FI90089C - Foerfarande foer separering och/eller rening av bio-verkande substanser med hjaelp av polymera adsorbenter - Google Patents

Description

1 90089

Menetelmä bio-v a ikut, teisten aineiden erottamiseksi ja/ tai puhdistamiseksi p a r t i k k o 1 i ma i s t e n po 1 y me e r i s t. e n ads orben11ie n avulla Tämä keksintö käsittelee menetelmää biomateriaalin erottamiseksi ja/tai puhdistamiseksi kalvosuodatuksen avulla.

IJ1 t r a s u o d a t u s m e n e 1. o 1 m ä ä käytetään y l e i s e s i, i biomateriaalien erottamiseen (sisältäen v ä k e v ö i m i s e n) ja/tai puhdistamiseen. G e a h e 1 ja K u 1 a kuvaavat orästii tällaista menetelmää julkaisussa Biotechnology Letters, Voi. 6(8), 481-6, 1984. Menetelmässä puhdistetaan nesteväli- aineessa oleva dehydrogenaasiliuos sitomalla se ensin suurimolekyyliseen, vesiliukoiseen dekstraaniin, jonka jälkeen liuos uitrasuodatetaan. Dehydrogenaasi-dekstraa-nikompleksi on liian suuri 1äpäistääkseen uitrasuodatus-kalvon, mutta liuoksessa olevat epäpuhtaudet eivät ole liian suuria, joten kompleksi jää suodattime11e ja epäpuhtaudet poistuvat permeaattiin. Kun epäpuhtaudet on tällä tavoin poistettu, vapautetaan (desorboidaan) dekstraaniin sidottu dehydrogenaasi lisäämällä liuoksen ionivoimakkuutta ja dehydrogenaasi otetaan talteen.

Tällä menetelmällä on kaksi pääasiallista heikkoutta. Ensinnäkin, dekstraani liukenee väliaineeseen ja se voi sen vuoksi päästä uitrasuodatuskalvon huokosten läpi pidentyneen molekyy1irakenteensä vuoksi. Vaikka pieni-huokoisempi kalvo voisi poistaa tämän heikkouden vähentämällä huokosten läpäisevien dekstraanimolekyy1 ien mää- 2 9Γ) 0 6 9 rää, rajoittaisi se myös dekstraanituotekompleksista erotettavien epäpuhtaiden molekyylien kokoa, heikentäen täten erotuksen tehokkuutta. Toiseksi, suurimolekyylisellä dekstraanikompleksilla on taipumus akkumuloitua suodatus -kalvolle muodostaen toisen kalvon tai konsentroidun polarisoidun kerroksen, joka heikentää suodattimen läpäisevän virtauksen.

Patenteissa US-A-4 474 690 ja EP-A-0 127 737 kuvataan peptidiä sisältävien yhdisteiden talteenottoa yhdistämällä affiniteettikromatografinen puhdistus ja ultrasuoda-tus, jossa peptidi-spesifinen ligandi sidotaan makromole-kyyliseen kiinteään kantajaan ja kompleksoidaan peptidin kanssa, minkä jälkeen liuoksessa oleva kompleksi ultra-suodatetaan siten, että epäpuhtaudet poistuvat permeaat-tiin. Peptidi vapautetaan tämän jälkeen ligandista ja kantajasta. Kantaja-aineita ovat akryylijohdannaistyyppiset, synteettiset lateksipolymeerit. Menetelmä on monimutkainen peptidi-spesifisen ligandin löytämisen suhteen ja sillä on siksi rajoitetut sovellutukset.

Olemme havainneet, että edellä mainitut heikkoudet ja rajoitukset voidaan poistaa tai niitä voidaan vähentää käyttämällä tämän keksinnön menetelmää, jossa mikroninko-koista partikkelimaista polymeeristä adsorbenttiä käytetään pääasiallisena kompleksinmuodostajana.

Tässä keksinnössä esitetään menetelmä, jossa (i) ensimmäinen veteen liukeneva tai veteen dispergoituva bio-vai -kutteinen aine, joka on ensimmäisessä nestevällaineessa yhdessä yhden tai useamman muun komponentin kanssa, jotka ovat epäpuhtauksia tai muita veteen liukenevia ja/tai veteen dispergoituvia bio-vaikutteisia aineita, erotetaan mainituista yhdestä tai useammasta muusta komponentista, ja/tai (ii) mainitussa ensimmäisessä nesteväliaineessa yhdessä mainittujen yhden tai useamman muun komponentin kanssa oleva mainittu ensimmäinen bio-vaikutteinen aine 3 90089 puhdistetaan, jolle menetelmälle on tunnusomaista, että se käsittää: (a) seoksen muodostamisen, joka seos sisältää ensimmäisen nesteväliaineen ja partikkelimaisen, polymeerisen adsor-bentin, jolla on kyky adsorboida edullisesti ensimmäinen bio-vaikutteinen aine tai mainittu yksi tai useampi muu komponentti ensimmäisestä nestevällaineesta ja jonka keskimääräinen partikkelikoko on 0,01-5 mikrometriä, sekä joka on valittu ioninvaihtohartsien ja ilman varausta olevien, ei-funktionalisoitujen polymeeripartikkeleiden joukosta, jolloin adsorbentti sitoo käänteisesti ensimmäisen bio-vaikutteisen aineen tai mainitut yhden tai useamman muun komponentin muodostaen kompleksin; (b) vaiheesta (a) saadun seoksen suodattamisen kalvo-suodatuksen avulla, joka kalvo ei läpäise mainittua kompleksia, jolloin mainittu ensimmäinen bio-vaikutteinen aine erottuu mainitusta yhdestä tai useammasta muusta komponentista ja/tai puhdistuu.

Keksinnön erään edullisen suoritusmuodon mukaan ensimmäinen veteen liukeneva tai veteen dispergoituva bio-vaikutteinen aine (i) erotetaan ensimmäisestä nestevällaineesta ja/tai (ii) puhdistetaan. Tämän suoritusmuodon mukaan partikkelimaisella polymeerisellä adsorbentilla on kyky adsorboida edullisesti ensimmäinen bio-vaikutteinen aine ensimmäisestä nesteväliaineesta, jolloin adsorbentti sitoo käänteisesti ensimmäisen bio-vaikutteisen aineen muodostaen kompleksin, ja kalvo läpäisee mainitun yhden tai :T: useamman muun komponentin muttei läpäise kompleksia, jol- ' . loin kompleksi ja mainittu yksi tai useampi muu kompo nentti erottuu, ja/tai mainittu ensimmäinen bio-vaikutteinen aine puhdistuu. Tämän suoritusmuodon mukaan menetelmä voi lisäksi käsittää vaiheen, jossa : ·.· (c) ensimmäinen bio-vaikutteinen aine vapautetaan komp leksin polymeeripartikkeleista, esimerkiksi elektrolyytin avulla, toiseen nestevällaineeseen.

4 90089

Esillä olevaa keksintöä kuvataan seuraavassa viitaten erityisesti edellä esitettyyn edulliseen suoritusmuotoon.

Kun adsorbentti/biomateriaali-kompleksin sisältämä neste-väliaine kalvosuodatetaan, jää adsorbentti/biomateriaali-kompleksi suodattimen pinnalle, sillä partikkelit ovat kalvosuodatinhuokosia suuremmat, mutta epäpuhtaudet ja/-tai muut biomateriaalit menevät suodattimen läpi perme-aattiin, josta ne kerätään ja poistetaan. Adsorboitu biomateriaali voidaan tämän jälkeen vapauttaa adsorbentistä nesteväliaineeseen, suodattaa ja ottaa talteen. Regeneroitu adsorbentti jää suodattimeen ja sitä voidaan käyttää uudestaan.

Näin ollen keksinnöllä aikaansaadaan uusi tapa biomateriaalien kromatografista erottamista ja/tai puhdistamista varten, erityisesti proteiinipohjaisten materiaalien suhteen. Toisin kuin tavanomaisessa kromatografiässä, mik-roninkokoiset polymeeriset adsorbentit virtaavat nesteiden tavoin eikä niitä pakata kolonneihin tavanomaisten adsorbenttien tavoin. Tämän vuoksi ei myöskään esiinny adsorbenttipartikkelien painosta johtuvaa ongelmaa, ts. ei ole kolonnia, joka voisi rikkoutua oman painonsa vuoksi. Pakkautumista ei myöskään esiinny, mikä voisi aiheuttaa heikentynyttä virtausta ja ei-toivottua paineen laskua kolonnissa. Tämän seurauksena adsorbentit voivat helposti kantaa biomateriaalia ultrasuodatinaukkojen hienojen, onttojen kuitujen soluonteloiden läpi (joiden kautta epäpuhteudet tai ei-adsorboidut biomateriaalit kulkeutuvat permeaattiin) adsorptioastiaan kierrättämistä ja vä-kevöittämisvä varten. Adsorbenttia voidaan siksi käyttää uudestaan useammassa kierrossa.

Tässä yhteydessä tarkoitetaan "biomateriaali"-käsitteellä vesiliukoista tai veteen dispergoituvaan, bio-vaikutteis-ta ainetta, joka on joko biologista tai ei-biologista alkuperää. Biomateriaaleihiin kuuluu yhdisteitä, molekyy- 5 90089 lejä, polymeerejä, partikkeleita ja sekä yksinkertaisia että monimutkaisia luonnosta saatavia tai biologisten tai ei-biologisten prosessien avulla syntetisoituja aineita. Käsitteeseen sisältyy myös proteiinipohjaiset aineet (kuten albumiinit ja entsyymit), aminohapot, nukleiinihapot, peptidit ja polypeptidit, vasta-aineet, antigeenit, steroidit, hormonit, antibiootit, vitamiinit ja polymeeriset hiilihydraatit, jotka käänteisesti muodostavat komplekseja tai muulla tavoin sitoutuvat, adsorboituvat tai kiinnittyvät partikkelimaisiin polymeerisiin adsorbentteihin. Sitoutuminen voi perustua sähköstaattiseen attraktioon, van der Waalsin voimien aikaansaamiin hydrofiilisiin/hyd-rofobisiin vuorovaikutuksiin, ominaisatfiniteettiin tai johonkin edellä mainittujen yhdistelmään.

Biomateriaaleja valmistetaan useimmiten nesteväliaineessa joko kemiallisen synteesin tai fermentaation avulla, tai näiden kahden menetelmän yhdistelmän avulla, ja erotetaan liuoksina tai hienoina dispersioina solusta, solujättees-tä tai muusta fermentaatioliemessä tai solukulttuuriväli-aineessa olevasta kiinteästä aineesta. Saatu biomateriaalia sisältävä väliaine sisältää tavallisesti joka tapauksessa epäpuhtauksia ja/tai muita biomateriaaleja, jotka on ehdottomasti poistettava, mikäli biomateriaalin tulee täyttää kaupalliset tai lääketieteelliset puhtausvaatimukset .

Käsitettä "biotuote" käytetään joskus mukavuuden ja selkeyden vuoksi tässä yhteydessä kuvaamaan biomateriaalia, joka on puhdistettu ja/tai erotettu keksinnön menetelmän mukaan.

Keksinnön menetelmässä käytetyt polymeeriset adsorbentit ovat partikkelimaisia, niiden koon ollessa sellainen, etteivät ne läpäise suodatinkalvoa, vaan sallivat vapaan virtauksen onttojen kuitujen läpi. Adsorbenttipartikkeli-en keskimääräinen halkaisija on 0,01-5 mikrometriä, edul- 6 9008$ lisesti 0,1-1,5 mikrometriä. Adsorbenttipartikkelit ovat yleensä veteen liukenemattomia tai pääosin veteen liukenemattomia, minkä vuoksi adsorbentit ja adsorbentti-biomateriaali-kompleksi ei läpäise kalvosuodattimen huokosia tai muodosta polarisoitua kerrosta kalvon pinnalle.

Edellä mainitut vaatimukset täyttävää partikkelimaista polymeeristä adsorbenttia voidaan käyttää, mikäli se myös kykenee selektiivisesti adsorboimaan nesteväliaineessa olevan biotuotteen, mutta ei epäpuhtauksia tai muita biomateriaaleja, eikä denaturoi biotuotetta, tai mikäli se vaihtoehtoisesti kykenee adsorboimaan epäpuhtaudet tai muut biomateriaalit, mutta ei adsorboi tai denaturoi biotuotetta. Adsorbenttipartikkelit voivat olla varattuja tai ne voivat olla ilman varausta. Varattu tila voidaan saavuttaa funktionaalisten ryhmien avulla, jotka modifioivat adsorbentin hydrofobista/hydrofiilistä ominaisuutta suhteessa biomateriaalin sisältämään vesijärjestelmään. Sopivia varattuja adsorbentteja ovat partikkelimaiset ioninvaihtohartsit, joissa ioninvaihtofunktionaalisuus antaa polymeerille pintavarauksen. Tyypillisiä ilman varausta olevia polymeerejä ovat ioninvaihtohartsiprekurso-rit, ts. silloitettu tai silloittamaton kiinteä polymeeri, jota ei vielä ole funktionalisoitu.

Jos partikkelimainen polymeerinen adsorbentti on varattu materiaali, on biomateriaalin sitoutumismekanis-mi kopleksiin nähden pääosin sähköstaattinen. Jos adsorbentti on ilman varausta, ja myös jossain määrin silloin kun adsorbentti on varattu, kuvataan sitou-tumismekanismia yhtenä tai useampana hydrofobisena/-hydrofiilisenä vuorovaikutuksena, ominaisaffini- 7 90089 teettivuorovaikutuksena tai muuna vaikutuksena.

Partikkelimainen polymeerinen adsorbentti sisältää edullisesti ionogeenisiä ryhmiä ja ioninvaihtohartsin, jonka partikkelikoko on mikrometri- tai submikrometri-luokkaa, ja joka on varattu biotuotteen varauksen vastaisella varauksella. Ioninvaihtohartsiads orbe ntit voivat sisältää yhden hartsin, jolla on anioninvaihto-funktionaalisuus, yhden hartsin, jolla on sekä anioni-nen ja kationinen funktionaalisuus (am foteeriset hartsit), tai olla näiden seos, hybridi, kelaatti- tai kom-posiittihartseja, joilla on anionin- tai sekä anionin-että kationinvaihto-ominaisuudet. Geelimäiset ja makro-retiku1 aaris et hartsit ovat lisäksi myös käyttökelpoisia.

Tässä keksinnössä käyttökelpoisia hartseja ovat makro-retikulaariset vinyyliaromaatti- tai akryylihartsi-- adsorbentit ja patenteissa US-A-3,037,052; 3,637,535; .*·.·. 3,843,566; 3,791,866; 3,275,548 ja 3,357 , 1 58 kuvatut ____: vaihtajat; patentissa US-A-3,991 ,017 kuvatut hybridi- hartsit; patentissa US-A-3,645,922 kuvatut komposiitti-hartsit; patentissa US-A-4,202,737 kuvatut amfoteeriset hartsit; ja muut julkaisussa Ion Exchange, J. Marinsky, ed., Voi. II, luku 6 (New York, 1969) kuvatut hartsit.

Esimerkkejä keksinnön menetelmässä käyttökelpoisista .;- erityisistä polymeeriadsorbenteista ovat vinylideeni- : m o n o m e e r e i s t ä koostuvat homo po l ymee r i t ja kopo 1 ymeor L t , kuten akryyli- ja me t ak r y y 1 i hapo t ja -esterit, ja muut monoe t y 1 een ises t i tyydy ttymättömät monomeerit tai ‘ niiden seokset, kuten monosykliset ja polysykliset 90089 8 aromaattiset monomeerit, kuten styreeni ja substituoi-dut styreenit. Monoetyleenisesti tyydyttymättömät monomeerit voivat olla polymerisoitu ilman silloitusta tai ne on voitu silloittaa in situ polyetyleenisesti tyydy t-tymättömällä monomeeri11 a , kuten polyvinyyliaromaatti-sella hiilivedyllä (esim. divinyy1ibe ntse eni11ä tai divinyy1ito 1ueeni11 a) , g1yko1idimetakry1 aati11 a , kuten ety1eenig 1yko1idimetakry1 aa11i, tai polyhydrisen alkoholin po1yvinyy1ie e11eri11ä, kuten divinoksietaani11 a ja trivinoksipropaani11 a.

Polymeeriset adsorbentit voidaan valmistaa tavanomaisella tavalla, esimerkiksi massa-, liuos-, suspensio- tai emu 1 siopo1ymeris oinni11 a . Jos polymeri-sointiprose s si on emu 1 siopolymerointi , saavutetaan haluttu pieni partikkelikoko heti, mikä käy ilmi Chongin patenteissa US-A - 4, 359,5 37 ja A, 380, 590 ,

Chongin, Isacoffin ja Neelyn patentissa US-A-4,200,695 ja Isacoffin ja Neelyn patentissa US-A - 4,537,683 , joihin kaikkiin tässä viitataan. Jos po1ymerointitapa on s uspensiopo1ymerointi tai muu polymerointimuoto, voidaan partikke 1imaiset tuotepo1ymeerit jauhaa pienemmiksi alalla hyvin tunnettujen jau hatusmene -telmien mukaan. Mikäli partikkelit ovat epäsännöllisen muotoisia (esim. jauhettu hartsi), oletetaan yllämainittujen partikkelikokojen tämän keksinnön suhteen viittavaan pisimpään partikkelin mittaan.

Veteen liukenemattomia, silloitta m attomi a tai osittain funktionalisoituja materiaaleja voidaan myös käyttää tässä keksinnössä. Esimerkiksi ioninvaihtopo 1 ymeerit , jotka partikkelipinnan läheisyydessä on funktion a li- 9 90089 soitu ionogeenisellä ryhmällä, esimerkiksi yksinkertainen kerros io ninvaih toryhmiä noin helmen ulkokehän kohdalla, ovat käyttökelpoisia. Kevyesti silloitetut tai pinta-si11 oitetut helmet, joiden vesiliukoisuus on alhainen, ovat myös tehokkaita.

Edellä mainittujen, Chongin , Chongin et ai ja Isacoffin et ai patenttien adsorbentit ovat, yleisesti kuvattuina, ioninvaihtohartseja, jotka koostuvat pyöreistä, he lmimäis istä, silloitetuista polymeereistä, joissa on noin 1,5, esimerkiksi 0,1-1,5 fuktionaalis ta ryhmää monomeeriyksikköä kohden. Nämä ryhmät voivat olla erittäin happamia (esim. -HSO^-ryhmät), lievästi happamia (esim. -COOH-ryhmät), erittäin emäksisiä (esim. kvaternääriset ammoniumiryhmät) tai lievästi emäksisiä (esim. tertiääriset amiiniryhmät).

Edulliset polymeeriset adsorbentit ovat, kuten on .. . todettu, ioninvaihtohartseja, joiden valinta tilan- teestä riippuen perustuu ensisijaisesti puhdistettavan ja/tai erotettavan biomateriaalin sähkövaraukseen. Mikäli biomateriaalin varaus on negatiivinen, käytetään positiivisesti varattua (emäksistä) hartsia; mikäli varaus on positiivinen, käytetään negatiivisesti varattua (hapanta) hartsia. Valinnan voi kummassakin tapauksessa suorittaa alan hallitseva henkilö ioninvaihto-: ·.. kemian periaatteita hyväksikäyttäen.

Käytetyn polymeerisen adsorbentin määrän tulee edulli-sesti olla tarpeeksi suuri, jotta suurin osa nesteväli-- aineessa olevasta biomateriaalista adsorboituisi, mutta · ei niin suuri, että väliaineesta tulee viskoottinen ja ίο 90089 vai!;’asti käsiteltävä ja suodatettava.

Adsorbenttiä käytetään edullisesti väliaineessa olevan biotuotteen painoa vastaava määrä, esimerkiksi noin 0,01-10 paino-% väliaineessa, joka sisältää yhtä paljon biotuotetta.

Keksinnön menetelmä voidaan toteuttaa poistamalla ensin biotuotetta sisältävässä nesteväliaineessa oleva parti k-kelimainen aines se ntrifugoimal1 a, suodattamalla tavanomaisella tavalla ja muilla kiinteän aineen poistamiseksi tarkoitetuilla erotusmenetelmillä, mikäli väliaine sisältää sellaisia kiinteitä aineita. Sopiva määrä valittua adsorbenttia lisätään suodokseen tai nesteväli-aineeseen, joka sisältää biotuotteen ja ja toisen(-t) biotuotteesta erotettavan(-t) komponentin(-t) . Saatua seosta voidaan sen jälkeen sekoittaa jonkin aikaa, yleensä usean minuutin ajan, jotta adsorbenttipartik-kelit adsorboituisivat biotuotteeseen. Tämän jälkeen seos suodatetaan suodatuskalvon läpi, edullisesti kierrättäen sitä onttoa kuitutyyppiä olevan modulin läpi. Kalvo valitaan siten, että se läpäisee mitkä tahansa epäpuhtaudet ja muut biomateriaalit biotuotetta ja ei-adsorboitua biotuotetta lukuunottamatta, mutta ei •..biotuotetta kantavia adsorbenttipartikkeleita. Käytetyt kalvosuodattimet ovatkin puolittain läpäiseviä kalvoja, jotka ovat tunnettuja kyvystään poistaa liuenneita tai dispersoituja aineita uitrasuodatuksen tai mikrosuoda-tuksen avulla, mutta jotka eivät erota liuenneita suoloja käänteisosmoosin a tunnetun menetelmän mukaan.

Adsorbentti-biotuotekompleksi jää suodattimeen, ja ,, 90089 permeaatti, joka sisältää epäpuhtauksia ja/tai muuta biomateriaalia, kerätään ja poistetaan yksiköstä. Biotuote vapautetaan tämän jälkeen adsorbentista, esimerkiksi tunnettujen desorptiomenetelmien mukaan. Biotuotteen luonteesta riippuen tämä voidaan saavuttaa muuttamalla väliaineen pH-arvoa, muuttamalla elektro-lyyttitasapainoa tai muun sopivan affiniteetti k romato-grafian tai vastaavan menetelmän mukaan.

Desorboidun biotuotteen sisältävä väliaine suodatetaan saman k a 1v o s u o d a 11 i m e n lävitse ja otetaan talteen. Regeneroitu adsorbentti jää suoda ttimeen ja se voidaan käyttää uudestaan.

Keksintöä tullaan kuvaamaan tarkemmin seuraavien esimerkkien avulla, joiden tarkoitus on ainoastaan kuvata keksintöä eikä asettaa rajoituksia keksinnön käytön suhteen. Esimerkeissä mainitut osa- ja prosenttiluvut on laskettu painon suhteen, mikäli muuta ei mainita.

Esimerkki 1 ' \ Tässä esimerkissä esitetään negatiivisesti varatun adsorbentin tehokkuus erottaa positiivisesti varattu . biomateriaali (Cytochrome C) negatiiivise sti varatusta biomateriaalista (naudan seerumialbumiin is ta) .

(A) Adsorben11i1 ataus:

Naudan seerumialbumiinia ("BSA"), 200 mg, liuotettiin ; 20 ml:aan 0,01 M kaiiumfosfaatti puskuria suodatetussa, deionisoidussa vedessä (" PPB-liuos"). Saatu liuos 12 90089 suodatettiin 0,22 mikrometrin Mi 11ipore-suoda11ime n läpi. Järjestelmän kokonaistilavuus tässä vaiheessa oli 175 ml. Puoli grammaa väkevää happoa, emulsiopolymeroi-tuja, styreeni/divinyy1ibe ntsee nigee1imäisiä kopoly-meerisiä (7,3% divinyy1ibe ntsee niä si11 oi11ajana) hartsihelmiä, joiden keskimääräinen partikkelikoko on 0,26 + 0,02 mikrometriä ja k ationinvaihtokapasitee11i on 5,1 meq/g kuiva-aine11a , lisättiin 195 ml:aan BSA/-PPB-1iuokseen . Saatuun suspensioon lisättiin 146,2 mg Cytochrome C:tä, tyyppi III.

(B) UItrasuodatus : BSA- ja Cytochrome C-valmisteet sekoitettiin ja seosta kierrätettiin 15 minuuttia Amicon HIMP01-43 onttokuitu-u11rasuodatusjärje ste 1män kalvon läpi, yksikön korkeus 20,32 cm (8 in), jonka kuitujen sisäh ai kaisija (I.D.) on 0,11 cm (43 mils), huokosten halkaisija on 0,1 mikrometriä ja tehokas pinta-ala on 0,028 m (0,3 ft ). Permeaatti kerättiin ja poistettiin. Suodattimeen jäänyt hartsisuspensio diasuodatettiin viidellä PPB-liuok-sen ti1avuuskorvauks e 11 a ja palautettiin tilavuuteen 200 ml. Analyysi osoitti, että 97,4 mg Cytochrome C:tä jäi hartsiin ja 48,8 mg Cytochrome C:ta ja 88% BSA: ta läpäisi suodattimen.

(C) Adsorbentin poisto (eluointi):

Nestemäistä 1,0 M:sta KCl-liuosta, 200 ml, lisättiin suspensioon, jota kierrätettiin u11rasuodatus k a 1vo n läpi 15 minuutin ajan. Permeaatti kerättiin, diasuodatettiin seitsemällä 1,0 M KCl:n ti1 avuus k orvaukse 11 a, ,3 90089 ja palautetun tilavuuteen 200 ml:a. Analyysi osoitti, että 102,0 mg Cytochrome C:tä oli eluoitunut. Eluointi-teho laskettiin seuraavan kaavan mukaanä 102,0 mg eluoitunut - x 100 = 105% 97,A mg ladattu

Esimerkki 2 Tässä esimerkissä esitetään tehokas tapa erottaa Cytochrome C (positiivisesti varattu biomateriaali) ja Penicillin G (positiivisesti varattu biomateriaali) toisistaan negatiivisesti varatun adsorbentin avulla.

(A) Adsorbenttilataus:

Penicillin Gstä ( " P G " ) , 200 mg, liuotettiin 200 m1 : a n PPB-liuosta (kuvattu esimerkissä 1). Kokonaistilavuus oli tässä vaiheessa 200 ml. Puoli grammaa esimerkissä 1 käytettyä väkevää happoioninvaihtohartsia lisättiin 195 ml:aan PPB-liuosta, joka sisälsi PG:tä. Saatuun suspensioon lisättiin 146,2 mg: a Cytochrome C:tä, tyyppi III.

(B) UItrasuodatus: PG- ja Cytochrome C-valmisteet sekoitettiin keskenään ja kierrätettiin 15 minuuttia esimerkissä 1 kuvatun :·. ui trasuodatus j ärj estelmän kalvon läpi. Permeaatti kerättiin ja poistettiin. Suodattimeen jäänyt . hartsisuspensio diasuodatettiin viidellä PPB-liuoksen tilavuuskorvauksella, jonka jälkeen tilavuus painu- 14 90089 tettiin 200 ml : an . Analyysi osoitti, että 105,6 mg:a Cytochrome C:tä jäi hartsiin ja 40,6 mg:a Cytochrome C:tä ja 92% PG:tä läpäisi suodattimen.

(C) Adsorbentin poisto (eluointi):

Nestemäistä 1,0 M:sta KCL-1iuosta, 200 ml, lisättiin hartsisuspensioon, jonka jälkeen seosta kierrätettiin uitrasuodatuskalvon läpi 15 minuutin ajan. Permeaatti kerättiin, diasuodate11iin seitsemällä 1,0 M K C L : n ti1 avuuskorv au k s e 11 a, jonka jälkeen tilavuus palautettiin 200 ml:an. Analyysi osoitti, että 109,8 mg Cytochrome C:tä oli eluoitunut, jolloin e 1uointite ho k si saatiin seuraavaa: 109,8 mg eluoitunut -— x 100 = 104% 105,6 mg ladattu

Esimerkki 3 Tässä esimerkissä kuvataan ilman varausta olevan adsorbentin käyttöä biomateriaalin erottamiseksi ja esitetään lisäksi, miten puhdistettavan ja/tai erotettavan biomateriaalin sisältävän väliaineen kohonnut ele ktroiyy11itaso heikentää adsorbentin 1 atauskapasitee11ia, ts. sen kykyä sitoutua biomateriaaliin.

a) 195 ml:an 0,1 M:sta PPB-liuosta (kuvattu esimerkissä 1) lisättiin kaiiumk1 oridia, jotta kaiiumkloridin pitoisuudeksi saataisiin 0,1 M, ja 2,0 g (kuiva-aineesta) 15 90089 50% hydroksietyyliakrylaattia ja 50% trimetylolipro-paanitrimetyyliakrylaattia sisältävää emulsiokopoly-meeriä. Tähän lisättiin 150 mg Cytochrome C:tä (kuvattu esimerkissä 1) 20 0 m1 s s s a 0,1 M PPB/0,1 M KCL-puskuri- liuosta, ja kopolymeerin lataus kapasiteetti määritettiin kuten esimerkissä 1 käyttämällä 1 M KCL/0,01 M F ? P -liuosta eluenttina. 1,6 mg Cytochrome C:tä kopolymeeri-grammaa kohden sitoutui näissä olosuhteissa ja 96,0% siitä eluoitui.

b) 195 mitan tislattua vettä lisättiin 2,0 g (kuiva-aineesta) yllä (a) kuvattua emulsiokopolymeeriä. Tähän lisättiin 150 mg Cytochrome C:tä ja 200 ml tislattua vettä ja latauskapasiteetti määritettiin ultrasuodatuksen avulla, kuten esimerkissä 1. 67,2 mg Cytochrome C:tä kopolymeerigrammaa kohden sitoutui ja 99,5% siirä eluoitui 1 M KCl/0,01 M PPB-1iuok se 11 a.

Esimerkki k Tässä esimerkissä kuvataan hiivasolu heksokinaasin ' uitrasuodatuskromatografiaa tämän keksinnön prosessia * käyttäen.

Kuivatut hiivasolut (Sigma Chemical Co., Cat. No. Ysc-1) liuotettiin suspendoimalla ne 0,12 M:een ammoniumi-hydroksidiin. Kun solut olivat liuonneet, laskettiin suspension pH-arvo 4,5 : e e n lisäämällä etikkahappoa. Lopullinen tilavuus oli 1,6 litraa ja kuiva-aine- :V: pitoisuus oli 9%. Suspensio laimennettiin 2,6 litraa:1.

deionisoidulla vedellä ja mikrosuodatettiin Romicon H P * -- ‘‘ - 4 7 M P 01 yksiköllä varustetussa s u o d a t u s y k s i k ö s s ä , jotta ,6 90089 solujätteet erottuisivat liukenevista entsyymeistä, heksokinaasi (HK) mukaan lukien. Suspensio väkevöitiin 500 ml:aan ja diasuodatettiin kymmenellä 0,14 M natrium-asetaatin ti1avuuskorvaukse11 a pH:ssa 5. Heksokinaasin talteenotto permeaatista oli 73% liuotetun suspension alkuperäisestä entsyymimäärästä.

Kahdessa litrassa mi krosuodatussuodosta , joka sisälsi yhden yksikön heksokinaasia ja 0,96 mg proteiinia/ml, oleva heksokinaasi väkevöitiin adsorboimalla se väkevään happoon, emulsiopolymeroituun , styreeni-7,3% divinyy1ibentseenigeelimäiseen hartsiin, jonka keskimääräinen partikkelin halkaisija oli 0,26 mikrometriä ja kation invaihtokapasitee11i 5,1 meq/g kuivaa hartsia. Hartsi lisättiin tämän jälkeen suspensioon jolloin sen pitoisuuus oli 2100 ppm. Entsyymi- ja hartsisuspensiota sekoitettiin hitaasti 15 minuuttia, jonka aikana pienen suodatetun osan analyysi osoitti, ettei su pernatantissa ollut entsyymiaktiivisuutta. Hartsi laskeutui nopeasti astian pohjalle, kun sekoittaminen lopetettiin ja se voitiin ottaa talteen monella tavalla. Tässä tapauksessa koko hartsisuspensio sijoitettiin suodatusyksikön k iertosäi1iöön, joka oli varustettu yllä kuvatulla mik-rosuodatusyksiköl1ä. 15 minuutin kierrättämisen jälkeen tehty suodoksen analyysi osoitti, että 505 alkuperäises-ti hartsiin sidotusta entsyymistä oli suodoksessa. Suspensio väkevöitiin 500 ml:aan ja diasuodatettiin kahdella litralla ads orptiopuskuria. Lopullisessa diasuo-doksessa ei havaittu entsyymiaktiivisuutta. 500 ml:a 4 M:sta natriumk1 oridia lisättiin retenaattiin ja kierrätettiin 15 minuuttia. Suspensio väkevöitiin tämän jälkeen 500 ml:aan. Tämä vaihe toistettiin vielä kaksi 17 90089 kertaa. 2 M NaCL-suodoksen analyysi osoitti, että 60% adsorboidusta entsyymistä saatiin talteen tässä vaiheessa.

Claims (12)

1. Menetelmä, jossa (i) ensimmäinen veteen liukeneva tai veteen dispergoituva bio-vaikutteinen aine, joka on ensimmäisessä nesteväliaineessa yhdessä yhden tai useamman muun komponentin kanssa, jotka ovat epäpuhtauksia tai muita veteen liukenevia ja/tai veteen dispergoituvia bio-vaikutteisia aineita, erotetaan mainituista yhdestä tai useammasta muusta * komponentista, ja/tai (ii) mainitussa ensimmäisessä nesteväliaineessa yhdessä mainittujen yhden tai useamman muun komponentin kanssa oleva mainittu ensimmäinen bio-vaikutteinen aine puhdistetaan, tunnettu siitä, että menetelmä käsittää: (a) seoksen muodostamisen, joka seos sisältää ensimmäisen nes-teväliaineen ja partikkelimaisen, polymeerisen adsorbentin, jolla on kyky adsorboida edullisesti ensimmäinen bio-vaikutteinen aine tai mainittu yksi tai useampi muu komponentti ensimmäisestä nesteväliaineesta ja jonka keskimääräinen partikkelikoko on 0,01-5 mikrometriä, sekä joka on valittu ionin-vaihtohartsien ja ilman varausta olevien, ei-funktionalisoitu-jen polymeeripartikkeleiden joukosta, jolloin adsorbentti sitoo käänteisesti ensimmäisen bio-vaikutteisen aineen tai mainitun yhden tai useamman muun komponentin muodostaen kompleksin; (b) vaiheesta (a) saadun seoksen suodattamisen kalvosuodatukeen avulla, joka kalvo ei läpäise mainittua kompleksia, jolloin mainittu ensimmäinen bio-vaikutteinen aine erottuu mainitusta yhdestä tai useammasta muusta komponentista ja/tai puhdistuu.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, jossa (i) ensimmäinen veteen liukeneva tai veteen dispergoituva bio-vaikutteinen aine erotetaan ensimmäisestä nesteväliaineesta, joka sisältää mainitun ensimmäisen bio-vaikutteisen aineen ja mainitun yhden tai useamman muun komponentin, ja/tai (ii) mainitussa ensimmäisessä nesteväliaineessa oleva mainittu ensimmäinen bio-vaikutteinen aine puhdistetaan, tunnettu siitä, että partikkelimaisella polymeerisellä adsorbentilla on kyky adsorboida edullisesti ensimmäinen bio-vaikutteinen aine ensimmäisestä nesteväliaineesta, jolloin adsorbentti sitoo käänteisesti ensimmäisen bio-vaikutteisen aineen muodostaen kompleksin, 19 90 08 9 ja että kalvo läpäisee mainitun yhden tai useamman muun komponentin muttei läpäise kompleksia, jolloin kompleksi ja mainittu yksi tai useampi muu komponentti erottuu, ja/tai mainittu ensimmäinen bio-vaikutteinen aine puhdistuu.

3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että se käsittää lisäksi vaiheen, jossa (c) ensimmäinen bio-vaikutteinen aine vapautetaan kompleksin polymeeripartikkeleista, esimerkiksi elektrolyytin avulla, toiseen nesteväliaineeseen.

4. Patenttivaatimuksen 3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että se käsittää lisäksi vaiheen, jossa (d) vapautuneen ensimmäisen bio-vaikutteisen aineen ja adsor-benttipolymeeripartikkelit sisältävä toinen nesteväliaine suodatetaan kalvosuodatuksen avulla kuten vaiheessa (b), jolloin ensimmäinen bio-vaikutteinen aine, mutta eivät adsorbenttipo-lymeeripartikkelit, akkumuloituu permeaattiin.

5. Minkä tahansa edellisen patenttivaatimuksen mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että adsorbentti käsittää ioninvaih-tohartsin, jossa on korkeintaan noin 1,5 funktionaalista ryhmää monomeeriyksikköä kohden.

6. Patenttivaatimuksen 5 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että ioninvaihtohartsin partikkelit käsittävät pääosin pyöreitä helmiä tai jauhettuja partikkeleita.

7. Patenttivaatimuksen 5 tai 6 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että ioninvaihtohartsi käsittää happaman tai emäksisen ioninvaihtohartsin, ensimmäinen bio-vaikutteinen aine voi esimerkiksi olla positiivisesti varattu ja ioninvaihtohartsi on hapan, tai ensimmäinen bio-vaikutteinen aine voi olla negatiivisesti varattu ja ioninvaihtohartsi on emäksinen.

8. Minkä tahansa patenttivaatimuksen 1-4 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että partikkelimainen, polymeerinen adsorbentti on ilman varausta olevien, ei-funktionalisoitujen polymee-ripartikkelien muodossa, ja että partikkelimainen, polymeeri- 20 90 0 89 nen adsorbentti ja ensimmäinen bio-vaikutteinen aine ovat hydrofobisia .

9. Minkä tahansa edellisen patenttivaatimuksen mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että ensimmäinen bio-vaikutteinen aine käsittää proteiinimaisen materiaalin, aminohapon, antibiootin, vitamiinin tai nukleiinihapon.

10. Minkä tahansa edellisen patenttivaatimuksen mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että ensimmäinen bio-vaikutteinen aine ja mainittu yksi tai useampi muu komponentti on suspen-doitu tai liuotettu ensimmäiseen nesteväliaineeseen, ja/tai ensimmäinen nesteväliaine on vesipitoinen ja partikkelimainen, polymeerinen adsorbentti on veteen liukenematon tai olennaisesti veteen liukenematon.

11. Minkä tahansa edellisen patenttivaatimuksen mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että muut veteen liukenevat ja/tai veteen dispergoituvat bio-vaikutteiset aineet käsittävät yhden tai useamman proteiinin, aminohapon, nukleiinihapon, antibiootin tai vitamiinin.

12. Partikkelimaisen, polymeerisen adsorbentin käyttö (i) erotettaessa ensimmäinen veteen liukeneva tai veteen disper-goituva bio-vaikutteinen aine, joka on ensimmäisessä nestevä-liaineessa yhdessä yhden tai useamman muun komponentin kanssa, jotka ovat epäpuhtauksia tai muita veteen liukenevia ja/tai veteen dispergoituvia bio-vaikutteisia aineita, mainitusta yhdestä tai useammasta muusta komponentista, ja/tai (ii) puhdistettaessa mainittu ensimmäinen bio-vaikutteinen aine, joka on mainitussa ensimmäisessä nestevällaineessa yhdessä mainittujen yhden tai useamman muun komponentin kanssa, tunnettu siitä, että (a) muodostetaan seos, joka sisältää ensimmäisen nesteväliai-neen ja partikkelimaisen, polymeerisen adsorbentin, jolla on kyky adsorboida edullisesti ensimmäinen bio-vaikutteinen aine tai mainittu yksi tai useampi muu komponentti ensimmäisestä nestevällaineesta ja jonka keskimääräinen partikkelikoko on 0,01-5 mikrometriä, sekä joka on valittu ioninvaihtohartsien 2i 9 Π O [' 9 ja ilman varausta olevien, ei-funktionalisoitujen polymeeri-partikkeleiden joukosta, jolloin adsorbentti sitoo käänteisesti ensimmäisen bio-vaikutteisen aineen tai mainitun yhden tai useamman muun komponentin muodostaen kompleksin; ja (b) vaiheesta (a) saatu seos suodatetaan kalvosuodatuksen avulla, joka kalvo ei läpäise mainittua kompleksia, jolloin mainittu ensimmäinen bio-vaikutteinen aine erottuu mainitusta yhdestä tai useammasta muusta komponentista ja/tai puhdistuu.