WO2010113680A1 - 乳酸菌の培養方法および飲食品 - Google Patents

乳酸菌の培養方法および飲食品 Download PDF

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中野　正理
美香 有福
晴美 水越
進 水澤
一雅 木村
伊藤　雅彦
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    • A23V2400/11—Lactobacillus
    • A23V2400/125—Casei

Definitions

  • the present invention relates to a method for culturing lactic acid bacteria and a food or drink containing a lactic acid bacteria culture obtained by the method.
  • lactic acid bacteria are used in the production of dairy products such as cheese, fermented milk and lactic acid bacteria beverages, and various fermented foods such as kimchi and pickles.
  • dairy products such as cheese, fermented milk and lactic acid bacteria beverages
  • various fermented foods such as kimchi and pickles.
  • various physiological functions such as the intestinal effect of lactic acid bacteria have been clarified, and bacterial bodies of lactic acid bacteria themselves and various lactic acid bacteria cultures have been used as materials for health foods and pharmaceuticals.
  • dairy products such as cheese, fermented milk and lactic acid bacteria beverages, and various fermented foods such as kimchi and pickles.
  • various physiological functions such as the intestinal effect of lactic acid bacteria have been clarified, and bacterial bodies of lactic acid bacteria themselves and various lactic acid bacteria cultures have been used as materials for health foods and pharmaceuticals.
  • Lactic acid bacteria are cultured in various forms, but for the production of lactic acid bacteria preparations and various fermented milk foods such as fermented milk, lactic acid bacteria beverages, and cheese, milk components such as animal milk are used as a medium. Most often. However, since many lactic acid bacteria generally have strict auxotrophy, when only milk components are used as a medium, many bacteria do not grow so much. In addition, even in the case of a relatively proliferative bacterium, in order to obtain a culture having a sufficient acidity (acid production amount) in the production of a lactic acid bacteria beverage or the like, it is necessary to perform a long-time culture. .
  • Patent Document 1 a method using a water extract of sake lees and / or a water extract of liquor treated with proteolytic enzyme
  • Patent Document 2 a method using an extract extracted from leaves of a genus Coffea
  • Patent Document 3 lipids
  • Patent Document 4 extracted teas, leeks and ginger obtained by extraction using an acid as a growth promoter for lactic acid bacteria. It has been found that a product (extract) is effective (Patent Document 4).
  • Patent Document 5 a method using a composition containing 20 to 90% by weight of a lipid whose phospholipid is 40 to 55% by weight
  • Patent Document 6 a method using dead cells of lactic acid bacteria
  • an object of the present invention is to provide a method for culturing lactic acid bacteria to obtain a lactic acid bacteria culture that can stably maintain the number of lactic acid bacteria.
  • a still further object of the present invention is to obtain a food or drink containing a lactic acid bacteria culture excellent in quality stability.
  • the present inventors obtained technical knowledge that the quality of milk components used in the medium affects the stabilization of the number of lactic acid bacteria in the lactic acid bacteria fermentation product, It was confirmed that a lactic acid bacteria culture capable of stably maintaining the number of lactic acid bacteria could not be obtained in a medium using a milk component having a free phosphoric acid concentration of less than 0.25% by mass as a raw material. And when using such a milk component as a culture medium, it discovered that stabilization of the number of lactic acid bacteria in the obtained lactic-acid-bacteria fermented material was improved by adding a phosphate, and completed this invention. Moreover, it discovered that food / beverage products, such as fermented milk products which have the outstanding quality stability, can be manufactured by utilizing this culture.
  • the present invention provides a method for cultivating lactic acid bacteria by inoculating lactic acid bacteria into a medium containing a milk component and a phosphate having a free phosphate concentration of less than 0.25% by mass.
  • the present invention also provides a milk component having a free phosphoric acid concentration of less than 0.25% by mass and a protein content per non-fat milk solid content (SNF) of less than 35% by mass, and water-soluble phosphoric acid.
  • the present invention provides a method for culturing lactic acid bacteria by inoculating lactic acid bacteria into a medium containing salt. Moreover, it is preferable to use skim milk powder as a milk component.
  • the present invention provides a milk component having a free phosphoric acid concentration of less than 0.25% by mass, or a protein content per non-fat milk solids (SNF) having a free phosphoric acid concentration of less than 0.25% by mass.
  • the present invention provides a food or drink containing a culture obtained by inoculating and culturing a lactic acid bacterium in a medium containing a milk component whose amount is less than 35% by mass and a water-soluble phosphate.
  • the number of lactic acid bacteria can be stably maintained even when a milk component whose quality is not constant depending on the season, production area, processing method, etc. is used as a medium because it is a natural product. Lactic acid bacteria cultures can be obtained and can be widely used in various health foods and pharmaceuticals.
  • the method of the present invention can obtain a culture containing a stable and high amount of highly active lactic acid bacteria by combining known substances useful for promoting growth and improving survival, so the number of viable bacteria is important. It is particularly suitable for the production of fermented milk foods such as lactic acid bacteria beverages.
  • the dairy product which is a natural product, can be used as a raw material for a medium for culturing lactic acid bacteria, regardless of the season, place of production, processing method, etc., by the method of the present invention.
  • a milk component having a free phosphoric acid concentration of less than 0.25% by mass is used as a milk component used in a medium for culturing lactic acid bacteria.
  • the free phosphoric acid concentration of such a milk component can be confirmed by measuring the free phosphoric acid concentration according to a known method such as a method using molybdic acid (molybdenum blue method).
  • the milk component means one containing milk protein, and specific examples include animal milk such as cow milk and goat milk, skim milk powder, whole milk powder, and fresh cream.
  • a method for measuring the concentration of free phosphoric acid in milk components will be described by taking skim milk powder as an example. In the present specification, the value measured by the following method is defined as the free phosphoric acid concentration in the milk component.
  • Reagent Ascorbic acid solution (72g / L) Dissolve 7.2 g of L (+)-ascorbic acid (Wako Pure Chemical Industries, Ltd., special grade) in water to make 100 mL, and store in a dark place at 0-10 ° C.
  • B Ammonium molybdate solution Hexammonium heptamolybdate tetrahydrate (Wako Pure Chemical Industries, Ltd., special grade) 6.0 g and potassium bis [(+) tartrate] diantimony (III) trihydrate (sum Mitsuru Kogyo Co., Ltd.
  • (special grade) 0.24g is dissolved to make about 300mL of water, and 120mL of sulfuric acid (2 + 1) is added to this to make 500mL.
  • (C) Ammonium molybdate-ascorbic acid mixed solution (color developing solution) Ammonium molybdate solution and ascorbic acid solution (72 g / L) are mixed at a volume ratio of 5: 1 (prepared at the time of use).
  • the amount of free phosphoric acid ( ⁇ g / Vial) is determined from the calibration curve determined in (2).
  • the ratio of the free phosphoric acid contained in skim milk powder is calculated
  • % Free phosphoric acid in skim milk powder Free phosphoric acid content ( ⁇ g / Vial) x 10,000mL / 5mL x 100g / 2g x 1g / 1,000,000 ⁇ g *
  • the analysis method was carried out with reference to the food component test method and the phosphate ion analysis method (molybdenum blue (ascorbic acid reduction) spectrophotometric method) of JIS K0102 (factory drainage test method, 1998).
  • the free phosphoric acid concentration measured by the above-mentioned method is less than 0.25 mass%, and it is per non-fat milk solid content (SNF).
  • SNF non-fat milk solid content
  • a milk component having a protein content of less than 35% by mass can be mentioned as a preferable example.
  • the protein content per non-fat milk solid content (SNF) can be calculated by the following formula 1.
  • the protein content is calculated by the Kjeldahl method
  • the lipid content is calculated by the Rosette Gottling method
  • the water content is calculated by the direct method or the weight loss method by the drying aid addition method at normal pressure or the reduced pressure heating drying method.
  • the phosphate used in the medium for culturing lactic acid bacteria together with the milk components described above is a water-soluble phosphate, specifically, sodium dihydrogen phosphate, disodium hydrogen phosphate, phosphorus
  • Preferable examples include ammonium dihydrogen phosphate, diammonium hydrogen phosphate, potassium dihydrogen phosphate, dipotassium hydrogen phosphate, trisodium phosphate, tripotassium phosphate, and the like.
  • These phosphates are preferably added in combination of two or more so that the pH of the medium is in the neutral range (pH 6-8).
  • the amount of phosphate added is when a medium is prepared using a milk component having a free phosphoric acid concentration of 0.25% by mass or more, preferably 0.25% by mass to 0.50% by mass as a basic raw material. Is set to be approximately the same as the phosphate amount obtained using a value obtained by subtracting the free phosphate concentration contained in the milk component from the theoretical free phosphate concentration in the medium.
  • the concentration of the milk component in the medium is not particularly limited and may be a general concentration, for example, about 5 to 30% by mass, preferably about 10 to 20% by mass. . That is, in this invention, the usage-amount of a phosphate can be calculated and set by following formula 2. In addition, the usage-amount of a phosphate can be set as a density
  • a phosphate (potassium hydrogen phosphate ( 50%) and potassium dihydrogen phosphate (50%), the average molecular weight: 155) is used by calculating as follows.
  • the theoretical free phosphate concentration in the medium when preparing a medium for culturing lactic acid bacteria, the theoretical free phosphate concentration in the medium when the medium is prepared using a milk component having a free phosphate concentration of 0.25% by mass as a basic raw material. If the value is too low, the number of lactic acid bacteria cannot be stably maintained in the obtained lactic acid bacteria culture, and the number of bacteria may be reduced due to storage in foods and drinks containing the culture. On the other hand, when the medium is prepared using a milk component having a free phosphoric acid concentration of 0.50% by mass as a basic raw material, the lactic acid bacterium in the lactic acid bacteria fermented product obtained is higher than the theoretical free phosphoric acid concentration in the medium. Although the stabilization of the number is improved, in foods and drinks containing this, quality deterioration such as aggregation and precipitation due to storage may occur.
  • the medium used for culturing lactic acid bacteria is used for ordinary lactic acid bacteria culture mediums in addition to the above-mentioned milk components and water-soluble phosphates having a free phosphate concentration of less than 0.25% by mass.
  • Ingredients may be added. Examples of such components include vitamins such as vitamin A, vitamin B, vitamin C, and vitamin E, various peptides, amino acids, salts of calcium, magnesium, and the like. The amount of these used is not particularly limited.
  • lactic acid bacteria are cultured using the medium prepared as described above.
  • the lactic acid bacteria used for the culture are not particularly limited as long as they are usually used for food production.
  • Lactobacillus casei Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus cremoris (Lactobacillus cromoris) cremoris), Lactobacillus helveticus, Lactobacillus salivarius, Lactobacillus gasseri, Lactobacillus fermentum, Lactobacillus fermentum, Lactobacillus cillus Bacillus del brooky Subspecies.
  • Bulgaricus Lacobacillus delbrueckii subsp.
  • Lactobacillus delbrukii Subspecies Lactobacillus delbrueckii subsp. Lactococcus lactis subsp. Lactis, Lactococcus lactis subspecies. Lactococcus lactis subsp. Cremoris, Lactococcus plantarum, Lactococcus raffinolactis, etc. And Enterococcus bacteria such as
  • the culture conditions for these lactic acid bacteria are generally not particularly limited as long as they are generally in accordance with the optimal conditions for lactic acid bacteria culture.
  • the temperature may be about 30 to 40 ° C. for about 1 to 7 days.
  • a method suitable for culturing lactic acid bacteria used from standing, stirring, shaking, aeration and the like may be appropriately selected.
  • the culture obtained by the culturing method of the present invention can be used as it is or after being sterilized for uses such as foods, drinks, cosmetics and pharmaceuticals. At that time, the culture may be used alone, or may be mixed with appropriate components, or the cells may be collected and washed from the culture using means such as centrifugation. Furthermore, the culture method of the present invention can also be applied when producing bacterial enzymes produced by lactic acid bacteria.
  • the form is plain type, flavored type, fruit type, sweet type, soft type, drink type, solid (hard) type, frozen type.
  • fermented milk lactic acid bacteria beverages, kefir, cheese and the like.
  • ingredients to be mixed with the culture when used as food or drink in addition to sweeteners such as syrup, other food materials such as various sugars, thickeners, emulsifiers, various vitamins, etc. These optional components can be blended.
  • these food materials include sugars such as sucrose, glucose, fructose, palatinose, trehalose, lactose, xylose, maltose, sorbitol, xylitol, erythritol, lactitol, palatinit, reduced starch syrup, reduced maltose starch syrup, etc.
  • High-sweetness sweeteners such as sugar alcohol, aspartame, thaumatin, sucralose, acesulfame K, stevia, agar, gelatin, carrageenan, guar gum, xanthan gum, pectin, locust bean gum, gellan gum, carboxymethylcellulose, soy polysaccharide, propylene glycol alginate, etc.
  • Various thickeners stable), sucrose fatty acid ester, glycerin fatty acid ester, polyglycerin fatty acid ester, sorbitan fatty acid ester, lecithin emulsifier, etc.
  • Milk fat such as cream, butter, sour cream, sour agents such as citric acid, lactic acid, acetic acid, malic acid, tartaric acid, gluconic acid, various vitamins such as vitamin A, vitamin B, vitamin C, vitamin E, calcium , Minerals such as magnesium, zinc, iron, manganese, yogurt, berry, orange, quince, shiso, citrus, apple, mint, grape, apricot, pair, custard cream, peach, Flavors such as melon, banana, tropical, herbal, tea and coffee can be mentioned.
  • the production of food and drink using the culture method of the present invention may be carried out by a conventional method and is not particularly limited.
  • a phosphate is added so as to satisfy a predetermined condition, and a medium is prepared and sterilized. Fermented milk is obtained by inoculating and homogenizing. Subsequently, a separately prepared syrup solution may be added and mixed, and a flavor may be further added to finish the final product.
  • Test Example 1 Component analysis of milk components
  • skim milk powder hereinafter simply referred to as “sample” manufactured by Murray Goulburn, which originated in Australia, the free phosphate concentration and protein content were measured as follows.
  • Example 1 (Preparation of lactic acid bacteria culture) Using the sample of Test Example 1, skim milk powder, phosphate, and glucose were dissolved in water with the composition shown in Table 1 to prepare a medium. In addition, the usage-amount of phosphate was made into the density
  • Example 2 Manufacture of lactic acid bacteria beverages
  • skim milk powder, phosphate, and glucose were dissolved in water with the composition shown in Table 2 to prepare a medium. These media were sterilized at 100 ° C. for 90 minutes, inoculated with 0.5% of Lactobacillus casei, and cultured until the pH reached about 3.6. And the number of lactic acid bacteria was measured. The results are shown in Table 2. Next, 400 mL of glucose fructose liquid sugar and 1.5 L of sterilized water were added to 600 mL of this culture, homogenized, and filled into a 65 mL container to produce lactic acid bacteria beverages (Examples 1 to 3).
  • the pH and the number of lactic acid bacteria were measured immediately after production and after storage at 10 ° C. for 14 days. Moreover, about the lactic acid bacteria drink after a preservation
  • the ratio to the filling liquid was calculated by the following formula.
  • DC / AC D Weight of container + precipitate (Weigh the contents after storing the product gently, and the weight of the container with the deposit after inversion for 1 minute)
  • C Weight of container A: Weight of container + filling liquid

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Abstract

　本発明は、乳酸菌数を安定して維持することができる乳酸菌培養物を得るための乳酸菌の培養方法を提供すること、および品質安定性に優れた乳酸菌培養物を含む飲食品を得ることをその目的とするものである。　その目的を達成するために、本発明は、遊離リン酸濃度が０．２５質量％未満である乳成分とリン酸塩とを含有する培地に、乳酸菌を接種することを特徴とする乳酸菌の培養方法、およびこの培養方法により得られた乳酸菌培養物を含有することを特徴とする飲食品を提供する。

Description

乳酸菌の培養方法および飲食品
　本発明は、乳酸菌の培養方法およびその方法により得られた乳酸菌培養物を含有する飲食品に関する。
　乳酸菌は、チーズ、発酵乳、乳酸菌飲料等の乳製品やキムチ、漬物等の各種発酵食品の製造に利用されていることは良く知られている。そして、近年では、乳酸菌の有する整腸効果等の様々な生理機能が明らかとされ、乳酸菌の菌体そのものや各種乳酸菌培養物を健康食品や医薬品などの素材として利用するようになり、その利用範囲は多岐に渡っている。
　乳酸菌の培養は、様々な態様で行われているが、乳酸菌製剤の製造や発酵乳、乳酸菌飲料、チーズ等、各種発酵乳食品の製造のために、獣乳等の乳成分を培地として行われる場合が最も多い。しかしながら、乳酸菌の多くは、一般に栄養要求性が厳格であるため、乳成分のみを培地とする場合には、あまり増殖しない菌が多い。また、比較的増殖性の良い菌であっても、乳酸菌飲料等の製造に当って、十分な酸度（酸生成量）を有する培養物を得るためには、長時間の培養を行わなければならない。
　しかしながら、長時間の培養は、生菌数の低下を招くため、生菌数を重要視する乳酸菌飲料等の製造の際には問題があった。そこで、乳酸菌の培養においては、培養時間を短縮する目的で、菌の増殖性を活性化し得る様々な増殖促進物質を培地に添加することが一般的に行われている。このような増殖促進物質又は増殖性の活性化に有効なことが確認されている物質としては、クロレラエキス、鉄塩、ビタミン類、アミノ酸やペプチドを含むタンパク分解物、酵母エキス等が知られている。
　また、酒粕の水抽出物及び／又はタンパク分解酵素処理した酒粕の水抽出物を用いる方法（特許文献１）、コーヒーノキ属植物の葉から抽出された抽出液を用いる方法（特許文献２）、脂質と蛋白質の複合体を用いる方法（特許文献３）等が提案されており、本出願人等も乳酸菌の増殖促進剤として、酸を用いて抽出することにより得られる茶類、ネギ及びショウガの抽出物（エキス）が有効であることを見出し、既に報告している（特許文献４）。
　一方で、乳酸菌の持つ様々な生理機能の向上には、生きた状態で腸内まで到達させることが重要であることから、培養物やそれを含む製品中での乳酸菌の生残性を高く維持するために、４０～５５重量％がリン脂質である脂質を全固形中２０～９０重量％含む組成物を利用する方法（特許文献５）や乳酸菌の死菌体を用いる方法（特許文献６）が提案されている。
特開平５－１５３６６号公報 特開平６－１２５７７１号公報 特開２００６－２３０２５９号公報 特許第３６４８１１５号明細書 特開２００７－９７４４７号公報 特開２００８－５８１１号公報
　ところが、天然物である乳成分は季節や産地、加工方法等により品質が一定でない。そのため、これを原料とする培地で乳酸菌を培養した場合には、たとえ、増殖性の活性化や生残性改善に有効なことが確認されている既知の材料を用いても、得られる培養物は、安定して乳酸菌数を維持することができないことがあり、これを飲食品等の製造に用いた場合には、保存後に生菌数の急激な低下を招くことがあった。
　従って、本発明は、乳酸菌数を安定して維持することができる乳酸菌培養物を得るための乳酸菌の培養方法を提供することをその目的とするものである。
　そして更に、本発明は、品質安定性に優れた乳酸菌培養物を含む飲食品を得ることを目的とするものである。
　本発明者等は、上記課題を解決すべく鋭意検討を行った結果、培地に用いる乳成分の品質が、乳酸菌発酵物における乳酸菌数の安定化に影響を与えるという技術的知見を得、特に、遊離リン酸濃度が０．２５質量％未満である乳成分を原料とする培地では、乳酸菌数を安定して維持できる乳酸菌培養物が得られないことを確認した。そして、このような乳成分を培地として用いる場合にはリン酸塩を添加することにより、得られる乳酸菌発酵物における乳酸菌数の安定化が向上することを見出し、本発明を完成した。
　また、この培養物を利用することにより、優れた品質安定性を有する発酵乳製品などの飲食品が製造できることを見出した。
　すなわち、本発明は、遊離リン酸濃度が０．２５％質量未満である乳成分とリン酸塩とを含有する培地に、乳酸菌を接種する乳酸菌の培養方法を提供するものである。
　また、本発明は、遊離リン酸濃度が０．２５質量％未満であり、且つ無脂乳固形分（ＳＮＦ）あたりのタンパク質含有量が３５質量％未満である乳成分と、水溶性のリン酸塩とを含有する培地に乳酸菌を接種する乳酸菌の培養方法を提供するものである。また、乳成分として、脱脂粉乳を用いることが好ましい。
　更に、本発明は、遊離リン酸濃度が０．２５質量％未満である乳成分、または遊離リン酸濃度が０．２５質量％未満であり、且つ無脂乳固形分（ＳＮＦ）あたりのタンパク質含有量が３５質量％未満である乳成分と、水溶性のリン酸塩とを含有する培地に乳酸菌を接種・培養して得られる培養物を含む飲食品を提供するものである。
　本発明の方法によれば、天然物であるために季節や産地、加工方法等により品質が一定でない乳成分を培地として利用する場合であっても、乳酸菌数を安定して維持することができる乳酸菌培養物を得ることができ、各種の健康食品や医薬品に広く利用することができる。
　また、本発明の方法は、増殖促進や生残性改善に有用な既知の物質を組み合わせることで、活性の高い乳酸菌を安定して多く含む培養物を得ることができるので、生菌数が重要視される乳酸菌飲料等の発酵乳食品の製造に特に好適である。
　更に言えば、本発明の方法により、天然物である乳製品を、季節や産地、加工方法等に関係なく、乳酸菌を培養する培地の原料に供することができる。
　本発明において、乳酸菌を培養する培地に用いる乳成分としては、遊離リン酸濃度が０．２５質量％未満の乳成分を使用する。このような乳成分の遊離リン酸濃度は、モリブデン酸を用いた方法（モリブデンブルー法）等、既知の方法に従って、遊離リン酸濃度を測定することにより確認することができる。ここで、乳成分とは、乳蛋白質を含有するものを意味し、具体的には、牛乳、山羊乳などの獣乳、脱脂粉乳、全脂粉乳、生クリーム等が挙げられる。
　以下、脱脂粉乳を例に挙げて、乳成分中の遊離リン酸濃度の測定方法を説明する。なお、本願明細書中においては、以下に示す方法により測定した値を乳成分中の遊離リン酸濃度と定義する。
《遊離リン酸濃度の測定法》
（１）試薬
　（ａ）アスコルビン酸溶液(72g/L)
　L(＋)-アスコルビン酸(和光純薬工業（株）、特級)7.2gを水に溶解して100mLとし、0～10℃の暗所に保存する。
　（ｂ）モリブデン酸アンモニウム溶液
　七モリブデン酸六アンモニウム４水和物(和光純薬工業（株）、特級)6.0gとビス[(＋)タルトラト]二アンチモン(ＩＩＩ)酸カリウム３水和物(和光純薬工業（株）、特級)0.24gを水約300mLになるように溶解し、これに硫酸(2+1)120mLを加えて500mLとする。
　（ｃ）モリブデン酸アンモニウム－アスコルビン酸混合溶液(発色液)
　モリブデン酸アンモニウム溶液とアスコルビン酸溶液(72g/L)とを体積比で5：1になるように混合する(用時調製)。
　（ｄ）リン酸イオン標準原液(50μg　PO4 3-‐P/mL)
　リン酸二水素カリウム(pH標準液用)を105±2℃で約2時間加熱し、デシケーター中で放冷する。その0.2197gを取り、1000mLとする。0～10℃の暗所にて保存する。
　（ｅ）リン酸イオン標準溶液(1μgPO4 3-‐P/mL)
　リン酸イオン標準原液(50μgPO4 3-‐P/mL)1mLを50mL容メスフラスコで定容する。
（２）検量線
　（ｉ）水を試験管に5.0mL、4.75mL、4.5mL、4.0mL、3.0mL、0.0mLずつ入れる。
　（ｉｉ）（ｉ）の各試験管にリン酸イオン標準溶液(1μgPO4 3-‐P/mL)を0.0mL、0.25mL、0.5mL、1.0mL、2.0mL、5.0mLそれぞれ加え、全量5.0mLとする。
　（ｉｉｉ）発色液を400μL加えて、約15分間放置する。
　（ｉｖ）30分以内に、分光光度計にてUV880nmの吸光度を測定する。
(３)測定手順
　（ｉ）試料（脱脂粉乳2.0g）を量り、水(または温水)で溶解後、100mL容メスフラスコで定容し、1時間以上放置する。
　（ｉｉ）（ｉ）の約6mLをビバスピン6(5,000MWCO)に量り取り、遠心分離機で限外ろ過する(7,500G、30分、25℃)。
　（ｉｉｉ）（ｉｉ）の通過液を1mLホールピペットで正確に100mL容メスフラスコに量り取り、水で定容する。
　（ｉｖ）（ｉｉｉ）の溶液を5mLホールピペットで試験管に量り取る。
　（ｖ）発色液を400μL加えて、約15分間放置する。
　（ｖｉ）30分以内に分光光度計にてUV880nmの吸光度を測定する。
　（ｖｉｉ）(２)で求めた検量線から遊離リン酸量(μg/Vial)を求める。求めた遊離リン酸量を用いて下記の式から脱脂粉乳中に含まれる遊離リン酸の割合を求める。
　　脱脂粉乳中の遊離リン酸％
　　＝遊離リン酸量(μg/Vial)×10,000mL/5mL×100g/2g×1g/1,000,000μg
※分析方法は、食品成分試験法およびJIS K0102(工場排水試験法、1998)のリン酸イオンの分析法(モリブデン青(アスコルビン酸還元)吸光光度法)を参考に行った。
　また、本発明においては、乳酸菌を培養する培地に用いる乳成分として、前記した方法により測定した遊離リン酸濃度が０．２５質量％未満であって、且つ無脂乳固形分（ＳＮＦ）あたりのタンパク質含有量が３５質量％未満である乳成分を好ましいものとして挙げることができる。
　ここで、無脂乳固形分（ＳＮＦ）あたりのタンパク質含有量は、下記式１により算出することができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000001
　なお、タンパク質含有量、脂質含有量および水分含有量は、五訂日本食品標準成分表に記載されている測定法に従って算出すればよい。具体的には、タンパク質含有量はケルダール法、脂質含有量はレーゼゴットリーブ法、水分含有量は直接法もしくは乾燥助剤添加法の常圧または減圧加熱乾燥法による減量法により算出される。
　一方で、本発明において、前記した乳成分と共に乳酸菌を培養する培地に用いるリン酸塩としては、水溶性のリン酸塩、具体的には、リン酸二水素ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム、リン酸二水素アンモニウム、リン酸水素二アンモニウム、リン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウム、リン酸三ナトリウム、リン酸三カリウム等を好ましいものとして挙げることができる。これらのリン酸塩は、２種以上を組み合わせて、培地のｐＨが中性領域(ｐＨ６～８)となるように添加することが好ましい。
　本発明において、リン酸塩の添加量は、遊離リン酸濃度が０．２５質量％以上、好ましくは０．２５質量％乃至０．５０質量％である乳成分を基本原料として培地を調製した場合における当該培地中の理論上の遊離リン酸濃度から、乳成分中に含まれる遊離リン酸濃度を減じた値を用いて求めたリン酸塩量と同程度となるように設定される。
　なお、培地における乳成分の濃度は、特に制限されるわけではなく、一般的な濃度とすればよく、例えば、５質量％～３０質量％、好ましくは、１０質量％～２０質量％程度である。
　すなわち、本発明において、リン酸塩の使用量は、下記式２により算出して設定することができる。なお、このとき、リン酸塩の使用量は、リン酸塩中のリン酸が全て遊離リン酸とした場合の濃度として設定することができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000002
 ※ ２種以上のリン酸塩を使用する場合は、平均分子量とする。
　例えば、遊離リン酸濃度がそれぞれ０．２０質量％または０．２４質量％である乳成分を用いて、乳成分含量が２０質量％の培地を調製する場合のリン酸塩(リン酸水素カリウム(５０％)とリン酸二水素カリウム(５０％)の混合物、平均分子量：１５５)の使用量は、以下のように算出して設定される。
（１）遊離リン酸濃度が０．２０質量％の乳成分を用いる場合　
・下限値
（０．２５－０．２０）×２０／１００×１５５／３１＝０．０５％
　・上限値
（０．５０－０．２０）×２０／１００×１５５／３１＝０．３０％
　すなわち、遊離リン酸濃度が０．２０質量％の乳成分を用いて、２０質量％の培地を調製する場合には、リン酸塩を０．０５質量％以上、好ましくは０．０５質量％～０．３０質量％の範囲で添加すればよい。つまり、乳成分を２０質量％含む培地１００ｇに関して、上記リン酸塩を０．０５ｇ以上、好ましくは０．０５ｇ～０．３０ｇ添加すればよい。
　（２）遊離リン酸濃度が０．２４質量％の乳成分を用いる場合　
・下限値　　
（０．２５－０．２４）×２０／１００×１５５／３１＝０．０１％
・上限値　
（０．５０－０．２４）×２０／１００×１５５／３１＝０．２６％
　すなわち、遊離リン酸濃度が０．２４質量％の乳成分を用いて、２０質量％の培地を調製する場合には、リン酸塩０．０１質量％以上、好ましくは０．０１質量％～０．２６質量％の範囲で添加すればよい。つまり、乳成分を２０質量％含む培地１００ｇに関して、上記リン酸塩を０．０１ｇ以上、好ましくは０．０１ｇ～０．２６ｇ添加すればよい。
　本発明において、乳酸菌を培養する培地を調製する際、遊離リン酸濃度が０．２５質量％である乳成分を基本原料として培地を調製した場合における当該培地中の理論上の遊離リン酸濃度よりも低くなると、得られる乳酸菌培養物において、乳酸菌数を安定して維持することができず、これを含む飲食品において、保存による菌数の低下を招くことがある。
　一方で、遊離リン酸濃度が０．５０質量％である乳成分を基本原料として培地を調製した場合における当該培地中の理論上の遊離リン酸濃度よりも高くなると、得られる乳酸菌発酵物における乳酸菌数の安定化は向上するが、これを含む飲食品において、保存による凝集や沈殿など、品質の劣化を生じることがある。
　また、本発明において、乳酸菌の培養に用いる培地には、前記した遊離リン酸濃度が０．２５質量％未満である乳成分と水溶性のリン酸塩の他に通常の乳酸菌培地に使用される成分を添加してもよい。このような成分としては、例えば、ビタミンＡ、ビタミンＢ類、ビタミンＣ、ビタミンＥ類等のビタミン類や、各種のペプチド、アミノ酸類、カルシウム、マグネシウム等の塩類等が挙げられる。これらの使用量は特に制限されない。
　本発明においては、上記のようにして調製した培地を用いて乳酸菌を培養する。培養に用いる乳酸菌としては、通常、食品製造に使用されるものであれば特に限定されず、例えば、ラクトバチルス・カゼイ（Lactobacillus casei）、ラクトバチルス・アシドフィルス（Lactobacillus acidophilus）、ラクトバチルス・クレモリス（Lactobacillus cremoris）、ラクトバチルス・ヘルベティカス（Lactobacillus helveticus）、ラクトバチルス・サリバリウス（Lactobacillus salivarius）、ラクトバチルス・ガセリ（Lactobacillus gasseri）、ラクトバチルス・ファーメンタム（Lactobacillus fermentum）、ラクトバチルス・ユーグルティ（Lactobacillus yoghurti）、ラクトバチルス・デルブルッキィー サブスピーシーズ．ブルガリカス（Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus）、ラクトバチルス・デルブルッキィー サブスピーシーズ．デルブルッキィー（Lactobacillus delbrueckii subsp. delbrueckii）、ラクトバチルス・ジョンソニー（Lactobacillus johnsonii）等のラクトバチルス属細菌、ストレプトコッカス・サーモフィルス（Streptococcus thermophilus）等のストレプトコッカス属細菌、ラクトコッカス・ラクチス サブスピーシーズ．ラクチス（Lactococcus lactis subsp. lactis）、ラクトコッカス・ラクチス サブスピーシーズ．クレモリス（Lactococcus lactis subsp. cremoris）、ラクトコッカス・プランタラム（Lactococcus plantarum）、ラクトコッカス・ラフィノラクチス（Lactococcus raffinolactis）等のラクトコッカス属細菌、エンテロコッカス・フェカーリス（Enterococcus faecalis）、エンテロコッカス・フェシウム（Enterococcus faecium）等のエンテロコッカス属細菌を挙げることができる。
　これら乳酸菌の培養条件は、一般的に乳酸菌培養の最適な条件に従って行えばよく、特に限定されない。例えば、３０～４０℃程度の温度で、１～７日間程度でよい。また、このときの培養条件としては、静置、攪拌、振盪、通気等から用いる乳酸菌の培養に適した方法を適宜選択して行えばよい。
　本発明の培養方法により得られる培養物は、これをそのまま或いは殺菌して飲食品、化粧品、医薬品等の用途に使用することが可能である。その際、培養物を単独で用いてもよいが、適宜の成分と混合してもよく、また、培養物から遠心分離等の手段を用い、菌体を回収・洗浄して用いてもよい。更に、本発明の培養方法は、乳酸菌が産生する菌体酵素を製造する際にも適用することができる。
　本発明の培養方法により得られる培養物を飲食品等として用いる場合、その形態としては、プレーンタイプ、フレーバードタイプ、フルーツタイプ、甘味タイプ、ソフトタイプ、ドリンクタイプ、固形（ハード）タイプ、フローズンタイプ等の発酵乳、乳酸菌飲料、ケフィア、チーズ等とすることができる。
　また、飲食品として使用する際に、培養物に混合する成分としては、シロップなどの甘味料の他、それ以外の各種食品素材、例えば、各種糖質、増粘剤、乳化剤、各種ビタミン剤等の任意成分を配合するができる。これらの食品素材として具体的なものは、ショ糖、グルコース、フルクトース、パラチノース、トレハロース、ラクトース、キシロース、麦芽糖等の糖質、ソルビトール、キシリトール、エリスリトール、ラクチトール、パラチニット、還元水飴、還元麦芽糖水飴等の糖アルコール、アスパルテーム、ソーマチン、スクラロース、アセスルファムＫ、ステビア等の高甘味度甘味料、寒天、ゼラチン、カラギーナン、グァーガム、キサンタンガム、ペクチン、ローカストビーンガム、ジェランガム、カルボキシメチルセルロース、大豆多糖類、アルギン酸プロピレングリコール等の各種増粘（安定）剤、ショ糖脂肪酸エステル、グリセリン脂肪酸エステル、ポリグリセリン脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル、レシチン等の乳化剤、クリーム、バター、サワークリーム等の乳脂肪、クエン酸、乳酸、酢酸、リンゴ酸、酒石酸、グルコン酸等の酸味剤、ビタミンＡ、ビタミンＢ類、ビタミンＣ、ビタミンＥ類等の各種ビタミン類、カルシウム、マグネシウム、亜鉛、鉄、マンガン等のミネラル分、ヨーグルト系、ベリー系、オレンジ系、花梨系、紫蘇系、シトラス系、アップル系、ミント系、グレープ系、アプリコット系、ペア、カスタードクリーム、ピーチ、メロン、バナナ、トロピカル、ハーブ系、紅茶、コーヒー系等のフレーバー類を挙げることができる。
　本発明の培養方法を用いた飲食品の製造は、常法により行えば良く、特に制限されるものではない。例えば、予め測定した遊離リン酸濃度が０．２５質量％未満である脱脂粉乳に、所定の条件を満足するようにリン酸塩を添加して培地を調製して殺菌処理し、これに乳酸菌を接種培養して均質化処理して発酵乳を得る。次いで、別途調製したシロップ溶液を添加混合し、更にフレーバーを添加して最終製品に仕上げればよい。
　以下、実施例および試験例を挙げて本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例等に何ら制約されるものではない。なお、パーセント（％）とあるのは特に断らない限りすべて質量基準である。
（試験例１）
（乳成分の成分分析）
　オーストラリアを原産国とするＭurray Goulburn社製の脱脂粉乳（以下、単に「試料」という。）について、以下により遊離リン酸濃度とタンパク質含有量を測定した。
（１）遊離リン酸濃度の測定
　本願明細書中、段落［００１５］に記載の方法に従って測定を行った。
　その結果、遊離リン酸濃度は、０．２３％であった。
（２）タンパク質含有量の測定
　以下の分析値を用いて本願明細書中、段落［００１７］に記載の式１により算出した。
　　　脱脂粉乳中のタンパク質含有量：３２．８％　　　　　　　　　
　　　水分含有量：３．８％、脂質含有量：０．６％
　その結果、無脂乳固形分当たりのタンパク質含有量は、３４．３％／ＳＮＦであった。
　（実施例１）
（乳酸菌培養物の調製）
　試験例１の試料を用いて、表１に示すとおりの組成で脱脂粉乳、リン酸塩、ぶどう糖を水に溶解し培地を調製した。なお、リン酸塩の使用量は、リン酸塩中のリン酸が全て遊離リン酸とした場合の濃度とした。（以下、同様とする。）この培地を１００℃で９０分間殺菌し、次いで、ラクトバチルス・カゼイを０．５％接種し、ｐＨ３．６程度になるまで培養して得た乳酸菌培養物の培養終了時のｐＨと乳酸菌数を測定した。また、この培養物６００ｍＬにぶどう糖果糖液糖４００ｍＬ及び滅菌水１．５Ｌを加えて均質化し、乳酸菌飲料（実施品、比較品）を製造した。製造直後と１０℃で１４日間保存後のｐＨ、乳酸菌数を測定した。その結果を下表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
 ※ リン酸水素二カリウム(５０％)とリン酸二水素カリウム(５０％)の混合物
　表１の結果から明らかな通り、遊離リン酸濃度が０．２５％未満の乳成分（試料）のみを原料とする培地で乳酸菌を培養して得られる培養物を用いて製造した乳酸菌飲料においては、保存により乳酸菌数が大幅に低下することが確認された。これに対し、この乳成分を原料とする培地に、リン酸塩を添加することにより、培養物における乳酸菌数の増加が認められ、また、この培養物を用いて製造した乳酸菌飲料においても乳酸菌数の安定化効果が認められた。
（実施例２）
（乳酸菌飲料の製造）
　試験例１の試料を用いて、表２に示すとおりの組成で脱脂粉乳、リン酸塩、ぶどう糖を水に溶解し培地を調製した。これらの培地を１００℃で９０分間殺菌し、ラクトバチルス・カゼイを０．５％接種し、ｐＨ３．６程度になるまで培養して得た乳酸菌培養物（A～C）の培養終了時のｐＨと乳酸菌数を測定した。その結果を表２に示す。次に、この培養物６００ｍＬにぶどう糖果糖液糖４００ｍＬ及び滅菌水１．５Ｌを加えて均質化し、６５ｍＬ容容器に充填して乳酸菌飲料（実施品１～３）を製造した。製造直後と１０℃で１４日間保存後のｐＨ、乳酸菌数を測定した。また、保存後の乳酸菌飲料については、沈殿量を目視により確認するとともに、沈殿量とホエーオフ（離水量）を測定した。その結果を表３に示す。
　なお、目視による沈殿量の評価は、下記の指標に基づいて判定した。
　判定基準
１．沈殿
　＋＋　：　非常に有り　　
　　＋　：　有り
　　±　：　僅かに有り（製品として問題無い程度）
　　－　：　無し
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
 　※ リン酸水素二カリウム(５０％)とリン酸二水素カリウム(５０％)の混合物
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　　注）沈殿量は、充填液に対する割合を次式により算出した。
　　　Ｄ－Ｃ／Ａ－Ｃ
　　　Ｄ；容器＋沈殿物の重さ
　　（製品保存後の内容物を静かに捨て、１分間倒置後の沈殿物が付着した容器の重さ）
　　　Ｃ；容器の重さ
　　　Ａ；容器＋充填液の重さ
　表３に示すとおり、遊離リン酸濃度が０．２５％未満の乳成分を原料として用いた場合であっても、リン酸塩を添加することにより、得られる乳酸菌を含む乳酸菌飲料において、乳酸菌数を安定して維持することができる。
　また、得られた乳酸菌飲料は、風味も良好で、保存後においても沈殿や分離なども生じることはなく、品質安定性にも優れていた。

Claims (6)

  1. 　遊離リン酸濃度が０．２５質量％未満である乳成分とリン酸塩とを含有する培地に、乳酸菌を接種することを特徴とする乳酸菌の培養方法。
  2. 　前記乳成分の無脂乳固形分（ＳＮＦ）あたりのタンパク質含有量が３５質量％未満である、請求項１に記載の乳酸菌の培養方法。
  3. 　前記リン酸塩が水溶性である、請求項１又は２に記載の乳酸菌の培養方法。
  4. 　前記乳成分が脱脂粉乳である、請求項１乃至３のいずれか一項に記載の乳酸菌の培養方法。
  5. 　請求項１乃至４のいずれか一項に記載の方法により得られた乳酸菌培養物を含有することを特徴とする飲食品。
  6. 　発酵乳製品である請求項５に記載の飲食品。
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