KR20100045458A

KR20100045458A - 신규 γ 세크레타아제 저해제

Info

Publication number: KR20100045458A
Application number: KR1020107002512A
Authority: KR
Inventors: 아츠히로 아베; 히데아키 시미즈; 세이고 사와다; 히로시 고다이라
Original assignee: 가부시끼가이샤 야구르트혼샤
Priority date: 2007-08-09
Filing date: 2008-07-01
Publication date: 2010-05-03
Also published as: US20110071224A1; CN101970458B; JP5374370B2; WO2009019815A1; CA2695877A1; EP2177529A1; JPWO2009019815A1; CN101970458A; EA017495B1; EP2177529A4; EP2177529B1; EA201070245A1; US8501813B2

Abstract

우수한 γ 세크레타아제 저해 효과를 갖고, 또한, Aβ 의 생성을 특이적으로 저해하는 신규 화합물을 제공하는 것.
하기 식 (1) 의 화합물 또는 그 약학적으로 허용할 수 있는 염.

[식 중, R¹ 은 탄소수 1 ∼ 4 의 직사슬 혹은 분기사슬의 알킬기 또는 페닐기를 나타내고 ； R² 는 1 개 이상의 페닐기 또는 할로게노페닐기에 의해 치환되어 있어도 되는 탄소수 1 ∼ 4 의 직사슬 또는 분기사슬의 알킬기를 나타내고 ； R³ 은 1 개 이상의 수산기에 의해 치환되어 있어도 되는 탄소수 1 ∼ 4 의 직사슬 또는 분기사슬의 알킬기를 나타내고 ； R⁴ 는 탄소수 1 ∼ 4 의 직사슬 또는 분기사슬의 알킬기를 나타내고, 「*」은 키랄 중심을 나타낸다.]

Description

신규 γ 세크레타아제 저해제 {NOVEL γ-SECRETASE INHIBITOR}

본 발명은 아밀로이드 전구체 단백질로부터 아밀로이드 단백질을 생성시키는 분해 효소인 γ 세크레타아제를 저해하는 화합물, 그 약학적으로 허용할 수 있는 염 및 이들을 함유하는 의약에 관한 것이다.

최근, 고령화 사회의 진행과 함께 알츠하이머형 인지증 환자가 증가되어, 사회적 문제가 되고 있다.

알츠하이머형 인지증의 발증은, 환자의 뇌에 특징적으로 진찰되는 노인반 (老人斑) 의 주요 구성 성분인 아밀로이드 β 단백질 (이하, Aβ 라고 한다) 의 생성 항진 또는 분해 저하에 계속되는 응집과 축적이라는 과정과 깊은 관계가 있는 것으로 생각된다.

이 Aβ 는 소수성 아미노산이 풍부한 40 개 내지 42 개/43 개의 아미노산으로 이루어지고, 그 전구체인 아밀로이드 전구체 단백질 (amyloid precursor protein (이하, APP 라고 한다)) 로부터 가수 분해 절단에 의해 생성된다. 또, APP 에는 아미노산 695 개로 이루어지는 APP (이하, APP 695 라고 한다), 아미노산 751 개로 이루어지는 APP (이하, APP 751 이라고 한다) 및 아미노산 770 개로 이루어지는 APP (이하, APP 770 이라고 한다) 의 3 종류가 존재한다.

APP 로부터 Aβ 가 생성되는 반응은 2 단계의 반응으로서, 제 1 단계는 β 세크레타아제에 의한 세포 외 도메인에서의 N 말단측의 절단, 제 2 단계는 γ 세크레타아제에 의한 세포막 관통 영역에서의 C 말단측의 절단이다.

종래의 지견으로는 제 2 단계의 절단점이 Aβ 의 C 말단인 γ 부위에서 발생하는 것으로 생각되어 왔는데, 최근의 지견으로는 γ 부위보다 더욱 아미노산 잔기 5 내지 10 개 분하류 (C 말단 방향) 의 세포질 근처의 ε 부위 (APP770 에서 말하는 Thr₇₁₉-Leu₇₂₀ 또는 Leu₇₂₀-Val₇₂₁) 에서 발생한다는 보고가 있다.

현재 알려져 있는 γ 세크레타아제 저해제로는, 그 효소가 작용하는 기질 APP 의 γ 부위에 기초하는 펩티드 모방 화합물인 DFK-167 (비특허 문헌 1), 이미 알려진 저해제 중에서 스크리닝된 화합물인 L-685, 458 (비특허 문헌 2), JLK-6 (비특허 문헌 3) 및 ε 부위에 기초하는 펩티드 모방 화합물 (특허 문헌 1) 등이 보고되어 있다.

그러나, DFK-167 은 γ 부위에 대해 설계된 저해제이기 때문에, 설계 목표나 구조가, 최근 보고된 ε 부위에서의 지견에 기초하여 완성된 것과는 완전히 상이하고, 저해제로서의 충분한 효과가 얻어지지 않는다는 문제가 있다.

또, 에이즈 치료약 개발의 과정에서 제조된 L-685, 458 및

-키모트립신 저해제인 JLK-6 에 대해서도, 본래 APP 의 Aβ 생성을 하는 γ 세크레타아제에 대한 특이적인 저해제로서 개발된 화합물은 아니기 때문에, 표적 조직에서의 유효성이 충분하지 않고, γ 세크레타아제의 비특이적인 활성 억제는 암화 (癌化) 유도 등의 중독 (重篤) 한 부작용을 유도할 가능성이 있다는 문제가 있다.

또한, 특허 문헌 1 에는 ε 부위에 기초하는 펩티드 모방 화합물로서 Thr-Leu-Val-Met 형 화합물이 개시되어 있는데, 저해제로서의 효과가 충분하지 않다는 문제를 안고 있고, 실시예 중에는 Thr 의 히드록실기가 t-부틸에테르화된 상태인 Thr-Leu-Val-Met 형 화합물 (1'a) 이 개시되어 있는데, 당해 화합물은 말하자면 합성 중간체에 지나지 않고, Thr-Leu-Val-Met 형 화합물로서 완성된 것은 아니었다.

그리고, Thr 의 히드록실기가 보호되어 있지 않은 Thr-Leu-Val-Met 형 화합물, 당해 화합물의 γ 세크레타아제 저해 효과의 특이성에 대해서는 지금까지 알려지지 않았다.

WO, 03/091278호

J.Med.Chem., 1998, 41 (1), 6-9 Biochemistry, 2000, 39 (30), 8698-8704 J.Biol.Chem., 1979, 254 (10), 4027-4032

따라서, 본 발명의 과제는 우수한 γ 세크레타아제 저해 효과를 갖고, 또한, Aβ 의 생성을 특이적으로 저해하는 신규 화합물을 제공하는 것이다.

본 발명의 추가적인 과제는, 알츠하이머병을 비롯한 유연 (類緣) 질환의 유용한 치료약·치료 방법 등을 제공하는 것이다. 여기서 말하는 유연 질환이란, 다운증을 비롯한, Aβ 가 직접·간접적으로 병인으로서 관여되는 것이 알려지거나 또는 가능성이 의심되는 질환, 및 Aβ 가 신경 병변 중에 확인되는 질환을 말한다.

본 발명은 관련된 연구 지견에 비추면서, APP 의 ε 부위에 주목하여 창의 연구를 거듭한 결과, APP 의 ε 부위를 포함하는 4 개의 아미노산 배열 (Thr-Leu-Val-Met) 과 유사한 화학 구조를 갖고, 효소 절단 부위인 ε 부위의 Thr 과 Leu 사이의 펩티드 결합을 효소에 대해 안정적인 결합으로 치환한 펩티드 유사 화합물에 있어서, 특정 구조를 갖는 것이 비약적이고 효율적으로 γ 세크레타아제를 저해하고, Aβ 생성을 억제시킨다는 것을 알아내고, 본 발명을 완성하였다.

즉, 본 발명은 하기 식 (1) 의 화합물 또는 그 약학적으로 허용할 수 있는 염을 제공하는 것이다.

[화학식 1]

또, 본 발명은 상기 식 (1) 의 화합물 또는 그 약학적으로 허용할 수 있는 염을 함유하는 의약을 제공하는 것이다.

또, 본 발명은 상기 식 (1) 의 화합물 또는 그 약학적으로 허용할 수 있는 염을 함유하는 γ 세크레타아제 저해제를 제공하는 것이다.

또한, 본 발명은 상기 식 (1) 의 화합물 또는 그 약학적으로 허용할 수 있는 염을 함유하는 아밀로이드 단백질 생성 억제제를 제공하는 것이다.

또한, 본 발명은 상기 식 (1) 의 화합물 또는 그 약학적으로 허용할 수 있는 염을 함유하는 γ 세크레타아제가 관여하는 질병의 예방·치료제를 제공하는 것이다.

또한, 본 발명은 상기 식 (1) 의 화합물 또는 그 약학적으로 허용할 수 있는 염의, γ-세크레타아제 저해제, 아밀로이드 단백질 생성 억제제 또는 γ-세크레타아제가 관여하는 질병의 예방·치료제 제조를 위한 사용을 제공하는 것이다.

또, 본 발명은 상기 식 (1) 의 화합물 또는 그 약학적으로 허용할 수 있는 염을 적용하는 것을 특징으로 하는 γ-세크레타아제 저해 방법, 아밀로이드 단백질 생성 억제 방법, 또는 γ-세크레타아제가 관여하는 질병의 예방·치료 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 화합물 및 그 약학적으로 허용할 수 있는 염은, 알츠하이머병 및 그 유연 질환, 예를 들어, 다운증을 비롯한, Aβ 가 직접·간접적으로 병인으로서 관여되는 것이 알려지거나 또는 가능성이 의심되고 있는 질환, 및 Aβ 가 신경 병변 중에 확인되는 질환의 예방·치료에 사용할 수 있다.

또 본 발명의 화합물 및 그 약학적으로 허용할 수 있는 염은, Aβ 의 생성을 특이적으로 저해하는 작용을 가지고 있고, 상기 질환의 예방·치료의 목적에 따라, 유효하며 또한 안전하게 이용할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 식 (1) 의 화합물은 적어도 5 개의 키랄 중심을 함유하고 (식 중, 키랄 중심을 「*」으로 나타낸다), 이들 키랄 중심은 R 형, S 형의 어느 입체도 취할 수 있기 때문에, 다양한 에난티오머형, 디아스테레오머형으로서 존재할 수 있는데, 이와 같은 화합물의 라세미 혼합물과 개개의 에난티오머 및 디아스테레오머 그리고 그들 혼합물의 양방으로서의 모든 광학 이성체 및 모든 입체 이성체는 본 발명의 범위에 포함된다. 이성체로는 예를 들어 (2R,4R-체), (2R,4S-체), (2S,4R-체), (2S,4S-체) 등을 들 수 있는데, γ 세크레타아제를 강하게 저해하고, Aβ 생성을 특이적으로 억제한다는 점에서, (2R,4R-체) 가 특히 바람직하다.

본 발명에 있어서, R¹ 은 탄소수 1 ∼ 4 의 직사슬 혹은 분기사슬의 알킬기 또는 페닐기를 나타내고, 탄소수 1 ∼ 4 의 직사슬 혹은 분기사슬의 알킬기로는 메틸기, 에틸기, 프로필기, 이소프로필기, n-부틸기, sec-부틸기, t-부틸기 등을 들 수 있다. R¹ 로는 특히 메틸기, 이소프로필기, 페닐기가 바람직하다.

본 발명에 있어서, R² 는 1 개 이상의 페닐기 또는 할로게노페닐기에 의해 치환되어 있어도 되는 탄소수 1 ∼ 4 의 직사슬 또는 분기사슬의 알킬기를 나타내고, 탄소수 1 ∼ 4 의 직사슬 또는 분기사슬의 알킬기로는 메틸기, 에틸기, 프로필기, 이소프로필기, n-부틸기, sec-부틸기, t-부틸기 등을 들 수 있고, 특히 메틸기, 에틸기, n-부틸기가 바람직하다.

또, 1 개 이상의 페닐기에 의해 치환되어 있어도 되는 탄소수 1 ∼ 4 의 직사슬 또는 분기사슬의 알킬기의 바람직한 예로서 벤질기, 1-페닐-에틸기를 들 수 있다.

할로게노페닐기에서의 할로겐 원자로는 불소, 염소, 브롬 및 요오드 등을 들 수 있고, 불소가 바람직하다. 할로게노페닐기에 의해 치환되어 있어도 되는 탄소수 1 ∼ 4 의 직사슬 또는 분기사슬의 알킬기의 바람직한 예의 하나로서, 4-플루오로-벤질기를 들 수 있다.

본 발명에 있어서, R³ 은 1 개 이상의 수산기에 의해 치환되어 있어도 되는 탄소수 1 ∼ 4 의 직사슬 또는 분기사슬의 알킬기를 나타내고, 구체적으로는 1-히드록시에틸기 또는 히드록시메틸기 등을 들 수 있고, 특히 1-히드록시에틸기가 바람직하다.

본 발명에 있어서, R⁴ 는 탄소수 1 ∼ 4 의 직사슬 또는 분기사슬의 알킬기를 나타내고, 구체적으로는 이소부틸기 또는 sec-부틸기 등을 들 수 있고, 특히 이소부틸기가 바람직하다.

본 발명에 있어서, γ 세크레타아제를 강하게 저해하고, Aβ 생성을 특이적으로 억제한다는 점에서, 하기 식 (2) 의 화합물 또는 그 약학적으로 허용할 수 있는 염이 보다 바람직하다.

[화학식 2]

[식 중, R¹, R², R³ 및 R⁴ 는 상기와 동일하다.]

본 발명에 있어서, γ 세크레타아제를 강하게 저해하고, Aβ 생성을 특이적으로 억제한다는 점에서, 하기 식 (3) 의 화합물 또는 그 약학적으로 허용할 수 있는 염이 더욱 바람직하다.

[화학식 3]

[식 중, R¹ 및 R² 는 상기와 동일하다.]

본 발명에 있어서, 하기의 화합물 또는 그 약학적으로 허용할 수 있는 염이 특히 바람직하다.

[5S-(tert-부톡시카르보닐아미노)-4R,6R-디히드록시-2R-(2-메틸프로필)헵타노일]-L-발릴-L-메티오닌 벤질아미드 (TLVM-5),

[5S-(tert-부톡시카르보닐아미노)-4R,6R-디히드록시-2R-(2-메틸프로필)헵타노일]-L-발릴-L-메티오닌 n-부틸아미드 (TLVM-7),

[5S-(tert-부톡시카르보닐아미노)-4R,6R-디히드록시-2R-(2-메틸프로필)헵타노일]-L-발릴-L-메티오닌 (S)-

-메틸벤질아미드 (TLVM-8),

[5S-(tert-부톡시카르보닐아미노)-4R,6R-디히드록시-2R-(2-메틸프로필)헵타노일]-L-발릴-L-메티오닌 4-플루오로벤질아미드 (TLVM-9),

[5S-(tert-부톡시카르보닐아미노)-4R,6R-디히드록시-2R-(2-메틸프로필)헵타노일]-L-알라닐-L-메티오닌 벤질아미드 (TLVM-10),

[5S-(tert-부톡시카르보닐아미노)-4R,6R-디히드록시-2R-(2-메틸프로필)헵타노일]-L-페닐글리실-L-메티오닌 벤질아미드 (TLVM-11).

본 발명에 있어서, 약학적으로 허용할 수 있는 염으로는, 염산염, 황산염, 시트르산염, 타르타르산염, 아세트산염, 메탄술폰산염, 인산염, 옥살산염, 벤조산염, 트리플루오로아세트산염, 말레산염, 푸마르산염, 락트산염, 브롬산염, 요오드산염, 숙신산염, 글루타르산염 등의 산부가염, 및 리튬염, 나트륨염, 칼륨염, 마그네슘염 등의 금속염을 들 수 있다.

본 발명에 있어서, 「아밀로이드 단백질 생성 억제제」란, γ 세크레타아제가 기질로 하는 여러 가지의 I 형막 단백질 중, Aβ 의 생성에 대해 억제 효과를 갖고 또한 다른 기질막 단백질 (예를 들어, 인간 Alcadein 등) 의 생성에 대해서는 억제 효과를 갖지 않는 화합물을 의미한다. 보다 구체적으로는, 후술하는 방법 (실시예 11) 에 의해 구해지는 (i) Aβ 분비율이 50 % 이하 또한 (ii) Alcadein 분비율이 60 % 이상이며, 또한 (i)/(ii) 가 0.8 이하, 보다 바람직하게는 0.4 이하인 화합물을 의미한다.

본 발명의 펩티드 모방 화합물은 APP 분해물에 관한 지금까지의 상세한 연구 성과에 비추어, 효소에 대한 ε 부위의 안정화에 의해 γ 세크레타아제 활성을 저해할 수 있다는 가정하에서, ε 부위의 구조와 유사하고, 게다가 효소에 대해 안정화된 화합물을 만들어 내는 시도로부터 얻어진 것으로서, 고발성 알츠하이머병의 Aβ 생성뿐만 아니라 조기 발증형 가족성 알츠하이머병의 유전 변이를 갖는 Aβ 생성에 대한 억제제로도 사용할 수 있다.

APP 의 ε 부위 부근과 동일한 아미노산 배열을 갖고, 또한 γ 세크레타아제 에 의한 절단 부위를 안정화시키도록 변경한 여러 가지의 펩티드 유사 화합물로서, γ 세크레타아제 저해 활성을 갖는 것을 본 발명의 목적으로 사용할 수 있다. 예를 들어, ε 부위 부근의 어느 아미노산 잔기 -NH-CHR-CO- 를, R 에 대해 유사한 성질 (소수성/친수성, 산성/염기성, 황의 유무, 히드록실기의 유무 등) 을 갖는 다른 아미노산 잔기로 치환된 형태의 화합물로서 γ 세크레타아제 저해 활성을 갖는 것이, 그러한 화합물의 예이다. 예를 들어, Leu 로 치환될 수 있는 아미노산으로는 Ile, Val, Ala, Gly 등을, Thr 로 치환될 수 있는 아미노산으로는 Ser 등을, Met 로 치환될 수 있는 아미노산으로는 Ala 등을, Val 로 치환될 수 있는 아미노산으로는 Leu, Ala, Gly, Ile, t-부틸글리신, 노르류신, 노르발린, 페닐글리신, 2-아미노부티릭애시드 등을 각각 들 수 있다.

본 발명의 화합물을 합성하기 위한 소재 및 합성의 각 단계에 있어서 사용하는 방법은 주지된 것이기 때문에, 당업자는 합성, 단리, 정제 등을 적절히 실시하여 목적으로 하는 화합물을 적절히 제조할 수 있다. 또, 대장균, 효모, 고초균, 곤충 세포, 동물 세포, 식물 세포의 자체 공지된 숙주를 이용한 유전자 재조합 기술에 의해, 본 발명의 화합물의 폴리펩티드 부분을 제조할 수도 있다. 화학 합성으로는 예를 들어, 후술하는 실시예에 준하여 실시할 수 있는데, 목적으로 하는 화합물이 얻어지는 한, 어떠한 방법을 사용해도 된다. 예를 들어, 주지된 방법인 Boc (tert-부톡시카르보닐) 반응, DMSO 산화, 알칼리 반응, 산성 반응, 에폭시화 반응, 실리카겔 칼럼 크로마토그래피, 알킬화 반응, 비누화 반응, 가열 반응, 탈탄산 반응, 축합 반응, 역상 고속 액체 크로마토그래피, 아실화 반응, 전이 반응, 이성화 반응, 메타세시스 반응, 부가 반응, 산화 반응, 환원 반응, 할로겐화 반응, 라디칼 반응, 커플링 반응, 탈리 반응, 니트로화 반응, 술폰화 반응 등을 적절히 조합하여 실시할 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 화합물의 구조 요소 부분을 순차적으로 반응시켜, 효율과 반응물 순도의 검정을 적절히 실시하는 방법을 취한다.

본 발명의 화합물은 합성이나 정제를 촉진시키기 위한 수식, 물리·화학적 안정화를 촉진시키기 위한 수식, 생체 내의 대사에 대한 안정성과 불안정성, 조건 부여 등의 활성화 수식, 나아가서는, 뇌혈관 관문 통과를 포함하는 장기 반송 효율의 항진과 저하를 가져오는 제어 수식을 포함하는 것이어도 된다. 여기서 말하는 제어 수식으로는, Tyr-Gly-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg 의 11 개의 아미노산으로 이루어지는 배열을 나타낸다. N 말단측에 펩티드 결합으로 연결된 그 제어 배열을 포함함으로써, 그 화합물은 혈액뇌 관문의 통과가 용이화되고, 뇌 내의 목표 부위에 의해 효율적으로 도달할 수 있게 된다.

본 발명의 화합물의 그 밖의 수식에는, 아세틸화, 아실화, ADP-리보실화, 아미드화, 플라빈의 공유 결합, 헴 부분의 공유 결합, 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 유도체의 공유 결합, 지질 또는 지질 유도체의 공유 결합, 포스파티딜이노시톨의 공유 결합, 교차 가교, 고리화, 디술파이드 결합, 탈메틸화, 교차 가교 공유 결합 형성, 시스틴 형성, 피로글루타메이트 형성, 포르밀화, 감마-카르복실화, 글리코실화, GPI 앵커화, 수산화, 요오드화, 메틸화, 미리스토일화, 산화, 단백질 가수 분해 프로세싱, 인산화, 프레닐화, 라세미화, 지질 결합, 황산화, 세레노일화, 알기닐화와 같은 트랜스퍼 RNA 매개의 단백에 대한 아미노산의 첨가, 유비퀴티네이션, 탈수 축합 그리고 알콕시카르보닐화 등이 있다.

또한, 본 발명의 화합물의 검출 혹은 정제를 용이하게 하기 위해, 또는 다른 기능을 부가하기 위해, 구조의 부가, 변경, 치환하는 것은 기술적으로 용이하여, 이들 생성물도 본 발명의 범위에 포함된다. 또한, 수식 부가에는 FLAG-tag, β 갈락토시다아제, 알카리포스파타아제, IgG 등의 면역 글로불린 Fc 단편이나 GFP 등의 유전자 공학 수법에 의한 생성물도 본 발명의 범위에 포함된다.

또한, 필요에 따라, 본 발명의 화합물에 대한 항체를 제조할 수 있다. 항체는, 본 발명의 화합물 및 그 유도체 혹은 그 분해물을 선별하여, 이들을 항원으로서 사용하여 정제할 수 있다. 항원은 당해 화합물 혹은 그들 파생물이어도 되고, 예를 들어 4 개 이하의 아미노산 잔기, 바람직하게는 3 개 이하의 아미노산 잔기, 더욱 바람직하게는 2 개의 아미노산 잔기로 구성된다. 정제에는 그들 항원을 조합시켜 사용해도 된다. 항원으로는 반드시 본 발명의 화합물 및 그 유도체 혹은 그 분해물 그 자체가 아니어도, APP 의 ε 부위 근방의 1 차 배열을 입체 구조 상 외부에 노출시켜 갖는 화합물이면 된다. 이들 항체는 당해 부위에 면역학적으로 결합 또는 이것을 인식하는 한, 종류 및 양은 특별히 한정되지 않는다. 항체의 결합 또는 인식의 유무는 공지된 항원 항체 반응에 의해 결정된다.

항체의 생산은 본 발명의 화합물 및 그 유도체 혹은 그 분해물을 항원으로서 아쥬반트의 존재 또는 비존재하에서, 단독 또는 담체에 결합 혹은 동거된 상태에서, 그 항원에 대해 체액성 응답 및/또는 세포성 응답의 면역 유도를 실시함으로써 실시된다. 혹은 배양 조건하에서 림프구 혹은 그 전구 세포를 면역 자극함으로써도 면역 유도할 수 있다. 담체는 그 자체가 숙주에 대해 유해 작용을 일으키지 않으면, 특별히 한정되지 않고 예를 들어 셀룰로오스, 생리 식염수, 완충화 생리 식염수, 덱스트로스, 물, 글리세롤, 에탄올, 중합 아미노산, 알부민 및 그들 혼합물 등이 예시되지만, 이것에 한정되지 않는다. 면역되는 동물은 마우스, 래트, 토끼, 염소, 말, 소 등이 바람직하게 사용된다. 폴리클로날 항체는 자체 공지된 방법에 의해 혈청으로서, 또 혈청으로부터의 항체 회수법에 의해 취득된다. 바람직한 수단으로는, 면역 어피니티 크로마토그래피법을 들 수 있다.

모노클로날 항체의 생산은, 상기의 면역 유도된 동물로부터 항체 활성을 포함하는 조직 (예를 들어 비장 또는 림프절) 혹은 배양 세포를 회수하고, 자체 공지된 영구 증식성 세포 (예를 들어, P3X63Ag8 주 등의 미엘로마주) 에 대한 형질 전환 수단을 도입함으로써 실시된다. 예를 들어, 상기 항체 생성 세포와 영구 증식 세포로 제조된 하이브리도마를 클론화하고, 본 발명에 관련된 신규 화합물을 특이적으로 인식하는 항체를 생성시키는 하이브리도마를 선별하여, 그 하이브리도마의 배양액으로부터 항체를 회수한다. 실례로는, 하이브리도마법 (Kohler G. and Milstein C. (1975) Nature 256, 495-497), 트리오마법 (Kozbor et al. Immunology Today (1983) 4 ： 72), 및 EBV 법 (Cole et al. Monoclonal antibodies and cancer therapy, Alan R. Liss, Inc., (1985) ： 77-96) 에 기재되는 여러 가지의 기법이 있다.

상기 항체는, 본 발명의 화합물 및 그 유도체 혹은 그 분해물의 동정, 검출, 정량, 혹은 어피니티 크로마토그래피에 의한 그 화합물의 조제와 정제에 사용할 수 있다. 상기 항체는 인간형 항체로, 자체 공지된 수법을 사용하여 개변할 수 있다.

구체적으로는, 본 발명의 화합물 및 그 유도체 혹은 그 분해물, 및 그들에 대한 특이적 항체로 본 발명의 화합물 및 그 유도체 혹은 그 분해물의 활성을 증가시키는 활성을 갖는 것은 Aβ 생성 저해약의 스크리닝에 부여되는 화합물의 표준 물로서, 또 스크리닝 수단으로서 유용하다.

본 발명의 화합물 및 그 유도체 혹은 그 분해물에 대한 항체를 사용한 어세이법으로는, 라디오이뮤노어세이, 경쟁 결합 어세이, 고속 액체 크로마토그래피, 웨스턴 블롯 분석 및 ELISA 어세이 등 그리고 이들 조합을 들 수 있다.

본 발명의 화합물은 알츠하이머병 및 그 유연 질환에 대해, 유효량을 의약상 허용되는 담체에 넣거나 혹은 단독으로 환자에게 투여하여, Aβ 생성량을 제어하고 그것에 의해, 그들 질환의 예방, 치료, 및 증상의 개선을 위해 사용된다. 본 발명의 화합물에는, 그 화합물의 뇌조직에 대한 수송 효율을 높이는 적절한 제제화를 실시해도 된다. 여기서, 알츠하이머 및 그 유연 질환으로는, 알츠하이머병, 크로이츠펠트-야콥병, 프리온 장해, 근위축성 측색 경화증, 진행성 핵상성 마비, 두부 외상, 발작, 다운 증후군, 췌장염, 봉입체 (封入體) 근염, 다른 말초 아밀로이드시스 및 당뇨병 등을 들 수 있다.

본 발명의 화합물은 그 중 1 종을 단독으로 사용해도 되고, 혹은 복수를 조합시켜 사용해도 된다. 나아가서는, 치료상 유리해지는 다른 화합물과 병용해도 되고, 당해 다른 화합물의 작용 기작은 본 발명의 화합물과 동일해도 되고, 또한 상이해도 된다. 본 발명의 화합물을 함유하여 이루어지는 의약품 조성물의 전신 투여의 바람직한 형태는 주사이고, 특히 정맥 주사이다. 피하, 근육 내 또는 복강 내와 같은 다른 주사 경로를 사용할 수도 있다. 전신 투여를 위한 다른 수단은, 담즙산염 또는 푹신산 또는 다른 계면활성제와 같은 침투제를 사용하는 경점막 또는 경피 투여이다. 또한, 장용 처방 또는 캡슐 처방 등에 의해, 경구 투여도 가능하다. 이들 의약품 조성물의 투여는 국소적인 것이어도 되고, 고약, 페이스트, 겔 등의 형태여도 된다.

본 발명의 γ 세크레타아제 저해제의 유효 성분인 펩티드 유사 화합물을 사용할 때의 투여량에 엄격한 제한은 없다. 대상자나 적용 질환 등의 여러 가지 사용 양태에 의해 얻어지는 효과가 상이하기 때문에 적절히 투여량을 설정하는 것이 바람직한데, 그 바람직한 투여량은 1 일당 0.01 ∼ 100 g, 보다 바람직하게는 0.1 ∼ 10 g 이다.

이와 같은 제제로는 예를 들어, 정제, 과립제, 산제, 캡슐제 등의 고체제, 용액제, 현탁제, 유제 등의 액제, 동결 건조제 등을 들 수 있다. 이들 제제는 제제 상의 통상적인 수단에 의해 조제할 수 있다. 상기의 의약용 무독성 담체로는 예를 들어, 전분, 덱스트린, 지방산 글리세라이드, 폴리에틸렌글리콜, 히드록시에틸 전분, 에틸렌글리콜, 폴리옥시에틸렌소르비탄 지방산 에스테르, 아미노산, 젤라틴, 알부민, 물, 생리 식염수 등을 들 수 있다. 또, 필요에 따라, 안정화제, 습윤제, 유화제, 결합제 등장화제, 부형제 등의 관용된 첨가제를 적절히 첨가할 수도 있다.

또, 본 발명의 γ 세크레타아제 저해제는, 상기와 같은 의약품 제제로서 사용할 뿐만 아니라, 음식품 등으로서 사용할 수도 있다. 이 경우에는, 본 발명의 펩티드 유사 화합물을 그대로, 또는 여러 가지의 영양 성분을 첨가하여, 음식품 중에 함유시키면 된다. 이 음식품은, 알츠하이머병, 크로이츠펠트-야콥병, 프리온 장해, 근위축성 측색 경화증, 진행성 핵상성 마비, 두부 외상, 발작, 다운 증후군, 췌장염, 봉입체 근염, 다른 말초 아밀로이드시스 및 당뇨병 등의 개선, 예방 등에 유용한 보건용 식품 또는 식품 소재로서 이용할 수 있고, 이들 음식품 또는 그 용기에는, 상기의 효과를 갖는 취지의 표시를 부여해도 된다. 구체적으로 본 발명의 γ 세크레타아제 저해제를 음식품에 배합하는 경우에는, 음식품으로서 사용 가능한 첨가제를 적절히 사용하고, 관용 수단을 사용하여 식용에 적절한 형태, 예를 들어, 과립 형상, 입자 형상, 정제, 캡슐, 페이스트 등으로 성형해도 되고, 또 다양한 식품, 예를 들어, 햄, 소세지 등의 식육 가공품, 어묵, 생선살 꼬치구이 등의 수산 가공품, 빵, 과자, 버터, 분유, 발효 음식품에 첨가하여 사용하거나 물, 과즙, 우유, 청량 음료, 차 음료 등의 음료에 첨가하여 사용해도 된다. 또한, 음식품에는 동물의 사료도 포함된다.

또한 음식품으로는, 유효 성분인 펩티드 유사 화합물을 함유하는 발효유, 유산균 음료, 발효 두유, 발효 과즙, 발효 식물액 등의 발효유 제품이 바람직하게 사용된다. 이들 발효유 음식품의 제조는 정법에 따라 제조할 수 있다. 예를 들어 발효유는, 살균된 유 (乳) 배지에 유산균이나 비피더스균을 접종 배양하고, 이것을 균질화 처리하여 발효유 베이스를 얻는다. 이어서 별도 조제된 시럽 용액 및 펩티드 유사 화합물을 첨가 혼합하고, 호모게나이저 등으로 균질화하고, 추가로 플레이버를 첨가하여 최종 제품으로 할 수 있다. 이와 같이 하여 얻어지는 발효유는 플레인 타입, 소프트 타입, 프루트 플레이버 타입, 고형상, 액상 등의 어느 형태의 제품으로 할 수도 있다.

또, 본 발명의 γ 세크레타아제 저해제는 인간을 포함하는 모든 포유 동물에게 적용할 수 있다.

실시예

이하, 실시예를 들어 본 발명의 내용을 더욱 상세하게 설명하지만, 본 발명은 이들에 의해 전혀 제약되는 것은 아니다.

실시예 1 [5S-(tert-부톡시카르보닐아미노)-4S,6R-디히드록시-2R-(2-메틸프로필)헵타노일]-L-발릴-L-메티오닌 벤질아미드 (TLVM-4) 의 제조

(공정 1)

3-벤질옥시카르보닐-2,2-디메틸-4S-(N-메톡시-N-메틸카르바모일)-5R-메틸옥사졸리딘 (화합물 1)

N-Cbz-L-트레오닌 (12.7 g, 50 mmol), 디메틸히드록실아민 염산염 (5.9 g, 60 mmol) 및 EDC 염산염 (11.5 g, 60 mmol) 을 클로로포름 (350 ㎖) 에 녹여, 트리에틸아민 (8.4 ㎖, 60 mmol) 및 HOBt·H₂O (7.7 g, 50 mmol) 를 첨가하고, 40 ℃ 에서 6 일간 교반하였다. 반응 혼합물에 아세트산에틸을 첨가하고, 1N-염산, 물 및 포화 탄산수소나트륨 수용액으로 세정한 후, 유기층을 무수 황산 마그네슘으로 건조시켜, 감압하에서, 용매를 증류 제거하였다. 잔류물 (12.4 g) 을 톨루엔 (250 ㎖) 에 녹여, 2-메톡시프로펜 (35 ㎖) 과 PPTS (0.39 g) 를 첨가하고, 80 ℃ 에서 2 시간 교반하였다. 톨루엔을 증류 제거한 후, 잔류물에 클로로포름을 첨가하고, 포화 탄산수소나트륨 수용액으로 세정하였다. 유기층을 무수 황산 마그네슘으로 건조시켜, 감압하에서, 용매를 증류 제거한 후, 실리카겔 칼럼 크로마토그래프법 (hexane ： AcOEt = 8 ： 1 에서 4 ： 1) 으로 정제하여, 표기 화합물 (12.2 g, 36 mmol, 80 %) 을 얻었다.

(공정 2)

3-벤질옥시카르보닐-2,2-디메틸-4S-(4-펜테노일)-5R-메틸옥사졸리딘 (화합물 2)

화합물 1 (12.2 g, 36 mmol) 을 THF (170 ㎖) 에 녹여, 빙욕 중에서 3-부테닐마그네슘브로마이드 (0.5 mol/ℓ THF 용액, 130 ㎖, 65 mmol) 를 적하하고, 빙욕 중에서 0.5 시간 교반한 후, 실온에서 3 일간 교반하였다. 반응 혼합물에 시트르산 수용액을 첨가하고, 10 분간 교반한 후, 클로로포름으로 추출하였다. 유기층을 무수 황산 마그네슘으로 건조시켜, 감압하에서, 용매를 증류 제거한 후, 실리카겔 칼럼 크로마토그래프법 (hexane ： AcOEt = 9 ： 1 에서 6 ： 1) 으로 정제하여, 표기 화합물 (6.9 g, 20.8 mmol, 78 %) 및 미반응의 화합물 1 (3.14 g, 9.3 mmol) 을 얻었다.

(공정 3)

4-(3-벤질옥시카르보닐-2,2-디메틸-5R-메틸옥사졸리딘-4S-일)-4-옥소부티르산 (화합물 3)

화합물 2 (6.9 g, 21 mmol) 를 톨루엔 (105 ㎖) 에 녹여, nBu₄NBr (84 mg), 물 (105 ㎖) 및 아세트산 (21 ㎖) 을 첨가하였다. 빙욕 중에서 10 분간 교반한 후, KMnO₄ (11.3 g, 71.4 mmol) 를 첨가하고, 실온에서 격렬하게 5 시간 교반하였다. 반응 혼합물에 NaHSO₃ 을 첨가한 후, 빙욕 중에서 포화 황산수소칼륨 수용액을 첨가하고, pH 를 1 에서 2 로 조정하였다. 클로로포름으로 추출하고, 유기층을 무수 황산 마그네슘으로 건조시켜, 감압하에서, 용매를 증류 제거한 후, 실리카겔 칼럼 크로마토그래프법 (hexane ： AcOEt = 8 ： 1 에서 CHCl₃ ：MeOH = 97 ： 3) 으로 정제하여, 표기 화합물 (5.2 g, 14.9 mmol, 83 %) 및 미반응의 화합물 2 (1.02 g, 3.1 mmol) 를 얻었다.

(공정 4)

4-(3-벤질옥시카르보닐-2,2-디메틸-5R-메틸옥사졸리딘-4S-일)-4-옥소부티르산메틸에스테르 (화합물 4)

화합물 3 (5.2 g, 15 mmol) 을 톨루엔 (240 ㎖) 에 녹여, MeOH (60 ㎖) 및 트리메틸실릴디아조메탄 (10 % hexane 용액, 27 ㎖) 을 첨가하고, 실온에서 1 시간 교반하였다. 반응 혼합물에 아세트산을 적하하고, 황색이 사라지는 것을 확인한 후, 감압하에서, 용매를 증류 제거하였다. 실리카겔 칼럼 크로마토그래프법 (hexane ： AcOEt = 8 ： 1) 으로 정제하여, 표기 화합물 (4.6 g, 12.7 mmol, 85 %) 을 얻었다.

(공정 5)

3-벤질옥시카르보닐-2,2-디메틸-5R-메틸-4S-[5-옥소테트라히드로푸란-2-일]옥사졸리딘 (화합물 5)

화합물 4 (4.13 g, 11.4 mmol) 를 MeOH (120 ㎖) 에 녹여, NaBH₄ (860 mg, 23 mmol) 를 첨가하고, 실온에서 3 시간 교반하였다. 반응 혼합물을 감압하에서, 용매를 증류 제거한 후, 물을 첨가하여 클로로포름으로 추출하였다. 유기층을 무수 황산 마그네슘으로 건조시켜, 감압하에서, 용매를 증류 제거하였다. 얻어진 잔류물을 톨루엔 (100 ㎖) 에 녹여, 아세트산 (3 ㎖) 을 첨가하고, 환류하에서 4 시간 교반하였다. 반응 혼합물에 포화 탄산수소나트륨 수용액을 첨가하여 클로로포름으로 추출하였다. 유기층을 무수 황산 마그네슘으로 건조시켜, 감압하에서, 용매를 증류 제거한 후, 실리카겔 칼럼 크로마토그래프법 (hexane ： AcOEt = 3 ： 1 에서 2 ： 1) 으로 정제하여, 표기 화합물 (2.99 g, 9.00 mmol, 79 %) 을 얻었다.

(공정 6)

3-벤질옥시카르보닐-2,2-디메틸-5R-메틸-4S-[4R-(2-메틸-2-프로페닐)-5-옥소테트라히드로푸란-2S-일]옥사졸리딘 (화합물 6)

아르곤 분위기하에서, 화합물 5 (2.99 g, 9.0 mmol) 를 THF (50 ㎖) 에 녹여, -78 ℃ 에서 20 분간 교반한 후, LiHMDS (1.0 M THF 용액, 12 ㎖, 12 mmol) 를 첨가하고, -78 ℃ 에서 1 시간 교반하였다. 반응계 중에 3-브로모-2-메틸프로펜 (1.2 ㎖, 12 mmol) 을 시린지로 적하하고, 추가로 -78 ℃ 에서 2 시간 교반하였다. 반응 혼합물에 시트르산 수용액을 첨가하여 클로로포름으로 추출하였다. 유기층을 무수 황산 마그네슘으로 건조시켜, 감압하에서, 용매를 증류 제거한 후, 실리카겔 칼럼 크로마토그래프법 (hexane ： AcOEt = 4 ： 1 에서 3 ： 1) 으로 정제하여, 표기 화합물 (2.22 g, 5.7 mmol, 83 %) 을 얻었다.

(공정 7)

2R-히드록시-1S-[4R-(2-메틸프로필)-5-옥소테트라히드로푸란-2S-일]프로필카르밤산 tert-부틸에스테르 (화합물 7)

화합물 6 (1.30 g, 3.36 mmol) 을 메탄올 (120 ㎖) 및 0.1N-염산 (30 ㎖) 에 녹여, 교반하면서 10 % 팔라듐-탄소 (0.9 g) 를 첨가하였다. 수소 가스를 채운 풍선을 사용하여 반응계 중을 수소 치환하고, 실온에서 철야 교반하였다. 반응 혼합물을 셀라이트 패드로 여과하고, 여과액을 농축하였다. 잔류물을 아세트산에틸 (300 ㎖) 에 녹여, 물 (90 ㎖) 및 탄산수소나트륨 (1.68 g, 20 mmol) 을 첨가하고, 빙욕 중에서 10 분간 교반하였다. 반응계 중에 Boc₂O (800 mg, 3.67 mmol) 를 천천히 적하하고, 빙욕 중에서 6 시간 교반하고, 추가로 실온에서 철야 교반하였다. 반응 혼합물에 클로로포름을 첨가하고, 포화 탄산수소나트륨 수용액으로 세정하였다. 유기층을 무수 황산 마그네슘으로 건조시켜, 감압하에서, 용매를 증류 제거한 후, 실리카겔 칼럼 크로마토그래프법 (hexane ： AcOEt = 4 ： 1 에서 2 ： 1) 으로 정제하여, 표기 화합물 (0.62 g, 1.97 mmol, 59 % 2 steps) 을 얻었다.

(공정 8)

2R-(tert-부틸디메틸실릴옥시)-1S-[4R-(2-메틸프로필)-5-옥소테트라히드로푸란-2S-일]프로필카르밤산 tert-부틸에스테르 (화합물 8)

화합물 7 (0.62 g, 1.97 mmol) 을 DMF (100 ㎖) 에 녹여, 이미다졸 (2.7 g, 40 mmol), DMAP (24 mg, 0.2 mmol) 및 t-부틸디메틸클로로실란 (3.0 g, 20 mmol) 을 첨가하고, 50 ℃ 에서 5 시간 교반하였다. 반응 혼합물을 실온으로 되돌리고, 메탄올을 첨가하고, 0.5 시간 교반하였다. 감압하에서, 용매를 증류 제거한 후, 반응 혼합물에 클로로포름을 첨가하고, 시트르산 수용액 및 포화 식염수로 세정하였다. 유기층을 무수 황산 마그네슘으로 건조시켜, 감압하에서, 용매를 증류 제거한 후, 실리카겔 칼럼 크로마토그래프법 (hexane ： AcOEt = 8 ： 1) 으로 정제하여, 표기 화합물 (0.81 g, 1.89 mmol, 96 %) 을 얻었다.

(공정 9)

아세트산[5S-(tert-부톡시카르보닐아미노)-6R-(tert-부틸디메틸실릴옥시)-4S-히드록시-2R-(2-메틸프로필)헵틸]에스테르 (화합물 9)

화합물 8 (0.81 g, 1.89 mmol) 을 THF (11 ㎖) 및 에탄올 (11 ㎖) 에 녹여, 염화칼슘 (420 mg, 3.8 mmol) 을 첨가하고, 빙욕 중에서 15 분간 교반한 후, NaBH₄ (290 mg, 7.6 mmol) 를 첨가하고, 빙욕 중에서 3 시간 교반하였다. 반응 혼합물을 빙욕 중에서 차게 하면서 1M KHSO₄ 수용액을 첨가하고, 15 분간 교반한 후, 아세트산에틸로 추출하였다. 유기층을 포화 탄산수소나트륨 수용액으로 세정한 후, 무수 황산 마그네슘으로 건조시켜, 감압하에서, 용매를 증류 제거하여, 디올체 (0.85 g) 를 얻었다. 아르곤 분위기하에서, 디올체 (0.85 g) 를 염화메틸렌 (50 ㎖) 에 녹여, 빙욕 중에서 10 분간 교반한 후, 트리에틸아민 (273 mg, 2.7 mmol) 및 아세틸클로라이드 (212 mg, 2.7 mmol) 를 첨가하고, 빙욕에서 3 시간 교반하였다. 반응 혼합물에 메탄올 (1 ㎖) 을 첨가하고, 10 분간 교반한 후, 용매를 증류 제거하여, 실리카겔 칼럼 크로마토그래프법 (hexane ： AcOEt = 8 ： 1 에서 6 ： 1) 으로 정제하여, 표기 화합물 (0.66 g, 1.39 mmol, 73 % 2 steps) 을 얻었다.

(공정 10)

아세트산[4S,6R-비스(tert-부틸디메틸실릴옥시)-5S-(tert-부톡시카르보닐아미노)-2R-(2-메틸프로필)헵틸]에스테르 (화합물 10)

아르곤 분위기하에서, 화합물 9 (0.66 g, 1.39 mmol) 를 염화메틸렌 (20 ㎖) 에 녹여, 2,6-루티딘 (500 mg, 4.7 mmol) 및 t-부틸디메틸실릴트리플루오로메탄술포네이트 (0.53 ㎖, 2.3 mmol) 를 첨가하고, 실온에서 3 시간 교반하였다. 반응 혼합물에 포화 식염수를 첨가하여 클로로포름으로 추출하였다. 유기층을 무수 황산 마그네슘으로 건조시켜, 감압하에서, 용매를 증류 제거한 후, 실리카겔 칼럼 크로마토그래프법 (hexane ： AcOEt = 9 ： 1) 으로 정제하여, 표기 화합물 (0.55 g, 0.93 mmol, 67 %) 을 얻었다.

(공정 11)

1S-(1R-tert-부틸디메틸실릴옥시에틸)-2S-(tert-부틸디메틸실릴옥시)-4R-히드록시메틸-6-메틸헵틸카르밤산 tert-부틸에스테르 (화합물 11)

화합물 10 (0.10 g, 0.17 mmol) 을 THF (4 ㎖) 및 에탄올 (4 ㎖) 에 녹여, 염화칼슘 (114 mg, 1.0 mmol) 을 첨가하고, 빙욕 중에서 15 분간 교반한 후, NaBH₄ (78 mg, 2.0 mmol) 를 첨가하고, 빙욕 중에서 1 시간, 추가로 실온에서 24 시간 교반하였다. 반응 혼합물을 빙욕 중에서 차게 하면서 1M KHSO₄ 수용액을 첨가하고, 15 분간 교반한 후, 아세트산에틸로 추출하였다. 유기층을 포화 탄산수소나트륨 수용액으로 세정한 후, 무수 황산 마그네슘으로 건조시켜, 감압하에서, 용매를 증류 제거하고, 실리카겔 칼럼 크로마토그래프법 (hexane ： AcOEt = 8 ： 1) 으로 정제하여, 표기 화합물 (0.09 g, 0.16 mmol, 97 %) 을 얻었다.

(공정 12)

4S,6R-비스(tert-부틸디메틸실릴옥시)-5S-(tert-부톡시카르보닐아미노)-2R-(2-메틸프로필)헵탄산 (화합물 12)

화합물 11 (0.36 g, 0.66 mmol) 을 아세토니트릴 (4 ㎖) 과 4 염화탄소 (4 ㎖) 에 녹여, 물 (6 ㎖) 및 과요오드산 나트륨 (0.55 g, 2.56 mmol) 을 첨가하고, 실온에서 5 분간 교반한 후, 염화루테늄·nH₂O (20 mg) 를 첨가하고, 추가로 실온에서 3 시간 격렬하게 교반하였다. 반응 혼합물에 물과 클로로포름을 첨가하고, 유기층을 분리한 후, 셀라이트 패드로 여과하고, 여과액을 포화 식염수로 세정하였다. 유기층을 무수 황산 마그네슘으로 건조시켜, 감압하에서, 용매를 증류 제거하고, 표기 화합물 (0.37 g) 을 얻었다. 그대로 다음의 반응에 사용하였다.

(공정 13)

4S,6R-비스(tert-부틸디메틸실릴옥시)-5S-(tert-부톡시카르보닐아미노)-2R-(2-메틸프로필)헵탄산 1S-히드록시메틸-2-메틸프로필아미드 (화합물 13)

화합물 12 (0.37 g) 와 L-발리놀 (83 mg, 0.80 mmol) 을 DMF (30 ㎖) 에 녹여, 빙욕 중에서 10 분간 교반한 후, 디에틸시아노포스포네이트 (DEPC, 130 mg, 0.830 mmol) 및 디이소프로필에틸아민 (103 mg, 0.80 mmol) 을 첨가하고, 빙욕 중에서 1 시간 추가로 실온에서 철야 교반하였다. 반응 혼합물에 아세트산에틸을 첨가하고, 황산수소칼륨 수용액, 물 및 포화 탄산수소나트륨 수용액으로 순서대로 세정하였다. 유기층을 무수 황산 마그네슘으로 건조시켜, 감압하에서, 용매를 증류 제거한 후, 실리카겔 칼럼 크로마토그래프법 (CHCl₃ ：MeOH = 98 ： 2) 으로 정제를 실시하여, 표기 화합물 (0.39 g, 0.60 mmol, 91 % 2 steps) 을 얻었다.

(공정 14)

[4S,6R-비스(tert-부틸디메틸실릴옥시)-5S-(tert-부톡시카르보닐아미노)-2R-(2-메틸프로필)헵타노일]-L-발린 (화합물 14)

화합물 13 (0.39 g, 0.60 mmol) 을 아세토니트릴 (3.2 ㎖) 과 4 염화탄소 (3.2 ㎖) 에 녹여, 물 (4.8 ㎖) 및 과요오드산 나트륨 (496 mg, 2.32 mmol) 을 첨가하고, 실온에서 5 분간 교반한 후, 염화루테늄·nH₂O (4 mg) 를 첨가하고, 추가로 실온에서 3 시간 격렬하게 교반하였다. 반응 혼합물에 물과 클로로포름을 첨가하고, 유기층을 분리한 후, 셀라이트 패드로 여과하고, 여과액을 포화 식염수로 세정하였다. 유기층을 무수 황산 마그네슘으로 건조시켜, 감압하에서, 용매를 증류 제거하고, 표기 화합물 (0.33 g, 83 %) 을 얻었다. 그대로 다음의 반응에 사용하였다.

(공정 15)

[4S,6R-비스(tert-부틸디메틸실릴옥시)-5S-(tert-부톡시카르보닐아미노)-2R-(2-메틸프로필)헵타노일]-L-발릴-L-메티오닌 벤질아미드 (화합물 15)

아르곤 분위기하에서, 화합물 14 (0.18 g, 0.27 mmol) 와 H-Met-NHBn 을 THF에 (4 ㎖) 녹여, 교반하면서 4-(4,6-디메톡시-1,3,5,-트리아진-2-일)-4-메틸모르폴리늄클로라이드 (DMT-MM nH₂O, 125 mg) 를 첨가하고, 실온에서 철야 교반하였다. 반응 혼합물에 아세트산에틸을 첨가하고, 황산수소칼륨 수용액 및 포화 식염수로 순서대로 세정하였다. 유기층을 무수 황산 마그네슘으로 건조시켜, 감압하에서, 용매를 증류 제거한 후, 실리카겔 칼럼 크로마토그래프법 (CHCl₃ ：MeOH = 98 ： 2) 으로 정제를 실시하여, 표기 화합물 (0.14 g, 0.15 mmol, 67 %) 을 얻었다.

(공정 16)

[5S-(tert-부톡시카르보닐아미노)-4S,6R-디히드록시-2R-(2-메틸프로필)헵타노일]-L-발릴-L-메티오닌 벤질아미드 (TLVM-4)

화합물 15 (0.15 g, 0.17 mmol) 를 THF (3 ㎖) 에 녹여, 아세트산 (80 mg) 을 첨가한 후, 테트라부틸암모늄플루오라이드·nH₂O (TBAF, 0.47 g) 를 첨가하고, 실온에서 8 일간 교반하였다. 반응 혼합물에 클로로포름을 첨가하고, 실리카겔 칼럼 크로마토그래프법 (CHCl₃ ：MeOH = 97 ： 3) 으로 정제를 실시하여, 표기 화합물 (0.06 g, 0.092 mmol, 81 %) 을 얻었다.

실시예 2

[5S-(tert-부톡시카르보닐아미노)-4R,6R-디히드록시-2R-(2-메틸프로필)헵타노일]-L-발릴-L-메티오닌 벤질아미드 (TLVM-5) 의 제조

(공정 1)

1S-[4R-(2-메틸프로필)-5-옥소테트라히드로푸란-2S-일]-2R-트리에틸실릴옥시-프로필카르밤산 tert-부틸에스테르 (화합물 16)

화합물 10 의 합성과 동일한 방법으로 화합물 7 (2.00 g, 6.3 mmol) 과 트리에틸실릴트리플루오로메탄술포네이트 (2.64 g, 10 mmol) 로부터 표기 화합물 (1.73 g, 4.0 mmol, 85 %) 을 얻었다.

(공정 2)

아세트산[5S-(tert-부톡시카르보닐아미노)-4S-히드록시-2R-(2-메틸프로필)-6R-트리에틸실릴옥시헵틸]에스테르 (화합물 17)

화합물 9 의 합성과 동일한 방법으로 화합물 16 (1.73 g, 4.0 mmol) 으로부터 표기 화합물 (1.73 g, 3.6 mmol, 91 % 2 steps) 을 얻었다.

(공정 3)

아세트산[5S-(tert-부톡시카르보닐아미노)-2R-(2-메틸프로필)-4-옥소-6R-트리에틸실릴옥시헵틸]에스테르 (화합물 18)

화합물 17 (1.73 g, 3.6 mmol) 을 염화메틸렌 (20 ㎖) 에 녹여, Dess-Martin 시약 (DMP, 1.7 g, 4.0 mmol) 을 첨가한 후, 물을 포화시킨 염화메틸렌 (2 ㎖) 을 천천히 첨가하고, 실온에서 3 시간 교반하였다. 반응 혼합물에 티오황산나트륨 수용액을 첨가하여 클로로포름으로 추출하였다. 유기층을 무수 황산 마그네슘으로 건조시켜, 감압하에서, 용매를 증류 제거한 후, 실리카겔 칼럼 크로마토그래프법 (hexane ： AcOEt = 9 ： 1) 으로 정제하여, 표기 화합물 (1.44 g, 3.0 mmol, 84 %) 을 얻었다.

(공정 4)

아세트산[5S-(tert-부톡시카르보닐아미노)-6R-히드록시-2R-(2-메틸프로필)-4-옥소헵틸]에스테르 (화합물 19)

화합물 18 (0.25 g, 0.53 mmol) 을 THF (4 ㎖) 에 녹여, 물 (1 ㎖) 및 아세트산 (4 ㎖) 을 첨가하고, 실온에서 5 시간 교반하였다. 반응 혼합물에 포화 탄산수소나트륨 수용액을 주의 깊게 첨가하고, 기체의 발생이 안정된 후, 클로로포름으로 추출하였다. 유기층을 무수 황산 마그네슘으로 건조시켜, 감압하에서, 용매를 증류 제거하고, 표기 화합물 (0.24 g) 을 얻었다.

(공정 5)

아세트산 2R-[5S-(tert-부톡시카르보닐아미노)-2,2-디메틸-6R-메틸-1,3-디옥산-4R-일]메틸-4-메틸펜틸에스테르 (화합물 20)

화합물 19 (0.24 g) 를 THF (5 ㎖) 에 녹여, 빙욕 중에서 10 분간 교반한 후, NaBH(OAc)₃(318 mg, 1.5 mmol) 의 THF (3 ㎖) 와 아세트산 (0.3 ㎖) 의 현탁액을 첨가하고, 빙욕에서 1 시간, 실온에서 3 시간 교반하였다. 반응 혼합물에 아세트산 칼륨 수용액을 첨가하고, 10 분간 교반한 후, 포화 식염수를 첨가하여 클로로포름으로 추출하였다. 유기층을 무수 황산 마그네슘으로 건조시켜, 감압하에서, 용매를 증류 제거하였다. 잔류물을 톨루엔 (30 ㎖) 에 녹여, 2-메톡시프로펜 (1.2 ㎖) 과 PPTS (30 mg) 를 첨가하고, 70 ℃ 에서 3 시간 교반하였다. 톨루엔을 증류 제거한 후, 잔류물에 클로로포름을 첨가하고, 포화 탄산수소나트륨 수용액으로 세정하였다. 유기층을 무수 황산 마그네슘으로 건조시켜, 감압하에서, 용매를 증류 제거한 후, 실리카겔 칼럼 크로마토그래프법 (hexane ： AcOEt = 9 ： 1 에서 6 ： 1) 으로 정제하여, 표기 화합물 (0.09 g, 0.22 mmol, 42 % 3 steps) 과 5 원자 고리형의 보호체 (0.08 g) 를 얻었다.

(공정 6)

[2,2-디메틸-4R-(2R-히드록시메틸-4-메틸펜틸)-6R-메틸-1,3-디옥산-5S-일]카르밤산 tert-부틸에스테르 (화합물 21)

화합물 11 의 합성과 동일한 방법으로 화합물 20 (0.12 g, 0.30 mmol) 으로부터 표기 화합물 (0.12 g) 을 얻었다. 그대로 다음의 반응에 사용하였다.

(공정 7)

2R-[5S-(tert-부톡시카르보닐아미노)-2,2-디메틸-6R-메틸-1,3-디옥산-4R-일]메틸-4-메틸발레르산 (화합물 22)

화합물 12 의 합성과 동일한 방법으로 화합물 21 (0.43 g) 로부터 표기 화합물 (0.38 g, 1.0 mmol, 95 % 2 steps) 을 얻었다.

(공정 8)

2R-[5S-(tert-부톡시카르보닐아미노)-2,2-디메틸-6R-메틸-1,3-디옥산-4R-일]메틸-4-메틸펜타노일-L-발릴-L-메티오닌 벤질아미드 (화합물 23)

화합물 15 의 합성과 동일한 방법으로 화합물 22 (0.11 g, 0.29 mmol) 와 H-Val-Met-NHBn 으로부터 표기 화합물 (0.10 g, 0.14 mmol, 48 %) 을 얻었다.

(공정 9)

[5S-(tert-부톡시카르보닐아미노)-4R,6R-디히드록시-2R-(2-메틸프로필)헵타노일]-L-발릴-L-메티오닌 벤질아미드 (TLVM-5)

화합물 23 (0.10 g, 0.14 mmol) 을 메탄올 (20 ㎖) 에 녹여, PPTS (20 mg) 를 첨가한 후, 40 ℃ 에서 24 시간 교반하였다. 감압하에서, 메탄올을 증류 제거한 후, 잔류물을 실리카겔 칼럼 크로마토그래프법 (CHCl₃ ：MeOH = 98 ： 2) 으로 정제하여, 표기 화합물 (0.07 g, 0.107 mmol, 77 %) 을 얻었다.

실시예 3

[5S-(tert-부톡시카르보닐아미노)-4R,6R-디히드록시-2R-(2-메틸프로필)헵타노일]-L-발릴-L-메티오닌 n-부틸아미드 (TLVM-7) 의 제조

(공정 1)

2R-[5S-(tert-부톡시카르보닐아미노)-2,2-디메틸-6R-메틸-1,3-디옥산-4R-일]메틸-4-메틸펜타노일-L-발릴-L-메티오닌 n-부틸아미드 (화합물 24)

화합물 15 의 합성과 동일한 방법으로 화합물 22 (0.08 g, 0.21 mmol) 와 H-Val-Met-NH-n-Pr 로부터 표기 화합물 (0.17 g) 을 얻었다.

(공정 2)

[5S-(tert-부톡시카르보닐아미노)-4R,6R-디히드록시-2R-(2-메틸프로필)헵타노일]-L-발릴-L-메티오닌 n-부틸아미드 (TLVM-7)

TLVM-5 의 합성과 동일한 방법으로 화합물 24 (0.16 g) 로부터 표기 화합물 (0.07 g, 0.11 mmol, 54 % 2 steps) 을 얻었다.

실시예 4

-메틸벤질아미드 (TLVM-8) 의 제조

(공정 1)

2R-[5S-(tert-부톡시카르보닐아미노)-2,2-디메틸-6R-메틸-1,3-디옥산-4R-일]메틸-4-메틸펜타노일-L-발릴-L-메티오닌 (S)-

-메틸벤질아미드 (화합물 25)

화합물 15 의 합성과 동일한 방법으로 화합물 22 (0.07 g, 0.19 mmol) 와 H-Val-Met-NH-(S)-CH(Me)Ph 로부터 표기 화합물 (0.12 g) 을 얻었다.

(공정 2)

-메틸벤질아미드 (TLVM-8)

TLVM-5 의 합성과 동일한 방법으로 화합물 25 (0.12 g) 로부터 표기 화합물 (0.08 g, 0.12 mmol, 63 % 2 steps) 을 얻었다.

실시예 5

[5S-(tert-부톡시카르보닐아미노)-4R,6R-디히드록시-2R-(2-메틸프로필)헵타노일]-L-발릴-L-메티오닌 4-플루오로벤질아미드 (TLVM-9) 의 제조

(공정 1)

2R-[5S-(tert-부톡시카르보닐아미노)-2,2-디메틸-6R-메틸-1,3-디옥산-4R-일]메틸-4-메틸펜타노일-L-발릴-L-메티오닌 4-플루오로벤질아미드 (화합물 26)

화합물 15 의 합성과 동일한 방법으로 화합물 22 (0.08 g, 0.21 mmol) 와 H-Val-Met-NH-p-F-Bn 으로부터 표기 화합물 (0.16 g) 을 얻었다.

(공정 2)

[5S-(tert-부톡시카르보닐아미노)-4R,6R-디히드록시-2R-(2-메틸프로필)헵타노일]-L-발릴-L-메티오닌 4-플루오로벤질아미드 (TLVM-9)

TLVM-5 의 합성과 동일한 방법으로 화합물 26 (0.16 g) 으로부터 표기 화합물 (0.09 g, 0.13 mmol, 64 % 2 steps) 을 얻었다.

실시예 6

[5S-(tert-부톡시카르보닐아미노)-4R,6R-디히드록시-2R-(2-메틸프로필)헵타노일]-L-알라닐-L-메티오닌 벤질아미드 (TLVM-10) 의 제조

(공정 1)

2R-[5S-(tert-부톡시카르보닐아미노)-2,2-디메틸-6R-메틸-1,3-디옥산-4R-일]메틸-4-메틸펜타노일-L-알라닐-L-메티오닌 벤질아미드 (화합물 27)

화합물 15 의 합성과 동일한 방법으로 화합물 22 (0.04 g, 0.11 mmol) 와 H-Ala-Met-NH-Bn 으로부터 표기 화합물 (0.04 g, 0.06 mmol, 55 %) 을 얻었다.

(공정 2)

[5S-(tert-부톡시카르보닐아미노)-4R,6R-디히드록시-2R-(2-메틸프로필)헵타노일]-L-알라닐-L-메티오닌 벤질아미드 (TLVM-10)

TLVM-5 의 합성과 동일한 방법으로 화합물 27 (0.04 g) 로부터 표기 화합물 (0.01 g, 0.016 mmol, 27 %) 을 얻었다.

실시예 7

[5S-(tert-부톡시카르보닐아미노)-4R,6R-디히드록시-2R-(2-메틸프로필)헵타노일]-L-페닐글리실-L-메티오닌 벤질아미드 (TLVM-11) 의 제조

(공정 1)

2R-[5S-(tert-부톡시카르보닐아미노)-2,2-디메틸-6R-메틸-1,3-디옥산-4R-일]메틸-4-메틸펜타노일-L-페닐글리실-L-메티오닌 벤질아미드 (화합물 28)

화합물 15 의 합성과 동일한 방법으로 화합물 22 (0.13 g, 0.35 mmol) 와 H-Phg-Met-NH-Bn 으로부터 표기 화합물 (0.12 g, 0.17 mmol, 79 %) 을 얻었다.

(공정 2)

[5S-(tert-부톡시카르보닐아미노)-4R,6R-디히드록시-2R-(2-메틸프로필)헵타노일]-L-페닐글리실-L-메티오닌 벤질아미드 (TLVM-11)

TLVM-5 의 합성과 동일한 방법으로 화합물 28 (0.12 g, 0.17 mmol) 로부터 표기 화합물 (0.06 g, 0.09 mmol, 51 %) 을 얻었다.

실시예 8 γ 세크레타아제 저해 작용의 검토 (I)

(1) 시험 방법

HEK293 세포 (ATCC 사) 에 APP C99 pcDNA3.1 (그 코드 영역의 염기 배열을 배열 번호 1 에 나타낸다) (J. Biol. Chem., 2003, 278, 49448-49458) 을 도입하여 APP-C99 (APP 로부터 Aβ 가 생성되는 2 단계 반응의 제 1 단계에 있어서,

혹은β 세크레타아제에 의해 절제되는 폴리펩티드 부분이 미리 결여된 APP 인공 단편) 를 안정적으로 발현시키는 것이 확인된 세포주 (C99 세포) 를 사용하여, 4 종류의 피험 물질 (TLVM-5, 7, 8, 9) 의 γ 세크레타아제 저해 작용에 대해 in vitro 에서 검토하였다.

본 시험에서, C99 세포의 배지로는 Dulbecco＇s Modified Eagle＇s Medium (DMEM, Sigma Aldrich 사) 500 ㎖ 에, 소태아혈청 (Biosource 사) 55 ㎖, MEM 비필수 아미노산 (Gibco 사) 5.5 ㎖ 및 페니실린/스트렙토마이신 (Gibco 사) 5.5 ㎖ 를 첨가한 것을 사용하였다.

C99 세포를 5 × 10⁴ cells/㎖ 가 되도록 배지에 현탁하여, 1 ㎖ (5 × 10⁴ cells)/well 씩 24 웰 콜라겐 플레이트 (아키타 스미토모베이크사) 에 첨가하고, 3 일간 배양한 후, 웰 내의 배지를 제거하고, 배지 1 ㎖/well 로 웰 내를 세정하였다. 배지를 제거 후, 새로운 배지 0.4 ㎖/well 을 첨가하였다. 피험 물질 및 양성 대조 물질에 폭로하여 24 시간 인큐베이트하고, 배양 상청을 채취하였다. 양성 대조 물질로는 L-685, 458 (CALBIOCHEM 사) 및 특허 문헌 1 (WO 03/091278호) 의 실시예 1 에 개시되어 있는 Boc-Leu-Val-Met-Leu-OMe (이하, LVML-1 이라고 한다) 를 사용하였다. 폭로 농도는 모든 피험 물질 및 양성 대조 물질에 대해 0.3, 1, 3 및 10 μmol/ℓ 의 4 농도를 설정하였다. 배지 상청 중의 Aβ (1-40) 및 Aβ (1-42) 의 농도를 Human Amyloidβ (1-40) (N) 측정 키트 (L)-IBL 및 Human Amyloidβ (1-42) (N) 측정 키트 (L)-IBL (면역 생물 연구소) 을 사용하여 측정하였다. C99 세포를 파종하기 전의 배지에 원래 함유되어 있는 Aβ (1-40) 및 Aβ (1-42) 농도를 공제하고, 각각의 분비량을 산출하였다. 또, 음성 대조 (5 % DMSO 함유 배지, 최종 농도로 1 % DMSO 가 된다) 의 Aβ 분비율을 100 % 로 하여 피험 물질 및 양성 대조의 각 농도에서의 Aβ 분비율을 산출하였다.

(2) 결과

표 1 ∼ 3 에 나타내는 바와 같이, TLVM-5, 7, 8 및 9 는 양성 대조 물질인 L-685, 458 및 LVML-1 보다 현격히 강한 γ 세크레타아제 저해 작용을 나타냈다.

또, 특허 문헌 1 (WO 03/091278) 의 실시예 6 에는, Thr-Leu-Val-Met 형 화합물 (1＇a) 의 Aβ40 생성에 대한 저해율 (폭로 농도 10 μM) 이 73 % 임이 개시되어 있다. 한편, 표 1 에 나타내는 바와 같이, TLVM-5, 7, 8 및 9 의 Aβ40 의 분비율 (폭로 농도 10 μM) 은 3 % 이하 (저해율로서 97 % 이상) 이며, 나아가서는 보다 낮은 농도역 (폭로 농도 0.3 μM) 에서도 분비율 24 % 이하 (저해율로서 76 % 이상) 의 활성을 유지하고 있고, 본 발명의 화합물이 종래 화합물과 비교하여 매우 우수한 γ 세크레타아제 저해 작용을 발휘하는 것이 확인되었다.

실시예 9 γ 세크레타아제 저해 작용의 검토 (Ⅱ)

(1) 시험 방법

실시예 8 에 있어서, γ 세크레타아제 활성에 대한 강한 저해 활성이 확인된 TLVM-5, 7, 8, 9 에 대해서는 저농도에서의 추가 실험을 하였다 (폭로 농도 ： 피험 물질에 대해서는 0.03, 0.1 및 0.3 μmol/ℓ 의 3 농도, 양성 대조에 대해서는 0.1, 0.3, 1 및 3 μmol/ℓ 의 4 농도를 설정).

또, Aβ 분비를 50 % 저해시켰을 때의 피험 물질 농도 (IC₅₀) 를 사이에 둔 2 농도의 Aβ 분비율을 사용하여 다음 식으로부터 IC₅₀ 을 산출하였다.

IC₅₀ ₌10^[ ^LOG ^{(A/B)*(50-C)/(D-C)+LOG(B)]}

A ： 50 % 저해를 사이에 둔 2 점의 고농도측의 피험 물질 농도

B ： 50 % 저해를 사이에 둔 2 점의 저농도측의 피험 물질 농도

C ： B 에서의 분비율 (%)

D ： A 에서의 분비율 (%)

(2) 결과

표 4 ∼ 6 에 나타내는 바와 같이, TLVM-5, 7, 8 및 9 는 저농도역 (0.03 ∼ 0.3 μmol/ℓ) 에서도 우수한 γ 세크레타아제 저해 작용을 보였다.

피험 물질 (TLVM-5, 7, 8 및 9) 의 Aβ (1-40) 및 Aβ (1-42) 에 대한 IC₅₀ 은 각각 0.033 ∼ 0.089 μmol/ℓ (양성 대조 ： 1.8 μmol/ℓ), 0.11 ∼ 0.29 μmol/ℓ (양성 대조 ： 1.7 μmol/ℓ) 이고, 양성 대조와 비교하여 현격히 강한 효과를 발휘하였다.

실시예 10 세포 독성의 측정

(1) 시험 방법

이하에 나타내는 방법을 사용하여, 4 종류의 피험 물질 (TLVM-5, 7, 8, 9) 의 C99 세포에 대한 세포 독성을 측정하였다.

본 시험에 있어서, C99 세포의 배지로는 Dulbecco＇s Modified Eagle＇s Medium (DMEM, Sigma Aldrich 사) 500 ㎖ 에, 소태아혈청 (Biosource 사) 55 ㎖, MEM 비필수 아미노산 (Gibco 사) 5.5 ㎖ 및 페니실린/스트렙토마이신 (Gibco 사) 5.5 ㎖ 를 첨가한 것을 사용하였다.

C99 세포를 0.75 × 10⁵ cells/㎖ 가 되도록 배지에 현탁하여, 100 ㎕ (0.75 × 10⁴ cells)/well 씩 96 웰 콜라겐 플레이트 (아키타 스미토모베이크사) 에 첨가하고, 2 일간 배양한 후, 웰 내의 배지 50 ㎕/well 을 제거하고, 새로운 배지 30 ㎕/well 을 첨가하였다. 피험 물질 20 ㎕/well (최종 농도는 0.3, 1, 3, 10, 30 및 100 μmol/ℓ) 에 24 시간 폭로한 후, Cell Counting Kit-8 (도우진 화학 연구소) 을 사용하여 세포 생존율을 측정하였다.

(2) 결과

표 7 에 나타내는 바와 같이, 30 μmol/ℓ 이상의 농도에서 세포 생존율을 저하시키는 피험 물질이 산견되었는데, 본 발명의 실시예에서 사용된 폭로 농도 (10 μmol/ℓ 이하) 에서는 어느 저해제에 대해서도 세포 생존율의 저하는 확인되지 않은 점에서, 본 실시예에 있어서 확인된 γ 세크레타아제 활성 저해 작용은 피험 물질의 세포 독성에서 기인되는 것은 아닌 것으로 판단되었다.

실시예 11 기질 특이성의 검토

(1) 시험 방법

γ 세크레타아제의 기질로서 APP 와 뇌신경 세포에서 공국재화 (共局在化) 하는 것이 알려져 있는 인간 Alcadein (이하, Alc 라고 한다) 을 구성하는 패밀리 중, 세포 외의 1 회째의 절단 사이트 및 γ 세크레타아제에 의한 절단 사이트가 결정되는 Alc

의 인공 단편 (이하, Alc

C150 이라고 한다) 을 사용하여, 본 발명의 γ 세크레타아제 저해제의 기질 특이성을 검토하였다. Alc

의 1 회 절단 컨스트럭트로부터 생성되는 β-Alc

는 Aβ 의 측정에 사용하는 sELISA 법으로는 정량할 수 없기 때문에, Alc

및 C99 의 1 회 절단 컨스트럭트의 N 말단측에 FLAG-택을 붙인 단백을 세포에 발현시켜, 배지 중에 분비된 FLAG-Aβ 형 펩티드를 항 FLAG 항체를 사용한 면역 침강법으로 회수하고, 동일 항체를 사용한 웨스턴 블롯법으로 검출하였다. 구체적인 방법을 이하에 나타낸다.

10 % FCS 를 함유하는 DMEM (와코우 쥰야쿠 공업 주식 회사) 6 ㎖ 로 배양한 HEK 293 세포 (ATCC 사) (1 × 10⁷ cells/10 cm dish) 에 FLAG APP C99 pcDNA 3.1 (그 코드 영역의 염기 배열을 배열 번호 2 에 나타낸다) (J.Biol.Chem., 2003, 278, 49448-49458 (pcDNA3-APP C99 로부터 제조)) 또는 FLAG Alc

C150 pcDNA 3.1 (그 코드 영역의 염기 배열을 배열 번호 3 에 나타낸다) (J.Biol.Chem., 2004, 279, 24343-24354 (pcDNA3Alc

ΔE 와 동일)) 을 리포펙트아민 2000 (Invitrogen 사) 을 사용하여 시약 프로토콜에 따라 도입하여, 각 0.2 또는 2 μmol/ℓ 가 되도록 각 저해제 및 양성 대조 물질 (γ-Secretase Inhibitor IX (DAPT)) (Calbiochem Contact Information 사) 을 첨가하였다. 음성 대조는 동일 용량의 DMSO (와코우 순약 공업 주식 회사) 를 첨가하였다. 24 시간 후, 배양 상청을 회수하여 비즈 (100 ㎕ 의 50 % (v/v) 프로테인-G 세파로스 (GE 헬스케어사)) 로 샘플을 예비 정제한 후, 15 ㎕ 의 50 % (v/v) 항 FLAG 항체 M2 비즈 (Sigma 사) 를 첨가하여, 4 ℃ 에서 1 시간 인큐베이트하였다. 원심 분리하여 비즈를 회수하고, 버퍼 (10 mM 트리스-염산[pH 8.0], 140 mM NaCl, 0.1 % n-옥틸글루코사이드, 0.025 % 아지화나트륨) 로 3 회 세정하고, 배지 중의 Aβ 및 β-Alc

를 회수하였다. 15 % 트리스-트리신 겔 (Anal Biochem., 1987, 166 (2), 368-379) 로 SDS-PAGE 후, 전사하였다. 멤브레인은 PBS 중에서 5 분간 끓인 후, 항 FLAG M2 항체 (5 ㎍/㎖) (Sigma 사) 를 첨가하고, 인큐베이트하여, 웨스턴 블로팅 검출 시약 ECL (GE 헬스케어사) 로 검출하였다. 이 시그널을 Versa-doc system (Bio-rad 사) 으로 정량하고, 단백질 분비율을 산출하였다 (음성 대조의 단백질 분비율을 100 % 로 한다).

(2) 결과

표 8, 9 에 나타낸 바와 같이, TLVM-5, 7, 8, 9 및 11 에 대해서는 0.2 μmol/ℓ, TLVM-10 에 대해서는 2 μmol/ℓ 의 농도로, 세포에 작용시킨 경우, Alc

-C150 의 γ 절단을 저해하지 않고, APP-C99 의 절단을 특이적으로 저해하였다.

특정 농도역에서의 저해 효과에 특이성이 확인된 점에서, 알츠하이머병의 유용한 치료약이 되는 것으로 생각되었다.

<110> Kabushiki Kaisha Yakult Honsha <120> Novel gamma-Secretase inhibitor <130> YK0043 <140> JP 2007-207521 <141> 2007-08-09 <160> 3 <170> PatentIn version 3.1 <210> 1 <211> 357 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 atgctgcccg gtttggcact gctcctgctg gccgcctgga cggctcgggc ggatgcagat 60 gcagaattcc gacatgactc aggatatgaa gttcatcatc aaaaattggt gttctttgca 120 gaagatgtgg gttcaaacaa aggtgcaatc attggactca tggtgggcgg tgttgtcata 180 gcgacagtga tcgtcatcac cttggtgatg ctgaagaaga aacagtacac atccattcat 240 catggtgtgg tggaggttga cgccgctgtc accccagagg agcgccacct gtccaagatg 300 cagcagaacg gctacgaaaa tccaacctac aagttctttg agcagatgca gaactag 357 <210> 2 <211> 378 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 2 atgctgcccg gtttggcact gctcctgctg gccgcctgga cggctcgggc ggatgcagat 60 gcagaattcc gacatgacta caaggacgac gatgacaagt caggatatga agttcatcat 120 caaaaattgg tgttctttgc agaagatgtg ggttcaaaca aaggtgcaat cattggactc 180 atggtgggcg gtgttgtcat agcgacagtg atcgtcatca ccttggtgat gctgaagaag 240 aaacagtaca catccattca tcatggtgtg gtggaggttg acgccgctgt caccccagag 300 gagcgccacc tgtccaagat gcagcagaac ggctacgaaa atccaaccta caagttcttt 360 gagcagatgc agaactag 378 <210> 3 <211> 570 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 3 gccaccatgc tgcgccgccc cgctcccgcg ctggccccgg ccgcccggct gctgctggcc 60 gggctgctgt gcggcggcgg ggtctgggcc gattacaagg atgatgatga caagttcgtg 120 cacccggaac accgctcctt tgttgacctg tcaggccaca acctggccaa cccccacccg 180 ttcgcagtcg tccccagcac tgcgacagtt gtgatcgtgg tgtgcgtcag cttcctggtg 240 ttcatgatta tcctgggggt atttcggatc cgggccgcac atcggcggac catgcgggat 300 caggacaccg ggaaggagaa cgagatggac tgggacgact ctgccctgac catcaccgtc 360 aaccccatgg agacctatga ggaccagcac agcagtgagg aggaggagga agaggaagag 420 gaagaggaaa gcgaggacgg cgaagaagag gatgacatca ccagcgccga gtcggagagc 480 agcgaggagg aggaggggga gcagggcgac ccccagaacg caacccggca gcagcagctg 540 gagtgggatg actccaccct cagctactga 570

Claims

하기 식 (1) 의 화합물 또는 그 약학적으로 허용할 수 있는 염.
[화학식 1]

[식 중, R¹ 은 탄소수 1 ∼ 4 의 직사슬 혹은 분기사슬의 알킬기 또는 페닐기를 나타내고 ； R² 는 1 개 이상의 페닐기 또는 할로게노페닐기에 의해 치환되어 있어도 되는 탄소수 1 ∼ 4 의 직사슬 또는 분기사슬의 알킬기를 나타내고 ； R³ 은 1 개 이상의 수산기를 갖는 탄소수 1 ∼ 4 의 직사슬 또는 분기사슬의 알킬기를 나타내고 ； R⁴ 는 탄소수 1 ∼ 4 의 직사슬 또는 분기사슬의 알킬기를 나타내고, 「*」은 키랄 중심을 나타낸다.]
제 1 항에 있어서,
하기 식 (2) 의 구조를 갖는 화합물 또는 그 약학적으로 허용할 수 있는 염.
[화학식 2]

[식 중, R¹, R², R³ 및 R⁴ 는 상기와 동일하다.]
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
하기 식 (3) 의 구조를 갖는 화합물 또는 그 약학적으로 허용할 수 있는 염.
[화학식 3]

[식 중, R¹ 및 R² 는 상기와 동일하다.]
하기에서 선택되는 화합물 또는 그 약학적으로 허용할 수 있는 염.
[5S-(tert-부톡시카르보닐아미노)-4R,6R-디히드록시-2R-(2-메틸프로필)헵타노일]-L-발릴-L-메티오닌 벤질아미드,
[5S-(tert-부톡시카르보닐아미노)-4R,6R-디히드록시-2R-(2-메틸프로필)헵타노일]-L-발릴-L-메티오닌 n-부틸아미드,
[5S-(tert-부톡시카르보닐아미노)-4R,6R-디히드록시-2R-(2-메틸프로필)헵타노일]-L-발릴-L-메티오닌 (S)--메틸벤질아미드,
[5S-(tert-부톡시카르보닐아미노)-4R,6R-디히드록시-2R-(2-메틸프로필)헵타노일]-L-발릴-L-메티오닌 4-플루오로벤질아미드,
[5S-(tert-부톡시카르보닐아미노)-4R,6R-디히드록시-2R-(2-메틸프로필)헵타노일]-L-알라닐-L-메티오닌 벤질아미드,
[5S-(tert-부톡시카르보닐아미노)-4R,6R-디히드록시-2R-(2-메틸프로필)헵타노일]-L-페닐글리실-L-메티오닌 벤질아미드.
제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 기재된 화합물 또는 그 약학적으로 허용할 수 있는 염을 함유하는 의약.
제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 기재된 화합물 또는 그 약학적으로 허용할 수 있는 염을 함유하는 γ 세크레타아제 저해제.
제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 기재된 화합물 또는 그 약학적으로 허용할 수 있는 염을 함유하는 아밀로이드 단백질 생성 억제제.
제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 기재된 화합물 또는 그 약학적으로 허용할 수 있는 염을 함유하는 γ 세크레타아제가 관여하는 질병의 예방·치료제.
제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 기재된 화합물 또는 그 약학적으로 허용할 수 있는 염의 γ 세크레타아제 저해제 제조를 위한 사용.
제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 기재된 화합물 또는 그 약학적으로 허용할 수 있는 염의 아밀로이드 단백질 생성 억제제 제조를 위한 사용.
제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 기재된 화합물 또는 그 약학적으로 허용할 수 있는 염의 γ 세크레타아제가 관여하는 질병의 예방·치료제 제조를 위한 사용.
제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 기재된 화합물 또는 그 약학적으로 허용할 수 있는 염을 적용하는 것을 특징으로 하는 γ 세크레타아제의 저해 방법.
제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 기재된 화합물 또는 그 약학적으로 허용할 수 있는 염을 적용하는 것을 특징으로 하는 아밀로이드 단백질 생성의 억제 방법.
제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 기재된 화합물 또는 그 약학적으로 허용할 수 있는 염을 투여하는 것을 특징으로 하는 γ 세크레타아제가 관여하는 질병의 예방·치료 방법.