

[111] Por esse motivo, a atividade de um anticorpo anti-CAPRIN-1 a ser utilizado na presente invenção pode ser avaliada, conforme descrito especificamente nos Exemplos a seguir, pela medição da atividade ex vivo da ADCC ou CDC contra as células cancerosas expressando CAPRIN-1.

[112] Um anticorpo anti-CAPRIN-1 a ser utilizado na presente invenção, se liga a uma proteína CAPRIN-1 em uma célula cancerosa e exibe efeitos antitumorais devido à atividade citada acima, e, dessa forma, é útil para tratar ou prevenir um câncer. Especificamente, a presente invenção fornece uma composição farmacêutica para tratar e/ou prevenir um câncer, que compreende um anticorpo anti-CAPRIN-1 como ingrediente ativo. Quando o anticorpo anti- CAPRIN-1 é usado para administração a um corpo humano (terapia de anticorpo), ele é preferencialmente um anticorpo humano ou anticorpo humanizado, a fim de se diminuir a imunogenicidade.

[113] Além disso, quanto maior a afinidade de ligação entre um anticorpo anti-CAPRIN-1 e uma proteína CAPRIN-1 sobre as superfícies de células cancerosas, uma atividade antitumoral mais forte do anticorpo anti- CAPRIN-1 poderá ser obtida. Portanto, quando um anticorpo anti-CAPRIN-1 com elevada afinidade de ligação para a proteína CAPRIN-1 pode ser adquirido, fortes efeitos antitumorais podem ser esperados, de modo que a aplicação do anticorpo como uma composição farmacêutica para fins de tratar e/ou prevenir um câncer torna-se possível. A elevada afinidade de ligação é desejavelmente as seguintes. Conforme descrito acima, a constante de ligação (constantes de afinidade) Ka (kon/koff) é preferencialmente, de pelo menos 107 M-1, pelo menos 108 M-1, pelo menos 5 *108 M-1, pelo menos 109 M-1, pelo menos 5 *109 M-1, pelo menos 1010 M-1, pelo menos 5 *1010 M-1, pelo menos 1011 M-1, pelo menos 5 *1011 M-1, pelo menos 1012 M-1 ou pelo menos 1013 M-1.

LIGAÇÃO ÀS CÉLULAS EXPRESSANDO O ANTÍGENO

[114] A capacidade de um anticorpo de se ligar a CAPRIN-1 pode ser especificada pelo ensaio de ligação utilizando o método ELISA, um método de Western blot, imuno-fluorescência e análise por citometria de fluxo, ou técnicas similares, tais como aquelas descritas nos Exemplos.

COLORAÇÃO POR IMUNOHISTOQUÍMICA

[115] Um anticorpo que reconhece a CAPRIN-1 pode ser testado quanto à reatividade para CAPRIN-1 por meio de um método de imunohistoquímica conhecido pelos técnicos do assunto, utilizando cortes de tecido congelado fixado em acetona ou cortes de tecido fixado emblocado em parafina, que é preparado a partir de amostras de tecido obtidas de um paciente durante a cirurgia, ou amostras de tecido obtidas de um animal que tem um heterotransplante inoculado com uma linhagem celular que expressa CAPRIN- 1, naturalmente ou após a transfecção.

[116] Um anticorpo reativo com a CAPRIN-1 pode ser corado por diversos métodos de coloração de imunohistoquímica. Por exemplo, um anticorpo de cabra anti-camundongo ou anticorpo de cabra anti-frango conjugado com peroxidase de rábano silvestre pode realizar a reação, e um anticorpo alvo pode ser visualizado.

COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA

[117] Um alvo da composição farmacêutica para tratar e/ou prevenir um câncer da presente invenção não está particularmente limitado, contanto que ele seja um câncer (célula) que expressa um gene CAPRIN-1.

[118] Os termos “tumor” e “câncer”, utilizados na presente invenção, referem-se a neoplasias malignas e são utilizados de forma alternada.

[119] O câncer ser submetido na presente invenção é o câncer que expressa genes que codificam proteínas CAPRIN-1 que tem as sequências de aminoácidos NE numeração par das SEQ ID NOS: 2 a 30. Exemplos de tal câncer inclui preferencialmente câncer de mama, tumor cerebral, leucemia, linfoma, câncer de pulmão, mastocitoma, câncer renal, câncer de colo uterino, câncer de bexiga, câncer de esôfago, câncer gástrico ou câncer colorretal.

[120] Exemplos de tal câncer específico incluem, mas não estão limitados a, adenocarcinoma da mama, adenocarcinoma da mama tipo composto, tumor misto maligno da glândula mamária, adenocarcinoma papilar intraductal, adenocarcinoma de pulmão, carcinoma de células escamosas, carcinoma de células pequenas, carcinoma de células grandes, glioma que é tumor de tecido epitelial neural, ependimoma, neurocitoma, tumor neuroectodérmico fetal, schwannoma, neurofibroma, meningioma, leucemia linfocítica crônica, linfoma, linfoma gastrointestinal, linfoma digestivo, linfoma de células pequenas e células médias, câncer de ceco, cólon ascendente, cólon descendente, câncer de cólon transverso, cólon sigmoide e câncer retal.

[121] Além disso, os indivíduos preferidos são mamíferos, incluindo os primatas, animais de estimação, animais domésticos, animais de raça, e similares e são particularmente preferencialmente os humanos, cães e gatos.

[122] Quando o anticorpo utilizado na presente invenção é utilizado como uma composição farmacêutica, ele pode ser formulado por um método conhecido pelos técnicos hábeis no assunto. Por exemplo, o anticorpo pode ser utilizado por via parenteral sob a forma de uma preparação injetável, tal como uma solução asséptica ou suspensão preparada com água ou com uma solução farmaceuticamente aceitável que não seja água. Por exemplo, ele pode ser formulado pela mistura de uma forma de dosagem unitária exigida pela prática farmacêutica geralmente aceita, em combinação adequada com um veículo o meio farmacologicamente aceitável, especificamente, água esterilizada ou soro fisiológico, óleo vegetal, um emulsionante, uma suspensão, um agente tensoativo, um estabilizante, um composto aromatizante, um excipiente, um veículo, um antiséptico, um agente de ligação, e similares. As quantidades de ingredientes ativos nestas preparações são determinadas de modo que uma dose adequada dentro do intervalo indicado possa ser obtida.

[123] Uma composição para injeção asséptica pode ser prescrita de acordo com a prática farmacêutica geral, utilizando um veículo tal como água destilada para injeção.

[124] Exemplos de uma solução aquosa para injeção incluem solução salina, solução isotônica contendo dextrose ou outros adjuvantes, tais como D-sorbitol, D-manose, D-manitol, e cloreto de sódio. Estes exemplos podem ser utilizados em combinação com um agente de solubilização adequado, tal como o álcool, especialmente etanol e poliálcool (por exemplo, propilenoglicol e polietileno-glicol), e um surfactante (tensoativo) não iônico (por exemplo, polisorbato 80® e HCO-60).

[125] Exemplos de óleos incluem o óleo de gergelim e óleo de soja, que podem ser usados em combinação com um agente solubilizante como o benzoato de benzila ou álcool benzílico. Além disso, agentes de tamponamento, como o tampão fosfato ou tampão acetato de sódio, agentes com ação calmante como o cloridrato de procaína, um estabilizante como o álcool benzílico, fenol, ou antioxidantes podem ser misturados com o mesmo. Uma ampola adequada é geralmente preenchida com a solução de injeção assim preparada.

[126] A administração é a administração oral ou parenteral e é de preferência a administração parenteral. Exemplos específicos da via de administração incluem a injeção, administração transnasal, administração pulmonar e administração transdérmica. Exemplos de injeção incluem injeção intravenosa, injeção intramuscular, injeção intraperitoneal, e injeção subcutânea, de modo que a administração sistêmica ou local é possível.

[127] Além disso, os métodos de administração podem ser adequadamente selecionados dependendo da idade do paciente, peso corporal, sexo, sintomas, dentre outros. A dosagem pela administração de uma composição farmacêutica contendo um anticorpo ou polinucleotídeo que codifica o anticorpo pode ser selecionada a partir do intervalo entre 0,0001 mg e 1000 mg por kg de peso corporal, por exemplo. Alternativamente, a dosagem pode ser selecionada, por exemplo, a partir do intervalo entre 0,001 mg/corpo e 100000 mg/corpo por paciente. Entretanto, o intervalo de dosagem não é sempre limitado a estes valores numéricos. A dosagem e método de administração variam dependendo do peso corporal do paciente, da idade, sexo, sintomas, e similares, mas podem ser adequadamente selecionados pelos técnicos do assunto.

[128] A composição farmacêutica acima contendo o anticorpo ou um fragmento do mesmo da presente invenção é administrada a um sujeito, de modo que o câncer, preferencialmente câncer da mama, tumor cerebral, leucemia, câncer de pulmão, linfoma, mastocitoma, câncer renal, câncer do colo uterino, câncer de bexiga, câncer esofágico, câncer gástrico, câncer colorretal, pode ser tratado e/ou prevenido.

[129] A presente invenção abrange ainda um método para tratar e/ou prevenir um câncer, compreendendo a administração a um sujeito da composição farmacêutica da presente invenção em combinação com o agente antitumoral exemplificado acima ou uma composição farmacêutica contendo o dito agente antitumoral. O anticorpo ou fragmento do mesmo da presente invenção e o agente antitumoral podem ser administrados simultaneamente ou separadamente a um sujeito. Eles podem ser administrados separadamente, independentemente da ordem de administração. Os intervalos de administração, dosagem, via de administração, e frequência de administração podem ser apropriadamente selecionados por um especialista. Exemplos de outra formulação farmacêutica para ser administrada simultaneamente incluem composições farmacêuticas obtidas pela mistura do anticorpo ou fragmento do mesmo da presente invenção com um agente antitumoral em um veículo (ou meio) farmaceuticamente aceitável seguido pela formulação. Além disso, é aplicável a composição farmacêutica acima contendo um agente antitumoral e a formulação, explicações relativas à prescrição, formulação, via de administração, dose, câncer a ser tratado e similares para a administração de uma composição farmacêutica contendo o anticorpo da presente invenção e a formulação.

[130] Portanto, a presente invenção fornece também uma combinação farmacêutica para tratar e/ou prevenir um câncer, compreendendo a composição farmacêutica da presente invenção e a composição farmacêutica exemplificada acima contendo um agente antitumoral.

[131] Além disso, a presente invenção fornece uma composição farmacêutica para tratar e/ou prevenir um câncer, compreendendo o anticorpo ou fragmento do mesmo da presente invenção e um agente antitumoral juntamente com um veículo farmacologicamente aceitável.

POLIPEPTÍDEO E DNA

[132] A presente invenção também fornece os seguintes polipeptídeos ou DNAs relacionados aos anticorpos acima. (i) Um polipeptídeo compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 42, e o DNA codificante do polipeptídeo, em que o DNA compreende as sequências de nucleotídeos de SEQ ID NO: 49. (ii) Um polipeptídeo compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 46, e o DNA codificante do polipeptídeo, em que o DNA compreende as sequências de nucleotídeos de SEQ ID NO: 50. (iii) Um polipeptídio da CDR de cadeia pesada selecionado a partir das sequências de aminoácidos representadas pelas SEQ ID NOS: 39, 40 e 41, e o DNA codificante do polipeptídeo. (iv) Um polipeptídio da CDR de cadeia leve selecionado a partir das sequências de aminoácidos representadas pelas SEQ ID NOS: 43, 44 e 45, e o DNA codificante do polipeptídeo.

[133] Estes polipeptídeos e DNAs podem ser preparados utilizando as técnicas de recombinação gênica conforme descrito acima.

DESCRIÇÃO RESUMIDA DA INVENÇÃO

[134] A presente invenção explanada acima é resumida da seguinte forma. (1) Uma composição farmacêutica para tratar e/ou prevenir um câncer, compreendendo um anticorpo que compreende uma região variável de cadeia pesada compreendendo SEQ ID NOS: 39, 40 e 41; e uma região variável de cadeia leve compreendendo SEQ ID NOS: 43, 44, e 45 ou um fragmento das mesmas como ingrediente ativo e que tem reatividade imunológica com uma proteína CAPRIN-1. (2) A composição farmacêutica de acordo com o item (1) em que o câncer é câncer de mama, tumor cerebral, leucemia, linfoma, câncer de pulmão, mastocitoma, câncer renal, câncer de colo uterino, câncer de esôfago, câncer gástrico, câncer de bexiga, ou câncer colorretal. (3) A composição farmacêutica de acordo com o item (1) ou (2), caracterizada pelo fato de que o dito anticorpo é um anticorpo humano, anticorpo humanizado, anticorpo quimérico, anticorpo com cadeia única ou um anticorpo biespecífico. (4) Um anticorpo que compreende uma região variável de cadeia pesada compreendendo SEQ ID NOS: 39, 40 e 41; e uma região variável de cadeia leve compreendendo SEQ ID NOS: 43, 44, e 45, e que tem reatividade imunológica com uma proteína CAPRIN-1. (5) O anticorpo de acordo com o item (4) acima caracterizado pelo fato de que o anticorpo é um anticorpo humano, anticorpo humanizado, anticorpo quimérico, anticorpo com cadeia única ou anticorpo biespecífico. (6) Uma combinação farmacêutica para tratar e/ou prevenir um câncer, compreendendo a composição farmacêutica de qualquer um dos itens de (1) a (3) acima e uma composição farmacêutica contendo um agente antitumoral. (7) Um método para tratar e/ou prevenir um câncer, compreendendo administrar a um sujeito uma composição farmacêutica de qualquer um dos itens de (1) a (3) acima; ou o anticorpo de qualquer um dos itens de (3) a (5) acima ou um fragmento do mesmo. (8) Um método para tratar e/ou prevenir um câncer, compreendendo o uso de composições farmacêuticas da combinação farmacêutica do item (6) acima, em combinação, em um sujeito.

EXEMPLOS

(135) A presente invenção é descrita mais especificamente com base em exemplos, mas o escopo da presente invenção não está limitado por estes exemplos específicos.

EXEMPLO 1 IDENTIFICAÇÃO DE NOVAS PROTEÍNAS ANTÍGENO DE CÂNCER PELO MÉTODO SEREX (1) PREPARAÇÃO DE BIBLIOTECA DE cDNA

(136) O RNA total foi extraído a partir de um tecido de testículos de um cão saudável por um método de ácido guanídino-fenol-clorofórmio. O RNA poliA foi purificado de acordo com os protocolos fornecidos com um kit de purificação “Oligotex-dT30 mRNA” (Takara Shuzo Co., Ltd.), utilizando o kit.

(137) Uma biblioteca fago de cDNA de testículo de cão foi sintetizada utilizando o RNAm assim obtido (5 μg). Para a preparação da biblioteca fago de cDNA, um kit de síntese de cDNA, um kit de síntese “ZAP- cDNA”, e um kit de clonagem “ZAP-cDNA gigapack III gold clonning kit” (Stratagene) foram utilizados e a biblioteca foi preparada de acordo com protocolos incluídos nos kits. O tamanho da biblioteca fago de cDNA preparada foi de 7,73 x 105 pfu/ml. (2) SELEÇÃO DA BIBLIOTECA DE CDNA UTILIZADO O SORO

[138] A imunoseleção foi realizada usando a biblioteca fago de cDNA de testículo de cão preparada acima. Especificamente, um hospedeiro Escherichia coli (XL1-Blue MRF') foi infectado com o fago de modo a que 2210 clones estavam presentes em uma placa de agarose NZY de 0 90 x 15 mm. As células foram cultivadas a 42 °C durante 3 a 4 horas, de modo a causar a formação de placas. A placa foi coberta com uma membrana de nitrocelulose (Hybond C extra: GE Healthcare Bio-Science) impregnados com IPTG (isopropil- β-D-tiogalactoside) a 37 °C durante 4 horas. As proteínas foram induzidas, expressas, e, em seguida, transferidas para a membrana. Subsequentemente, a membrana foi recuperada, imersa, e foi submetida a agitação em TBS (10 mM de Tris-HCl, 150 mM de NaCl pH 7,5) contendo 0,5% de leite em pó desnatado a 4 °C durante a noite, de modo que a reação não específica foi suprimida. O filtro foi deixado reagir com o soro do cão diluído 500 vezes em temperatura ambiente por 2 a 3 horas.

[139] Como o soro acima de cães com câncer, foram utilizados os soros coletados de cães com câncer de mama. Os soros foram armazenados a -80 °C e, em seguida, submetidos ao pré-tratamento imediatamente antes do uso. O pré-tratamento para o soro foi realizado pelo seguinte método. Especificamente, o hospedeiro Escherichia coli (XL1-blure MRF') foi infectado com fago expresso “X ZAP Express” dentro do qual nenhum gene estrangeiro foi introduzido, e em seguida, cultivados em placa com meio NZY a 37 °C durante a noite. Subsequentemente, um tampão a 0,2 M de NaHCO3 (pH 8,3) contendo 0,5 M de NaCl foi adicionado à placa e, em seguida, a placa foi deixada em repouso a 4 °C durante 15 horas. Os sobrenadantes foram coletados como extratos de Escherichia coli/fago. Em seguida, a os extratos de Escherichia coli/fago coletados foram passados através de uma coluna-NHS (GE Healthcare Bio-Science), de modo a imobilizar a proteína derivada da Escherichia coli/fago. O soro de um cão com o câncer foi passado através da coluna à qual a proteína foi imobilizada por reação, removendo assim a Escherichia coli e anticorpos adsorvidos ao fago a partir do soro. Cada fração de soro que passou através da coluna foi diluída 500 vezes com TBS contendo 0,5% de leite em pó desnatado, e o resultante foi usado como material de imunoseleção.

[140] Uma membrana, ao qual o soro tratado e a proteína de fusão citados acima foram submetidos à técnica de blotting, foi lavada por 4 vezes com TBS-T (0,05% de Tween 20/TBS). A membrana foi reagida com anticorpo de cabra anti-IgG de cão (cabra anti-IgG-h+i de cão conjugado com HRP: BETHYL Laboratories), diluído 5.000 vezes, como um anticorpo secundário com TBS contendo 0,5% de leite em pó desnatado em temperatura ambiente durante 1 hora. A detecção foi realizada por reação enzimática de cor utilizando uma solução de reação NBT/BCIP (Roche). As colônias correspondendo ao sítio positivo da reação de cor foram coletadas das placas de agarose NZY de 090 x 15 mm, e em seguida dissolvidas em 500 μl de tampão SM (100 mM de NaCl, 10 mM de MgClSO4, 50 mM de Tris-HCl, 0,01% de gelatina, pH 7,5). Até a unificação de colônias positivas para a reação de cor, a seleção secundária e seleção terciária foram repetidas por um método semelhante ao descrito acima. Assim, 30940 clones de fagos que reagiram com o IgG do soro foram triados de modo que 5 clones positivos foram isolados. (3) PESQUISA DE HOMOLOGIA PARA O GENE ANTÍGENO ISOLADO

[141] Um procedimento para a conversão dos vetores fagos para vetores plasmidiais foi realizado para os 5 clones positivos isolados pelo método descrito acima para a finalidade de submeter os clones a análise de sequência de nucleotídeos. Especificamente, 200 μL de uma solução de hospedeiros Escherichia coli (XL1-Blue MRF') preparada para dar uma absorbância em OD600 de 1,0; 250 μL de uma solução de fagos purificados, e 1 μL de fagos auxiliares “ExAssist helper phage” (Stratagene) foram misturados e deixados reagir a 37 °C durante 15 minutos. Em seguida 3 ml de meio LB foi adicionado, as células foram cultivadas a 37 °C durante 2,5 a 3 horas, e, em seguida, o resultante foi imediatamente colocado em banho de água a 70 °C para uma incubação de 20 minutos. A centrifugação foi realizada a 4 °C, 1000 x g durante 15 minutos e, em seguida, o sobrenadante foi coletado como uma solução de fagomídeo. Subsequentemente, 200 μl de uma solução preparada a partir do fagomídeo hospedeiro Escherichia coli SOLR para dar uma absorbância a OD600 de 1,0; e 10 μL da solução de fagos purificados foram misturados, seguido por 15 minutos de reação a 37 °C. 50 μl da solução resultante foi plaqueada sobre meio ágar LB contendo ampicilina (em uma concentração final de 50 μg/ml) e depois cultivadas durante a noite a 37 °C. Uma única colônia SOLR transformada foi coletada e, em seguida, cultivada em meio LB contendo ampicilina (em uma concentração final de 50 μg/ml) a 37 °C. Após o cultivo, o DNA plasmidial contendo uma inserção de interesse foi purificado utilizando um kit “QIAGEN plasmid Miniprep Kit” (QIAGEN).

[142] O plasmídeo purificado foi submetido à análise de toda a sequência do segmento inserido pelo método de “primer walking” usando o primer T3 de SEQ ID NO: 31 e o primer T7 de SEQ ID NO: 32. As sequências do gene de SEQ ID NOS: 5, 7, 9, 11, e 13 foram obtidas por meio da análise de sequência. Com a utilização das sequências de nucleotídeos dos genes e as sequências de aminoácidos dos mesmos (SEQ ID NOS: 6, 8, 10, 12, e 14), o programa de pesquisa de homologia BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/) foi conduzido para a busca de homologia com genes conhecidos. Como resultado, foi revelado que todos os cinco genes obtidos eram genes que codificam a CAPRIN-1. As identidades de sequência entre os cinco genes foram de 100% com relação à sequência de nucleotídeos e de 99% em relação à sequência de aminoácidos nas regiões a serem traduzidas em proteínas. As identidades de sequência destes genes com os genes codificantes homólogos humanos foram de 94% com relação à sequência de nucleotídeos e de 98% com relação à sequência de aminoácidos nas regiões a serem traduzidas em proteínas. As sequências de nucleotídeos dos homólogos humanos são representados pelas SEQ ID NOS: 1 e 3 e as sequências de aminoácidos dos mesmos são representadas pelas SEQ ID NOS: 2 e 4. Além disso, as identidades de sequência dos genes de cão obtidos com os genes codificantes de homólogos de gado foram de 94% com relação à sequência de nucleotídeos e de 97% com relação à sequência de aminoácidos nas regiões que são traduzidas em proteínas. A sequência de nucleotídeos do homólogo de gado é representada pela SEQ ID NO: 15 e a sequência de aminoácidos da mesma é representada pela SEQ ID NO: 16. Além disso, as identidades de sequência dos genes codificantes de homólogo humano com os genes codificantes de homólogo do gado foram de 94% com relação à sequência de nucleotídeos e de 93% a 97% com relação à sequência de aminoácidos nas regiões que são traduzidas em proteínas. Além disso, as identidades de sequência dos genes de cão obtidos com os genes codificantes de homólogos de cavalo foram de 93% com relação à sequência de nucleotídeos e de 97% com relação à sequência de aminoácidos nas regiões que são traduzidas em proteínas. A sequência de nucleotídeos do homólogo de cavalo é representada pela SEQ ID NO: 17 e a sequência de aminoácidos da mesma é representada pela SEQ ID NO: 18. Além disso, as identidades de sequência dos genes codificantes de homólogo humano com os genes codificantes de homólogo do cavalo foram de 93% com relação à sequência de nucleotídeos e de 96% com relação à sequência de aminoácidos nas regiões que são traduzidas em proteínas. Além disso, as identidades de sequência dos genes de cão obtidos com os genes codificantes de homólogos de camundongo foram de 87% a 89% com relação à sequência de nucleotídeos e de 95 a 97% com relação à sequência de aminoácidos nas regiões que são traduzidas em proteínas. As sequências de nucleotídeos dos homólogos de camundongo são representadas pelas SEQ ID NOS: 19, 21, 23, 25 e 37; e as sequências de aminoácidos dos mesmos são representadas pelas SEQ ID NOS: 20, 22, 24, 26 e 28. Além disso, as identidades de sequência dos genes codificantes de homólogo humano com os genes codificantes de homólogo de camundongo foram de 89% a 91% com relação à sequência de nucleotídeos e foram de 95% a 96% com relação à sequência de aminoácidos nas regiões que são traduzidas em proteínas. Além disso, as identidades de sequência dos genes de cão obtidos com os genes codificantes de homólogos de frango foram de 82% com relação à sequência de nucleotídeos e de 87% com relação à sequência de aminoácidos nas regiões que são traduzidas em proteínas. A sequência de nucleotídeos do homólogo de frango é representada pela SEQ ID NO: 29 e a sequência de aminoácidos da mesma é representada pela SEQ ID NO: 30. Além disso, as identidades de sequência dos genes codificantes do homólogo humano com os genes codificantes do homólogo do frango foram de 81% a 82% com relação à sequência de nucleotídeos; e de 86% com relação à sequência de aminoácidos nas regiões que são traduzidas em proteínas. (4) ANÁLISE DA EXPRESSÃO GÊNICA EM CADA TECIDO

[143] A expressão de genes obtida pelo método descrito acima foi examinada em tecidos normais de cães e humanos e em diferentes linhagens de células pelo método de RT-PCR. A reação de transcrição reversa foi realizada da seguinte forma. Especificamente, o RNA total foi extraído a partir de 50 mg a 100 mg de tecido ou 5 a 10 x 106 células da linhagem celular utilizando um reagente Trizol (Invitrogen) de acordo com os protocolos anexos. O cDNA foi sintetizado com o RNA total utilizando um sistema de síntese para RT-PCR “Superscript First-Strand Synthesis System” (Invitrogen) de acordo com o protocolo do fabricante. A PCR foi realizada da seguinte forma utilizando primers de SEQ ID NOS: 33 e 34 específicos para os genes obtidos. Especificamente, os reagentes e um tampão de acompanhamento foram adicionados a 0,25 μL da amostra, preparada pela reação de transcrição reversa em um volume total de 25 μL, de modo que o resultante continha os primers acima a 2 μM cada, dNTPs 0,2 mM de cada um, e 0,65U de polimerase ExTaq (Takara Shuzo Co., Ltd.). A PCR foi realizada repetindo um ciclo de 94 °C durante 30 segundos, 60 °C durante 30 segundos, e 72 °C durante 30 segundos, por 30 ciclos, utilizando um termociclador Thermal Cycler (BIO RAD). Os primers gene-específicos acima são capazes de amplificar a região que vai dos nucleotídeos 206 a 632 na sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 5 (gene CAPRIN-1 de cão) e da região que vai dos nucleotídeos 698 a 1124 na sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 1 (gene da CAPRIN-1 humana). Como controle para comparação, primers específicos para GAPDH de SEQ ID NOS: 35 e 36 também foram utilizados simultaneamente. Como resultado, conforme exibido na Fig. 1, foi observada uma forte expressão no testículo entre tecidos de cães normais, enquanto foi observada a expressão nos tecidos de câncer da mama e adenocarcinoma de cão. Além disso, a observação da expressão do homólogo humano a partir de dos genes obtidos também foi realizada. Como resultado, de forma semelhante ao caso do gene CAPRIN-1 de cão, a expressão pôde ser observada apenas no testículo entre os tecidos normais. Entretanto, no caso de células cancerosas, a expressão foi detectada em muitos tipos de linhagens celulares de câncer, incluindo as linhagens de células de câncer da mama, tumor cerebral, leucemia, câncer de pulmão, e câncer esofágico. A expressão foi observada especialmente em muitas das linhagens de células de câncer de mama. Estes resultados foram confirmados pelos resultados de que com exceção do tecido de testículo a expressão de CAPRIN-1 não é observada em tecidos normais, enquanto a CAPRIN-1 foi expressa em células cancerosas e, especificamente, em muitas linhagens de células de câncer de mama.

[144] Na Fig. 1, o número de referência 1 em cada eixo vertical indica os padrões de expressão de genes identificados acima e o número de referência 2 indica os padrões de expressão do gene GAPDH como controle. (5) COLORAÇÃO IMUNOHISTOQUÍMICA (5)-1 EXPRESSÃO DE CAPRIN-1 EM TECIDOS NORMAIS DE CAMUNDONGO E CÃO

[145] Camundongos (Balb/c, fêmeas) e cães (beagles, fêmeas) foram exsanguinados sob anestesia com éter e anestesia com cetamina/isoflurano. Após a laparotomia, cada órgão (estômago, fígado, globo ocular, timo, músculo, medula óssea, útero, intestino delgado, esôfago, coração, rim, glândula salivar, intestino grosso, glândula mamária, cérebro, pulmão, pele, glândula supra-renal, ovário, pâncreas, baço, e bexiga) foi transferido para uma placa de 10 cm contendo PBS. Cada órgão foi cortado em PBS e, em seguida, submetido a perfusão de fixação durante a noite em tampão fosfato 0,1 M (pH 7,4) contendo paraformaldeído a 4% (PFA). A solução de perfusão foi descartada, a superfície do tecido dos órgãos foi lavada com PBS, uma solução de PBS contendo 10% de sacarose foi adicionada a um tubo de centrífuga de 50 ml, cada um dos tecidos foi adicionado ao tubo, e em seguida, o tubo foi agitado usando um rotor a 4 °C durante 2 horas. A solução foi substituída por uma solução de PBS contendo 20% de sacarose, e, em seguida, deixada em repouso a 4 °C até que o tecido afundasse. A solução foi substituída por uma solução de PBS contendo 30% de sacarose e em seguida deixada em repouso a 4 °C até que o tecido afundasse. O tecido foi removido e, em seguida, porções necessárias foram excisadas com um bisturi cirúrgico. Em seguida, um composto OCT (Tissue Tek), foi adicionado ao tecido a fim de que ele fosse completamente aplicado na superfície do tecido, e em seguida o tecido foi colocado em um criomolde. O criomolde foi colocado em gelo seco para o rápido congelamento. Em seguida, o tecido foi cortado de 10 μm a 20 μm utilizando um criostato (Leica). Os cortes foram secos em ar sobre lâminas de vidro, utilizando um secador de cabelo durante 30 minutos, para preparar o tecido cortado montado em uma lâmina de vidro. Em seguida, cada amostra foi colocada em uma garrafa de coloração preenchida com PBS-T (solução salina contendo 0,05% de Tween 20) e, em seguida, submetida a substituição do PBS-T por três vezes a cada 5 minutos. O excesso de água em torno dos cortes foi removido com Kimwipes, e em seguida, os cortes foram circulados usando uma caneta “DAKOPEN” (DAKO). Como soluções de bloqueio, um reagente de bloqueio de Ig de camundongo MOM (Vectastain) e uma solução de PBS-T contendo SBF a 10% foi colocado nas lâminas sobre o tecido de camundongo e cão, respectivamente, e em seguida deixado em repouso em câmara úmida à temperatura ambiente durante 1 hora. Em seguida, uma solução do anticorpo monoclonal anti-CAPRIN- 1 (anticorpo monoclonal #1 preparado no Exemplo 4) de 10 μg/ml ajustado com uma solução de bloqueio, que reage com as superfícies celulares de câncer e compreende a região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 42 e a região variável de cadeia leve da SEQ ID NO: 46, foi colocada sobre o tecido na lâmina e em seguida deixado em repouso durante a noite em câmara úmida a 4 °C. Foram realizadas lavagens de 10 minutos com PBS-T por 3 vezes, e em seguida, foi colocado um anticorpo anti-IgG MOM marcado com biotina (Vectastain) diluído 250 vezes com a solução de bloqueio, e em seguida, as lâminas foram incubadas em temperatura ambiente durante 1 hora em câmara úmida. Após dez (10) minutos de lavagem com PBS-T por 3 vezes, um reagente avidina-biotina ABC (Vectastain) foi colocado sobre as lâminas, e em seguida, a amostra foi deixada em repouso em câmara úmida à temperatura ambiente durante 5 minutos. Após de dez (10) minutos de lavagem com PBS-T por 3 vezes, foi colocada uma solução corante DAB (10 mg de DAB + 30% de H2O2 10 μl/0,05 M de Tris-HCl (pH 7,6) 50 ml), e em seguida, a amostra foi deixada em repouso em câmara úmida à temperatura ambiente durante 30 minutos. Após lavagem com água destilada, um reagente de hematoxilina (DAKO) foi colocado sobre a amostra e a amostra foi deixada em repouso à temperatura ambiente durante 1 minuto e, em seguida, lavada com água destilada. A lâmina de vidro foi imersa, em soluções de etanol a 70%, 80%, 90%, 95%, e finalmente, 100%, durante 1 minuto cada, em seguida, as lâminas ficaram em repouso durante a noite em xileno. As lâminas de vidro foram removidas, seladas com meio de montagem “Glycergel Mounting Medium” (DAKO), e em seguida, foram analisadas. Como resultado, a expressão da CAPRIN-1 foi observada ligeiramente dentro de células de cada tecido de glândulas salivares, rim, cólon e estômago, mas a expressão da mesma não foi observada nas superfícies celulares. Além disso, não foi observada a expressão em tecidos de outros órgãos. (5)-2 EXPRESSÃO DE CAPRIN-1 EM TECIDO DE CÂNCER DA MAMA DE CÃO

[146] Lâminas com cortes de congelação foram preparadas por um método semelhante ao descrito acima usando 108 espécimes de câncer de mama congelados a partir de tecido de cães patologicamente diagnosticados como portadores de câncer da mama maligno, e a coloração de imunohistoquímica foi realizada utilizando o anticorpo monoclonal #1, preparado no Exemplo 4. Como resultado, a expressão da CAPRIN-1 foi observada em 100 das 108 amostras (92,5%) e a CAPRIN-1 foi fortemente expressa na superfície das células cancerosas com um grau de atipismo particularmente elevado. (5)-3 EXPRESSÃO DE CAPRIN-1 EM TECIDO DE CÂNCER DA MAMA HUMANO

[147] A coloração de imunohistoquímica foi realizada utilizando 188 espécimes de tecido de câncer de mama humano em um arranjo tecidual em matriz (tissue array) de câncer de mama humano emblocado em parafina (BIOMAX). Após 3 horas de tratar do arranjo de tecido de câncer da mama em matriz a uma temperatura de 60 °C, a matriz foi colocada em uma garrafa de coloração com xileno, seguido pela substituição do xileno por três vezes a cada 5 minutos. Em seguida, um processo semelhante foi realizado com etanol e PBS- T em vez de xileno. A matriz de tecido de câncer de mama humano foi colocada em uma garrafa de coloração com tampão citrato 10 mM (pH 6,0) contendo 0,05% de Tween 20. Após 5 minutos de tratar a 125 °C, a matriz foi deixada em repouso em temperatura ambiente durante 40 minutos ou mais. O excesso de água em torno dos cortes foi removido com Kimwipes, e os cortes foram circulados com uma caneta DAKOPEN, e um bloqueador da peroxidase endógena (DAKO) foi adicionado gota a gota em quantidades apropriadas. Em seguida as amostras teciduais em matriz ficaram em repouso à temperatura ambiente durante 5 minutos, as amostras teciduais em matriz foram colocadas em uma garrafa de coloração com PBS-T, seguido pela substituição do PBS-T por três vezes a cada 5 minutos. Como solução de bloqueio, uma solução de PBS-T contendo SBF a 10% foi colocada na matriz, e em seguida, a matriz foi deixada em repouso em câmara úmida à temperatura ambiente durante 1 hora. Após a incubação, foi colocada uma solução do anticorpo monoclonal #1 de 10 μg/ml ajustado com uma solução de PBS-T contendo 5% de SBF, um anticorpo que reage com a superfície das células cancerosas e que foi preparado no Exemplo 4, e o arranjo tecidual em matriz ficou em repouso durante a noite em câmara úmida a 4 °C. Após dez (10) minutos de lavagem com PBS-T por 3 vezes, foi adicionado gota a gota um polímero conjugado marcado com peroxidase “Peroxidase Labeled Polymer Conjugated (DAKO)” sobre as lâminas em quantidades apropriadas, e em seguida, o arranjo tecidual em matriz ficou em repouso em câmara úmida à temperatura ambiente durante 30 minutos. Depois de dez (10) minutos após a lavagem com PBS-T por 3 vezes, uma solução corante DAB (DAKO) foi colocada sobre as lâminas e em seguida foi incubada em temperatura ambiente durante cerca de 10 minutos. A solução corante foi descartada, e foram realizadas lavagens de 10 minutos com PBS-T por 3 vezes, e depois lavagens com água destilada. O arranjo tecidual em matriz foi imerso em soluções de etanol a 70%, 80%, 90%, 95%, e finalmente, 100%, durante 1 minuto cada, em seguida, ficou em repouso durante a noite em xileno. As lâminas de vidro foram removidas, seladas com meio de montagem “Glycergel Mounting Medium” (DAKO), e em seguida, foram analisadas. Como resultado, foi observada a expressão forte de CAPRIN-1 em um total de 138 dos 188 espécimes de tecido de câncer da mama (73%).

(5)-4 EXPRESSÃO DE CAPRIN-1 EM TUMOR CEREBRAL MALIGNO HUMANO

[148] A coloração de imunohistoquímica foi realizada de acordo com um método semelhante ao utilizado no item (5)-3 acima com 247 espécimes teciduais de tumores cerebrais malignos em um arranjo tecidual em matriz (tissue array) de tumores cerebrais malignos humanos emblocado em parafina (BIOMAX), utilizando o anticorpo monoclonal #1 preparado no Exemplo 4. Como resultado, foi observada a forte expressão de CAPRIN-1 em um total de 227 dos 247 espécimes de tecido de tumor cerebral maligno humano (92%).

(5)-5 EXPRESSÃO DE CAPRIN-1 EM LINFONODO COM METÁSTASE DE CÂNCER DE MAMA HUMANO

[149] A coloração de imunohistoquímica foi realizada de acordo com um método semelhante ao utilizado no item (5)-3 acima com 150 espécimes teciduais de linfonodo com metástase de câncer de mama em um arranjo tecidual em matriz (tissue array) de linfonodos com metástase de câncer de mama humano emblocado em parafina (BIOMAX), utilizando o anticorpo monoclonal #1 preparado no Exemplo 4. Como resultado, foi observada a expressão forte de CAPRIN-1 em 136 de um total de 150 espécimes de tecido de linfonodo com metástase de câncer de mama (90%). Especificamente, foi revelado que a CAPRIN-1 foi fortemente expressa também em tecidos de câncer que tinham metástases de câncer de mama.

(5)-6 EXPRESSÃO DE CAPRIN-1 EM DIVERSOS TECIDOS DE CÂNCER HUMANO

[150] A coloração de imunohistoquímica foi realizada de acordo com um método semelhante ao anterior, com espécimes em diferentes arranjos teciduais em matriz emblocados em parafina de tecido de câncer humano (BIOMAX), utilizando o anticorpo monoclonal #1, preparado no Exemplo 4. Como resultado, foi observada uma forte expressão de CAPRIN-1 em câncer de esôfago, câncer de cólon, câncer de reto, câncer de pulmão, câncer renal, câncer de bexiga e câncer de colo uterino.

EXEMPLO 2 PREPARAÇÃO DE UMA NOVA PROTEÍNA ANTÍGENO DE CÂNCER HUMANO (1) PREPARAÇÃO DE PROTEÍNA RECOMBINANTE

[151] Com base no gene de SEQ ID NO: 1 obtido no Exemplo 1, uma proteína recombinante a partir do gene homólogo humano foi preparada pelo seguinte método. Foi realizada uma PCR em um volume total de 50 μL, com 1 μL de cDNA, dois primers(SEQ ID NOS: 37 e 38, compreendendo as sequencias para clivagem pelas enzimas de restrição SacI e XhoI) de 0,4 μM cada, 0,2 mM de dNTP, e 1,25U de polimerase PrimeStar HS (Takara Shuzo Co., Ltd.), preparada pela adição dos reagentes e um tampão de acompanhamento. A expressão foi confirmada por um método de RT-PCR para o cDNA utilizado entre os vários cDNAs derivados de tecidos ou células preparados no Exemplo 1. A PCR foi executada pela repetição de termociclagens de 98 °C por 10 segundos e 68 °C por 2,5 minutos por 30 ciclos, utilizando um termociclador Thermal Cycler (BIO RAD). Os dois primers acima são capazes de amplificar uma região codificante da sequência de aminoácido inteira de SEQ ID NO: 2. Após a PCR, o DNA amplificado foi submetido à eletroforese em gel de agarose a 1%, em seguida, um fragmento de DNA de cerca de 2,1 kpb foi purificado utilizando um kit “QIAquick Gel Extration Kit” (QIAGEN).

[152] O fragmento de DNA assim purificado foi ligado a um vetor de clonagem PCR-Blunt (Invitrogen). Após a transformação de Escherichia coli, com ele, o plasmídeo foi coletado. Verificou-se pelo sequenciamento do fragmento que o gene assim amplificado possui a sequência de interesse. O plasmídeo que possui uma sequência correspondente com a sequência de interesse foi tratado com as enzimas de restrição SacI e XhoI e depois foi purificado com um kit de extração em gel QIAquick. A sequência do gene de interesse foi introduzida em um vetor de expressão de Escherichia coli pET30a (Novagen), e tratada com as enzimas de restrição SacI e XhoI. A proteína recombinante fundida ao marcador His-tagpôde ser produzida utilizando o vetor. O plasmídeo foi transformado em Escherichia coli para a expressão, BL21(DE3) e, em seguida, a expressão foi induzida com 1 mM de IPTG, de modo que a proteína de interesse foi expressa na Escherichia coli. (2) PURIFICAÇÃO DE PROTEÍNA RECOMBINANTE

[153] A Escherichia coli recombinante obtida acima que expressa o gene de SEQ ID NO: 1 foi cultivada em meio LB contendo 30 μg/ml de canamicina a 37 °C até a absorbância a 600 nm atingir cerca de 0,7, foi adicionado isopropil-β-D-tiogalactopiranosida a uma concentração final de 1 mM, em seguida, as células foram cultivadas a 37 °C durante 4 horas. Subsequentemente, foi realizada a centrifugação a 4800 rpm durante 10 minutos, em seguida, as células foram coletadas. O precipitado celular resultante foi suspenso em solução salina tamponada com fosfato e centrifugado a 4800 rpm durante 10 minutos, em seguida, as células foram lavadas.

[154] As células foram suspensas em solução salina tamponada com fosfato e em seguida rompidas utilizando ultrassom em gelo. O lisado resultante das Escherichia coli ultrassonicada foi submetido à centrifugação a 6000 rpm durante 20 minutos e, em seguida, o sobrenadante resultante foi considerado como uma fração solúvel e o precipitado foi considerado como uma fração insolúvel.

[155] A fração solúvel foi adicionada a uma coluna de quelato de níquel ajustada de acordo com um método convencional (transportador: resina “Chelating Sepharose®Fast Flow” (GE Healthcare), capacidade de coluna de 5 ml, e um tampão de equilíbrio: 50 mM de tampão cloridrato (pH 8,0)). As frações não adsorvidas foram lavados com 50 mM de tampão cloridrato (pH 8,0) em uma quantidade de 10 vezes a capacidade da coluna e 20 mM de tampão fosfato (pH 8,0) contendo 20 mM de imidazol. Imediatamente após a lavagem, 6 leitos foram eluídos com tampão fosfato a 20 mM (pH 8,0) contendo 100 mM de imidazol. A eluição da proteína de interesse foi confirmada pela coloração com a coloração de Coomassie na fração de eluição com tampão de fosfato 20 mM (pH 8,0) contendo 100 mM de imidazol e, em seguida, a fração de eluição foi adicionada a uma coluna de troca aniônica forte (transportador: resina “Q Sepharose®Fast Flow” (GE Healthcare), capacidade de coluna de 5 ml, e 20 mM de tampão fosfato (pH 8,0) como tampão de equilíbrio). Uma fração não adsorvida foi lavada com tampão fosfato 20 mM (pH 7,0) em uma quantidade de 10 vezes a capacidade da coluna e 20 mM de tampão de fosfato (pH 7,0) contendo cloreto de sódio 200 mM. Imediatamente após a lavagem, 5 leitos foram eluídos com tampão fosfato 20 mM (pH 7,0) contendo 400 mM de cloreto de sódio, assim a fração purificada da proteína que tem a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 2 foi obtida.

[156] 200 μL de cada amostra purificada obtida pelo método descrito acima foi distribuída em 1 ml de tampão de reação (20 mM de Tris-Hcl, 50 mM de NaCl, 2 mM de CaCl2, pH 7,4), seguida pela adição de 2 μL de enteroquinase (Novagen). Depois disso, o resultante foi deixado em repouso durante a noite em temperatura ambiente de modo que o His-tag fosse clivado, e depois a purificação foi realizada utilizando um kit de captura de clivagem por enteroquinase “Enterokinase Cleavage Capture Kit” (Novagen), de acordo com os protocolos do fabricante. Em seguida, 1,2 ml de amostra purificada obtida pelo método descrito acima foram submetidos à substituição do tampão por tampão fosfato fisiológico (Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.), utilizando ultrafiltração NANOSEP 10K OMEGA (PALL). Adicionalmente, a filtração estéril foi realizada utilizando um HT Tuffryn Acrodisc 0,22μm (PALL), em seguida, o resultante foi utilizado no experimento seguinte.

EXEMPLO 3 PREPARAÇÃO DA ANTICORPO MONOCLONAL DE FRANGO CONTRA CAPRIN-1

[157] 300 μg da proteína antígeno (CAPRIN-1 humana) exibida pela SEQ ID NO: 2 e preparada no Exemplo 2, foi misturada com uma quantidade equivalente de adjuvante completo de Freund, em seguida, foi utilizada como uma solução de antígeno para um frango. A solução de antígeno foi administrada intraperitonealmente em frangos de 7 semanas de idade, em seguida, a administração foi realizada por 7 vezes a cada 4 semanas, e, assim, a imunização foi concluída. Cada baço foi retirado no dia 4 após a imunização final, e colocado entre duas lâminas de vidro esterilizadas e, em seguida, esmagados.. O produto resultante foi lavado com PBS (-) (Nissui) e então centrifugado a 1500 rpm durante 10 minutos para remover o sobrenadante. Este procedimento foi repetido 3 vezes, de modo que os esplenócitos foram obtidos. Os esplenócitos assim obtidos e as células de mieloma de frango com deficiência de cadeia leve foram misturados em uma proporção de 5:1. As células de mieloma de frango utilizadas foram estabelecidas a partir de um frango pela transformação utilizando um vírus da reticuloendoteliose aviária. A solução de PEG preparada pela mistura de 200 μL de meio IMDM contendo 10% de SBF aquecido a 37 °C e 800 μL de PEG1500 (Boehringer) foi adicionada à mistura, deixado em repouso durante 5 minutos para a fusão celular, e depois submetida à centrifugação a 1700 rpm durante 5 minutos. Após a remoção do sobrenadante, as células foram suspensas em 300 ml de meio IMDM contendo 10% de SBF, suplementado com uma solução de HAT (Gibco) (2% em equivalentes) (meio HAT seletivo), em seguida, a suspensão de células foi plaqueada em trinta placas de 96 poços (Nunc) a 100 μL por poço. As células foram cultivadas por 7 dias a 37 °C sob condições de 5% de CO2, de modo que os hibridomas preparados pela fusão de esplenócitos e células de mieloma foram obtidos.

[158] Os hibridomas foram selecionados utilizando de um marcador de afinidade de ligação do anticorpo produzido pelos hibridomas preparados para a proteína CAPRIN-1. A solução de proteína CAPRIN-1 (1 μg/ml) preparada no Exemplo 2 foi adicionada a uma placa de 96 poços com 100 μL por poço e, em seguida, deixada em repouso a 4 °C durante 18 horas. Cada poço foi lavado 3 vezes com PBS-T, 400 μL de uma solução 0,5% de Albumina de Soro Bovino (BSA) (Sigma) foram adicionados em cada poço, em seguida, a placa foi deixada em repouso em temperatura ambiente durante 3 horas. A solução foi removida e, em seguida, os poços foram lavados três vezes com 400 μL de PBS-T por poço. O sobrenadante da cultura dos hibridomas obtidos acima foi adicionado a um volume de 100 μL por poço e em seguida as placas foram deixadas em repouso à temperatura ambiente durante 2 horas. Após a lavagem de cada poço por três vezes com PBS-T, um anticorpo IgY de anti-IgY de frango marcado com HRP (Sigma) diluído 5000 vezes com PBS foi adicionado a 100 μL por poço e o resultante foi deixado em repouso à temperatura ambiente durante 1 hora. Após a lavagem do poço por três vezes com PBS-T, 100 μL de uma solução de substrato TMB (Thermo) foram adicionados em cada poço e em seguida a placa foi deixada em repouso durante 15 a 30 minutos para a reação de coloração. Após o desenvolvimento de cor, 100 μL de ácido sulfúrico 1N foi adicionado em cada poço para parar a reação, em seguida, as absorbâncias a 450 nm e 595 nm foram mensuradas utilizando um espectrômetro de absorção. Como resultado, os hibridomas que produzem anticorpos com altos valores de absorvência foram selecionados.

[159] Os hibridomas assim selecionados foram adicionados a uma placa de 96 poços a 0,5 células por poço e então cultivados. Após 1 semana, foram observados hibridomas que formaram colônias isoladas nos poços. Estas células nos poços de cultura foram cultivadas por mais tempo, em seguida, os hibridomas foram selecionados utilizando como um marcador a afinidade de ligação dos anticorpos produzidos pelos hibridomas clonados com a proteína CAPRIN-1. A solução de proteína CAPRIN-1 (1 μg/ml) preparada no Exemplo 2 foi adicionada a uma placa de 96 poços, 100 μL por poço, e em seguida, foi deixada em repouso a 4 °C durante 18 horas. Cada poço foi lavado três vezes com PBS-T, 400 μL de uma solução 0,5% de BSA foram adicionados em cada poço, em seguida, a placa foi deixada em repouso em temperatura ambiente durante 3 horas. A solução foi removida e, em seguida, os poços foram lavados três vezes com 400 μL de PBS-T por poço. 100 μL de cada sobrenadante de cultura dos hibridomas obtidos acima foram adicionados por poço, e depois a placa foi deixada em repouso à temperatura ambiente durante 2 horas. Após a lavagem de cada poço por três vezes com PBS-T, 100 μL de um anticorpo anti-IgY de frango marcado com HRP (Sigma) diluído 5.000 vezes com PBS foram adicionados por poço, em seguida, a placa ficou em repouso à temperatura ambiente durante 1 hora. Após a lavagem do poço por três vezes com PBS-T, 100 μL de uma solução de substrato TMB (Thermo) foram adicionados em cada poço e em seguida a placa foi deixada em repouso durante 15 a 30 minutos para a reação de coloração. Após o desenvolvimento de cor, 100 μL de ácido sulfúrico 1N foi adicionado em cada poço para parar a reação, em seguida, as absorbâncias a 450 nm e 595 nm foram mensuradas utilizando um espectrômetro de absorção. Como resultado, diversas linhagens de células de hibridoma produtoras de anticorpos monoclonais reativos contra a proteína CAPRIN-1 foram obtidas.

[160] Em seguida, destes anticorpos monoclonais, os anticorpos reativos com as superfícies celulares das células de câncer de mama que expressam CAPRIN-1 foram selecionados. Especificamente, a 5 x 105células da linhagem celular de câncer de mama humano MDA-MB-231V foram submetidas a centrifugação em um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml, e 100 μL do sobrenadante da cultura de cada um dos hibridomas acima foi adicionado ao tubo, em seguida, o tubo foi deixado em repouso em gelo durante 1 hora. Após lavagem com PBS, um anticorpo de cabra anti-IgG de frango (H + L) marcado com FITC (SouthernBiotech) diluído 30 vezes com PBS contendo 0,1% de SBF foi adicionado, em seguida, a solução resultante foi deixada em repouso em gelo durante 1 hora. Após lavagem com PBS, a intensidade da fluorescência foi mensurada usando um FACScalibur (Becton, Dickinson & Company). Enquanto isso, os procedimentos semelhantes ao acima foram realizados para o meio de cultura de hibridomas, de forma que uma amostra controle foi obtida. Como resultado, foi selecionado um anticorpo monoclonal (anticorpo monoclonal #1) que exibiu intensidade de fluorescência mais forte do que a do controle, ou seja, que reagiu com as superfícies celulares de células de câncer de mama expressando CAPRIN-1.

EXEMPLO 4 CARACTERIZAÇÃO DO ANTICORPO SELECIONADO (1) CLONAGEM DE GENES DAS REGIÕES VARIÁVEIS DO ANTICORPO MONOCLONAL ANTI-CAPRIN-1

[161] O mRNA foi extraído a partir de uma linhagem de células de hibridoma derivada de frango que produz anticorpos monoclonais (selecionado no exemplo 3) reativos com as superfícies de células câncer de mama que expressam CAPRIN-1. Um método de RT-PCR utilizando primers específicos para a sequência derivada da FR1 de frango e sequência derivada da FR4 de frango foi realizado para os mesmos, e os genes da região variável de cadeia pesada (VH) e cadeia leve (VL) do anticorpo foram obtidos. O mRNA também foi extraído a partir de duas linhagens de células de hibridoma derivada de camundongos que produzem anticorpos monoclonais reativos com as superfícies de células câncer de mama que expressam CAPRIN-1. Um método de RT-PCR utilizando primers específicos para a sequência derivada da FR1 de camundongo e sequência derivada da FR4 de camundongo foi realizado para os mesmos, e os genes da região variável de cadeia pesada (VH) e cadeia leve (VL) de cada um dos anticorpos foram obtidos. Para a determinação da sequência, estes genes foram clonados em um vetor pCR2.1 (Invitrogen).

(1)-1 RT-PCR

[162] Após a extração do RNA total a partir de 106células de cada linhagem celular de hibridoma utilizando um kit “High Pure RNA Isolation Kit” (Roche), o cDNA foi sintetizado utilizando o kit de síntese “PrimeScriptII 1st strand cDNA Synthesis Kit” (Takara). Estes procedimentos foram realizados de acordo com protocolos anexados a cada kit.

[163] O gene da região variável de cadeia pesado do anticorpo de frango e o gene da região variável de cadeia leve de frango, e o gene da região variável de cadeia pesada do anticorpo de camundongo e o gene da região variável de cadeia leve do anticorpo de camundongo foram cada um amplificados por um método de PCR de acordo com um método convencional, utilizando o cDNA sintetizado como molde e a DNA polimerase “KOD-Plus DNA-Polimerase” (TOYOBO).

[164] Para obter o gene da região VH do anticorpo de frango, um primerespecífico para a sequência FR1 da cadeia pesada de frango e um primer específico para a sequência FR4 da cadeia pesada de frango FR4 foram utilizados.. Adicionalmente, para obter o gene da região VL, um primerespecífico para a sequência FR1 da cadeia leve de frango e um primerespecífico para a sequência FR4 da cadeia leve de frango FR4 foram utilizados. Os genes das regiões VH e VL do anticorpo de camundongo foram obtidos por um modo similar ao descrito acima. Especificamente, um primerespecífico para a sequência FR1 da cadeia pesada de camundongo, um primerespecífico para a sequência FR4 da cadeia pesada de camundongo, um primerespecífico para a sequência FR1 da cadeia leve de camundongo e um primerespecífico para a sequência FR4 da cadeia leve de camundongo foram usados.

[165] Os produtos da PCR assim obtidos foram submetidos a eletroforese em gel de agarose, e as bandas de DNA da região VH e da VL região foram excisadas. Os fragmentos de DNA foram purificados utilizando um kit de purificação “QIAquick Gel purification kit” (QIAGEN) de acordo com o protocolo do fabricante. O DNA purificado foi clonado no vetor pCR2.1 utilizando o kit de clonagem TA (Invitrogen). O vetor ligado foi transformado em células competentes DH5 (TOYOBO), de acordo com um método convencional. 10 clones de cada transformante foram cultivados durante a noite em meio 100 μg/ml de ampicilina) a 37 °C, em seguida, o DNA plasmidial foi purificado usando um kit de purificação “Qiaspin Miniprep kit” (QIAGEN).

(1)-2 DETERMINAÇÃO DA SEQUÊNCIA

[166] As sequências gênicas da região VH e da região VL em cada plasmídeo obtido acima foram analisadas com um primer direto (forward) M13 (SEQ ID NO: 47) e um primer reverso (reverse) M13 (SEQ ID NO: 48) em um sequenciador de fluorescência (DNA Sequencer 3130XL; ABI), utilizando um kit de sequenciamento “Big Dye Terminator Cycle Sequencing Kit” Ver3.1 (ABI) de acordo com os protocolos do fabricante. Como resultado, cada sequência gênica foi determinada. As sequências foram idênticas entre os 10 clones.

[167] A sequência obtida do gene codificante da região variável de cadeia pesada do anticorpo monoclonal derivado de frango é representada pela SEQ ID NO: 49 e a sequência de aminoácidos derivada da mesma é representada pela SEQ ID NO: 42, e a sequência obtida do gene codificante da região variável de cadeia leve é representada pela SEQ ID NO: 50 e a sequência de aminoácidos derivada da mesma é representada pela SEQ ID NO: 46.

[168] Especificamente, foi revelado que o anticorpo monoclonal #1 compreende a região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 42 e a região variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 46, em que a CDR1, CDR2 e CDR3 na região variável de cadeia pesada consistem das sequências de aminoácidos de SEQ ID NOS: 39, 40, e 41, respectivamente, e a CDR1, CDR2 e CDR3 da região variável de cadeia leve consistem das sequências de aminoácidos de SEQ ID NOS: 43, 44, e 45, respectivamente.

(2) PREPARAÇÃO DE ANTICORPO RECOMBINANTE QUIMÉRICO HUMANO-FRANGO E ANTICORPO QUIMÉRICO CAMUNDONGO-FRANGO

[169] Um fragmento de amplificação do gene da região variável de cadeia pesada (SEQ ID NO: 42) do anticorpo monoclonal de frango #1 obtido no item (1) acima, foi tratado em ambas as extremidades com enzimas de restrição e em seguida purificado. O fragmento resultante foi inserido em um vetor pcDNA4/myc-His (Invitrogen) de acordo com um método convencional, no qual uma sequência líder derivada do anticorpo de frango compreendendo a SEQ ID NO: 51 e uma região constante da cadeia H de IgG1 humana compreendendo a SEQ ID NO : 52 já haviam sido introduzidas. Além disso, um fragmento de amplificação do gene da região variável de cadeia leve do anticorpo monoclonal de frango #1 (SEQ ID NO: 46) foi tratado em ambas as extremidades com as enzimas de restrição e, então, purificado. O fragmento resultante foi inserido em um vetor pcDNA3.1/myc-His (Invitrogen) de acordo com um método convencional, no qual uma sequência líder derivada de anticorpo de frango compreendendo a SEQ ID NO: 51 e uma região constante da cadeia L de IgG1 humana compreendendo a SEQ ID NO : 53 já haviam sido introduzidas.

[170] Em seguida, o vetor recombinante acima no qual a região variável de cadeia pesada (SEQ ID NO: 42) do anticorpo monoclonal de frango #1 foi inserida, e o vetor recombinante acima dentro do qual a região variável de cadeia leve (SEQ ID NO: 46) do anticorpo monoclonal #1 foi inserida, foram introduzidos em células CHO-K1 (obtidas a partir do Banco de Células RIKEN). Especificamente, 2 x 105células CHO-K1 cultivadas em 1 ml de meio F12 de Ham (Invitrogen) contendo 10% de SBF por poço de uma placa de cultura de 12 poços foram lavadas com PBS(-). 1 ml de meio F12 de Ham contendo 10% de SBF foi adicionado por poço e, em seguida, uma mistura de 250 ng de cada um dos vetores acima dissolvidos em 30 μL de OptiMEM (Invitrogen) e 30 μL de um reagente de transfecção Polyfect (QIAGEN) foram adicionados a cada poço. Células CHO-K1 nas quais o vetor recombinante acima havia sido introduzido foram cultivadas em meio F12 de Ham contendo 10% de SBF, suplementado com 200 μg/mL de zeocina (Invitrogen) e 200 μg/ml de geneticina (Roche). As células CHO-K1 nas quais o vetor recombinante acima foi introduzido foram plaqueadas em placas de 96 poços em uma densidade de 0,5 células por poço. Dessa forma, foi preparada uma linhagem celular capaz de produzir estavelmente um anticorpo quimérico humano- frango #1 (também designado como #1) que tem a região variável do anticorpo monoclonal de frango #1. A linhagem celular assim preparada foi cultivada em um frasco de 150 cm2 contendo 30 ml de meio sem soro OptiCHO (Invitrogen) a 5 x 105 células/ml durante 5 dias. Em seguida, um sobrenadante da cultura contendo o #1 foi obtido.

[171] Com um método semelhante ao descrito acima, um fragmento de amplificação do gene da região variável de cadeia pesada (SEQ ID NO: 42) do anticorpo monoclonal de frango #1, foi tratado em ambas extremidades com enzimas de restrição e em seguida purificado. O fragmento resultante foi inserido de acordo com um método convencional em um vetor pcDNA4/myc-His (Invitrogen) no qual a sequência líder derivada de anticorpo de frango e a região constante da cadeia L de IgG1 humana já haviam sido inseridas. Além disso, um fragmento de amplificação do gene da região variável de cadeia leve (SEQ ID NO: 46) do anticorpo monoclonal de frango #1 foi tratado em ambas as extremidades com as enzimas de restrição e, então, purificado. O fragmento resultante foi então inserido de acordo com um método convencional em um vetor pcDNA3.1/myc-His (Invitrogenno qual a sequência líder derivada de anticorpo de frango e a região constante da cadeia L de IgG1 humana já haviam sido inseridas. O resultante foi introduzido em células CHO-K1 de um modo semelhante ao descrito acima, e, assim, foi preparada uma linhagem de células que produz de maneira estável um anticorpo quimérico camundongo- frango # 1 compreendendo a região variável do anticorpo monoclonal de frango #1. As células foram cultivadas a uma densidade de 5 x 105células/mL, utilizando um balão de 150 cm2 e 30 mL e de meio OptiCHO sem soro (Invitrogen) durante 5 dias, de modo que um sobrenadante de cultura contendo o anticorpo quimérico camundongo-frango #1 foi obtido.

(3) EXPRESSÃO DE CAPRIN-1 SOBRE A SUPERFÍCIE DE VÁRIAS CÉLULAS CANCEROSAS UTILIZANDO O ANTICORPO ANTI-CAPRIN-1 #1

[172] Em seguida, 7 linhagens de células de câncer de mama (MDA-MB-157, T47D, MRK-nu-1, MDA-MB-231V, BT20, SK-BR-3, e DA-MB- 231T) nas quais um gene expressando CAPRIN-1 foi observado, e outras três linhagens de células de câncer de mama (MDA-MB-231c, MCF-7 e ZR75-1), 5 linhagens de células de glioma (T98G, SNB19, U251, U87MG, e U373), 4 linhagens de células de câncer renal (Caki-1, Caki-2, A498 e ACHN), 2 linhagens de células de câncer gástrico (MNK28 e MNK45), 5 linhagens de células de câncer colorretal (HT29, LoVo, Caco2, SW480 e HCT116), 3 linhagens de células de câncer de pulmão (A549, QG56 e PC8), 4 linhagens de células de leucemia (AML5, Namalwa, BDCM, RPI1788), uma linhagem de células de linfoma (Ramos), uma linhagem de células de câncer do colo uterino (SW756), uma linhagem de células de câncer de bexiga (T24), e uma linhagem de células de câncer de esôfago (KYSE180) foram examinadas quanto à expressão de proteína CAPRIN-1 sobre as superfícies celulares de cada linhagem de células utilizando os sobrenadantes de cultura das células CHO-K1 que continham o anticorpo #1 obtido no item (2) acima. 106células de cada linhagem de células foram centrifugadas em um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Cada sobrenadante de cultura de células CHO-K1 (100 μL) contendo #1 obtido no item (2) acima foi adicionado e em seguida incubado em gelo durante 1 hora. Após a lavagem com PBS, um anticorpo de cabra anti-IgG humano (H+L) marcado com FITC (SouthernBiotech) e um anticorpo anti-IgG de camundongo (H+L) marcado com FITC (Invitrogen) diluído 500 vezes com PBS contendo 0,1% de SBF foram adicionados, em seguida, a solução resultante ficou em repouso em gelo durante 1 hora. Após lavagem com PBS, a intensidade da fluorescência foi mensurada usando um FACS Calibur (Becton, Dickinson & Company). Enquanto isso, os procedimentos semelhantes aos descritos acima foram realizados utilizando um sobrenadante de cultura de células CHO-K1 em que nenhum gene de anticorpo e meio para a cultura de hibridomas foram introduzidos, de forma que uma amostra de controle negativo foi preparada. Como resultado, as células às quais o anticorpo #1 foi adicionado exibiu intensidade de fluorescência 20% mais forte em comparação com o controle. Especificamente, a intensidade de fluorescência aumentou em 4.900% no caso da SK-BR-3 e 5.000% no caso da MDA-MB-231V. Com estes resultados foi revelado que a proteína CAPRIN-1 estava expressa sobre as superfícies das membranas celulares das linhagens de células de câncer humano acima. A percentagem de aumento na intensidade de fluorescência acima foi expressa como uma percentagem do aumento na intensidade de fluorescência média (nível MFI) em cada tipo de célula e foi calculada pela seguinte fórmula.

[173] Percentagem de aumento na intensidade média de fluorescência (percentagem de aumento na intensidade de fluorescência) (%) = ((nível MFI em células que reagiram com o anticorpo anti-CAPRIN-1 humana) - (nível MFI do controle)) / (nível MFI do controle) x 100.

(4) EFEITOS ANTITUMORAIS (ATIVIDADEADCC) DO ANTICORPO ANTI-CAPRIN-1 #1 CONTRA CÉLULAS DE CÂNCER

[174] Em seguida, o anticorpo anti-CAPRIN-1 #1 foi avaliado quanto à sua citotoxicidade (atividade ADCC) celular contra células de câncer. Cada sobrenadante da cultura de células produtora de #1 obtido no item (2) acima foi purificado utilizando uma coluna “Hitrap ProteinA Sepharose FF” (GE Healthcare), submetido a substituição do tampão com PBS(-), e em seguida filtrado com um filtro de 0,22 μm (Millipore). Os resultantes foram utilizados como anticorpos para a medição de atividade. 106 células da linhagem de células de câncer de mama humano MDA-MB-157 foram coletadas em um tubo de centrífuga de 50 ml, foi adicionado 100 μCi de crômio-51, e seguida, foi realizada a incubação a 37 °C durante 2 horas. Subsequentemente, o produto resultante foi lavado três vezes com meio RPMI 1640 contendo 10% de SBF. As células foram adicionadas a uma placa de 96 poços de fundo em V em uma densidade de 5 x 103 células por poço para utilização como células alvo. Os anticorpos purificados acima foram adicionados às células a uma concentração final de 1 μg/ml. 2,5 x 105 células de linfócitos, separadas do sangue periférico humano de acordo com um método convencional foram adicionadas e, em seguida, cultivadas sob condições de 37 °C e 5% de CO2 durante 4 horas. Após a cultura, a quantidade de crômio-51 liberado a partir de células de câncer danificadas em um sobrenadante da cultura foi mensurada, e a atividade ADCC de cada anticorpo anti-CAPRIN-1 contra as células cancerosas foi calculada. Como amostras de controle negativo, foi utilizada uma amostra preparada pela adição de PBS em vez de anticorpos anti-CAPRIN-1 e uma amostra preparada pela adição de um anticorpo de controlo isotípico, em vez de anticorpos anti-CAPRIN- 1. Como resultado, o anticorpo #1 exibiu mais de 30% ou mais de atividade citotóxica contra a linhagem MDA-MB-157 (vide Fig. 2). Em contraste, a atividade da amostra de controle negativo preparada pela adição de PBS e a atividade na amostra de controle negativo preparada pela adição de anticorpo controle isotípico foram de 1,1% e 2,0%, respectivamente. Do mesmo modo, o anticorpo #1 foi avaliado quanto à atividade ADCC contra outras células cancerosas, incluindo linhagens de células de glioma T98G e U373, linhagens de células de câncer de pulmão A549 e QG56, linhagens de células de câncer renal Caki-1 e ACHN, linhagem de células de câncer do colo uterino SW756, linhagem de células de câncer de bexiga T24, linhagem de células de câncer de esôfago KYSE180, linhagens de células de câncer gástrico MKN28 e MNK45, linhagem de células de câncer colorretal SW480, linhagem de células de leucemia AML5, linhagem de células de linfoma Ramos. Como resultado, o anticorpo #1 exibiu 16,4% de atividade contra T98G (1,2% no caso do controle isotípico), 23,1% contra U373 (3,2% no caso do controle isotípico), 36,1% contra A549 (3,0% no caso do controle isotípico), 33,5% contra QG56 (0,5% no caso do controle isotípico), 28,3% contra Caki-1 (2,6% no caso do controle isotípico), 25,1% contra ACHN (1,6% no caso do controle isotípico), 27,9% contra SW756 (2,2% no caso do controle isotípico), 25,8% contra T24 (2,0% no caso do controle negativo), 26,7% contra KYSE180 (3,0% no caso do controle isotípico), 21,5% contra MNK28 (1,9% no caso do controle isotípico), 23,0% contra MNK45 (3,0% no caso do controle isotípico), 24,0% contra SW480 (1,8% no caso do controle isotípico), 8,3% contra AML5 (1,8% no caso do controle isotípico), e 8,0% contra Ramos (2,2% no caso do controle isotípico). Foi demonstrado pelos resultados acima que o anticorpo anti-CAPRIN-1 #1 obtido causa danos a várias células de câncer humano que expressam CAPRIN-1.

(5) EFEITOS ANTITUMORAIS (ATIVIDADE CDC) DO ANTICORPO ANTI-CAPRIN-1 #1 CONTRA CÉLULAS DE CÂNCER

[175] Em seguida, o anticorpo anti-CAPRIN-1 #1 foi avaliado quanto à atividade citotóxica (atividade CDC) contra células de câncer. O sangue coletado de um coelho foi adicionado a um tubo Eppendorf e deixado em repouso à temperatura ambiente durante 60 minutos, em seguida, foi submetido a 5 minutos de centrifugação a 3000 rpm. Dessa forma, o soro para medição da atividade CDC foi preparado. 106células de câncer de mama humano MDA-MB- 213V foram coletadas em um tubo de centrífuga de 50 ml, foi adicionado 100 μCi de crômio-51, e seguida, foi realizada a incubação a 37 °C durante 2 horas. O produto resultante foi lavado três vezes com meio RPMI 1640 contendo 10% de SBF. Subsequentemente, as células foram suspensas em meio RPMI contendo o soro de coelho preparado acima (50%) e, em seguida, as células foram adicionadas a uma placa de 96 poços com fundo em V em uma densidade de 5 x 103 células por poço. O anticorpo #1 obtido no item (5) acima foi adicionado às células em uma concentração final de 1 μg/ml e, em seguida, as células foram cultivadas durante 4 horas a 37 °C, em condições de 5% de CO2. Após a cultura, a quantidade de crômio-51 liberado a partir de células tumorais danificadas em um sobrenadante da cultura foi mensurada, e então, a atividade CDC contra as células MDA-MB-213V foi calculada. Como resultado, o anticorpo #1 exibiu 25% ou mais de atividade CDC. Portanto, foi revelado que o anticorpo #1 pode danificar células de câncer que expressam CAPRIN-1 também pela atividade CDC.

EXEMPLO 5 EFEITOS ANTITUMORAIS IN VIVO DO ANTICORPO ANTI-CAPRIN-1 #1 EM CAMUNDONGOS

[176] Em seguida, o anticorpo anti-CAPRIN-1 #1 obtido foi avaliado quanto aos seus efeitos antitumorais in vivo em camundongos enxertados com tumor. Os anticorpos utilizados no presente foram preparados pela purificação em coluna do sobrenadante da cultura de cada célula produtora de #1, da mesma maneira que foi descrita acima.

[177] Os efeitos antitumorais do anticorpo #1 foram examinados usando ratos portadores de tumores nos quais uma linhagem de células de câncer derivada de camundongo expressando CAPRIN-1 foi transplantada. Células 4T1 (adquiridas da ATCC) foram transplantadas subcutaneamente na região dorsal de 20 camundongos Balb/c (SLC Japan Inc.) a uma densidade de 5x105células por camundongo. Foi deixado que os cânceres crescessem até um tamanho de cerca de 5 mm de diâmetro. O anticorpo #1 foi administrado por via intraperitoneal em 10 camundongos dentre os 30 camundongos portadores de tumor, em uma quantidade de 200 μg (em 200 μL) por camundongo. Posteriormente, a mesma quantidade de anticorpo foi administrada por via intraperitoneal a cada camundongo portador de tumor em um total de 3 vezes dentro de 2 dias. Os tamanhos dos cânceres foram medidos todos os dias e os efeitos antitumorais foram examinadas por meio da observação. Enquanto isso, como grupo controle, foi administrado PBS (-) em vez de anticorpos para os 10 camundongos restantes portadores de tumor. Como resultado da observação dos efeitos antitumorais, no grupo teste ao qual o anticorpo anti-CAPRIN-1 #1 foi administrado, os cânceres foram considerados como tendo regredido para cerca de 55% no dia 4, cerca de 32% no dia 6, cerca de 7% no dia 8, e observou- se que os cânceres regrediram quase que completamente antes dos dias 10 a 14, de modo que o volume do tumor no início da administração do anticorpo foi designada com sendo de 100% (vide a Fig. 3). No grupo controle ao qual foi administrado PBS(-), o tamanho do tumor aumentou para cerca de 170%, 270%, 440% e 670% nos dias 4, 6, 8, e 11, respectivamente (vide Fig. 3). Foi demonstrado pelos resultados que o anticorpo #1 obtido exibe forte efeito antitumoral in vivo contra células de câncer que expressam CAPRIN-1. O tamanho do tumor (câncer) foi calculado como um volume utilizando a fórmula: comprimento do eixo maior x comprimento do eixo menor x comprimento do eixo menor x 0,5.

APLICABILIDADE INDUSTRIAL

[178] Os anticorpos da presente invenção são úteis para tratar e/ou prevenir um câncer.

[179] Todas as publicações, patentes e pedidos de patentes citados no presente são integralmente incorporados ao presente pela referência.

LISTAGEM DE SEQUENCIAS EM TEXTO LIVRE

[180] SEQ ID NOS: 31-38, 47, e 48: primers.

Claims (9)

1. ANTICORPO, caracterizado por compreender uma região variável de cadeia pesada compreendendo regiões determinantes de complementaridade (CDRs) 1 a 3 representadas por SEQ ID NOS: 39, 40, e 41, respectivamente, e uma região variável de cadeia leve compreendendo CDRs 1 a 3 representadas por SEQ ID NOS: 43, 44, e 45, respectivamente, e ter reatividade imunológica com uma proteína CAPRIN-1.

2. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por ser um anticorpo humano, anticorpo humanizado, anticorpo quimérico, anticorpo com cadeia única, ou anticorpo biespecífico.

3. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, caracterizada por compreender um anticorpo, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 2, ou um fragmento do mesmo, como um ingrediente ativo.

4. COMPOSIÇÃO, de acordo com a reivindicação 3, caracterizada por compreender adicionalmente um agente antitumoral.

5. COMBINAÇÃO FARMACÊUTICA, caracterizada por compreender a composição farmacêutica, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 3 a 4, e uma composição farmacêutica contendo um agente antitumoral.

6. USO DE UM ANTICORPO, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 2, caracterizado por ser para a fabricação de um medicamento para tratar e/ou prevenir um câncer.

7. USO DE UMA COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 3 a 4, caracterizado por ser para a fabricação de um medicamento para tratar e/ou prevenir um câncer.

8. USO DE UMA COMBINAÇÃO FARMACÊUTICA, conforme definida na reivindicação 5, caracterizado por ser para a fabricação de um medicamento para tratar e/ou prevenir um câncer.

9. USO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 a 8, caracterizado pelo câncer ser câncer de mama, tumor cerebral, leucemia, linfoma, câncer de pulmão, mastocitoma, câncer renal, câncer de colo uterino, câncer de esôfago, câncer gástrico, câncer de bexiga, ou câncer colorretal.

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