CN114868016A - 在生物体试样中存在的低分子物质的提取方法 - Google Patents
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Abstract
提供在生物体试样中存在的低分子物质的提取方法。解决手段是一种从生物体试样提取在该试样中存在的低分子物质的方法，包括：1)吸附工序，将上述生物体试样与具有3.5～150nm的中孔、和尺寸比该中孔大的微孔作为层级结构的多孔性碳混合，然后，从所得的混合物回收多孔性碳，或者，使上述生物体试样与配置或担载了具有3.5～150nm的中孔、和尺寸比该中孔大的微孔作为层级结构的多孔性碳的过滤滤除器接触，从而使上述低分子物质吸附于上述多孔性碳；以及2)游离工序，将在上述吸附工序后获得的吸附了上述低分子物质的多孔性碳与包含平均粒径10～100nm的圆球二氧化硅0.1～1质量％并且包含10～12％的乙腈的水溶液混合，或者，使上述水溶液接触并通过在上述吸附工序后获得的过滤滤除器，从而使低分子物质从多孔性碳游离。
Description
技术领域
本发明涉及在生物体试样中存在的低分子物质的提取方法。
背景技术
作为用于将在生物体试样中存在的低分子物质吸附/除去的方法，已知使用活性炭的方法。
例如，在日本特开昭59-176215公报(专利文献1)中记载了使用活性炭从渗析后的IgG-级分中除去低分子量的部分的方法，此外，在国际公开第2011/114470号小册子(专利文献2)中记载了使用活性炭从含有透明质酸类的液体高效地分离除去杂质的方法。
此外，日本特开昭61-148147号公报(专利文献3)记载了包含使L-苯基丙氨酸吸附于活性炭，然后，使L-苯基丙氨酸从活性炭溶出的L-苯基丙氨酸的纯化法。
专利文献3虽然使用活性炭进行L-苯基丙氨酸的吸附和溶出，但是使吸附于活性炭的低分子物质有效率地游离而回收一般不容易。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特开昭59-176215公报
专利文献2：国际公开第2011/114470号小册子
专利文献3：日本特开昭61-148147号公报
发明内容
发明所要解决的课题
本发明的课题是提供可以容易地提取在生物体试样中存在的低分子物质的方法。
用于解决课题的手段
本发明者们为了解决上述课题而进行了深入研究，结果发现，具有3.5～150nm的中孔、和尺寸比该中孔大的微孔作为层级结构的多孔性碳可以有效率地吸附在生物体试样中存在的低分子物质，以及使吸附了低分子物质的多孔性碳与包含平均粒径10～100nm的圆球二氧化硅0.1～1质量％并且包含10～12％的乙腈的水溶液接触，从而使吸附了的低分子物质容易地游离，由此可以以高回收率回收低分子物质，从而完成了本发明。
即，本发明涉及：
[1]一种从生物体试样提取在该试样中存在的低分子物质的方法，其包含下述工序：
1)吸附工序，将上述生物体试样与具有3.5～150nm的中孔、和尺寸比该中孔大的微孔作为层级结构的多孔性碳混合，然后，从所得的混合物回收多孔性碳，或者，使上述生物体试样与配置或担载了具有3.5～150nm的中孔、和尺寸比该中孔大的微孔作为层级结构的多孔性碳的过滤滤除器接触，从而使上述低分子物质吸附于上述多孔性碳；以及
2)游离工序，将在上述吸附工序后获得的吸附了上述低分子物质的多孔性碳与包含平均粒径10～100nm的圆球二氧化硅0.1～1质量％并且包含10～12％的乙腈的水溶液混合，或者，使上述水溶液接触并通过在上述吸附工序后获得的过滤滤除器，从而使低分子物质从多孔性碳游离，
[2]根据上述[1]所述的方法，进一步包括为了将上述游离工序后的多孔性碳再次使用于吸附工序而进行再生的再生工序，
[3]根据上述[1]或上述[2]所述的方法，在上述吸附工序之前，进一步包括生物体试样的前处理工序，
[4]根据上述[1]～上述[3]中任一项所述的方法，上述圆球二氧化硅为表面处理圆球二氧化硅，以及
[5]根据上述[4]所述的方法，上述表面处理圆球二氧化硅进行了将圆球二氧化硅表面的硅烷醇基置换为苯基、乙烯基或甲基丙烯酰氧基的处理。
发明的效果
通过本发明，能够提供可以容易地提取在生物体试样中存在的低分子物质的方法。
此外，本发明的方法通过追加将游离工序后的多孔性碳再生的工序，从而可以从多个生物体试样连续地提取低分子物质。
此外，本发明的方法通过在吸附工序之前追加生物体试样的前处理工序，从而能够从血清等各种不同的生物体试样提取低分子物质。
附图说明
图1是在用保持着多孔性碳的微孔滤器的筒进行过滤前，将含有标准8-oxo-dG的模拟生物体试样(8-oxo-dG：250ng/mL)进行了HPLC分析时的HPLC图。
图2是将含有标准8-oxo-dG的模拟生物体试样用保持着多孔性碳的微孔滤器的筒进行了过滤后，将所得的滤液进行了HPLC分析时的HPLC图。
图3是将在保持着吸附了8-oxo-dG的多孔性碳的筒中注入游离液(0.1质量％的圆球二氧化硅悬浮的10％乙腈溶液：1mL)，将所得的连续的4个流分(各0.25mL)进行了HPLC分析时的HPLC图，图3中的(A)显示0～0.25mL的流分的HPLC图，(B)显示0.25～0.5mL的流分的HPLC图，(C)显示0.5～0.75mL的流分的HPLC图，(D)显示0.75～1.0mL的流分的HPLC图。
具体实施方式
进一步详细地说明本发明。
本发明的从生物体试样提取在该试样中存在的低分子物质的方法，其特征在于，包含下述工序：
1)吸附工序，将上述生物体试样与具有3.5～150nm的中孔、和尺寸比该中孔大的微孔作为层级结构的多孔性碳混合，然后，从所得的混合物回收多孔性碳，或者，使上述生物体试样与配置或担载了具有3.5～150nm的中孔、和尺寸比该中孔大的微孔作为层级结构的多孔性碳的过滤滤除器接触，从而使上述低分子物质吸附于上述多孔性碳；以及
2)游离工序，将在上述吸附工序后获得的吸附了上述低分子物质的多孔性碳与包含平均粒径10～100nm的圆球二氧化硅0.1～1质量％并且包含10～12％的乙腈的水溶液混合，或者，使上述水溶液接触并通过在上述吸附工序后获得的过滤滤除器，从而使低分子物质从多孔性碳游离。
作为本发明能够使用的生物体试样，可举出来自尿、血清、组织的提取液、来自细胞的提取液等，优选为不存在沉淀物的生物体试样。
作为优选的生物体试样、可举出尿、血清等，优选为尿。
作为成为本发明的对象的低分子物质，可举出核酸或其衍生物(核苷酸、核苷和/或碱基等)、肽、胺、类固醇、脂肪酸、维生素、其它低分子化合物等，优选可举出分子量为5000以下的化合物。
作为优选的低分子物质，可举出dG(脱氧鸟苷)、8-oxo-dG、各种单核苷等核酸衍生物、肽、药物(包含麻醉药、掺杂剂等)、胺、类固醇、脂肪酸、维生素、肌酸酐等低分子化合物等，优选为dG(脱氧鸟苷)、8-oxo-dG等核酸衍生物。
作为本发明能够使用的具有3.5～150nm的中孔、和尺寸比该中孔大的微孔作为层级结构的多孔性碳，优选为通过使用特定大小的金属氧化物、例如MgO作为模板来控制中孔的大小从而获得的细孔控制中孔碳等。
作为本发明能够使用的多孔性碳的平均粒径，可举出1μm～100μm，优选为1μm～10μm。
作为本发明能够使用的具体的多孔性碳，可举出能够从东洋炭素株式会社获得的、CNovel(注册商标)MJ(4)010(设计中孔径：10nm)、MJ(4)030(设计中孔径：30nm)、MJ(4)110(设计中孔径：110nm)、MJ(4)150(设计中孔径：150nm)等，优选为MJ(4)110。
作为本发明能够使用的过滤滤除器，只要具备具有上述多孔性碳不泄漏的孔径的过滤膜，就没有特别限定，可举出例如，微孔滤器等，具体而言，可举出能够从アドバンテック東洋株式会社获得的、DISMIC13HP045AN(テフロン(注册商标)(PTFE)制过滤膜(孔径0.45μm)、膜的直径：13mm)、DISMIC 03JP050AN(テフロン(注册商标)(PTFE)制过滤膜(孔径0.50μm)、膜的直径：3mm)等。
作为本发明能够使用的平均粒径10～100nm的圆球二氧化硅，只要是成为平均粒径10～100nm的圆球状的二氧化硅，就没有特别限定，优选为平均粒径10～50nm的圆球二氧化硅、平均粒径10～30nm的圆球二氧化硅。
此外，圆球二氧化硅优选为了增加与亲水物的亲和性而进行了表面处理，作为具体的表面处理，优选为将圆球二氧化硅表面的硅烷醇基置换为苯基、乙烯基或甲基丙烯酰氧基的表面处理等，特别优选为将硅烷醇基置换为乙烯基的表面处理。
作为本发明能够使用的具体的圆球二氧化硅，可举出能够从株式会社アドマテックス获得的、アドマナノYA010C(平均粒径10nm)、アドマナノYA010C-SV1(平均粒径10nm，表面处理：乙烯基化)、アドマナノYA030C(平均粒径30nm)、アドマナノYC100C(平均粒径100nm)等，优选为アドマナノYA010C-SV1(平均粒径10nm，表面处理：乙烯基化)。
在本说明书中，平均粒径是指通过激光衍射散射法而获得的粒度分布(体积基准)的粒径D50(中值粒径)的值，圆球二氧化硅是指圆球变异系数(σ/D(％)，σ：粒径的标准偏差，D：平均粒径)为20％以下，优选为15％以下的二氧化硅粒子。
本发明的方法中的吸附工序的特征在于，将上述生物体试样与具有3.5～150nm的中孔、和尺寸比该中孔大的微孔作为层级结构的多孔性碳混合，然后，从所得的混合物回收多孔性碳，或者，使上述生物体试样与配置或担载了具有3.5～150nm的中孔、和尺寸比该中孔大的微孔作为层级结构的多孔性碳的过滤滤除器接触，从而使上述低分子物质吸附于上述多孔性碳。
在本发明的方法中能够使用的吸附工序只要是将生物体试样、与具有3.5～150nm的中孔、和尺寸比该中孔大的微孔作为层级结构的多孔性碳进行混合的工序，就没有特别限定，但为了使空气的泡不堵塞多孔性碳表面的细孔，优选轻轻地混合，用超声波等充分脱气。
此外，作为配置了多孔性碳的过滤滤除器，可以制成在二个滤除器间填充了多孔性碳的筒的形态而使用。
在使用上述筒的情况下，优选形成筒内面和多孔性碳的表面被水分子覆盖了的状态，注意不使空气泡混入。
作为使用上述筒的情况下的操作，可举出使用注射器将生物体试样注入到填充了多孔性碳的筒而进行过滤等。
注入时，优选以尽量成为等压的方式注入。
此外，作为担载了多孔性碳的过滤滤除器，可举出多孔性碳通过已知的方法被固定化了的过滤滤除器等。
本发明的方法中的游离工序的特征在于，将在上述吸附工序后获得的吸附了上述低分子物质的多孔性碳与包含平均粒径10～100nm的圆球二氧化硅0.1～1质量％并且包含10～12％的乙腈的水溶液混合，或者，使上述水溶液接触并通过在上述吸附工序后获得的过滤滤除器，从而使低分子物质从多孔性碳游离。
在游离工序中，通过包含圆球二氧化硅的乙腈水溶液与吸附了低分子物质的多孔性碳接触，从而被捕捉在多孔性碳的细孔内的水溶性物质，被置换为与多孔性碳具有亲和性的圆球二氧化硅，由此，水溶性物质游离在溶液中。
在调制包含圆球二氧化硅的乙腈水溶液时，以溶液的均匀化和脱气作为目的，优选进行超声波处理。
此外，在使水溶液接触并通过在吸附工序后获得的过滤滤除器的情况下，优选使用注射器将包含圆球二氧化硅的乙腈水溶液注入到过滤滤除器，此时，优选以尽量成为等压的方式注入。
本发明的方法也涉及进一步包括为了将游离工序后的多孔性碳再次使用于吸附工序而进行再生的再生工序的方法的发明。
在再生工序中可以包含洗涤工序和干燥工序。
作为具体的洗涤工序，可举出例如，将游离工序后的多孔性碳用100％乙腈洗涤，接下来，用10％乙腈水溶液洗涤，最后，用超纯水洗涤等。
此外，作为干燥工序，可举出例如，将洗涤工序后的多孔性碳在120～180℃的温度下加热干燥1～8小时等。
通过包含上述再生工序，从而可以从多个生物体试样，例如，通过整夜的自动操作等而连续地提取低分子物质。
此外，上述连续的提取方法不仅作为提取方法，而且作为分析方法也能够有利地使用。
本发明的方法也涉及在吸附工序之前进一步包括生物体试样的前处理工序的方法。
作为生物体试样的前处理工序，可以使用已知的前处理方法，可举出采用前置柱的分离、离心分离、渗析膜分离、改性沉淀、酶处理等。
通过上述处理，能够从各种生物体试样提取低分子物质。
实施例
试验例1：从人工尿提取8-oxo-dG
＜含有8-oxo-dG的模拟生物体试样的调制＞
在人工尿(JIS代码T3214：2011)中以成为250ng/mL的浓度的方式溶解标准8-oxo-dG，制备出模拟生物体试样。
＜保持着多孔性碳的微孔滤器的筒的制作＞
将多孔性碳(在立体结构中高密度地具有CNovel(注册商标)MJ(4)110(设计中孔径：110nm)的功能性活性炭，粒径：约5μm以下，亲水性，东洋炭素(株)社制)以1mg/mL的量在超纯水中轻轻地(不起泡)混合，为了使空气的泡不堵塞细孔，施与100KHz的超声波5分钟而充分脱气，调制出多孔性碳悬浮液。
将上述调制的多孔性碳悬浮液1mL，使用注射器并用微孔滤器(DISMIC13HP045AN，テフロン(注册商标)(PTFE)制过滤膜(孔径0.45μm)，膜的直径：13mm，アドバンテック東洋(株)社制)进行过滤，在过滤膜的前腔中均匀地补充了多孔性碳。
接下来，在上述补充了多孔性碳的微孔滤器中，连接第二个微孔滤器(DISMIC13HP045AN，テフロン(注册商标)(PTFE)制过滤膜(孔径0.45μm)，膜的直径：13mm，アドバンテック東洋(株)社制)，慢慢地通水超纯水1mL，从而在前后2个过滤膜之间确实地保持了多孔性碳。注意在将二个微孔滤器连接而构成的筒的空间中不混入空气泡，由此，形成将筒内面和多孔性碳中的碳原子的表面用水分子覆盖了的状态。
＜游离液的调制＞
在100％乙腈中，将亲水性的圆球二氧化硅(アドマナノYA010C-SV1，平均粒径10nm，表面处理：乙烯基化，(株)アドマテックス社制)以1质量％的比例混合使其悬浮(游离原液)。以溶液的均匀化和脱气作为目的，施与100KHz的超声波，保存为常温保存。
游离原液在使用时用超纯水稀释为10倍，从而制成游离液(0.1质量％的圆球二氧化硅悬浮的10％乙腈溶液)。
＜模拟生物体试样的过滤(试样中的8-oxo-dG的过滤吸附)＞
将上述调制的、含有标准8-oxo-dG的模拟生物体试样的1mL使用上述制作的保持着多孔性碳的微孔滤器的筒，使用注射器，大致以1mL/分钟作为标准，尽量以等压进行了过滤。
将过滤前和后的试样用HPLC进行了分析。
将过滤前的HPLC图示于图1中，将过滤后的HPLC图示于图2中。
以下显示HPLC的分析条件。
HPLC分析条件
仪器：HTEC-500((株)エイコム社制)(8-oxo-dG电化学检测)
ODS柱：CA-5ODS，柱尺寸：2.1φ×150mm((株)エイコム社制)
流动相：磷酸缓冲液(pH6.5-6.8)，甲醇2％，SDS 90mg/L
作为将8-oxo-dG标准溶液(250ng/mL)的HPLC测定值的峰面积设为100的情况下的比率％而算出的结果是，被吸附于多孔性碳的8-oxo-dG的量成为在模拟生物体试样中包含的8-oxo-dG的量的98.2％。
＜8-oxo-dG从多孔性碳的回收＞
在保持着吸附了8-oxo-dG的多孔性碳的筒中，使用注射器，大致以1mL/分钟作为标准，以成为等压的方式注入上述调制的游离液的1mL，作为0.25mL的4个流分而回收。
将0～0.25mL的流分的HPLC图示于图3的(A)中，将0.25～0.5mL的流分的HPLC图示于图3的(B)中，将0.5～0.75mL的流分的HPLC图示于图3的(C)中，将0.75～1.0mL的流分的HPLC图示于图3的(D)中。
作为将8-oxo-dG标准溶液(250ng/mL)的HPLC测定值的峰面积设为100的情况下的比率％而算出的结果是，用游离液1mL回收的8-oxo-dG的量为90.9％。
Claims (5)
1.一种从生物体试样提取在该试样中存在的低分子物质的方法，包括：
1)吸附工序，将所述生物体试样与具有3.5～150nm的中孔、和尺寸比该中孔大的微孔作为层级结构的多孔性碳混合，然后，从所得的混合物回收多孔性碳，或者，使所述生物体试样与配置或担载了具有3.5～150nm的中孔、和尺寸比该中孔大的微孔作为层级结构的多孔性碳的过滤滤除器接触，从而使所述低分子物质吸附于所述多孔性碳；以及
2)游离工序，将在所述吸附工序后获得的吸附了所述低分子物质的多孔性碳与包含平均粒径10～100nm的圆球二氧化硅0.1～1质量％并且包含10～12％的乙腈的水溶液混合，或者，使所述水溶液接触并通过在所述吸附工序后获得的过滤滤除器，从而使低分子物质从多孔性碳游离。
2.根据权利要求1所述的方法，进一步包括为了将所述游离工序后的多孔性碳再次使用于吸附工序而进行再生的再生工序。
3.根据权利要求1或2所述的方法，在所述吸附工序之前，进一步包括生物体试样的前处理工序。
4.根据权利要求1～3中任一项所述的方法，所述圆球二氧化硅为表面处理圆球二氧化硅。
5.根据权利要求4所述的方法，所述表面处理圆球二氧化硅进行了将圆球二氧化硅表面的硅烷醇基置换为苯基、乙烯基或甲基丙烯酰氧基的处理。
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