CN101970458B - 新型γ分泌酶抑制剂 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种具有优异的γ分泌酶抑制效果、并且特异地抑制Aβ生成的新型化合物。该化合物是下述式(1)所示的化合物或其药学上可接受的盐。式中，R1表示碳原子数为1～4的直链或支链的烷基或苯基，R2表示可以取代有1个以上的苯基或卤代苯基的碳原子数为1～4的直链或支链的烷基，R3表示可以取代有1个以上的羟基的碳原子数为1～4的直链或支链的烷基，R4表示碳原子数为1～4的直链或支链的烷基，“*”表示手性中心。

Description

新型γ分泌酶抑制剂
技术领域
本发明涉及抑制由淀粉样前体蛋白质产生淀粉样蛋白质的分解酶γ分泌酶的化合物、其药学上可接受的盐以及含有它们的药品。
背景技术
近年来，随着高龄化社会的发展，阿尔茨海默(Alzheimer)型的痴呆患者增加，成为社会问题。
阿尔茨海默型痴呆症的发病被认为与患者脑中出现特征性诊断的作为老年斑的主要构成成分的β淀粉样蛋白质(以下，称为Aβ)的产生亢进或者分解降低而后续产生的凝集和积蓄的过程有很深的关系。
该Aβ由40个至42个/43个疏水性氨基酸所富含的氨基酸构成，通过从作为其前体的淀粉样前体蛋白质(amyloid precursor protein(以下称为APP))水解断裂而产生。另外，APP还存在由695个氨基酸形成的APP(以下称为APP695)、由751个氨基酸形成的APP(以下称为APP751)和由770个氨基酸形成的APP(以下称为APP770)三种。
由APP产生Aβ的反应是两阶段的反应，第一阶段是通过β分泌酶切断细胞外区域的N末端侧，第二阶段通过γ分泌酶切断细胞跨膜区域的C末端侧。
在现有的观点中，认为第二阶段的剪切点产生于Aβ的C末端的γ部位，但是，最近的研究报告了产生于与γ部位相比更靠近下游(C末端方向)5～10个氨基酸残基的细胞质的ε部位(在APP770中称为Thr719-Leu720或Leu720-Val721)。
作为现在已知的γ分泌酶抑制剂，报道了基于该酶发生作用的底物APP的γ部位的肽模拟化合物DFK-167(非专利文献1)，从已知抑制剂中筛选的化合物L-685、458(非专利文献2)、JLK-6(非专利文献3)以及基于ε部位的肽模拟化合物(专利文献1)等。
但是，DFK-167是对γ部位设计的抑制剂，因此，设计目标和结构与最近报道的基于ε部位的研究而完成的完全不同，存在不能得到作为抑制剂的充分效果的问题。
另外，在开发治疗艾滋病的药物的过程中制造的L-685、458和作为α-糜蛋白酶抑制剂的JLK-6，由于原本不是作为对APP的Aβ产生的γ分泌酶的特异性抑制剂开发的化合物，因此对标的组织的有效性不充分，存在γ分泌酶的非特异性的活性抑制可能会引发癌化等的严重的副作用的问题。
另外，在专利文献1中，作为基于ε部位的肽模拟化合物，公开了Thr-Leu-Val-Met型的化合物，但是存在作为抑制剂的效果不充分的问题，实施例中，公开了Thr的羟基被叔丁醚化的Thr-Leu-Val-Met型化合物(1′a)，但是，该化合物可以说只是合成中间体，不是已经完成的Thr-Leu-Val-Met型化合物。
并且，迄今为止，对于Thr的羟基没有被保护的Thr-Leu-Val-Met型化合物、该化合物的γ分泌酶抑制效果的特异性仍然未知。
专利文献1：WO 03/091278号公报
非专利文献1：J.Med.Chem.，1998，41(1)，6-9
非专利文献2：Biochemistry，2000，39(30)，8698-8704
非专利文献3：J.Biol.Chem.，1979，254(10)，4027-4032
发明内容
因此，本发明的课题在于提供一种具有优异的γ-分泌酶抑制效果，并且特异地抑制Aβ生成的新型化合物。
本发明的进一步的课题在于提供一种对于以阿尔茨海默病为代表的类似疾病有效的治疗药物、治疗方法等。这里所说的类似疾病是指以唐氏综合症为代表的、已知Aβ直接或间接作为病因参与的或者怀疑其可能性的疾病，以及Aβ在神经病变中被观察到的疾病。
本发明参照相关的研究成果，并且着眼于APP的ε部位，进行独创性的重复试验，结果发现一种肽类似化合物，其具有类似于含APP的ε部位的4个氨基酸序列(Thr-Leu-Val-Met)的化学结构、作为酶切断部位ε部位的Thr和Leu之间的肽键被对酶稳定的键所代替，该化合物具有特定的结构，能够飞跃性地高效抑制γ分泌酶，抑制Aβ的产生，从而完成了本发明。
即，本发明提供下述式(1)所示的化合物或其药学上可接受的盐。
Figure GPA00001021153000031
[式中，R1表示碳原子数为1～4的直链或支链的烷基或苯基，R2表示可以取代有1个以上的苯基或卤代苯基的碳原子数为1～4的直链或支链的烷基，R3表示可以取代有1个以上的羟基的碳原子数为1～4的直链或支链的烷基，R4表示碳原子数为1～4的直链或支链的烷基，“*”表示手性中心。]
另外，本发明提供一种药品，其含有上述式(1)所示的化合物或其药学上可接受的盐。
另外，本发明提供一种γ分泌酶抑制剂，其含有上述式(1)所示的化合物或其药学上可接受的盐。
另外，本发明提供一种淀粉样蛋白质生成抑制剂，其含有上述式(1)所示的化合物或其药学上可接受的盐。
并且，本发明还提供一种γ分泌酶参与的疾病的预防、治疗剂，其含有上述式(1)所示的化合物或其药学上可接受的盐。
另外，本发明提供上述式(1)所示的化合物或其药学上可接受的盐在制造γ分泌酶抑制剂、淀粉样蛋白质生成抑制剂或γ分泌酶参与的疾病的预防、治疗剂中的使用。
另外，本发明提供一种γ分泌酶的抑制方法、抑制生成淀粉样蛋白质的方法或γ分泌酶参与的疾病的预防、治疗方法，其特征在于：将上述式(1)所示的化合物或其药学上可接受的盐进行给药。
发明效果
本发明的化合物及其药学上可接受的盐能够适用于预防或治疗阿尔茨海默病及其类似疾病，例如，以唐氏综合症为代表的、已知Aβ直接或间接作为病因参与或者怀疑其可能性的疾病，以及Aβ在神经病变中被观察到的疾病。
另外，本发明的化合物及其药学上可接受的盐，具有特异性地抑制Aβ生成的作用，以上述疾病的预防、治疗为目的，能够有效且安全地利用。
具体实施方式
在本发明中，上述式(1)的化合物含有至少5个手性中心(式中，以“*”表示手性中心)，这些手性中心可以是R型、S型的任一种立体结构，因此，可以作为各种对映异构体、非对映异构体存在，这样的化合物的外消旋混合物和各个对映异构体和非对映异构体以及它们的混合物的双方的所有的光学异构体和所有的立体异构体也包含于本发明的范围内。作为异构体，例如可以列举(2R，4R-体)、(2R，4S-体)、(2S，4R-体)、(2S，4S-体)等，但是从强烈抑制γ分泌酶、特异性地抑制Aβ生成的观点出发，特别优选(2R，4R-体)。
在本发明中，R1表示碳原子数为1～4的直链或支链的烷基或苯基，作为碳原子数为1～4的直链或支链的烷基，可以列举甲基、乙基、丙基、异丙基、正丁基、仲丁基、叔丁基等。作为R1，特别优选甲基、异丙基、苯基。
在本发明中，R2表示可以被1个以上的苯基或卤代苯基取代的碳原子数为1～4的直链或支链的烷基，作为碳原子数为1～4的直链或支链的烷基，可以列举甲基、乙基、丙基、异丙基、正丁基、仲丁基、叔丁基等，特别优选甲基、乙基、正丁基。
另外，作为可以被1个以上的苯基取代的碳原子数为1～4的直链或支链的烷基的优选例，可以列举苄基、1-苯基-乙基。
作为卤代苯基中的卤原子，可以列举氟、氯、溴和碘等，优选氟。作为可以被卤代苯基取代的碳原子数为1～4的直链或支链的烷基的一个优选例，可以列举4-氟苄基。
在本发明中，R3表示可以被1个以上的羟基取代的碳原子数为1～4的直链或支链的烷基，具体可以列举1-羟乙基或羟甲基等，特别优选1-羟乙基。
在本发明中，R4表示碳原子数为1～4的直链或支链的烷基，具体可以列举异丁基或仲丁基等，特别优选异丁基。
在本发明中，从强烈抑制γ分泌酶、特异性地抑制Aβ生成的观点出发，更优选下述式(2)所示的化合物或其药学上可接受的盐。
Figure GPA00001021153000051
[式中，R1、R2、R3和R4同上。]
在本发明中，从强烈抑制γ分泌酶、特异性地抑制Aβ生成的观点出发，进一步优选下述式(3)所示的化合物或其药学上可接受的盐。
[式中，R1和R2同上。]
在本发明中，特别优选下列化合物或其药学上可接受的盐：
[5S-(叔丁氧基羰基氨基)-4R，6R-二羟基-2R-(2-甲基丙基)庚酰]-L-缬氨酰-L-蛋氨酸苯甲酰胺(TLVM-5)、
[5S-(叔丁氧基羰基氨基)-4R，6R-二羟基-2R-(2-甲基丙基)庚酰]-L-缬氨酰-L-蛋氨酸正丁酰胺(TLVM-7)、
[5S-(叔丁氧基羰基氨基)-4R，6R-二羟基-2R-(2-甲基丙基)庚酰]-L-缬氨酰-L-蛋氨酸(S)-α-甲基苯甲酰胺(TLVM-8)、
[5S-(叔丁氧基羰基氨基)-4R，6R-二羟基-2R-(2-甲基丙基)庚酰]-L-缬氨酰-L-蛋氨酸-4-氟代苯甲酰胺(TLVM-9)、
[5S-(叔丁氧基羰基氨基)-4R，6R-二羟基-2R-(2-甲基丙基)庚酰]-L-丙氨酰-L-蛋氨酸苯甲酰胺(TLVM-10)、
[5S-(叔丁氧基羰基氨基)-4R，6R-二羟基-2R-(2-甲基丙基)庚酰]-L-苯基甘氨酰-L-蛋氨酸苯甲酰胺(TLVM-11)。
在本发明中，作为药学上可接受的盐，可以列举盐酸盐、硫酸盐、柠檬酸盐、酒石酸盐、乙酸盐、甲磺酸盐、磷酸盐、草酸盐、安息香酸盐、三氟乙酸盐、马来酸盐、富马酸盐、乳酸盐、溴酸盐、碘酸盐、琥珀酸盐、戊二酸盐等的酸加成盐，以及锂盐、钠盐、钾盐、镁盐等的金属盐。
在本发明中，“淀粉样蛋白质生成抑制剂”是指，作为γ分泌酶的底物的各种I型膜蛋白质中，对Aβ的生成具有抑制作用并且对其它的底物膜蛋白质(例如，人Alcadein等)的生成没有抑制作用的化合物。进一步具体而言，是指使用后述的方法(实施例11)求出的(i)Aβ的分泌率在50％以下且(ii)Alcadein的分泌率在60％以上，并且(i)/(ii)为0.8以下、更优选0.4以下的化合物。
本发明的肽模拟化合物，是参照迄今为止关于APP分解物的详细的研究成果，尝试作出假定能够通过对酶的ε部位的稳定化抑制γ分泌酶的活性、并且与ε部位的结构类似且对酶稳定化的化合物而得到的，不仅能够作为突发性阿尔茨海默病的Aβ产生的抑制剂使用，还能够作为早发型家族性阿尔茨海默病的具有遗传变异的Aβ产生的抑制剂使用。
能够将具有与APP的ε部位附近相同的氨基酸序列、并且以使γ分泌酶的切断部位稳定化的方式进行变更的各种肽类似化合物、且具有γ分泌酶抑制活性的化合物用于本发明的目的。例如，用具有R类似特性(疏水性/亲水性、酸性/碱性、有无硫、有无羟基等)的其它氨基酸残基对ε部位附近的某氨基酸残基-NH-CHR-CO-进行取代而得到的化合物、即具有γ分泌酶抑制活性的化合物，就是这种化合物的例子。例如，作为能够取代成Leu的氨基酸，可以列举Ile、Val、Ala、Gly等；作为能够取代成Thr的氨基酸，可以列举Ser等；作为能够取代成Met的氨基酸，可以列举Ala等；作为能够取代成Val的氨基酸，可以列举Leu、Ala、Gly、Ile、叔丁基甘氨酸、正亮氨酸、正缬氨酸、苯基甘氨酸、2-氨基丁酸等。
用于合成本发明的化合物的原料和合成的各步骤中使用的方法是公知的，因此本领域技术人员可以适当进行合成、离析、精制等，从而适当制造目的化合物。另外，通过利用大肠菌、酵母、枯草杆菌、昆虫细胞、动物细胞、植物细胞的自身公知的寄主的基因重组技术，也能够制造本发明的化合物的多肽部分。作为化学合成，例如，能够基于后述的实施例进行，但是，只要能得到目的化合物，可以使用任意方法。例如，可以适当组合进行作为公知方法的Boc(叔丁氧基羰基)反应、DMSO氧化、碱反应、酸性反应、环氧化反应、硅胶柱层析、烷基化反应、皂化反应、加热反应、脱羧反应、缩合反应、反相高速液相色谱、酰化反应、转换反应、异构化反应、复分解反应、加成反应、氧化反应、还原反应、卤化反应、自由基反应、偶联反应、消去反应、硝化反应、磺化反应等。优选采用使本发明的化合物的结构要素部分依次进行反应，适当检测效率和反应物纯度的方法。
本发明的化合物也可以是包括用于促进合成和精制的修饰、用于促进物理、化学稳定性的修饰、对生物体内的代谢的稳定性和不稳定性的条件活化等的活性化修饰、以及包括通过脑血管屏障的使脏器搬运效率亢进和降低的控制修饰的化合物。作为这里所说的控制修饰，表示由Tyr-Gly-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg的11个氨基酸形成的序列。通过包括N末端侧利用肽键结合的该控制序列，该化合物能够使血液通过脑屏障变得容易，能够以更良好的效率到达脑内的目标部位。
本发明的化合物的其它修饰有：乙酰化、酰基化、ADP-核糖化、酰胺化、黄素的共价结合、血红素部分的共价结合、核苷酸或核苷酸衍生物的共价结合、脂质或脂质衍生物的共价结合、磷脂酰肌醇的共价结合、交联、环化、二硫结合、脱甲基化、交联共价形成、胱氨酸形成、焦谷氨酸盐形成、甲酰化、γ-羧基化、糖苷化、GPI锚定化、氢氧化、碘化、甲基化、豆蔻酰化、酸化、蛋白质水解处理、磷酸化、异戊烯化、外消旋化、脂质结合、硫酸化、硒化、精氨酰化的这样的向转移RNA介质的蛋白质中添加氨基酸、泛素化、脱水缩合以及烷氧羰基化等。
另外，为了容易地进行本发明的化合物的检测或精制，或者为了赋予其它的功能，结构的加成、变更、取代在技术上容易实现，因此，这些生成物也包含于本发明的范围中。另外，修饰加成FLAG-tag、β-半乳糖苷酶、碱性磷酸酯酶、IgG等免疫球蛋白Fc片段和GFP等的基因工学方法的生成物也包含于本发明的范围中。
另外，根据需要，能够制作对本发明的化合物的抗体。挑选本发明的化合物及其衍生物或者其分解物，使用它们作为抗原精制抗体。抗原可以是该化合物或者其派生物，例如由4个以下的氨基酸残基构成，优选由3个以下的氨基酸残基构成，更优选由2个氨基酸残基构成。精制也可以组合这些抗原使用。作为抗原，不需要一定是本发明的化合物及其衍生物或其分解物本身，也可以是APP的ε部位附近的一次序列在立体结构上向外部露出构成的化合物。这些抗体只要能够在该部位免疫结合或者能够识别该部位，则种类和量没有特别限定。抗体的结合或识别的有无可以通过公知的抗原抗体反应确定。
抗体的生产通过以下方法实施，将本发明的化合物及其衍生物或其分解物作为抗原，在存在或者不存在佐剂的条件下，以单独或者结合或共存于载体的状态，对该抗原进行体液性应答和/或细胞性应答的免疫诱导。或者通过在培养条件下对淋巴细胞或其前体细胞进行免疫刺激而进行免疫诱导。载体只要是其自身对寄主不发生有害作用，没有特别限定，例如可以使用纤维素、生理盐水、缓冲化生理盐水、右旋糖、水、甘油、乙醇、聚合氨基酸、白蛋白以及它们的混合物等。被免疫的动物优选使用小鼠、大鼠、兔、山羊、马、牛等。可以通过自身公知方法制作血清，通过来自血清的抗体回收法取得多克隆抗体。作为优选的方法，可以列举免疫亲和色谱法。
单克隆抗体的生产可以通过以下方法进行：从进行上述免疫诱导后的动物回收含有抗体活性的组织(例如脾脏或者淋巴结)或者培养细胞，向自身公知的永久增殖性细胞(例如，P3X63Ag8株等的骨髓瘤细胞株)以转化的方法导入。例如，将从上述抗体产生细胞和永久增殖细胞制作的杂交瘤克隆化，挑选产生特异性识别本发明的新型化合物的抗体的杂交瘤，从该杂交瘤的培养液中回收抗体。作为实例，有杂交瘤法(Kohler G.and Milstein C.(1975)Nature 256，495-497)、三源杂交瘤法(Kozbor et al.Immunology Today(1983)4：72)以及EBV法(Cole et al.Monoclonal antibodies and cancer therapy，Alan R.Liss Inc.，(1985)：77-96)中记载的各种方法。
上述抗体能够用于本发明的化合物及其衍生物或其分解物的鉴定、检测、定量或者使用亲和色谱法的该化合物的调制和精制。上述抗体能够使用自身公知的方法改变成为人类型抗体。
具体而言，本发明的化合物及其衍生物或其分解物、以及具有利用它们的特异性抗体使本发明的化合物及其衍生物或其分解物的活性增加的活性的物质，作为Aβ生成抑制药物的筛选中的化合物的标准物，或者作为筛选方法有用。
作为使用本发明的化合物及其衍生物或其分解物的抗体的测定方法，可以列举放射性免疫测定、竞争结合测定、高速液相色谱、蛋白印迹分析以及ELISA测定等以及它们的组合。
本发明的化合物，对阿尔茨海默病及其类似疾病，将有效量加入医药上可接受的载体或单独向患者给药，抑制Aβ产生量，由此，可以用于这些疾病的预防、治疗以及症状的改善。可以对本发明的化合物实施提高该化合物向脑组织的输送效率的适当的制剂化。这里，作为阿尔茨海默病以及类似疾病，可以列举阿尔茨海默病、克雅病(Creutzfeldt-Jakob Disease)、朊蛋白病(Prion Disorder)、肌萎缩性脊髓侧索硬化症(Amyotrophic Lateral Sclerosis)、进行性核上性麻痹(Progressive Supranuclear Palsy)、头部外伤、中风(stroke)、唐氏综合症、胰腺炎、包涵体肌炎(Inclusion Body Myositis)、其它的末梢的淀粉样变性(Amyloidoses)以及糖尿病等。
本发明的化合物可以单独使用其中的一种，或者也可以组合多种使用。并且，也可以并用治疗上有利的其它化合物，该其它化合物的作用机理可以与本发明的化合物相同，也可以不同。含有本发明的化合物的医药组合物的全身给药的优选方式是注射，特别优选静脉注射。也可以使用皮下、肌肉内或者腹腔内的其它注射途径。用于全身给药的其它方法，可以是使用胆汁酸盐或梭链孢酸或者其它的表面活性剂这样的渗透剂的经粘膜或者经皮给药。另外，也可以通过肠溶配方或者胶囊配方等口服给药。这些医药组合物的给药可以是局部的，也可以是膏药、软膏、凝胶等的形态。
使用本发明的γ分泌酶抑制剂的有效成分肽类似化合物时的给药量没有严格的限制。由于根据对象和适用疾病等的各种使用方式得到的效果不同，期望设定适当给药量，其优选的给药量为每日0.01～100g，更优选0.1～10g。
作为这样的制剂，例如可以列举片剂、颗粒剂、散剂、胶囊剂等的固体剂，溶液剂、悬浊剂、乳剂等的液剂，冷冻干燥剂等。这些制剂可以通过制剂上的常用方法进行调制。作为上述的医药用无毒性载体，例如可以列举淀粉、糊精、脂肪酸甘油酯、聚乙二醇、羟乙基淀粉、乙二醇、聚氧乙烯山梨糖醇酐脂肪酸酯、氨基酸、明胶、白蛋白、水、生理盐水等。另外，根据需要，能够适当添加稳定剂、湿润剂、乳化剂、粘合剂、等渗剂、赋形剂等常用的添加剂。
另外，本发明的γ分泌酶抑制剂不仅可以作为上述的医药制剂使用，也可以作为饮食品等使用。此时，饮食品中可以直接含有本发明的肽类似化合物，或者添加各种营养成分。该饮食品可以用作阿尔茨海默病、克雅病、朊蛋白病、肌萎缩性脊髓侧索硬化症、进行性核上性麻痹、头部外伤、中风、唐氏综合症、胰腺炎、包涵体肌炎、其它的末梢的淀粉样变性以及糖尿病等的改善、预防等有用的保健用食品或食品原料，在这些饮食品或其容器上，可以标注具有上述效果的表示。具体而言，在饮食品中配合本发明的γ分泌酶抑制剂时，可以适当使用作为饮食品能够使用的添加剂，使用常用方法成形为适合于食用的形态，例如，颗粒状、粒状、片剂、胶囊、糊状等，也可以添加在各种食品例如火腿、香肠等的肉食加工品、鱼糕(kamaboko)、鱼肠(chikuwa)等的水产加工品、面包、点心、黄油、奶粉、发酵饮食品中使用，也可以添加在水、果汁、牛奶、清凉饮料、茶饮料等的饮料中使用。其中，饮食品也包括动物的饲料。
另外，作为饮食品，适宜使用含有有效成分肽类似化合物的发酵乳、乳酸菌饮料、发酵豆奶、发酵果汁、发酵植物液等的发酵乳制品。这些发酵乳饮食品的制造可以利用常规方法进行制造。例如发酵乳，可以在杀菌后的奶培养基中接种培养乳酸菌和双歧杆菌(bifidobacterium)，对其进行均质化处理从而得到发酵乳基质。接着添加混合另外调制的糖浆溶液和肽类似化合物，使用均质器等进行均质化，并进一步添加香料，从而得到最终制品。这样得到的发酵乳能够制成普通型(plane type)、软质型、果香型、固态、液态等的各种形态的制品。
另外，本发明的γ分泌酶抑制剂能够适用于包括人的所有哺乳动物。
实施例
下面，列举实施例对本发明的内容进行更详细的说明，但是本发明不限于这些实施例。
实施例1[5S-(叔丁氧基羰基氨基)-4S，6R-二羟基-2R-(2-甲基丙基)庚酰]-L-缬氨酰-L-蛋氨酸苯甲酰胺(TLVM-4)的制造
(工序1)
3-苯甲氧基羰基-2，2-二甲基-4S-(N-甲氧基-N-甲基氨基甲酰基)-5R-甲基噁唑烷(化合物1)
将N-Cbz-L-苏氨酸(12.7g，50mmol)、二甲基羟基胺盐酸盐(5.9g，60mmol)和EDC盐酸盐(11.5g，60mmol)溶解在氯仿(350ml)中，加入三乙胺(8.4ml，60mmol)和HOBt·H2O(7.7g，50mmol)，在40℃搅拌6天。在反应混合物中加入乙酸乙酯，用1N盐酸、水和饱和碳酸氢钠水溶液洗净后，使用无水硫酸镁将有机层干燥，在减压条件下蒸馏除去溶剂。将残留物(12.4g)溶解在甲苯(250ml)中，加入2-甲氧基丙烯(35ml)和PPTS(0.39g)，在80℃搅拌2小时。蒸馏除去甲苯后，在残留物中添加氯仿，用饱和碳酸氢钠水溶液洗净。使用无水硫酸镁将有机层干燥，在减压条件下蒸馏除去溶剂后，采用硅胶色层法(己烷(hexane)∶AcOEt＝8∶1～4∶1)进行精制，得到标记化合物(12.2g，36mmol，80％)。
1H-NMR(CDCl3)δ：1.36 and 1.40(3H，2d，J＝6Hz)1.60 and 1.68(3H，2s)1.62 and 1.71(3H，2s)3.02(3H，s)3.24 and 3.26(3H，2s)4.15 and 4.22(1H，2m)4.39 and 4.57(1H，2d，J＝7Hz)4.92 and 5.12(1H，2d，J＝12Hz)5.09 and 5.20(1H，2d，J＝12Hz)7.28-7.38(5H，m)。
(工序2)
3-苯甲氧基羰基-2，2-二甲基-4S-(4-戊烯酰基)-5R-甲基噁唑烷(化合物2)
将化合物1(12.2g，36mmol)溶解在THF(170ml)中，在冰浴中滴入3-丁烯溴化镁(0.5mol/1THF溶液，130ml，65mmol)，在冰浴中搅拌0.5小时后，在室温下搅拌3天。在反应混合物中添加柠檬酸水溶液，搅拌10分钟后，使用氯仿进行萃取。使用无水硫酸镁将有机层干燥，在减压条件下蒸馏除去溶剂后，使用硅胶色层法(己烷∶AcOEt＝9∶1～6∶1)进行精制，得到标记化合物(6.9g，20.8mmol，78％)和未反应的化合物1(3.14g，9.3mmol)。
1H-NMR(CDCl3)δ：1.37 and 1.38(3H，2d，J＝5Hz)1.56 and 1.68(3H，2s)1.57 and 1.62(3H，2s)2.05-2.85(4H，m)3.96-4.15(2H，m)4.88-5.17(2H，m)4.98 and 5.12(1H，2d，J＝12Hz)5.06 and 5.16(1H，2d，J＝12Hz)5.60 and 5.80(1H，2m)7.28-7.38(5H，m)。
(工序3)
4-(3-苯甲氧基羰基-2，2-二甲基-5R-甲基噁唑烷-4S-基)-4-氧丁酸(化合物3)
将化合物2(6.9g，21mmol)溶解在甲苯(105ml)中，加入nBu4NBr(84mg)、水(105ml)和乙酸(21ml)。在冰浴中搅拌10分钟后，加入KMnO4(11.3g，71.4mmol)，在室温下剧烈搅拌5小时。在反应混合物中加入NaHSO3后，在冰浴中加入饱和硫酸氢钾水溶液，将pH调整为1～2。使用氯仿进行萃取，使用无水硫酸镁将有机层干燥，在减压条件下蒸馏除去溶剂后，使用硅胶色层法(己烷∶AcOEt＝8∶1至CHCl3∶MeOH＝97∶3)进行精制，得到标记化合物(5.2g，14.9mmol，83％)和未反应化合物2(1.02g，3.1mmol)。
1H-NMR(CDCl3)δ：1.38 and 1.41(3H，2d，J＝5Hz)1.57 and 1.63(3H，2s)1.58 and 1.68(3H，2s)2.28-3.02(4H，m)4.01-4.15(2H，m)4.94 and 5.11(1H，2d，J＝12Hz)5.10 and 5.16(1H，2d，J＝12Hz)7.28-7.40(5H，m)。
(工序4)
4-(3-苯甲氧基羰基-2，2-二甲基-5R-甲基噁唑烷-4S-基)-4-氧丁酸甲酯(化合物4)
将化合物3(5.2g，15mmol)溶解在甲苯(240ml)中，添加MeOH(60ml)和三甲基硅烷化重氮甲烷(10％己烷溶液，27ml)，在室温下搅拌1小时。向反应混合物中滴下乙酸，确认黄色消失后，在减压条件下蒸馏除去溶剂。使用硅胶色层法(己烷∶AcOEt＝8∶1)进行精制，得到标记化合物(4.6g，12.7mmol，85％)。
1H-NMR(CDCl3)δ：1.41 and 1.42(3H，2d，J＝6Hz)1.57 and 1.63(3H，2s)1.58 and 1.68(3H，2s)2.20-3.00(4H，m)3.64 and 3.70(3H，2s)3.97-4.18(2H，m)4.94 and 5.10(1H，2d，J＝12Hz)5.10 and 5.15(1H，2d，J＝12Hz)7.26-7.38(5H，m)。
(工序5)
3-苯甲氧基羰基-2，2-二甲基-5R-甲基-4S-[5-氧四氢呋喃-2-基]噁唑烷(化合物5)
将化合物4(4.13g，11.4mmol)溶解在MeOH(120ml)中，加入NaBH4(860mg，23mmol)，在室温下搅拌3小时。将反应混合物在减压条件下蒸馏除去溶剂后，加入水，使用氯仿进行萃取。使用无水硫酸镁将有机层干燥，在减压条件下蒸馏除去溶剂。将得到的残留物溶解在甲苯(100ml)中，加入乙酸(3ml)，在回流条件下搅拌4小时。在反应混合物中加入饱和碳酸氢钠水溶液，使用氯仿进行萃取。使用无水硫酸镁将有机层干燥，在减压条件下蒸馏除去溶剂，使用硅胶色层法(己烷∶AcOEt＝3∶1～2∶1)进行精制，得到标记化合物(2.99g，9.00mmol，79％)。
1H-NMR(CDCl3)δ：1.39(3H，d，J＝6Hz)1.53(3H，s)1.59(3H，s)1.95-2.23(2H，m)2.42-2.57(2H，m)3.98-4.16(2H，m)4.79 and 5.06(1H，2m)5.15(2H，s)7.28-7.40(5H，m)。
(工序6)
3-苯甲氧基羰基-2，2-二甲基-5R-甲基-4S-[4R-(2-甲基-2-丙烯基)-5-氧四氢呋喃-2S-基]噁唑烷(化合物6)
在氩氛围下，将化合物5(2.99g，9.0mmol)溶解在THF(50ml)中，在-78℃搅拌20分钟后，加入LiHMDS(1.0M THF溶液，12ml，12mmol)，在-78℃搅拌1小时。使用注射器在反应体系中滴下3-溴-2-甲基丙烯(1.2ml，12mmol)，进一步在-78℃搅拌2小时。在反应混合物中添加柠檬酸水溶液，使用氯仿进行萃取。使用无水硫酸镁将有机层干燥，在减压条件下蒸馏除去溶剂后，使用硅胶色层法(己烷∶AcOEt＝4∶1～3∶1)进行精制，得到标记化合物(2.22g，5.7mmol，83％)。
1H-NMR(CDCl3)δ：1.37(3H，d，J＝6Hz)1.55(3H，m)1.60(3H，s)1.69(3H，s)1.95(1H，m)2.09(1H，m)2.30(1H，m)2.53(1H，m)2.65 and 2.79(1H，2m)3.90-4.13(2H，m)4.68(1H，m)4.81(1H，m)5.11(1H，m)5.15 and 5.18(2H，2s)7.30-7.40(5H，m)。
(工序7)
2R-羟基-1S-[4R-(2-甲基丙基)-5-氧四氢呋喃-2S-基]丙基氨基甲酸叔丁酯(化合物7)
将化合物6(1.30g，3.36mmol)溶解在甲醇(120ml)和0.1N-盐酸(30ml)中，边搅拌边加入10％钯-碳(0.9g)。使用充满氢气的气球，对反应体系进行氢置换，在室温下搅拌过夜。将反应混合物使用硅藻土片(celite pad)进行过滤，将滤液浓缩。将残留物溶解在乙酸乙酯(300ml)中，加入水(90ml)和碳酸氢钠(1.68g，20mmol)，在冰浴中搅拌10分钟。向反应体系中缓慢滴下Boc2O(800mg，3.67mmol)，在冰浴中搅拌6小时，并在室温下搅拌过夜。在反应混合物中添加氯仿，使用饱和碳酸氢钠水溶液进行洗净。使用无水硫酸镁将有机层干燥，在减压条件下蒸馏除去溶剂后，使用硅胶色层法(己烷∶AcOEt＝4∶1～2∶1)进行精制，得到标记化合物(0.62g，1.97mmol，59％2steps)。
1H-NMR(CDCl3)δ：0.90(3H，d，J＝7Hz)0.95(3H，d，J＝6Hz)1.22(3H，d，J＝6Hz)1.34(1H，m)1.45(9H，s)1.62-1.73(2H，m)1.98(1H，m)2.43(1H，m)2.68(1H，m)3.62(1H，m)4.13(1H，m)4.70(1H，m)5.05(1H，d，J＝9Hz，NH)。
(工序8)
2R-(叔丁基二甲基硅烷基氧基)-1S-[4R-(2-甲基丙基)-5-氧四氢呋喃-2S-基]丙基氨基甲酸叔丁酯(化合物8)
将化合物7(0.62g，1.97mmol)溶解在DMF(100ml)中，加入咪唑(2.7g，40mmol)、DMAP(24mg，0.2mmol)和叔丁基二甲基氯硅烷(3.0g，20mmol)，在50℃搅拌5小时。将反应混合物恢复到室温，加入甲醇搅拌0.5小时。在减压条件下蒸馏除去溶剂后，在反应混合物中加入氯仿，使用柠檬酸水溶液和饱和食盐水进行洗净。使用无水硫酸镁将有机层干燥，在减压条件下蒸馏除去溶剂后，使用硅胶色层法(己烷∶AcOEt＝8∶1)进行精制，得到标记化合物(0.81g，1.89mmol，96％)。
1H-NMR(CDCl3)δ：0.07(3H，s)0.08(3H，s)0.88(9H，s)0.89(3H，d，J＝6Hz)0.94(3H，d，J＝7Hz)1.19(3H，d，J＝6Hz)1.31(1H，m)1.43(9H，s)1.61-1.71(2H，m)1.96(1H，m)2.31(1H，m)2.65(1H，m)3.60(1H，m)3.90(1H，m)4.63(1H，m)4.66(1H，d，J＝10Hz.NH)。
(工序9)
乙酸[5S-(叔丁氧基羰基氨基)-6R-(叔丁基二甲基硅烷基氧基)-4S-羟基-2R-(2-甲基丙基)庚]酯(化合物9)
将化合物8(0.81g，1.89mmol)溶解在THF(11ml)和乙醇(11ml)中，添加氯化钙(420mg，3.8mmol)，在冰浴中搅拌15分钟后，添加NaBH4(290mg，7.6mmol)，在冰浴中搅拌3小时。边将反应混合物在冰浴中进行冷却边加入1M KHSO4水溶液，搅拌15分钟后，使用乙酸乙酯进行萃取。使用饱和碳酸氢钠水溶液将有机层洗净后，使用无水硫酸镁进行干燥，在减压条件下蒸馏除去溶剂，得到二元醇(0.85g)。在氩氛围下，将二元醇(0.85g)溶解在二氯甲烷(50ml)中，在冰浴中搅拌10分钟后，添加三乙胺(273mg，2.7mmol)和乙酰氯(212mg，2.7mmol)，在冰浴中搅拌3小时。向反应混合物中添加甲醇(1ml)，搅拌10分钟后，蒸馏除去溶剂，使用硅胶色层法(己烷∶AcOEt＝8∶1～6∶1)进行精制，得到标记化合物(0.66g，1.39mmol，73％2steps)。
1H-NMR(CDCl3)δ：0.11(3H，S)0.12(3H，S)0.87(3H，d，J＝7Hz)0.88(3H，d，J＝7Hz)0.89(9H，S)1.12(1H，m)1.18(3H，d，J＝6Hz)1.25(1H，m)1.37(1H，m)1.45(9H，s)1.47(1H，m)1.62(1H，m)1.98(1H，m)2.04(3H，S)3.35(1H，m)3.91(1H，m)3.97-4.10(2H，m)4.12(1H，m)5.09(1H，d，J＝10Hz，NH)。
(工序10)
乙酸[4S，6R-二(叔丁基二甲基硅烷基氧基)-5S-(叔丁氧基羰基氨基)-2R-(2-甲基丙基)庚]酯(化合物10)
在氩氛围下，将化合物9(0.66g，1.39mmol)溶解在二氯甲烷(20ml)中，添加2，6-二甲基吡啶(500mg，4.7mmol)和叔丁基二甲基硅烷基三氟甲磺酸酯(0.53ml，2.3mmol)，在室温下搅拌3小时。向反应混合物中添加饱和食盐水，使用氯仿进行萃取。使用无水硫酸镁将有机层干燥，在减压条件下蒸馏除去溶剂后，使用硅胶色层法(己烷∶AcOEt＝9∶1)进行精制，得到标记化合物(0.55g，0.93mmol，67％)。
1H-NMR(CDCl3)δ：0.07(3H，S)0.08(3H，S)0.08(3H，S)0.10(3H，S)0.87(3H，d，J＝6Hz)0.88(3H，d，J＝6Hz)0.89(9H，S)0.89(9H，S)1.05(1H，m)1.16(3H，d，J＝6Hz)1.22(1H，m)1.37(1H，m)1.44(9H，s)1.54(1H，m)1.61(1H，m)1.81(1H，m)2.04(3H，S)3.42(1H，m)3.89(1H，m)3.90-4.00(2H，m)4.90(1H，m)4.81(1H，d，J＝10Hz，NH)。
(工序11)
1S-(1R-叔丁基二甲基硅烷基氧基乙基)-2S-(叔丁基二甲基硅烷基氧基)-4R-羟甲基-6-甲基庚基-氨基甲酸叔丁酯(化合物11)
将化合物10(0.10g，0.17mmol)溶解在THF(4ml)和乙醇(4ml)中，添加氯化钙(114mg，1.0mmol)，在冰浴中搅拌15分钟后，添加NaBH4(78mg，2.0mmol)，在冰浴中搅拌1小时，再在室温下搅拌24小时。边将反应混合物在冰浴中冷却边添加1M KHSO4水溶液，搅拌15分钟后，使用乙酸乙酯进行萃取。使用饱和碳酸氢钠水溶液将有机层洗净后，使用无水硫酸镁进行干燥，在减压条件下蒸馏除去溶剂，使用硅胶色层法(己烷∶AcOEt＝8∶1)进行精制，得到标记化合物(0.09g，0.16mmol，97％)。
1H-NMR(CDCl3)δ：0.06(3H，S)0.07(3H，S)0.08(3H，S)0.09(3H，S)0.88(3H，d，J＝6Hz)0.89(9H，s)0.89(3H，d，J＝6Hz)0.90(9H，S)1.04(1H，m)1.15(1H，m)1.18(3H，d，J＝6Hz)1.27(1H，m)1.44(9H，s)1.56-1.68(3H，m)1.78(1H，m)3.26(1H，m)3.53-3.64(2H，m)3.31-3.41(2H，m)4.70(1H，d，J＝10Hz，NH)。
(工序12)
4S，6R-二(叔丁基二甲基硅烷基氧基)-5S-(叔丁氧基羰基氨基)-2R-(2-甲丙基)庚酸(化合物12)
将化合物11(0.36g，0.66mmol)溶解在乙腈(4ml)和四氯化碳(4ml)中，添加水(6ml)和高碘酸钠(0.55g，2.56mmol)，在室温下搅拌5分钟后，添加氯化钌·nH2O(20mg)，进一步在室温下剧烈搅拌3小时。向反应混合物中添加水和氯仿，分离有机层后，使用硅藻土片进行过滤，使用饱和食盐水将滤液洗净。使用无水硫酸镁将有机层干燥，在减压条件下蒸馏除去溶剂，得到标记化合物(0.37g)。直接用于下面的反应。
(工序13)
4S，6R-二(叔丁基二甲基硅烷基氧基)-5S-(叔丁氧基羰基氨基)-2R-(2-甲丙基)庚酸-1S-羟甲基-2-甲基丙酰胺(化合物13)
将化合物12(0.37g)和L-缬氨醇(83mg，0.80mmol)溶解在DMF(30ml)中，在冰浴中搅拌10分钟后，添加氰基磷酸二乙酯(Diethylcyanophosphonate，DEPC，130mg，0.830mmol)和二异丙基乙胺(103mg，0.80mmol)，在冰浴中搅拌1小时，再在室温下搅拌过夜。向反应混合物中添加乙酸乙酯，依次使用硫酸氢钾水溶液、水和饱和碳酸氢钠水溶液洗净。使用无水硫酸镁将有机层干燥，在减压条件下蒸馏除去溶剂之后，使用硅胶色层法(CHCl3∶MeOH＝98∶2)进行精制，得到标记化合物(0.39g，0.60mmol，91％2steps)。
1H-NMR(CDCl3)δ：0.05(3H，s)0.06(3H，s)0.08(3H，s)0.10(3H，s)0.89(9H，s)0.89(9H，s)0.89(3H，d，J＝6Hz)0.90(3H，d，J＝6Hz)0.93(3H，d，J＝7Hz)0.95(3H，d，J＝7Hz)1.07(1H，m)1.18(3H，d，J＝6Hz)1.40(9H，s)1.54(1H，m)1.72(1H，m)1.76(1H，m)1.98(1H，m)2.40(1H，m)3.41(1H，m)3.42(1H，m)3.64(1H，m)3.72(1H，m)3.78-3.88(2H，m)4.72(1H，d，J＝10Hz，NH)6.45(1H，m，NH)。
(工序14)
[4S，6R-二(叔丁基二甲基硅烷基氧基)-5S-(叔丁氧基羰基氨基)-2R-(2-甲基丙基)庚酰]-L-缬氨酸(化合物14)
将化合物13(0.39g，0.60mmol)溶解在乙腈(3.2ml)和四氯化碳(3.2ml)中，添加水(4.8ml)和高碘酸钠(496mg，2.32mmol)，在室温下搅拌5分钟后，添加氯化钌·nH2O(4mg)，进一步在室温下剧烈搅拌3小时。向反应混合物中添加水和氯仿，分离有机层后，使用硅藻土片进行过滤，使用饱和食盐水将滤液洗净。使用无水硫酸镁将有机层干燥，在减压条件下蒸馏除去溶剂，得到标记化合物(0.33g，83％)。直接用于下面的反应。
1H-NMR(CDCl3)δ：0.03(3H，s)0.05(3H，s)0.08(3H，s)0.11(3H，s)0.81(3H，d，J＝6Hz)0.84(3H，d，J＝6Hz)0.85(9H，s)0.86(3H，d，J＝7Hz)0.87(9H，s)0.88(3H，d，J＝7Hz)1.05(1H，m)1.13(3H，d，J＝6Hz)1.38(9H，s)1.40-1.56(2H，m)1.67-1.80(2H，m)2.23(1H，m)2.40(1H，m)3.56(1H，m)3.72-3.82(2H，m)4.51(1H，m)4.94(1H，d，J＝10Hz，NH)7.33(1H，d，J＝7Hz，NH)。
(工序15)
[4S，6R-二(叔丁基二甲基硅烷基氧基)-5S-(叔丁氧基羰基氨基)-2R-(2-甲基丙基)庚酰]-L-缬氨酰-L-蛋氨酸苯甲酰胺(化合物15)
在氩氛围下，将化合物14(0.18g，0.27mmol)和H-Met-NHBn溶解在THF(4ml)中，边搅拌边加入4-(4，6-二甲氧基-1，3，5-三嗪-2-基)-4-甲基氯化吗啉(DMT-MM nH2O，125mg)，在室温下搅拌过夜。向反应混合物中添加乙酸乙酯，依次使用硫酸氢钾水溶液和饱和食盐水洗净。使用无水硫酸镁将有机层干燥，在减压条件下蒸馏除去溶剂后，使用硅胶色层法(CHCl3∶MeOH＝98∶2)进行精制，得到标记化合物(0.14g，0.15mmol，67％)。
1H-NMR(CDCl3)δ：0.06(3H，s)0.07(3H，s)0.08(3H，s)0.10(3H，s)0.84(3H，d，J＝7Hz)0.88(3H，d，J＝7Hz)0.89(9H，s)0.89(9H，s)0.90(3H，d，J＝7Hz)0.94(3H，d，J＝7Hz)1.07(1H，m)1.18(3H，d，J＝6Hz)1.43(9H，s)1.48(1H，m)1.63(1H，m)1.69-1.82(2H，m)1.94(1H，m)2.05-2.11(2H，m)2.06(3H，s)2.40(1H，m)2.44-2.59(2H，m)3.44(1H，m)3.78(1H，m)3.90(1H，m)4.05(1H，m)4.37-4.48(2H，m)4.58(1H，m)4.70(1H，d，J＝10Hz，NH)6.46(1H，br d，J＝7Hz，NH)6.64(1H，br d，J＝8Hz，NH)6.86(1H，m，NH)7.20-7.35(5H，m)。
(工序16)
[5S-(叔丁氧基羰基氨基)-4S，6R-二羟基-2R-(2-甲基丙基)庚酰]-L-缬氨酰-L-蛋氨酸苯甲酰胺(TLVM-4)
将化合物15(0.15g，0.17mmol)溶解在THF(3ml)中，添加乙酸(80mg)后，添加四丁基氟化铵·nH2O(TBAF，0.47g)，在室温下搅拌8天。向反应混合物中添加氯仿，使用硅胶色层法(CHCl3∶MeOH＝97∶3)进行精制，得到标记化合物(0.06g，0.092mmol，81％)。
1H-NMR(CDCl3-CD3OD)δ：0.86(3H，d，J＝7Hz)0.89(3H，d，J＝7Hz)0.90(3H，d，J＝7Hz)0.92(3H，d，J＝7Hz)1.15(3H，d，J＝6Hz)1.21(1H，m)1.44(9H，s)1.46(1H，m)1.53-1.64(2H，m)1.66(1H，m)1.94(1H，m)2.00-2.15(2H，m)2.07(3H，s)2.42-2.50(2H，m)2.60(1H，m)3.38(1H，m)3.77(1H，m)4.02(1H，m)4.10(1H，m)4.37(1H，d，J＝15Hz)4.42(1H，d，J＝15Hz)4.50(1H，m)7.20-7.37(5H，m)。
实施例2
[5S-(叔丁氧基羰基氨基)-4R，6R-二羟基-2R-(2-甲基丙基)庚酰]-L-缬氨酰-L-蛋氨酸苯甲酰胺(TLVM-5)
(工序1)
1S-[4R-(2-甲基丙基)-5-氧四氢呋喃-2S-基]-2R-三乙基硅烷基氧基-丙基-氨基甲酸叔丁酯(化合物16)
使用与化合物10的合成相同的方法，由化合物7(2.00g，6.3mmol)和三乙基硅烷基三氟甲磺酸酯(2.64g，10mmol)得到标记化合物(1.73g，4.0mmol，85％)。
1H-NMR(CDCl3)δ：0.56-0.65(6H，m)0.89(3H，d，J＝6Hz)0.92-1.00(9H，m)0.96(3H，d，J＝6Hz)1.20(3H，d，J＝6Hz)1.33(1H，m)1.44(9H，s)1.64-1.73(2H，m)1.96(1H，m)1.96(1H，m)2.30(1H，m)2.65(1H，m)3.61(1H，m)3.92(1H，m)4.66(1H，m)4.74(1H，d，J＝10Hz.NH)。
(工序2)
乙酸[5S-(叔丁氧基羰基氨基)-4S-羟基-2R-(2-甲基丙基)-6R-三乙基硅烷基氧基庚]酯
使用与化合物9的合成相同的方法，由化合物16(1.73g，4.0mmol)得到标记化合物(1.73g，3.6mmol，91％2steps)。
1H-NMR(CDCl3)δ：0.65(2H×3，q，J＝8Hz)0.89(3H，d，J＝7Hz)0.89(3H，d，J＝7Hz)0.98(3H×3，t，J＝8Hz)1.14(1H，m)1.21(3H，d，J＝6Hz)1.27(1H，m)1.38(1H，m)1.47(9H，s)1.50(1H，m)1.65(1H，m)1.98(1H，m)2.05(3H，s)3.36(1H，m)3.42(1H，br s，OH)3.97(1H，m)4.00-4.14(2H，m)4.18(1H，m)5.15(1H，d，J＝10Hz，NH)。
(工序3)
乙酸[5S-(叔丁氧基羰基氨基)-2R-(2-甲基丙基)-4-氧-6R-三乙基硅烷基氧基庚]酯(化合物18)
将化合物17(1.73g，3.6mmol)溶解在二氯甲烷(20ml)中，添加Dess-Martin试剂(DMP，1.7g，4.0mmol)后，缓慢添加以水饱和的二氯甲烷(2ml)，在室温下搅拌3小时。向反应混合物中添加硫代硫酸钠水溶液，使用氯仿进行萃取。使用无水硫酸镁将有机层干燥，在减压条件下蒸馏除去溶剂后，使用硅胶色层法(己烷∶AcOEt＝9∶1)进行精制，得到标记化合物(1.44g，3.0mmol，84％)。
1H-NMR(CDCl3)δ：0.58(2H×3，q，J＝8Hz)0.86(3H，d，J＝7Hz)0.91(3H，d，J＝7Hz)0.93(3H×3，t，J＝8Hz)1.11(1H，m)1.13(3H，d，J＝6Hz)1.18(1H，m)1.46(9H，s)1.58(1H，m)2.02(3H，s)2.36(1H，m)2.41(1H，dd，J＝18，6Hz)2.74(1H，dd，J＝18，6Hz)3.92(1H，dd，J＝11，6Hz)4.03(1H，dd，J＝11，5Hz)4.12(1H，dd，J＝9，3Hz)4.36(1H，dq，J＝6，3Hz)5.37(1H，d，J＝9Hz，NH)。
(工序4)
乙酸[5S-(叔丁氧基羰基氨基)-6R-羟基-2R-(2-甲基丙基)-4-氧-庚]酯(化合物19)
将化合物18(0.25g，0.53mmol)溶解在THF(4ml)中，添加水(1ml)和乙酸(4ml)，在室温下搅拌5小时。小心地向反应混合物中添加饱和碳酸氢钠水溶液，气体的产生停止后，使用氯仿进行萃取。使用无水硫酸镁将有机层干燥，在减压条件下蒸馏除去溶剂，得到标记化合物(0.24g)。
1H-NMR(CDCl3)δ：0.87(3H，d，J＝6Hz)0.91(3H，d，J＝6Hz)1.10(1H，m)1.21(3H，d，J＝7Hz)1.22(1H，m)1.45(9H，s)1.59(1H，m)2.03(3H，s)2.38(1H，m)2.50(1H，dd，J＝18，5Hz)2.65(1H，dd，J＝18，8Hz)3.87(1H，dd，J＝11，6Hz)4.14(1H，dd，J＝11，4Hz)4.19(1H，br d，J＝9Hz)4.30(1H，m)5.41(1H，d，J＝9Hz，NH)。
(工序5)
乙酸2R-[5S-(叔丁氧基羰基氨基)-2，2-二甲基-6R-甲基-1，3-二噁烷-4R-基)甲基-4-甲基庚酯(化合物20)
将化合物19(0.24g)溶解在THF(5ml)中，在冰浴中搅拌10分钟后，添加NaBH(OAc)3(318mg，1.5mmol)的THF(3ml)和乙酸(0.3ml)的悬浊液，在冰浴中搅拌1小时，在室温下搅拌3小时。向反应混合物中添加乙酸钾水溶液，搅拌10分钟后，添加饱和食盐水，使用氯仿进行萃取。使用无水硫酸镁将有机层干燥，在减压条件下蒸馏除去溶剂。将残留物溶解在甲苯(30ml)中，添加2-甲氧基丙烯(1.2ml)和PPTS(30mg)，在70℃搅拌3小时。蒸馏除去甲苯之后，向残留物中加入氯仿，使用饱和碳酸氢钠水溶液洗净。使用无水硫酸镁将有机层干燥，在减压条件下蒸馏除去溶剂后，使用硅胶色层法(己烷∶AcOEt＝9∶1～6∶1)进行精制，得到标记化合物(0.09g，0.22mmol，42％3steps)和五元环的保护体(0.08g)。
1H-NMR(CDCl3)δ：0.86(3H，d，J＝7Hz)0.88(3H，d，J＝7Hz)1.09(3H，d，J＝6Hz)1.11(1H，m)1.15(1H，m)1.32(3H，s)1.44(9H，s)1.56(3H，s)1.56(1H，m)1.60-1.73(2H，m)1.91(1H，m)2.05(3H，s)3.35(1H，ddd，J＝10，7，3Hz)3.57(1H，ddd，J＝10，8，5Hz)3.94-4.04(2H，m)4.08(1H，m)4.65(1H，d，J＝10Hz，NH)。
(工序6)
[2，2-二甲基-4R-(2R-羟甲基-4-甲基戊基)-6R-甲基-1，3-二噁烷-5S-基]氨基甲酸叔丁酯(化合物21)
使用与化合物11的合成相同的方法，由化合物20(0.12g，0.30mmol)得到标记化合物(0.12g)。直接用于下面的反应。
(工序7)
2R-[5S-(叔丁氧基羰基氨基)-2，2-二甲基-6R-甲基-1，3-二噁烷-4R-基]甲基-4-甲基戊酸(化合物22)
使用与化合物12的合成相同的方法，由化合物21(0.43g)得到标记化合物(0.38g，1.0mmol，95％2steps)。
1H-NMR(CDCl3)δ：0.89(3H，d，J＝6Hz)0.90(3H，d，J＝6Hz)1.09(3H，d，J＝6Hz)1.25(1H，m)1.30(3H，s)1.43(9H，s)1.46(3H，s)1.55-1.65(2H，m)1.77(1H，m)1.96(1H，m)2.52(1H，m)3.35(1H，m)4.08(1H，m)4.80(1H，d，J＝10Hz，NH)。
(工序8)
2R-[5S-(叔丁氧基羰基氨基)-2，2-二甲基-6R-甲基-1，3-二噁烷-4R-基]甲基-4-甲基戊酰-L-缬氨酰-L-蛋氨酸苯甲酰胺(化合物23)
使用与化合物15的合成相同的方法，由化合物22(0.11g，0.29mmol)和H-Val-Met-NHBn得到标记化合物(0.10g，0.14mmol，48％)。
1H-NMR(CDCl3)δ：0.85(3H，d，J＝7Hz)0.86(3H，d，J＝7Hz)0.91(3H，d，J＝7Hz)0.93(3H，d，J＝7Hz)1.09(3H，d，J＝7Hz)1.21(1H，m)1.32(3H，s)1.44(9H，s)1.46(3H，s)1.58(1H，m)1.73-1.90(2H，m)1.92-2.17(4H，m)2.05(3H，s)2.39(1H，m)2.41-2.59(2H，m)3.34(1H，m)3.56(1H，m)4.05(1H，m)4.18(1H，m)4.42(1H，d，J＝6Hz)4.43(1H，d，J＝6Hz)4.55(1H，m)4.61(1H，d，J＝7Hz，NH)6.28(1H，m，NH)6.78(1H，m，NH)6.84(1H，m，NH)7.20-7.34(5H，m)。
(工序9)
[5S-(叔丁氧基羰基氨基)-4R，6R-二羟基-2R-(2-甲基丙基)庚酰]-L-缬氨酰-L-蛋氨酸苯甲酰胺(TLVM-5)
将化合物23(0.10g，0.14mmol)溶解在甲醇(20ml)中，添加PPTS(20mg)后，在40℃搅拌24小时。在减压条件下蒸馏除去甲醇后，使用硅胶色层法(CHCl3∶MeOH＝98∶2)对残留物进行精制，得到标记化合物(0.07g，0.107mmol，77％)。
1H-NMR(CDCl3-CD3OD)δ：0.87(3H，d，J＝6Hz)0.91(3H，d，J＝7Hz)0.91(3H，d，J＝6Hz)0.93(3H，d，J＝7Hz)1.15(3H，d，J＝6Hz)1.24(1H，m)1.45(9H，s)1.46-1.61(2H，m)1.66-1.81(2H，m)1.94(1H，m)2.03-2.16(2H，m)2.08(3H，s)2.44-2.55(3H，m)3.28(1H，m)3.64(1H，m)4.11(1H，d，J＝7Hz)4.23(1H，m)4.32-4.43(2H，m)4.50(1H，m)7.22-7.35(5H，m)。
实施例3
[5S-(叔丁氧基羰基氨基)-4R，6R-二羟基-2R-(2-甲基丙基)庚酰]-L-缬氨酰-L-蛋氨酸正丁酰胺(TLVM-7)的制造
(工序1)
2R-[5S-(叔丁氧基羰基氨基)-2，2-二甲基-6R-甲基-1，3-二噁烷-4R-基]甲基-4-甲基戊酰-L-缬氨酰-L-蛋氨酸正丁酰胺(化合物24)
使用与化合物15的合成相同的方法，由化合物22(0.08g，0.21mmol)和H-Val-Met-NH-n-Pr得到标记化合物(0.17g)。
1H-NMR(CDCl3)δ：0.88(3H，d，J＝7Hz)0.90(3H，d，J＝7Hz)0.91(3H，t，J＝6Hz)0.96(3H，d，J＝7Hz)1.01(3H，d，J＝7Hz)1.09(3H，d，J＝6Hz)1.20(1H，m)1.31(2H，m)1.33(3H，s)1.34(3H，s)1.44(9H，s)1.46(2H，m)1.62(1H，m)1.75-1.89(2H，m)1.90-2.14(4H，m)2.09(3H，s)2.26(1H，m)2.43-2.61(2H，m)3.22(2H，m)3.35(1H，m)3.57(1H，m)4.05(1H，m)4.17(1H，m)4.40(1H，m)4.72(1H，d，J＝10Hz，NH)6.25(1H，br d，J＝9Hz，NH)6.77(1H，br d，J＝9Hz，NH)7.25(1H，br d，J＝10Hz，NH)。
(工序2)
[5S-(叔丁氧基羰基氨基)-4R，6R-二羟基-2R-(2-甲基丙基)庚酰]-L-缬氨酰-L-蛋氨酸正丁酰胺(TLVM-7)
使用与TLVM-5的合成相同的方法，由化合物24(0.16g)得到标记化合物(0.07g，0.11mmol，54％2steps)。
1H-NMR(CDCl3-CD3OD)δ：0.88(3H，d，J＝6Hz)0.91(3H，d，J＝7Hz)0.92(3H，t，J＝7Hz)0.92(3H，d，J＝7Hz)0.93(3H，d，J＝7Hz)1.18(3H，d，J＝6Hz)1.29(1H，m)1.34(2H，m)1.40-1.61(3H，m)1.44(9H，s)1.77-1.86(2H，m)1.97(1H，m)2.02-2.13(2H，m)2.09
(3H，s)2.31(1H，m)2.43-2.59(3H，m)3.12-3.35(3H，m)3.75(1H，m)4.20(1H，m)4.32(1H，m)4.60(1H，m)5.34(1H，d，J＝8Hz，NH)6.70(1H，m，NH)6.92(1H，m，NH)7.92(1H，m，NH)。
实施例4
[5S-(叔丁氧基羰基氨基)-4R，6R-二羟基-2R-(2-甲基丙基)庚酰]-L-缬氨酰-L-蛋氨酸(S)-α-甲基苯甲酰胺(TLVM-8)的制造
(工序1)
2R-[5S-(叔丁氧基羰基氨基)-2，2-二甲基-6R-甲基-1，3-二噁烷-4R-基]甲基-4-甲基戊酰-L-缬氨酰-L-蛋氨酸(S)-α-甲基苯甲酰胺(化合物25)
使用与化合物15的合成相同的方法，由化合物22(0.07g，0.19mmol)和H-Val-Met-NH-(S)-CH(Me)Ph得到标记化合物(0.12g)。
1H-NMR(CDCl3)δ：0.88(3H，d，J＝6Hz)0.90(3H，d，J＝7Hz)0.92(3H，d，J＝6Hz)0.96(3H，d，J＝7Hz)1.09(3H，d，J＝7Hz)1.26(1H，m)1.33(3H，d，J＝7Hz)1.44(9H，s)1.45(3H，s)1.48(3H，s)1.59(1H，m)1.79(1H，m)1.83-2.22(4H，m)2.01(3H，s)2.26-2.60(4H，m)3.36(1H，m)3.57(1H，m)4.06(1H，m)4.21(1H，m)4.56(1H，m)4.72(1H，d，J＝10Hz，NH)5.07(1H，m)6.23(1H，m，NH)6.69(1H，m，NH)6.76(1H，m，NH)7.21-7.36(5H，m)。
(工序2)
[5S-(叔丁氧基羰基氨基)-4R，6R-二羟基-2R-(2-甲基丙基)庚酰]-L-缬氨酰-L-蛋氨酸(S)-α-甲基苯甲酰胺(TLVM-8)
使用与TLVM-5的合成相同的方法，由化合物25(0.12g)得到标记化合物(0.08g，0.12mmol，63％2steps)。
1H-NMR(CDCl3-CD3OD)δ：0.88(3H，d，J＝6Hz)0.92(3H，d，J＝7Hz)0.92(3H，d，J＝7Hz)0.94(3H，d，J＝7Hz)1.15(3H，d，J＝6Hz)1.27(1H，m)1.44(9H，s)1.46(3H，d，J＝7Hz)1.47-1.58(2H，m)1.72-1.81(2H，m)1.88(1H，m)1.96-2.06(2H，m)2.02(3H，s)2.24(1H，m)2.31-2.44(3H，m)2.50(1H，m)3.28(1H，m)3.68(1H，m)4.18(1H，d，J＝7Hz)4.26(1H，m)4.49(1H，m)4.52(1H，m)5.42(1H，m，NH)7.05(1H，m，NH)7.55(1H，m，NH)7.83(1H，m，NH)。
实施例5
[5S-(叔丁氧基羰基氨基)-4R，6R-二羟基-2R-(2-甲基丙基)庚酰]-L-缬氨酰-L-蛋氨酸-4-氟代苯甲酰胺(TLVM-9)的制造
(工序1)
2R-[5S-(叔丁氧基羰基氨基)-2，2-二甲基-6R-甲基-1，3-二噁烷-4R-基]甲基-4-甲基戊酰-L-缬氨酰-L-蛋氨酸-4-氟代苯甲酰胺(化合物26)
使用与化合物15的合成相同的方法，由化合物22(0.08g，0.21mmol)和H-Val-Met-NH-p-F-Bn得到标记化合物(0.16g)。
1H-NMR(CDCl3)δ：0.85(3H，d，J＝6Hz)0.87(3H，d，J＝6Hz)0.92(3H，d，J＝7Hz)0.94(3H，d，J＝7Hz)1.09(3H，d，J＝7Hz)1.18(1H，m)1.33(3H，s)1.34(3H，s)1.44(9H，s)1.58(1H，m)1.79(1H，m)1.84(1H，m)1.98(1H，m)2.04-2.17(3H，m)2.07(3H，s)2.39(1H，m)2.44-2.63(2H，m)3.35(1H，m)3.57(1H，m)4.07(1H，m)4.12(1H，m)4.31-4.45(2H，m)4.60(1H，m)4.73(1H，d，J＝10Hz，NH)6.20(1H，m，NH)6.75(1H，m，NH)6.83(1H，m，NH)6.95-7.03(2H，m)7.20-7.28(2H，m)。
(工序2)
[5S-(叔丁氧基羰基氨基)-4R，6R-二羟基-2R-(2-甲基丙基)庚酰]-L-缬氨酰-L-蛋氨酸-4-氟代苯甲酰胺(TLVM-9)
使用与TLVM-5的合成相同的方法，由化合物26(0.16g)得到标记化合物(0.09g，0.13mmol，64％2steps)。
1H-NMR(CDCl3-CD3OD)δ：0.87(3H，d，J＝6Hz)0.90(3H，d，J＝7Hz)0.91(3H，d，J＝7Hz)0.91(3H，d，J＝7Hz)1.16(3H，d，J＝6Hz)1.26(1H，m)1.45(9H，s)1.47-1.58(2H，m)1.68-1.81(2H，m)1.93(1H，m)2.05-2.24(2H，m)2.08(3H，s)2.43-2.52(3H，m)3.22(1H，m)3.64(1H，m)4.12(1H，d，J＝7Hz)4.26(1H，m)4.33(1H，d，J＝15Hz)4.38(1H，d，J＝15Hz)4.50(1H，dd，J＝8，6Hz)5.52(1H，m，NH)6.97-7.04(2H，m)7.20(1H，m，NH)7.21-7.36(2H，m)7.73(1H，m，NH)7.83(1H，m，NH)。
实施例6
[5S-(叔丁氧基羰基氨基)-4R，6R-二羟基-2R-(2-甲基丙基)庚酰]-L-丙氨酰-L-蛋氨酸苯甲酰胺(TLVM-10)的制造
(工序1)
2R-[5S-(叔丁氧基羰基氨基)-2，2-二甲基-6R-甲基-1，3-二噁烷-4R-基]甲基-4-甲基戊酰-L-丙氨酰-L-蛋氨酸苯甲酰胺(化合物27)
使用与化合物15的合成相同的方法，由化合物22(0.04g，0.11mmol)和H-Ala-Met-NH-Bn得到标记化合物(0.04g，0.06mmol，55％)。
1H-NMR(CDCl3)δ：0.85(3H，d，J＝7Hz)0.86(3H，d，J＝6Hz)1.09(3H，d，J＝7Hz)1.16(1H，m)1.31(3H，s)1.32(3H，s)1.36(3H，d，J＝7Hz)1.44(9H，s)1.57(1H，m)1.74(1H，m)1.86(1H，m)1.98(1H，m)2.03(1H，m)2.05(3H，s)2.12(HI，m)2.33(1H，m)2.43-2.58(2H，m)3.33(1H，m)3.56(1H，m)4.08(1H，m)4.34(1H，m)4.42(2H，m)4.59(1H，m)4.82(1H，d，J＝10Hz，NH)6.28(1H，m，NH)6.88(1H，m，NH)7.00(1H，m，NH)7.17-7.34(5H，m)。
(工序2)
[5S-(叔丁氧基羰基氨基)-4R，6R-二羟基-2R-(2-甲基丙基)庚酰]-L-丙氨酰-L-蛋氨酸苯甲酰胺(TLVM-10)
使用与TLVM-5的合成相同的方法，由化合物27(0.04g)得到标记化合物(0.01g，0.016mmol，27％)。
1H-NMR(CDCl3-CD3OD)δ：0.91(3H，d，J＝6Hz)0.95(3H，d，J＝6Hz)1.18(3H，d，J＝6Hz)1.33(1H，m)1.46(9H，s)1.48(3H，d，J＝7Hz)1.55-1.83(3H，m)1.99(1H，m)2.06(3H，s)2.07(1H，m)2.10(1H，m)2.29(1H，m)2.46-2.53(2H，m)3.38(1H，m)3.52(1H，m)4.19(1H，m)4.34-4.46(2H，m)4.47-4.62(2H，m)7.21-7.38(5H，m)。
实施例7
[5S-(叔丁氧基羰基氨基)-4R，6R-二羟基-2R-(2-甲基丙基)庚酰]-L-苯基甘氨酰-L-蛋氨酸苯甲酰胺(TLVM-11)的制造
(工序1)
2R-[5S-(叔丁氧基羰基氨基)-2，2-二甲基-6R-甲基-1，3-二噁烷-4R-基]甲基-4-甲基戊酰-L-苯基甘氨酰-L-蛋氨酸苯甲酰胺(化合物28)
使用与化合物15的合成相同的方法，由化合物22(0.13g，0.35mmol)和H-Phg-Met-NH-Bn得到标记化合物(0.12g，0.17mmol，79％)。
1H-NMR(CDCl3-CD3OD)δ：0.89(3H，d，J＝7Hz)0.92(3H，d，J＝7Hz)1.14(3H，d，J＝6Hz)1.24(1H，m)1.34(3H，s)1.42(3H，s)1.43(9H，s)1.48-1.62(2H，m)1.65-1.80(2H，m)1.98(1H，m)2.07(3H，s)2.14(1H，m)2.40-2.55(3H，m)3.22(1H，m)3.60(1H，m)4.05(1H，m)4.26-4.37(3H，m)4.53(1H，m)7.05-7.25(10H，m)。
(工序2)
[5S-(叔丁氧基羰基氨基)-4R，6R-二羟基-2R-(2-甲基丙基)庚酰]-L-苯基甘氨酰-L-蛋氨酸苯甲酰胺(TLVM-11)
使用与TLVM-5的合成相同的方法，由化合物28(0.12g，0.17mmol)得到标记化合物(0.06g，0.09mmol，51％)。
1H-NMR(CDCl3-CD3OD)δ：0.88(3H，d，J＝6Hz)0.92(3H，d，J＝6Hz)1.14(3H，d，J＝6Hz)1.23(1H，m)1.44(9H，s)1.47-1.62(2H，m)1.64-1.76(2H，m)1.97(1H，m)2.07(3H，s)2.16(1H，m)2.44-2.55(3H，m)3.22(1H，m)3.60(1H，m)4.21(1H，m)4.27-4.40(3H，m)4.57(1H，m)7.16-7.40(10H，m)。
实施例8γ-分泌酶抑制作用的研究(I)
(1)试验方法
使用确认了向HEK293细胞(ATCC社)中导入APP C99 pcDNA3.1(在序列编号1中表示该编码区域的碱基序列)(J.Biol.Chem.，2003，278，49448-49458)、稳定表达APP-C99(在由APP生成Aβ的两阶段反应的第一阶段中，预先缺少通过α或者β分泌酶剪切的多肽部分的APP人工片段)的细胞株(C99细胞)，在体外(in intro)对4种被检测物质(TLVM-5、7、8、9)的γ分泌酶抑制作用进行研究。
在本实验中，作为C99细胞的培养基，使用在Dulbecco’s ModifiedEagle’s Medium(DMEM，Sigma Aldrich社)500mL中添加有胎牛血清(Biosource社)55ml、MEM非必需氨基酸(Gibco社)5.5ml和青霉素/链霉素(Gibco社)5.5ml的培养基。
将C99细胞悬浊在培养基中达到5×104cells/ml，以1ml(5×104cells)/well向24孔胶原质培养板(collagen plate)(Akita SumitomoBakelite Co.，Ltd.)中添加，培养3天后，除去孔内的培养基，用培养基1ml/well将孔内洗净。除去培养基后，添加新的培养基0.4ml/well。暴露在被检测物质和阳性对照物质中，进行24小时孵育，收集培养上清。作为阳性对照物质，使用L-685、458(CALBIOCHEM社)以及专利文献1(WO03/091278号公报)的实施例1中公开的Boc-Leu-Val-Met-Leu-OMe(以下，称为LVML-1)。暴露浓度对全部的被检测物质和阳性对照物质，设定为0.3、1、3和10μmol/L的4个浓度。使用HumanAmyloidβ(1-40)(N)测定试剂盒(L)-IBL和HumanAmyloidβ(1-42)(N)测定试剂盒(L)-IBL(免疫生物研究所)，测定培养基上清中的Aβ(1-40)和Aβ(1-42)的浓度。减去接种C99细胞前的培养基中原本含有的Aβ(1-40)和Aβ(1-42)浓度，求出各自的分泌量。另外，将阴性对照(含5％DMSO的培养基，终浓度为1％DMSO)的Aβ分泌率作为100％，求出被检测物质和阳性对照的各浓度下的Aβ分泌率。
(2)结果
如表1～3所示，TLVM-5、7、8和9显示远远比阳性对照物质L-685、458和LVML-1强的γ分泌酶抑制作用。
另外，专利文献1(WO03/091278)的实施例6中显示，Thr-Leu-Val-Met型化合物(1′a)的对Aβ产生的抑制率(暴露浓度10μM)为73％。另一方面，如表1所示，TLVM-5、7、8和9的Aβ40的分泌率(暴露浓度10μM)保持3％以下(抑制率97％以上)，进一步在更低的浓度区域(暴露浓度0.3μM)中的分泌率也为24％以下(抑制率为76％以上)的活性，能够确认，本发明的化合物与现有化合物相比，具有极其优异的γ分泌酶抑制作用。
[表1]
C99细胞中各被检测物质添加时的Aβ(1-40)分泌率(％)
Figure GPA00001021153000281
[表2]
C99细胞中各被检测物质添加时的Aβ(1-42)分泌率(％)
Figure GPA00001021153000282
[表3]
C99细胞中各被检测物质添加时的Aβ[(1-40)+(1-42)]分泌率(％)
Figure GPA00001021153000291
实施例9γ分泌酶抑制作用的研究(II)
(1)试验方法
对实施例8中确认了对γ分泌酶的活性具有强抑制活性的TLVM-5、7、8、9进行低浓度下的追加实验(暴露浓度：被检测物质设定为0.03、0.1和0.3μmol/L的3种浓度，阳性对照设定为0.1、0.3、1和3μmol/L的4种浓度)。
另外，使用隔着将Aβ分泌抑制50％时的被检测物质浓度(IC50)的2个浓度的Aβ分泌率，通过下式求出IC50。
IC50＝10[LOG(A/B)*(50-C)/(D-C)+LOG(B)]
A：隔着50％抑制的2点的高浓度侧的被检测物质浓度
B：隔着50％抑制的2点的低浓度侧的被检测物质浓度
C：B点的分泌率(％)
D：A点的分泌率(％)
(2)结果
如表4～6所示，TLVM-5、7、8和9在低浓度区域(0.03～0.3μmol/L)也显示优异的γ分泌酶抑制作用。
被检测物质(TLVM-5、7、8和9)的对Aβ(1-40)和Aβ(1-42)的IC50分别为0.033～0.089μmol/L(阳性对照：1.8μmol/L)、0.11～0.29μmol/L(阳性对照：1.7μmol/L)，显示远远强于阳性对照的效果。
[表4]
C99细胞中各被检测物质添加时的Aβ(1-40)分泌率(％)
Figure GPA00001021153000301
[表5]
C99细胞中各被检测物质添加时的Aβ(1-42)分泌率(％)
Figure GPA00001021153000302
[表6]
C99细胞中各被检测物质添加时的Aβ[(1-40)+(1-42)]分泌率(％)
Figure GPA00001021153000303
实施例10细胞毒性的测定
(1)试验方法
使用如下所述的方法，测定4种被检测物质(TLVM-5、7、8、9)的对C99细胞的细胞毒性.
在本实验中，作为C99细胞的培养基，使用在Dulbecco’s ModifiedEagle’s Medium(DMEM，Sigma Aldrich社)500mL中添加有胎牛血清(Biosource社)55ml、MEM非必需氨基酸(Gibco社)5.5ml和青霉素/链霉素(Gibco社)5.5ml的培养基。
将C99细胞悬浊在培养基中达到0.75×105cells/ml，以100μL(0.75×104cells)/well向96孔胶原质培养板(Akita Sumitomo Bakelite Co.，Ltd.)中添加，培养2天后，除去孔内的培养基50μL/well，添加新的培养基30μL/well。在被检测物质20μL/well(最终浓度为0.3、1、3、10、30和100μmol/L中暴露24小时后，使用Cell Counting Kit-8(同仁化学研究所)测定细胞生存率。
(2)结果
如表7所示，在30μmol/L以上的浓度中，散见使细胞生存率下降的被检测物质，但是在本发明的实施例中使用的暴露浓度(10μmol/L以下)中，所有抑制剂都没有发现细胞生存率的降低，因此，能够断定，本发明中确认的γ分泌酶活性抑制作用不是由被检测物质的细胞毒性引起的。
[表7]
C99细胞中各被检测物质添加时的细胞生存率(％)
Figure GPA00001021153000311
实施例11底物特异性的研究
(1)试验方法
在构成作为γ分泌酶的底物的、已知在脑神经细胞中与APP共局部存在化的、人Alcadein(以下称为Alc)的家族中，使用细胞外的第一剪切位点和γ分泌酶的剪切位点所决定的Alcα的人工片段(以下称为Alc α C150)，研究本发明的γ分泌酶抑制剂的底物特异性。由于由Alc a的一次切断结构生成的β-Alc α不能使用Aβ的测定中使用的sELISA法进行定量，因此，使细胞中表达在Alc α和C99的一次切断结构的N末端侧带有FLAG-标签的蛋白质，采用使用抗FLAG抗体的免疫沉淀法，回收分泌在培养基中的FLAG-Aβ样肽，采用使用同抗体的蛋白质免疫印迹(Western Blotting)法进行检测。具体的方法如下所示。
使用Lipofectamine 2000(Invitrogen社)，根据试剂草案(protocol)，将FLAGAPP C99pcDNA3.1(在序列编号2中表示该编码区域的碱基序列)(J.Biol.Chem.，2003，278，49448-49458(由pcDNA3-APPC99制作))或者FLAG AlcαC150 pcDNA3.1(在序列编号3中表示该编码区域的碱基序列)(J.Biol.Chem.，2004，279，24343-24354(与pcDNA3AlcαΔE相同))导入用含有10％FCS的DMEM(和光纯药工业株式会社)6ml培养后的HEK293细胞(ATCC社)(1×107cells/10cmdish)，添加各抑制剂和阳性对照物质(γ-Secretase Inhibitor IX(DAPT))(Calbiochem Contact Information社)，分别达到0.2或2μmol/L。阴性对照添加同用量的DMSO(和光纯药工业株式会社)。24小时后，回收培养上清，使用珠子(100μL的50％(v/v)蛋白G琼脂糖凝胶(Protein-G Sepharose)(GE Healthcare社))对试样进行预精制后，添加15μL的50％(v/v)抗FLAG抗体M2珠子(SIGMA社)，在4℃孵育1小时。离心分离回收珠子，用缓冲液(10mM Tris-HCl[pH8.0]、140mM NaCl、0.1％正辛基葡糖苷、0.025％叠氮化钠)进行3次洗净，回收培养基中的Aβ和β-Alcα。用15％的Tris-Tricine凝胶(AnalBiochem.，1987，166(2)，368-379)进行SDS-PAGE后，进行转膜。膜在PBS中煮沸5分钟后，添加抗FLAG M2抗体(5μg/ml)(Sigma社)，进行孵育，使用蛋白质免疫印迹检测试剂ECL(GE Healthcare社)进行检测。将该信号使用Versadoc system(Bio-rad社)进行定量，求出蛋白质分泌率(以阴性对照的蛋白质分泌率为100％)。
(2)结果
如表8、9所示，对TLVM-5、7、8、9和11以0.2μmol/L的浓度、对TLVM-10以2μmol/L的浓度对细胞作用时，不抑制Alc α-C150的γ切断，而特异性地抑制APP-C99的切断。
由于能够确认特定浓度区域的抑制效果的特异性，因此，认为可以作为阿尔茨海默病的有用的治疗药物。
[表8]
HEK293细胞中各被检测物质添加时(0.2μmol/L)的Aβ和β-Alcα分泌率(％)
[表9]
HEK293细胞中各被检测物质添加时(2μmol/L)的Aβ和β-Alcα分泌率(％)
Figure GPA00001021153000332
序列表
<110>株式会社益力多本社
<120>新型γ分泌酶抑制剂
<130>YK0043
<140>JP 2007-207521
<141>2007-08-09
<160>3
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>357
<212>DNA
<213>智人
<400>1
atgctgcccg gtttggcact gctcctgctg gccgcctgga cggctcgggc ggatgcagat    60
gcagaattcc gacatgactc aggatatgaa gttcatcatc aaaaattggt gttctttgca    120
gaagatgtgg gttcaaacaa aggtgcaatc attggactca tggtgggcgg tgttgtcata    180
gcgacagtga tcgtcatcac cttggtgatg ctgaagaaga aacagtacac atccattcat    240
catggtgtgg tggaggttga cgccgctgtc accccagagg agcgccacct gtccaagatg    300
cagcagaacg gctacgaaaa tccaacctac aagttctttg agcagatgca gaactag       357
<210>2
<211>378
<212>DNA
<213>智人
<400>2
atgctgcccg gtttggcact gctcctgctg gccgcctgga cggctcgggc ggatgcagat    60
gcagaattcc gacatgacta caaggacgac gatgacaagt caggatatga agttcatcat    120
caaaaattgg tgttctttgc agaagatgtg ggttcaaaca aaggtgcaat cattggactc    180
atggtgggcg gtgttgtcat agcgacagtg atcgtcatca ccttggtgat gctgaagaag    240
aaacagtaca catccattca tcatggtgtg gtggaggttg acgccgctgt caccccagag  300
gagcgccacc tgtccaagat gcagcagaac ggctacgaaa atccaaccta caagttcttt  360
gagcagatgc agaactag                                                378
<210>3
<211>570
<212>DNA
<213>智人
<400>3
gccaccatgc tgcgccgccc cgctcccgcg ctggccccgg ccgcccggct gctgctggcc  60
gggctgctgt gcggcggcgg ggtctgggcc gattacaagg atgatgatga caagttcgtg  120
cacccggaac accgctcctt tgttgacctg tcaggccaca acctggccaa cccccacccg  180
ttcgcagtcg tccccagcac tgcgacagtt gtgatcgtgg tgtgcgtcag cttcctggtg  240
ttcatgatta tcctgggggt atttcggatc cgggccgcac atcggcggac catgcgggat  300
caggacaccg ggaaggagaa cgagatggac tgggacgact ctgccctgac catcaccgtc  360
aaccccatgg agacctatga ggaccagcac agcagtgagg aggaggagga agaggaagag  420
gaagaggaaa gcgaggacgg cgaagaagag gatgacatca ccagcgccga gtcggagagc  480
agcgaggagg aggaggggga gcagggcgac ccccagaacg caacccggca gcagcagctg  540
gagtgggatg actccaccct cagctactga                                   570

Claims (10)

1.一种以下述式(2)的结构表示的化合物或其药学上可接受的盐，
Figure FSB00001093223900011
式中，R1表示碳原子数为1～4的直链或支链的烷基或苯基，R2表示可以取代有1个以上的苯基或卤代苯基的碳原子数为1～4的直链或支链的烷基，R3表示具有1个羟基的碳原子数为1～4的直链或支链的烷基，R4表示碳原子数为1～4的直链或支链的烷基。
2.如权利要求1所述的化合物或其药学上可接受的盐，以下述式(3)的结构表示，
Figure FSB00001093223900012
式中，R1和R2同上。
3.一种选自下列物质的化合物或其药学上可接受的盐，
[5S-(叔丁氧基羰基氨基)-4R，6R-二羟基-2R-(2-甲基丙基)庚酰]-L-缬氨酰-L-蛋氨酸苯甲酰胺，
[5S-(叔丁氧基羰基氨基)-4R，6R-二羟基-2R-(2-甲基丙基)庚酰]-L-缬氨酰-L-蛋氨酸正丁酰胺，
[5S-(叔丁氧基羰基氨基)-4R，6R-二羟基-2R-(2-甲基丙基)庚酰]-L-缬氨酰-L-蛋氨酸(S)-α-甲基苯甲酰胺，
[5S-(叔丁氧基羰基氨基)-4R，6R-二羟基-2R-(2-甲基丙基)庚酰]-L-缬氨酰-L-蛋氨酸-4-氟代苯甲酰胺，
[5S-(叔丁氧基羰基氨基)-4R，6R-二羟基-2R-(2-甲基丙基)庚酰]-L-丙氨酰-L-蛋氨酸苯甲酰胺，
[5S-(叔丁氧基羰基氨基)-4R，6R-二羟基-2R-(2-甲基丙基)庚酰]-L-苯基甘氨酰-L-蛋氨酸苯甲酰胺。
4.一种药品，其含有权利要求1～3中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐。
5.一种γ分泌酶抑制剂，其含有权利要求1～3中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐。
6.一种淀粉样蛋白质生成抑制剂，其含有权利要求1～3中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐。
7.一种γ分泌酶参与的疾病的预防、治疗剂，其含有权利要求1～3中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐。
8.权利要求1～3中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐在制造γ分泌酶抑制剂中的使用。
9.权利要求1～3中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐在制造淀粉样蛋白质生成抑制剂中的使用。
10.权利要求1～3中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐在制造γ分泌酶参与的疾病的预防、治疗剂中的使用。
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Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EA201171143A1 (ru) * 2009-03-19 2012-03-30 Бристол-Маерс Сквибб Компани Новое соединение альфа-(n-сульфонамидо)ацетамида в качестве ингибитора продукции бета амилоидного пептида
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JP2016204397A (ja) * 2016-09-14 2016-12-08 国立大学法人京都大学 アルツハイマー病予防薬
CA3108275A1 (en) 2018-08-10 2020-02-13 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Stem cell derived islet differentiation
AU2022377078A1 (en) 2021-11-01 2024-04-04 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Stem cell derived pancreatic islet differentiation

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP4344518B2 (ja) * 2000-12-28 2009-10-14 オクラホマ メディカル リサーチ ファウンデーション メマプシン２のインヒビターおよびその使用
US20040121947A1 (en) 2000-12-28 2004-06-24 Oklahoma Medical Research Foundation Compounds which inhibit beta-secretase activity and methods of use thereof
AU2002359301B2 (en) 2001-10-23 2008-07-03 Comentis, Inc. Beta-secretase inhibitors and methods of use
US7585938B2 (en) 2002-04-24 2009-09-08 Hiroshi Mori Gamma-secretase inhibitors

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EA017495B1 (ru) 2012-12-28
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