WO2010100914A1 - 液体クロマトグラフ及び分析方法 - Google Patents

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Definitions

  • the present invention relates to a liquid chromatograph and an analysis method using a post-column method.
  • Liquid chromatography using the post-column method is an analysis method in which one or more reaction reagents are mixed with the sample eluted from the separation column, and the resulting reaction product is detected. And are often used to measure substances that do not have UV absorption.
  • FIG. 7 is a block diagram of a conventional high performance liquid chromatograph using a post column method.
  • the high-performance liquid chromatograph includes a mobile phase feed pump 1, an injector 2 for injecting a sample, a separation column 3 for separating a sample, a column oven 4 for keeping the separation column 3 at a constant temperature, and a sample eluted from the separation column 3 T joint 5 with a three-way joint structure for mixing reagents, piping 6 flowing while the sample eluted from separation column 3 and reaction reagents are mixed, detector 7 for detecting a target component in the sample, and delivery of reaction reagents
  • the reaction reagent delivery pump 8 is provided.
  • the sample is injected from the injector 2, passes through the separation column 3 by the mobile phase fed from the mobile phase feed pump 1, and is separated.
  • the separated sample is mixed with the reaction reagent fed from the reaction reagent feed pump 8 at T joint 5 to react, passes through the pipe 6 and is detected by the detector 7.
  • the resolution is improved by making the column packing in the separation column 3 as small as about 2 ⁇ m, so the separation capacity can be increased by increasing the linear flow rate of the mobile phase and reducing the separation column 3 accordingly. It can be maintained to reduce analysis time, but the pressure on the pump will rise.
  • a liquid chromatograph apparatus having a pump pressure resistance of about 40 MPa has been widely used.
  • the lineup of liquid chromatograph devices hereinafter referred to as “ultra-high-speed chromatograph” with pump pressure resistance greater than 40 MPa .
  • the internal volume of this reagent mixing reaction part Although the mixing and reaction will be carried out sufficiently if D is increased, diffusion of the target component will occur and the detection peak of the target component of the chromatogram will spread and become broad. As a result, the separation performance and the sensitivity are reduced.
  • Patent Document 1 when the mixing reaction is performed at a low flow rate of, for example, 0.5 mL / min or less, the effects of the above problems are significant, and the inventions described in Patent Document 1, Patent Document 2, and Patent Document 3 are special A reagent mixing and reaction unit having the following structure has been proposed.
  • the present invention is an ultra high performance liquid chromatograph which can be used for a post column method which prevents the detection peak of a chromatogram from becoming broad and which does not require a decrease in sensitivity without requiring a reagent mixing reaction part of a special structure. And it aims at providing the method.
  • a mobile phase transport unit that transports a mobile phase, an injector that injects a sample into the mobile phase, a separation column that separates the sample, and after passing through the separation column
  • the reaction reagent sending part for sending the reaction reagent to the mobile phase, the joint part for mixing the mobile phase and the reaction reagent after passing through the separation column, the piping through which the sample reacts with the reaction reagent, the reaction reagent And a detector for detecting a reacted sample, the pressure being added to the upstream side of the detector so as to increase the pressure of the reaction reagent sent from the reaction reagent sending section up to the pressure of the mobile phase.
  • a pressure means is provided.
  • the upstream side is the mobile phase and mobile phase liquid feed pump side
  • the downstream side is the detector side.
  • FIG. 1 shows a first embodiment of the present invention, and is a configuration diagram showing a main configuration of a liquid chromatograph. It is a figure of the chromatogram obtained by the conventional liquid chromatograph.
  • FIG. 2 is a diagram of a chromatogram obtained by a liquid chromatograph according to the invention. It is a figure of a baseline chromatogram when the pressure applied to the reaction reagent delivery pump is changed. It is a figure of a baseline chromatogram when the internal volume of T joint is changed. It is a figure of the chromatogram of organic acid analysis which applied the post column method. It is a block diagram which shows the main structures of the liquid chromatograph which performs the conventional post column method.
  • FIG. 1 It is a block diagram which shows the 2nd Example of this invention, and shows the main structures of the liquid chromatograph which performs a post-column method. It is a figure of the chromatogram which measured relative fluorescence intensity for a relatively long time using the ultra-fast liquid chromatograph shown in FIG. It is a figure of the chromatogram which shows the difference in the detection peak by the difference in the inner diameter of piping.
  • FIG. 1 shows a first embodiment of the present invention and is a block diagram showing the main configuration of a liquid chromatograph. Reference numerals in the figure are the same as those shown in FIG. 7, but a pressure unit, ie, pressure, is provided between the reagent mixing / reacting unit having T joint 5 and piping 6 and reaction reagent delivery pump 8. The point which provided the coil 9 differs from FIG.
  • the pressurizing unit is a pipe through which the reaction reagent can flow.
  • the liquid chromatograph of this example is an ultra-high-speed liquid chromatograph using a post-column method, and the pressure resistance of the mobile phase liquid transfer pump 1 is greater than 40 MPa, and the particle diameter of the filler of the separation column 3 is 3 ⁇ m, such as 2 ⁇ m. It is smaller.
  • the volume of the T joint 5 is set to 1 ⁇ L or less.
  • a pressure coil 9 for increasing the pressure applied to the reaction reagent delivery pump 8 is connected between the T-joint 5 and the reaction reagent delivery pump 8.
  • the pressurizing coil 9 has a long length in order to increase the internal resistance of the pipe, and is compacted in a coil shape for storage in the apparatus. As a result, it is possible to suppress and stabilize the pulsation of liquid transfer of the reaction reagent liquid transfer pump 8 and to increase the detection sensitivity.
  • FIG. 2 and 3 are diagrams of chromatograms obtained by liquid chromatograph
  • FIG. 2 is a chromatogram obtained by the conventional method as a comparative example
  • FIG. 3 is obtained by the method of this embodiment. It is a chromatogram. The analysis conditions when these chromatograms are obtained are shown below.
  • the T-joint 5 to be used has an internal volume of 2.1 ⁇ L
  • the pipe 6 is a pipe having an inner diameter of 0.25 mm used in the conventional post-column method, and measured under the above analysis conditions, as shown in FIG. A chromatogram was obtained.
  • the reaction reagent liquid sending section for sending the reaction reagent by setting the withstand pressure of the entire system including the separation column 3 and the piping to be greater than 40 MPa.
  • the pressure coil 9 is connected in such a way that the pressure applied to the pressure is equal to that of the mobile phase feed pump 1 for feeding the mobile phase. Thereby, it is possible to suppress and stabilize the pulsation of the liquid transfer of the reaction reagent liquid transfer pump 8.
  • the joint where the sample eluted in the separation column 3 and the reaction reagent are mixed, that is, the T joint 5 has an internal volume of 0.57 ⁇ L.
  • the pipe 6 connecting the T-joint 5 and the detector 7 directly connects an inlet tube of an inner diameter of 0.1 mm with an inner diameter of 0.13 mm or less in order to minimize the internal volume. It is desirable that the detector 7 can collect data at a speed of 50 ms or less and a response speed of 50 ms or less, with a low capacity flow cell, and a detection collection interval of 200 ms or less.
  • the rising of the detection peak of the target component is sharpened, the spread can be suppressed, and the degree of separation can be improved.
  • the detection peak of the chromatogram is prevented from becoming broad by using a T joint having an internal volume of 1 ⁇ L and a pipe having an inner diameter of 0.13 mm or less in the liquid chromatograph of the post column method according to this embodiment. And, a drop in sensitivity can be prevented.
  • FIG. 4 is a diagram of a baseline chromatogram when the pressure applied to the reaction reagent delivery pump 8 is changed.
  • the pressure applied to the reaction reagent feed pump 8 was set to 34 MPa for case a, 9.4 MPa for case b, and 0 MPa for case c, and the baseline was measured. Comparing the above three cases, noise is reduced when the pressure in case a is high. That is, it can be seen that the noise can be reduced as the pressure becomes closer to that of the mobile phase liquid transfer pump 1.
  • the inside diameter of the pressure coil 9 is preferably 0.13 mm or less. Alternatively, when the inner diameter is 0.13 mm or more, the pressure applied to the reaction reagent delivery pump 8 can be increased by increasing the length of the pressure coil 9.
  • FIG. 5 is a diagram of a baseline chromatogram when the internal volume of the T-joint 5 is changed. Since the size of the internal volume of the T joint 5 for mixing the sample eluted from the separation column 3 and the reaction reagent affects the mixing efficiency, the internal volume of the T joint 5 is desirably 1 ⁇ L or less. In the figure, the measurement was performed using 0.57 ⁇ L for the case a and 2.06 ⁇ L for the case b as the internal volume of the T joint 5. In case a, the noise of the baseline is reduced, and it can be seen that as the internal volume of the T joint 5 is smaller, the mixture of the sample eluted from the separation column 3 and the reaction solution becomes more uniform.
  • FIG. 6 is a diagram of a chromatogram of an organic acid analysis to which the BTB post-column method is applied using a bromothymol blue (BTB) solution as a reaction reagent using the ultra-high performance liquid chromatograph according to the present invention shown in FIG. It is. As shown in the figure, the spread of the detection peak is suppressed, and it is possible to suppress the diffusion of the target component in the reagent mixing reaction section and measure the target component.
  • BTB bromothymol blue
  • a method which enables reaction of bromothymol blue solution by BTB post column method using a reverse phase mode separation column having hydrophilicity. . Since this analysis is performed using an ultra-high-speed liquid chromatograph in which the pressure resistance of the mobile phase liquid transfer pump 1 is greater than 40 MPa using a small separation column in which the particle diameter of the column packing is 2 ⁇ m, the mobile phase line Compared with the analysis of organic acid using BTB post column method, the separation column using the conventional ion exclusion mode and the ion exchange mode packing agent becomes faster without increasing the flow rate and lowering the separation performance. The measurement time can be shortened to about one-half. In addition, since the amount of use of the mobile phase and the reagent is reduced, there is an effect that these can be saved.
  • FIG. 8 shows a second embodiment of the present invention, and is another configuration diagram of a high performance liquid chromatograph using a post column method.
  • the high-performance liquid chromatograph includes a mobile phase feed pump 1, an injector 2 for injecting a sample, a separation column 3 for separating a sample, a column oven 4 for keeping the separation column 3 at a constant temperature, and a sample eluted from the separation column 3 T joint 5 with a three-way joint structure for mixing reagents, piping 6 flowing while the sample eluted from separation column 3 and reaction reagents are mixed, detector 7 for detecting a target component in the sample, and delivery of reaction reagents
  • the reaction reagent delivery pump 8 is provided.
  • the sample is injected from the injector 2, passes through the separation column 3 by the mobile phase fed from the mobile phase feed pump 1, and is separated.
  • the separated sample is mixed with the reaction reagent fed from the reaction reagent feed pump 8 at the T joint 5 and passes through the pipe 10 while being reacted and detected by the detector 7.
  • the internal volume of the T joint 5 is 0.57 ⁇ L which is less than 1 ⁇ L as in the first embodiment
  • the pipe connecting the T joint 5 and the detector 7 is the first embodiment.
  • a pipe 10 with an inner diameter of 0.1 mm and a length of 1 m is used. As it has a length of 1 m, when it is stored in the device, it is made compact, for example, in a coil shape as shown in the figure. By lengthening the length of the pipe 10, the pressure of the liquid transfer from the reaction reagent transfer pump 8 can be increased.
  • This pipe has a pressurizing function similar to that of the pressurizing coil 9 in the first embodiment, and the length of the pipe 10 is preferably a pressure similar to that applied to the mobile phase liquid feeding pump 1 to the T joint 5
  • FIG. 9 is a diagram of a chromatogram in which relative fluorescence intensity was measured for a relatively long time using the ultra-high performance liquid chromatograph shown in FIG. 8, wherein an orthophthalaldehyde (OPA) solution is used as a reaction reagent, amino acids, etc.
  • OPA orthophthalaldehyde
  • An example of the chromatogram which applied the OPA method post column method is shown for analysis of the compound which has an amino group.
  • the vertical axis represents relative fluorescence intensity
  • the horizontal axis represents elution time.
  • the spread of the detection peak of the target component in the separation column is determined using a known calculation formula to verify the effect of the present invention.
  • the spread of the detection peak of the target component in the separation column can be expressed as the dispersion ⁇ c with reference to the high performance liquid chromatography handbook Kanto branch of the Japan Society for Analytical Chemistry, Maruzen (March 2000). expressed.
  • ⁇ c 0.6 ⁇ dc 2 h dp (N) 1/2 (1 + k) / 4 equation 1
  • dc is the diameter of the separation column
  • h the reduced theoretical height
  • dp the particle diameter of the filler
  • N the number of theoretical plates
  • k the retention coefficient.
  • dc 2 mm
  • h 4
  • dp 2 ⁇ m
  • N 10000
  • k 0, ⁇ c is 1.5 ⁇ L.
  • the detection peak has already spread at the connection, and if the pipe with an inner diameter of 0.25 mm is used, the spread becomes larger as with the connection, but by using a pipe with an inner diameter of 0.13 mm or less, the influence from the connection by one digit or more Less and the spread is virtually negligible.
  • the configuration of any one or the combination of them can provide an ultra-high performance liquid chromatograph which prevents the detection peak of the target component from spreading and becoming broad and prevents the decrease in sensitivity.
  • FIG. 10 is a chromatogram showing differences in detected peaks due to differences in inner diameter of piping.
  • the length of the pipe 10 was fixed at 1 m, and analysis was performed using four types of commercially available products whose inner diameters are 0.1 mm, 0.13 mm, 0.25 mm, and 0.3 mm.
  • the T joint 5 in the figure, the reaction reagent feed pump 8, and the pipe 10 are removed, and the shortest distance between the column 3 and the detector 7 is 0.1 mm pipe with an inner diameter of 0.13 mm or less.
  • the piping connected by was used, it was 0.033 minutes when analysis was conducted.
  • the vertical axis in FIG. 10 is the half width (in units) of the detection peak of the chromatogram.
  • the peak half value widths when the inner diameter of the pipe 10 is 0.1 mm and 0.13 mm are 0.036 minutes and 0.037 minutes, and when the inner diameter is 0.25 mm or 0.3 mm, 0.047 minutes or 0.050 Much less than a minute.
  • the spread in the pipe is proportional to the square of the inner diameter of the pipe, as shown by the equation (3) above.
  • the spread of the pipe having an inner diameter of 0.1 mm is 1, it becomes 1.7, 6.3, and 9.0 for 0.13 mm, 0.25 mm, and 0.3 mm, respectively, which matches the present data.
  • the peak half value width when the inner diameter of the pipe 10 is 0.1 mm and 0.13 mm is a value close to that in the example shown in FIG. 1, and if the inner diameter of the pipe 10 is 0.13 mm or less, It can be seen that it is possible to suppress the spread of the detection peak of the gram and prevent it from becoming broad.
  • the present invention can be applied to a liquid chromatograph which can prevent the detection peak of a chromatogram from becoming broad and can be used in a post-column method in which a decrease in sensitivity is prevented.

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Abstract

　ポストカラム法を用いた高速液体クロマトグラフ分析において、特別な混合反応部を備えずともカラムから溶出された試料と反応試薬との混合精度を保ち、かつ目的成分の拡散を防ぎ、高感度に測定することができる液体クロマトグラフを提供することを目的とする。　本発明の液体クロマトグラフは、移動相送液ポンプ１の耐圧が４０ＭＰａより大きく、分離カラム３の充填剤の粒子径が３μｍより小さく、反応試薬送液ポンプ８には、反応試薬送液ポンプ８にかかる圧力を上げる加圧コイル９が接続されている。

Description

液体クロマトグラフ及び分析方法
　本発明は、ポストカラム法を用いた液体クロマトグラフ及び分析方法に係るものである。
　ポストカラム法を用いた液体クロマトグラフは、分離カラムから溶出された試料に１つ以上の反応試薬を混合し、得られる反応物を検出する分析法であり、高い選択性を必要とする測定や、ＵＶ吸収を持たない物質の測定などに多く利用されている。
　図７は、ポストカラム法を用いた従来の高速液体クロマトグラフの構成図である。高速液体クロマトグラフは、移動相送液ポンプ１、試料を注入するためのインジェクタ２、試料を分離する分離カラム３、分離カラム３を恒温に保つカラムオーブン４、分離カラム３から溶出した試料と反応試薬を混合するための３方ジョイント構造のＴジョイント５、分離カラム３から溶出した試料と反応試薬が混合されながら流れる配管６、試料中の目的成分を検出する検出器７、反応試薬を送液する反応試薬送液ポンプ８を備えている。試料はインジェクタ２から注入され、移動相送液ポンプ１から送液される移動相によって分離カラム３を通過し、分離する。分離した試料はＴジョイント５で反応試薬送液ポンプ８から送液される反応試薬と混合されて反応し、配管６を通過して検出器７で検出される。
　液体クロマトグラフでは、分離カラム３中のカラム充填剤を２μｍ程度に細かくすることにより、分離能が向上するため、その分移動相の線流速を早くし分離カラム３を小さくすることで分離能を維持して分析時間を短縮できるが、ポンプにかかる圧力は上昇する。従来は、カラム充填剤の粒子径が３から５μｍを想定し、ポンプの耐圧が４０ＭＰａ程度の液体クロマトグラフ装置が普及していた。しかし、２００４年以降、カラム充填剤の粒子径が３μｍより小さいものを想定し、ポンプの耐圧が４０ＭＰａより大きい液体クロマトグラフ装置（以下、「超高速クロマトグラフ」と称する）を各社ラインアップしてきた。なお、市販されている超高速クロマトグラフ用のカラムとしては、株式会社日立ハイテクノロジーズ製　ＬａＣｈｒｏｍＵｌｔｒａ　Ｃ１８（充填剤の粒子径２μｍ）、Ａｇｉｌｅｎｔ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ　Ｉｎｃ．製　ＺＯＲＢＡＸ　ＳＢ－Ｃ１８（充填剤の粒子径１．８μｍ）、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ　Ｉｎｃ．製　Ａｓｃｅｎｔｉｓ　ＲＰ－Ａｍｉｄｅ（充填剤の粒子径２．７μｍ）などがあり、耐圧上限は前者が５０ＭＰａ、後２者が６０ＭＰａである。なお、ポンプなど装置やカラムを日常用いるときに、耐圧上限値の半分、若しくはそれ以下で用いることが多い。現在、液体クロマトグラフは、耐圧４０ＭＰａ以下の高速液体クロマトグラフと４０ＭＰａより大きい超高速液体クロマトグラフの２つに分類される。
　従来、上述の超高速液体クロマトグラフを用いたポストカラム法による分析例は公表されていない。以下のような問題によると考えられる。
　図７に示す分離カラム３から溶出された試料と反応試薬が混合するＴジョイント５と検出器７までの配管６を含む流路を試薬混合反応部とよぶと、この試薬混合反応部の内部容量を大きくすると混合および反応は十分行われるが、目的成分の拡散が起こって、クロマトグラムの目的成分の検出ピークが広がってブロードになってしまう。これにより、分離性能や感度が低下してしまう。
　一方、試薬混合反応部の内部容量を小さくすると、混合および反応が十分に行われず、クロマトグラムのベースラインノイズが増大してしまい、感度が低下してしまう。
　特に、例えば０．５ｍＬ／ｍｉｎ以下の低流量で混合反応を行う場合、前記問題の影響が大きく、特許文献１，特許文献２，特許文献３に記載された発明では混合効率を上げるための特別な構造を備える試薬混合反応部が提案されている。
：特開２００２－１３１３２６号公報 ：特開２００５－６９８１８号公報 ：特開平８－３０４３７３号公報
　本発明は、特別な構造の試薬混合反応部を必要とせず、クロマトグラムの検出ピークがブロードになるのを防止し、かつ、感度の低下を防止したポストカラム法に利用できる超高速液体クロマトグラフ及びその方法を提供することを目的とする。
　上記課題を解決するために、本発明の実施態様は、移動相を送液する移動相送液部と、移動相に試料を注入するインジェクタと、試料を分離する分離カラムと、分離カラム通過後の移動相に反応試薬を送液する反応試薬送液部と、分離カラム通過後の移動相と反応試薬とが混合するジョイント部と、試料が反応試薬と反応して通過する配管と、反応試薬と反応した試料を検出する検出器とを備えた液体クロマトグラフであって、反応試薬送液部から送液される反応試薬の圧力を移動相の圧力まで高めるように検出器の上流側に加圧手段を設けたことを特徴とする。ここで上流側とは、移動相及び移動相送液ポンプ側であり、下流側とは検出器側である。
　本発明によれば、クロマトグラムの検出ピークがブロードになるのを防止し、かつ、感度の低下を防止したポストカラム法に利用できる液体クロマトグラフ及び液体クロマトグラフ分析方法を提供することができる。
本発明の第一の実施例を示し、液体クロマトグラフの主な構成を示す構成図である。 従来の液体クロマトグラフで得られたクロマトグラムの図である。 本発明による液体クロマトグラフで得られたクロマトグラムの図である。 反応試薬送液ポンプにかける圧力を変化させたときのベースラインクロマトグラムの図である。 Ｔジョイントの内部ボリュームを変えたときのベースラインクロマトグラムの図である。 ポストカラム法を適応した有機酸分析のクロマトグラムの図である。 従来のポストカラム法を行う液体クロマトグラフの主な構成を示す構成図である。 本発明の第二の実施例を示し、ポストカラム法を行う液体クロマトグラフの主な構成を示す構成図である。 図８に示した超高速液体クロマトグラフを用いて、比較的長時間相対蛍光強度を測定したクロマトグラムの図である。 配管の内径の違いによる検出ピークの違いを示すクロマトグラムの図である。
　以下、図面を参照して本発明の実施例を説明する。
　図１は、本発明の第一の実施例を示し、液体クロマトグラフの主な構成を示す構成図である。図中の参照符号は、図７に示すものと同様であるが、Ｔジョイント５と配管６とを構成とする試薬混合反応部と反応試薬送液ポンプ８との間に加圧部即ち加圧コイル９を設けた点が、図７と異なる。加圧部はその内部に反応試薬が流通しうる配管である。
　本実施例の液体クロマトグラフは、ポストカラム法を用いた超高速液体クロマトグラフであり、移動相送液ポンプ１の耐圧が４０ＭＰａより大きく、分離カラム３の充填剤の粒子径が２μｍ等の３μｍより小さいものである。つまり、超高速液体クロマトグラフにおいてポストカラム法を実現することを提案する。
　このために、本実施例では、Ｔジョイント５の容積を１μＬ以下とした。、反応試薬送液ポンプ８にかかる圧力を上げるための加圧コイル９をＴジョイント５と反応試薬送液ポンプ８の間に接続する。加圧コイル９は、配管の内部抵抗を上げるために長さを長くし、装置に収納するためにコイル状にコンパクトにしている。これにより、反応試薬送液ポンプ８の送液の脈動を抑えて安定化させ、検出感度を上げることができる。
　図２および図３は、液体クロマトグラフで得られたクロマトグラムの図であり、図２は、比較例として従来の方法により得られたクロマトグラム、図３は、本実施例の方法により得られたクロマトグラムである。これらのクロマトグラムを得たときの分析条件を、以下に示す。
　　移動相：３ｍＭ過塩素酸溶液
　　移動相流量：０．４ｍＬ／ｍｉｎ
　　カラム温度：２５℃
　　注入量：１μＬ
　　反応試薬：ブロモチモールブルー（ＢＴＢ）溶液
　　反応試薬流量：０．５ｍＬ／ｍｉｎ
　　検出器：可視光検出器（検出波長４４０ｎｍ）
　図７に示した従来の液体クロマトグラフを用いた場合、反応試薬を送液する反応試薬送液ポンプ８にかかる圧力は３ＭＰａ以下であり、分離カラム３から溶出された試料と反応試薬とが混合するＴジョイント５は内部ボリュームが２．１μＬのものを用い、配管６は従来のポストカラム法で用いられている内径０．２５ｍｍの配管を使用し、上記分析条件で測定し、図２に示すクロマトグラムを得た。
　図７に示すＴジョイント５と配管６を構成する従来の試薬混合反応部を用いた場合、図２に示すようにクロマトグラムの目的成分の検出ピークがすそ広がりに広がってブロードになり、分離度が悪くなっている。これは、試薬混合反応部の内部ボリューム容量が大きいために、目的成分の拡散が起こってしまうことが原因と考えられる。
　一方、図１に示す本発明による液体クロマトグラフでは、分離カラム３や配管を含むシステム全体の耐圧を４０ＭＰａより大きくし、反応試薬を送液する反応試薬送液部すなわち、反応試薬送液ポンプ８にかかる圧力を、移動相を送液する移動相送液ポンプ１と同等の圧力になるように加圧コイル９を接続している。これにより、反応試薬送液ポンプ８の送液の脈動を押さえ安定化させることができる。分離カラム３で溶出された試料と反応試薬とが混合するジョイント部すなわち、Ｔジョイント５には、内部ボリュームが０．５７μＬのものを用いている。Ｔジョイント５と検出器７とを接続する配管６は、内部ボリュームを最小限とするために、内径０．１３ｍｍ以下の内径０．１ｍｍの検出器のインレットチューブを直接接続している。検出器７は、フローセルが低容量のもので、検出の収集間隔が２００ｍｓ以下、応答速度が５０ｍｓ以下の速度でデータを収集できることが望ましい。
　図３に示すクロマトグラムは、図２と比較すると、目的成分の検出ピークの立ち上がりが急になり、広がりを抑えることができ、分離度を改善することができた。このように、本実施例によるポストカラム法の液体クロマトグラフに内部ボリュームが１μＬのＴジョイントと内径０．１３ｍｍ以下の配管を用いることにより、クロマトグラムの検出ピークがブロードになるのを防止し、かつ、感度の低下を防止することができる。
　図４は、反応試薬送液ポンプ８にかける圧力を変化させたときのベースラインクロマトグラムの図である。反応試薬送液ポンプ８にかける圧力を、ケースａが３４ＭＰａ、ケースｂが９．４ＭＰａ、ケースｃが０ＭＰａとし、ベースラインを測定した。以上の３ケースを比較すると、ケースａの圧力が高い方がノイズが低減されている。すなわち、移動相送液ポンプ１と同等の圧力に近づけるほどノイズが低減できることがわかる。図１に示すように反応試薬送液ポンプ８の下流側に加圧コイル９を設けることにより、反応試薬送液ポンプ８にかける圧力を高くすることができる。加圧コイル９の内径は、０．１３ｍｍ以下の配管を用いることが望ましい。あるいは、内径が０．１３ｍｍ以上の場合、加圧コイル９の長さをより長くすることにより、反応試薬送液ポンプ８にかける圧力を高くすることができる。
　図５は、Ｔジョイント５の内部ボリュームを変えたときのベースラインクロマトグラムの図である。分離カラム３から溶出した試料と反応試薬とを混合するＴジョイント５の内部ボリュームの大小が、混合効率に影響するため、Ｔジョイント５の内部ボリュームは、１μＬ以下とすることが望ましい。図では、Ｔジョイント５の内部ボリュームとして、ケースａは０．５７μＬ、ケースｂは２．０６μＬを用いて測定を行った。ケースａの方が、ベースラインのノイズが低減されており、Ｔジョイント５の内部ボリュームが小さいほど、分離カラム３から溶出した試料と反応液との混合が均一になることがわかる。
　図６は、図１に示した本発明による超高速液体クロマトグラフを用いて、ブロモチモールブルー（ＢＴＢ）溶液を反応試薬として用いたＢＴＢ法ポストカラム法を適応した有機酸分析のクロマトグラムの図である。図に示されるように、検出ピークの広がりが抑制されており、試薬混合反応部における目的成分の拡散を抑え、目的成分を測定することが可能となっている。
　ＢＴＢ法ポストカラム法を用いた有機酸の分析には、イオン排除モードとイオン交換モードの充填剤を用いた分離カラムを使用することが一般的である。有機酸の分離のために、逆相モードを用いた分離も可能であるが、分離カラムへの保持を強くするために水系の移動相の割合が大きくなり、通常の逆相モードのカラムでは安定性の観点より好ましくない。しかし、親水性のアミド基と逆相のＣ１８（オクタデシル）の両方の官能基を持つ親水性を兼ね備えた逆相モードの分離カラムを使用することで、水系の移動相のみでも安定して高い分離性能が得られるので、図６に示した本実施例では、親水性を兼ね備えた逆相モードの分離カラムを用い、ＢＴＢ法ポストカラム法によるブロモチモールブルー溶液反応を可能とする方法を用いている。この分析を、カラム充填剤の粒子径が２μｍである小型の分離カラムを用い、移動相送液ポンプ１の耐圧を４０ＭＰａより大きくした超高速の液体クロマトグラフを用いて行うので、移動相の線流速が早くなり、分離性能を低下させずに従来のイオン排除モードとイオン交換モードの充填剤を用いた分離カラムで、ＢＴＢ法ポストカラム法を用いた有機酸の分析に比べ、従来法の１０分の１程度にまで測定時間の短縮が可能となる。また、移動相、試薬の使用量が減るので、これらが節約できるという効果がある。
　図８は本発明の第二の実施例を示し、ポストカラム法を用いた高速液体クロマトグラフの別の構成図である。高速液体クロマトグラフは、移動相送液ポンプ１、試料を注入するためのインジェクタ２、試料を分離する分離カラム３、分離カラム３を恒温に保つカラムオーブン４、分離カラム３から溶出した試料と反応試薬を混合するための３方ジョイント構造のＴジョイント５、分離カラム３から溶出した試料と反応試薬が混合されながら流れる配管６、試料中の目的成分を検出する検出器７、反応試薬を送液する反応試薬送液ポンプ８を備えている。試料はインジェクタ２から注入され、移動相送液ポンプ１から送液される移動相によって分離カラム３を通過し、分離する。分離した試料はＴジョイント５で反応試薬送液ポンプ８から送液される反応試薬と混合されて、配管１０内で反応しながら通り検出器７で検出される。
　図８において、Ｔジョイント５の内部ボリュームは、第一の実施例と同じく１μＬ以下の０．５７μＬのものを使用し、Ｔジョイント５と検出器７とを接続する配管は、第一の実施例で用いた配管６に加え、内径０．１ｍｍ、長さ１ｍの配管１０を用いる。長さが１ｍあるので、装置に収納する際には、図に示すように例えばコイル状にしてコンパクトにする。配管１０の長さを長くすることで、反応試薬送液ポンプ８からの送液の圧力を高くすることができる。
　この配管は実施例１における加圧コイル９と同様な加圧機能を有し、配管１０の長さは、好ましくは、移動相送液ポンプ１にかける圧力と同程度の圧力をＴジョイント５に与えるのに必要な長さで、たとえば０．８ｍ程度もしくはそれ以上である。また、Ｔジョイントにおける圧力が高すぎることのないように、配管の長さを設定する。
　図９は、図８に示した超高速液体クロマトグラフを用いて、比較的長時間相対蛍光強度を測定したクロマトグラムの図であり、反応試薬にオルトフタルアルデヒド（ＯＰＡ）溶液を用い、アミノ酸などアミノ基を有する化合物の分析のために、ＯＰＡ法ポストカラム法を適応したクロマトグラムの一例を示している。縦軸は相対蛍光強度を、横軸は溶出時間を表す。
　図９に示したクロマトグラムを得るときの分析条件を以下に示す。
　　分離カラム：内径２．１ｍｍ、長さ１００ｍｍ
　　充填剤：粒子径２μｍ　シリカＯＤＳ（オクシデンタルシリル基で表面が修飾された化学結合型多孔性球状シリカゲル充填剤）
　　移動相：２０ｍモル／Ｌ　りん酸緩衝液、ヘキサンスルホン酸ナトリウム／アセトニトリル＝９２／８（モル比）
　　移動相流量：０．４ｍＬ／ｍｉｎ
　　カラム温度：２５℃
　　注入量：１μＬ
　　反応試薬：オルトフタルアルデヒド（ＯＰＡ）溶液
　　反応試薬流量：０．４ｍＬ／ｍｉｎ
　　検出器：蛍光検出器（励起波長３４５ｎｍ、蛍光波長４５０ｎｍ）
　このように、ＯＰＡ法ポストカラム法においても、低容量のジョイントと内径０．１３ｍｍ以下の配管を用いる本発明の構成を採用することにより、クロマトグラムの目的成分の検出ピークの広がりを抑えることができる。
　ここで、分離カラム内での目的成分の検出ピークの広がりを、既知の算出式を用いて求め、本発明の効果を検証する。文献「高速液体クロマトグラフィーハンドブック」日本分析化学会関東支部編、丸善（２０００年３月）を参考にして、分離カラム内での目的成分の検出ピークの広がりを分散σｃで表すと、次式で表される。
σｃ＝０．６πｄｃ２　ｈｄｐ（Ｎ）１／２（１＋ｋ）／４　　　　　…数１
　但し、ｄｃは分離カラムの直径、ｈは換算理論高さ、ｄｐは充填剤の粒子径、Ｎは理論段数、ｋは保持係数である。ｄｃ＝２ｍｍ、ｈ＝４、ｄｐ＝２μｍ、Ｎ＝１００００、ｋ＝０とすると、σｃは１．５μＬとなる。
　分離カラム外での広がりを分散σｅｘとし、この標準偏差をａとすると、両者の関係は次式で表される。
（（１＋ａ）σｃ）２　＝σｃ２　＋σｅｘ２　　　　　　　　　　　　…数２
　目的成分の検出ピークの広がりを２０％まで許容すると、ａ＝０．２として、σｅｘ＝１μＬとなる。さらに、試薬混合反応部と検出器とを接続する配管が設けられており、この配管の内径は０．１３ｍｍ以下である。配管内での試料の広がり（σｐ）は、日本国特許出願公開公報、特開２００２－２４３７１５号公報の記載によれば、次式で表される。
σｐ２　＝ｒ４　ｖＬｐ／２４Ｄｍ　　　　　　　　　　　　　　　　…数３
　但しｒは配管内径の半径、ｖは流速、Ｌｐは配管の長さ、Ｄｍは溶質の拡散係数である。ｖ＝１．２ｍｌ／ｍｉｎ、Ｌｐ＝１００ｃｍ、
Ｄｍ＝１．２×１０－９　（ｍ２／ｓ）として、一般に高速液体クロマトグラフ用に販売されている内径０．２５ｍｍと０．１３ｍｍの配管で比較すると、内径０．２５ｍｍでは０．５３μＬ、内径０．１３ｍｍでは０．０４μＬとなる。接続部において既に検出ピークが広がっており、内径０．２５ｍｍの配管を用いれば接続部と同様に広がりが大きくなるが、内径０．１３ｍｍ以下の配管を用いることにより接続部より１桁以上影響が少なくなり、広がりが事実上無視できる。これらのいずれかまたは組み合わせの構成により、目的成分の検出ピークが広がってブロードになるのを防止し、かつ、感度の低下を防止した超高速液体クロマトグラフを提供することができる。
　図１０は、配管の内径の違いによる検出ピークの違いを示すクロマトグラムの図である。配管１０の長さは１ｍで一定とし、配管の内径が０．１ｍｍ、０．１３ｍｍ、０．２５ｍｍ、０．３ｍｍの４種類の市販品を用いて分析を行った。また、比較のために、図中のＴジョイント５、反応試薬送液ポンプ８、配管１０を外し、カラム３と検出器７との間を内径０．１３ｍｍ以下の０．１ｍｍの配管で最短距離で接続した配管を用いた場合も分析を行ったところ、０．０３３分であった。図１０の縦軸は、クロマトグラムの検出ピークの半値幅（単位分）である。配管１０の内径が０．１ｍｍと０．１３ｍｍのときのピーク半値幅は０．０３６分と０．０３７分で、内径が０．２５ｍｍや０．３ｍｍのときの０．０４７分や０．０５０分よりも大幅に小さい。配管での広がりは、上述の数３の式で示されるように、配管の内径の２乗に比例する。ここで内径０．１ｍｍの配管での広がりを１とすれば、０．１３ｍｍ、０．２５ｍｍ、０．３ｍｍではそれぞれ１．７、６．３、９．０となり、本データと一致する。配管１０の内径が０．１ｍｍと０．１３ｍｍのときのピーク半値幅は、図１に示した例の場合に近い値となっており、配管１０の内径が０．１３ｍｍ以下であれば、クロマトグラムの検出ピークの広がりを抑えてブロードになるのを防止できることがわかる。
　本発明は、クロマトグラムの検出ピークがブロードになるのを防止でき、かつ、感度の低下を防止したポストカラム法に利用できる液体クロマトグラフに適用することができる。
１　移動相送液ポンプ
２　インジェクタ
３　分離カラム
４　カラムオーブン
５　Ｔジョイント
６　配管
７　検出器
８　反応試薬送液ポンプ
９　加圧コイル
１０　配管

Claims (16)

  1. 　分離カラムと、
    　移動相を該分離カラムに送液する移動相送液部と、
    　前記分離カラム通過後の液体に対して反応試薬を送液する反応試薬送液部と、
    　前記分離カラムから通過後の液体と前記反応試薬を混合するジョイント部と、
    　ジョイント部内の試料中の成分を検出する検出部とを備えた液体クロマトグラフであって、
    　前記移動相送液部の耐圧が４０ＭＰａより大きく、前記分離カラムの充填剤の粒子径が３μｍより小さく、
    　前記反応試薬送液部と前記ジョイント部の間に、該反応試薬送液部にかかる圧力を上げる加圧部が接続され、
    　前記ジョイント部の容積は１μＬ以下であることを特徴とする液体クロマトグラフ。
  2. 　分離カラムと、
    　移動相を分離カラムに送液する移動相送液部と、
    　前記分離カラム通過後の液体に対して反応試薬を送液する反応試薬送液部と、
    　前記分離カラム通過後の液体と前記反応試薬を混合するジョイント部と、
    　ジョイント部内の試料中の成分を検出する検出部とを備えた液体クロマトグラフであって、
    　前記移動相送液部の耐圧が４０ＭＰａより大きく、前記分離カラムの充填剤の粒子径が３μｍより小さく、
    　前記反応試薬送液部と前記ジョイント部の間には、該反応試薬送液部にかかる圧力を上げる加圧部が接続され、
    　前記ジョイント部と前記検出部とを接続する接続配管が設けられており、該接続配管の内径が０．１３ｍｍ以下であることを特徴とする液体クロマトグラフ。
  3. 　前記加圧部は、コイル状のものであることを特徴とする請求項１または２に記載の液体クロマトグラフ。
  4. 　前記加圧部は、内径が０．１３ｍｍ以下の配管であることを特徴とする請求項１から３のいずれか１項に記載の液体クロマトグラフ。
  5. 　前記加圧部は、前記反応試薬送液部にかかる圧力を前記移動相送液部にかかる圧力とほぼ同じ圧力まで上げることを特徴とする請求項１から４のいずれか１項に記載の液体クロマトグラフ。
  6. 　前記ジョイント部と前記検出部とを接続する接続配管が設けられており、該接続配管の内径が０．１３ｍｍ以下であることを特徴とする請求項１に記載の液体クロマトグラフ。
  7. 　前記ジョイント部の容積は１μＬ以下であることを特徴とする請求項２に記載の液体クロマトグラフ。
  8. 　前記反応試薬としてブロモチモールブルー溶液を用いたことを特徴とする請求項１から７のいずれか１項に記載の液体クロマトグラフ。
  9. 　前記反応試薬としてオルトフタルアルデヒド溶液を用いたことを特徴とする請求項１から７のいずれか１項に記載の液体クロマトグラフ。
  10. 　前記分離カラムは、親水性を備えた逆相モードのカラムであることを特徴とする請求項１から９のいずれか１項に記載の液体クロマトグラフ。

    　分離カラムと、
    　該分離カラムに移動相を送液する移動相送液部と、
    　前記分離カラム通過後の液体に対して反応試薬を送液する反応試薬送液部と、
    　前記分離カラム通過後の液体と前記反応試薬を混合するジョイント部と、
    　前記ジョイント部内の試料を検出する検出部とを備えた液体クロマトグラフであって、
    　前記移動相送液部の耐圧が４０ＭＰａより大きく、前記分離カラムの充填剤の粒子径が３μｍより小さく、
    　前記ジョイント部の容積は１μＬ以下であることを特徴とする液体クロマトグラフ。
  11. 　試料を分離する分離カラムと、
    　移動相を前記分離カラムに送液する移動相送液部と、
    　前記移動相に試料を注入するインジェクタと、
    　前記
    　前記分離カラム通過後の前記移動相に反応試薬を送液する反応試薬送液部と、
    　前記分離カラム通過後の前記移動相と前記反応試薬とが混合するジョイント部と、
    　前記試料が前記反応試薬と反応して通過する配管と、
    　前記反応試薬と反応した前記試料を検出する検出器とを備えた液体クロマトグラフであって、
    　前記反応試薬送液部から送液される反応試薬の圧力を前記移動相の圧力まで高めるように前記検出器の上流側の配管を長くしたことを特徴とする液体クロマトグラフ。
  12. 　試料を分離する分離カラムと、
    　前記分離カラムに移動相を送液する移動相送液部と、
    　前記移動相に試料を注入するインジェクタと、
    　前記
    　前記分離カラム通過後の前記移動相に反応試薬を送液する反応試薬送液部と、
    　前記分離カラム通過後の前記移動相と前記反応試薬とが混合するジョイント部と、
    　前記試料が前記反応試薬と反応して通過する配管と、
    　前記反応試薬と反応した前記試料を検出する検出器とを備えた液体クロマトグラフであって、
    　前記反応試薬送液部と前記ジョイント部との間に、前記反応試薬送液部から送液される反応試薬の圧力を前記移動相の圧力まで高める加圧コイルを設けたことを特徴とする液体クロマトグラフ。
  13. 　移動相を送液する移動相送液部と、
    　前記移動相に試料を注入するインジェクタと、
    　前記試料を分離する分離カラムと、
    　前記分離カラム通過後の前記移動相に反応試薬を送液する反応試薬送液部と、
    　前記分離カラム通過後の前記移動相と前記反応試薬とが混合するジョイント部と、
    　前記試料が前記反応試薬と反応して通過する配管と、
    　前記反応試薬と反応した前記試料を検出する検出器とを備えた液体クロマトグラフであって、
    　前記ジョイント部と前記検出器との間の前記配管の長さを、前記反応試薬送液部から送液される反応試薬の圧力を前記移動相の圧力まで高めるように長くしたことを特徴とする液体クロマトグラフ。
  14. 　移動相を送液する移動相送液部と、
    　分離カラムと、
    　前記分離カラム通過後の液体に対して反応試薬を送液する反応試薬送液部と、
    　前記分離カラムから溶出された液体と前記反応試薬が混ざるジョイント部と、
    　検出部とを備えた液体クロマトグラフを用いた分析方法であって、
    　前記移動相送液部の耐圧が４０ＭＰａより大きく、前記分離カラムの充填剤の粒子径が３μｍより小さく、前記ジョイント部の容積は１μＬ以下にして、反応試薬送液部にかかる圧力を上げることを特徴とする分析方法。
  15. 　移動相を送液する移動相送液部と、
    　分離カラムと、
    　前記分離カラム通過後の液体に対して反応試薬を送液する反応試薬送液部と、
    　前記分離カラムから溶出された液体と前記反応試薬が混ざるジョイント部と、
    　検出部とを備えた液体クロマトグラフを用いた分析方法であって、
    　前記移動相送液部の耐圧が４０ＭＰａより大きく、前記分離カラムの充填剤の粒子径が３μｍより小さく、前記ジョイント部と前記検出部とを接続する接続配管の内径を０．１３ｍｍ以下にして、反応試薬送液部にかかる圧力を上げることを特徴とする分析方法。
  16. 　前記反応試薬送液部にかかる圧力を前記移動相送液部にかかる圧力とほぼ同じ圧力まで上げることを特徴とする請求項１１または１２に記載の分析方法。
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