WO2010103837A1 - アテローム性動脈硬化症の進行抑制薬・予防薬・血中コレステロール低下薬・機能性食品・特定保健用食品 - Google Patents

アテローム性動脈硬化症の進行抑制薬・予防薬・血中コレステロール低下薬・機能性食品・特定保健用食品 Download PDF

Info

Publication number
WO2010103837A1
WO2010103837A1 PCT/JP2010/001734 JP2010001734W WO2010103837A1 WO 2010103837 A1 WO2010103837 A1 WO 2010103837A1 JP 2010001734 W JP2010001734 W JP 2010001734W WO 2010103837 A1 WO2010103837 A1 WO 2010103837A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
gly
pro
ala
collagen
hyp
Prior art date
Application number
PCT/JP2010/001734
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
省吾 勝田
立華 唐
酒井　康夫
Original Assignee
ゼライス株式会社
学校法人金沢医科大学
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by ゼライス株式会社, 学校法人金沢医科大学 filed Critical ゼライス株式会社
Priority to JP2011503722A priority Critical patent/JP5604417B2/ja
Priority to EP10750593.5A priority patent/EP2407174B1/en
Priority to US13/255,651 priority patent/US9339524B2/en
Publication of WO2010103837A1 publication Critical patent/WO2010103837A1/ja

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/04—Peptides having up to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • A61K38/06—Tripeptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
    • A23L33/10—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives
    • A23L33/17—Amino acids, peptides or proteins
    • A23L33/18—Peptides; Protein hydrolysates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/06—Antihyperlipidemics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/08—Tripeptides
    • C07K5/0802—Tripeptides with the first amino acid being neutral
    • C07K5/0804—Tripeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic
    • C07K5/0806—Tripeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic the side chain containing 0 or 1 carbon atoms, i.e. Gly, Ala
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
    • A23V2002/00—Food compositions, function of food ingredients or processes for food or foodstuffs

Definitions

  • the present invention relates to a progression inhibitor and preventive for atherosclerosis and a blood cholesterol lowering drug. More specifically, the present invention relates to an atherosclerosis progression inhibitor and preventive agent, and a blood cholesterol lowering agent comprising a collagen hydrolyzate containing a collagen tripeptide as an active ingredient. Furthermore, the present invention relates to a functional food and a food for specified health use that suppresses and prevents aging and inflammation of blood vessels, which contains a collagen hydrolyzate containing a collagen tripeptide as an active ingredient.
  • Patent Documents 1 to 5 Patent Documents 1 to 5
  • Patent Document 6 the method of orally administering activated carbon for medical use (Patent Document 6) and the method of ingesting black yeast culture fluid as a health supplement (Patent Document 7) ingestion of natural substances and arteries
  • Patent Document 7 the method of orally administering activated carbon for medical use (Patent Document 6) and the method of ingesting black yeast culture fluid as a health supplement (Patent Document 7) ingestion of natural substances and arteries
  • Patent Document 7 Many methods for preventing / improving curing have also been proposed.
  • collagen is a diverse but related group of molecules. Each has different biochemical and physical properties, but they commonly contain a similar triple helix domain consisting of three polypeptide chains called alpha chains. Each ⁇ chain contains a high proportion of glycine, which is present in three regularly repeated amino acid sequences and can be expressed as Gly-X-Y. Furthermore, here, the relatively large amino acid in X is proline, and the relatively large amino acid in Y is hydroxyproline. In this conformation, glycine and peptide bonds are embedded inside the molecule, which gives collagen high resistance to proteolysis.
  • Patent Document 10 Bacterial collagenase that cleaves the peptide bond of type I collagen at the amino terminus of glycine (Patent Documents 8 and 9), highly purified non-antigenic and low-protein containing a Gly-XY sequence called collagen tripeptide (CTP) An allergenic tripeptide fraction is obtained (Patent Document 10).
  • Non-Patent Document 1 the joint pain reduction effect (nonpatent literature 2) etc. are shown.
  • CTP-containing wound healing agent improvement for tendon or ligament damage, etc.
  • healing promotion or prevention agent tendon or ligament improvement or strengthening agent
  • improvement for racehorse flexor tendon or ligament damage or rupture improvement for racehorse flexor tendon or ligament damage or rupture
  • healing promotion or A prophylactic agent an agent for improving or reinforcing a flexor tendon or ligament of a racehorse, a functional food and a pharmaceutical containing the wound healing agent have also been proposed (Patent Document 11).
  • Patent Document 1 Japanese Patent Laid-Open No. 11-49802
  • Patent Document 2 Japanese Patent Application Laid-Open No. 2003-48889
  • Patent Document 3 JP 2004-35475 A
  • Patent Document 4 Japanese Patent Application Laid-Open No. 2002-275062
  • Patent Document 5 Japanese Patent Application Laid-Open No. 2005-263758
  • Patent Document 6 Japanese Unexamined Patent Application Publication No. 2007-182448
  • Patent Document 7 Japanese Patent Laid-Open No. 2002-204687
  • Patent Document 8 Japanese Patent Laid-Open No. 2000-102381
  • Patent Document 9 Japanese Patent Application Laid-Open No.
  • Patent Document 10 Japanese Patent Application Laid-Open No. 2007-231225
  • Patent Document 11 Japanese Patent Application Laid-Open No. 2005-281186
  • Patent Document 12 Japanese Patent Laid-Open No. 2001-31586
  • Non-Patent Document 1 Effect of collagen tripeptide "HACP” on bone and tendon, FFI Journal, Volume 210 (September issue), 854-858 (2005)
  • Non-Patent Document 2 The 12th Annual Meeting of the Japanese Society for Arthropathy Research
  • Non-Patent Document 3 Stehbens WE: Atherosclerosis and degenerative diseases of blood vessels. In. Vascular Pathology.
  • Non-Patent Document 4 Shogo Katsuta: From the viewpoint of human pathology, arteriosclerosis, 2001, 28, 3, 69-73
  • Non-Patent Document 5 Ross R: The pathogenesis of atherosclerosis: a perspective for the 1990s. Nature 1993; 362: 801-809.
  • Non-Patent Document 6 Teruo Watanabe et al., Atherosclerosis (disease), Ringo Sogoi, 1984, 33: 647-655 The entire descriptions of Patent Documents 1 to 12 and Non-Patent Documents 1 to 6 are specifically incorporated herein by reference.
  • Non-patent Document 3 Human atherosclerosis (Atherosclerosis) occurs soon after birth and progresses slowly and quietly. After about 50 years of age, various clinical symptoms are exhibited, and lesions further progress. In the pathological examination, there are cases where strong arteriosclerosis is observed even in the younger group, while there are cases where there are almost no lesions in the arteries of the elderly. Because these are phenomena in which arteriosclerosis progresses slowly over a long period of time, it is caused by various factors such as lifestyle habits and social factors greatly affecting the degree of lesions (Non-patent Document 4). As Thomas Sydenham once said, “A human is aging with arteries“ A man is as old as his arteries ””, arteriosclerosis is closely related to human aging and aging.
  • the artery consists of three layers: intima, media and adventitia, but the aging and aging of the artery itself is pathologically due to the proliferation of smooth muscle cells in the intima and the accumulation of interstitial components including collagen fibers. Diffuse thickening, degeneration, rupture and fibrosis of the elastic fibers of the media, and arteriosclerosis and aging of blood vessels are closely related to each other.
  • Atherosclerosis an increasingly important disease in recent years, causes an inflammatory reaction in the intima of arteries, infiltrating and proliferating smooth muscle cells, macrophages, and T lymphocytes, and lipids (mainly cholesterol and Cholesterol ester) accumulates and the intima thickens (plaque formation).
  • lipids mainly cholesterol and Cholesterol ester
  • plaque formation lipids (mainly cholesterol and Cholesterol ester) accumulates and the intima thickens (plaque formation).
  • atherosclerosis has recently been recognized as a type of inflammation in blood vessels. When a large amount of lipid is deposited outside the cell, the plaque becomes weak, and acute myocardial infarction and cerebral infarction develop with rupture and thrombus formation.
  • an atherosclerotic lesion may be simply expressed as a plaque.
  • SMC Arterial smooth muscle cells
  • a therapeutic drug for atherosclerosis for example, a therapeutic drug for hyperlipidemia (statin type, fibrate type) is used.
  • the therapeutic drug for hyperlipidemia is a drug mainly intended to improve blood lipids, and does not directly act on SMC to suppress the progression of atherosclerosis. There has never been a drug aimed at acting directly on collagen-producing cells such as SMC.
  • Atherosclerosis early lesions are observed in most children's arteries.
  • the increase in lesions becomes prominent from around puberty, and the lesions occupy about 30% of the aortic surface by the age of 20-30 (Non-patent Document 6). Therefore, it has the effect of suppressing and preventing aging / inflammation of blood vessels even for healthy people who are aware of atherosclerosis or before onset, and the effect of suppressing or preventing the progression of atherosclerosis
  • an object of the present invention is to provide a novel therapeutic or preventive agent for atherosclerosis containing an active ingredient having some action on SMC that plays an important role in the formation of atherosclerosis. It is in. Furthermore, the present invention is to provide a blood cholesterol lowering drug having a blood cholesterol lowering effect related to atherosclerosis. In addition, an object of the present invention is to provide a functional food and a food for specified health use that have an inhibitory effect on atherosclerosis and are effective in suppressing and preventing the progression of atherosclerosis.
  • the CTP was not known to have any action on SMC. Therefore, the present inventors investigated whether CTP has any effect on smooth muscle cell migration and proliferation using aortic smooth muscle cells (AoSMC). As a result, it was found that migration and proliferation were suppressed in the culture solution of cultured smooth muscle cells supplemented with CTP. Furthermore, an experiment of oral administration was conducted using a familial hypercholesterolemia model rabbit, and it was found that it was possible to suppress the occurrence and progression of atherosclerosis itself as an effect that exceeded the initial expectation. . Based on such knowledge, the present invention has been completed.
  • AoSMC aortic smooth muscle cells
  • Atheromatous arteries containing as an active ingredient a collagen hydrolyzate containing at least one collagen tripeptide Gly-XY (Gly-XY is an amino acid sequence, X and Y are amino acid residues other than Gly)
  • a sclerosis progression inhibitor or prophylactic agent A sclerosis progression inhibitor or prophylactic agent.
  • Collagen tripeptide Gly-XY is Gly-Ala-Asp, Gly-Ala-Lys, Gly-Ala-Val, Gly-Pro-Gln, Gly-Pro-Met, Gly-Pro-Ile, Gly-Pro-Thr, Gly-Pro-Val, Gly-Ser-Hyp, Gly-Lys-Asp, Gly-Ala-Ala, Gly-Pro-Hyl, Gly-Leu-Hyp, Gly-Ala-Arg, Gly-Ala-Ser, Gly- Ala-Hyp, Gly-Gln-Glu, Gly-Glu-Gln, Gly-Pro-Ser, Gly-Pro-Lys, Gly-Pro-Ala, Gly-Pro-Pro, Gly-Pro-Arg and Gly-Pro- The progression inhibitor or prophylactic agent according to [1] or [2], which is at least one tripeptide selected from the group consisting of Hyp.
  • Collagen tripeptide Gly-XY is Gly-Ala-Asp, Gly-Ala-Lys, Gly-Ala-Val, Gly-Pro-Gln, Gly-Pro-Met, Gly-Pro-Ile, Gly-Pro-Thr, Gly-Pro-Val, Gly-Ser-Hyp, Gly-Lys-Asp, Gly-Ala-Ala, Gly-Pro-Hyl, Gly-Leu-Hyp, Gly-Ala-Arg, Gly-Ala-Ser, Gly- Ala-Hyp, Gly-Gln-Glu, Gly-Glu-Gln, Gly-Pro-Ser, Gly-Pro-Lys, Gly-Pro-Ala, Gly-Pro-Pro, Gly-Pro-Arg and Gly-Pro- The blood cholesterol lowering drug according to [5] or [6], which is at least one tripeptide selected from the group consisting of Hyp.
  • Collagen tripeptide Gly-XY is Gly-Ala-Asp, Gly-Ala-Lys, Gly-Ala-Val, Gly-Pro-Gln, Gly-Pro-Met, Gly-Pro-Ile, Gly-Pro-Thr, Gly-Pro-Val, Gly-Ser-Hyp, Gly-Lys-Asp, Gly-Ala-Ala, Gly-Pro-Hyl, Gly-Leu-Hyp, Gly-Ala-Arg, Gly-Ala-Ser, Gly- Ala-Hyp, Gly-Gln-Glu, Gly-Glu-Gln, Gly-Pro-Ser, Gly-Pro-Lys, Gly-Pro-Ala, Gly-Pro-Pro, Gly-Pro-Arg and Gly-Pro- The functional food or food for specified health use according to [9] or [10], which is at least one tripeptide selected from the group consisting of Hyp.
  • Collagen tripeptide Gly-XY is Gly-Ala-Asp, Gly-Ala-Lys, Gly-Ala-Val, Gly-Pro-Gln, Gly-Pro-Met, Gly-Pro-Ile, Gly-Pro-Thr, Gly-Pro-Val, Gly-Ser-Hyp, Gly-Lys-Asp, Gly-Ala-Ala, Gly-Pro-Hyl, Gly-Leu-Hyp, Gly-Ala-Arg, Gly-Ala-Ser, Gly- Ala-Hyp, Gly-Gln-Glu, Gly-Glu-Gln, Gly-Pro-Ser, Gly-Pro-Lys, Gly-Pro-Ala, Gly-Pro-Pro, Gly-Pro-Arg and Gly-Pro- The method for inhibiting or preventing progression according to [13] or [14], which is at least one tripeptide selected from the group consisting of Hyp.
  • Collagen tripeptide Gly-XY is Gly-Ala-Asp, Gly-Ala-Lys, Gly-Ala-Val, Gly-Pro-Gln, Gly-Pro-Met, Gly-Pro-Ile, Gly-Pro-Thr, Gly-Pro-Val, Gly-Ser-Hyp, Gly-Lys-Asp, Gly-Ala-Ala, Gly-Pro-Hyl, Gly-Leu-Hyp, Gly-Ala-Arg, Gly-Ala-Ser, Gly- Ala-Hyp, Gly-Gln-Glu, Gly-Glu-Gln, Gly-Pro-Ser, Gly-Pro-Lys, Gly-Pro-Ala, Gly-Pro-Pro, Gly-Pro-Arg and Gly-Pro- The collagen hydrolyzate according to [17] or [18], which is at least one tripeptide selected from the group consisting of Hyp.
  • Gly-XY is Gly-Ala-Asp, Gly-Ala-Lys, Gly-Ala-Val, Gly-Pro-Gln, Gly-Pro-Met, Gly-Pro-Ile, Gly-Pro-Thr, Gly-Pro-Val, Gly-Ser-Hyp, Gly-Lys-Asp, Gly-Ala-Ala, Gly-Pro-Hyl, Gly-Leu-Hyp, Gly-Ala-Arg, Gly-Ala-Ser, Gly- Ala-Hyp, Gly-Gln-Glu, Gly-Glu-Gln, Gly-Pro-Ser, Gly-Pro-Lys, Gly-Pro-Ala, Gly-Pro-Pro, Gly-Pro-Arg and Gly-Pro- The method for reducing blood cholesterol according to [21] or [22], which is at least one tripeptide selected from the group consisting of Hyp.
  • Collagen tripeptide Gly-XY is Gly-Ala-Asp, Gly-Ala-Lys, Gly-Ala-Val, Gly-Pro-Gln, Gly-Pro-Met, Gly-Pro-Ile, Gly-Pro-Thr, Gly-Pro-Val, Gly-Ser-Hyp, Gly-Lys-Asp, Gly-Ala-Ala, Gly-Pro-Hyl, Gly-Leu-Hyp, Gly-Ala-Arg, Gly-Ala-Ser, Gly- Ala-Hyp, Gly-Gln-Glu, Gly-Glu-Gln, Gly-Pro-Ser, Gly-Pro-Lys, Gly-Pro-Ala, Gly-Pro-Pro, Gly-Pro-Arg and Gly-Pro- The collagen hydrolyzate according to [25] or [26], which is at least one tripeptide selected from the group consisting of Hyp. [28] The collagen hydro
  • the present invention it is possible to provide a novel therapeutic agent (progression inhibitor) and preventive agent for atherosclerosis, and a blood cholesterol lowering agent effective for the treatment and prevention of atherosclerosis. it can. Furthermore, according to the present invention, it is also possible to provide a functional food or a food for specified health that is effective in suppressing and / or preventing aging / inflammation of blood vessels.
  • the collagen hydrolyzate containing the collagen tripeptide Gly-XY contained as an active ingredient in the progression inhibitor, preventive drug, blood cholesterol-lowering drug, functional food and food for specified health use of the present invention is a safety derived from a living body. It is a highly active substance, has the effect of suppressing the migration and proliferation of smooth muscle cells, and has the effect of suppressing the onset and progression of atherosclerosis itself, making it safe for the living body and atherosclerosis Can be suppressed.
  • FIG. 1 shows the experimental results on the effect of CTP on the migration of human aortic smooth muscle cells (AoSMC). This is a migrating AoSMC in a low magnification field of view under an inverted microscope.
  • A is a control group and B is a CTP 3 ⁇ g / ml group.
  • FIG. 2 shows the results of the effect of various concentrations of CTP30 on human aortic smooth muscle cell (AoSMC) migration. Displayed as a percentage of the number of migrating cells in the control group (CTP30: 0 ⁇ g / ml).
  • FIG. 3 shows the experimental results on the effect of CTP30 on PCNA protein expression of AoSMC.
  • FIG. 3A shows an SDS-PAGE electrophoresis image of PCNA expressed in AoSMC after 24 hours exposure to CTP30.
  • FIG. 3B represents the mean of relative intensity of bands ⁇ SD (PCNA / tubulin).
  • FIG. 4 shows the experimental results on the effect of CTP30 on the PCNA positive ratio in human aortic smooth muscle cells (AoSMC). By immunocytochemistry, PCNA positive AoSMC shows brown nuclei and PCNA negative AoSMC shows blue nuclei.
  • FIG. 5 shows the experimental results on the effect of CTP30 on the PCNA positive ratio in human aortic smooth muscle cells (AoSMC). The percentage of PCNA positive cells (mean ⁇ SD) was expressed.
  • FIG. 4 shows the experimental results on the effect of CTP30 on the PCNA positive ratio in human aortic smooth muscle cells (AoSMC). The percentage of PCNA positive cells (mean ⁇ SD) was expressed.
  • FIG. 4 shows the experimental results on the effect of CTP30 on
  • FIG. 6 shows the time course of the effect of various concentrations of CTP30 on the proliferation of human aortic smooth muscle cells (AoSMC).
  • AoSMC was dosed with each concentration of CTP30 for the indicated times, and the total number of cells in 5 high power fields ( ⁇ 200) was calculated. Each value represents the mean ⁇ SD of 3 independent experiments.
  • FIG. 7 shows the results of comparison of the total blood cholesterol levels in the CTP30 administration group and the control group in Example 2.
  • FIG. 8 shows an observation photograph of the aorta in the CTP30 administration group.
  • FIG. 9 shows an observation photograph of the aorta in the control group.
  • FIG. 10 shows three regions of the aorta (the aortic arch, thoracic aorta, and abdominal aorta from the left) obtained from the area of the lesion (plaque) causing atherosclerosis.
  • FIG. 11 shows the results of the effect of various concentrations of CTP90 on human aortic smooth muscle cell (AoSMC) migration. Displayed as a percentage of the number of migrating cells in the control group (CTP90: 0 ⁇ g / ml).
  • FIG. 12 shows the experimental results on the effect of CTP90 on the PCNA positive ratio in human aortic smooth muscle cells (AoSMC). The percentage of PCNA positive cells (mean ⁇ SD) was expressed.
  • FIG. 11 shows the results of the effect of various concentrations of CTP90 on human aortic smooth muscle cell (AoSMC) migration. Displayed as a percentage of the number of migrating cells in the control group (CTP90: 0 ⁇ g /
  • FIG. 13 shows the time course of the effect of various concentrations of CTP90 on the proliferation of human aortic smooth muscle cells (AoSMC).
  • AoSMC was dosed with each concentration of CTP90 for the indicated times, and the total number of cells in 5 high power fields ( ⁇ 200) was calculated. Each value represents the mean ⁇ SD of 3 independent experiments.
  • FIG. 14 shows the analysis result of fibrosis of rabbit atherosclerotic lesion (plaque) by Azan staining.
  • Figure A The dark blue part (black arrow) shows the advanced fibrosis region with many collagen fibers.
  • Figure B The light blue part (blue arrow) shows the initial fibrosis area with few collagen fibers.
  • FIG. 15 shows the effect of CTP30 on the fibrosis of rabbit atherosclerotic lesions (plaque).
  • the area ratio (%) of the dark blue part (fibrosis) and the light blue part (sparse collagen) in the control group (control) and the CTP30 administration group (CTP) is compared.
  • FIG. 16 shows the results of analysis of smooth muscle cells and macrophages in rabbit atherosclerotic lesions (plaques) by immunohistochemistry.
  • a (RAM11) Localization of macrophages (brown cells) in plaques
  • B (HHF35) Localization of smooth muscle cells (brown cells) in plaques.
  • FIG. 17 shows the results of the effect of CTP30 on SMC and macrophage organization in atherosclerotic lesions (plaque).
  • FIG. 18 shows a comparison of the composition (area) ratio of SMC and macrophage in plaque between the CTP30 administration group and the control group.
  • FIG. 19-1 counted the number of migrating cells after administration of GELITA-SOL DA (hereinafter referred to as DA) for 24 hours and expressed the number of AoSMC cells migrating in the control group as 100%. Values represent the relative mean ⁇ SD (% of control group) of 4 independent experiments.
  • FIG. 19-2 counts migratory cells 48 hours after administration of DA, and represents the number of AoSMC cells that migrated in the control group as 100%. Values represent the relative mean ⁇ SD (% of control group) of 4 independent experiments.
  • FIG. 19-1 counted the number of migrating cells after administration of GELITA-SOL DA (hereinafter referred to as DA) for 24 hours and expressed the number of AoSMC cells migrating in the control group as 100%. Values represent the relative mean ⁇ SD (% of control group) of 4
  • 19-3 counts the number of migrating cells after administration of GELITA-SOL LDA Aggl. (Hereinafter, LDA) for 24 hours, and represents the number of AoSMC cells that migrated in the control group as 100%. Values represent the relative mean ⁇ SD (% of control group) of 4 independent experiments.
  • LDA GELITA-SOL LDA Aggl.
  • FIG. 20-1 shows the effect of three concentrations of DA (3, 30, 300 ⁇ g / ml) on the growth of AoSMC and the time course of the control group (0 ⁇ g / ml).
  • AoSMC was dosed with each concentration of DA for the indicated times, after which the total number of cells in 5 high power fields ( ⁇ 200) was calculated. Values represent the mean ⁇ SD of 3 independent experiments.
  • FIG. 20-2 shows the effect of three concentrations of LDA (3, 30, 300 ⁇ g / ml) on the growth of AoSMC and the time course of the control group (0 ⁇ g / ml).
  • AoSMCs were administered each concentration of LDA for the indicated times, after which the total number of cells in 5 high power fields ( ⁇ 200) was calculated.
  • FIG. 21-1 shows the effect of the three concentrations of DA (3, 30, 300 ⁇ g / ml) and the control group (0 ⁇ g / ml) on the PCNA positive cell ratio in AoSMC. Each value represents the mean ⁇ SD of 3 independent experiments and represents the percentage of PCNA positive cells.
  • FIG. 21-2 shows the effects of three concentrations of LDA (3, 30, 300 ⁇ g / ml) and the control group (0 ⁇ g / ml) on the PCNA positive cell ratio in AoSMC. Each value represents the mean ⁇ SD of 3 independent experiments and represents the percentage of PCNA positive cells.
  • FIG. 22 shows HPLC chromatograms of Gelita CP components (DA and LDA) used in Comparative Examples and CTP30 and 90 used in Examples.
  • the first aspect of the present invention is an agent for inhibiting the progression of atherosclerosis.
  • Atherosclerosis occurs in relatively thick arteries such as the aorta, cerebral artery, and coronary arteries.
  • Atherosclerotic plaques adenomas
  • Atherosclerotic plaques accumulate in the inner lining of the arteries of muddy rod-like substances consisting of fats such as cholesterol and cholesterol esters. Spots are formed and gradually thicken, gradually narrowing the lumen of the artery. According to the present invention, progression of atherosclerosis can be suppressed.
  • the progression inhibitor of atherosclerosis of the present invention contains at least one collagen tripeptide Gly-XY (Gly-XY is an amino acid sequence, and X and Y are amino acid residues other than Gly). It contains collagen hydrolyzate as an active ingredient.
  • the collagen hydrolyzate preferably contains 25 to 100% by mass of collagen tripeptide Gly-X-Y.
  • the content of the collagen tripeptide Gly-XY is preferably higher when it is desired to selectively obtain only the effect of the collagen tripeptide Gly-XY, in which case 30 to 100% by mass, More preferably, it can be in the range of 50 to 100% by mass, and still more preferably in the range of 80 to 100% by mass.
  • the progression inhibitor of atherosclerosis of the present invention can achieve a desired effect if it contains the collagen tripeptide Gly-XY, while in order to increase the purity of the collagen tripeptide Gly-XY, Since purification is required, the manufacturing cost tends to increase. Therefore, the content (purity) of the hydrolyzate of collagen containing the collagen tripeptide Gly-X-Y to be used can be determined in consideration of the desired efficacy and cost (expense).
  • Collagen tripeptide Gly-XY contained in collagen hydrolyzate is, for example, Gly-Ala-Asp, Gly-Ala-Lys, Gly-Ala-Val, Gly-Pro-Gln, Gly-Pro-Met , Gly-Pro-Ile, Gly-Pro-Thr, Gly-Pro-Val, Gly-Ser-Hyp, Gly-Lys-Asp, Gly-Ala-Ala, Gly-Pro-Hyl, Gly-Leu-Hyp, Gly -Ala-Arg, Gly-Ala-Ser, Gly-Ala-Hyp, Gly-Gln-Glu, Gly-Glu-Gln, Gly-Pro-Ser, Gly-Pro-Lys, Gly-Pro-Ala, Gly-Pro It can be at least one tripeptide selected from the group consisting of -Pro, Gly-Pro-Arg and Gly-Pro-Hyp. Most of these tripeptid
  • the collagen hydrolyzate is a collagen hydrolyzate other than the above-mentioned collagen tripeptide Gly-XY, but is a hydrolyzate of tetramers or more of amino acids having a molecular weight larger than that of the tripeptide, and the collagen tripeptide Gly-XY. It may further contain Gly-X or XY which is a decomposition product of XY. Gly-X and X-Y are both dipeptides, and X and Y represent amino acid residues other than Gly.
  • the content of the collagen tripeptide Gly-XY is 25 to 35% by mass, the content of Gly-X and XY is about 10% by mass, and the remainder is an amino acid having a molecular weight larger than that of the tripeptide. It is a hydrolyzate of tetramer or higher. Hydrolyzate of amino acid tetramer or higher has a molecular weight of about 6000 at the maximum. This point is also apparent from the HPLC chromatogram of CTP30 shown in FIG.
  • the content of collagen tripeptide Gly-XY is 85 to 100% by mass, and the remainder is a tetramer or more of Gly-X and XY and amino acids having a molecular weight larger than that of the tripeptide. It is a hydrolyzate. This point is also apparent from the HPLC chromatogram of CTP90 shown in FIG.
  • a collagen hydrolyzate containing the collagen tripeptide Gly-X-Y is obtained by hydrolysis using a bacterial collagenase (Patent Documents 8 and 9) that cleaves the peptide bond of type I collagen at the amino terminus of glycine.
  • the type of collagen tripeptide Gly-X-Y contained in the hydrolyzate of collagen varies depending on the type of collagen used as a raw material for hydrolysis, the type of collagenase used for hydrolysis, the hydrolysis conditions, and the like.
  • the hydrolyzate contains highly purified non-antigenic and low allergenic tripeptide fractions containing collagen tripeptides (CTP) with Gly-XY sequences by subjecting them to purification processes by various methods. It can also be a hydrolyzate.
  • the progression inhibitor of atherosclerosis of the present invention varies depending on the concentration of collagen tripeptide Gly-XY contained in the collagen hydrolyzate, which is an active ingredient of collagen hydrolyzate.
  • a hydrolyzate of collagen having a peptide Gly-XY concentration of 30% it can be orally administered in an amount of 10 to 1000 mg per kg of body weight, once a day or divided into 2 to 3 times.
  • the hydrolyzate of collagen which is an active ingredient can be a powder or a tablet, and can also be an aqueous solution.
  • the dosage form is not limited to oral, and injection or the like can also be used.
  • the second aspect of the present invention is a prophylactic agent for atherosclerosis.
  • Atherosclerosis occurs in relatively thick arteries such as the aorta, cerebral artery, and coronary arteries.
  • Atherosclerotic plaques (adenomas) accumulate in the inner lining of the arteries of muddy rod-like substances consisting of fats such as cholesterol and cholesterol esters. Spots are formed and gradually thicken, narrowing the lumen of the artery, and clinical symptoms appear. According to the present invention, the onset of atherosclerosis can be prevented.
  • the collagen hydrolyzate contained as an active ingredient in the prophylactic agent for atherosclerosis of the present invention is the same as that described for the progression inhibitor.
  • the prophylactic agent for atherosclerosis of the present invention varies depending on the concentration of the collagen tripeptide Gly-XY, which is an active ingredient contained in the collagen hydrolyzate.
  • the collagen tripeptide Gly-XY concentration is 30%.
  • 10 to 1000 mg per kg body weight can be orally administered once a day or divided into 2 to 3 times.
  • the hydrolyzate of collagen which is an active ingredient can be a powder or a tablet, and can also be an aqueous solution.
  • the dosage form is not limited to oral, and injection or the like can also be used.
  • hydrolysis of collagen containing at least one collagen tripeptide Gly-XY of the present invention (Gly-XY is an amino acid sequence, X and Y are amino acid residues other than Gly)
  • a method for inhibiting or preventing the progression of atherosclerosis, comprising administering an effective amount of the product to a patient can also be performed.
  • at least one collagen tripeptide Gly-XY (Gly-XY is an amino acid sequence, X, Y for use in the progression inhibition or prevention of atherosclerosis of the present invention) Is a hydrolyzate of collagen containing amino acid residues other than Gly).
  • the third aspect of the present invention is a blood cholesterol lowering drug.
  • Atherosclerosis occurs in relatively thick arteries such as the aorta, cerebral artery, and coronary arteries.
  • Atherosclerotic plaques (adenomas) accumulate in the inner lining of the arteries of muddy rod-like substances consisting of fats such as cholesterol and cholesterol esters. Spots are formed and gradually thicken, narrowing the lumen of the artery, and clinical symptoms appear.
  • blood cholesterol can be lowered, and as a result, the onset of various diseases caused by blood cholesterol such as atherosclerosis can be suppressed or prevented.
  • the collagen hydrolyzate contained in the blood cholesterol-lowering drug of the present invention as an active ingredient is the same as that described for the progression inhibitor.
  • the preventive agent for blood cholesterol lowering drug of the present invention varies depending on the concentration of the active ingredient collagen tripeptide Gly-XY contained in the collagen hydrolyzate, for example, the collagen tripeptide Gly-XY concentration is 30%.
  • the collagen tripeptide Gly-XY concentration is 30%.
  • 10 to 1000 mg per kg body weight can be orally administered once a day or divided into 2 to 3 times.
  • the hydrolyzate of collagen which is an active ingredient can be a powder or a tablet, and can also be an aqueous solution.
  • the dosage form is not limited to oral, and injection or the like can also be used.
  • hydrolysis of collagen containing at least one collagen tripeptide Gly-XY of the present invention (Gly-XY is an amino acid sequence, X and Y are amino acid residues other than Gly)
  • a method for lowering blood cholesterol can also be practiced comprising administering an effective amount of the product to the patient.
  • at least one collagen tripeptide Gly-XY (Gly-XY is an amino acid sequence, and X and Y are amino acids other than Gly, for use in lowering blood cholesterol of the present invention.
  • Collagen hydrolysates containing residues) can also be performed.
  • the present invention includes a hydrolyzate of collagen containing at least one collagen tripeptide Gly-XY (Gly-XY is an amino acid sequence, X and Y are amino acid residues other than Gly) as an active ingredient.
  • Gly-XY is an amino acid sequence
  • X and Y are amino acid residues other than Gly
  • functional foods and foods for specified health use that are effective in suppressing and / or preventing aging / inflammation of blood vessels are also included.
  • the functional food and the food for specified health use of the present invention are effective for suppressing and / or preventing aging / inflammation of blood vessels, and can be used for many people who need to suppress or prevent the progression of atherosclerosis. it can.
  • the kind of collagen tripeptide Gly-X-Y contained in the functional food and the food for specified health use of the present invention is the same as that used for the progression inhibitor or preventive of atherosclerosis.
  • Examples of functional foods and foods for specified health use include supplements such as tablets, capsules and drinks containing the hydrolyzate of collagen containing at least one collagen tripeptide Gly-XY as an active ingredient, or the same collagen And foods and beverages containing the hydrolyzate. Since the functional food and the food for specified health use of the present invention are effective in suppressing and preventing the progression of atherosclerosis, they are used by many people who need to suppress and prevent the progression of atherosclerosis. .
  • the concentration of the collagen hydrolyzate in the functional food and the food for specified health use is preferably 15% by mass or more as the collagen tripeptide Gly-X-Y.
  • the progression suppression and prevention effect of atherosclerosis of the present invention can be obtained by using a collagen hydrolyzate containing collagen tripeptide Gly-XY, while collagen tripeptide Gly-XY is effective.
  • collagen hydrolyzate with low concentration of collagen tripeptide Gly-XY has many components other than collagen tripeptide Gly-XY, especially high molecular weight components with low degree of hydrolysis. It may cause trouble.
  • the purity of the collagen hydrolyzate containing the collagen tripeptide Gly-XY is appropriate to be used in consideration of the desired efficacy and cost (expense), and ease of addition to food. It is. In functional foods, the price may be desired to be suppressed to some extent. In such a case, the content of the collagen tripeptide Gly-X-Y is preferably 15 to 25% by mass. In the food for specified health use, the content of the collagen tripeptide Gly-X-Y can be 15 to 25% by mass as in the case of the functional food. However, there are cases where it is desired to more surely express the effect than functional foods. In such a case, the content of the collagen tripeptide Gly-XY is preferably 25 to 35% by mass. It is.
  • the functional food of the present invention varies depending on the concentration of the active ingredient collagen tripeptide Gly-XY contained in the collagen hydrolyzate.
  • the collagen tripeptide Gly-XY concentration is 20%.
  • 10 to 1000 mg per kg body weight can be taken orally once a day or divided into 2 to 3 times a day.
  • the form of the functional food of the present invention is not particularly limited, and can be solid, liquid, fluid (eg, gel, paste, etc.), and the type of food is not particularly limited.
  • the hydrolyzate of collagen as an active ingredient can be, for example, a powder or a liquid (such as an aqueous solution or an aqueous dispersion) from the viewpoint of being easily applied to a solid, liquid, or fluid.
  • the functional food of the present invention has a function of suppressing changes in blood vessels with aging, in particular, atherosclerosis and inflammation of blood vessels, and maintaining the blood vessels in a good state. Therefore, it is useful for human use that requires such a function.
  • the food for specified health use of the present invention varies depending on the concentration of the collagen tripeptide Gly-XY as an active ingredient contained in the collagen hydrolyzate.
  • the collagen tripeptide Gly-XY concentration is 20%.
  • it can be taken orally in 10 to 500 mg / kg body weight, once daily or in 2 to 3 divided doses.
  • the food for specified health use of the present invention is not particularly limited in form, and can be solid, liquid, fluid (eg, gel, paste, etc.), and the type of food is not particularly limited. Furthermore, it can also be set as a tablet, a capsule, and a drink like the above-mentioned pharmaceutical.
  • the collagen hydrolyzate as an active ingredient can be, for example, a powder or a liquid (aqueous solution or aqueous dispersion) depending on the form of the food.
  • the food for specified health use of the present invention is effective for the suppression and / or prevention of aging / inflammation of blood vessels, and for those who are concerned about atherosclerosis or aging of blood vessels (human) and atherosclerosis or aging of blood vessels. Useful for people who want to prevent or improve.
  • the food for specified health is generally food that is sold while displaying the specific health use of the food.
  • the food for specified health use of the present invention is a food that is scheduled to be sold with the indication of prevention / improvement of atherosclerosis or aging of blood vessels as a specific health use of the food.
  • Example 1 Cell culture Human aortic smooth muscle cells (AoSMC) are purchased from Lonza Walkersville (USA, product code CC-2571) and include basal medium (SmBM, CC-3181) and SingleQuots (CC-4149) Maintained in SmGM-2 Bullet Kit (BulletKit) (Cambrex, CC-3182) at 37 ° C., 5% CO 2 environment. The cells were grown in a 10 cm diameter collagen-coated culture dish at 37 ° C. in a 5% CO 2 incubator.
  • HBSS Hank's buffered saline solution
  • FBS fetal bovine serum
  • AoSMC Migration Assay AoSMC migration was performed using Transwell Permeable Supports (Corning Incorporated Life Sciences, USA, No. 3422) with a membrane filter (6.5 mm diameter) with a pore size of 8.0 ⁇ m. ). AoSMC cultured for 24 hours in SmBM medium was trypsinized and suspended in SmBM at a concentration of 1 ⁇ 10 6 cells / ml. Place 100 ⁇ l of cell suspension in the upper chamber well, put 650 ⁇ l of SmGM containing CTP30 (collagen tripeptide content 30%) at various concentrations (0, 3, 30, 300 ⁇ g / ml) into the lower chamber well, Transwells were incubated at 37 ° C. in a 5% CO 2 incubator.
  • PCNA Western Blot Assay for AoSMC AoSMC suspended at a concentration of 1 ⁇ 10 5 cells / ml was distributed into 6-well microplates (5 ml / well). After attachment, the medium was replaced with SmGM containing CTP30 at various concentrations (0, 3, 30, 300 ⁇ g / ml).
  • This transfer membrane was blocked with tris buffered saline containing 3% bovine serum albumin for 1 hour at 25 ° C., and then reacted with a primary antibody (anti-human PCNA antibody, 1: 500).
  • a primary antibody anti-human PCNA antibody, 1: 500.
  • HRP-conjugated goat anti-mouse IgG (PIERCE, USA) and Supersignal West Femto maximum sensitivity substrate (Pierce, USA) were used for detection of primary antibodies.
  • the resulting chemiluminescence was captured with a cooled CCD camera system (ATTO) and quantified by densitometric analysis ImageJ software (NIH Image).
  • PCNA positive ratio test for AoSMC was trypsinized and suspended in SmGM medium at a concentration of 1 ⁇ 10 5 cells / ml. Sterile cover slices were placed in 6-well microplates and the cell suspension was then dispensed into wells (5 ml cells / well). After attachment (about 6 hours after distribution), the medium was replaced with SmGM containing CTP30 at various concentrations (0, 3, 30, 300 ⁇ g / ml). After incubation for 24 hours, the slices were removed, and PCNA immunocytochemistry was performed using monoclonal mouse anti-human PCNA antibody (Dako Japan, Japan, M0879) and SAB-PO kit (Histofine, Japan, code) 424022).
  • the slices were then double stained with hematoxylin, dehydrated, sealed, and used for cell counting under a microscope.
  • Proliferation assay for AoSMC AoSMC suspended in SmGM medium at a concentration of 1 ⁇ 10 5 cells / ml was distributed into 6-well microplates with sterile cover slices in each well. After attachment, the medium was replaced with SmGM containing CTP30 at various concentrations (0, 3, 30, 300 ⁇ g / ml). Cultures were each 0, 24, 48 and 72 hours, slices removed, fixed with 4% paraformaldehyde, and stained with hematoxylin. The slices were then dehydrated, sealed and used for cell counting under a microscope. Five high power fields (magnification ⁇ 200) were selected for each slice and the total number of cells was calculated.
  • FIG. 1 shows an image of migrating cells at 48 hours. A large number of migrating cells expressed as typical spindles attached to the bottom of the lower chamber well were detected under an inverted microscope.
  • FIG. 2 shows the effect of CTP30 on AoSMC migration. CTP30 strongly inhibited AoSMC migration 48 hours after administration at three concentrations (3, 30, 300 ⁇ g / ml). However, there was no significant difference between different CTP30 concentrations.
  • FIGS. 1 and 2 show the effect of various concentrations of CTP30 on the migration of human aortic smooth muscle cells (AoSMC). Each concentration of CTP30 was administered to AoSMC for 48 hours, after which migrated cells were calculated.
  • FIG. 1 A migrating AoSMC in a low magnification field under an inverted microscope. A and B are a control group and a CTP30-3 ⁇ g / ml group, respectively.
  • FIG. 2 Each value represents the relative mean ⁇ SD (% of control group) counted in 4 independent experiments, and the number of smooth muscle cells that migrated in the control group (CTP 0 ⁇ g / ml) was expressed as 100%. .
  • FIG. 3A shows an SDS-PAGE electrophoresis image of PCNA expressed in AoSMC after 24 hours exposure to CTP30.
  • FIG. 3 shows the effect of various concentrations of CTP30 on PCNA expression in human aortic smooth muscle cells (AoSMC). Each concentration of CTP30 was administered to AoSMC for 24 hours, and then Western blotting was performed as described in the experimental method above.
  • Figure 3A AoSMC PCNA SDS-polyacrylamide gel (10%) electrophoresis image
  • Figure 3B Each value is the average of three independent experiments and represents the mean ⁇ SD of the relative intensity of the bands ( PCNA / tubulin).
  • FIG. 4 shows the results of immunocytochemistry at various CTP30 concentrations.
  • PCNA positive cells can be seen to show brown nuclei and fine spindles.
  • PCNA negative cells show a blue nucleus and appear as an irregular shape with a wide cytoplasm.
  • the quantitative analysis shown in FIG. 5 revealed that CTP30 can greatly reduce the PCNA positive ratio 24 hours after CTP administration. At the same time, there is no significant difference between these three groups at various concentrations, indicating that this effect at 24 hours has no clear dose dependence.
  • Figures 4 and 5 show the effect of various concentrations of CTP30 on the PCNA positive ratio in human aortic smooth muscle cells (AoSMC).
  • AoSMC human aortic smooth muscle cells
  • Various concentrations of CTP30 were administered to AoSMC for 24 hours, and then a PCNA immunocytochemistry method was performed as described in the experimental method above to calculate the positive ratio in 10 high power fields ( ⁇ 200).
  • Figure 4 PCNA positive AoSMC (brown nuclei), PCNA negative AoSMC ⁇ (blue nuclei) by immunocytochemistry;
  • Figure 5 Each value represents the mean ⁇ SD of 3 independent experiments, PCNA positive cells The percentage of
  • FIG. 6 shows the time course of the action of various concentrations of CTP30 on proliferation in human aortic smooth muscle cells (AoSMC).
  • AoSMC was administered with each concentration of CTP30 for the indicated time, and then the total number of cells in 5 high power fields ( ⁇ 200) was calculated as described in the experimental method above. Each value represents the mean ⁇ SD of 3 independent experiments.
  • CTP30 with low CTP content 3 ⁇ g / ml group and 30 ⁇ g / ml group cannot show significant inhibitory effect at this time point (24 hours), but significant growth inhibitory effect after 48 hours and 72 hours of culture time showed that. It suggested that the appearance of an inhibitory effect at high concentrations was earlier than at low concentrations, and that this dose dependence exists only at the beginning of culture (24 hours). Supporting this suggestion, CTP90 with a high CTP content significantly inhibited cell proliferation 24 hours after administration even at low concentrations (3 ⁇ g / ml, 30 ⁇ g / ml).
  • PCNA Proliferating cell nuclear antigen
  • SMC growth and migration is a complex process involving the expression of various genes and related proteins such as transcription factors, cyclins, cyclin-dependent kinases (Cdk), and adhesion molecules. So far, the relationship of proliferation / migration between collagen or degraded fragments and smooth muscle cells has been reported. Fibrous collagen can inhibit arterial smooth muscle cell proliferation through the regulation of Cdk2 inhibitors (refs. 1-2), and fibrous collagen also stimulates human vascular smooth muscle cell genes involved in cellular responses and the pericellular matrix environment. It has been reported that it can be specifically regulated (Cited documents 1-3). However, the knowledge that CTP inhibits proliferation and migration has never been obtained.
  • Example 1 HUMBERT C, SANTISTEBAN MS, USSON Y, ROBERT-NICOUD M: Intranuclear co-location of newly replicated DNA and PCNA by simultaneous immunofluorescent labelling and confocal microscopy in MCF-7 cells.J Cell Sci. 1992 103: 97 -103 (1-2) Koyama H, Raines EW, Bornfeldt KE, Roberts JM, Ross R. Fibrillar collagen inhibits arterial smooth muscle cell proliferation through regulation of Cdk2 inhibitors.
  • Example 2 200mg / in 5 familial hypercholesterolemia model rabbits (KHC rabbit, body weight approx. 2kg, 3 months old, production area: Nippon Medical Science Animal Materials Laboratory, Tokyo; supplier: Sankyo Lab Service Co., Ltd., Toyama) kg of CTP30 (400 mg of CTP30 dissolved in 5 ml of distilled water (MilliQ)) was orally administered for 3 months, and the amount of total cholesterol in blood was compared with that of 5 control groups treated with distilled water without CTP. The results are shown in FIG. Compared to 3 months ago, the control group had a 8% reduction in total blood cholesterol. On the other hand, in the CTP30 administration group, it decreased by 23.2%, and CTP clearly showed an effect of decreasing the total blood cholesterol level.
  • plaques occurred in 16.4% of the total aortic area in the control group, but only 4.5% in the CTP administration group. This is only 27.4% of the plaque area generated in the control group, and it can be said that the occurrence of plaque is strongly suppressed.
  • Example 3 Effect of CTP90 (collagen tripeptide content 90%) on migration and proliferation of cultured smooth muscle cells
  • Smooth muscle cell migration and proliferation assays were performed in the same manner as CTP30 described above.
  • FIG. 11 shows the effect of CTP90 on AoSMC migration.
  • CTP90 inhibited AoSMC migration 48 hours after administration at three concentrations (3, 30, and 300 ⁇ g / ml). However, there was no significant difference between different CTP90 concentrations.
  • FIG. 11 shows the effect of various concentrations of CTP90 on the migration of human aortic smooth muscle cells (AoSMC). Each concentration of CTP90 was administered to AoSMC for 48 hours, after which migrated cells were counted. (FIG. 11) Each value represents the relative mean ⁇ SD (% of control group) of 4 independent experiments, and the number of smooth muscle cells that migrated in the control group was expressed as 100%.
  • FIG. 12 shows the effect of various concentrations of CTP90 on PCNA positive ratio in human aortic smooth muscle cells (AoSMC). Each concentration of CTP90 was administered to AoSMC for 24 hours, and then the PCNA immunocytochemistry method was performed as described in the above experimental method to calculate the positive ratio in 10 high power fields ( ⁇ 200). Each value in FIG. 12 represents the mean ⁇ SD of three independent experiments and represents the percentage of PCNA positive cells.
  • FIG. 13 shows the time course of the action of various concentrations of CTP90 on proliferation in human aortic smooth muscle cells (AoSMC). Each concentration of CTP90 was administered to AoSMC for the indicated time, and then the total number of cells in 5 high power fields ( ⁇ 200) was calculated as described in the experimental method above. Each value represents the mean ⁇ SD of 3 independent experiments.
  • Example 4 Histopathological and immunohistochemical analysis of rabbit aortic lesions [experimental method] In both the experimental group (administered with CTP30) and the control group (administered drinking water without CTP30), the rabbits were sacrificed 3 months later, and the aorta, heart and other organs were collected and fixed in formalin. For the aorta, whole specimens were prepared at intervals of 5 mm, embedded in paraffin, and subjected to histopathological and immunohistochemical analysis.
  • Paraffin sections were immunostained with anti-smooth muscle cell antibody (HHF35, Dako Japan, 1:50) and anti-macrophage antibody (RAM11, Dako Japan, 1:50) to identify each cell. Quantitative analysis was performed using Image-Pro Plus 5.1. Quantification was performed for any five visual fields in the experimental group and the control group at a high magnification ( ⁇ 200).
  • FIG. 16 shows RAM11 positive (brown) macrophages and HHF35 positive (brown) smooth muscle cells of atherosclerotic lesions.
  • FIG. 17 shows that the control group (control) has more cellular components in the plaque than the CTP30 treated group (CTP), and It shows that there are more macrophages (M) than smooth muscle cells (SMC), and that the main cells of atherosclerotic lesions (plaque) are macrophages.
  • FIG. 18 shows that in the control group (control) to which CTP was not added, macrophages were more than twice as large as smooth muscle cells (SMC), and in the CTP30 administration group (CTP), macrophages and smooth muscle cells (SMC) were almost the same. It shows that it exists in the same ratio.
  • CTP30 has an effect of suppressing macrophage infiltration and proliferation in atherosclerotic lesions (plaque).
  • the CTP30, 3-month treatment group significantly increased blood total cholesterol and the area of atherosclerotic lesions (plaque) on the aortic surface compared to the control group Reduced.
  • excessive collagen fiber deposition fibrosis was suppressed.
  • macrophages and smooth muscle cells which are the main constituent cells of plaque, were analyzed immunohistochemically, macrophages were clearly decreased in the CTP-administered group compared to the control group.
  • Macrophages are plaques that produce and secrete various cytokines, growth factors, and proteolytic enzymes such as metalloproteases to develop lesions (Cited document 4-1).
  • most of the lipid soaked in the plaque is accumulated in foam cells derived from macrophages, and lipids such as cholesterol and cholesterol ester are accumulated outside the cells by the collapse of the foam cells.
  • Macrophages develop an acute myocardial infarction or cerebral infarction accompanied by rupture and thrombus formation due to the increase in extracellular lipids and the degradation of extracellular matrix components such as collagen fibers by proteolytic enzymes released by macrophages. The decrease in the effect of suppressing the onset, progress and rupture of plaque (Cited document 4-2).
  • CTP's cholesterol-lowering effect is considered to be one of the causes.
  • Aortic smooth muscle cell (AoSMC) migration and proliferation experiments were performed in the same manner as CTP30 (Example 1) and CTP90 (Example 3) described above.
  • Figure 20 shows the effects of DA and LDA on Ao SMC growth over time .
  • Figure 20 shows the effects of three concentrations of DA and LDA (3, 30, 300 ⁇ g / ml) on the growth of AoSMC and the time course of the control group (0 ⁇ g / ml). Showing change. Each concentration of DA and LDA was administered to AoSMC for the times indicated, and then the total number of cells in 5 high power fields ( ⁇ 200) was calculated. Each value represents the mean ⁇ SD of 3 independent experiments.
  • CTP30, 90, DA, and LDA did not show any significant decrease in the number of cells with culture time. It is not considered to be cytotoxic.
  • DA significantly increased AoSMC after 300 ⁇ g / ml administration, so it is not expected to give a good effect when considered based on the mechanism of atherosclerosis. That is, DA that is equivalent to the collagen hydrolyzate described in Non-Patent Document 12 is not expected to give a good effect when considered based on the mechanism of atherosclerosis.
  • FIG. 21 shows the effect of three concentrations of DA and LDA (3, 30, 300 ⁇ g / ml) and control group (0 ⁇ g / ml) on PCNA positive cell ratio in AoSMC Indicates.
  • Each concentration of DA and LDA was administered to AoSMC for 24 hours, and then PCNA immunocytochemistry was performed as described in Examples 1 and 3 (FIGS. 5 and 12). ) was calculated.
  • Each value in FIG. 21 represents the mean ⁇ SD of three independent experiments and represents the percentage of PCNA positive cells.
  • Each DA and LDA concentration tended to increase the proportion of PCNA positive cells compared to the control group.
  • DA and LDA show an effect of increasing cells in the growth phase of AoSMC.
  • DA and LDA have not shown a positive effect on atherosclerosis, but rather a negative effect (promoting atherosclerosis), because the active proliferation of AoSMC may drive the progression of atherosclerosis The result strongly suggests.
  • FIG. 22 shows HPLC chromatograms of Gelita CP components (DA and LDA) used in the above comparative examples and CTP30 and 90 used in the examples.
  • HPLC measurement conditions are as follows. ⁇ Column: Superdex Peptide 10/300 GL (GE Healthcare Japan Ltd.) ⁇ Eluent: 10 mM Tris-HCl (pH 7.4), 150 mM NaCl, 5 mM CaCl 2 ⁇ Flow rate: 1 mL / min ⁇ Analysis time: 30 min ⁇ Detection: UV (214 nm)
  • CTP30 has a content of collagen tripeptide Gly-XY of 25 to 35% by mass, a content of Gly-X and XY of about 10% by mass, and the remaining 4 amino acids having a molecular weight higher than that of tripeptide. It is a hydrolyzate of a monomer or higher, and the hydrolyzate of a tetramer or higher of amino acids has a molecular weight of about 6000 at the maximum.
  • CTP90 has a collagen tripeptide Gly-X-Y content of 85 to 100% by mass, and the remainder is a hydrolyzate of Gly-X and X-Y and amino acids having a molecular weight larger than that of the tripeptide and higher than tetramers.
  • DA contains almost no peptides with a molecular weight of 500-1500, which is the second largest component in CTP30
  • LDA also contains peptides with a molecular weight of 500-1,500, which is the second largest in CTP30. The amount is small.
  • the product is suspected of being effective as an atherosclerosis progression inhibitor or preventive agent
  • the collagen hydrolyzate containing the collagen tripeptide Gly-XY of the present invention (molecular weight is about 300) is It turns out that it is effective as a progress inhibitor or preventive agent of atherosclerosis.
  • the present invention is useful in the field of producing atherosclerosis progression inhibitors and preventive agents, blood cholesterol lowering agents, and functional foods for suppressing and preventing blood vessel aging and inflammation and foods for specified health use. .

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Coloring Foods And Improving Nutritive Qualities (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

新たなアテローム性動脈硬化症の治療薬及び予防薬、並びに血中コレステロール低下薬を提供する。血管の老化・炎症の抑制及び／又は予防に有効な機能性食品または特定保健用食品を提供する。少なくとも１種類のコラーゲントリペプチドGly-X-Y(Gly-X-Yはアミノ酸配列であり、X、YはGly以外のアミノ酸残基を示す）を含有するコラーゲンの加水分解物を有効成分として含む、アテローム性動脈硬化症の進行抑制薬、アテローム性動脈硬化症の予防薬、血中コレステロール低下薬、血管の老化・炎症の抑制及び／又は予防に有効な機能性食品及び特定保健用食品。

Description

アテローム性動脈硬化症の進行抑制薬・予防薬・血中コレステロール低下薬・機能性食品・特定保健用食品 関連出願の相互参照
　本出願は、２００９年３月１１日出願の日本特願２００９－５７４４４号の優先権を主張し、その全記載は、ここに特に開示として援用される。
　本発明は、アテローム性動脈硬化症の進行抑制薬および予防薬並びに血中コレステロール低下薬に関する。より詳しくは、本発明は、コラーゲントリペプチドを含有するコラーゲンの加水分解物を有効成分として含むアテローム性動脈硬化症の進行抑制薬および予防薬並びに血中コレステロール低下薬に関する。さらに本発明は、コラーゲントリペプチドを含有するコラーゲンの加水分解物を有効成分として含む、血管の老化・炎症を抑え、予防する機能性食品及び特定保健用食品に関する。
　動脈硬化の予防については、その発生機序に関連するいくつかの因子に対して、それらを標的とした各種化合物質が特許出願されている（例えば、特許文献1～5）。
　また、新規化合物のほかに、医療用活性炭を経口投与する方法（特許文献6）や、黒酵母の培養液を健康補助食品として摂取する方法（特許文献7）など、天然物質を摂取して動脈硬化を予防/改善する方法も多数提唱されている。
　一方、コラーゲンは多様な、しかし関連する分子のグループである。各々は異なる生化学的および物理的性質を有するが、それらはα鎖と呼ばれる３本のポリペプチド鎖から成る同様の３重らせんドメインを共通して含む。各α鎖は高い割合のグリシンを含み、グリシンは規則的に反復される３つのアミノ酸配列中に存在し、Gly-X-Yと表現できる。さらに、ここで概ねXで比較的多いアミノ酸はプロリンであり、Yで比較的多いアミノ酸はヒドロキシプロリンである。このコンホメーションでは、グリシンおよびペプチド結合は分子の内側に埋め込まれ、そのことがコラーゲンにタンパク質分解に対する高い耐性を与える。
　I型コラーゲンのペプチド結合をグリシンのアミノ末端で切断する細菌コラゲナーゼ(特許文献8、9)を用いて、コラーゲントリペプチド(CTP)というGly-X-Y配列を含む高度に精製された非抗原性および低アレルゲン性トリペプチド画分が得られる(特許文献10)。
　近年の研究は、CTPがコラーゲンの産生を、線維芽細胞の分泌活性をアップレギュレートすることによって調節できることを示唆しており、皮膚、骨、軟骨などといった多数の臓器において生物学的作用を示している(非特許文献1)。また、関節痛軽減効果（非特許文献2）などが示されている。
　CTPを有効成分とする創傷治癒剤、腱または靭帯の損傷等に対する改善、治癒促進または予防剤、腱または靭帯の改善または強化剤、競走馬の屈腱または靭帯の損傷または断裂に対する改善、治癒促進または予防剤、競走馬の屈腱または靭帯の改善または強化剤、その創傷治癒剤を含む機能性食品ならびに医薬品も提案している(特許文献11)。
[特許文献１]特開平１１－４９８０２号公報
[特許文献２]特開２００３－４８８８９号公報
[特許文献３]特開２００４－３５４７５号公報
[特許文献４]特開２００２－２７５０６２号公報
[特許文献５]特開２００５－２６３７５８号公報
[特許文献６]特開２００７－１８２４４８号公報
[特許文献７]特開２００２－２０４６８７号公報
[特許文献８]特開２０００－１０２３８１号公報
[特許文献９]特開２００４－３５０５１３号公報
[特許文献１０]特開２００７－２３１２２５号公報
[特許文献１１]特開２００５－２８１１８６号公報
[特許文献１２]特開２００１－３１５８６号公報
[非特許文献１]コラーゲン・トリペプチド「HACP」の骨・腱に対する効果、FFIジャーナル、210巻（9月号）、854-858（2005）
[非特許文献２]第12回日本関節症研究会学術集会/丸山公ら
[非特許文献３]Stehbens WE: Atherosclerosis and degenerative diseases of blood vessels. In. Vascular Pathology. ed by Stehbens and Lie JT, pp175-269, Chapman and Hall Medical, London, 1995
[非特許文献４]勝田　省吾:人体病理の立場から、動脈硬化、2001、28巻3号、69-73
[非特許文献５]Ross R: The pathogenesis of atherosclerosis: a perspective for the 1990s. Nature 1993;362:801-809.
[非特許文献６]渡辺照男ほか、粥状硬化（症）、綜合臨牀、1984、33：647-655
上記特許文献１～１２及び非特許文献１～６の全記載は、ここに特に開示として援用される。
　ヒトの動脈硬化（Atherosclerosis：アテローム性動脈硬化症）は生後まもなく発生し、ゆっくりと静かに進行する。50歳前後を過ぎるといろいろな臨床症状を呈するとともに、病変もさらに進行する（非特許文献３）。病理学的検証で、若年層でも強い動脈硬化を認める事例がある一方、高齢者の動脈にほとんど病変を認めない事例がみられることもある。これらは動脈硬化が長期間かけてゆっくり進行する現象であるからこそ、生活習慣や社会的要因など種々の因子が病変の程度に大きく影響することに起因する（非特許文献４）。かつてThomas Sydenhamが「ヒトは動脈とともに老いる“A man is as old as his arteries”」と述べたように、動脈硬化は人の加齢・老化と深く関係している。動脈は内膜・中膜・外膜の三層から成るが、動脈自体の加齢・老化は病理学的には内膜での平滑筋細胞の増生とコラーゲン線維を含む間質成分の蓄積によるびまん性肥厚、中膜の弾性線維の変性・断裂や線維化をさしており、動脈硬化と血管の老化はお互い密接な関係にある。
　近年益々重要な疾患になっているアテローム性動脈硬化は動脈の内膜に炎症反応が起こり平滑筋細胞、マクロファージ、Tリンパ球が浸潤・増殖すると共に内膜の細胞内外に脂質（主にコレステロールやコレステロールエステル）が蓄積し、内膜が肥厚してくる（プラーク形成）。こうした発生機序に基づき、近年ではアテローム性動脈硬化が血管における炎症の一種であると認識されている。細胞外に脂質が多量に沈着するとプラークは弱くなり、破裂・血栓形成を伴い急性心筋梗塞や脳梗塞が発症する。尚、本明細書において、アテローム性動脈硬化巣を単にプラークと表現することがある。
　動脈平滑筋細胞(SMC)は動脈の中膜の主な細胞成分であり、動脈に正常構造を与え、および、刺激に応じた血管収縮および拡張、コラーゲン、エラスチン、および他の細胞外マトリックスの成分の合成、多数のサイトカインの分泌など、重要な身体機能を与える。また、中膜平滑筋細胞の血管内膜への遊走および増殖は、アテローム性動脈硬化症の発生・進行の基礎となる重要な現象である（非特許文献５）。そのため、SMCは動脈の構造および機能の重要な決定因子であり、機能または分布の異常はアテローム性動脈硬化症や他の動脈病変の病理過程に深く関与する。
　アテローム性動脈硬化症の治療薬としては、例えば、高脂血症治療薬(スタチン系、フィブラート系)が用いられている。高脂血症治療薬は、主に血中の脂質改善を目的とする薬剤であり、SMCに直接作用してアテローム性動脈硬化症の進行を抑制するものではない。SMCといったコラーゲン産生細胞に対して直接的に作用することを狙った薬剤はこれまでにはない。
　化学物質、特に合成品は、まず人体への副作用などが懸念され、効果・効能の制御や実際に商品に至るまで多くの検証を行う必要があり、時間もかかる。天然物質については、経口摂取が可能な場合が多いが、効果・効能は様々であり、また、品質管理が難しいといった問題点が考えられる。さらにこれまでのところ、既存のどの製品もアテローム性動脈硬化症の予防や治療に決定的といえるものはない。
　また、２～１５歳になるとほとんどの小児の動脈にアテローム性動脈硬化症の初期病変が観察される。思春期頃から病変の増加が著明となり、２０～３０歳までには大動脈表面の約３０％を病変が占めるに至る（非特許文献６）。従って、アテローム性動脈硬化症を自覚し、または発症する前の健康な人々にとっても、血管の老化・炎症を抑え、予防する効果を有し、アテローム性動脈硬化症の進行を抑制または予防する効果を期待できる機能性食品及び特定保健用食品に対するニーズは存在する。
　そこで本発明の目的は、アテローム性動脈硬化の成り立ちに重要な役割を果たすSMCに対して何らかの作用を有する有効成分を含有する、新たなアテローム性動脈硬化症の治療薬あるいは予防薬を提供することにある。さらに本発明は、アテローム性動脈硬化に関連する血中コレステロールの低下効果を有する血中コレステロールの低下薬を提供することにある。加えて本発明は、アテローム性動脈硬化症に対して抑制効果を有する、アテローム性動脈硬化症の進行抑制および予防に有効な機能性食品及び特定保健用食品を提供することにある。
　前記CTPは、SMCに対して何らかの作用を有することは知られていなかった。そこで、本発明者らは、大動脈平滑筋細胞（AoSMC）を用いて、CTPが平滑筋細胞の遊走および増殖に対して、何らかの作用を有するか否かについて調査した。その結果、CTPを添加した平滑筋培養細胞の培養液において遊走性と増殖性が抑制されることが見出された。さらに、家族性高コレステロール血症モデルウサギを用いて、経口投与の実験を行ったところ、当初の予想を超えた効果として、アテローム性動脈硬化の発生・進行自体を抑制することができることが判明した。このような知見に基づいて本発明は完成された。
　上記課題を解決するための本発明は以下のとおりである。
［1］
少なくとも１種類のコラーゲントリペプチドGly-X-Y(Gly-X-Yはアミノ酸配列であり、X、YはGly以外のアミノ酸残基を示す）を含有するコラーゲンの加水分解物を有効成分として含む、アテローム性動脈硬化症の進行抑制薬または予防薬。
［2］
コラーゲンの加水分解物が25～100質量%のコラーゲントリペプチドGly-X-Yを含有する［1］に記載の進行抑制薬または予防薬。
［3］
コラーゲントリペプチドGly-X-Yが、Gly-Ala-Asp、Gly-Ala-Lys、Gly-Ala-Val、Gly-Pro-Gln、Gly-Pro-Met、Gly-Pro-Ile、Gly-Pro-Thr、Gly-Pro-Val、Gly-Ser-Hyp、Gly-Lys-Asp、Gly-Ala-Ala、Gly-Pro-Hyl、Gly-Leu-Hyp、Gly-Ala-Arg、Gly-Ala-Ser、Gly-Ala-Hyp、Gly-Gln-Glu、Gly-Glu-Gln、Gly-Pro-Ser、Gly-Pro-Lys、Gly-Pro-Ala、Gly-Pro-Pro、Gly-Pro-ArgおよびGly-Pro-Hypから成る群から選ばれる少なくとも1種のトリペプチドである［1］または［2］に記載の進行抑制薬または予防薬。
［4］
コラーゲンの加水分解物がコラーゲントリペプチドGly-X-Yの分解物であるGly-XまたはX-Yをさらに含有する［1］～［3］のいずれかに記載の進行抑制薬または予防薬。
［5］
少なくとも１種類のコラーゲントリペプチドGly-X-Y(Gly-X-Yはアミノ酸配列であり、X、YはGly以外のアミノ酸残基を示す）を含有するコラーゲンの加水分解物を有効成分として含む、血中コレステロール低下薬。
［6］
コラーゲンの加水分解物が25～100質量%のコラーゲントリペプチドGly-X-Yを含有する［5］に記載の血中コレステロール低下薬。
［7］
コラーゲントリペプチドGly-X-Yが、Gly-Ala-Asp、Gly-Ala-Lys、Gly-Ala-Val、Gly-Pro-Gln、Gly-Pro-Met、Gly-Pro-Ile、Gly-Pro-Thr、Gly-Pro-Val、Gly-Ser-Hyp、Gly-Lys-Asp、Gly-Ala-Ala、Gly-Pro-Hyl、Gly-Leu-Hyp、Gly-Ala-Arg、Gly-Ala-Ser、Gly-Ala-Hyp、Gly-Gln-Glu、Gly-Glu-Gln、Gly-Pro-Ser、Gly-Pro-Lys、Gly-Pro-Ala、Gly-Pro-Pro、Gly-Pro-ArgおよびGly-Pro-Hypから成る群から選ばれる少なくとも1種のトリペプチドである［5］または［6］に記載の血中コレステロール低下薬。
［8］
コラーゲンの加水分解物がコラーゲントリペプチドGly-X-Yの分解物であるGly-XあるいはX-Yをさらに含有する［5］～［7］のいずれかに記載の血中コレステロール低下薬。
［9］
少なくとも１種類のコラーゲントリペプチドGly-X-Y(Gly-X-Yはアミノ酸配列であり、X、YはGly以外のアミノ酸残基を示す）を含有するコラーゲンの加水分解物を有効成分として含む、血管の老化・炎症の抑制及び／又は予防に有効な機能性食品または特定保健用食品。
［10］
コラーゲンの加水分解物が15～100質量%のコラーゲントリペプチドGly-X-Yを含有する［9］に記載の機能性食品または特定保健用食品。
［11］
コラーゲントリペプチドGly-X-Yが、Gly-Ala-Asp、Gly-Ala-Lys、Gly-Ala-Val、Gly-Pro-Gln、Gly-Pro-Met、Gly-Pro-Ile、Gly-Pro-Thr、Gly-Pro-Val、Gly-Ser-Hyp、Gly-Lys-Asp、Gly-Ala-Ala、Gly-Pro-Hyl、Gly-Leu-Hyp、Gly-Ala-Arg、Gly-Ala-Ser、Gly-Ala-Hyp、Gly-Gln-Glu、Gly-Glu-Gln、Gly-Pro-Ser、Gly-Pro-Lys、Gly-Pro-Ala、Gly-Pro-Pro、Gly-Pro-ArgおよびGly-Pro-Hypから成る群から選ばれる少なくとも1種のトリペプチドである［9］または［10］に記載の機能性食品または特定保健用食品。
［12］
コラーゲンの加水分解物がコラーゲントリペプチドGly-X-Yの分解物であるGly-XあるいはX-Yをさらに含有する［9］～［11］のいずれかに記載の機能性食品または特定保健用食品。
[13]
少なくとも１種類のコラーゲントリペプチドGly-X-Y(Gly-X-Yはアミノ酸配列であり、X、YはGly以外のアミノ酸残基を示す）を含有するコラーゲンの加水分解物の有効量を患者に投与することを含む、アテローム性動脈硬化症の進行抑制または予防する方法。
[14]
コラーゲンの加水分解物が25～100質量%のコラーゲントリペプチドGly-X-Yを含有する[13]に記載の進行抑制または予防方法。
[15]
コラーゲントリペプチドGly-X-Yが、Gly-Ala-Asp、Gly-Ala-Lys、Gly-Ala-Val、Gly-Pro-Gln、Gly-Pro-Met、Gly-Pro-Ile、Gly-Pro-Thr、Gly-Pro-Val、Gly-Ser-Hyp、Gly-Lys-Asp、Gly-Ala-Ala、Gly-Pro-Hyl、Gly-Leu-Hyp、Gly-Ala-Arg、Gly-Ala-Ser、Gly-Ala-Hyp、Gly-Gln-Glu、Gly-Glu-Gln、Gly-Pro-Ser、Gly-Pro-Lys、Gly-Pro-Ala、Gly-Pro-Pro、Gly-Pro-ArgおよびGly-Pro-Hypから成る群から選ばれる少なくとも1種のトリペプチドである[13]または[14]に記載の進行抑制または予防方法。
[16]
コラーゲンの加水分解物がコラーゲントリペプチドGly-X-Yの分解物であるGly-XまたはX-Yをさらに含有する[13]～[15]のいずれかに記載の進行抑制または予防方法。
[17]
アテローム性動脈硬化症の進行抑制または予防に用いるための、少なくとも１種類のコラーゲントリペプチドGly-X-Y(Gly-X-Yはアミノ酸配列であり、X、YはGly以外のアミノ酸残基を示す）を含有するコラーゲンの加水分解物。
[18]
コラーゲンの加水分解物が25～100質量%のコラーゲントリペプチドGly-X-Yを含有する[17]に記載のコラーゲンの加水分解物。
[19]
コラーゲントリペプチドGly-X-Yが、Gly-Ala-Asp、Gly-Ala-Lys、Gly-Ala-Val、Gly-Pro-Gln、Gly-Pro-Met、Gly-Pro-Ile、Gly-Pro-Thr、Gly-Pro-Val、Gly-Ser-Hyp、Gly-Lys-Asp、Gly-Ala-Ala、Gly-Pro-Hyl、Gly-Leu-Hyp、Gly-Ala-Arg、Gly-Ala-Ser、Gly-Ala-Hyp、Gly-Gln-Glu、Gly-Glu-Gln、Gly-Pro-Ser、Gly-Pro-Lys、Gly-Pro-Ala、Gly-Pro-Pro、Gly-Pro-ArgおよびGly-Pro-Hypから成る群から選ばれる少なくとも1種のトリペプチドである[17]または[18]に記載のコラーゲンの加水分解物。
[20]
コラーゲンの加水分解物がコラーゲントリペプチドGly-X-Yの分解物であるGly-XまたはX-Yをさらに含有する[17]～[19]のいずれかに記載のコラーゲンの加水分解物。
[21]
少なくとも１種類のコラーゲントリペプチドGly-X-Y(Gly-X-Yはアミノ酸配列であり、X、YはGly以外のアミノ酸残基を示す）を含有するコラーゲンの加水分解物の有効量を患者に投与することを含む、血中コレステロールを低下させる方法。
[22]
コラーゲンの加水分解物が25～100質量%のコラーゲントリペプチドGly-X-Yを含有する[21]に記載の血中コレステロールを低下させる方法。
[23]
コラーゲントリペプチドGly-X-Yが、Gly-Ala-Asp、Gly-Ala-Lys、Gly-Ala-Val、Gly-Pro-Gln、Gly-Pro-Met、Gly-Pro-Ile、Gly-Pro-Thr、Gly-Pro-Val、Gly-Ser-Hyp、Gly-Lys-Asp、Gly-Ala-Ala、Gly-Pro-Hyl、Gly-Leu-Hyp、Gly-Ala-Arg、Gly-Ala-Ser、Gly-Ala-Hyp、Gly-Gln-Glu、Gly-Glu-Gln、Gly-Pro-Ser、Gly-Pro-Lys、Gly-Pro-Ala、Gly-Pro-Pro、Gly-Pro-ArgおよびGly-Pro-Hypから成る群から選ばれる少なくとも1種のトリペプチドである[21]または[22]に記載の血中コレステロールを低下させる方法。
[24]
コラーゲンの加水分解物がコラーゲントリペプチドGly-X-Yの分解物であるGly-XあるいはX-Yをさらに含有する[21]～[23]のいずれかに記載の血中コレステロールを低下させる方法。
[25]
血中コレステロールの低下に用いるための、少なくとも１種類のコラーゲントリペプチドGly-X-Y(Gly-X-Yはアミノ酸配列であり、X、YはGly以外のアミノ酸残基を示す）を含有するコラーゲンの加水分解物。
[26]
コラーゲンの加水分解物が25～100質量%のコラーゲントリペプチドGly-X-Yを含有する[25]に記載のコラーゲンの加水分解物。
[27]
コラーゲントリペプチドGly-X-Yが、Gly-Ala-Asp、Gly-Ala-Lys、Gly-Ala-Val、Gly-Pro-Gln、Gly-Pro-Met、Gly-Pro-Ile、Gly-Pro-Thr、Gly-Pro-Val、Gly-Ser-Hyp、Gly-Lys-Asp、Gly-Ala-Ala、Gly-Pro-Hyl、Gly-Leu-Hyp、Gly-Ala-Arg、Gly-Ala-Ser、Gly-Ala-Hyp、Gly-Gln-Glu、Gly-Glu-Gln、Gly-Pro-Ser、Gly-Pro-Lys、Gly-Pro-Ala、Gly-Pro-Pro、Gly-Pro-ArgおよびGly-Pro-Hypから成る群から選ばれる少なくとも1種のトリペプチドである[25]または[26]に記載のコラーゲンの加水分解物。
[28]
コラーゲンの加水分解物がコラーゲントリペプチドGly-X-Yの分解物であるGly-XあるいはX-Yをさらに含有する[25]～[27]のいずれかに記載のコラーゲンの加水分解物。
　本発明によれば、アテローム性動脈硬化症の新たな治療薬（進行抑制薬）および予防薬、並びにアテローム性動脈硬化症の治療及び予防等に有効な、血中コレステロール低下薬を提供することができる。さらに本発明によれば、血管の老化・炎症の抑制及び／又は予防に有効な機能性食品または特定保健用食品を提供することもできる。本発明の進行抑制薬、予防薬、血中コレステロール低下薬、機能性食品および特定保健用食品に有効成分として含有されるコラーゲントリペプチドGly-X-Yを含有するコラーゲン加水分解物は、生体由来の安全性の高い物質であり、平滑筋細胞の遊走性と増殖性を抑制する効果があり、かつアテローム性動脈硬化の発生・進行自体を抑制する効果を有することから、生体に安全でアテローム性動脈硬化の発症抑制ができるものである。
図1は、ヒト大動脈平滑筋細胞(AoSMC)の遊走に対するCTPの作用についての実験結果を示す。倒立顕微鏡下の一低倍率視野中の遊走AoSMCである。Aは対照群であり、BはCTP3μg/ml群である。 図2は、ヒト大動脈平滑筋細胞(AoSMC)の遊走に対するさまざまな濃度のCTP30の作用の結果を示す。対照群(CTP30:0μg/ml)における遊走細胞数に対する百分率で表示してある。 図3は、AoSMCのPCNAタンパク質発現に対するCTP30の作用についての実験結果を示す。図3AはCTP30へ24時間曝露後のAoSMCに発現されるPCNAのSDS-PAGEの電気泳動像を示す。図3Bは、バンドの相対強度の平均±SDを表す(PCNA/チューブリン)。 図4は、ヒト大動脈平滑筋細胞(AoSMC)におけるPCNA陽性比に対するCTP30の作用についての実験結果を示す。免疫細胞化学法によってPCNA陽性AoSMCは茶色の核を示し、PCNA陰性AoSMCは青色の核を示す。 図5は、ヒト大動脈平滑筋細胞(AoSMC)におけるPCNA陽性比に対するCTP30の作用についての実験結果を示す。PCNA陽性細胞の割合(平均±SD)を表した。 図6は、ヒト大動脈平滑筋細胞(AoSMC)の増殖に対するさまざまな濃度のCTP30の作用の経時変化を示す。AoSMCに各濃度のCTP30を記載の時間投与し、5個の高倍率視野(×200)中の細胞総数を計算した。各値は3回の独立した実験の平均±SDを表す。 図7は、実施例2におけるCTP30投与群と対照群の血中総コレステロール量についての比較結果を示す。 図8は、CTP30投与群の大動脈の観察写真を示す。 図9は、対照群の大動脈の観察写真を示す。 図10は、アテローム性動脈硬化を起こしている病変(プラーク)の面積をもとめた大動脈の3領域(左から大動脈弓部、胸部大動脈および腹部大動脈)を示す。 図11は、ヒト大動脈平滑筋細胞（AoSMC）の遊走に対するさまざまな濃度のCTP90の作用の結果を示す。対照群（CTP90:0μg/ml)における遊走細胞数に対する百分率で表示してある。 図12は、ヒト大動脈平滑筋細胞（AoSMC）におけるPCNA陽性比に対するCTP90の作用についての実験結果を示す。PCNA陽性細胞の割合（平均±SD）を表した。 図13は、ヒト大動脈平滑筋細胞（AoSMC）の増殖に対するさまざまな濃度のCTP90の作用の経時的変化を示す。AoSMCに各濃度のCTP90を記載の時間投与し、5個の高倍率視野（×200）中の細胞総数を計算した。各値は3回の独立した実験の平均±SDを表す。 図14は、アザン染色によるウサギ・アテローム性動脈硬化巣（プラーク）の線維化の解析結果を示す。図A:濃青色の部分（黒の矢印）はコラーゲン線維の多い進行した線維化領域を示す。図B:淡青色の部分（青の矢印）はコラーゲン線維の少ない初期の線維化領域を示す。 図15は、ウサギ・アテローム性動脈硬化巣（プラーク）の線維化に対するCTP30の作用を示す。対照群（control）、CTP30投与群（CTP）における濃青色の部分（fibrosis）と淡青色の部分（sparse collagen）の面積率（%）を比較したものである。 図16は、免疫組織化学によるウサギ・アテローム性動脈硬化巣（プラーク）における平滑筋細胞とマクロファージの解析結果を示す。A（RAM11）：プラークにおけるマクロファージ（褐色の細胞）の局在を示し、B（HHF35）：プラークにおける平滑筋細胞（褐色の細胞）の局在を示す。 図17は、アテローム性動脈硬化巣（プラーク）におけるSMCとマクロファージの構成に対するCTP30の作用の結果を示す。 図18は、CTP30投与群と対照群の、プラーク中のSMCとマクロファージの構成（面積）比の比較を示す。 図19-1は、GELITA-SOL DA（以下、DA）の投与24時間の遊走細胞を計数し、対照群において遊走したAoSMCの細胞数を100％として表した。値は4回の独立した実験の相対平均±SD（対照群の％）を示している。 図19-2は、DAの投与48時間の遊走細胞を計数し、対照群において遊走したAoSMCの細胞数を100％として表した。値は4回の独立した実験の相対平均±SD（対照群の％）を示している。 図19-3は、GELITA-SOL LDA Aggl.（以下、LDA）の投与24時間の遊走細胞を計数し、対照群において遊走したAoSMCの細胞数を100％として表した。値は4回の独立した実験の相対平均±SD（対照群の％）を示している。 図19-4は、LDAの投与48時間後の遊走細胞を計数し、対照群において遊走したAoSMCの細胞数を100％として表した。値は4回の独立した実験の相対平均±SD（対照群の％）を示している。 図20-1は、AoSMCの増殖に対するDAの3種類の濃度（3、30、300 μg/ml）の作用と対照群（0μg/ml）の経時変化を示す。AoSMCに各濃度のDAを記載の時間投与し、その後、5個の高倍率視野（×200）中の細胞総数を計算した。値は3回の独立した実験の平均±SDを表す。 図20-2は、AoSMCの増殖に対するLDAの3種類の濃度（3、30、300 μg/ml）の作用と対照群（0μg/ml）の経時変化を示す。AoSMCに各濃度のLDAを記載の時間投与し、その後、5個の高倍率視野（×200）中の細胞総数を計算した。各値は3回の独立した実験の平均±SDを表す。 図21-1は、AoSMCにおけるPCNA陽性細胞比に対するDAの3種類の濃度（3、30、300 μg/ml）と対照群（0μg/ml）の作用を示す。各値は3回の独立した実験の平均±SDを表し、PCNA陽性細胞の割合を表した。 図21-2は、AoSMCにおけるPCNA陽性細胞比に対するLDAの3種類の濃度（3、30、300 μg/ml）と対照群（0μg/ml）の作用を示す。各値は3回の独立した実験の平均±SDを表し、PCNA陽性細胞の割合を表した。 図22は、比較例で使用したGelita社のCP成分（DAおよびLDA）及び実施例で使用したCTP30及び90それぞれのHPLCのクロマトグラムを示す。
[アテローム性動脈硬化症の進行抑制薬]
　本発明の第１の態様は、アテローム性動脈硬化症の進行抑制薬である。アテローム性動脈硬化症は、大動脈や脳動脈、冠動脈などの比較的太い動脈に起こり、動脈の内膜にコレステロールやコレステロールエステルなどの脂肪からなるドロドロの粥状物質がたまってアテローム性プラーク（粥腫斑）ができ、次第に肥厚することで生じ、徐々に動脈の内腔を狭めていく。本発明によれば、アテローム性動脈硬化症の進行を抑制することができる。
　本発明のアテローム性動脈硬化症の進行抑制薬は、少なくとも１種類のコラーゲントリペプチドGly-X-Y(Gly-X-Yはアミノ酸配列であり、X、YはGly以外のアミノ酸残基を示す）を含有するコラーゲンの加水分解物を有効成分として含むものである。このコラーゲンの加水分解物は、好ましくは25～100質量%のコラーゲントリペプチドGly-X-Yを含有するものである。コラーゲントリペプチドGly-X-Yの含有率は、コラーゲントリペプチドGly-X-Yの効果のみを選択的に得たい場合には、より高い含有量であることが好ましく、その場合には30～100質量%、より好ましくは50～100質量%、さらに好ましくは80～100質量%の範囲であることができる。本発明のアテローム性動脈硬化症の進行抑制薬は、コラーゲントリペプチドGly-X-Yを含有すれば、所望の効果を得られる一方で、コラーゲントリペプチドGly-X-Yの純度を高めるためには、高度の精製が必要になることから、製造コストが高くなる傾向がある。従って、所望の効能とコスト(費用)を考慮して、使用するコラーゲントリペプチドGly-X-Yを含有するコラーゲンの加水分解物の含有量(純度)を決めることができる。
　また、コラーゲンの加水分解物に含有されるコラーゲントリペプチドGly-X-Yは、例えば、Gly-Ala-Asp、Gly-Ala-Lys、Gly-Ala-Val、Gly-Pro-Gln、Gly-Pro-Met、Gly-Pro-Ile、Gly-Pro-Thr、Gly-Pro-Val、Gly-Ser-Hyp、Gly-Lys-Asp、Gly-Ala-Ala、Gly-Pro-Hyl、Gly-Leu-Hyp、Gly-Ala-Arg、Gly-Ala-Ser、Gly-Ala-Hyp、Gly-Gln-Glu、Gly-Glu-Gln、Gly-Pro-Ser、Gly-Pro-Lys、Gly-Pro-Ala、Gly-Pro-Pro、Gly-Pro-ArgおよびGly-Pro-Hypから成る群から選ばれる少なくとも1種のトリペプチドであることができる。これらのトリペプチドは、ほとんどが親水性を示す物である。
　コラーゲンの加水分解物は、上記コラーゲントリペプチドGly-X-Y以外に、コラーゲンの加水分解物ではあるが、トリペプチドよりも分子量の大きいアミノ酸の4量体以上の加水分解物と、コラーゲントリペプチドGly-X-Yの分解物であるGly-XまたはX-Yをさらに含有することができる。Gly-X及びX-Yはいずれもジペプチドであり、X、YはGly以外のアミノ酸残基を示す。実施例で使用するCTP30の場合、コラーゲントリペプチドGly-X-Yの含有量が25～35質量%、Gly-X及びX-Yの含有量が約10質量%、残りがトリペプチドよりも分子量の大きいアミノ酸の4量体以上の加水分解物である。アミノ酸の4量体以上の加水分解物は、最大でも分子量が6000程度である。この点は、図22に示すCTP30のHPLCのクロマトグラムからも明らかである。また、実施例で使用するCTP90の場合、コラーゲントリペプチドGly-X-Yの含有量が85～100質量%であり、残りがGly-X及びX-Yとトリペプチドよりも分子量の大きいアミノ酸の4量体以上の加水分解物である。この点は、図22に示すCTP90のHPLCのクロマトグラムからも明らかである。
　コラーゲントリペプチドGly-X-Yを含有するコラーゲンの加水分解物は、I型コラーゲンのペプチド結合をグリシンのアミノ末端で切断する細菌コラゲナーゼ(特許文献8、9)を用いて加水分解することで得られる。コラーゲンの加水分解物に含まれるコラーゲントリペプチドGly-X-Yの種類は、加水分解の原料となるコラーゲンの種類や加水分解に使用するコラゲナーゼの種類や加水分解条件等により変化する。さらに、加水分解物は、種々の方法による精製処理に供することによって、Gly-X-Y配列を有するコラーゲントリペプチド(CTP)を含む高度に精製された非抗原性および低アレルゲン性トリペプチド画分を含む加水分解物とすることもできる。
　本発明のアテローム性動脈硬化症の進行抑制薬は、有効成分であるコラーゲンの加水分解物を、コラーゲンの加水分解物に含まれるコラーゲントリペプチドGly-X-Yの濃度によっても異なるが、例えば、コラーゲントリペプチドGly-X-Y濃度が30%のコラーゲンの加水分解物の場合、体重1kg当たり10～1000mg、1日1回または2～3回に分けて経口投与することができる。有効成分であるコラーゲンの加水分解物は、粉末または錠剤とすることができる他、水溶液とすることもできる。また投与形態は、経口に限らず、注射等も利用できる。
[アテローム性動脈硬化症の予防薬]
　本発明の第２の態様は、アテローム性動脈硬化症の予防薬である。アテローム性動脈硬化症は、大動脈や脳動脈、冠動脈などの比較的太い動脈に起こり、動脈の内膜にコレステロールやコレステロールエステルなどの脂肪からなるドロドロの粥状物質がたまってアテローム性プラーク（粥腫斑）ができ、次第に肥厚することで動脈の内腔を狭め、臨床症状が出現してくる。本発明によれば、アテローム性動脈硬化症の発症を予防することができる。
　本発明のアテローム性動脈硬化症の予防薬が有効成分として含有するコラーゲンの加水分解物は、上記進行抑制薬で説明したものと同様である。
　本発明のアテローム性動脈硬化症の予防薬は、コラーゲンの加水分解物に含まれる有効成分のコラーゲントリペプチドGly-X-Yの濃度によっても異なるが、例えば、コラーゲントリペプチドGly-X-Y濃度が30%のコラーゲンの加水分解物の場合、体重1kg当たり10～1000mg、1日1回または2～3回に分けて経口投与することができる。有効成分であるコラーゲンの加水分解物は、粉末または錠剤とすることができる他、水溶液とすることもできる。また投与形態は、経口に限らず、注射等も利用できる。
　以上の記載に基づいて、本発明の少なくとも１種類のコラーゲントリペプチドGly-X-Y(Gly-X-Yはアミノ酸配列であり、X、YはGly以外のアミノ酸残基を示す）を含有するコラーゲンの加水分解物の有効量を患者に投与することを含む、アテローム性動脈硬化症の進行抑制または予防する方法も実施できる。さらに、以上の記載に基づいて、本発明のアテローム性動脈硬化症の進行抑制または予防に用いるための、少なくとも１種類のコラーゲントリペプチドGly-X-Y(Gly-X-Yはアミノ酸配列であり、X、YはGly以外のアミノ酸残基を示す）を含有するコラーゲンの加水分解物も実施できる。
[血中コレステロール低下薬]
　本発明の第３の態様は、血中コレステロール低下薬である。アテローム性動脈硬化症は、大動脈や脳動脈、冠動脈などの比較的太い動脈に起こり、動脈の内膜にコレステロールやコレステロールエステルなどの脂肪からなるドロドロの粥状物質がたまってアテローム性プラーク（粥腫斑）ができ、次第に肥厚することで動脈の内腔を狭め、臨床症状が出現してくる。本発明によれば、血中コレステロールを低下させることができ、その結果、アテローム性動脈硬化症等の血中コレステロールに起因する種々の疾患の発症を抑制又は予防することができる。
　本発明の血中コレステロール低下薬が有効成分として含有するコラーゲンの加水分解物は、上記進行抑制薬で説明したものと同様である。
　本発明の血中コレステロール低下薬の予防薬は、コラーゲンの加水分解物に含まれる有効成分のコラーゲントリペプチドGly-X-Yの濃度によっても異なるが、例えば、コラーゲントリペプチドGly-X-Y濃度が30%のコラーゲンの加水分解物の場合、体重1kg当たり10～1000mg、1日1回または2～3回に分けて経口投与することができる。有効成分であるコラーゲンの加水分解物は、粉末または錠剤とすることができる他、水溶液とすることもできる。また投与形態は、経口に限らず、注射等も利用できる。
　以上の記載に基づいて、本発明の少なくとも１種類のコラーゲントリペプチドGly-X-Y(Gly-X-Yはアミノ酸配列であり、X、YはGly以外のアミノ酸残基を示す）を含有するコラーゲンの加水分解物の有効量を患者に投与することを含む、血中コレステロールを低下する方法も実施できる。さらに、以上の記載に基づいて、本発明の血中コレステロールの低下に用いるための、少なくとも１種類のコラーゲントリペプチドGly-X-Y(Gly-X-Yはアミノ酸配列であり、X、YはGly以外のアミノ酸残基を示す）を含有するコラーゲンの加水分解物も実施できる。
[機能性食品及び特定保健用食品]
　本発明は、少なくとも１種類のコラーゲントリペプチドGly-X-Y(Gly-X-Yはアミノ酸配列であり、X、YはGly以外のアミノ酸残基を示す）を含有するコラーゲンの加水分解物を有効成分として含む、血管の老化・炎症の抑制及び／又は予防に有効な機能性食品及び特定保健用食品も包含する。
　前述のように、２～１５歳になるとほとんどの小児の動脈にアテローム性動脈硬化症の初期病変が観察される。思春期頃から病変の増加が著明となり、２０～３０歳までには大動脈表面の約３０％を病変が占めるに至る（非特許文献６）。本発明の機能性食品及び特定保健用食品は、血管の老化・炎症の抑制及び／又は予防に有効であり、アテローム性動脈硬化症の進行抑制や予防を必要とする多くの人々に用いることができる。本発明の機能性食品及び特定保健用食品に含まれるコラーゲントリペプチドGly-X-Yの種類は、アテローム性動脈硬化症の進行抑制薬や予防薬に用いられるものと同様である。機能性食品及び特定保健用食品としては、例えば、少なくとも１種類のコラーゲントリペプチドGly-X-Yを含有するコラーゲンの加水分解物を有効成分として含む錠剤、カプセル剤およびドリンク剤等のサプリメント、あるいは同じコラーゲンの加水分解物を配合した食品および飲料等を挙げることができる。本発明の機能性食品及び特定保健用食品は、アテローム性動脈硬化症の進行抑制および予防に有効であることから、アテローム性動脈硬化症の進行抑制および予防を必要とする多くの人々に用いられる。
　機能性食品及び特定保健用食品におけるコラーゲンの加水分解物の濃度は、コラーゲントリペプチドGly-X-Yとして、好ましくは15質量%以上であることができる。前述のように、本発明のアテローム性動脈硬化症の進行抑制及び予防効果は、コラーゲントリペプチドGly-X-Yを含有するコラーゲンの加水分解物を用いれば得られる一方で、コラーゲントリペプチドGly-X-Yの純度を高めるためには、高度の精製が必要になることから、製造コストが高くなる傾向がある。しかし、コラーゲントリペプチドGly-X-Yの濃度が低いコラーゲンの加水分解物では、コラーゲントリペプチドGly-X-Y以外の成分、特に、加水分解の程度が低い高分子量の成分が多くなり、食品への添加に支障をきたす場合もある。そこで、所望の効能とコスト(費用)、さらには食品への添加のし易さ等を考慮して、使用するコラーゲントリペプチドGly-X-Yを含有するコラーゲンの加水分解物の純度を決めることが適当である。機能性食品においては、価格をある程度抑制したい場合があり、そのような場合には、コラーゲントリペプチドGly-X-Yの含有率は、好ましくは15～25質量%であることが適当である。特定保健用食品においても、コラーゲントリペプチドGly-X-Yの含有率は、機能性食品と同様に15～25質量%であることができる。但し、機能性食品よりは、効果の発現をより確実にしたい場合があり、そのような場合には、コラーゲントリペプチドGly-X-Yの含有率は、好ましくは25～35質量%であることが適当である。
　本発明の機能性食品は、コラーゲンの加水分解物に含まれる有効成分のコラーゲントリペプチドGly-X-Yの濃度によっても異なるが、例えば、コラーゲントリペプチドGly-X-Y濃度が20%のコラーゲンの加水分解物の場合、体重1kg当たり10～1000mg、1日1回または2～3回に分けて経口摂取することができる。本発明の機能性食品は、形態は特に制限はなく、固形、液状、流動物(例えば、ゲル、ペースト等)等であることができ、また、食品の種類にも特に制限はない。さらに、有効成分であるコラーゲンの加水分解物は、固形、液状、または流動物に適用が容易であるという観点からは、例えば、粉末または液体(水溶液または水分散物等)であることができる。本発明の機能性食品は、加齢に伴う血管の変化、特にアテローム性動脈硬化や血管の炎症を抑え、血管をよい状態に維持する機能を有する。そのため、このような機能を必要とするヒトへの使用に有用である。
　本発明の特定保健用食品は、コラーゲンの加水分解物に含まれる有効成分のコラーゲントリペプチドGly-X-Yの濃度によっても異なるが、例えば、コラーゲントリペプチドGly-X-Y濃度が20%のコラーゲンの加水分解物の場合、体重1kg当たり10～500mg、1日1回または2～3回に分けて経口摂取することができる。本発明の特定保健用食品は、形態は特に制限はなく、固形、液状、流動物(例えば、ゲル、ペースト等)等であることができ、また、食品の種類にも特に制限はない。さらに、上述の医薬品と同様に錠剤、カプセル剤およびドリンク剤とすることもできる。また、有効成分であるコラーゲンの加水分解物は、食品の形態に応じて、例えば、粉末または液体(水溶液または水分散物等)であることができる。本発明の特定保健用食品は、血管の老化・炎症の抑制及び／又は予防に有効であり、アテローム性動脈硬化または血管の老化が心配な方(ヒト)及びアテローム性動脈硬化または血管の老化を予防・改善したい方(ヒト)に有用である。特定保健用食品とは、一般に、食品の持つ特定の保健の用途を表示して販売される食品である。本発明の特定保健用食品は、食品の持つ特定の保健の用途として、アテローム性動脈硬化または血管の老化の予防・改善を表示して販売されることが予定される食品である。
　以下、本発明を実施例に基づいてさらに詳細に説明する。
実施例１
(平滑筋細胞培養実験方法)
細胞培養
　ヒト大動脈平滑筋細胞(AoSMC)はロンザ・ウォーカーズビル（Lonza Walkersville）(米国、製品コードCC-2571)から購入し、基本培地(SmBM,CC-3181)およびSingleQuots(CC-4149)を含むSmGM-2バレットキット（BulletKit）(キャンブレックス（Cambrex）, CC-3182)中で37℃,5%CO2環境下で維持した。細胞を直径10cmのコラーゲンコート培養ディッシュにて37℃,5%CO2インキュベーター内で増殖させた。細胞が、70～80%集密になり、プレート全体に多数の有糸分裂像を含む時に0.025%トリプシン、0.01%EDTAを含むハンクス緩衝塩類溶液(HBSS)を用いて継代した。トリプシン処理後、細胞を5%ウシ胎仔血清(FBS)を含むかまたは含まない培地に懸濁し、以後の実験に供した。
AoSMCの遊走検定
　AoSMCの遊走は、孔径8.0μmのメンブランフィルター(直径6.5mm)を有するトランスウェル（Transwell Permeable Supports）(コーニング・インコーポレイテッド・ライフサイエンス社（Corning Incorporated Life Sciences）, 米国, No.3422)を用いて検定した。SmBM培地を用いて24時間培養したAoSMCをトリプシン処理し、濃度1×106細胞/mlでSmBMに懸濁した。細胞懸濁液100μl量を上室のウェルに入れ、CTP30(コラーゲントリペプチド含有率30%)をさまざまな濃度(0、3、30、300μg/ml)で含むSmGM650μlを下室のウェルに入れ、トランスウェルを37℃にて5%CO2インキュベーターでインキュベートした。12時間、24時間および48時間インキュベーションした後、上室のウェルを除去した。メンブランフィルターの穴を通って下室のウェルへ遊走し、下室の底面に付着したAoSMCを4%パラホルムアルデヒドで固定した後、AoSMC遊走の定量のために倒立顕微鏡(倍率×400)下で計数した。
AoSMCに関するPCNAウェスタンブロットアッセイ
　濃度1×105細胞/mlにて懸濁したAoSMCを6ウェルマイクロプレート(5ml/ウェル)に分配した。接着後、培地をさまざまな濃度(0、3、30、300μg/ml)でCTP30を含むSmGMで置き換えた。24時間インキュベート後、細胞を下記の通りウェスタンブロットアッセイのために回収した:細胞培養をリン酸緩衝生理食塩水で２回洗浄し、次いでプロテアーゼインヒビターカクテル(コンプリートミニ（Complete mini）、EDTAフリー、ロシュ社（Roche）)を添加した溶解緩衝液(50mM トリス-HCl，150mM NaCl，1.0% ノニデット（Nonidet）P40)中で氷上にて溶解し、12,000 gにて20分間4℃で遠心分離した。上清を、試料緩衝液を添加することによって直ちに混合した。タンパク質濃度はビシンコニン酸タンパク質アッセイ試薬を用いて測定した。等量のタンパク質(30μg)を10%SDS-PAGEで単離し、およびイモビロン（Immobilon）転写膜(ミリポア社（Millipore）、米国)にブロットした。この転写膜を3%ウシ血清アルブミン含有トリス緩衝生理食塩水を用いて1時間25℃にてブロックし、次いで一次抗体(抗ヒトPCNA抗体、1:500)を用いて反応を行った。HRP結合ヤギ抗マウスIgG(ピアース社（PIERCE）、米国)およびスーパーシグナル（Supersignal）ウェスト・フェムト最大感度基質(ピアース社、米国)を一次抗体の検出に用いた。結果として生じる化学発光を冷却CCDカメラシステム(アトー社（ATTO）)で捕捉し、デンシトメトリー分析ImageJソフトウェア(NIH Image)によって定量した。
AoSMCに関するPCNA陽性比検定
　AoSMCをトリプシン処理し、濃度1×105細胞/mlにてSmGM培地に懸濁した。滅菌カバースライスを6ウェルマイクロプレートに入れ、次いで細胞懸濁液をウェルに分配した(5ml細胞/ウェル)。接着後（分配の約６時間後）、培地をさまざまな濃度(0、3、30、300μg/ml)でCTP30を含むSmGMに置き換えた。24時間インキュベート後、スライスを除去し、PCNA免疫細胞化学法をモノクローナルマウス抗ヒトPCNA抗体(ダコ・ジャパン社（DakoJapan）、日本、M0879)およびSAB-POキット(ヒストファイン（Histofine)、日本、コード424022)を用いて実施した。次いでスライスをヘマトキシリンで二重染色し、脱水、密封し、顕微鏡下で細胞計算に用いた。10個の高倍率視野(倍率×200)を各スライスについて選択し、細胞総数およびPCNA陽性細胞数を計算した(PCNA陽性比=陽性細胞数/細胞総数)。
AoSMCに関する増殖検定
　濃度1×105 細胞/mlにてSmGM培地に懸濁したAoSMCを、各ウェルに滅菌カバースライスを入れた6ウェルマイクロプレートに分配した。接着後、培地をさまざまな濃度(0、3、30、300μg/ml)でCTP30を含むSmGMに置き換えた。各0時間、24時間、48時間、72時間培養し、スライスを除去し、4%パラホルムアルデヒドで固定し、ヘマトキシリンで染色した。次いでスライスを脱水、密封し、顕微鏡下で細胞計算に用いた。5個の高倍率視野(倍率×200)を各スライスについて選択し、細胞総数を計算した。
データ解析および統計評価
　データはSocial Sciences 10.0統計ソフトウェアの統計パッケージを用いて分析した。一元ANOVA法に次いで最小有意差事後検定を用いて、群間の統計的有意性を判定した。
(結果)
AoSMCにおける遊走に対するCTPの作用
　CTP30のさまざまな濃度での投与後、12時間でAoSMCの明瞭な遊走を観察せず、24時間でごくわずかの遊走を認めた(結果記載せず)。図1は48時間での遊走細胞の像を示す。倒立顕微鏡下で下室のウェルの底面に付着した典型的な紡錘形として表される多数の遊走細胞を検出した。図2はAoSMCの遊走に対するCTP30の作用を示す。CTP30は3種類の濃度(3、30、300μg/ml)とも投与48時間後にAoSMCの遊走を強く阻害した。しかし異なるCTP30濃度間に有意差はみられなかった。
　図1，2は、ヒト大動脈平滑筋細胞(AoSMC)の遊走に対するさまざまな濃度のCTP30の作用を示す。AoSMCに各濃度のCTP30を48時間投与し、その後、遊走細胞を計算した。(図1)倒立顕微鏡下の一低倍率視野中の遊走AoSMC。A、Bはそれぞれ対照群およびCTP30 3μg/ml群である。(図2)各値は４回の独立した実験でカウントした相対平均±SD(対照群の%)を示し、対照群（CTP 0μg/ml）において遊走した平滑筋細胞数を100%として表示した。
AoSMCにおけるPCNAタンパク質発現に対するCTPの作用
　図3AはCTP30へ24時間曝露後のAoSMCに発現されるPCNAのSDS-PAGEの電気泳動像を示す。デンシトメトリーによって定量分析が実施された際、対照群に比較して300μg/ml CTP30が明らかに、AoSMCのPCNA発現を阻害できることを見出した。しかしこの作用は3μg/mlCTP群と30μg/mlCTP群で検出されなかった(図3に示す)。これらの結果はAoSMCにおけるPCNA発現の抑制は投与後24時間で高濃度のCTP30により強く起こることを示した。
　図3は、ヒト大動脈平滑筋細胞(AoSMC)におけるPCNA発現に対するさまざまな濃度のCTP30の作用を示す。AoSMCに各濃度のCTP30を24時間投与し、その後、上記実験方法に記載の通りウェスタンブロットを実施した。(図3A)AoSMCのPCNAのSDS-ポリアクリルアミドゲル(10%)電気泳動像;(図3B)各値は3回の独立した実験の平均であり、バンドの相対強度の平均±SDを表す(PCNA/チューブリン)。
AoSMCにおけるPCNA陽性細胞比に対するCTPの作用
　ウェスタンブロットで認められたPCNA発現の変化が、全ての細胞におけるダウンレギュレーションの結果であるか、またはPCNA陽性細胞比の減少の結果であるかを調べるため、さらにPCNA免疫細胞化学法を実施し、陽性比を計算した。図4はそれぞれさまざまなCTP30濃度の免疫細胞化学法結果を示す。図中に、PCNA陽性細胞は茶色の核および細い紡錘形を示すのが見られる。同時に、PCNA陰性細胞は青色の核を示し、広い細胞質を有する不整形の形態として現れる。図5に示す定量分析は、CTP30はCTP投与24時間後のPCNA陽性比を大きく低下できることを明らかにした。同時に、さまざまな濃度のこれらの3群間に有意差は無く、それは24時間でのこの作用に明瞭な用量依存性が無いことを示す。
　図4、5は、ヒト大動脈平滑筋細胞(AoSMC)におけるPCNA陽性比に対するさまざまな濃度のCTP30の作用を示す。AoSMCにさまざまな濃度のCTP30を24時間投与し、その後、上記実験方法に記載の通り、PCNA免疫細胞化学法を実施し10個の高倍率視野(×200)における陽性比を計算した。(図4)免疫細胞化学法によるPCNA陽性AoSMC (茶色の核)、PCNA陰性AoSMC (青色の核);(図5)各値は3回の独立した実験の平均±SDを表し、PCNA陽性細胞の割合を表した。
AoSMC増殖に対するCTPの経時作用
　図6に示すグラフによると、CTP30 300μg/ml群がCTP30投与後24時間に対照群と比較してAoSMCの増殖に対して明らかな阻害作用を示すことがわかるが、CTP30 3μg/ml群とCTP30 30μg/ml群は明らかな阻害作用を示すことができなかった。しかし、CTP30投与後、48時間および72時間の時点に、CTP30高濃度群(300μg/ml)および低濃度群(3μg/mlおよび30μg/ml)間の差は消滅し、すべてのCTP群が対照群と比較して明らかな阻害作用を示した。さらに、開始時の細胞数と比較して、各群の細胞は持続する増殖傾向を示したので、AoSMCに対するCTP30の毒性作用は除外することができる。
　図6は、ヒト大動脈平滑筋細胞(AoSMC)における増殖に対するさまざまな濃度のCTP30の作用の経時変化を示す。AoSMCに各濃度のCTP30を記載の時間投与し、その後、上記実験方法に記載の通り、5個の高倍率視野(×200)中の細胞総数を計算した。各値は3回の独立した実験の平均±SDを表す。
(考察)
　動脈中膜平滑筋細胞の内膜への遊走と内膜での増殖は、マクロファージやTリンパ球の浸潤・増殖と共にアテローム性動脈硬化症の成り立ちの主要な過程であることがよく知られている。動脈の内皮細胞障害に続いて、平滑筋細胞(SMC)は中膜から内膜へ遊走し、内膜で増殖する。内膜で平滑筋細胞はコラーゲン線維や弾性線維を産生し、さらに、一部の細胞は脂質を貪食し、泡沫細胞へ転換する。従って、平滑筋細胞と平滑筋細胞によって産生されたコラーゲン線維や他の細胞外マトリックス成分は、アテローム性プラークの主要な構造となる。多数の基礎および臨床研究は、SMCの増殖および遊走が治療効果に対して大きな影響を及ぼし、また、長期効果に直接影響することを示した。冠動脈アテローム性動脈硬化狭窄のための一般的な治療法である、経皮的冠動脈形成術(PTCA)のように、平滑筋細胞の内膜への遊走および増殖は、術後の再狭窄を結果として生じる最も重要な理由である。そのため、どのようにこの過程を調節し、およびSMCの遊走および増殖を阻害するかが、基礎医学だけでなく臨床治療分野でも大きな問題になっている。
　上記実験結果では、大動脈中膜由来平滑筋細胞(AoSMC)における増殖および遊走に対するCTP30の作用を初めて示した。この結果によると、in vitroでのヒトAoSMCの増殖に対してだけでなく遊走に対しても、CTP30の顕著な阻害作用があることが分かる。CTP含有率の異なるCTP30およびCTP90とも、それぞれ3つの異なる濃度のすべてが同様の作用および阻害傾向を示すことができる。CTP投与後24時間で、CTP30 300μg/ml群は有意に総PCNA発現レベルを低下および細胞増殖を阻害できた。CTP含有率の低いCTP30では 3μg/ml群と30μg/ml群はこの時点(24時間)では有意な阻害作用を示すことができないが、培養時間の48時間および72時間後では有意な増殖阻害作用を示した。それは、高濃度での阻害作用の出現は低濃度よりも早く、この用量依存性は培養の初期(24時間)にだけ存在することを示唆した。CTP含有率の高いCTP90では、低濃度（3μg/ml、30μg/ml）でも投与後24時間で有意に細胞増殖を阻害したことはこの示唆を支持している。
　増殖性細胞核抗原(PCNA)は、自己免疫疾患(SLE)患者の血清中にある抗体に反応する細胞周期のDNA合成期(S期)に細胞の核で検出される抗原として最初に同定され、増殖細胞の指標として用いられた。ハンバート（Humbert）他はS期の異なる時点のPCNA強度を三次元表示で示し、PCNA発現レベルは時点によって大きく異なり、S期の中期で高く、初期または後期で低いことを示した(引用文献1-1)。上記実験結果では、CTP30の投与24時間後で、低濃度群(3μg/mlおよび30μg/ml)でPCNA陽性比の減少を誘導できることが示されたが、しかしPCNA発現レベルまたは細胞数のどちらも、いずれの群でも減少を示さなかった。本発明者らは、免疫組織化学によるPCNA陽性細胞の同定とウエスタンブロット解析によるPCNAタンパク質発現レベルおよび実際の細胞分裂・増殖に時間的差（time-lag）があるものと考えている。
　SMCの増殖および遊走は複雑な過程であり、種々の遺伝子と関連タンパク質の発現、例えば転写因子、サイクリン、サイクリン依存性キナーゼ(Cdk)、接着分子などが関与する。これまでに、コラーゲンまたは分解された断片と平滑筋細胞の間の増殖・遊走の関連が報告されている。線維性コラーゲンはCdk2阻害因子の調節を通じて動脈平滑筋細胞増殖を阻害しうること(引用文献1-2)、線維性コラーゲンはまた細胞応答および細胞周辺マトリックス環境に関与するヒト血管平滑筋細胞遺伝子を特異的に調節しうること(引用文献1-3)が報告されている。しかしCTPが増殖および遊走を阻害するといった知見はこれまで全く得られていなかった。
　本実験結果は、CTPがヒトAoSMCの増殖および遊走をin vitroで有意に阻害し、かつPCNA発現レベルおよびPCNA陽性細胞比を低下しうることを示している。同時に、この種の阻害作用は明らかな用量依存性または細胞毒性を有しない。今回の結果は、CTPがヒト動脈平滑筋細胞の遊走および増殖の効果的な調節因子であることを強く示唆し、かつCTPが医薬分野で心血管病変に使用できることを示唆するものである。
実施例１における引用文献
(1-1) HUMBERT C, SANTISTEBAN M S, USSON Y, ROBERT-NICOUD M: Intranuclear co-location of newly replicated DNA and PCNA by simultaneous immunofluorescent labelling and confocal microscopy in MCF-7 cells. J Cell Sci. 1992 103: 97-103
(1-2) Koyama H, Raines EW, Bornfeldt KE, Roberts JM, Ross R. Fibrillar collagen inhibits arterial smooth muscle cell proliferation through regulation of Cdk2 inhibitors. Cell 1996; 87: 1069-1078
(1-3) Ichii T, Koyama H, Tanaka S, Kim S, Shioi A, Okuno Y, Raines EW, Iwao H, Otani S, Nishizawa Y. Fibrillar collagen specifically regulates human vascular smooth muscle cell genes involved in cellular responses and the pericellular matrix environment. Circ Res. 2001; 88: 460-467
上記引用文献1-1～1-3の全記載は、ここに特に開示として援用される。
実施例２
　家族性高コレステロール血症モデルウサギ(KHCウサギ、体重約2kg、生後3ヶ月、生産地：日本医科学動物資材研究所、東京；購入先：三共ラボサービス株式会社、富山)5羽に、200mg/kgのCTP30(CTP30 400mgを5mlの蒸留水(ミリQ)に溶解したもの)を3ヶ月間経口投与し、CTP非添加蒸留水投与の対照群5羽と血中総コレステロール量について比較した。結果を図7に示す。3か月前と比較し、対照群では血中総コレステロールが8%低下していた。一方、CTP30投与群では、23.2%も低下しており、CTPは明らかに血中総コレステロール量の低下作用を示した。
　さらに、これらのウサギを犠牲死させ、大動脈を観察した。CTP投与群の大動脈の観察写真を図8に示し、対照群の大動脈の観察写真を図9に示す。さらに、アテローム性動脈硬化を起こしている病変(プラーク)の面積を図10に示す。3領域ごとに求めたデータを以下の表1に示す。具体的には、3領域におけるアテローム性動脈硬化巣（プラーク）の面積（デジタルカメラ画像を元に、病巣画像の面積をピクセル数で数値化し、大動脈表面の面積中の割合；％で表記）を比較した。この結果、対照群は大動脈総面積の16.4％にプラークが生じていたが、CTP投与群は、わずか4.5％であった。これは対照群で生じたプラーク面積の27.4％にしかすぎず、プラークの発生が強く抑制されているといえる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
実施例３
CTP90（コラーゲントリペプチド含有率90%）の培養平滑筋細胞の遊走および増殖に及ぼす効果
〔実験方法〕
　平滑筋細胞の遊走および増殖検定は先に述べたCTP30と同様の方法で行った。
（結果）
AoSMCにおける遊走に対するCTP90の作用
　CTP90のさまざまな濃度での投与後、12時間でAoSMCの明瞭な遊走を観察せず、24時間でごくわずかの遊走を認めた（結果記載せず）。図11はAoSMCの遊走に対するCTP90の作用を示す。CTP90は3種類の濃度（3、30、300μg/ml）とも投与48時間後にAoSMCの遊走を阻害した。しかし異なるCTP90濃度間に有意差はみられなかった。
　図11は、ヒト大動脈平滑筋細胞（AoSMC）の遊走に対するさまざまな濃度のCTP90の作用を示す。AoSMCに各濃度のCTP90を48時間投与し、その後、遊走細胞を計数した。（図11）各値は4回の独立した実験の相対平均±SD（対照群の%）を表し、対照群において遊走した平滑筋細胞数を100％として表した。
AoSMCにおけるPCNA陽性細胞比に対するCTP90の作用
　図12は、ヒト大動脈平滑筋細胞（AoSMC）におけるPCNA陽性比に対するさまざまな濃度のCTP90の作用を示す。AoSMCに各濃度のCTP90を24時間投与し、その後、上記実験方法に記載の通り、PCNA免疫細胞化学法を実施し10個の高倍率視野（×200）における陽性比を計算した。図12各値は3回の独立した実験の平均±SDを表し、PCNA陽性細胞の割合を表した。
AoSMC増殖に対するCTPの経時作用
　図13に示すグラフによると、CTP90投与後、24時間、48時間および72時間の時点に、すべてのCTP群（3、30、300μg/ml）が対照群と比較して明らかな増殖速度への阻害作用を示した。さらに、開始時の細胞数と比較して、各群の細胞は持続する増殖傾向を示したので、AoSMCに対するCTP90の毒性作用は除外することができる。
　図13は、ヒト大動脈平滑筋細胞（AoSMC）における増殖に対するさまざまな濃度のCTP90の作用の経時変化を示す。AoSMCに各濃度のCTP90を記載の時間投与し、その後、上記実験方法に記載の通り、5個の高倍率視野（×200）中の細胞総数を計算した。各値は3回の独立した実験の平均±SDを表す。
実施例４
ウサギ大動脈病変の病理組織学的及び免疫組織化学的解析
〔実験方法〕
　実験群（CTP30投与）、対照群（CTP30非添加飲料水投与）とも3ヶ月後にウサギを屠殺し大動脈、心臓および他の臓器を採取し、ホルマリン固定した。大動脈は5mm間隔で全割標本を作製し、パラフィン包埋し、病理組織学的及び免疫組織化学的解析に供した。
〔大動脈の病理組織学的解析〕
　全大動脈標本についてHE染色、エラスチカ・ワンギーソン（EVG）染色、アザン（Azan）染色を行い、病変を観察した。大動脈弓部の病変の最も進行した標本、実験群5個、対照群5個について線維化の程度をアザン染色で比較検討した。各アザン染色標本はコラーゲン沈着の多い濃青色の部分（進行した線維化領域、図14A）とコラーゲン沈着の少ない淡青色の部分（初期の線維化領域、図14B）の面積をImage-Pro Plus5.1で解析・定量化した。定量化は実験群、対照群とも高倍率（×400）で任意の5視野について行った。
〔結果〕
アテローム性動脈硬化巣（プラーク）の線維化に対するCTP30の作用
　図15に示すようにCTP30投与群（実験群）ではCTP30非投与群（対照群）に比べて、進行した線維化領域、初期の線維化領域とも減少した。この所見は、CTP30が過剰の線維化を抑制することを示している。
　なお、肺、肝臓、および腎臓を含む他臓器には線維化は認められず（結果記載せず）、副作用にあたる悪い影響はなかった。
〔大動脈の免疫組織化学的解析〕
　大動脈弓部の病変の最も進行した標本、実験群5個、対照群5個について、病変部を構成する細胞成分（平滑筋細胞とマクロファージ）を免疫組織化学的に解析した。
　パラフィン切片について抗平滑筋細胞抗体（HHF35、ダコ・ジャパン社、1：50）、抗マクロファージ抗体（RAM11、ダコ・ジャパン社、1：50）を用いて免疫染色を実施し各細胞の同定を行い、Image-Pro Plus5.1で定量解析した。定量化は実験群、対照群とも高倍率（×200）で任意の5視野について行った。図16はアテローム性動脈硬化巣のRAM11陽性（褐色）のマクロファージ、HHF35陽性（褐色）の平滑筋細胞を示す。
〔結果〕
アテローム性動脈硬化巣（プラーク）における平滑筋細胞とマクロファージの構成に対するCTP30の作用
　図17は、対照群（control）はCTP30投与群（CTP）に比べてプラークに細胞成分が多く存在し、また、平滑筋細胞（SMC）よりマクロファージ（M）が多いことを示しており、アテローム性動脈硬化巣(プラーク)の主要細胞はマクロファージであることを示している。また、図18は、CTP非添加の対照群（control）ではマクロファージは平滑筋細胞（SMC）の2倍以上存在しており、CTP30投与群（CTP）ではマクロファージと平滑筋細胞（SMC）はほぼ同じ比率で存在していることを表している。
　以上の結果は、CTP30はアテローム性動脈硬化巣（プラーク）において、マクロファージの浸潤・増生も抑制する効果を有することを示している。
〔考察〕
　家族性高コレステロール血症モデルウサギを用いたin vivoの実験で、CTP30、3ヶ月投与群は対照群に比べて血中総コレステロールと大動脈表面のアテローム性動脈硬化病変（プラーク）の面積を有意に低下させた。また、過剰なコラーゲン線維の沈着（線維化）を抑制した。さらに、プラークの主要構成細胞であるマクロファージと平滑筋細胞を免疫組織化学的に解析したところ、CTP投与群は対照群に比べてマクロファージが明らかに減少していた。
　マクロファージはプラークで種々のサイトカイン・増殖因子やメタロプロテアーゼ等のタンパク質分解酵素を産生・分泌し病変を進展させる（引用文献4-1）。また、プラークに滲み込んだ脂質の大部分はマクロファージ由来の泡沫細胞に蓄積されており、泡沫細胞の崩壊によって細胞外にコレステロールやコレステロールエステルなどの脂質が貯留する。細胞外の脂質が多くなり、さらにマクロファージの放出するタンパク質分解酵素によってコラーゲン線維などの細胞外マトリックス成分が分解されプラークが弱くなり、破裂・血栓形成を伴い急性心筋梗塞や脳梗塞が発症するのでマクロファージの減少はプラークの発症・進展・破裂を抑制する効果がある（引用文献4-2）。
　CTPのマクロファージを減少させる作用機序は明らかでないが、血中コレステロールの低下がプラークにおけるマクロファージの集簇を低下させ、また、タンパク質分解酵素の発現・活性を低下させるといわれており（引用文献4-3）、CTPのコレステロール低下作用がその一因であると考えられる。
実施例４における引用文献
(4-1) Ross R:Atherosclerosis-An inflammatory disease. N EnglJ Med, 1999, 340:115-126
(4-2) Libby P:Molecular bases of the acute coronary syndrome. Circulation, 1995, 91:2844-2850
(4-3) 相川眞範:脂質低下療法による動脈硬化病変の安定化,実験医学, 2000, 18:145-151
上記引用文献4-1～4-3の全記載は、ここに特に開示として援用される。
比較例１
GELITA-SOL DAおよびGELITA-SOL LDA  Aggl.の培養大動脈平滑筋細胞の遊走および増殖に及ぼす効果
非特許文献１２の実施例で使用されているコラーゲン加水分解物と同等品のGELITA-SOL DA（豚皮由来、平均分子量約5,000～7,000、DGF社製）、およびGELITA-SOL LDA  Aggl.（豚皮由来、平均分子量約3,000、DGF社製）について、培養大動脈平滑筋細胞の遊走および増殖に及ぼす効果を検討した。
（実験方法）
　大動脈平滑筋細胞（AoSMC）の遊走および増殖実験は先に述べたCTP30（実施例1）およびCTP90（実施例3）と同様の方法で行った。
（結果）
AoSMCの遊走に対するGELITA-SOL DA（以下、DA）、およびGELITA-SOL LDA Aggl.（以下、LDA）の作用
　DAおよびLDAは3種類の濃度（3、30、300μg/ml）で投与した。24時間後、48時間後いずれもAoSMCの遊走を阻害せず、促進した。図19それぞれDAとLDAの投与24時間、および48時間後の遊走細胞を計数し、対照群において遊走したAoSMCの細胞数を100％として表した。各値は4回の独立した実験の相対平均±SD（対照群の％）を示している。図19から確認できるように、DA、LDA投与群は、対照群（DA 0μg/ml、LDA 0μg/ml）に比べて有意に遊走を促進した。
　これは実施例1、3 （図2、11）に示したCTPの遊走抑制効果に対して反対の効果を示している。ヒト大動脈平滑筋細胞の遊走を活発にするということは、アテローム性動脈硬化を発生・進行させる危険性を高めると考えられる。従って、非特許文献１２に記載のコラーゲン加水分解物と同等物であるDA、LDAは、アテローム性動脈硬化を発生・進行させる危険性を高めるものであると考えられる。
Ao SMCの増殖に対するDA、およびLDAの経時作用
　図20はAoSMCの増殖に対するDA、およびLDAの3種類の濃度（3、30、300 μg/ml）の作用と対照群（0μg/ml）の経時変化を示す。AoSMCに各濃度のDA、LDAを記載の時間投与し、その後、5個の高倍率視野（×200）中の細胞総数を計算した。各値は3回の独立した実験の平均±SDを表す。
　DA 300μg/ml投与後72時間で対照群と比較してAoSMCの増殖に対して促進作用を示したが、その他のDA投与群、LDA投与群とも明らかな促進作用・阻害作用を示さなかった。
　実施例1、3（図6、13）に示したCTPの細胞増殖に対する効果と比較すると、CTP30、90、およびDA、LDAはすべて培養時間に伴う細胞数の顕著な減少がみられなかったため、細胞毒性はないと考えられる。一方で、DA では300μg/ml投与後、有意にAoSMCを増殖させているため、アテローム性動脈硬化の発生機序に基づき考察すると、よい効果を与えないと予想される。即ち、非特許文献１２に記載のコラーゲン加水分解物と同等物であるDAは、アテローム性動脈硬化の発生機序に基づき考察すると、よい効果を与えないと予想される。
AoSMCにおけるPCNA陽性細胞比に対するDA、LDAの作用
　図21はAoSMCにおけるPCNA陽性細胞比に対するDAとLDAの3種類の濃度（3、30、300 μg/ml）と対照群（0μg/ml）の作用を示す。AoSMCに各濃度のDAとLDAを24時間投与し、その後、実施例1、3（図5、12）に記載の通り、PCNA免疫細胞化学法を実施し、10個の高倍率視野（×200）における陽性比を計算した。図21の各値は3回の独立した実験の平均±SDを表し、PCNA陽性細胞の割合を表した。DAおよびLDAの各濃度とも対照群に比べて、PCNA陽性細胞の割合を増加させる傾向を示した。
　CTPを添加して培養した場合のPCNA陽性細胞の割合に関する対照群との比較と比べると、DAおよびLDAはAoSMCの増殖期の細胞を増加させる効果を示しているといえる。
　AoSMCの活発な増殖はアテローム性動脈硬化症の進行を進める恐れがあるため、DAおよびLDAはアテローム性動脈硬化に関してはよい効果を示しておらず、むしろ負の効果（アテローム性動脈硬化の促進）を強く示唆する結果となった。
参考例
　上記比較例で使用したGelita社のCP成分（DAおよびLDA）及び実施例で使用したCTP30及び90それぞれのHPLCのクロマトグラムを図22に示す。HPLCの測定条件は以下のとおりである。
・カラム：Superdex Peptide 10/300 GL (GEヘルスケア・ジャパン株式会社)
・溶離液：10 mM Tris-HCl (pH7.4)、150 mM NaCl、5 mM CaCl2
・流速：1 mL/min
・分析時間：30min
・検出：UV (214 nm)
　前述のように、CTP30は、コラーゲントリペプチドGly-X-Yの含有量が25～35質量%、Gly-X及びX-Yの含有量が約10質量%、残りがトリペプチドよりも分子量の大きいアミノ酸の4量体以上の加水分解物であり、アミノ酸の4量体以上の加水分解物は、最大でも分子量が6000程度である。CTP90は、コラーゲントリペプチドGly-X-Yの含有量が85～100質量%であり、残りがGly-X及びX-Yとトリペプチドよりも分子量の大きいアミノ酸の4量体以上の加水分解物である。
　それに対して、DAは主成分が分子量約5,000～10,000の範囲にあり、LDAは主成分が分子量約1,000～8,000の範囲にあり、いずれも、コラーゲントリペプチドGly-X-Yの含有量は極わずかである。さらに、DAについては、CTP30において主成分に次いで含有量が多い分子量500～1500のペプチドはほとんど含有せず、LDAについても、CTP30において主成分に次いで含有量が多い分子量500～1500のペプチドの含有量は少ない。
　これらコラーゲンペプチドの組成と上記実施例及び比較例の結果から、主成分の分子量が約5,000～10,000の範囲にあるコラーゲン加水分解物及び主成分の分子量が約1,000～8,000の範囲にあるコラーゲン加水分解物は、アテローム性動脈硬化症の進行抑制薬または予防薬として有効性が疑わしいのに対して、本発明のコラーゲントリペプチドGly-X-Y（分子量は約300）を含有するコラーゲンの加水分解物は、アテローム性動脈硬化症の進行抑制薬または予防薬として有効であることが分かる。
　本発明は、アテローム性動脈硬化症の進行抑制薬及び予防薬、血中コレステロール低下薬、さらには血管の老化・炎症を抑え、予防する機能性食品及び特定保健用食品の製造分野に有用である。

Claims (28)

  1. 少なくとも１種類のコラーゲントリペプチドGly-X-Y(Gly-X-Yはアミノ酸配列であり、X、YはGly以外のアミノ酸残基を示す）を含有するコラーゲンの加水分解物を有効成分として含む、アテローム性動脈硬化症の進行抑制薬または予防薬。
  2. コラーゲンの加水分解物が25～100質量%のコラーゲントリペプチドGly-X-Yを含有する請求項1に記載の進行抑制薬または予防薬。
  3. コラーゲントリペプチドGly-X-Yが、Gly-Ala-Asp、Gly-Ala-Lys、Gly-Ala-Val、Gly-Pro-Gln、Gly-Pro-Met、Gly-Pro-Ile、Gly-Pro-Thr、Gly-Pro-Val、Gly-Ser-Hyp、Gly-Lys-Asp、Gly-Ala-Ala、Gly-Pro-Hyl、Gly-Leu-Hyp、Gly-Ala-Arg、Gly-Ala-Ser、Gly-Ala-Hyp、Gly-Gln-Glu、Gly-Glu-Gln、Gly-Pro-Ser、Gly-Pro-Lys、Gly-Pro-Ala、Gly-Pro-Pro、Gly-Pro-ArgおよびGly-Pro-Hypから成る群から選ばれる少なくとも1種のトリペプチドである請求項1または2に記載の進行抑制薬または予防薬。
  4. コラーゲンの加水分解物がコラーゲントリペプチドGly-X-Yの分解物であるGly-XまたはX-Yをさらに含有する請求項1～3のいずれかに記載の進行抑制薬または予防薬。
  5. 少なくとも１種類のコラーゲントリペプチドGly-X-Y(Gly-X-Yはアミノ酸配列であり、X、YはGly以外のアミノ酸残基を示す）を含有するコラーゲンの加水分解物を有効成分として含む、血中コレステロール低下薬。
  6. コラーゲンの加水分解物が25～100質量%のコラーゲントリペプチドGly-X-Yを含有する請求項5に記載の血中コレステロール低下薬。
  7. コラーゲントリペプチドGly-X-Yが、Gly-Ala-Asp、Gly-Ala-Lys、Gly-Ala-Val、Gly-Pro-Gln、Gly-Pro-Met、Gly-Pro-Ile、Gly-Pro-Thr、Gly-Pro-Val、Gly-Ser-Hyp、Gly-Lys-Asp、Gly-Ala-Ala、Gly-Pro-Hyl、Gly-Leu-Hyp、Gly-Ala-Arg、Gly-Ala-Ser、Gly-Ala-Hyp、Gly-Gln-Glu、Gly-Glu-Gln、Gly-Pro-Ser、Gly-Pro-Lys、Gly-Pro-Ala、Gly-Pro-Pro、Gly-Pro-ArgおよびGly-Pro-Hypから成る群から選ばれる少なくとも1種のトリペプチドである請求項5または6に記載の血中コレステロール低下薬。
  8. コラーゲンの加水分解物がコラーゲントリペプチドGly-X-Yの分解物であるGly-XあるいはX-Yをさらに含有する請求項5～7のいずれかに記載の血中コレステロール低下薬。
  9. 少なくとも１種類のコラーゲントリペプチドGly-X-Y(Gly-X-Yはアミノ酸配列であり、X、YはGly以外のアミノ酸残基を示す）を含有するコラーゲンの加水分解物を有効成分として含む、血管の老化・炎症の抑制及び／又は予防に有効な機能性食品または特定保健用食品。
  10. コラーゲンの加水分解物が15～100質量%のコラーゲントリペプチドGly-X-Yを含有する請求項9に記載の機能性食品または特定保健用食品。
  11. コラーゲントリペプチドGly-X-Yが、Gly-Ala-Asp、Gly-Ala-Lys、Gly-Ala-Val、Gly-Pro-Gln、Gly-Pro-Met、Gly-Pro-Ile、Gly-Pro-Thr、Gly-Pro-Val、Gly-Ser-Hyp、Gly-Lys-Asp、Gly-Ala-Ala、Gly-Pro-Hyl、Gly-Leu-Hyp、Gly-Ala-Arg、Gly-Ala-Ser、Gly-Ala-Hyp、Gly-Gln-Glu、Gly-Glu-Gln、Gly-Pro-Ser、Gly-Pro-Lys、Gly-Pro-Ala、Gly-Pro-Pro、Gly-Pro-ArgおよびGly-Pro-Hypから成る群から選ばれる少なくとも1種のトリペプチドである請求項9または10に記載の機能性食品または特定保健用食品。
  12. コラーゲンの加水分解物がコラーゲントリペプチドGly-X-Yの分解物であるGly-XあるいはX-Yをさらに含有する請求項9～11のいずれかに記載の機能性食品または特定保健用食品。
  13. 少なくとも１種類のコラーゲントリペプチドGly-X-Y(Gly-X-Yはアミノ酸配列であり、X、YはGly以外のアミノ酸残基を示す）を含有するコラーゲンの加水分解物の有効量を患者に投与することを含む、アテローム性動脈硬化症の進行抑制または予防する方法。
  14. コラーゲンの加水分解物が25～100質量%のコラーゲントリペプチドGly-X-Yを含有する請求項13に記載の進行抑制または予防方法。
  15. コラーゲントリペプチドGly-X-Yが、Gly-Ala-Asp、Gly-Ala-Lys、Gly-Ala-Val、Gly-Pro-Gln、Gly-Pro-Met、Gly-Pro-Ile、Gly-Pro-Thr、Gly-Pro-Val、Gly-Ser-Hyp、Gly-Lys-Asp、Gly-Ala-Ala、Gly-Pro-Hyl、Gly-Leu-Hyp、Gly-Ala-Arg、Gly-Ala-Ser、Gly-Ala-Hyp、Gly-Gln-Glu、Gly-Glu-Gln、Gly-Pro-Ser、Gly-Pro-Lys、Gly-Pro-Ala、Gly-Pro-Pro、Gly-Pro-ArgおよびGly-Pro-Hypから成る群から選ばれる少なくとも1種のトリペプチドである請求項13または14に記載の進行抑制または予防方法。
  16. コラーゲンの加水分解物がコラーゲントリペプチドGly-X-Yの分解物であるGly-XまたはX-Yをさらに含有する請求項13～15のいずれかに記載の進行抑制または予防方法。
  17. アテローム性動脈硬化症の進行抑制または予防に用いるための、少なくとも１種類のコラーゲントリペプチドGly-X-Y(Gly-X-Yはアミノ酸配列であり、X、YはGly以外のアミノ酸残基を示す）を含有するコラーゲンの加水分解物。
  18. コラーゲンの加水分解物が25～100質量%のコラーゲントリペプチドGly-X-Yを含有する請求項17に記載のコラーゲンの加水分解物。
  19. コラーゲントリペプチドGly-X-Yが、Gly-Ala-Asp、Gly-Ala-Lys、Gly-Ala-Val、Gly-Pro-Gln、Gly-Pro-Met、Gly-Pro-Ile、Gly-Pro-Thr、Gly-Pro-Val、Gly-Ser-Hyp、Gly-Lys-Asp、Gly-Ala-Ala、Gly-Pro-Hyl、Gly-Leu-Hyp、Gly-Ala-Arg、Gly-Ala-Ser、Gly-Ala-Hyp、Gly-Gln-Glu、Gly-Glu-Gln、Gly-Pro-Ser、Gly-Pro-Lys、Gly-Pro-Ala、Gly-Pro-Pro、Gly-Pro-ArgおよびGly-Pro-Hypから成る群から選ばれる少なくとも1種のトリペプチドである請求項17または18に記載のコラーゲンの加水分解物。
  20. コラーゲンの加水分解物がコラーゲントリペプチドGly-X-Yの分解物であるGly-XまたはX-Yをさらに含有する請求項17～19のいずれかに記載のコラーゲンの加水分解物。
  21. 少なくとも１種類のコラーゲントリペプチドGly-X-Y(Gly-X-Yはアミノ酸配列であり、X、YはGly以外のアミノ酸残基を示す）を含有するコラーゲンの加水分解物の有効量を患者に投与することを含む、血中コレステロールを低下させる方法。
  22. コラーゲンの加水分解物が25～100質量%のコラーゲントリペプチドGly-X-Yを含有する請求項21に記載の血中コレステロールを低下させる方法。
  23. コラーゲントリペプチドGly-X-Yが、Gly-Ala-Asp、Gly-Ala-Lys、Gly-Ala-Val、Gly-Pro-Gln、Gly-Pro-Met、Gly-Pro-Ile、Gly-Pro-Thr、Gly-Pro-Val、Gly-Ser-Hyp、Gly-Lys-Asp、Gly-Ala-Ala、Gly-Pro-Hyl、Gly-Leu-Hyp、Gly-Ala-Arg、Gly-Ala-Ser、Gly-Ala-Hyp、Gly-Gln-Glu、Gly-Glu-Gln、Gly-Pro-Ser、Gly-Pro-Lys、Gly-Pro-Ala、Gly-Pro-Pro、Gly-Pro-ArgおよびGly-Pro-Hypから成る群から選ばれる少なくとも1種のトリペプチドである請求項21または22に記載の血中コレステロールを低下させる方法。
  24. コラーゲンの加水分解物がコラーゲントリペプチドGly-X-Yの分解物であるGly-XあるいはX-Yをさらに含有する請求項21～23のいずれかに記載の血中コレステロールを低下させる方法。
  25. 血中コレステロールの低下に用いるための、少なくとも１種類のコラーゲントリペプチドGly-X-Y(Gly-X-Yはアミノ酸配列であり、X、YはGly以外のアミノ酸残基を示す）を含有するコラーゲンの加水分解物。
  26. コラーゲンの加水分解物が25～100質量%のコラーゲントリペプチドGly-X-Yを含有する請求項25に記載のコラーゲンの加水分解物。
  27. コラーゲントリペプチドGly-X-Yが、Gly-Ala-Asp、Gly-Ala-Lys、Gly-Ala-Val、Gly-Pro-Gln、Gly-Pro-Met、Gly-Pro-Ile、Gly-Pro-Thr、Gly-Pro-Val、Gly-Ser-Hyp、Gly-Lys-Asp、Gly-Ala-Ala、Gly-Pro-Hyl、Gly-Leu-Hyp、Gly-Ala-Arg、Gly-Ala-Ser、Gly-Ala-Hyp、Gly-Gln-Glu、Gly-Glu-Gln、Gly-Pro-Ser、Gly-Pro-Lys、Gly-Pro-Ala、Gly-Pro-Pro、Gly-Pro-ArgおよびGly-Pro-Hypから成る群から選ばれる少なくとも1種のトリペプチドである請求項25または26に記載のコラーゲンの加水分解物。
  28. コラーゲンの加水分解物がコラーゲントリペプチドGly-X-Yの分解物であるGly-XあるいはX-Yをさらに含有する請求項25～27のいずれかに記載のコラーゲンの加水分解物。
PCT/JP2010/001734 2009-03-11 2010-03-11 アテローム性動脈硬化症の進行抑制薬・予防薬・血中コレステロール低下薬・機能性食品・特定保健用食品 WO2010103837A1 (ja)

Priority Applications (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2011503722A JP5604417B2 (ja) 2009-03-11 2010-03-11 アテローム性動脈硬化症の進行抑制薬・予防薬・血中コレステロール低下薬・機能性食品・特定保健用食品
EP10750593.5A EP2407174B1 (en) 2009-03-11 2010-03-11 Progression inhibitor or prophylactic agent for atherosclerosis, blood cholesterol level-lowering agent, and functional food or food for specified health uses
US13/255,651 US9339524B2 (en) 2009-03-11 2010-03-11 Drug inhibiting the progression of atherosclerosis, preventive drug, blood cholesterol-lowering drug, functional food, and specific health food

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2009057444 2009-03-11
JP2009-057444 2009-03-11

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2010103837A1 true WO2010103837A1 (ja) 2010-09-16

Family

ID=42728134

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2010/001734 WO2010103837A1 (ja) 2009-03-11 2010-03-11 アテローム性動脈硬化症の進行抑制薬・予防薬・血中コレステロール低下薬・機能性食品・特定保健用食品

Country Status (4)

Country Link
US (1) US9339524B2 (ja)
EP (1) EP2407174B1 (ja)
JP (1) JP5604417B2 (ja)
WO (1) WO2010103837A1 (ja)

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP5752033B2 (ja) * 2009-05-07 2015-07-22 富士フイルム株式会社 遺伝子組み換えゼラチンを含む血管新生誘導剤
JPWO2015156246A1 (ja) * 2014-04-10 2017-04-13 サントリーホールディングス株式会社 コラーゲンペプチド含有組成物の苦味マスキング方法
WO2021107101A1 (ja) * 2019-11-29 2021-06-03 株式会社バイオラジカル研究所 血管拡張剤およびその用途
CN114634549A (zh) * 2022-03-30 2022-06-17 北京盛美诺生物技术有限公司 一种胶原三肽产品及其制法和应用
US11612619B2 (en) 2018-11-01 2023-03-28 National Institute Of Health (Nih), U.S. Dept. Of Health And Human Services (Dhhs), U.S. Government Compostions and methods for enabling cholesterol catabolism in human cells

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114315960B (zh) * 2021-12-31 2022-10-14 深圳市维琪医药研发有限公司 一种经修饰的肽及其美容组合物或药用组合物和用途

Citations (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH1149802A (ja) 1997-04-16 1999-02-23 Usa Government 慢性進行性血管瘢痕疾患を治療するための医薬組成物
JP2000102381A (ja) 1998-09-30 2000-04-11 Dai Ichi Pure Chem Co Ltd プロテアーゼ、これを生産する微生物及び当該プロテアーゼの製造法
JP2001031586A (ja) 1999-07-14 2001-02-06 Sunstar Inc 動脈硬化症及び動脈硬化症に起因する疾患の予防又は治療組成物
JP2002204687A (ja) 2000-11-09 2002-07-23 Onaka Yasushi β−１．３−１．６グルカン（アウレオバシジウム培養液）の医療、保健、福祉、食品および各種産業分野での応用
JP2002275062A (ja) 2001-02-12 2002-09-25 Warner Lambert Co 核因子カッパｂ媒介の疾患および障害の治療剤
JP2003048889A (ja) 2001-08-01 2003-02-21 Ajinomoto Co Inc 新規核酸系化合物
JP2003137807A (ja) * 2001-11-01 2003-05-14 Miyagi Kagaku Kogyo Kk コラーゲン産生促進剤、それを含む化粧品、食品および医薬品ならびに皮膚疾患の予防または改善用外用剤
JP2004035475A (ja) 2002-07-03 2004-02-05 Ajinomoto Co Inc ＴＧＦβ作用抑制剤
JP2004350513A (ja) 2003-05-27 2004-12-16 Jellice Co Ltd プロテアーゼ、このプロテアーゼをコードするｄｎａ、プロテアーゼの製造方法
JP2005263758A (ja) 2004-03-22 2005-09-29 Kirin Brewery Co Ltd 非晶質のｎ−｛２−クロロ−４−［（６，７−ジメトキシ−４−キナゾリニル）オキシ］フェニル｝−ｎ’−プロピルウレア
JP2005281186A (ja) 2004-03-29 2005-10-13 Jellice Co Ltd 創傷治癒剤、腱または靭帯の損傷等に対する改善、治癒促進または予防剤、機能性食品ならびに医薬品
JP2007182448A (ja) 2007-02-26 2007-07-19 Kureha Corp 血管性病変の治療又は予防剤
JP2007231225A (ja) 2006-03-03 2007-09-13 Jellice Co Ltd エンドトキシン含有量を低減したゼラチンの製造方法および低エンドトキシンゼラチン

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS5830300B2 (ja) * 1981-11-02 1983-06-28 三菱化学株式会社 トリペプチドおよびその誘導体の製造法
US5643892A (en) 1995-06-07 1997-07-01 Baker Norton Pharmaceuticals, Inc. Method of treating chronic progressive vascular diseases
US6956120B2 (en) 2000-11-09 2005-10-18 Yasushi Onaka β-1.3-1.6 glucan (Aureobasidium medium)
JP2003284551A (ja) * 2002-03-29 2003-10-07 National Institute Of Advanced Industrial & Technology アンジオテンシンｉ変換酵素阻害剤
JP2005029488A (ja) * 2003-07-09 2005-02-03 National Institute Of Advanced Industrial & Technology 血圧降下剤およびＧｌｙ−Ｐｒｏ
JP4099541B2 (ja) * 2006-07-19 2008-06-11 ゼライス株式会社 ペプチド精製物の製造方法
CN101568552B (zh) 2006-11-15 2014-03-26 株式会社明治 胶原肽组合物以及含有其的饮食品
WO2009035169A1 (ja) * 2007-09-14 2009-03-19 Nippon Meat Packers, Inc. 血圧上昇抑制作用を有するぺプチド

Patent Citations (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH1149802A (ja) 1997-04-16 1999-02-23 Usa Government 慢性進行性血管瘢痕疾患を治療するための医薬組成物
JP2000102381A (ja) 1998-09-30 2000-04-11 Dai Ichi Pure Chem Co Ltd プロテアーゼ、これを生産する微生物及び当該プロテアーゼの製造法
JP2001031586A (ja) 1999-07-14 2001-02-06 Sunstar Inc 動脈硬化症及び動脈硬化症に起因する疾患の予防又は治療組成物
JP2002204687A (ja) 2000-11-09 2002-07-23 Onaka Yasushi β−１．３−１．６グルカン（アウレオバシジウム培養液）の医療、保健、福祉、食品および各種産業分野での応用
JP2002275062A (ja) 2001-02-12 2002-09-25 Warner Lambert Co 核因子カッパｂ媒介の疾患および障害の治療剤
JP2003048889A (ja) 2001-08-01 2003-02-21 Ajinomoto Co Inc 新規核酸系化合物
JP2003137807A (ja) * 2001-11-01 2003-05-14 Miyagi Kagaku Kogyo Kk コラーゲン産生促進剤、それを含む化粧品、食品および医薬品ならびに皮膚疾患の予防または改善用外用剤
JP2004035475A (ja) 2002-07-03 2004-02-05 Ajinomoto Co Inc ＴＧＦβ作用抑制剤
JP2004350513A (ja) 2003-05-27 2004-12-16 Jellice Co Ltd プロテアーゼ、このプロテアーゼをコードするｄｎａ、プロテアーゼの製造方法
JP2005263758A (ja) 2004-03-22 2005-09-29 Kirin Brewery Co Ltd 非晶質のｎ−｛２−クロロ−４−［（６，７−ジメトキシ−４−キナゾリニル）オキシ］フェニル｝−ｎ’−プロピルウレア
JP2005281186A (ja) 2004-03-29 2005-10-13 Jellice Co Ltd 創傷治癒剤、腱または靭帯の損傷等に対する改善、治癒促進または予防剤、機能性食品ならびに医薬品
JP2007231225A (ja) 2006-03-03 2007-09-13 Jellice Co Ltd エンドトキシン含有量を低減したゼラチンの製造方法および低エンドトキシンゼラチン
JP2007182448A (ja) 2007-02-26 2007-07-19 Kureha Corp 血管性病変の治療又は予防剤

Non-Patent Citations (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
"The effects of the collagen tripeptide HACP on bone and tendon", FFI JOURNAL, vol. 210, September 2005 (2005-09-01), pages 854 - 858
HUMBERT C, SANTISTEBAN M S, USSON Y, ROBERT-NICOUD M: "Intranuclear co-location of newly replicated DNA and PCNA by simultaneousimmunofluorescent labelling and confocal microscopy in MCF-7 cells", J CELL SCI, vol. 103, 1992, pages 97 - 103
ICHII T, KOYAMA H, TANAKA S, KIM S, SHIOI A, OKUNO Y, RAINES EW, IWAO H, OTANI S, NISHIZAWA Y.: "Fibrillar collagen specifically regulates human vascularsmooth muscle cell genes involved in cellular responses and the pericellularmatrix environment", CIRC RES., vol. 88, 2001, pages 460 - 467
K. MARUYAMA ET AL.: "The 12th Meeting of the Japanese Osteoarthitis Research Society"
KOYAMA H, RAINES EW, BOMFELDT KE, ROBERTS JM, ROSS R: "Fibrillarcollagen inhibits arterial smooth muscle cell proliferation through regulation ofCdk2 inhibitors", CELL, vol. 87, 1996, pages 1069 - 1078
LIBBY P: "Molecular bases of the acute coronary syndrome", CIRCULATION, vol. 91, 1995, pages 2844 - 2850
MASANORI AIKAWA: "The stabilization of arteriosclerotic change by lipid- reducing treatments", EXPERIMENTAL MEDICINE, vol. 18, 2000, pages 145 - 151
ROSS R: "Atherosclerosis-An inflammatory disease", N ENGL J MED, vol. 340, 1999, pages 115 - 126
ROSS R: "The pathogenesis of atherosclerosis: a perspective for the 1990s", NATURE, vol. 362, 1993, pages 801 - 809, XP002087100, DOI: doi:10.1038/362801a0
See also references of EP2407174A4
SHOGO KATSUDA: "From the standpoint of human pathology", ARTERIOSCLEROSIS, vol. 28, no. 3, 2001, pages 69 - 73
STEHBENS WE: "Vascular Pathology", 1995, CHAPMAN AND HALL MEDICAL, article "Atherosclerosis and degenerative diseases of blood vessels", pages: 175 - 269
TERUO WATANABE ET AL.: "Atherosclerosis", vol. 33, 1984, SOGO RINSHO, pages: 647 - 655

Cited By (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP5752033B2 (ja) * 2009-05-07 2015-07-22 富士フイルム株式会社 遺伝子組み換えゼラチンを含む血管新生誘導剤
JPWO2015156246A1 (ja) * 2014-04-10 2017-04-13 サントリーホールディングス株式会社 コラーゲンペプチド含有組成物の苦味マスキング方法
JP2020097578A (ja) * 2014-04-10 2020-06-25 サントリーホールディングス株式会社 コラーゲンペプチド含有組成物の苦味マスキング方法
JP7104018B2 (ja) 2014-04-10 2022-07-20 サントリーホールディングス株式会社 コラーゲンペプチド含有組成物の苦味マスキング方法
US11612619B2 (en) 2018-11-01 2023-03-28 National Institute Of Health (Nih), U.S. Dept. Of Health And Human Services (Dhhs), U.S. Government Compostions and methods for enabling cholesterol catabolism in human cells
WO2021107101A1 (ja) * 2019-11-29 2021-06-03 株式会社バイオラジカル研究所 血管拡張剤およびその用途
CN114634549A (zh) * 2022-03-30 2022-06-17 北京盛美诺生物技术有限公司 一种胶原三肽产品及其制法和应用
CN114634549B (zh) * 2022-03-30 2023-08-18 北京盛美诺生物技术有限公司 一种胶原三肽产品及其制法和应用

Also Published As

Publication number Publication date
EP2407174A4 (en) 2012-11-28
JPWO2010103837A1 (ja) 2012-09-13
US20130123167A1 (en) 2013-05-16
EP2407174B1 (en) 2014-05-07
EP2407174A1 (en) 2012-01-18
JP5604417B2 (ja) 2014-10-08
US9339524B2 (en) 2016-05-17

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP5604417B2 (ja) アテローム性動脈硬化症の進行抑制薬・予防薬・血中コレステロール低下薬・機能性食品・特定保健用食品
Nobukata et al. Long-term administration of highly purified eicosapentaenoic acid ethyl ester improves the dysfunction of vascular endothelial and smooth muscle cells in male WBN/Kob rats
Wang et al. Sodium butyrate ameliorates the cognitive impairment of Alzheimer’s disease by regulating the metabolism of astrocytes
JP2003137807A (ja) コラーゲン産生促進剤、それを含む化粧品、食品および医薬品ならびに皮膚疾患の予防または改善用外用剤
JP2015528001A (ja) Ｈｃ−ｈａ／ｐｔｘ３複合体を含む組成物およびその使用方法
US20040057955A1 (en) Methods of inhibition of stenosis and/or sclerosis of the aortic valve
JP2006511586A (ja) 線維細胞形成阻害の検出方法、ならびに線維細胞形成を増強する方法および化合物
Yamamoto et al. Recent progress in understanding dialysis-related amyloidosis
JP6379113B2 (ja) 免疫グロブリンｇの鼻腔内投与による中枢神経系障害の治療
JP5425086B2 (ja) 神経再生ペプチド化合物
EP3377105A1 (en) Compositions for treating ectopic calcification disorders, and methods using same
JP2021527669A (ja) 線維症の軽減又は治療のための組成物及び方法
Hocking et al. A small chimeric fibronectin fragment accelerates dermal wound repair in diabetic mice
EP3119414B1 (en) Ostreolysin for use in the treatment of overweight and obesity
KR20100045458A (ko) 신규 γ 세크레타아제 저해제
NO329848B1 (no) Anvendelse av rekonstituert HDL
EA017609B1 (ru) Применение гидролизата казеина молока животных и продукта ферментации исходного материала, содержащего молочный белок, включающих ile-pro-pro и/или val-pro-pro, в производстве профилактического средства от артериосклероза
Jacob et al. Influence of non-enzymatically glycated collagen on monocyte–macrophage differentiation
US20160002323A1 (en) Notch Inhibition in the Prevention of Vein Graft Failure
JP3977452B2 (ja) 動脈疾患治療剤
KR20170057308A (ko) 연하곤란 환자에서 뇌졸중의 치료에서 사용하기 위한 아미노산을 포함하는 조성물
RU2586286C2 (ru) Применение для лечения и профилактики атеросклероза белково-пептидного комплекса (далее-бпк), полученного из эмбриональной нервной ткани или из быстрозамороженного эмбрионального мозга сельскохозяйственных копытных животных, влияющего на обратный транспорт холестерина из сосудистой стенки и профиль активации моноцитов у пациентов с выраженным атеросклерозом магистральных сосудов или с предрасположенностью к сердечно-сосудистым заболеваниям и способ профилактики и лечения пациентов с атеросклерозом артериальных сосудов и с заболеваниями, вызванными атеросклерозом магистральных и периферических сосудов головного мозга, сердца, сосудов нижних конечностей и аорты (два варианта)
JP5207048B2 (ja) 海洋深層水を原料とする外用剤
US20240207213A1 (en) Methods and compositions for treating disorders with oral systemically bioavailable butyrate conjugates
Iezzi et al. Effect of Weight Loss on Markers of Inflammation and Endothelial Function in Childhood Obesity

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 10750593

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

DPE1 Request for preliminary examination filed after expiration of 19th month from priority date (pct application filed from 20040101)
WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2011503722

Country of ref document: JP

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2010750593

Country of ref document: EP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 13255651

Country of ref document: US