WO2010082631A1 - 核酸試料の製造方法、および、それを用いた核酸増幅物の製造方法 - Google Patents

核酸試料の製造方法、および、それを用いた核酸増幅物の製造方法 Download PDF

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carrier
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cells
cell
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昌弘 小塚
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アークレイ株式会社
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    • C12P19/28—N-glycosides
    • C12P19/30—Nucleotides
    • C12P19/34—Polynucleotides, e.g. nucleic acids, oligoribonucleotides

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing a nucleic acid sample by collecting nucleic acid from a cell sample containing cells, and a method for producing a nucleic acid amplification product using the nucleic acid sample.
  • nucleic acids are usually collected from the patient's whole blood, but whole blood contains various components such as red blood cells and plasma, and some components that affect subsequent amplification reactions when left in large quantities. Is also present. Nucleic acids are generally contained in leukocytes, but leukocyte debris after releasing the nucleic acids may affect the subsequent amplification reaction. For this reason, when recovering a nucleic acid as a template from a patient's blood sample, it is necessary to release the nucleic acid from the white blood cells and to remove unnecessary components to some extent.
  • SNP single nucleotide polymorphism
  • Patent Document 1 there is a method of binding nucleic acid to silica particles in the presence of a high concentration of chaotropic salt. According to this method, since the nucleic acid binds to the silica particles, the nucleic acid can be recovered by separating the complex of the nucleic acid and the silica particles from the liquid fraction.
  • chaotropic salts are corrosive denaturing agents, and their influence on the human body and the environment is regarded as a problem.
  • chaotropic salts are essential for the binding of nucleic acids and silica particles, but in order to inhibit the reaction of many enzymes such as DNA polymerase and restriction enzymes, washing with a nucleic acid-insoluble organic solvent such as ethanol is necessary. .
  • organic solvents such as ethanol also inhibit various enzyme reactions, it is necessary to completely remove them by, for example, drying, and there is a problem that the operation is complicated.
  • the said organic solvent is usually volatile, handling is also difficult.
  • the carrier for recovering the nucleic acid is limited to particles of silica and its derivatives, and the reagent is also limited to a special reagent including a chaotropic salt. For this reason, there is a problem that a carrier or reagent other than these cannot be substituted and costs and preparation are troublesome.
  • the second method is a method in which a biological sample is brought into contact with a bead-shaped support in the presence of a surfactant to bind and recover DNA in the biological sample to the support (Patent Document 2). ).
  • DNA can be recovered as a gel-like DNA-bead complex.
  • it is necessary to treat a large amount of cell suspension with a surfactant. As a result, the amount of sample increases, and the beads are efficiently contacted. It may not be possible. For this reason, pretreatment such as concentration of cells by centrifugal filtration or the like, or concentration of necessary cells after removing unnecessary cells or substances occurs, and the operation becomes complicated.
  • the third method is a method in which the nucleic acid in the cell extract is adsorbed to the nonwoven fabric by bringing the cell extract into contact with the nonwoven fabric (Patent Document 3).
  • Patent Document 3 it is necessary to make the cell extract a high salt concentration condition in order to adsorb the nucleic acid onto the nonwoven fabric.
  • the obtained nucleic acid for nucleic acid amplification for example, in order to avoid the influence by a salt, it is necessary to remove a salt beforehand and operation is complicated.
  • nucleic acid adheres very firmly to a nonwoven fabric, it is difficult to elute DNA from the nonwoven fabric.
  • elution requires treatment under an extremely harsh environment, for example, heat treatment for a long time under strong alkaline conditions such as pH 12, and treatment with active oxygen.
  • heat treatment for a long time under strong alkaline conditions such as pH 12, and treatment with active oxygen.
  • the present invention does not require the use of a large amount of high-risk chaotropic salt or the like as in the prior art, and is not limited to a special carrier, and has excellent safety and a simple nucleic acid sample production method. It aims at providing the manufacturing method of the nucleic acid amplification product using it.
  • the method for producing a nucleic acid sample of the present invention is a method for producing a nucleic acid sample for recovering nucleic acid from a cell, and includes the following steps (A) to (E).
  • a step of releasing a nucleic acid complex from the cell with respect to a cell sample containing the cell (B) a step of bringing a treatment liquid containing the cell sample after the step (A) into contact with a carrier (C) A step of separating the carrier and the treatment liquid (D) a step of subjecting the carrier to heat treatment (E) a step of adding a dispersion medium to the carrier before or after the step (D)
  • the method for producing a nucleic acid amplification product of the present invention is a method for producing a nucleic acid amplification product of a target sequence by a nucleic acid amplification method, and includes the following steps (a) and (b).
  • nucleic acids can be recovered with excellent efficiency by releasing nucleic acid complexes from cells. For this reason, for example, mitochondrial DNA can be recovered in addition to genomic DNA and RNA. Moreover, since the nucleic acid complex can be released from the cells without using a special reagent, for example, it is excellent in safety and operability. Thus, since the present invention is excellent in safety and operability and excellent in the recovery rate, for example, a nucleic acid serving as a template necessary for nucleic acid amplification or the like from a small amount of cells or a small amount of cell sample, A sufficient amount can be recovered.
  • FIG. 1 is a cross-sectional view showing an example of a pipette tip for nucleic acid recovery in the present invention.
  • FIGS. 2A to 2D are schematic views showing an outline of a nucleic acid recovery method using the nucleic acid recovery pipette tip in the present invention.
  • 3A to 3D are schematic views showing an example of a biochip for nucleic acid recovery in the present invention.
  • 4A to 4D are schematic views showing an example of a biochip for nucleic acid amplification in the present invention.
  • 5A and 5B are schematic views showing an example of a jig device used in Example 1 of the present invention, where FIG. 5A is a top view, FIG. 5B is a cross-sectional view, and FIG. It is a schematic diagram shown.
  • FIGS. 6A and 6B are schematic views showing an example of a jig device used in Example 2 of the present invention, in which FIGS. 6A and 6B are perspective views, FIG. 6C is a top view, and FIG. 6D is a cross-sectional view. is there.
  • FIG. 7 is a photograph showing Giemsa staining of a nucleic acid complex in a reference example.
  • the method for producing a nucleic acid sample of the present invention is a method for producing a nucleic acid sample for recovering nucleic acid from a cell, and includes the following steps (A) to (E).
  • the method for producing a nucleic acid sample of the present invention can also be referred to as a nucleic acid sample preparation method, a nucleic acid sample recovery method, or a nucleic acid recovery method from cells.
  • a step of releasing a nucleic acid complex from the cell with respect to a cell sample containing the cell B) a step of bringing a treatment liquid containing the cell sample after the step (A) into contact with a carrier
  • C A step of separating the carrier and the treatment liquid
  • D a step of subjecting the carrier to heat treatment
  • E a step of adding a dispersion medium to the carrier before or after the step (D)
  • nucleic acid recovery is presumed to be due to the following mechanism, but the present invention is not limited to this.
  • Conventional nucleic acid recovery particularly genomic DNA recovery, usually involves firstly processing the sample such as blood, destroying the nucleus in the cell (eg, white blood cell), releasing the chromosome packaged in the nucleus, and unnecessary.
  • the nuclear genome is linearized by removing various proteins and fibers, and the nuclear genome is recovered by separating the carrier and the liquid fraction, for example, by holding the nuclear genome on various carriers. .
  • the nuclear genome is not linearized, but is a particle structure having a high-order structure in which the nuclear genome is entangled.
  • the nuclear genome is maintained as a nucleic acid complex.
  • This nucleic acid complex is usually about 50 to 200 ⁇ m in diameter, larger than a nucleus having a diameter of 10 ⁇ m or less, more sterically hindered than a linear nuclear genome, and has a high-order structure. ing. For this reason, it is easy to be hold
  • the mitochondrial genome can be recovered by capturing the nuclear genome on the carrier in the state of the nucleic acid complex.
  • the mitochondrial genome is a circular DNA in which about 17,000 nucleotides are connected and is very fine, and it was extremely difficult to recover it.
  • the nucleic acid complex captured by the carrier has a structure in which nucleic acids are entangled, it is considered that a mitochondrial genome is further captured in this structure.
  • such a nucleic acid complex is very stable as compared with, for example, a linear nuclear genome, so that it is difficult to be destroyed by operations such as pipetting and vortex mixing. For this reason, the fall of the collection rate by collection
  • nucleic acids contained in the nucleic acid complex for example, genomic DNA, mitochondrial DNA, plasmid DNA, RNA, etc. can be recovered in a dispersion medium only by subjecting the nucleic acid complex captured by the carrier to heat treatment.
  • the method for bringing the treatment liquid after the step (A) into contact with the carrier, and the method for separating the carrier and the treatment liquid in the step (C), respectively is not particularly limited, and can be appropriately determined according to, for example, the shape of the carrier and the arrangement state thereof, as described later.
  • the separation of the carrier and the treatment liquid can be, for example, the separation of the carrier and the liquid fraction, or the removal of the treatment liquid or the liquid fraction. .
  • the treatment liquid (liquid fraction) may not be completely removed from the carrier, for example, and the treatment liquid may remain on the carrier, for example.
  • the addition of the dispersion medium in the step (E) may be performed before or after the step (D) in which the heat treatment is performed.
  • the production method of the present invention performs, for example, the steps (A) to (C) in this order, followed by the heat treatment (D).
  • the step (E) of adding the dispersion medium is performed.
  • the production method of the present invention includes, for example, the steps (A) to (C) in this order, and then the dispersion medium is added.
  • the step (E) of heat treatment is performed.
  • the step (A) is a first production in which, for example, a treatment reagent containing a protease and a surfactant and the cell sample are mixed (A1).
  • a treatment reagent containing a protease and a surfactant and the cell sample are mixed (A1).
  • the cell sample and the treatment reagent are mixed to obtain a treatment liquid in which the nucleic acid complex is released from the cells. .
  • the first production method of the present invention will be described, but the present invention is not limited thereto.
  • the reagent containing the protease and the surfactant before mixing with the cell sample is hereinafter referred to as “treatment reagent”, and the mixture of the treatment reagent and the cell sample is referred to as “treatment liquid” or “mixing”. It is called “treatment liquid”.
  • the mixing of the cell sample and the treatment reagent may be, for example, adding the treatment reagent to the cell sample or adding the cell sample to the treatment reagent.
  • the processing reagent used in the first production method of the present invention is also referred to as “first processing reagent”, for example.
  • the concentration of the protease is, for example, 0.5 mU / ⁇ L or more, and the concentration of the surfactant is, for example, 0.1% by volume or more. It is preferable.
  • the protease concentration and the surfactant concentration are, for example, concentrations in a treatment solution containing the treatment reagent and the cell sample, respectively, and the cell content in the treatment solution is about 1 ⁇ 10 2 to 1 ⁇ . It is the density when assuming 10 9 .
  • the protease concentration and the surfactant concentration are, for example, concentrations in a treatment solution containing the treatment reagent and the cell sample, respectively, and the addition ratio of the cell sample in the treatment solution is 50 to 100 ⁇ L, The concentration may preferably be 50 ⁇ L.
  • the lower limit of the protease concentration is, for example, 0.5 mU / ⁇ L or more, preferably 1 mU / ⁇ L or more, more preferably 2 mU / ⁇ L or more.
  • the upper limit of the protease concentration is not particularly limited, but is, for example, 1 U / ⁇ L or less, preferably 500 mU / ⁇ L or less.
  • the concentration range of the protease is, for example, 0.5 to 1000 mU / ⁇ L, preferably 1 to 1000 mU / ⁇ L, more preferably 2 to 500 mU / ⁇ L, and particularly preferably 5 to 15 mU / ⁇ L. It is a range.
  • the amount of enzyme that produces a peptide corresponding to 1 ⁇ mol of tyrosine per minute at 37 ° C. using hemoglobin as a substrate is generally 1 U.
  • the ratio of protease to 1 ⁇ 10 2 to 1 ⁇ 10 9 cells is not particularly limited, but the lower limit is, for example, 0.02 mU or more, preferably 0.08 mU or more.
  • the upper limit is, for example, 100 U or less, preferably 50 U or less.
  • the ratio of the protease to 50 ⁇ L of the cell sample is not particularly limited, but the lower limit is, for example, 0.02 mU or more, preferably 0.08 mU or more, and the upper limit is, for example, 100 U or less, preferably 50 U or less.
  • the lower limit of the concentration of the surfactant is not particularly limited, but is, for example, 0.1% by volume or more, preferably 0.2% by volume or more.
  • the upper limit of the surfactant is not particularly limited, but is, for example, 20% by volume or less, preferably 10% by volume or less, more preferably 5% by volume or less, and still more preferably. Is 2% by volume or less.
  • the concentration range of the surfactant is, for example, 0.1 to 20% by volume, preferably 0.1 to 5% by volume, more preferably 0.1 to 2% by volume, and particularly preferably 0. The range is from 2 to 0.8% by volume.
  • the ratio of the surfactant to 1 ⁇ 10 2 to 1 ⁇ 10 9 cells is not particularly limited, but the lower limit is, for example, 1 femtomole (1 ⁇ 10 ⁇ 15 mol) or more.
  • the upper limit is, for example, 200 femtomole or less, preferably 100 femtomole or less.
  • the ratio of the surfactant to 50 ⁇ L of the cell sample is not particularly limited, but the lower limit is, for example, 1 femtomole or more, preferably 2 femtomole or more, and the upper limit is, for example, It is 200 femtomole or less, preferably 100 femtomole or less.
  • the ratio of the aforementioned protease and surfactant is preferably 1 ⁇ 10 2 to 1 ⁇ 10 8 , more preferably 1 ⁇ . It is a ratio to 10 3 to 1 ⁇ 10 7 pieces.
  • the eukaryotic cells in particular, when the cells are cells derived from whole blood (for example, leukocytes), the ratio is preferably from 5 ⁇ 10 3 to 1 ⁇ 10 7 , more preferably 2. This is a ratio to 5 ⁇ 10 4 to 1 ⁇ 10 7 pieces.
  • the ratio is preferably 1 ⁇ 10 2 to 1 ⁇ 10 7 , and more preferably 1 ⁇ 10 3 to 1 ⁇ 10 6. It is. Further, when the cell is a prokaryotic cell, for example, the ratio is preferably 1 ⁇ 10 3 to 1 ⁇ 10 9 , more preferably 1 ⁇ 10 3 to 1 ⁇ 10 8 , for example, The same applies to E. coli and the like.
  • the protease concentration and surfactant concentration in the treatment reagent are not particularly limited, and for example, when the treatment reagent is mixed with the cell sample, the concentration may be set to the above-described concentration in the treatment liquid. preferable.
  • the concentration of the protease in the treatment reagent is not particularly limited, but the lower limit is, for example, 1 mU / ⁇ L or more, preferably 2 mU / ⁇ L or more, more preferably 4 mU / ⁇ L or more, and the upper limit is, for example, 2 U / ⁇ L or less, preferably 1 U / ⁇ L or less, and the concentration range is, for example, 1 to 2000 mU / ⁇ L, preferably 2 to 2000 mU / ⁇ L, more preferably 4 to 1000 mU / ⁇ L. Particularly preferably, it is in the range of 10 to 30 mU / mL.
  • the concentration of the surfactant in the treatment reagent is not particularly limited, but the lower limit is preferably, for example, 0.2% by volume or more, and the upper limit is, for example, 40% by volume or less, more preferably 20%. It is not more than volume%, more preferably not more than 10 volume%, particularly preferably not more than 4 volume%, and the concentration range is, for example, 0.2 to 40 volume%, preferably 0.2 to 10 volume%. %, More preferably 0.2 to 4% by volume, particularly preferably 0.4 to 1.6% by volume.
  • the addition ratio (volume ratio S: T) of the cell sample (S) and the treatment reagent (T) is not particularly limited, but is, for example, 1: 0.5 to 1:20, preferably 1: 0. .5 to 1:10, more preferably 1: 0.5 to 1: 5.
  • protease examples include proteinase K, chymotrypsin, pepsin, cathepsin D, and papain. Any one of these proteases may be used, or two or more thereof may be used in combination.
  • the surfactant is not particularly limited, but for example, a nonionic surfactant is preferable.
  • the nonionic surfactant include polyoxyethylene-p-isooctylphenol (polyoxyethylene-p-isopropylphenol), polyoxyethylene sorbitan monolauric acid (polyoxyethylene sorbitan monolaurate), polyoxyethylene nonylphenol ether, Examples thereof include thioethoxylate.
  • These surfactants include, for example, Triton series such as Triton (trademark) X-100 and Triron (trademark) X-114, Nonidet series such as Nonidet (trademark) P40, Tween (trademark) 20, and Tween (trademark).
  • Examples thereof include 80-type surfactants such as 80. Any one kind of these surfactants may be used, or two or more kinds thereof may be used in combination.
  • the form of the processing reagent is not particularly limited, and may be, for example, a solid (dry body) or a liquid.
  • the protease and the surfactant are preferably added to a solvent.
  • the solvent is not particularly limited, and examples thereof include water, various buffers, aqueous solutions such as buffered saline, organic solvents, and mixtures thereof.
  • buffer examples include Tris-HCl, BES, PIPES, SSC, TAE, TBE, TG, MES, Bis-Tris, ADA, ACES, MOPSO, MOPS, TES, HEPES, DLPSO, TAPSO, POPSO, HEPPSO, EPPS, Tricine, Bicine, TAPS, CHES, CAPSO, CAPS, PBS, boric acid, cacodylic acid, citric acid, glycine, glycylglycine, imidazole, lithium citrate, potassium phosphate, sodium citrate, sodium phosphate, trityl Examples thereof include ammonium acetate (Trithylammonium Acetate).
  • the concentration of the buffer solution in the treatment reagent is not particularly limited, but is, for example, 0.1 to 100 mmol / L, more preferably 0.1 to 50 mmol / L, and particularly preferably 0.1 to 20 mmol / L. It is.
  • the pH of the treatment reagent is, for example, 7.8 to 9.5, preferably 8.5 to 8.9.
  • the treatment reagent may further contain a protein denaturant and the like, for example.
  • the protein denaturant include urea, ⁇ -mercaptoethanol, sodium lauryl sulfate, dithiothreitol, guanidine hydrochloride and the like.
  • the concentration of the protein denaturant in the treatment reagent is not particularly limited, but is, for example, 0 to 8 mol / mL, preferably 1 to 5 mol / mL, more preferably 1 to 3 mol / mL. One kind of these may be used, or two or more kinds may be used in combination.
  • the treatment reagent may further contain a chelating agent, for example.
  • a chelating agent examples include EDTA, EGTA, NTA, DTPA, GLDA, HEDTA, GEDTA, TTHA, HIDA, DHEG and the like.
  • the concentration of the chelating agent in the treatment reagent is not particularly limited, but is, for example, 0 to 10 mmol / mL, preferably 0 to 1 mmol / mL, and more preferably 0 to 0.1 mmol / mL.
  • the cell may be any cell containing a nucleic acid, and examples thereof include eukaryotic cells and prokaryotic cells.
  • the eukaryotic cells include blood cells such as leukocytes, oral cells, somatic cells such as nail cells and hair cells, germ cells and tumor cells, and these cultured cells. May be.
  • the cell sample containing the eukaryotic cell as the cell is not particularly limited, and examples thereof include blood, saliva, oral mucosa, nails, and hair, and even a culture of the eukaryotic cell. Good.
  • the prokaryotic cells are not particularly limited, and examples thereof include Escherichia coli and the like, and cultured cells thereof may be used.
  • the cell sample containing the prokaryotic cell as the cell is not particularly limited, and may be, for example, a culture of the prokaryotic cell.
  • the culture include cell culture fluid, recovered cultured cells, and the like.
  • the cell sample may be, for example, an undiluted cell sample or a diluted cell sample, but the present invention is preferably applied to nucleic acid recovery from an undiluted cell sample.
  • the cell sample is, for example, an oral cell or a cultured cell collected after culturing, for example, a cell sample obtained by suspending the cell in a physiological saline or a buffer solution in advance is used as the treatment reagent.
  • the cells may be directly used as a cell sample and mixed with the treatment reagent.
  • the cell sample may be, for example, a cell sample immediately after collection, or a cell sample that has been left at room temperature, stored in a refrigerator, or thawed after freezing.
  • the blood examples include whole blood, hemolyzed whole blood, a blood cell fraction of whole blood, a dispersion of the blood cell fraction, and the like.
  • the blood may be either undiluted blood or diluted blood, but is preferably applied to, for example, nucleic acid recovery from undiluted blood.
  • the blood may be, for example, blood immediately after collection, or blood that has been allowed to stand at room temperature, refrigerated, or thawed after freezing.
  • the nucleic acid recovered by the present invention is, for example, at least one of DNA and RNA.
  • Examples of the DNA include genomic DNA, plasmid DNA, mitochondrial DNA, and the like.
  • the carrier is brought into contact with a treatment solution containing the cell sample after the step (A), for example, a treatment solution obtained by mixing the treatment reagent and the cell sample.
  • the carrier in the step (B) is not particularly limited as long as it can capture the nucleic acid complex released from the cells by the treatment with the treatment reagent in the step (A).
  • the average diameter of the nucleic acid complex is, for example, 50 to 200 ⁇ m.
  • the carrier preferably has, for example, a void through which the nucleic acid complex is difficult to pass and a liquid fraction can pass through. Thereby, for example, the nucleic acid complex can be retained and the liquid fraction can be removed.
  • the nucleic acid complex since the nucleic acid complex has a high-order higher-order structure as described above, it easily adheres to, for example, fibers (entangles easily). For this reason, the size of the voids in the carrier is not particularly limited. For example, even if the nucleic acid complex is held by the carrier itself such as woven fabric and non-woven fiber, the nucleic acid complex is retained. Good. In addition, due to its higher order structure, it is considered that another nucleic acid complex is further retained by the nucleic acid complex attached to the carrier.
  • the carrier examples include nonwoven fabrics, woven fabrics such as mesh-like woven fabrics, and porous bodies such as sponges.
  • the shape is not particularly limited, and examples thereof include a sheet shape, a film shape, a block shape, and a bead shape.
  • the bead-shaped carrier may be formed from, for example, a nonwoven fabric, a woven fabric, a porous body, or the like, or may be formed from a non-porous body.
  • Diameter (particle size) For example, 30 nm to 100 ⁇ m, preferably about 5 ⁇ m
  • Surface area ratio for example, 0.5 to 200 m 2 / g, preferably 1.1 m 2 / g
  • Filling ratio for example, 0.1 to 10%, preferably 0.1 to 5%
  • the carrier examples include a polymer carrier.
  • the polymer is not particularly limited.
  • polyterolafluoro such as polypropylene, polyethylene, polyester, polyamide (for example, trade name nylon), polyurethane, polyether, polystyrene, polyvinyl chloride, for example, Teflon (registered trademark) or the like.
  • ethylene for example, polytetrafluoroethylene, polypropylene, polyamide, polyurethane, and polyester are preferable, and polypropylene, polyurethane, and polyester are more preferable.
  • the polymer carrier may be, for example, a carrier formed entirely from the polymer, or may be a carrier coated with the polymer only on a portion that comes into contact with blood, for example, only an exposed surface.
  • the bead-shaped polymer carrier may be formed of a porous body or a non-porous body as described above, for example.
  • a magnetic bead having a magnetic property is preferable because it can be recovered by a magnet.
  • the polymer constituting the magnetic beads is not particularly limited. For example, polystyrene, polyethyleneimine (PEI), polymethyl methacrylate (PMMA), polylactic acid (PLA), chitosan, and a copolymer of these polymers with maleic acid. Examples thereof include polymers.
  • the magnetic beads may be surface-treated with, for example, PEG-COOH, alkyl-OH, SO 3 H, SiO 2 or the like.
  • the magnetic beads may be, for example, such that the surface of a bead made of a magnetic material such as metal is coated with the polymer as described above. Examples of the metal include magnetite, maghemite, iron, nickel, and the like.
  • examples of the carrier include a metal carrier.
  • examples of the metal include stainless steel, titanium, and aluminum. These metals may be one kind or two or more kinds.
  • the carrier may be, for example, a single layer or a laminate of two or more layers.
  • the laminate may be composed of any one type of member, may be composed of two or more different types of members, and may be composed of members of different materials.
  • the size of the carrier to be used is not limited.
  • the amount of the cell sample in the step (A), the amount of the treatment liquid in which the cell sample and the treatment reagent are mixed, the shape of the carrier, etc. It can be determined appropriately according to A specific example will be described later.
  • the method for bringing the treatment liquid into contact with the carrier and the method for separating the treatment liquid and the carrier in the step (C) are not particularly limited. As will be described later, it can be appropriately determined according to the shape of the carrier, the arrangement state thereof and the like. Note that the treatment liquid does not have to be completely separated from the carrier as described above.
  • a method for producing the first nucleic acid sample of the present invention a method for recovering nucleic acid from whole blood will be described as an example, but the present invention is not limited to this.
  • the processing reagent is added to whole blood. This releases nucleic acid complexes from whole blood leukocytes.
  • This nucleic acid complex includes, for example, mitochondrial DNA in addition to genomic DNA and RNA.
  • the treatment conditions with the treatment reagent are not particularly limited, but the treatment time is, for example, 1 to 600 seconds, preferably 5 to 600 seconds, and more preferably 5 to 300 seconds.
  • the treatment temperature is, for example, 4 to 60 ° C., preferably 10 to 60 ° C., and more preferably 15 to 40 ° C.
  • the treatment liquid obtained by mixing the whole blood and the treatment reagent is brought into contact with the carrier.
  • the nucleic acid complex released from the leukocytes of whole blood which is a nucleic acid-containing cell, is captured on the carrier.
  • the size of the carrier is not particularly limited as described above, and can be appropriately determined depending on, for example, the amount of whole blood to be processed, the material and shape of the carrier, and the like. Specific examples are shown below.
  • the ratio (X: Y) of the volume of the carrier (Y: including voids) to the volume (X) of whole blood treated in the step (A) is, for example, 1: 2.2 ⁇ 10 ⁇ 3 to 1: It is 0.7, preferably 1: 2.2 ⁇ 10 ⁇ 3 to 1: 0.31, and more preferably 1: 2.2 ⁇ 10 ⁇ 3 to 1: 0.13.
  • the ratio (X ′: Y) of the volume of the carrier (Y: including voids) to the volume (X ′) of the treatment liquid containing the whole blood after the step (A) is, for example, 1: 1. 1 ⁇ 10 ⁇ 3 to 1: 0.35, preferably 1: 1.1 ⁇ 10 ⁇ 3 to 1: 0.16, more preferably 1: 1.1 ⁇ 10 ⁇ 3 to 1: 0. .07.
  • the carrier is, for example, beads
  • the shape of the beads is not particularly limited, and examples thereof include true spheres, substantially true spheres, and elliptic spheres.
  • the average diameter of the beads is, for example, 30 nm to 100 ⁇ m, preferably 30 nm to 20 ⁇ m, and more preferably 30 nm to 5 ⁇ m.
  • the total surface area (Z) of the plurality of beads is, for example, 5 to 2000 cm 2 , preferably 10 to 2000 cm 2 , more preferably 200 to 2000 cm 2 . is there.
  • the bead filling rate is, for example, 0.1 to 10%, preferably 0.1 to 5%, and more preferably 1 to 5%.
  • the treatment conditions for bringing the nucleic acid complex into the carrier by bringing the treatment liquid into contact with the carrier are not particularly limited, but the treatment temperature is, for example, 15 to 40 ° C., preferably 20 to The temperature is 35 ° C., particularly preferably room temperature (about 25 ° C.), and the treatment time is, for example, 1 second to 10 minutes, preferably 30 seconds to 5 minutes.
  • the method for bringing the treatment liquid into contact with the carrier is not particularly limited, and can be appropriately determined according to, for example, the shape of the carrier as described above.
  • the both can be brought into contact, for example, in a container such as an Eppendorf tube, a test tube, or a chip having a flow path.
  • the carrier and the treatment liquid may be put in contact with each other, or the treatment liquid is put in the container in which the carrier is immobilized in advance. The both may be brought into contact.
  • the carrier may be disposed in a flow path such as a chip, the treatment liquid may be flowed through the flow path, and the inside of the carrier may be brought into contact with each other.
  • the nucleic acid complex in the treatment liquid is held on the carrier, and other components can be removed.
  • “passing the carrier” means, for example, that the treatment liquid enters the carrier and moves inside the carrier.
  • the processing liquid is passed from the inside of the carrier to the outside of the carrier, for example, the amount of unnecessary components in the processing liquid remaining in the carrier can be reduced. Thereby, the content of unnecessary components in the finally obtained nucleic acid sample can be further reduced.
  • a plurality of the carriers for example, beads
  • the treatment liquid may be passed between the carrier and the carrier to contact each other. This also allows the nucleic acid complex to be retained on the carrier and remove other components as described above.
  • the treatment liquid can be passed through the inside of the carrier in the channel or between the carriers by, for example, decompression or pressurization.
  • the carrier and the treatment liquid are separated.
  • the separation method of the both is not particularly limited, and can be appropriately determined depending on, for example, the shape of the carrier and the arrangement state thereof.
  • both can be separated by taking out the carrier or the treatment liquid from the container.
  • the two can be separated by collecting the beads with a magnet or the like, for example.
  • both can be separated by removing (discharging) the processing liquid from the container.
  • the carrier when the carrier is disposed in the flow path as described above, by passing the treatment liquid inside the carrier or between the plurality of carriers, for example, from blood cells
  • the nucleic acid complex released into the treatment liquid can be captured by the carrier, and the treatment liquid and the carrier can be separated.
  • the dispersion medium is then added a dispersion medium to the carrier removal of the treatment solution.
  • the dispersion medium may be added before the heat treatment in the next step or after the heat treatment as described above.
  • the dispersion medium is not particularly limited, and examples thereof include water, various buffers, aqueous solvents such as buffered saline, organic solvents, or a mixture thereof.
  • the buffer include Tris-HCl, BES, MOPS, TES, HEPES, DLPSO, TAPSO, POPSO, HEPPSO, EPPS, Tricine, Bicine, and TAPS.
  • the concentration of the buffer solution is not particularly limited, but is, for example, 0.1 to 100 mmol / L, preferably 0.1 to 50 mmol / L, and particularly preferably 0.1 to 10 mmol / L. .
  • the pH of the dispersion medium is, for example, 7.8 to 9.5, and preferably 8.5 to 8.9.
  • the addition ratio of the dispersion medium is not particularly limited.
  • the ratio (volume ratio X: D) of the volume (D) of the dispersion medium to the volume (X) of the whole blood processed in the step (A) is, for example, 1: 0.5 to 1:10, preferably 1: 0.5 to 1: 5, and more preferably 1: 1 to 1: 3.
  • the cleaning liquid prior to the supply of the dispersion medium to the carrier, for example, the cleaning liquid may be supplied and removed. Thereby, unnecessary components remaining on the carrier can be further eliminated.
  • the cleaning liquid is not particularly limited, and for example, the same liquid as the dispersion medium can be used. In the case where heat treatment is performed prior to the supply of the dispersion medium, it is preferable to supply the cleaning liquid to the carrier and remove the cleaning liquid prior to the heat treatment.
  • Heat treatment step Heat treatment is performed on the carrier in the dispersion medium. As a result, the nucleic acid is released from the nucleic acid complex captured by the carrier, and the released nucleic acid is released (released) into the dispersion medium.
  • the temperature of the heat treatment is not particularly limited, but is, for example, 50 to 130 ° C., preferably 80 to 130 ° C., and more preferably 90 to 100 ° C.
  • the heat treatment may be performed at a constant temperature, or the temperature may be increased continuously or stepwise.
  • the treatment time is not particularly limited, but is, for example, 1 to 30 minutes, preferably 1 to 5 minutes.
  • the nucleic acid is released from the nucleic acid complex by the heat treatment, and then the dispersion medium is added to remove the released nucleic acid in the dispersion medium. It can be released inside.
  • the dispersion medium after the heat treatment is recovered.
  • the nucleic acid is released into the dispersion medium, the dispersion medium can be recovered as a nucleic acid sample containing nucleic acid derived from whole blood.
  • the use of the nucleic acid sample obtained by the present invention is not particularly limited, for example, it is preferably used for nucleic acid amplification described later. In addition, it can process similarly about cell samples other than whole blood, and can collect a nucleic acid sample.
  • the whole blood to be processed is 50 ⁇ L
  • the processing reagent to be used is 50 ⁇ L
  • the dispersion medium is 100 ⁇ L, for example, 100 to 10000 copy / ⁇ L.
  • Nucleic acid samples can be recovered. This amount of nucleic acid can be a sufficient template in a nucleic acid amplification method such as PCR.
  • PCR nucleic acid amplification method
  • not only genomic DNA and RNA but also mitochondrial DNA that has been difficult to recover can be recovered.
  • the following second production method is preferred.
  • a treatment reagent containing no protease and containing a protease is mixed with the cell sample after freeze-thawing or refrigerated storage ( A2)
  • A2 It is a manufacturing method of a process.
  • the processing reagent used in the second production method of the present invention is also referred to as “second processing reagent”, for example.
  • the second manufacturing method may be performed, for example, by performing the step (A2) instead of the step (A1), and the other steps may be performed in the same manner as the first manufacturing method. .
  • Examples of the cell sample in the present invention include the above-described cell samples containing eukaryotic cells.
  • a reagent containing no protease and containing a protease can be used as the second treatment reagent. Since the cell sample after freezing and thawing or refrigerated storage has a part or most of the cell membrane of eukaryotic cells destroyed, for example, the destruction of the cell membrane by the surfactant can be omitted, and the surfactant does not contain the surfactant. It is presumed that a nucleic acid complex can be efficiently released even with a treatment reagent. For this reason, the cost of the processing reagent can be further reduced. Note that this assumption does not limit the present invention.
  • the conditions for freezing and thawing the cell sample are not limited at all, and the cell sample may be frozen and then thawed.
  • the freezing temperature is, for example, ⁇ 15 to ⁇ 200 ° C.
  • the melting temperature is, for example, 4 to 50 ° C.
  • the conditions for refrigerated storage of the cell sample are not limited at all.
  • the refrigeration temperature is, for example, 0 to 8 ° C.
  • the storage time is, for example, 4 days to 1 year, and 1 week to 1 May be months.
  • the second treatment reagent may be added to the cell sample, for example, before refrigerated storage or before cryopreservation, or may be added to the cell sample after refrigerated storage or after freeze-thawing.
  • the composition of the second processing reagent is the same as that of the first processing reagent in the first manufacturing method, except that no surfactant is added. Further, in the treatment liquid in which the second treatment reagent and the cell sample are mixed, the ratio of the protease to the eukaryotic cell and the cell sample is the same as in the first production method.
  • the following third production method is preferable.
  • the treatment reagent containing no surfactant and protease is mixed with the cell sample after freeze-thawing (A3).
  • the processing reagent used in the third production method of the present invention is also referred to as “third processing reagent”, for example.
  • the third manufacturing method may be performed by, for example, performing the step (A3) instead of the step (A1) or (A2), and otherwise the first or second manufacturing method. It can be performed in the same way as the method.
  • the third production method for example, the cell sample after freeze-thawing is brought into contact with the carrier in the step (B) without being mixed with the third processing reagent in the step (A). You may let them.
  • Examples of the cell sample in the present invention include the above-described cell samples containing eukaryotic cells.
  • a reagent having no surfactant and no protease can be used as the third treatment reagent.
  • the cell sample after freeze-thawing the cell membrane of eukaryotic cells and part or most of the nuclear membrane are destroyed, and at the same time, in some cells, the protein that has packaged the nucleic acid in the nucleus is denatured, Loss of function is thought to release the nucleic acid complex. For this reason, for example, even if it is a processing reagent which does not contain a surfactant and a protease, the nucleic acid complex can be efficiently released. For this reason, the cost of the processing reagent can be further reduced.
  • the conditions for freezing and thawing the cell sample are not limited at all, and the cell sample may be frozen and then thawed.
  • the freezing temperature is, for example, ⁇ 15 to ⁇ 200 ° C.
  • the melting temperature is, for example, 4 to 50 ° C.
  • the third treatment reagent may be added to the cell sample, for example, before cryopreservation, or may be added to the cell sample after freeze-thawing.
  • composition of the third treatment reagent is the same as that of the first treatment reagent in the first production method except that, for example, no surfactant and protease are added, and examples thereof include the above-mentioned various solvents. It is done.
  • the fourth production method of the present invention is, for example, a production method of the step (A) in which a cell sample containing the prokaryotic cells is freeze-thawed or refrigerated.
  • the fourth manufacturing method may be performed by, for example, performing the step (A4) instead of the step (A1), (A2) or (A3). It can be performed in the same manner as the third manufacturing method.
  • the cell sample in the present invention includes a cell sample containing the above-mentioned prokaryotic cells.
  • the nucleic acid complex can be released only by refrigeration or freezing and thawing of a cell sample.
  • the cell sample is frozen, thawed, or refrigerated to obtain a treatment solution in which the nucleic acid complex is released from the cells. It is done.
  • the treatment liquid after the step (A) is preferably mixed with a treatment reagent, for example, before the step (B) to be brought into contact with the carrier.
  • the treatment reagent include a reagent that does not include any of the protease and the surfactant, or a reagent that includes any one of the protease and the surfactant and that does not contain the other.
  • the processing reagent used in the fourth production method of the present invention is also referred to as “fourth processing reagent”, for example.
  • the addition ratio thereof is the same as that of the first treatment reagent in the first production method, for example. Moreover, the addition ratio with respect to a cell sample is the same as that of the said 1st manufacturing method.
  • the fourth processing reagent does not contain a protease and a surfactant, the fourth processing reagent is the same as the first processing reagent in the first manufacturing method, for example, except that they are not added. For example, the above-mentioned various solvents and the like can be mentioned.
  • the cell wall of the prokaryotic cell is broken or easily broken. Since prokaryotic cells do not have cell nuclei, the cell walls are broken or easily broken as described above. As a result, for example, a nucleic acid complex can be efficiently released even with a fourth treatment reagent that does not contain a surfactant and a protease, or any one of them. For this reason, the cost of the processing reagent can be further reduced.
  • the fourth treatment reagent may be added to the cell sample, for example, before refrigerated storage or before cryopreservation, or may be added to the cell sample after refrigerated storage or after freeze-thawing.
  • the nucleic acid sample obtained by the method for producing a nucleic acid sample of the present invention can be used, for example, as a template sample for various nucleic acid amplification methods.
  • the present invention is a method for producing a nucleic acid amplification product of a target sequence by a nucleic acid amplification method, and includes the following steps (a) and (b).
  • the present invention can also be referred to as a method for amplifying a target sequence.
  • a step of recovering a nucleic acid sample from a cell sample containing cells by the method for producing a nucleic acid sample of the present invention (b) A nucleic acid amplification method using the nucleic acid in the nucleic acid sample recovered in the step (a) as a template And a step of producing a nucleic acid amplification product of the target sequence in the template
  • the method for producing a nucleic acid amplification product of the present invention is characterized in that the nucleic acid is collected by the method for producing a nucleic acid sample of the present invention, and other processes and conditions are not limited at all. Further, as described above, according to the method for producing a nucleic acid sample of the present invention, a sufficient amount of nucleic acid that can be used as a template can be obtained. For example, the nucleic acid in the step (a) is used as it is in the above (b ) Can be used in the process.
  • the type of nucleic acid amplification method in the step (b) is not limited at all, and conventionally known amplification methods can be mentioned. Specific examples include the PCR (Polymerase Chain Reaction) method, the NASBA (Nucleic acid sequence based amplification) method, the TM (Transplication-Mediated Amplification Method), and the SDA (Strandative Amplification Method). Examples include the Isometric Amplification (Isomatic Amplification) method and the ICAN (Isothermal and Chimeric Primer-Initiated Amplification of Nucleic Acids) method. Moreover, the process of various nucleic acid amplification methods, reaction conditions, etc. are not restrict
  • the reagent used in the nucleic acid amplification method is not particularly limited, and a conventionally known reagent can be used. Examples thereof include polymerases, nucleoside triphosphates (dNTPs), buffers, solvents such as water and buffer solutions, and the like. . In addition to this, for example, glycerol, heparin, betaine, KCl, MgCl 2 , MgSO 4 and the like may be included.
  • the first nucleic acid recovery reagent of the present invention is a reagent for use in the production method of the first nucleic acid sample of the present invention, and includes the protease and the surfactant.
  • the first nucleic acid recovery reagent of the present invention is the same as, for example, the first treatment reagent in the first nucleic acid sample production method of the present invention.
  • the ratio of the protease to 1 ⁇ 10 2 to 1 ⁇ 10 9 cells is, for example, 0.02 mU or more.
  • the ratio of the surfactant to 1 ⁇ 10 2 to 1 ⁇ 10 9 cells is 1 femtomole or more.
  • the first nucleic acid recovery reagent of the present invention only needs to contain the protease and a surfactant so as to be in the above-mentioned range when mixed with the cell sample, for example.
  • the second nucleic acid recovery reagent of the present invention is a reagent for use in the method for producing the second nucleic acid sample of the present invention, and is not particularly limited as long as it contains at least a protease. When mixed, the protease is preferably included so as to be in the same range as the first treatment reagent.
  • the second nucleic acid recovery reagent of the present invention is the same as, for example, the second treatment reagent in the second nucleic acid sample production method of the present invention.
  • the third nucleic acid recovery reagent of the present invention is a reagent for use in the third nucleic acid sample production method of the present invention.
  • the third nucleic acid recovery reagent of the present invention may contain any one of the protease and the surfactant. It may be a solvent that does not contain any of them.
  • the third nucleic acid recovery reagent of the present invention is the same as, for example, the third treatment reagent in the third nucleic acid sample production method of the present invention.
  • the fourth nucleic acid recovery reagent of the present invention is a reagent for use in the fourth method for producing a nucleic acid sample of the present invention, and may be, for example, a solvent containing neither the protease nor the surfactant.
  • the solvent may contain any one of the protease and the surfactant and the other may not be added.
  • the fourth nucleic acid recovery reagent of the present invention is, for example, the same as the fourth treatment reagent in the fourth method for producing a nucleic acid sample of the present invention.
  • Each nucleic acid recovery reagent of the present invention may be liquid or solid, for example.
  • the stock solution may be used as it is as the aforementioned processing reagent, or a diluted solution diluted before use may be used as the aforementioned processing reagent.
  • a solid for example, before mixing with the cell sample, it can be dissolved or dispersed in the solvent of the aforementioned treatment reagent and used as the aforementioned treatment reagent.
  • Each nucleic acid recovery reagent of the present invention may further contain other components, for example.
  • each nucleic acid recovery reagent of the present invention when used to recover nucleic acids from cells and to amplify the nucleic acid of the target sequence, each nucleic acid recovery reagent of the present invention further includes components necessary for nucleic acid amplification. For example, polymerases, nucleoside triphosphates (dNTPs), buffers, solvents such as water and buffer solutions, and the like can be mentioned.
  • dNTPs nucleoside triphosphates
  • Each nucleic acid recovery reagent of the present invention can be said to be a production reagent for use in, for example, the method for producing a nucleic acid amplification product of the present invention.
  • the first nucleic acid recovery kit of the present invention is a kit for use in the method for producing the first nucleic acid sample of the present invention, and includes the carrier, the protease, and the surfactant. And In the present invention, the carrier, the protease, and the surfactant are as described above.
  • the first nucleic acid recovery kit of the present invention may include, as the carrier, for example, the nucleic acid recovery chip or nucleic acid amplification chip of the present invention having the carrier described later.
  • the protease and the surfactant may be stored in separate containers, for example, or both may be stored in the same container.
  • the first nucleic acid recovery kit of the present invention preferably includes, for example, the carrier and the first nucleic acid recovery reagent of the present invention.
  • the first nucleic acid recovery reagent of the present invention is as described above, and may contain the protease and the surfactant, and may be liquid or solid.
  • the ratio between the protease and the surfactant is not particularly limited, and may be used, for example, so that the ratio is as described above at the time of use.
  • the second nucleic acid recovery kit of the present invention is a kit for use in the method for producing the second nucleic acid sample of the present invention, and is not particularly limited, and includes the carrier and the protease.
  • a carrier and the second nucleic acid recovery reagent of the present invention may be included.
  • the third nucleic acid recovery kit of the present invention is a kit for use in the method for producing the third nucleic acid sample of the present invention.
  • any one of the carrier, the protease, and the surfactant is used.
  • a solvent that contains neither the protease nor the surfactant for example, the carrier and the third nucleic acid recovery reagent of the present invention may be included. May be included.
  • the fourth nucleic acid recovery kit of the present invention is a kit for use in the fourth method for producing a nucleic acid sample of the present invention, and does not contain, for example, the carrier, the protease, or the surfactant. May include a solvent, and may include the carrier and a solvent that includes any one of the protease and the surfactant and the other is not added. And a fourth nucleic acid recovery reagent.
  • each nucleic acid recovery kit of the present invention may further include instructions for use, for example.
  • each nucleic acid recovery kit of the present invention may further include other components, for example.
  • the nucleic acid recovery kit of the present invention may further contain components necessary for nucleic acid amplification as appropriate.
  • a polymerase, a nucleoside triphosphate (dNTP), a buffering agent, a solvent such as water or a buffer, and the like can be mentioned.
  • the nucleic acid collection kit of the present invention can be said to be a production kit for use in the method for producing a nucleic acid amplification product of the present invention, for example.
  • the nucleic acid recovery chip of the present invention is a chip for use in the method for producing a nucleic acid sample of the present invention, and includes a chip body and the carrier, the chip body including a liquid channel, The carrier is arranged in the path.
  • the method for producing a nucleic acid sample of the present invention can be carried out.
  • the carrier may be disposed in a flow path through which the liquid such as the cell sample and the processing reagent passes, and other configurations and shapes are not limited at all.
  • recovery of this invention is illustrated below, this invention is not restrict
  • the first nucleic acid recovery chip includes, for example, the chip main body and the carrier, the chip main body has a liquid flow path, and one end of the flow path for introducing and discharging liquid. 1 is provided, the other end of the channel is provided with a second opening that can be connected to the pressure control means, and the carrier is disposed in the channel.
  • the carrier may be, for example, a sheet-like carrier serving as a filter or a plurality of bead-like carriers.
  • the pressure control means is connected to the second opening, and the flow path is controlled to a reduced pressure condition by the pressure control means, whereby the liquid is By introducing into the flow path from the first opening and controlling the flow path to the pressurizing condition by the pressure control means, the introduced liquid is discharged from the first opening to the outside of the flow path. it can. For this reason, first, if the treatment liquid containing the cell sample is introduced into the flow path under a reduced pressure condition, the treatment liquid passes through the arranged carrier. For this reason, for example, the nucleic acid complex released from the cells in the cell sample by the treatment reagent is captured by the carrier during passage.
  • the method for introducing the cell sample and the treatment reagent is not particularly limited.
  • a treatment liquid in which the cell sample and the treatment reagent are mixed in advance may be prepared and introduced.
  • the operation (pipetting) in which the liquid is introduced and discharged to the other may be repeated, and finally the treatment liquid may be introduced.
  • the nucleic acid recovery chip having such a configuration examples include a pipette chip that is used by being attached to a suction device.
  • a suction device such as a manual or automatic pipetter corresponds to the pressure control means.
  • the first nucleic acid recovery chip will be described with reference to FIG. 1, taking a pipette chip as an example.
  • FIG. 1 is a cross-sectional view of a pipette tip for nucleic acid recovery (hereinafter referred to as “pipette tip”).
  • the pipette tip 1 includes a hollow conical body 13, a first opening 11 that is a liquid outlet, and a second opening 12 that can be attached to a pipetter.
  • the carrier 10 is disposed on the first opening 11 side.
  • the void inside the conical body 13 serves as a liquid flow path and a container for the introduced liquid.
  • the size and shape of the pipette tip are not particularly limited, and can be appropriately set according to, for example, the amount of the treatment liquid containing the cell sample to be introduced.
  • the nucleic acid recovery chip of the present invention is characterized by including the carrier as described above, and can be manufactured, for example, by simply placing the carrier on a commercially available pipette chip.
  • the attachment method etc. to suction devices, such as a pipette can also be performed similarly to the past.
  • FIG. 2 is a cross-sectional view schematically showing the steps of a method for producing a nucleic acid sample using a pipette tip.
  • FIG. 2 the same parts as those in FIG.
  • the pipette tip 1 is attached to the pipetter (not shown) from the second opening 12. Then, as shown in FIG. 2A, the processing liquid 20 is sucked from the first opening 11 by the operation of the pipetter. At that time, it is preferable that all of the sucked processing liquid 20 passes through the carrier 10 in the pipette tip 1. Thereby, the nucleic acid complex released into the treatment liquid 20 is captured by the carrier 10. Next, as shown in FIG. 2B, the sucked processing liquid 20 is discharged from the first opening 11 to the outside by the operation of the pipettor.
  • the treatment liquid 20 ′ discharged here is a liquid containing a component unnecessary for nucleic acid recovery, such as red blood cells, from which the nucleic acid complex has been removed by the carrier 10.
  • the dispersion medium 30 is sucked from the first opening 11 by the operation of the pipetter.
  • the carrier 10 in the pipette tip 1 is filled with the sucked dispersion medium 30.
  • the heat treatment as described above is performed.
  • the dispersion medium 40 after the heat treatment is discharged to the outside from the first opening 11 by the operation of the pipetter.
  • the discharged dispersion medium 40 contains the nucleic acid released from the nucleic acid complex captured by the carrier 10 as described above. If this dispersion medium 40 is recovered as a nucleic acid sample, it can be used as a template sample for nucleic acid amplification, for example. In this nucleic acid sample, since unnecessary components for nucleic acid recovery are discharged in the step shown in FIG. 2B, the content of the unnecessary components is also reduced.
  • the second nucleic acid recovery chip includes, for example, the chip body and the carrier, the chip body has a liquid flow path, and one end of the flow path is connectable to a pressurizing unit; A first opening for introducing a liquid; the other end of the flow path includes a second opening for discharging the liquid; and the nucleic acid recovery carrier of the present invention is disposed in the flow path. ing.
  • the second nucleic acid recovery chip is configured to connect a pressurizing unit to the first opening and pressurize the liquid by the pressurizing unit so that the liquid is discharged from the first opening.
  • the liquid can be introduced into the flow path, pressurized by the pressurizing means, and the introduced liquid can be discharged out of the flow path from the second opening. For this reason, if the treatment liquid is first introduced into the flow path under a pressurized condition, the treatment liquid passes through the arranged carrier, so that the nucleic acid complex in the treatment liquid is captured by the carrier. Is done. Subsequently, unnecessary components derived from the cell sample can be removed by discharging the treatment liquid introduced under pressurized conditions to the outside of the flow path.
  • the nucleic acid recovery chip and the pressurizing means may be direct or indirect (the same applies hereinafter).
  • FIG. 2 is a schematic diagram showing an outline of a biochip for nucleic acid recovery (hereinafter referred to as “biochip”), where (A) is a side view, (B) is a top view, and (D) is the above (B). It is AA direction sectional drawing.
  • FIG. 3C is a top view of the support substrate 22 constituting the biochip. As shown in the figure, the biochip 2 includes a support substrate 22 and a cover substrate 21.
  • a flow path 23, a flow path 27 branched from the flow path 23, a drainage part 24 connected to the flow path 27, and a nucleic acid-containing liquid (nucleic acid sample) connected to the flow path 23 are contained.
  • the part 25 is formed as a concave groove.
  • the cover substrate 21 is covered on the surface of the support substrate 22 on which the concave grooves are formed. As a result, the end of the flow path 23 (the left end in the figure) becomes the liquid inlet 26.
  • the carrier 10 is disposed inside the flow path 23 and closer to the introduction port 26 than the connection portion between the drainage portion 24 and the storage portion 25.
  • the channel 23 is connected to both the nucleic acid sample storage unit 25 and the drainage unit 24 via the channel 27, but the introduction of the liquid into the drainage unit 24 and the liquid to the storage unit 25 are performed.
  • the introduction can be switched as appropriate.
  • the size and shape of the biochip are not particularly limited.
  • nucleic acid recovery method using the biochip 2 an example using a pressurized liquid feeding apparatus such as a syringe pressurization will be described with reference to FIG.
  • the present invention is not limited to this.
  • the processing liquid is fed from the inlet 26 by a pressurized liquid feeding device (not shown).
  • a pressurized liquid feeding device not shown
  • the fed processing liquid passes through the carrier 10 disposed in the flow path 23 and is stored in the drainage part 24 via the flow path 27.
  • the nucleic acid complex released in the treatment liquid is captured by the carrier 10.
  • the treatment liquid accommodated in the drainage part 24 is a liquid that contains components that are unnecessary for nucleic acid recovery, such as red blood cells, from which the nucleic acid complex has been removed by the carrier 10.
  • the dispersion medium is fed from the inlet 26 by a pressurized liquid feeding device.
  • the carrier 10 in the flow path 23 is preferably filled with the dispersion medium.
  • the heat treatment as described above is performed.
  • the dispersion medium after the heat treatment is moved to the nucleic acid-containing liquid storage unit 25 by the pressurized liquid feeding device.
  • the dispersion medium accommodated in the accommodating portion 25 contains the nucleic acid released from the captured nucleic acid complex.
  • the dispersion medium containing this nucleic acid can be used as a nucleic acid sample, for example, as a template sample for nucleic acid amplification.
  • the nucleic acid sample is free of components unnecessary for nucleic acid recovery, the content of the unnecessary components is also reduced.
  • the above-described method is an example in which liquid is introduced and discharged by pressurization, but the present invention is not limited to this. That is, for example, (1) introduction and discharge of liquid by decompression, (2) introduction of liquid by pressurization and discharge of liquid by decompression, or (3) introduction of liquid by decompression and discharge of liquid by pressurization
  • the chip body includes a first opening for introducing a liquid at one end of the flow path, and the other end of the flow path.
  • a second opening that can be connected to the decompression unit and discharge the liquid.
  • nucleic acid recovery chip for example, when in use, a decompression unit is connected to the second opening, the inside of the flow path is decompressed by the decompression unit, and the liquid is discharged from the first opening. It is preferable to introduce the liquid into the flow path and discharge the introduced liquid from the second opening to the outside of the flow path.
  • the connection between the nucleic acid recovery chip and the decompression means may be direct or indirect (hereinafter the same).
  • the nucleic acid recovery chip used in the method (2) for example, the chip body can be connected to a pressurizing means at one end of the flow path, and a liquid for introducing a liquid.
  • a first opening is provided, and the other end of the flow path is connected to a decompression unit and includes a second opening for discharging the liquid.
  • a pressurizing unit is connected to the first opening, and a liquid is pressurized by the pressurizing unit, so that the liquid flows from the first opening.
  • Introducing into the passage, connecting a pressure reducing means to the second opening, reducing the pressure inside the flow path by the pressure reducing means, and discharging the introduced liquid to the outside of the flow path from the second opening It is preferable to do.
  • the chip body can be connected to a pressurizing means at one end of the flow path, and a liquid for introducing a liquid. 1 at the other end of the flow path, and a second opening for discharging the liquid is provided at the other end of the flow path.
  • a pressure reducing means is connected, the pressure inside the flow path is reduced by the pressure reducing means, the liquid is introduced into the flow path from the first opening, and a pressure means is connected to the first opening.
  • the flow path is pressurized by the pressurizing means, and the introduced liquid is discharged from the second opening to the outside of the flow path.
  • the carrier for example, a plurality of beads or the like can be used.
  • a form in which the bead-shaped carrier is filled in the flow path can be mentioned.
  • the processing liquid is passed between the bead-shaped carriers by sending the processing liquid to the flow path, and at that time, in the processing liquid on the surface of each bead-shaped carrier Of the nucleic acid complex is captured.
  • the bead-shaped carrier is a porous body, for example, the nucleic acid complex can be captured not only on the outer surface but also on the exposed surface of the void, for example.
  • the biochip for nucleic acid recovery of the present invention may further include, for example, a reaction unit and a detection unit that perform various reactions using nucleic acids, a reagent unit that contains reagents necessary for the reaction, and the like.
  • the storage part may be connected to the reaction part via a flow path, and the reaction part is connected to the reagent via the flow path. It may be connected with a part, a detection part, etc.
  • a reagent necessary for a target reaction may be arranged in advance in the storage unit, or the storage unit may be connected to the reagent unit via a flow path.
  • the accommodating portion serves as the reaction portion.
  • the reaction unit and the detection unit By connecting the reaction unit and the detection unit in this manner, for example, in one biochip, not only the nucleic acid is recovered from the cell sample but also the target reaction is performed using the recovered nucleic acid. It is also possible to measure the reaction result. For this reason, by using the present invention for various analyzes using nucleic acids, for example, nucleic acid amplification and SNP detection, it is possible to perform simpler analysis than before. Moreover, the nucleic acid recovery chip of the present invention only needs to arrange the carrier in the flow path, and thus, for example, a biochip can be miniaturized. As a further form of such a biochip, a nucleic acid amplification chip is given as an example below.
  • the nucleic acid amplification chip of the present invention is a chip for use in the method for producing a nucleic acid amplification product of the present invention, A chip body and a carrier;
  • the chip body has an opening for introducing a liquid, a drainage part for storing a drainage liquid, a reaction part for performing a nucleic acid amplification reaction, and a liquid channel, One end of the flow path is the opening, The flow path is connected to the drainage section and the reaction section; It is characterized in that the carrier is arranged in the flow path, and closer to the opening than the connection part between the drainage part and the reaction part.
  • the nucleic acid amplification chip of the present invention is not limited as long as the carrier is provided in a flow path through which the treatment liquid, the cell sample, the treatment reagent and the like pass.
  • the nucleic acid amplification chip of the present invention further includes, for example, a second channel and a third channel in addition to the channel (first channel), and the reaction unit includes the second channel. May be directly or indirectly connected to the first flow path, and the drainage portion may be directly or indirectly connected to the first flow path by the third flow path.
  • the nucleic acid amplification chip of the present invention can be switched between, for example, introduction of liquid into the drainage part and introduction of liquid into the reaction part. More specifically, for example, the introduction of the liquid into the drainage section can be switched between the introduction of the liquid into the second passage and the introduction of the liquid into the third passage. More preferably, the introduction of the liquid into the reaction section can be switched.
  • the treatment necessary for the release and amplification reaction of the nucleic acid from the nucleic acid complex captured by the carrier is a heat treatment. Therefore, according to the nucleic acid amplification chip of the present invention, for example, nucleic acid recovery and amplification reaction can be carried out only by performing temperature control by setting in a device equipped with temperature control means.
  • nucleic acid amplification chip is a so-called biochip formed from a support substrate having a concave channel formed on the surface and a cover substrate covering the surface.
  • the nucleic acid amplification chip of the present invention will be described with reference to FIG. 4 taking a biochip as an example.
  • the biochip shown in FIG. 4 has the same form as the biochip shown in FIG. 3 unless otherwise indicated, and can be used in the same manner.
  • FIG. 4 is a schematic diagram showing an outline of a biochip for nucleic acid amplification (hereinafter referred to as “biochip”), where (A) is a side view, (B) is a top view, and (D) is the above-mentioned (B). It is AA direction sectional drawing.
  • FIG. 3C is a top view of the support substrate 22 constituting the biochip. In the figure, the same parts as those in FIG. As shown in the figure, the biochip 3 includes a support substrate 22 and a cover substrate 21.
  • the nucleic acid-containing liquid (nucleic acid sample) container 25 connected to the channel 23, the second channel 33 connected to the container 25, and the reaction unit 31 connected to the second channel 33 are concave. It is formed as a groove.
  • the cover substrate 21 is covered on the surface of the support substrate 22 on which the concave grooves are formed. As a result, the end of the flow path 23 (the left end in the figure) becomes the liquid inlet 26.
  • the carrier 10 is disposed inside the flow path 23 and closer to the introduction port 26 than the connection part between the drainage part 24 and the storage part 25 (the connection part with the third flow path 27).
  • the flow path 23 is connected to both the drainage section 24 via the nucleic acid-containing liquid storage section 25 and the third flow path 27, but the introduction of the liquid into the drainage section 24 and the storage section.
  • the introduction of liquid into 25 can be switched as appropriate.
  • the nucleic acid-containing solution stored in the storage unit 25 is further moved to the reaction unit 31 via the second flow path 33, for example.
  • the reagent required for an amplification reaction is arrange
  • an amplification reaction can be started as it is.
  • a reagent part separately containing reagents
  • the amplification reaction can be started after the reagent in the reagent part is sent to the reaction part 31.
  • the detection of the amplification reaction may be performed, for example, as it is in the reaction unit 31.
  • a detection unit (not shown) is provided, for example, the reaction solution is sent from the reaction unit 31 to the detection unit, You may detect in a detection part.
  • FIG. 5 is a schematic view of a jig device on which a carrier is set.
  • (A) is a top view of the jig apparatus on which the carrier is set
  • (B) is a sectional view taken along the II direction of (A)
  • (C) shows the liquid passing direction with respect to the carrier. It is a schematic diagram.
  • the jig device 4 has a flow path 23 and a carrier 10, and the carrier 10 is disposed near the center in the axial direction of the flow path 23.
  • the carrier 10 is disposed in the concave portion of the aluminum concave member 6 a, and further, by inserting the convex portion of the aluminum convex member 6 b into the concave portion, the concave member It is being fixed in the aluminum block which consists of 6a and the convex-shaped member 6b.
  • the aluminum block is fixed with a plastic member so that the bottom surface (the lower surface in FIG. 5B) is exposed.
  • This jig device 4 was placed on a heat block such that the exposed bottom surface was in contact.
  • the arrow indicates the traveling direction of the liquid. As shown by the arrow in FIG. 5C, in this embodiment, the liquid is introduced from the circular surface of the carrier 10 and discharged from the other surface.
  • genomic DNA could be easily recovered without using a special drug.
  • the genomic DNA concentration in the collected nucleic acid sample was 500 copy / ⁇ L or more, which was confirmed to be a necessary amount in PCR and the like.
  • Example 2 Various carriers (2a to 2j) shown in Table 3 below were prepared. Carriers 2b (woven fabric), 2c (woven fabric), and 2j (nonwoven fabric) were cut into a circular shape having a diameter of 2 mm and laminated so as to have a thickness of 1.5 mm to obtain a cylindrical carrier. The remaining carrier was cut into a cylindrical shape having a diameter of 2 mm and a height of 1.5 mm. The laminates 2b, 2c and 2j and other single layer bodies were respectively set as cylindrical carriers in a jig apparatus as shown in FIG. FIG. 6 is a schematic view of a jig device on which the carrier is set.
  • (A) is a perspective view showing a jig device main body and a carrier
  • (B) is a perspective view of a jig device in which a carrier is set on the main body
  • (C) is a top view of (B)
  • (D) is a cross-sectional view in the II-II direction of (C).
  • the jig device 5 includes a main body 7 having a flow path 23 having a diameter of 1 mm and a carrier arrangement portion 8 and a carrier 10, and the carrier arrangement portion 8 is provided near the center in the axial direction of the flow path 23.
  • a carrier 10 is arranged in the part 8. Further, although not shown, the exposed surface of the carrier 10 (the upper surface in FIG. 4D) is covered with an adhesive sheet.
  • various liquids are introduced from the side surface of the cylindrical carrier and discharged from the side surface.
  • the concentration of genomic DNA was measured in the same manner as in Example 1, and the recovery rate of genomic DNA by each carrier was calculated. These results are shown in Table 3 above.
  • the concentration of mitochondrial DNA was measured by the Real Time PCR method. As a result, it was about 10 5 copy / ⁇ L.
  • genomic DNA could be easily recovered without using a special drug.
  • concentration of genomic DNA in the collected nucleic acid sample was also 3000 copy / ⁇ L or more, confirming that it was a necessary amount in PCR and the like. A sufficient amount of mitochondrial DNA could be recovered.
  • Example 3 First, 50 ⁇ L of whole blood and 50 ⁇ L of the processing reagent 1-1 of Example 1 were mixed to prepare 100 ⁇ L of processing solution.
  • various carriers (Examples 3a to 3g) shown in Table 4 below were cut into a circle having a diameter of 2 mm. Each carrier thus cut out and 100 ⁇ L of the processing solution were placed in a 1.5 mL capacity tube, mixed by vortexing, and then the processing solution was removed. In the tube, 100 ⁇ L of the cleaning solution of Example 1 was added, mixed by vortexing, and then the cleaning solution was discarded.
  • carrier was taken out from the said tube, it put into the new tube with 100 microliters of dispersion media of the said Example 1, and it heated at 96 degreeC for 5 minute (s).
  • the dispersion medium after heating was recovered and used as a nucleic acid sample.
  • the concentration of genomic DNA was measured in the same manner as in Example 1, and the recovery rate of genomic DNA by each carrier was calculated. These results are shown in Table 4 above.
  • genomic DNA could be easily recovered without using a special drug.
  • concentration of genomic DNA in the collected nucleic acid sample was 1500 copy / ⁇ L or more, which was confirmed to be a necessary amount in PCR and the like.
  • Example 4 In a 1.5 mL tube, 50 ⁇ L of whole blood and 50 ⁇ L of the processing reagent 1-1 of Example 1 were mixed to prepare 100 ⁇ L of processing solution. Further, 1 mg of various magnetic beads (Examples 4a and 4b) shown in Table 5 below were added as a carrier to the tube and mixed by vortexing. The magnetic beads are collected with a magnet to remove the treatment liquid in the tube, and the collected magnetic beads and 100 ⁇ L of the cleaning liquid of Example 1 are put into the tube, mixed by vortex, The magnetic beads were collected and the washing solution was removed. The collected magnetic beads and 100 ⁇ L of the dispersion medium of Example 1 were placed in the tube, mixed by vortexing, and heated at 96 ° C. for 5 minutes. After heating, the tube was subjected to centrifugation to remove the magnetic beads, and the dispersion medium was recovered. This was used as a nucleic acid sample.
  • various magnetic beads shown in Table 5 below were added as a carrier to the tube and mixed by vortexing.
  • the concentration of genomic DNA was measured in the same manner as in Example 1, and the recovery rate of genomic DNA by each carrier was calculated. These results are shown in Table 5 above.
  • DNA could be easily recovered without using a special drug.
  • the DNA concentration in the collected nucleic acid sample was also 400 copy / ⁇ L or more, and it was confirmed that it was a necessary amount in PCR and the like.
  • Example 5 The trade name MF-80A (manufactured by Inoac Corporation) was used as a carrier for recovering RNA from whole blood .
  • This carrier was cut into a circle having a diameter of 2 mm and set in a jig apparatus in the same manner as in Example 1.
  • three types of whole blood fresh blood
  • 50 ⁇ L of each whole blood was mixed with 50 ⁇ L of treatment reagent 5-1 shown in Table 7 below to prepare 100 ⁇ L of a processing solution.
  • the amount of protease added is 1.35 U and the proportion of surfactant added is 0.25% by volume with respect to 50 ⁇ L of whole blood.
  • nucleic acid sample was prepared like the said Example 1 except having used the washing
  • the collected nucleic acid samples were subjected to RNA quantification using One Step SYBR Prime Script RT-PCR Kit II (TAKARA) and the following primer set for ⁇ -actin.
  • RNA was also quantified in the same manner for a nucleic acid sample purified from the same whole blood using QIAamp RNA Blood Mini (manufactured by QIAGEN). Then, the relative value (%) of the amount of recovered RNA in this example was calculated when the amount of recovered RNA in the control was 100%.
  • Example 6 Recovery of genomic DNA from saliva First, 100 ⁇ L of saliva (the number of human nucleic acid-containing cells: about 150,000) and 100 ⁇ L of each processing reagent shown in Table 8 below were mixed to prepare 200 ⁇ L of a processing solution.
  • the amount of protease added is 1 U with respect to 50 ⁇ L of saliva, and the addition ratio of the surfactant is 0.5% by volume, 1% by volume, and 2% by volume.
  • a PET mesh woven fabric manufactured by Sanfratec Co., Ltd., mesh size 60 ⁇ m
  • mesh size 60 ⁇ m having a pore diameter of 60 ⁇ m was used as the carrier.
  • This carrier was cut into a circle having a diameter of 3.5 mm and mounted inside the pipette tip (capacity 200 ⁇ L) shown in FIG. 1 (effective diameter 2.2 mm).
  • the effective diameter means a diameter that can actually be passed through the carrier mounted inside the pipette tip.
  • the pipette tip was attached to a pipetter, and 200 ⁇ L of the treatment liquid was sucked and discharged, and then 200 ⁇ L of the cleaning liquid of Example 1 was sucked and discharged. Again, 200 ⁇ L of the new cleaning solution was sucked and discharged, and then the carrier was taken out of the pipette tip.
  • the carrier was immersed in 100 ⁇ L of the dispersion medium of Example 1 and heated at 95 ° C. for 5 minutes to obtain a nucleic acid sample. For these nucleic acid samples, the concentration of genomic DNA was measured in the same manner as in Example 1. These results are shown in Table 8 below.
  • Example 7 Recovery of genomic DNA from oral mucosal cells First, rub the inside of the cheek 10 times on each side with a cotton swab (1P1501V, manufactured by Japan cotton swab) in a circular pattern, and mix with 200 ⁇ L of each treatment reagent in Table 9 below. 200 ⁇ L (number of human nucleic acid-containing cells: about 250,000) was prepared. In the treatment solution, the amount of protease added is 1 U and the amount of surfactant added is 0.5% by volume, 1% by volume, and 2% by volume with respect to 50 ⁇ L of the oral mucosal cell suspension. On the other hand, a nucleic acid sample was prepared in the same manner using the pipette tip equipped with the carrier in Example 6. For these nucleic acid samples, the concentration of genomic DNA was measured in the same manner as in Example 1. These results are shown in Table 9 below.
  • Example 8 Recovery of genomic DNA from cultured cells
  • a cultured cell suspension of normal umbilical vein endothelial cells derived from Asians KJB-110, DS PHARMA BIOMEDICAL
  • the cultured cells were suspended in physiological saline so as to be 1 ⁇ 10 3 cells / ⁇ L.
  • 100 ⁇ L of the cultured cell suspension (the number of nucleic acid-containing cells: about 1 ⁇ 10 5 cells) was mixed with 100 ⁇ L of each processing reagent shown in Table 10 below to prepare 200 ⁇ L of a processing solution.
  • the added amount of protease was 1 U with respect to 50 ⁇ L of the cultured cell suspension, and the addition ratio of the surfactant was 0.5 vol%, 1 vol%, and 2 vol%.
  • a nucleic acid sample was prepared in the same manner using the pipette tip equipped with the carrier in Example 6. For these nucleic acid samples, the concentration of genomic DNA was measured in the same manner as in Example 1. These results are also shown in Table 10 below.
  • Example 9 Recovery of plasmid DNA from E. coli
  • E. coli having a plasmid DNA incorporating an IAPP (islet amyloid peptide) sequence was cultured in LB medium for 12 hours, and then 100 ⁇ L of culture solution (number of nucleic acid-containing cells: about 1 ⁇ 10 7 cells). ) was mixed with 100 ⁇ L of each of the following processing reagents to prepare 200 ⁇ L of a processing solution.
  • the culture solution was frozen at ⁇ 80 ° C. as it was, thawed at 25 ° C. when used, and then treated with the treatment reagent 9-1. Mixed with.
  • the addition amount of protease is 0, 1 U with respect to 50 ⁇ L of the cultured cell suspension, and the addition ratio of the surfactant is 0 vol%, 0.5 vol%, 1 vol%, 2 vol. % By volume.
  • a nucleic acid sample was prepared in the same manner using the pipette tip equipped with the carrier in Example 6. About these nucleic acid samples, it carried out similarly to the said Example 1, and measured the density
  • Example 10 Collection of genomic DNA from whole blood First, 100 ⁇ L of whole blood refrigerated at 4 ° C. for 70 days and 100 ⁇ L of thawed whole blood after freezing at ⁇ 30 ° C. for 9 months were treated as shown in Table 12 below. 200 ⁇ L of processing solution was prepared by mixing with 100 ⁇ L of reagent. The number of nucleic acid-containing cells in 100 ⁇ L of the refrigerated whole blood was about 580,000, and the number of nucleic acid-containing cells in 100 ⁇ L of the frozen and thawed whole blood was about 560,000. In the treatment solution, the amount of protease added is 1 U and 2 U with respect to 50 ⁇ L of whole blood, and no surfactant is added.
  • nucleic acid sample was prepared in the same manner using the pipette tip equipped with the carrier in Example 6.
  • concentration of genomic DNA was measured in the same manner as in Example 1.
  • Example 11 Collection of genomic DNA from fresh blood Fresh whole blood on the day of blood collection that had not been refrigerated or frozen was treated under various conditions as described below, and then genomic DNA was collected. The fresh whole blood leukocyte count was about 5,500 / ⁇ L.
  • a tube 50 ⁇ L of the processing reagent 6 shown in Table 13 below and 50 ⁇ L of fresh whole blood were added to prepare a processing solution.
  • the concentrations of protease and surfactant in the treatment reagent 6 are shown in Table 14 below. Moreover, the concentration of the protease and the surfactant in the treatment liquid is 1 ⁇ 2 of the concentration shown in Table 14 below (the same applies hereinafter).
  • a PET mesh woven fabric (trade name: PET105, manufactured by SEFAR, mesh size: 105 ⁇ m) having a pore diameter of 105 ⁇ m was prepared as a carrier.
  • This carrier was cut into a circle having a diameter of 2.5 mm and mounted inside the pipette tip (capacity 200 ⁇ L) shown in FIG. 1 (effective diameter 1.4 mm).
  • This pipette tip was attached to a pipetter, and 100 ⁇ L of the processing solution was aspirated and discharged 20 times to discharge the processing solution.
  • 100 ⁇ L of the cleaning solution 1 250 mmol / L KCl aqueous solution
  • the cleaning solution 1 was discharged by performing suction and discharge 10 times using the pipette tip.
  • the genome was collected and measured in the same manner as the fresh whole blood except that the concentrations of protease and surfactant in the treatment reagent 6 were changed to the concentrations shown in Table 15 below.
  • Example B1 of Table 15 in the case of refrigerated blood, a sufficient amount as a PCR template can be obtained by treating with a treatment reagent containing no surfactant and containing protease, followed by heat treatment as described above. Was able to recover the genomic DNA.
  • a treatment reagent containing no surfactant and containing protease was used to recover the genomic DNA.
  • the recovery rate of genomic DNA can be further improved by including a surfactant in addition to the protease.
  • Table 15 shows that almost no DNA was recovered in Comparative Example B1 to which no protease or surfactant was added.
  • the genome was collected and measured in the same manner as the fresh whole blood except that the concentrations of protease and surfactant in the treatment reagent 6 were changed to the concentrations shown in Table 16 below.
  • Example C1 in Table 16 whole blood after freezing and thawing is sufficient as a template for PCR by heat treatment as described above, even if no surfactant and protease are added.
  • the amount of genomic DNA could be recovered.
  • the recovery rate of DNA can be improved by using a processing reagent containing a protease, and further, as shown in Example C4, a protease and a surfactant are included. It was found that the recovery rate of DNA can be further improved by using the treatment reagent.
  • nucleic acids can be easily recovered without using a special reagent.
  • nucleic acid can be recovered from cells with excellent efficiency.
  • mitochondrial DNA can be recovered in addition to genomic DNA and RNA.
  • the present invention is excellent in safety and operability, and also has a high nucleic acid recovery rate.
  • a sufficient amount of template nucleic acid required for nucleic acid amplification or the like can be recovered from a small amount of cell sample. Can do.
  • recovery from a small amount of cell sample can be performed with a simple operation, it is useful for nucleic acid recovery and nucleic acid amplification using, for example, microchips and microtuses that have recently attracted attention. It can be said.

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Abstract

　危険性の高いカオトロピック塩等を大量に使用する必要がなく、特殊な担体に制限されず、安全性に優れ、簡便な核酸試料の製造方法およびそれを用いた核酸増幅物の製造方法を提供する。細胞を含む細胞試料について、前記細胞から核酸複合体を放出させ、この処理液を担体と接触させることで前記核酸複合体を前記担体に保持させる。そして、分散媒の存在下、前記担体に加熱処理を施すことで、前記分散媒中にゲノムやミトコンドリア等のＤＮＡおよびＲＮＡを放出させる。これによって核酸試料を回収できる。

Description

核酸試料の製造方法、および、それを用いた核酸増幅物の製造方法
　本発明は、細胞を含む細胞試料から核酸を回収して核酸試料を製造する方法、および、それを用いた核酸増幅物の製造方法に関する。
　医療分野において、感染症および遺伝子疾患等を遺伝子レベルで診断する方法として、患者から採取したＤＮＡ等の核酸を鋳型として核酸増幅を行い、特定の変異または一塩基多型（ＳＮＰ）を解析する方法が広く実施されている。核酸は、通常、患者の全血から回収されるが、全血には、赤血球や血漿等の様々な成分が含まれ、中には、多量に残存すると、後の増幅反応に影響を及ぼす成分も存在する。また、核酸は、一般に白血球に含まれるが、核酸を放出した後の白血球の残骸も、後の増幅反応に影響を及ぼす可能性がある。このため、患者の血液試料から鋳型となる核酸を回収するにあたっては、白血球から核酸を放出させて、且つ、不要な成分をある程度除去することが必要とされている。
　また、近年、遺伝子の解析装置およびそれに用いるチップ等のツールの小型化が求められている。そして、それに応じて、少量の全血から効率よく鋳型となる核酸を回収することも必要となってきている。このように、不要な成分の除去および少量の生体試料からの核酸の高効率回収が求められることから、以下のような方法が開示されている。
　まず、第１の方法として、高濃度のカオトロピック塩の存在下で、核酸をシリカ粒子に結合させる方法があげられる（特許文献１）。この方法によれば、核酸がシリカ粒子に結合するため、核酸とシリカ粒子との複合体を液体画分と分離することで、核酸を回収できる。しかし、カオトロピック塩は、腐食性を有する変性剤であり、人体および環境への影響が問題視されている。また、カオトロピック塩は、核酸とシリカ粒子との結合に必須であるが、ＤＮＡポリメラーゼおよび制限酵素等の多くの酵素の反応を阻害するため、エタノール等の核酸不溶性の有機溶媒による洗浄が必要である。しかし、エタノール等の有機溶媒も、種々の酵素反応を阻害するため、例えば、乾燥によって完全に除去することが必要であり、操作が煩雑という問題がある。また、前記有機溶媒は、通常、揮発性であることから、取り扱いも困難である。さらに、この方法では、核酸を回収するための担体が、シリカおよびその誘導体の粒子に限定され、また、試薬も、カオトロピック塩を含む特殊な試薬に限定される。このため、これら以外の担体や試薬で代用できず、コストおよび調製に手間がかかるという問題がある。
　第２の方法は、生体試料を、界面活性剤の存在下、ビーズ状支持体に接触させることで、前記生体試料中のＤＮＡを前記支持体に結合させ、回収する方法である（特許文献２）。この方法では、ＤＮＡは、ゲル状のＤＮＡ－ビーズ複合体として回収できる。しかしながら、この方法では、生体試料から十分量のＤＮＡを放出させるため、多量の細胞懸濁液を界面活性剤で処理する必要があり、結果的に、サンプル量が多くなり、効率よくビーズと接触できないおそれがある。このため、あらかじめ、遠心ろ過等により細胞を濃縮する、あるいは、不要な細胞や物質を除去してから必要な細胞を濃縮する等の前処理が生じ、操作が煩雑となる。また、この複合体は、ピペッティングおよびボルテックス混合等の操作で簡単に破壊され、ＤＮＡの収量が著しく減少するという問題がある。このため、ゆるやかに操作したり、または、磁性ビーズを使用し、ＤＮＡが結合した磁性ビーズを磁石によって回収することで、液相から分離する必要がある。
　第３の方法は、細胞抽出液を不織布に接触させることで、前記細胞抽出液中の核酸を不織布に吸着させる方法である（特許文献３）。しかしながら、この方法によると、核酸を不織布に吸着させるために、前記細胞抽出液を高塩濃度条件にする必要がある。このため、得られた核酸を核酸増幅に使用する場合、例えば、塩による影響を回避するために、予め、塩を除去する必要があり、操作が煩雑である。また、核酸は不織布に非常に強固に付着するため、不織布からのＤＮＡの溶出が困難である。このため、溶出は、極めて過酷な環境下での処理、例えば、ｐＨ１２のような強アルカリ条件下での長時間加熱処理、その他にも、活性酸素での処理等が必要となる。このような方法では、操作が煩雑であるだけでなく、溶出によって核酸に損傷が生じる可能性が極めて高いと考えられる。
特許第２６８０４６２号公報 特許第３７８７３５４号公報 国際公開第０３／００６６５０号
　そこで、本発明は、従来のように、例えば、危険性の高いカオトロピック塩等を大量に使用する必要がなく、特殊な担体に制限されず、安全性に優れ、簡便な核酸試料の製造方法およびそれを用いた核酸増幅物の製造方法の提供を目的とする。
　本発明の核酸試料の製造方法は、細胞から核酸を回収する核酸試料の製造方法であって、下記（Ａ）～（Ｅ）工程を含むことを特徴とする。
（Ａ）前記細胞を含む細胞試料について、前記細胞から核酸複合体を放出させる工程
（Ｂ）前記（Ａ）工程後の前記細胞試料を含む処理液と、担体とを接触させる工程
（Ｃ）前記担体と前記処理液とを分離する工程
（Ｄ）前記担体に加熱処理を施す工程
（Ｅ）前記（Ｄ）工程の前または後、前記担体に分散媒を添加する工程
　本発明の核酸増幅物の製造方法は、核酸増幅方法により、目的配列の核酸増幅物を製造する方法であって、下記（ａ）および（ｂ）工程を含むことを特徴とする。
（ａ）本発明の核酸試料の製造方法により、細胞を含む細胞試料から核酸試料を回収する工程
（ｂ）前記（ａ）工程で回収した前記核酸試料中の核酸を鋳型として、核酸増幅方法により、前記鋳型核酸における目的配列の核酸増幅物を製造する工程
　本発明によれば、細胞から核酸複合体を放出させることにより、優れた効率で核酸を回収できる。このため、例えば、ゲノムＤＮＡやＲＮＡ以外に、ミトコンドリアＤＮＡの回収も可能である。また、前記細胞からの核酸複合体の放出は、例えば、特殊な試薬を使用することなく行えるため、安全性や操作性にも優れる。このように、本発明は、安全性ならびに操作性に優れ、且つ、回収率に優れることから、例えば、少量の細胞や少量の細胞試料からでも、核酸増幅等に必要な鋳型となる核酸を、十分量回収できる。さらに、このように少量の細胞や少量の細胞試料からの回収を、簡便な操作で効率良く行えることから、例えば、近年注目されているマイクロチップおよびマイクロタス等を用いた核酸回収ならびに核酸増幅にも有用といえる。
図１は、本発明における核酸回収用ピペットチップの一例を示す断面図である。 図２（Ａ）～（Ｄ）は、本発明における核酸回収用ピペットチップを使用した核酸回収方法の概略を示す模式図である。 図３（Ａ）～（Ｄ）は、本発明における核酸回収用バイオチップの一例を示す模式図である。 図４（Ａ）～（Ｄ）は、本発明における核酸増幅用バイオチップの一例を示す模式図である。 図５は、本発明の実施例１で使用した治具装置の一例を示す模式図であり、（Ａ）が上面図、（Ｂ）が断面図、（Ｃ）が担体に対する液体の通過方向を示す模式図である。 図６は、本発明の実施例２で使用した治具装置の一例を示す模式図であり、（Ａ）および（Ｂ）が斜視図、（Ｃ）が上面図、（Ｄ）が断面図である。 図７は、参考例における核酸複合体のギムザ染色を示す写真である。
＜核酸試料の製造方法＞
　本発明の核酸試料の製造方法は、前述のように、細胞から核酸を回収する核酸試料の製造方法であって、下記（Ａ）～（Ｅ）工程を含むことを特徴とする。本発明の核酸試料の製造方法は、核酸試料の調製方法、核酸試料の回収方法または細胞からの核酸の回収方法ということもできる。
（Ａ）前記細胞を含む細胞試料について、前記細胞から核酸複合体を放出させる工程
（Ｂ）前記（Ａ）工程後の前記細胞試料を含む処理液と、担体とを接触させる工程
（Ｃ）前記担体と前記処理液とを分離する工程
（Ｄ）前記担体に加熱処理を施す工程
（Ｅ）前記（Ｄ）工程の前または後、前記担体に分散媒を添加する工程
　本発明の製造方法において、核酸の回収は、以下のメカニズムによると推定されるが、本発明は、これには限定されない。従来の核酸回収、特に、ゲノムＤＮＡの回収では、通常、まず、血液等の試料の処理として、細胞（例えば、白血球）内の核の破壊、前記核内でパッケージングされた染色体の放出、不要なタンパク質および繊維等の除去による核ゲノムの直鎖化を行った上で、例えば、種々の担体に核ゲノムを保持させて、前記担体と液体画分との分離により核ゲノムを回収している。これに対して、本発明においては、細胞の核から核ゲノムを含む染色体を放出させるものの、核ゲノムを直鎖化させるのではなく、核ゲノムが絡み合った高度な高次構造である粒子形状の核酸複合体として、核ゲノムを維持させている。この核酸複合体は、通常、直径５０～２００μｍ程度であり、直径が１０μｍ以下である核よりも大きく、また、直鎖の核ゲノムよりも立体障害が大きく、且つ、高度な高次構造をとっている。このため、例えば、担体に保持され易い。したがって、細胞由来の核ゲノムを、効率良く担体で捕獲できる。さらに、このように核酸複合体の状態で核ゲノムを前記担体に捕獲させることによって、ミトコンドリアゲノムの回収も可能である。ミトコンドリアゲノムは、約１７，０００個程度のヌクレオチドがつながった環状ＤＮＡであって、非常に微細であることから、これを回収することは極めて困難であった。しかし、本発明によれば、前記担体に捕獲された核酸複合体は、核酸が絡み合った構造であるため、この構造内に、さらにミトコンドリアゲノムが捕獲されると考えられる。また、このような核酸複合体は、例えば、直鎖の核ゲノムと比較すると、非常に安定性に優れるため、例えば、ピペッティングおよびボルテックス混合等の操作によっても破壊され難い。このため、回収操作による回収率の低下を防止できる。そして、前記担体に捕獲された核酸複合体に加熱処理を施すのみで、前記核酸複合体に含まれる各種核酸、例えば、ゲノムＤＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、ＲＮＡ等を分散媒中に回収できる。
　前記（Ｂ）工程において、前記（Ａ）工程後の前記処理液と、前記担体とを接触させる方法、および、前記（Ｃ）工程において、前記担体と前記処理液とを分離する方法は、それぞれ、特に制限されず、例えば、後述するように、前記担体の形状や、その配置状態等に応じて適宜決定できる。前記（Ｃ）工程において、前記担体と前記処理液との分離は、例えば、前記担体と液体画分との分離ということもでき、また、前記処理液または前記液体画分の除去ということもできる。なお、前記処理液（液体画分）は、例えば、前記担体から完全に除去されなくてもよく、例えば、前記担体に前記処理液が残存してもよい。
　前記（Ｅ）工程における分散媒の添加は、前述のように、加熱処理を施す前記（Ｄ）工程の前に行ってもよいし、後に行ってもよい。前記（Ｅ）工程を前記（Ｄ）工程の後に行う場合、本発明の製造方法は、例えば、前記（Ａ）工程～（Ｃ）工程をこの順序で行い、続いて加熱処理の前記（Ｄ）工程を行った後に、前記分散媒を添加する前記（Ｅ）工程を行う。また、前記（Ｅ）工程を前記（Ｄ）工程の前に行う場合、本発明の製造方法は、例えば、前記（Ａ）工程～（Ｃ）工程をこの順序で行い、続いて前記分散媒を添加する前記（Ｅ）工程を行った後に、加熱処理の前記（Ｄ）工程を行う。
（第１の実施形態）
　本発明の核酸試料の製造方法において、前記（Ａ）工程の核酸複合体を放出させる手段は、特に制限されない。本発明の核酸試料の製造方法の一例として、前記（Ａ）工程が、例えば、プロテアーゼおよび界面活性剤を含む処理試薬と、前記細胞試料とを混合する（Ａ１）工程である、第１の製造方法があげられる。第１の製造方法においては、例えば、このように、前記（Ａ）工程において、前記細胞試料と前記処理試薬とを混合することによって、前記細胞から核酸複合体を放出させた処理液が得られる。
　以下に、本発明の第１の製造方法について説明するが、本発明は、これには制限されない。本発明において、以下、細胞試料と混合する前の、前記プロテアーゼおよび界面活性剤を含む試薬を「処理試薬」といい、前記処理試薬と細胞試料とを混合したものを「処理液」または「混合処理液」という。なお、本発明において、前記細胞試料と前記処理試薬との混合とは、例えば、前記処理試薬を前記細胞試料に添加してもよいし、前記処理試薬に前記細胞試料を添加してもよい。本発明の第１の製造方法において使用する前記処理試薬は、例えば、「第１の処理試薬」ともいう。
　前記処理試薬と前記細胞試料とを混合した処理液において、前記プロテアーゼの濃度は、例えば、０．５ｍＵ／μＬ以上であり、前記界面活性剤の濃度は、例えば、０．１体積％以上であることが好ましい。このような条件で前記細胞試料を処理することによって、前記核酸複合体を十分に放出できる。前記プロテアーゼ濃度および前記界面活性剤濃度は、例えば、それぞれ、前記処理試薬と前記細胞試料とを含む処理液における濃度であって、前記処理液における細胞の含有量を約１×１０２～１×１０９個と仮定した場合の濃度である。また、前記プロテアーゼ濃度および前記界面活性剤濃度は、例えば、それぞれ、前記処理試薬と前記細胞試料とを含む処理液における濃度であって、前記処理液における前記細胞試料の添加割合を５０～１００μＬ、好ましくは５０μＬと仮定した場合の濃度であってもよい。
　前記処理液において、前記プロテアーゼの濃度の下限は、例えば、０．５ｍＵ／μＬ以上であり、好ましくは１ｍＵ／μＬ以上であり、より好ましくは２ｍＵ／μＬ以上である。前記処理液において、前記プロテアーゼ濃度の上限は、特に制限されないが、例えば、１Ｕ／μＬ以下であり、好ましくは５００ｍＵ／μＬ以下である。前記プロテアーゼの濃度範囲としては、例えば、０．５～１０００ｍＵ／μＬであり、好ましくは１～１０００ｍＵ／μＬであり、より好ましくは２～５００ｍＵ／μＬであり、特に好ましくは５～１５ｍＵ／μＬの範囲である。プロテアーゼの活性単位（Ｕ：ユニット）は、一般に、ヘモグロビンを基質として３７℃で１分間に１μｍｏｌのチロシンに相当するペプチドを生成する酵素量を１Ｕとする。
　前記処理液において、例えば、前記細胞１×１０２～１×１０９個に対するプロテアーゼの割合は、特に制限されないが、下限が、例えば、０．０２ｍＵ以上であり、好ましくは０．０８ｍＵ以上であり、上限が、例えば、１００Ｕ以下であり、好ましくは５０Ｕ以下である。また、前記処理液において、例えば、前記細胞試料５０μＬに対するプロテアーゼの割合は、特に制限されないが、下限が、例えば、０．０２ｍＵ以上であり、好ましくは０．０８ｍＵ以上であり、上限が、例えば、１００Ｕ以下であり、好ましくは５０Ｕ以下である。
　前記処理液において、前記界面活性剤の濃度の下限は、特に制限されないが、例えば、０．１体積％以上であり、好ましくは０．２体積％以上である。また、前記処理液において、前記界面活性剤の上限は、特に制限されないが、例えば、２０体積％以下であり、好ましくは１０体積％以下であり、より好ましくは５体積％以下であり、さらに好ましくは２体積％以下である。前記界面活性剤の濃度範囲は、例えば、０．１～２０体積％であり、好ましくは０．１～５体積％であり、より好ましくは０．１～２体積％であり、特に好ましくは０．２～０．８体積％の範囲である。
　また、前記処理液において、前記細胞１×１０２～１×１０９個に対する界面活性剤の割合は、特に制限されないが、下限が、例えば、１フェムトモル（１×１０-１５モル）以上であり、好ましくは、２フェムトモル以上であり、上限が、例えば、２００フェムトモル以下であり、好ましくは１００フェムトモル以下である。また、前記処理液において、前記細胞試料５０μＬに対する前記界面活性剤の割合は、特に制限されないが、下限が、例えば、１フェムトモル以上であり、好ましくは、２フェムトモル以上であり、上限が、例えば、２００フェムトモル以下であり、好ましくは１００フェムトモル以下である。
　前述のプロテアーゼおよび界面活性剤の割合は、前記細胞が真核細胞（有核細胞）の場合、好ましくは１×１０２～１×１０８個に対する割合であることが好ましく、より好ましくは１×１０３～１×１０７個に対する割合である。前記真核細胞の中でも、特に、前記細胞が全血由来の細胞（例えば、白血球）の場合、例えば、５×１０３～１×１０７個に対する割合であることが好ましく、より好ましくは２．５×１０４～１×１０７個に対する割合である。前記真核細胞の中でも、特に唾液由来の細胞の場合、例えば、１×１０２～１×１０７個に対する割合であることが好ましく、より好ましくは１×１０３～１×１０６個に対する割合である。また、前記細胞が原核細胞の場合、例えば、１×１０３～１×１０９個に対する割合であることが好ましく、より好ましくは１×１０３～１×１０８個に対する割合であり、例えば、大腸菌等も同様である。
　前記処理試薬におけるプロテアーゼ濃度および界面活性剤濃度は、特に制限されず、例えば、前記処理試薬を前記細胞試料と混合した際に、前記処理液において、前述のような濃度になるよう設定することが好ましい。
　前記処理試薬におけるプロテアーゼの濃度は、特に制限されないが、下限が、例えば、１ｍＵ／μＬ以上であり、好ましくは２ｍＵ／μＬ以上であり、より好ましくは４ｍＵ／μＬ以上であり、上限が、例えば、２Ｕ／μＬ以下であり、好ましくは１Ｕ／μＬ以下であり、濃度範囲は、例えば、１～２０００ｍＵ／μＬであり、好ましくは２～２０００ｍＵ／μＬであり、より好ましくは４～１０００ｍＵ／μＬであり、特に好ましくは１０～３０ｍＵ／ｍＬの範囲である。前記処理試薬における界面活性剤の濃度としては、特に制限されないが、下限が、例えば、０．２体積％以上であることが好ましく、上限が、例えば、４０体積％以下であり、より好ましくは２０体積％以下であり、さらに好ましくは１０体積％以下であり、特に好ましくは４体積％以下であり、濃度範囲は、例えば、０．２～４０体積％であり、好ましくは０．２～１０体積％であり、より好ましくは０．２～４体積％であり、特に好ましくは０．４～１．６体積％の範囲である。
　前記細胞試料（Ｓ）と前記処理試薬（Ｔ）との添加割合（体積比Ｓ：Ｔ）は、特に制限されないが、例えば、１：０．５～１：２０であり、好ましくは１：０．５～１：１０であり、より好ましくは１：０．５～１：５である。
　前記プロテアーゼとしては、例えば、プロテイナーゼＫ、キモトリプシン、ペプシン、カテプシンＤ、パパイン等があげられる。これらのプロテアーゼは、いずれか一種類でもよいし、二種類以上を併用してもよい。
　前記界面活性剤としては、特に制限されないが、例えば、非イオン性界面活性剤が好ましい。前記非イオン性界面活性剤としては、例えば、ポリオキシエチレン－ｐ－イソオクチルフェノール（ｐｏｌｙｏｘｙｅｔｈｙｌｅｎｅ－ｐ－ｉｓｏｏｃｔｙｌｐｈｅｎｏｌ）、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウリル酸（ｐｏｌｙｏｘｙｅｔｈｙｌｅｎｅ　Ｓｏｒｂｉｔａｎ　Ｍｏｎｏｌａｕｒａｔｅ）、ポリオキシエチレンノニルフェニルエーテル、ノニルフェノールポリチオエトキシレート等があげられる。これらの界面活性剤としては、例えば、Ｔｒｉｔｏｎ（商標）Ｘ－１００、Ｔｒｉｒｏｎ（商標）Ｘ－１１４等のＴｒｉｔｏｎ系、Ｎｏｎｉｄｅｔ（商標）Ｐ４０等のＮｏｎｉｄｅｔ系、Ｔｗｅｅｎ（商標）２０、Ｔｗｅｅｎ（商標）８０等のＴｗｅｅｎ系の界面活性剤があげられる。これらの界面活性剤は、いずれか一種類でもよいし、二種類以上を併用してもよい。
　前記処理試薬の形態は、特に制限されず、例えば、固体（乾燥体）でもよいし、液体でもよい。後者の場合、例えば、溶媒に、前記プロテアーゼおよび前記界面活性剤が添加されていることが好ましい。前記溶媒は、特に制限されないが、例えば、水、各種緩衝液、緩衝生理食塩水等の水性溶媒、有機溶媒、または、それらの混合液があげられる。前記緩衝液としては、例えば、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ＢＥＳ、ＰＩＰＥＳ、ＳＳＣ、ＴＡＥ、ＴＢＥ、ＴＧ、ＭＥＳ、Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ、ＡＤＡ、ＡＣＥＳ、ＭＯＰＳＯ、ＭＯＰＳ、ＴＥＳ、ＨＥＰＥＳ、ＤｌＰＳＯ、ＴＡＰＳＯ、ＰＯＰＳＯ、ＨＥＰＰＳＯ、ＥＰＰＳ、Ｔｒｉｃｉｎｅ、Ｂｉｃｉｎｅ、ＴＡＰＳ、ＣＨＥＳ、ＣＡＰＳＯ、ＣＡＰＳ、ＰＢＳ、ホウ酸、カコジル酸、クエン酸、グリシン、グリシルグリシン、イミダゾール、クエン酸リチウム、リン酸カリウム、クエン酸ナトリウム、リン酸ナトリウム、トリチル酢酸アンモニウム（Ｔｒｉｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ　Ａｃｅｔａｔｅ）等があげられる。前記処理試薬における緩衝液の濃度は、特に制限されないが、例えば、０．１～１００ｍｍｏｌ／Ｌであり、より好ましくは０．１～５０ｍｍｏｌ／Ｌであり、特に好ましくは０．１～２０ｍｍｏｌ／Ｌである。前記処理試薬のｐＨは、例えば、７．８～９．５であり、８．５～８．９が好ましい。
　前記処理試薬は、例えば、さらに、タンパク質変性剤等を含んでもよい。前記タンパク質変性剤としては、例えば、尿素、β－メルカプトエタノール、ラウリル硫酸ナトリウム、ジチオトレイトール、グアニジン塩酸等があげられる。前記処理試薬における前記タンパク質変性剤の濃度は、特に制限されないが、例えば、０～８ｍｏｌ／ｍＬであり、好ましくは１～５ｍｏｌ／ｍＬであり、より好ましくは１～３ｍｏｌ／ｍＬである。これらは、一種類でもよいし、二種類以上を併用してもよい。
　前記処理試薬は、例えば、さらに、キレート剤を含んでもよい。前記キレート剤としては、例えば、ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡ、ＮＴＡ、ＤＴＰＡ、ＧＬＤＡ、ＨＥＤＴＡ、ＧＥＤＴＡ、ＴＴＨＡ、ＨＩＤＡ、ＤＨＥＧ等があげられる。前記処理試薬における前記キレート剤の濃度は、特に制限されないが、例えば、０～１０ｍｍｏｌ／ｍＬであり、好ましくは０～１ｍｍｏｌ／ｍＬであり、より好ましくは０～０．１ｍｍｏｌ／ｍＬである。
　前記細胞としては、例えば、核酸を含有している細胞であればよく、真核細胞および原核細胞があげられる。前記真核細胞としては、例えば、白血球等の血中細胞、口腔内細胞、爪の細胞および毛髪の細胞等の体細胞、生殖細胞および腫瘍細胞等があげられ、また、これらの培養細胞であってもよい。また、前記細胞として前記真核細胞を含む細胞試料は、特に制限されないが、例えば、血液、唾液、口腔粘膜、爪および毛髪等があげられ、また、前記真核細胞の培養物であってもよい。前記原核細胞としては、特に制限されないが、例えば、大腸菌等があげられ、また、その培養細胞であってもよい。また、前記細胞として前記原核細胞を含む細胞試料は、特に制限されないが、例えば、前記原核細胞の培養物であってもよい。前記培養物としては、例えば、細胞の培養液、回収した培養細胞等があげられる。また、前記細胞試料は、例えば、未希釈の細胞試料および希釈した細胞試料のいずれでもよいが、本発明は、未希釈の細胞試料からの核酸回収に適用することが好ましい。前記細胞試料が、例えば、口腔内細胞、または、培養後に回収した培養細胞等の場合、例えば、あらかじめ生理食塩水や緩衝液等に前記細胞を懸濁したものを、細胞試料として、前記処理試薬と混合してもよいし、細胞をそのまま細胞試料として、前記処理試薬と混合してもよい。また、前記細胞試料は、例えば、採取直後の細胞試料でもよいし、室温放置、冷蔵保存、または凍結後融解した細胞試料であってもよい。
　前記血液としては、例えば、全血、溶血した全血、全血の血球画分、前記血球画分の分散液等があげられる。前記血液は、未希釈血液および希釈血液のいずれでもよいが、例えば、未希釈血液からの核酸回収に適用することが好ましい。前記血液は、例えば、採取直後の血液でもよいし、室温放置、冷蔵保存または凍結後融解した血液であってもよい。
　本発明により回収される核酸は、例えば、ＤＮＡおよびＲＮＡの少なくとも一方である。前記ＤＮＡとしては、例えば、ゲノムＤＮＡの他に、プラスミドＤＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡ等があげられる。
　前記（Ｂ）工程では、前記（Ａ）工程後の前記細胞試料を含む処理液、例えば、前記処理試薬と前記細胞試料とを混合した処理液に、前記担体を接触させる。前記（Ｂ）工程における担体は、特に制限されず、例えば、前記（Ａ）工程において、前記処理試薬との処理によって前記細胞から放出された前記核酸複合体を捕獲できればよい。前記核酸複合体の平均直径は、例えば、５０～２００μｍである。したがって、前記担体は、例えば、前記核酸複合体が通過し難く、且つ、液体画分が通過できる空隙を有することが好ましい。これによって、例えば、前記核酸複合体を保持し、且つ、液体画分を除去できる。また、前記核酸複合体は、前述のように高度な高次構造を有しているため、例えば、繊維等に付着し易い（絡み易い）。このため、前記担体における空隙の大きさは、特に制限されず、例えば、織布および不織布の繊維等の担体自体に、前記核酸複合体が付着することで、前記核酸複合体が保持されてもよい。また、その高次構造から、前記担体に付着した核酸複合体によって、さらに他の核酸複合体が保持されると考えられる。
　前記担体としては、例えば、不織布、メッシュ状織布等の織布、スポンジ等の多孔質体等があげられる。その形状も特に制限されず、例えば、シート状、フィルム状、ブロック状、ビーズ状等があげられる。また、前記ビーズ状の担体は、例えば、不織布、織布、多孔質体等から形成されてもよいし、非孔質体から形成されてもよい。
　以下に、前記各担体の特性を例示するが、本発明は、これには制限されない。
＜不織布＞
　平均繊維直径：例えば、２０ｎｍ～１００μｍ、好ましくは約２μｍ
　目付：例えば、２０～１５０ｇ／ｍ３、好ましくは約２０ｇ／ｍ３
＜織布＞
　メッシュのサイズ：例えば、１０～１０００μｍ、好ましくは、１００～２５０μｍ
　糸径（線径）：例えば、４０～５００μｍ、好ましくは、４７～１５２μｍ
　目開き：例えば、５０～３００μｍ、好ましくは、５０～１０５μｍ
＜多孔質体＞
　平均孔径：例えば、１０μｍ～１０００μｍ、好ましくは、３０μｍ～１０００μｍ
　平均密度：例えば、１５～８５ｋｇ／ｍ３、好ましくは、３０～８０ｋｇ／ｍ３
　孔の形状：例えば、独立気泡体、連続気泡体
＜ビーズ＞
　形状：真球、楕円球等の球形
　直径（粒径）：例えば、３０ｎｍ～１００μｍ、好ましくは、約５μｍ
　表面積比：例えば、０．５～２００ｍ２／ｇ、好ましくは、１．１ｍ２／ｇ
　充填率：例えば、０．１～１０％、好ましくは、０．１～５％
　前記担体は、例えば、ポリマー製担体があげられる。前記ポリマーとしては、特に制限されず、例えば、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリエステル、ポリアミド（例えば、商品名ナイロン）、ポリウレタン、ポリエーテル、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、例えば、テフロン（登録商標）等のポリテロラフルオロエチレン等があげられる。中でも、例えば、ポリテトラフルオロエチレン、ポリプロピレン、ポリアミド、ポリウレタン、ポリエステルが好ましく、より好ましくはポリプロピレン、ポリウレタン、ポリエステルである。
　前記ポリマー製担体は、例えば、全体が前記ポリマーから形成された担体でもよいし、血液と接触する部分のみ、例えば、露出表面のみが、前記ポリマーに被覆された担体でもよい。
　前記ビーズ状のポリマー製担体は、例えば、前述のように、多孔質体から形成されてもよいし、非多孔質体から形成されてもよい。前記ビーズ状のポリマー製担体としては、例えば、磁石による回収が可能であることから、磁性を帯びた磁性ビーズも好ましい。前記磁性ビーズを構成するポリマーとしては、特に制限されないが、例えば、ポリスチレン、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、キトサンや、これらのポリマーとマレイン酸との共重合体等があげられる。また、前記磁性ビーズは、例えば、ＰＥＧ－ＣＯＯＨ、ａｌｋｙｌ－ＯＨ、ＳＯ３Ｈ、ＳｉＯ２等で表面処理されていてもよい。また、前記磁性ビーズは、例えば、金属等の磁性体から構成されるビーズの表面に、前述のようなポリマーが被覆されているものでもよい。前記金属としては、例えば、マグネタイト、マグヘマイト、鉄、ニッケル等があげられる。
　また、前記担体としては、この他に、例えば、金属製担体があげられる。前記金属としては、例えば、ステンレス、チタン、アルミニウム等があげられる。これらの金属は、一種類でもよいし、二種類以上であってもよい。
　前記担体は、例えば、単層体でもよいし、二層以上の積層体であってもよい。前記積層体は、例えば、いずれか一種類の部材から構成されてもよいし、異なる二種類以上の部材から構成されてもよく、また、異なる材質の部材から構成されてもよい。
　使用する前記担体の大きさは、制限されず、例えば、前記（Ａ）工程における前記細胞試料の量、前記細胞試料と前記処理試薬とを混合した処理液の量、および、前記担体の形状等に応じて適宜決定できる。なお、具体例については、後述する。
　前記（Ｂ）工程において、前記処理液と前記担体とを接触させる方法、および、前記（Ｃ）工程において、前記処理液と前記担体とを分離する方法は、それぞれ、特に制限されず、例えば、後述するように、前記担体の形状や、その配置状態等に応じて適宜決定できる。なお、前記担体から前記処理液は、前述のように、完全に分離されなくてもよい。
　本発明の第１の核酸試料の製造方法について、一例として、全血から核酸を回収する方法を説明するが、本発明は、これには限定されない。
血液の処理工程
　まず、全血に前記処理試薬を添加する。これによって、全血の白血球から核酸複合体が放出される。この核酸複合体には、例えば、ゲノムＤＮＡやＲＮＡの他に、ミトコンドリアＤＮＡが含まれる。
　前記処理試薬による処理条件は、特に制限されないが、処理時間は、例えば、１～６００秒であり、好ましくは５～６００秒であり、より好ましくは５～３００秒である。処理温度は、例えば、４～６０℃であり、好ましくは１０～６０℃であり、より好ましくは１５～４０℃である。
担体との接触工程
　続いて、前記全血と前記処理試薬とを混合した前記処理液を、前記担体に接触させる。これによって、前記担体に、核酸含有細胞である全血の白血球から放出された核酸複合体が捕獲される。
　前記担体の大きさは、前述のように、特に制限されず、例えば、処理する全血の量、前記担体の材質および形状等によって適宜決定できる。具体例を以下に示す。
　前記担体が、例えば、不織布、織布または多孔質体から構成されるシート状、フィルム状またはブロック状等の担体である場合、例えば、以下のような条件で、全血と担体とを接触させる。前記（Ａ）工程で処理した全血の体積（Ｘ）に対する前記担体の体積（Ｙ：空隙を含む）の比（Ｘ：Ｙ）は、例えば、１：２．２×１０－３～１：０．７であり、好ましくは１：２．２×１０－３～１：０．３１であり、より好ましくは１：２．２×１０－３～１：０．１３である。また、前記（Ａ）工程後の全血を含む前記処理液の体積（Ｘ’）に対する前記担体の体積（Ｙ：空隙を含む）の比（Ｘ’：Ｙ）は、例えば、１：１．１×１０－３～１：０．３５であり、好ましくは１：１．１×１０－３～１：０．１６であり、より好ましくは１：１．１×１０－３～１：０．０７である。
　前記担体が、例えば、ビーズである場合、複数のビーズを使用することが好ましい。前記ビーズの形状は、特に制限されないが、例えば、真球、略真球、楕円球等があげられる。前記ビーズの平均直径は、例えば、３０ｎｍ～１００μｍであり、好ましくは３０ｎｍ～２０μｍであり、より好ましくは３０ｎｍ～５μｍである。例えば、全血５０μＬから核酸を回収する場合、前記複数のビーズの総表面積（Ｚ）は、例えば、５～２０００ｃｍ２であり、好ましくは１０～２０００ｃｍ２であり、より好ましくは２００～２０００ｃｍ２である。また、前記ビーズの充填率は、例えば、０．１～１０％であり、好ましくは、０．１～５％であり、より好ましくは、１～５％である。
　前記処理液と前記担体とを接触させて、前記核酸複合体を前記担体に捕獲させる際の処理条件は、特に制限されないが、処理温度が、例えば、１５～４０℃であり、好ましくは２０～３５℃であり、特に好ましくは室温（約２５℃）であり、処理時間は、例えば、１秒～１０分であり、好ましくは３０秒～５分である。
　前記処理液と前記担体とを接触させる方法は、特に制限されず、前述のように、例えば、前記担体の形状等に応じて適宜決定できる。前記両者は、例えば、エッペンドルフチューブ、試験管、流路を備えるチップ等の容器内で接触させることができる。具体的には、前記容器内に、前記担体と前記処理液とを入れることで前記両者を接触させてもよいし、予め前記担体を固定化した前記容器に、前記処理液を入れることで、前記両者を接触させてもよい。
　また、後述するように、例えば、チップ等の流路内に前記担体を配置し、前記流路に前記処理液を流し、前記担体の内部を通過させることによって、両者を接触させてもよい。このような方法によれば、前記処理液中の核酸複合体は、前記担体に保持され、それ以外の成分を除去できる。ここで、「前記担体を通過」とは、例えば、前記処理液が、前記担体内部に入り、前記担体の内部を移動することを意味する。特に、前記担体に供給した前記処理液の全部または一部が、前記担体の内部に入り、前記担体の内部から前記担体の外部に通り抜けることが好ましい。このように前記担体の内部から前記担体の外部に前記処理液を通過させれば、例えば、前記担体内に残存する前記処理液中の不要成分の量を低減できる。これによって、最終的に得られる核酸試料における不要成分の含有量を、さらに低減できる。また、例えば、チップ等の流路内に複数の前記担体（例えば、ビーズ）を配置し、前記処理液を、前記担体と担体との間を通過させることによって、両者を接触させてもよい。これによっても、前述と同様に、前記核酸複合体は前記担体に保持され、それ以外の成分を除去できる。前記処理液は、例えば、減圧または加圧によって、前記流路内の前記担体の内部、または、前記担体の間を通過させることができる。
分離工程
　続いて、前記担体と前記処理液とを分離する。前記両者の分離方法は、特に制限されず、例えば、前記担体の形状や、その配置状態等によって適宜決定できる。前記担体が容器に固定されていない場合、例えば、前記容器から前記担体または前記処理液を取り出すことによって、両者を分離できる。また、前述の磁性体ビーズの場合は、例えば、磁石等でビーズを回収することによって、両者を分離できる。一方、前記担体が容器に固定されている場合、例えば、前記容器から前記処理液を除去（排出）することで、両者を分離できる。また、前述のように流路内に前記担体を配置している場合は、前記担体の内部または複数の前記担体と担体との間に前記処理液を通過させることで、例えば、血中細胞から前記処理液中に放出された核酸複合体を、前記担体に捕獲させると共に、前記処理液と前記担体とを分離できる。
分散媒の添加工程
　つぎに、前記処理液を除去した前記担体に分散媒を添加する。なお、前記分散媒の添加は、このように、次工程の加熱処理の前に行ってもよいし、加熱処理の後に行ってもよい。
　前記分散媒の添加によって、前記担体が前記分散媒中に浸漬した状態となることが好ましい。前記分散媒は、特に制限されないが、水、各種緩衝液、緩衝生理食塩水等の水性溶媒、有機溶媒、または、それらの混合液があげられる。前記緩衝液としては、例えば、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ＢＥＳ、ＭＯＰＳ、ＴＥＳ、ＨＥＰＥＳ、ＤｌＰＳＯ、ＴＡＰＳＯ、ＰＯＰＳＯ、ＨＥＰＰＳＯ、ＥＰＰＳ、Ｔｒｉｃｉｎｅ、Ｂｉｃｉｎｅ、ＴＡＰＳ等があげられる。前記緩衝液の濃度は、特に制限されないが、例えば、０．１～１００ｍｍｏｌ／Ｌであり、好ましくは、０．１～５０ｍｍｏｌ／Ｌであり、特に好ましくは、０．１～１０ｍｍｏｌ／Ｌである。前記分散媒のｐＨは、例えば、７．８～９．５であり、８．５～８．９が好ましい。
　前記分散媒の添加割合は、特に制限されないが、例えば、前記（Ａ）工程で処理した全血の体積（Ｘ）に対する分散媒の体積（Ｄ）の比（体積比Ｘ：Ｄ）は、例えば、１：０．５～１：１０であり、好ましくは、１：０．５～１：５であり、より好ましくは、１：１～１：３である。
　なお、前記担体への前記分散媒の供給に先立って、例えば、洗浄液の供給および除去を行ってもよい。これによって、前記担体に残存している不要な成分をさらに排除できる。前記洗浄液としては、特に制限されず、例えば、前記分散媒と同じものが使用できる。また、前記分散媒の供給に先立って、加熱処理を施す場合は、前記加熱処理に先立って、前記担体への洗浄液の供給および前記洗浄液の除去を行うことが好ましい。
加熱処理工程
　前記分散媒中の前記担体に加熱処理を施す。これによって、前記担体に捕獲された前記核酸複合体から核酸が放出され、前記放出された核酸が、前記分散媒中に解放（遊離）される。
　加熱処理の温度は、特に制限されないが、例えば、５０～１３０℃であり、好ましくは８０～１３０℃であり、より好ましくは９０～１００℃である。加熱処理は、例えば、一定の温度で行ってもよいし、温度を、連続的または段階的に上昇させてもよい。また、処理時間は、特に制限されないが、例えば、１～３０分であり、好ましくは１～５分である。
　なお、前記分散媒の添加に先立って加熱処理を行った場合は、加熱処理によって前記核酸複合体から核酸を放出させた後、前記分散媒を添加して、前記放出された核酸を前記分散媒中に遊離させればよい。
　続いて、加熱処理後の前記分散媒を回収する。前述のように、核酸が前記分散媒中に放出されているため、この分散媒を、全血由来の核酸を含有する核酸試料として回収できる。本発明により得られる核酸試料の用途は、特に制限されないが、例えば、後述する核酸増幅に使用することが好ましい。なお、全血以外の細胞試料についても、同様に処理を行い、核酸試料を回収できる。
　本発明の方法によれば、例えば、前記細胞試料が全血であり、処理する全血が５０μＬ、使用する前記処理試薬が５０μＬ、前記分散媒が１００μＬの場合、例えば、１００～１００００ｃｏｐｙ／μＬの核酸試料を回収できる。この量の核酸であれば、例えば、ＰＣＲ等の核酸増幅法において十分な鋳型となり得る。また、本発明の方法によれば、ゲノムＤＮＡやＲＮＡだけでなく、従来、回収が困難であったミトコンドリアＤＮＡも回収可能である。
（第２の実施形態）
　本発明の製造方法において、細胞が真核細胞であって、真核細胞を含む細胞試料が、冷蔵保存または凍結融解後の試料である場合、例えば、以下に示す第２の製造方法が好ましい。本発明の第２の製造方法は、例えば、前記（Ａ）工程が、界面活性剤無添加であり且つプロテアーゼを含む処理試薬と、凍結融解後または冷蔵保存後の前記細胞試料とを混合する（Ａ２）工程の製造方法である。本発明の第２の製造方法において使用する前記処理試薬は、例えば、「第２の処理試薬」ともいう。なお、特に示さない限り、第２の製造方法は、例えば、前記（Ａ１）工程に代えて前記（Ａ２）工程を行えばよく、その他は、前記第１の製造方法と同様に行うことができる。
　本発明における細胞試料としては、前述の真核細胞を含む細胞試料があげられる。本発明の第２の製造方法において、前記第２の処理試薬は、前述のように、界面活性剤無添加であり且つプロテアーゼを含む試薬が使用できる。凍結融解後または冷蔵保存後の細胞試料は、真核細胞の細胞膜の一部もしくは大部分が破壊されているため、例えば、界面活性剤による細胞膜の破壊を省略でき、界面活性剤を含まない前記処理試薬であっても、効率良く核酸複合体を放出できると推測される。このため、処理試薬のコストをより一層低下できる。なお、この推測は、本発明を何ら制限しない。
　前記細胞試料の凍結融解の条件は、何ら制限されず、細胞試料を凍結した後、融解すればよい。凍結温度は、例えば、－１５～－２００℃であり、融解温度は、例えば、４～５０℃である。また、前記細胞試料の冷蔵保存の条件は、何ら制限されないが、例えば、冷蔵温度は、例えば、０～８℃であり、保存時間は、例えば、４日～１年であり、１週間～１ヵ月であってもよい。
　前記第２の処理試薬は、例えば、冷蔵保存前または凍結保存前から、前記細胞試料に添加してもよいし、冷蔵保存後または凍結融解後に、前記細胞試料に添加してもよい。
　前記第２の処理試薬の組成は、界面活性剤無添加である以外は、前記第１の製造方法における第１の処理試薬と同様である。また、前記第２の処理試薬と細胞試料とを混合した処理液において、真核細胞ならびに細胞試料に対するプロテアーゼの割合も、前記第１の製造方法と同様である。
（第３の実施形態）
　本発明の製造方法において、細胞が真核細胞であって、真核細胞を含む細胞試料が、凍結融解後の試料である場合、例えば、以下に示す第３の製造方法が好ましい。本発明の第３の製造方法は、例えば、前記（Ａ）工程が、界面活性剤無添加且つプロテアーゼ無添加の処理試薬と、凍結融解後の前記細胞試料とを混合する（Ａ３）工程の製造方法である。本発明の第３の製造方法において使用する前記処理試薬は、例えば、「第３の処理試薬」ともいう。なお、特に示さない限り、第３の製造方法は、例えば、前記（Ａ１）または（Ａ２）工程に代えて、前記（Ａ３）工程を行えばよく、その他は、前記第１または第２の製造方法と同様に行うことができる。また、第３の製造方法においては、例えば、前記（Ａ）工程において前記第３の処理試薬と混合することなく、前記（Ｂ）工程において、前記凍結融解後の前記細胞試料を前記担体に接触させてもよい。
　本発明における細胞試料としては、前述の真核細胞を含む細胞試料があげられる。本発明の第３の製造方法において、前記第３の処理試薬は、前述のように、界面活性剤無添加且つプロテアーゼ無添加の試薬が使用できる。凍結融解後の細胞試料は、真核細胞の細胞膜および核膜の一部または大部分が破壊され、同時に、一部の細胞では核内で核酸をパッケージングしていたタンパク質が変性し、パッケージの機能を失うことで、核酸複合体を放出すると考えられる。このため、例えば、界面活性剤およびプロテアーゼを含まない処理試薬であっても、効率良く核酸複合体を放出させることができる。このため、処理試薬のコストをより一層低下できる。
　前記細胞試料の凍結融解の条件は、何ら制限されず、細胞試料を凍結した後、融解すればよい。凍結温度は、例えば、－１５～－２００℃であり、融解温度は、例えば、４～５０℃である。
　前記第３の処理試薬は、例えば、凍結保存前から、前記細胞試料に添加してもよいし、凍結融解後に、前記細胞試料に添加してもよい。
　前記第３の処理試薬の組成は、例えば、界面活性剤およびプロテアーゼ無添加である以外は、前記第１の製造方法における第１の処理試薬と同様であり、例えば、前述の各種溶媒等があげられる。
（第４の実施形態）
　本発明の製造方法において、細胞が原核細胞であって、原核細胞を含む細胞試料が、冷蔵保存または凍結融解後の試料である場合、例えば、以下に示す第４の製造方法が好ましい。本発明の第４の製造方法は、例えば、前記（Ａ）工程が、前記原核細胞を含む細胞試料を、凍結融解または冷蔵保存する工程の製造方法である。なお、特に示さない限り、第４の製造方法は、例えば、前記（Ａ１）、（Ａ２）または（Ａ３）工程に代えて、前記（Ａ４）工程を行えばよく、その他は、前記第１から第３の製造方法と同様に行うことができる。
　本発明における細胞試料としては、前述の原核細胞を含む細胞試料があげられる。第４の製造方法においては、例えば、細胞試料を冷蔵保存または凍結融解するのみで、前記核酸複合体を放出させることができる。
　第４の製造方法においては、例えば、前述のように、前記（Ａ）工程において、前記細胞試料を、凍結融解または冷蔵保存することによって、前記細胞から核酸複合体を放出させた処理液が得られる。この前記（Ａ）工程後の処理液は、例えば、前記担体に接触させる前記（Ｂ）工程の前に、例えば、処理試薬と混合することが好ましい。前記処理試薬としては、例えば、前記プロテアーゼおよび前記界面活性剤のいずれも含まない試薬、または、前記プロテアーゼおよび前記界面活性剤のいずれか一方を含み且つ他方が無添加である試薬があげられる。本発明の第４の製造方法において使用する前記処理試薬は、例えば、「第４の処理試薬」ともいう。前記第４の処理試薬がプロテアーゼまたは界面活性剤を含む場合、その添加割合は、例えば、前記第１の製造方法における第１の処理試薬と同様である。また、細胞試料に対する添加割合も、前記第１の製造方法と同様である。前記第４の処理試薬がプロテアーゼおよび界面活性剤を含まない場合、前記第４の処理試薬は、例えば、これらが無添加である以外は、前記第１の製造方法における第１の処理試薬と同様であり、例えば、前述の各種溶媒等があげられる。
　凍結融解後または冷蔵保存後の細胞試料は、原核細胞の細胞壁が破壊されている、もしくは、破壊され易くなっている。そして、原核細胞は、細胞核が存在しないため、前述のように細胞壁が破壊されている、または、破壊され易くなっている。これによって、例えば、界面活性剤およびプロテアーゼ、または、いずれか一方を含まない第４の処理試薬であっても、効率良く核酸複合体を放出させることができる。このため、処理試薬のコストをより一層低下できる。
　前記第４の処理試薬は、例えば、冷蔵保存前または凍結保存前から、前記細胞試料に添加してもよいし、冷蔵保存後または凍結融解後に、前記細胞試料に添加してもよい。
＜増幅産物の製造方法＞
　以上のように、本発明の核酸試料の製造方法により得られた核酸試料は、例えば、各種核酸増幅方法の鋳型試料として使用できる。そこで、本発明は、核酸増幅方法により、目的配列の核酸増幅物を製造する方法であって、下記（ａ）および（ｂ）工程を含むことを特徴とする。また、本発明は、目的配列の増幅方法ということもできる。
（ａ）本発明の核酸試料の製造方法により、細胞を含む細胞試料から核酸試料を回収する工程
（ｂ）前記（ａ）工程で回収した前記核酸試料中の核酸を鋳型として、核酸増幅方法により、前記鋳型における目的配列の核酸増幅物を製造する工程
　本発明の核酸増幅物の製造方法は、本発明の核酸試料の製造方法により核酸を回収する点が特徴であり、その他の工程や条件等は、何ら制限されない。また、前述のように、本発明の核酸試料の製造方法によれば、鋳型として使用可能な十分量の核酸を得ることができるため、例えば、前記（ａ）工程の核酸を、そのまま前記（ｂ）工程に使用できる。
　前記（ｂ）工程における核酸増幅方法の種類は、何ら制限されず、従来公知の増幅方法があげられる。具体例としては、ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　Ｃｈａｉｎ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法、ＮＡＳＢＡ（Ｎｕｃｌｅｉｃ　ａｃｉｄ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｂａｓｅｄ　ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、ＴＭ（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ－ｍｅｄｉａｔｅｄ　ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、ＳＤＡ（Ｓｔｒａｎｄ　Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ　Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、ＳＭａｒｔ　Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｐｒｏｃｅｓｓ法、ＬＡＭＰ（Ｌｏｏｐ－Ｍｅｄｉａｔｅｄ　Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ　Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、ＩＣＡＮ（Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ　ａｎｄ　Ｃｈｉｍｅｒｉｃ　ｐｒｉｍｅｒ－ｉｎｉｔｉａｔｅｄ　Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｎｕｃｌｅｉｃ　ａｃｉｄｓ）法等があげられる。また、各種核酸増幅方法の工程や反応条件等は、制限されず、例えば、従来公知の条件に従って行うことができる。
　前記核酸増幅方法に使用する試薬としては、特に制限されず、従来公知の試薬が使用でき、例えば、ポリメラーゼ、ヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）、緩衝剤、水や緩衝液等の溶媒等があげられる。この他にも、例えば、グリセロ－ル、ヘパリン、ベタイン、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ２、ＭｇＳＯ４等を含んでもよい。
＜核酸回収用試薬＞
　本発明の第１の核酸回収用試薬は、本発明の第１の核酸試料の製造方法に使用するための試薬であり、前記プロテアーゼおよび前記界面活性剤を含む。本発明の第１の核酸回収用試薬は、例えば、本発明の第１の核酸試料の製造方法における第１の処理試薬と同様である。前記核酸回収用試薬において、前記プロテアーゼおよび界面活性剤は、前記細胞試料と混合した際に、前記細胞１×１０２～１×１０９個に対する前記プロテアーゼの割合が、例えば、０．０２ｍＵ以上となり、前記細胞１×１０２～１×１０９個に対する前記界面活性剤の割合が、１フェムトモル以上となるように、配合されていることを特徴とする。
　なお、本発明の第１の核酸回収用試薬は、例えば、前記細胞試料と混合した際、前述の範囲となるように、前記プロテアーゼおよび界面活性剤が配合されていればよい。
　本発明の第２の核酸回収用試薬は、本発明の第２の核酸試料の製造方法に使用するための試薬であり、特に制限されないが、少なくともプロテアーゼを含んでいればよく、前記細胞試料と混合した際に、前記第１の処理試薬と同様の範囲となるように、前記プロテアーゼを含んでいることが好ましい。本発明の第２の核酸回収用試薬は、例えば、本発明の第２の核酸試料の製造方法における第２の処理試薬と同様である。また、本発明の第３の核酸回収用試薬は、本発明の第３の核酸試料の製造方法に使用するための試薬であり、例えば、前記プロテアーゼおよび前記界面活性剤のいずれか一方を含んでもよいし、いずれも含まない溶媒であってもよい。本発明の第３の核酸回収用試薬は、例えば、本発明の第３の核酸試料の製造方法における第３の処理試薬と同様である。本発明の第４の核酸回収用試薬は、本発明の第４の核酸試料の製造方法に使用するための試薬であり、例えば、前記プロテアーゼおよび前記界面活性剤のいずれも含まない溶媒でもよいし、前記プロテアーゼおよび前記界面活性剤のいずれか一方を含み且つ他方が無添加である溶媒であってもよい。本発明の第４の核酸回収用試薬は、例えば、本発明の第４の核酸試料の製造方法における第４の処理試薬と同様である。
　本発明の各核酸回収用試薬は、例えば、液体でも固体であってもよい。液体の場合、例えば、原液をそのまま前述の処理試薬として使用してもよいし、使用前に希釈した希釈液を前述の処理試薬として使用してもよい。固体の場合、例えば、前記細胞試料と混合する前に、前述の処理試薬の溶媒に溶解または分散し、これを前述の処理試薬として使用することもできる。本発明の各核酸回収用試薬は、例えば、さらに他の成分を含んでもよい。本発明の核酸回収用試薬を用いて、例えば、細胞からの核酸の回収ならびに目的配列の核酸増幅を行う場合、本発明の各核酸回収用試薬は、さらに、核酸増幅に必要な成分を適宜含んでもよく、例えば、ポリメラーゼ、ヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）、緩衝剤、水や緩衝液等の溶媒等があげられる。本発明の各核酸回収用試薬は、例えば、本発明の核酸増幅物の製造方法に使用するための製造用試薬ともいえる。
＜核酸回収用キット＞
　本発明の第１の核酸回収用キットは、本発明の第１の核酸試料の製造方法に使用するためのキットであり、前記担体と、前記プロテアーゼと、前記界面活性剤とを含むことを特徴とする。本発明において、前記担体、前記プロテアーゼおよび前記界面活性剤は、前述の通りである。
　本発明の第１の核酸回収用キットは、前記担体として、例えば、後述する、前記担体を有する本発明の核酸回収用チップまたは核酸増幅用チップを含んでもよい。
　本発明の第１の核酸回収用キットにおいて、前記プロテアーゼと前記界面活性剤は、例えば、それぞれ別個の容器に収容されてもよいし、両者が共存して同じ容器に収容されてもよい。前記プロテアーゼと前記界面活性剤とが共存している場合、本発明の第１の核酸回収用キットは、例えば、前記担体と前記本発明の第１の核酸回収用試薬とを含むことが好ましい。前記本発明の第１の核酸回収用試薬は、前述の通りであって、前記プロテアーゼと前記界面活性剤とを含んでいればよく、液体でも固体でもよい。本発明の第１の核酸回収用キットにおいて、前記プロテアーゼと前記界面活性剤との割合は、特に制限されず、例えば、使用時において、前述のような割合となるように使用できればよい。
　本発明の第２の核酸回収用キットは、本発明の第２の核酸試料の製造方法に使用するためのキットであり、特に制限されないが、前記担体と、前記プロテアーゼとを含み、例えば、前記担体と前記本発明の第２の核酸回収用試薬とを含んでもよい。また、本発明の第３の核酸回収用キットは、本発明の第３の核酸試料の製造方法に使用するためのキットであり、例えば、前記担体と、前記プロテアーゼおよび前記界面活性剤のいずれか一方とを含んでもよいし、前記担体と、前記プロテアーゼおよび前記界面活性剤のいずれも含まない溶媒とを含んでもよく、また、例えば、前記担体と前記本発明の第３の核酸回収用試薬とを含んでもよい。本発明の第４の核酸回収用キットは、本発明の第４の核酸試料の製造方法に使用するためのキットであり、例えば、前記担体と、前記プロテアーゼおよび前記界面活性剤のいずれも含まない溶媒とを含んでもよいし、前記担体と、前記プロテアーゼおよび前記界面活性剤のいずれか一方を含み且つ他方が無添加である溶媒とを含んでもよく、また、例えば、前記担体と前記本発明の第４の核酸回収用試薬とを含んでもよい。
　本発明の各核酸回収用キットは、例えば、さらに、使用説明書を含んでもよい。また、本発明の各核酸回収用キットは、例えば、さらに他の成分を含んでもよい。本発明の核酸回収用キットを用いて、例えば、細胞からの核酸の回収ならびに目的配列の核酸増幅を行う場合、本発明の核酸回収用キットは、さらに、核酸増幅に必要な成分を適宜含んでもよく、例えば、ポリメラーゼ、ヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）、緩衝剤、水や緩衝液等の溶媒等があげられる。本発明の核酸回収用キットは、例えば、本発明の核酸増幅物の製造方法に使用するための製造用キットともいえる。
＜核酸回収用チップ＞
　本発明の核酸回収用チップは、本発明の核酸試料の製造方法に使用するためのチップであり、チップ本体と前記担体とを有し、前記チップ本体が、液体の流路を備え、前記流路内に前記担体が配置されていることを特徴とする。本発明の核酸回収用チップと前記本発明の核酸回収用試薬とを使用することによって、例えば、本発明の核酸試料の製造方法を実施できる。
　本発明の核酸回収用チップは、例えば、前記細胞試料および前記処理試薬等の液体が通る流路に、前記担体が配置されていればよく、その他の構成や形状等は何ら制限されない。以下に、本発明の核酸回収用チップの形態を例示するが、本発明は、これには制限されない。
（第１の核酸回収用チップ）
　第１の核酸回収用チップは、例えば、前記チップ本体と前記担体とを有し、前記チップ本体が、液体の流路を有し、前記流路の一端が液体を導入および排出するための第１の開口部を備え、前記流路の他端が圧力制御手段と連結可能な第２の開口部を備え、前記流路内に前記担体が配置されている。前記担体は、例えば、フィルターとなるシート状担体でもよいし、複数のビーズ状担体であってもよい。
　前記第１の核酸回収用チップは、例えば、使用時において、前記第２の開口部に圧力制御手段を連結し、前記圧力制御手段により前記流路を減圧条件に制御することで、液体を前記第１の開口部から前記流路内部に導入し、前記圧力制御手段により前記流路を加圧条件に制御することで、導入された液体を前記第１の開口部から前記流路外部に排出できる。このため、まず、減圧条件で、前記細胞試料を含む前記処理液を前記流路内部に導入すれば、前記処理液が、配置された前記担体を通過する。このため、例えば、前記処理試薬によって細胞試料中の細胞から放出した核酸複合体が、通過の際、前記担体に捕獲される。続いて、加圧状態で、導入された前記処理液を前記流路外部に排出すれば、前記細胞試料由来の不要成分を除去できる。そして、減圧条件で前記分散媒を前記流路内部に導入した後、前記分散媒の存在下で前記担体に加熱処理を施せば、前記担体に捕獲された前記核酸複合体から核酸が前記分散媒中に放出される。そこで、加圧条件で、前記分散媒を前記流路外部に排出すれば、前記核酸を含有する分散媒を、核酸試料として回収できる。核酸回収用チップと圧力制御手段との連結は、直接的であっても間接的であってもよい。なお、前記細胞試料および前記処理試薬の導入方法は、特に制限されず、例えば、予め、前記細胞試料と前記処理試薬とを混合した処理液を準備し、これを導入してもよいし、一方を導入してこれを他方に排出する操作（ピペッティング）を繰り返し、最終的に、前記処理液を導入してもよい。
　このような形態の核酸回収用チップとしては、例えば、吸引装置に装着して使用するピペットチップがあげられる。この場合、例えば、手動や自動のピペッター等の吸引装置が、前記圧力制御手段に該当する。前記第１の核酸回収用チップとして、ピペットチップを例にあげて、図１を用いて説明する。同図は、核酸回収用ピペットチップ（以下、「ピペットチップ」という）の断面図である。同図に示すように、ピペットチップ１は、中空の円錐状本体１３、液体の導出口である第１の開口部１１およびピペッターに装着可能な第２の開口部１２を備え、円錐状本体１３の内部であって、第１の開口部１１側に、担体１０が配置されている。ピペットチップ１において、円錐状本体１３の内部の空隙が、液体の流路ならびに導入された液体の収容部となる。
　前記ピペットチップの大きさや形状は、特に制限されず、例えば、導入する前記細胞試料を含む前記処理液の量に応じて、適宜設定できる。また、本発明の核酸回収用チップは、前述のように、前記担体を備えることが特徴であることから、例えば、市販のピペットチップに前記担体を配置するのみで製造可能である。また、ピペット等の吸引装置への装着方法等も従来と同様に行うことができる。
　ピペットチップ１を使用した核酸試料の製造方法（核酸回収方法）の一例を、図２を用いて説明する。なお、本発明はこれに制限されない。図２は、ピペットチップを用いた核酸試料の製造方法の工程の概略を示した断面図である。図２において、図１と同一箇所には同一符合を付している。
　まず、ピペットチップ１を第２の開口部１２からピペッター（図示せず）に装着する。そして、図２（Ａ）に示すように、ピペッターの操作により、第１の開口部１１から処理液２０を吸引する。その際、吸引した処理液２０の全てが、ピペットチップ１内の担体１０を通過することが好ましい。これによって、処理液２０中に放出された核酸複合体が担体１０に捕獲される。つぎに、図２（Ｂ）に示すように、ピペッターの操作により、吸引した処理液２０を第１の開口部１１から外部に排出する。ここで排出される処理液２０’は、核酸複合体が担体１０により除去されており、核酸回収に不要な成分、例えば、赤血球等を含む液体である。続いて、図２（Ｃ）に示すように、ピペッターの操作により、第１の開口部１１から分散媒３０を吸引する。この際、ピペットチップ１内の担体１０が、吸引した分散媒３０で満たされていることが好ましい。そして、この状態、すなわち、担体１０が分散媒３０中に存在する状態で、前述のような加熱処理を行う。最後に、図２（Ｄ）に示すように、ピペッターの操作により、第１の開口部１１から加熱処理後の分散媒４０を外部に排出する。排出した分散媒４０には、前述のように、担体１０に捕獲されていた前記核酸複合体から放出された核酸が含まれている。この分散媒４０を核酸試料として回収すれば、例えば、核酸増幅の鋳型試料に利用できる。この核酸試料は、図２（Ｂ）で表される工程において、核酸回収に不要な成分が排出されていることから、前記不要成分の含有量も低減されている。
（第２の核酸回収用チップ）
　第２の核酸回収用チップは、例えば、前記チップ本体と前記担体とを有し、前記チップ本体が、液体の流路を有し、前記流路の一端が加圧手段と連結可能であり且つ液体を導入するための第１の開口部を備え、前記流路の他端が液体を排出するための第２の開口部を備え、前記流路内に本発明の核酸回収用担体が配置されている。
　前記第２の核酸回収用チップは、使用時において、前記第１の開口部に加圧手段を連結し、前記加圧手段により液体を加圧することで、前記液体を前記第１の開口部から前記流路内部に導入し、前記加圧手段により前記流路を加圧して、導入された液体を前記第２の開口部から前記流路外部に排出することができる。このため、まず、加圧条件下で前記処理液を前記流路内部に導入すれば、前記処理液は配置された前記担体を通過するため、前記担体に前記処理液中の核酸複合体が捕獲される。つづいて、加圧条件下で導入された前記処理液を前記流路外部に排出すれば、細胞試料由来の不要成分を除去できる。そして、加圧条件で前記分散媒を前記流路内部に導入した後、前記分散媒の存在下で前記担体に加熱処理を施せば、前記担体に捕獲されている前記核酸複合体から核酸が前記分散媒中に解放される。そこで、加圧条件で前記分散媒を前記流路外部に排出すれば、核酸を含有する分散媒を核酸試料として回収できる。なお、核酸回収用チップと加圧手段との連結は、直接的であっても間接的であってもよい（以下、同様）。
　このような形態の核酸回収用チップとしては、例えば、表面に凹状の流路が形成された支持基板と、前記表面を覆うカバー基板とから形成される、いわゆるバイオチップがあげられる。前記第２の核酸回収用チップとして、バイオチップを例にあげて、図３を用いて説明する。同図は、核酸回収用バイオチップ（以下、「バイオチップ」という）の概略を示す模式図であり、（Ａ）は側面図、（Ｂ）は上面図、（Ｄ）は前記（Ｂ）のＡ－Ａ方向断面図である。また、同図（Ｃ）は、バイオチップを構成する支持基板２２の上面図である。同図に示すように、バイオチップ２は、支持基板２２とカバー基板２１とを含む。支持基板２２の表面には、流路２３、流路２３から分岐する流路２７、流路２７に連結された排液部２４、流路２３に連結された核酸含有液（核酸試料）の収容部２５が、凹状の溝として形成されている。カバー基板２１は、支持基板２２の凹状の溝が形成された表面に被覆されており、これによって、流路２３の末端（図において左端）が液体の導入口２６となる。そして、流路２３内部であって、排液部２４および収容部２５との連結部よりも導入口２６側に、担体１０が配置されている。流路２３は、核酸試料の収容部２５と、流路２７を介して排液部２４との両方に連結しているが、排液部２４への液体の導入と収容部２５への液体の導入とは、適宜切り替え可能である。バイオチップの大きさや形状は、特に制限されない。
　バイオチップ２を使用した核酸回収方法として、シリンジ加圧等の加圧送液装置を用いた一例を、図３を用いて説明する。なお、本発明はこれに制限されない。
　加圧送液装置（図示せず）により、導入口２６から処理液を送液する。これによって、送液された処理液は、流路２３内に配置された担体１０を通過して、流路２７を介して排液部２４に収容される。そして、処理液中に放出されている核酸複合体が担体１０に捕獲される。ここで排液部２４に収容される処理液は、前記核酸複合体が担体１０により除去されており、核酸回収に不要な成分、例えば、赤血球等を含む液体である。つぎに、同様にして、加圧送液装置により、導入口２６から分散媒を送液する。この際、流路２３内の担体１０が、分散媒で満たされていることが好ましい。そして、この状態、すなわち、担体１０が分散媒中に存在する状態で、前述のような加熱処理を行う。最後に、加圧送液装置により、加熱処理後の分散媒を、核酸含有液の収容部２５に移動させる。収容部２５に収容された分散媒には、前述のように、捕獲されていた前記核酸複合体から放出された核酸が含まれている。この核酸を含有する分散媒を核酸試料として、例えば、核酸増幅の鋳型試料に利用できる。また、この核酸試料は、核酸回収に不要な成分が排出されていることから、前記不要成分の含有量も低減されている。
　前述の手法は、加圧により液体を導入および排出する例であるが、本発明は、これに制限されない。すなわち、例えば、（１）減圧により液体を導入および排出、（２）加圧により液体を導入して減圧により液体を排出、または、（３）減圧により液体を導入して加圧により液体を排出することもできる。前記（１）の方法に使用する核酸回収用チップとしては、例えば、前記チップ本体が、前記流路の一端に、液体を導入するための第１の開口部を備え、前記流路の他端に、減圧手段と連結可能であり、且つ、液体を排出するための第２の開口部を備えることが好ましい。この核酸回収用チップは、例えば、使用時において、前記第２の開口部に減圧手段を連結し、前記減圧手段により前記流路内部を減圧して、前記液体を前記第１の開口部から前記流路内部に導入し、且つ、導入された液体を前記第２の開口部から前記流路外部に排出することが好ましい。なお、核酸回収用チップと減圧手段との連結は、直接的であっても間接的であってもよい（以下、同様）。また、前記（２）の方法に使用する核酸回収用チップとしては、例えば、前記チップ本体が、前記流路の一端に、加圧手段と連結可能であり、且つ、液体を導入するための第１の開口部を備え、前記流路の他端に、減圧手段と連結可能であり、且つ、液体を排出するための第２の開口部を備えることが好ましい。この核酸回収用チップは、例えば、使用時において、前記第１の開口部に加圧手段を連結し、前記加圧手段により液体を加圧して、前記液体を前記第１の開口部から前記流路内部に導入し、前記第２の開口部に減圧手段を連結し、前記減圧手段により前記流路内部を減圧して、導入された液体を前記第２の開口部から前記流路外部に排出することが好ましい。また、前記（３）の方法に使用する核酸回収用チップとしては、例えば、前記チップ本体が、前記流路の一端に、加圧手段と連結可能であり、且つ、液体を導入するための第１の開口部を備え、前記流路の他端に、減圧手段と連結可能であり、且つ、液体を排出するための第２の開口部を備え、使用時において、前記第２の開口部に減圧手段を連結し、前記減圧手段により前記流路内部を減圧して、前記液体を前記第１の開口部から前記流路内部に導入し、前記第１の開口部に加圧手段を連結し、前記加圧手段により前記流路を加圧して、導入された液体を前記第２の開口部から前記流路外部に排出することが好ましい。これらの形態は、例えば、液体を導入する第１の開口部を加圧手段と連結可能にしたり、液体を排出する第２の開口部を減圧手段と連結可能にする等、組合せによって適宜設定可能である。
　なお、前記担体として、例えば、ビーズ状等の担体を複数使用することもできる。この場合、例えば、前記流路内に前記ビーズ状担体が充填された形態があげられる。本形態においては、例えば、前記流路に前記処理液を送液することで、前記ビーズ状担体の間を前記処理液が通過し、その際に、各ビーズ状担体の表面において前記処理液中の核酸複合体が捕獲される。また、前記ビーズ状担体が、例えば、多孔質体の場合は、外側の表面だけでなく、例えば、空隙部の露出表面においても、前記核酸複合体を捕獲することが可能である。
　本発明の核酸回収用バイオチップは、例えば、さらに、核酸を用いた各種反応を行う反応部および検出部、前記反応に必要な試薬を収容する試薬部等を有していてもよい。具体的には、核酸回収用バイオチップ内において、前記収容部が、流路を介して、反応部と連結されていてもよいし、また、前記反応部が、流路を介して、前記試薬部ならびに検出部等と連結されていてもよい。また、予め、前記収容部に目的の反応に必要な試薬を配置してもよいし、前記収容部が、流路を介して、前記試薬部と連結されてもよい。このような形態においては、例えば、前記収容部が前記反応部となる。このように反応部および検出部等が連結されることによって、例えば、一つのバイオチップ内で、細胞試料からの核酸の回収だけでなく、回収した核酸を用いて目的の反応を行い、さらにその反応結果を測定することも可能となる。このため、本発明を、核酸を用いる各種分析、例えば、核酸増幅やＳＮＰ検出等に利用することで、従来よりもさらに簡便な分析が可能となる。また、本発明の核酸回収用チップは、流路に前記担体を配置するのみで足りることから、例えば、バイオチップの小型化も可能になる。このようなバイオチップのさらなる形態として、以下に、一例として核酸増幅用チップをあげる。
＜核酸増幅用チップ＞
　本発明の核酸増幅用チップは、本発明の核酸増幅物の製造方法に使用するためのチップであって、
チップ本体と担体とを有し、
前記チップ本体が、液体を導入する開口部、排液を収容する排液部、核酸増幅反応を実施する反応部、および、液体の流路を有し、
前記流路の一端が前記開口部であり、
前記流路が、前記排液部および前記反応部と連結され、
前記流路内であって、前記排液部および前記反応部との連結部よりも前記開口部側に、前記担体が配置されていることを特徴とする。本発明の核酸増幅用チップと前記本発明の核酸回収用試薬とを使用することによって、例えば、本発明の核酸試料の製造方法を利用した核酸増幅物の製造方法を実施できる。
　本発明の核酸増幅用チップは、前記処理液、前記細胞試料および前記処理試薬等の液体が通る流路に、前記担体を備えていればよく、その他の構成や形状は制限されない。
　本発明の核酸増幅用チップは、例えば、前記流路（第１の流路）に加え、第２の流路および第３の流路をさらに含み、前記反応部が、前記第２の流路によって直接または間接的に前記第１の流路と連結され、前記排液部が、前記第３の流路によって直接または間接的に前記第１の流路と連結されていてもよい。また、本発明の核酸増幅用チップは、例えば、前記排液部への液体の導入と前記反応部への液体の導入とが切り替え可能であることが好ましい。より具体的には、例えば、前記第２の流路への液体の導入と前記第３の流路への液体の導入とが切り替え可能であることにより、前記排液部への液体の導入と前記反応部への液体の導入とが切り替え可能であることがさらに好ましい。
　本発明において、前記担体に捕獲された前記核酸複合体からの核酸の放出ならびに増幅反応に必要な処理は、ともに加熱処理である。したがって、本発明の核酸増幅用チップによれば、例えば、温度制御手段を備える装置にセットして温度制御を行うのみで、核酸の回収ならびに増幅反応を実施することができる。
　このような形態の核酸増幅用チップとしては、例えば、表面に凹状の流路が形成された支持基板と、前記表面を覆うカバー基板とから形成される、いわゆるバイオチップがあげられる。本発明の核酸増幅用チップとして、バイオチップを例にあげて、図４を用いて説明する。なお、図４に示すバイオチップは、特に示さない限り、図３に示すバイオチップと同様の形態であり、また、同様にして使用できる。
　図４は、核酸増幅用バイオチップ（以下、「バイオチップ」という）の概略を示す模式図であり、（Ａ）は側面図、（Ｂ）は上面図、（Ｄ）は前記（Ｂ）のＡ－Ａ方向断面図である。また、同図（Ｃ）は、バイオチップを構成する支持基板２２の上面図である。同図において、図３と同一箇所には同一符号を付している。同図に示すように、バイオチップ３は、支持基板２２とカバー基板２１とを含む。支持基板２２の表面には、第１の流路２３、第１の流路２３に連結された第３の流路２７、第３の流路２７に連結された排液部２４、第１の流路２３に連結された核酸含有液（核酸試料）の収容部２５、収納部２５に連結された第２の流路３３、第２の流路３３に連結された反応部３１が、凹状の溝として形成されている。カバー基板２１は、支持基板２２の凹状の溝が形成された表面に被覆されており、これによって、流路２３の末端（図において左端）が液体の導入口２６となる。そして、流路２３内部であって、排液部２４および収容部２５との連結部（第３の流路２７との連結部）よりも導入口２６側に、担体１０が配置されている。なお、流路２３は、核酸含有液の収容部２５と第３の流路２７を介して排液部２４との両方に連結しているが、排液部２４への液体の導入と収容部２５への液体の導入とは、適宜切り替え可能である。
　バイオチップ３では、収容部２５に収納された核酸含有液を、例えば、さらに第２の流路３３を介して反応部３１に移動させる。そして、増幅反応に必要な試薬が反応部３１に配置されている場合は、そのまま増幅反応を開始させることができる。また、別個に試薬を収容した試薬部（図示せず）を備える場合には、例えば、試薬部内の試薬を反応部３１に送液した後、増幅反応を開始させることができる。増幅反応の検出は、例えば、反応部３１でそのまま行ってもよいし、さらに、検出部（図示せず）を備える場合は、例えば、反応部３１から反応液を検出部に送液し、前記検出部にて検出を行ってもよい。
　つぎに、本発明の実施例について説明する。ただし、本発明は下記実施例により制限されない。
［実施例１］
　下記表２に示す各種担体（１ａおよび１ｂ）を直径２ｍｍの円形に切り抜き、これを、図５に示すように治具装置にセットした。図５は、担体をセットした治具装置の模式図である。同図において、（Ａ）が、担体をセットした治具装置の上面図、（Ｂ）が、前記（Ａ）のＩ－Ｉ方向断面図、（Ｃ）が、担体に対する液体の通過方向を示す模式図である。治具装置４は、流路２３と担体１０を有しており、流路２３の軸方向中央付近に担体１０が配置されている。具体的には、治具装置４において、担体１０は、アルミ製の凹状部材６ａの凹部に配置され、さらに、前記凹部にアルミ製の凸状部材６ｂの凸部を嵌入することによって、凹状部材６ａと凸状部材６ｂとからなるアルミブロック内に固定されている。なお、図示していないが、前記アルミブロックは、底面（同図（Ｂ）において下側の面）が露出するように、プラスチック製部材で固定されている。この治具装置４を、前記露出した底面が接触するように、ヒートブロック上に配置した。各図において矢印は、液体の進行方向を示す。同図（Ｃ）の矢印に示すように、本実施例において、液体は、担体１０の円形表面から導入され、他方の表面から排出される。
　他方、全血５０μＬと下記表１の処理試薬１－１　５０μＬとを混合して処理液１００μＬを準備した。前記処理液において、全血５０μＬに対して、プロテアーゼの添加量は５．４Ｕであり、界面活性剤の添加割合は０．２５体積％とした。そして、前記処理液１００μＬを、治具装置４の流路２３の一端の開口部から流路２３内部に加圧によって注入し、担体１０を通過させ、流路２３の他端の開口部から排出させた。つぎに、下記表１の洗浄液１００μＬを同様にして注入し、担体１０に通過させた後、排出した。そして、ヒートブロックにより、治具装置４内の担体１０を９６℃で５分間加熱した後、下記表１の分散媒１００μＬを同様にして注入し、担体１０に前記分散媒を通過させ、前記分散媒を排出させた。排出させた前記分散媒を核酸試料とした。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
 　　　　１ａ：商品名ナイロン、ＳＥＦＡＲ社製
　　　　１ｂ：商品名ＭＦ８０Ａ、イノアックコーポレーション社製
　回収した核酸試料について、ゲノムＤＮＡの濃度をＲｅａｌ　Ｔｉｍｅ　ＰＣＲ法により測定した。また、全血５０μＬあたりのゲノムＤＮＡ量の理論値を算出し、下記式から、前記各担体によるゲノムＤＮＡの回収率を算出した。これらの結果を、前記表２にあわせて示す。
　　回収率（％）＝１００×（Ａ×Ｂ）／Ｃ
　　　　　　　Ａ：核酸試料のＤＮＡ濃度
　　　　　　　Ｂ：核酸試料の体積
　　　　　　　Ｃ：全血５０μＬ当たりのＤＮＡ量の理論値
　前記表２に示すように、本実施例の方法によれば、従来とは異なり、例えば、特殊な薬剤を使用することなく、簡便にゲノムＤＮＡを回収できた。また、回収した核酸試料中のゲノムＤＮＡ濃度も、５００ｃｏｐｙ／μＬ以上であり、ＰＣＲ等における必要量であることが確認できた。
［実施例２］
　下記表３に示す各種担体（２ａ～２ｊ）を準備した。２ｂ（織布）、２ｃ（織布）および２ｊ（不織布）の担体は、直径２ｍｍの円形に切り抜いて、厚みが１．５ｍｍとなるように積層し、円柱状の担体とした。残りの担体は、直径２ｍｍ、高さ１．５ｍｍの円柱状に切り抜いた。２ｂ、２ｃおよび２ｊの積層体および他の単層体を、それぞれ円柱状担体として、図６に示すように治具装置にセットした。図６は、前記担体をセットした治具装置の模式図である。同図において、（Ａ）が、治具装置本体と担体とを示す斜視図、（Ｂ）が本体に担体をセットした治具装置の斜視図、（Ｃ）が前記（Ｂ）の上面図、（Ｄ）が前記（Ｃ）のII－II方向断面図である。治具装置５は、直径１ｍｍの流路２３と担体配置部８とを有する本体７、および、担体１０を備え、流路２３の軸方向中央付近に、担体配置部８が設けられ、担体配置部８内に担体１０が配置されている。さらに、図示していないが、担体１０の露出面（同図（Ｄ）において上側の面）は、粘着シートで覆われている。なお、本実施例においては、図６（Ｂ）～（Ｄ）の矢印に示すように、各種液体は、円柱状担体の側面から導入され、側面から排出される。
　他方、全血５０μＬと前記実施例１の処理試薬１－１　５０μＬとを混合して処理液１００μＬを準備した。そして、前記処理液１００μＬを、治具装置５の流路２３の一端の開口部から流路２３内部に加圧によって注入し、担体１０を通過させ、流路２３の他端の開口部から排出させた。つぎに、前記実施例１の洗浄液１００μＬを同様にして注入し、前記洗浄液を担体１０に通過させた後、排出した。そして、治具装置５から担体１０を取り出し、前記実施例１の分散媒１００μＬ中に浸漬させた。そして、前記各担体を９６℃で５分間加熱した。加熱後の前記分散媒を回収し、これを核酸試料とした。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
 　　　　２ａ：商品名ＭＡＰＳ、イノアックコーポレーション社製
　　　　２ｂ：商品名ＰＥＴ１５０－ＨＤ、ＳＥＦＡＲ社製
　　　　２ｃ：商品名９Ｐ－１５０、ＳＥＦＡＲ社製
　　　　２ｄ：商品名ＣＦＳ、イノアックコーポレーション社製
　　　　２ｅ：商品名ＭＦ５０、イノアックコーポレーション社製
　　　　２ｆ：商品名ＭＦ８０、イノアックコーポレーション社製
　　　　２ｇ：商品名８００ＥＡ、倉敷紡績株式会社製
　　　　２ｈ：商品名８０６ＥＡ、倉敷紡績株式会社製
　　　　２ｉ：商品名８５２ＥＡ、倉敷紡績株式会社製
　　　　２ｊ：商品名ＥＭ０２０１０、東レ・ファインケミカル株式会社製
　　　　ＰＰ：ポリプロピレン
　　　　ＰＥ：ポリエチレン
　回収した核酸試料について、前記実施例１と同様に、ゲノムＤＮＡの濃度を測定し、前記各担体によるゲノムＤＮＡの回収率を算出した。これらの結果を、前記表３にあわせて示す。
　実施例２ａの核酸試料については、ミトコンドリアＤＮＡの濃度をＲｅａｌ　Ｔｉｍｅ　ＰＣＲ法により測定した。その結果、約１０５ｃｏｐｙ／μＬであった。
　前記表３に示すように、本実施例の方法によれば、従来とは異なり、例えば、特殊な薬剤を使用することなく、簡便にゲノムＤＮＡを回収できた。回収した核酸試料中のゲノムＤＮＡ濃度も、３０００ｃｏｐｙ／μＬ以上であり、ＰＣＲ等における必要量であることが確認できた。また、ミトコンドリアＤＮＡについても、十分量を回収することができた。
［実施例３］
　まず、全血５０μＬと前記実施例１の処理試薬１－１　５０μＬとを混合して処理液１００μＬを準備した。他方、担体として、下記表４に示す各種担体（実施例３ａ～３ｇ）を直径２ｍｍの円形に切り抜いた。１．５ｍＬ容量のチューブ内に、切り抜いた前記各担体と前記処理液１００μＬとを入れ、ボルテックスで混合した後、前記処理液を除去した。前記チューブ内に、前記実施例１の洗浄液１００μＬを添加し、ボルテックスで混合した後、前記洗浄液を廃棄した。そして、前記チューブから前記各担体を取り出し、新たなチューブ内に、前記実施例１の分散媒１００μＬと共に入れ、９６℃で５分間加熱した。加熱後の前記分散媒を回収し、核酸試料とした。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
 　　　　３ａ：商品名ＬＶ、セルポール工業社製
　　　　３ｂ：商品名ＭＡＰＳ、イノアックコーポレーション社製
　　　　３ｃ：商品名ＰＥＴ２５０－ＨＤ、ＳＥＦＡＲ社製
　　　　３ｄ：商品名ＰＥＴ１５０－ＨＤ、ＳＥＦＡＲ社製
　　　　３ｅ：商品名９Ｐ－１５０、ＳＥＦＡＲ社製
　　　　３ｆ：商品名ＣＦＳ、イノアックコーポレーション社製
　　　　３ｇ：商品名ＥＭ０２０１０、東レ・ファインケミカル株式会社製
　　　　ＰＥ：ポリエチレン
　　　　ＰＰ：ポリプロピレン
　回収した核酸試料について、前記実施例１と同様に、ゲノムＤＮＡの濃度を測定し、前記各担体によるゲノムＤＮＡの回収率を算出した。これらの結果を、前記表４にあわせて示す。
　前記表４に示すように、本実施例の方法によれば、従来とは異なり、例えば、特殊な薬剤を使用することなく、簡便にゲノムＤＮＡを回収できた。また、回収した核酸試料中のゲノムＤＮＡ濃度も、１５００ｃｏｐｙ／μＬ以上であり、ＰＣＲ等における必要量であることが確認できた。
［実施例４］
　１．５ｍＬ容量のチューブ内で、全血５０μＬと前記実施例１の処理試薬１－１　５０μＬとを混合して処理液１００μＬを準備した。前記チューブに、さらに、担体として、下記表５に示す各種磁性ビーズ（実施例４ａおよび４ｂ）を総量１ｍｇ添加して、ボルテックスで混合した。磁石で前記磁性ビーズを回収して、前記チューブ内の前記処理液を除去し、前記チューブ内に、回収した前記磁性ビーズと前記実施例１の洗浄液１００μＬとを入れ、ボルテックスで混合し、再度、前記磁性ビーズを回収して、前記洗浄液を除去した。そして、前記チューブに、回収した前記磁性ビーズと前記実施例１の分散媒１００μＬとを入れ、ボルテックスで混合し、９６℃で５分間加熱した。加熱後、前記チューブを遠心分離に供して前記磁性ビーズを除去し、前記分散媒を回収した。これを核酸試料とした。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
 　　　　４ａおよび４ｂ：商品名ｍｉｃｒｏｍｅｒ（商標）Ｍ、
　　　　　　　　　　　　ｍｉｃｒｏｍｏｄ社製
　　　　　　　　　ＰＳ：ポリスチレン
　回収した核酸試料について、前記実施例１と同様に、ゲノムＤＮＡの濃度を測定し、前記各担体によるゲノムＤＮＡの回収率を算出した。これらの結果を、前記表５にあわせて示す。
　前記表５に示すように、本実施例の方法によれば、従来とは異なり、例えば、特殊な薬剤を使用することなく、簡便にＤＮＡを回収できた。また、回収した核酸試料中のＤＮＡ濃度も、４００ｃｏｐｙ／μＬ以上であり、ＰＣＲ等における必要量であることが確認できた。
［参考例１］
　全血を本発明の核酸回収用試薬（処理試薬）で処理して、フィルター状の担体に保持される核酸複合体を確認した。
　全血１０μＬと下記表６の処理試薬１０μＬとを混合して処理液２０μＬを準備した。担体としては、目開き１００μｍのフィルター（商品名ナイロンメッシュ；ＳＥＦＡＲ社製）を使用した。この処理液２０μＬを、前記実施例１と同様にして、前記担体に通過させた。そして、前記担体を、常法に従ってギムザ染色し、光学顕微鏡で観察した。この結果を、図７に示す。同図の光学顕微鏡写真において、矢印で示すように、直径約２００μｍ程度の紫色で染色された核酸複合体が、担体に付着していることが確認された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
［実施例５］
全血からのＲＮＡの回収
　担体として、商品名ＭＦ－８０Ａ（イノアックコーポレーション社製）を使用した。この担体を直径２ｍｍの円形に切り抜き、前記実施例１と同様にして治具装置にセットした。他方、異なる検体から三種類の全血（新鮮血）を準備し、各全血５０μＬと下記表７の処理試薬５－１　５０μＬとを混合して処理液１００μＬを調製した。前記処理液において、全血５０μＬに対して、プロテアーゼの添加量は１．３５Ｕであり、界面活性剤の添加割合は０．２５体積％である。そして、下記表７の洗浄液および分散媒を使用した以外は、前記実施例１と同様にして、核酸試料を調製した。回収した核酸試料について、One　Step　SYBR　Prime　Script　RT-PCR　Kit　II（TAKARA）およびβ－アクチン用の下記プライマーセットを用いて、ＲＮＡの定量を行った。コントロールとして、同一の全血からQIAamp　RNA　Blood　Mini（QIAGEN社製）を用いて精製した核酸試料についても、同様にＲＮＡの定量を行った。そして、コントロールの回収ＲＮＡ量を１００％とした場合の、本実施例の回収ＲＮＡ量の相対値（％）を求めた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
　その結果、三種類の検体についての結果は、それぞれ５．６％、１２．３％、７．２％であった。この回収率は、例えば、ＲＴ－ＰＣＲの鋳型としては十分量である。したがって、本実施例によれば、従来とは異なり、特殊な薬剤を使用することなく、簡便に必要量のＲＮＡを回収することができた。
［実施例６］
唾液からのゲノムＤＮＡの回収
　まず、唾液１００μＬ（ヒト核酸含有細胞数：約150,000個）と下記表８の各処理試薬１００μＬとを混合して処理液２００μＬを準備した。前記処理液において、唾液５０μＬに対して、プロテアーゼの添加量は１Ｕであり、界面活性剤の添加割合は０．５体積％、１体積％、２体積％である。他方、担体として、孔径６０μｍのＰＥＴ製メッシュ状織布（サンフラテック社製、メッシュサイズ６０μｍ）を使用した。この担体を直径３．５ｍｍの円形に切り抜き、図１に示すピペットチップ（容量２００μＬ）内部に装着した（有効径２．２ｍｍ）。前記有効径とは、前記ピペットチップ内部に装着した前記担体において、実際に通液可能な直径を意味する。このピペットチップをピペッターに装着し、前記処理液２００μＬを吸引吐出した後、前記実施例１の洗浄液２００μＬの吸引吐出を行った。再度、新たな前記洗浄液２００μＬを吸引吐出した後、前記ピペットチップから担体を取り出した。この担体を前記実施例１の分散媒１００μＬに浸漬し、９５℃で５分間加熱することで、核酸試料を得た。これらの核酸試料について、前記実施例１と同様にして、ゲノムＤＮＡの濃度を測定した。これらの結果を、下記表８にあわせて示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
　前記表８に示すように、本実施例の方法によれば、唾液についても、ＰＣＲの鋳型として十分量である３０００ｃｏｐｙ／μＬ程度のゲノムＤＮＡを回収できた。
［実施例７］
口腔粘膜細胞からのゲノムＤＮＡの回収
　まず、綿棒（1P1501V、日本綿棒製)で頬の内側を左右それぞれ１０回、円を描くようにこすり、下記表９の各処理試薬２００μＬに混合して処理液２００μＬ（ヒト核酸含有細胞数：約250,000個）を準備した。前記処理液において、口腔粘膜細胞懸濁液５０μＬに対して、プロテアーゼの添加量は１Ｕであり、界面活性剤の添加量は０．５体積％、１体積％、２体積％である。他方、前記実施例６における担体を装着したピペットチップを用いて、同様にして、核酸試料を調製した。これらの核酸試料について、前記実施例１と同様にして、ゲノムＤＮＡの濃度を測定した。これらの結果を、下記表９にあわせて示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
　前記表９に示すように、本実施例の方法によれば、口腔粘膜細胞についても、ＰＣＲの鋳型として十分量である１０００～２０００ｃｏｐｙ／μＬ程度のゲノムＤＮＡを回収できた。
［実施例８］
培養細胞からのゲノムＤＮＡの回収
　まず、アジア人由来正常臍帯静脈血管内皮細胞（KJB-110、DS　PHARMA　BIOMEDICAL）の培養細胞懸濁液を、生理食塩水で洗浄して培地成分を除去し、前記培養細胞を１×１０３ｃｅｌｌｓ／μＬになるように生理食塩水に懸濁した。前記培養細胞懸濁液１００μＬ（核酸含有細胞数：約１×１０５個）を、下記表１０の各処理試薬１００μＬに混合して処理液２００μＬを準備した。前記処理液において、培養細胞懸濁液５０μＬに対して、プロテアーゼの添加量は１Ｕであり、界面活性剤の添加割合は０．５体積％、１体積％、２体積％とした。他方、前記実施例６における担体を装着したピペットチップを用いて、同様にして、核酸試料を調製した。これらの核酸試料について、前記実施例１と同様にして、ゲノムＤＮＡの濃度を測定した。これらの結果を、下記表１０にあわせて示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
　前記表１０に示すように、本実施例の方法によれば、培養細胞についても、ＰＣＲの鋳型として十分量である数百ｃｏｐｙ／μＬ程度のゲノムＤＮＡを回収できた。
［実施例９］
大腸菌からのプラスミドＤＮＡの回収
　まず、ＩＡＰＰ（膵島アミロイドペプチド）配列を組み込んだプラスミドＤＮＡを有する大腸菌を、ＬＢ培地で１２時間培養した後、培養液１００μＬ（核酸含有細胞数：約１×１０７個）を以下の各処理試薬１００μＬに混合して、処理液２００μＬを準備した。なお、下記表１１の処理試薬９－１で処理する大腸菌は、培養後、培養液のまま－８０℃で凍結し、使用時に２５℃で融解させた後、同様にして前記処理試薬９－１と混合した。前記処理液において、培養細胞懸濁液５０μＬに対して、プロテアーゼの添加量は、０、１Ｕであり、界面活性剤の添加割合は、０体積％、０．５体積％、１体積％、２体積％である。他方、前記実施例６における担体を装着したピペットチップを用いて、同様にして、核酸試料を調製した。これらの核酸試料について、前記実施例１と同様にして、プラスミドＤＮＡの濃度を測定した。また、これらの核酸試料について、２６０ｎｍの吸光度測定から、ゲノムＤＮＡの濃度を測定した。これらの結果を、下記表１１にあわせて示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000011
　前記表１１に示すように、本実施例の方法によれば、大腸菌の培養細胞についても、ＰＣＲの鋳型として十分量である約５０万ｃｏｐｙ／μＬ程度のプラスミドＤＮＡ、約３万ｃｏｐｙ／μＬのゲノムＤＮＡをそれぞれ回収できた。また、各処理試薬９－１を使用した結果から、大腸菌の培養細胞を凍結融解することによって、プロテアーゼおよび界面活性剤を使用することなく、同定度のプラスミドＤＮＡならびにゲノムＤＮＡを回収できることがわかった。
［実施例１０］
全血からのゲノムＤＮＡの回収
　まず、４℃で７０日間冷蔵保存した全血１００μＬ、および、－３０℃で９カ月間凍結保存後、融解した全血１００μＬを、それぞれ、下記表１２の各処理試薬１００μＬに混合して処理液２００μＬを準備した。前記冷蔵保存全血１００μＬ中の核酸含有細胞数は、約580,000個であり、前記凍結融解全血１００μＬ中の核酸含有細胞数は、約560,000個であった。前記処理液において、全血５０μＬに対して、プロテアーゼの添加量は１Ｕ、２Ｕであり、界面活性剤は無添加である。他方、前記実施例６における担体を装着したピペットチップを用いて、同様にして、核酸試料を調製した。これらの核酸試料について、前記実施例１と同様にして、ゲノムＤＮＡの濃度を測定した。これらの結果を、下記表１２にあわせて示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000012
　前記表１２に示すように、本実施例の方法によれば、全血を冷蔵保存または凍結融解することによって、界面活性剤を使用することなしに、ＰＣＲの鋳型として十分量であるゲノムＤＮＡを回収できた。
［実施例１１］
１．新鮮血からのゲノムＤＮＡの回収
　冷蔵または冷凍保存していない採血当日の新鮮全血を、以下に示す種々の条件で処理した後、ゲノムＤＮＡの回収を行った。前記新鮮全血の白血球数は、約５，５００個／μＬであった。
　チューブ内に、５０μＬの下記表１３の処理試薬６と５０μＬの新鮮全血とを入れ、処理液を調製した。なお、前記処理試薬６におけるプロテアーゼおよび界面活性剤の濃度は、下記表１４に示す。また、前記処理液におけるプロテアーゼおよび界面活性剤の濃度は、下記表１４の濃度の１／２である（以下、同様）。他方、担体として、孔径１０５μｍのＰＥＴ製メッシュ状織布（商品名ＰＥＴ１０５、ＳＥＦＡＲ社製、メッシュサイズ１０５μｍ）を準備した。この担体を直径２．５ｍｍの円形に切り抜き、図１に示すピペットチップ（容量２００μＬ）内部に装着した（有効径１．４ｍｍ）。このピペットチップをピペッターに装着し、前記処理液１００μＬの吸引吐出を２０回行い、前記処理液を吐出した。続いて、新たなチューブに洗浄液１（２５０ｍｍｏｌ／Ｌ　ＫＣｌ水溶液）１００μＬを入れ、前記ピペットチップを用いて吸引吐出を１０回行い、前記洗浄液１を吐出した。さらに、新たなチューブに洗浄液２（０．１ｍｍｏｌ／Ｌ　ＥＤＴＡおよび１ｍｍｏｌ／Ｌ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ８．０）１００μＬを入れ、前記ピペットチップへの吸引吐出を１０回行い、前記洗浄液２を吐出した後、前記ピペットチップから担体を取り出した。この担体を、分散媒（０．１ｍｍｏｌ／Ｌ　ＥＤＴＡおよび１ｍｍｏｌ／Ｌ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ８．０）１００μＬに浸漬し、その状態で、５分間９５℃で処理することで、核酸試料を得た。これらの核酸試料について、前記実施例１と同様にして、ゲノムＤＮＡの濃度を測定した。これらの結果を、下記表１４にあわせて示す。なお、プロテアーゼおよび界面活性剤を含む処理試薬を使用した例を実施例Ａ１～Ａ６、いずれか一方または両方が無添加である処理試薬を使用した例を比較例Ａ１～Ａ３とした。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000013
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000014
　前記表１４に示すように、本実施例によれば、新鮮全血から、ＰＣＲの鋳型として十分量である約１００ｃｏｐｙ／μＬ程度のゲノムＤＮＡをそれぞれ回収できた。これに対して、プロテアーゼおよび界面活性剤を添加していない比較例Ａ１、いずれか一方を添加していない比較例Ａ２およびＡ３については、ＤＮＡがほとんど回収できなかった。
２．冷蔵血からのゲノムＤＮＡの回収
　２ヵ月間冷蔵保存した全血を、以下に示す種々の条件で処理した後、ゲノムＤＮＡの回収を行った。前記冷蔵血の白血球数は、約６，９００個／μＬであった。
　前記処理試薬６におけるプロテアーゼおよび界面活性剤の濃度を下記表１５に示す濃度とした以外は、前記新鮮全血と同様にしてゲノムの回収ならびに測定を行った。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000015
　前記表１５の実施例Ｂ１に示すように、冷蔵血であれば、界面活性剤無添加且つプロテアーゼを含む処理試薬で処理した後、前述のように加熱処理することで、ＰＣＲの鋳型として十分量であるゲノムＤＮＡを回収できた。このように、全血を冷蔵保存した場合は、前記処理試薬が界面活性剤を含有しなくても、効率良くＤＮＡを回収できることがわかった。また、前記表１５の実施例Ｂ２に示すように、前記処理試薬が、プロテアーゼの他に、さらに界面活性剤を含むことによって、より一層ゲノムＤＮＡの回収率を向上できることがわかった。これに対して、前記表１５に示すように、プロテアーゼおよび界面活性剤を添加していない比較例Ｂ１については、ＤＮＡがほとんど回収できなかった。
３．凍結血からのゲノムＤＮＡの回収
　－３０℃で２時間凍結保存した全血を、室温解凍して以下に示す種々の条件で処理した後、ゲノムＤＮＡの回収を行った。前記凍結血の白血球数は、約５，５００個／μＬであった。
　前記処理試薬６におけるプロテアーゼおよび界面活性剤の濃度を下記表１６に示す濃度とした以外は、前記新鮮全血と同様にしてゲノムの回収ならびに測定を行った。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000016
　前記表１６の実施例Ｃ１に示すように、凍結融解後の全血であれば、界面活性剤およびプロテアーゼが無添加であっても、前述のように加熱処理することで、ＰＣＲの鋳型として十分量であるゲノムＤＮＡを回収できた。また、実施例Ｃ２およびＣ３に示すように、プロテアーゼを含有する処理試薬を使用することによって、ＤＮＡの回収率を向上でき、さらに、実施例Ｃ４に示すように、プロテアーゼと界面活性剤とを含む処理試薬を使用することで、より一層ＤＮＡの回収率を向上できることがわかった。
　以上のように、本発明によれば、例えば、特殊な試薬を使用することなく、簡便に核酸を回収することができる。さらに、本発明によれば、優れた効率で細胞からの核酸回収が可能であり、例えば、ゲノムＤＮＡやＲＮＡ以外に、ミトコンドリアＤＮＡの回収も可能である。このように、本発明は、安全性ならびに操作性に優れ、且つ、核酸の回収率も優れることから、例えば、少量の細胞試料からでも、核酸増幅等に必要な鋳型核酸を十分量回収することができる。さらに、このように少量の細胞試料からの回収を簡便な操作で行うことが可能であることから、例えば、近年注目されているマイクロチップやマイクロタス等を用いた核酸回収や核酸増幅にも有用といえる。

Claims (31)

  1. 細胞から核酸を回収する核酸試料の製造方法であって、
    下記（Ａ）～（Ｅ）工程を含むことを特徴とする製造方法。
    （Ａ）前記細胞を含む細胞試料について、前記細胞から核酸複合体を放出させる工程
    （Ｂ）前記（Ａ）工程後の前記細胞試料を含む処理液と、担体とを接触させる工程
    （Ｃ）前記担体と前記処理液とを分離する工程
    （Ｄ）前記担体に加熱処理を施す工程
    （Ｅ）前記（Ｄ）工程の前または後、前記担体に分散媒を添加する工程
  2. 前記（Ａ）工程が、プロテアーゼおよび界面活性剤を含む処理試薬と、前記細胞試料とを混合する工程であり、
    前記処理試薬と前記細胞試料とを混合した処理液において、前記プロテアーゼの濃度が０．５ｍＵ／μＬ以上であり、界面活性剤の濃度が、０．１体積％以上である、請求の範囲１記載の製造方法。
  3. 前記処理液において、前記プロテアーゼの濃度が０．５～１０００ｍＵ／μＬであり、前記界面活性剤の濃度が、０．１～２０体積％である、請求の範囲２記載の製造方法。
  4. 前記処理液において、前記細胞１×１０２～１×１０９個に対する前記プロテアーゼの割合が、０．０２ｍＵ以上であり、前記細胞１×１０２～１×１０９個に対する前記界面活性剤の割合が、１フェムトモル（１×１０-１５モル）以上である、請求の範囲２記載の製造方法。
  5. 前記処理液において、前記細胞試料５０μＬに対する前記プロテアーゼの割合が、０．０２ｍＵ以上であり、前記細胞試料５０μＬに対する前記界面活性剤の割合が、１フェムトモル以上である、請求の範囲２記載の製造方法。
  6. 前記プロテアーゼが、プロテイナーゼＫ、キモトリプシン、ペプシン、カテプシンＤおよびパパインからなる群から選択された少なくとも一つのプロテアーゼである、請求の範囲２記載の製造方法。
  7. 前記界面活性剤が、非イオン性界面活性剤である、請求の範囲２記載の製造方法。
  8. 前記非イオン性界面活性剤が、ポリオキシエチレン－ｐ－イソオクチルフェノール、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウリル酸、ポリオキシエチレンノニルフェニルエーテル、および、ノニルフェノールポリチオエトキシレートからなる群から選択された少なくとも一つの界面活性剤である、請求の範囲７記載の製造方法。
  9. 前記処理試薬が、さらに、キレート剤およびタンパク質変性剤の少なくとも一方を含む、請求の範囲２記載の製造方法。
  10. 前記細胞が、真核細胞であり、
    前記（Ａ）工程が、界面活性剤無添加であり且つプロテアーゼを含む処理試薬と、凍結融解後または冷蔵保存後の前記細胞試料とを混合する工程である、請求の範囲１記載の製造方法。
  11. 前記細胞が、血中細胞、唾液中細胞、口腔粘膜細胞、体細胞、生殖細胞および腫瘍細胞からなる群から選択された少なくとも一つである、請求の範囲１記載の製造方法。
  12. 前記細胞が、培養細胞である、請求の範囲１記載の製造方法。
  13. 前記細胞試料が、血液、唾液、口腔粘膜、爪および毛髪からなる群から選択された少なくとも一つである、請求の範囲１記載の製造方法。
  14. 前記細胞試料が、細胞の培養物である、請求の範囲１記載の製造方法。
  15. 前記細胞試料が、未希釈の細胞試料である、請求の範囲１記載の製造方法。
  16. 前記細胞が、原核細胞であり、
    前記（Ａ）工程が、前記原核細胞を含む細胞試料を、凍結融解または冷蔵保存する工程である、請求の範囲１記載の製造方法。
  17. 前記（Ａ）工程において、プロテアーゼ無添加であり且つ界面活性剤を含む処理試薬または界面活性剤無添加であり且つプロテアーゼを含む処理試薬と、凍結融解後または冷蔵保存後の前記細胞試料とを混合する工程である、請求の範囲１６記載の製造方法。
  18. 前記担体が、不織布、織布および多孔質体からなる群から選択された少なくとも一つである、請求の範囲１記載の製造方法。
  19. 前記担体が、多孔質体であり、その平均孔径が、１０～１０００μｍである、請求の範囲１記載の製造方法。
  20. 前記担体が、不織布であり、その目付が、２０～１５０ｇ／ｍ３である、請求の範囲１記載の製造方法。
  21. 前記担体が、織布であり、そのメッシュサイズが、１０～１０００μｍである、請求の範囲１記載の製造方法。
  22. 前記担体の形状が、フィルター状、シート状、ブロック状およびビーズ状からなる群から選択された少なくとも一つである、請求の範囲１記載の製造方法。
  23. 前記担体が、ビーズであり、体積充填率が、０．１～１０％の範囲である、請求の範囲１記載の製造方法。
  24. 前記担体が、ポリマー製担体および金属製担体の少なくとも一方である、請求の範囲１記載の製造方法。
  25. 前記ポリマーが、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリエステル、ポリアミド、ポリウレタン、ポリエーテル、ポリスチレン、ポリ塩化ビニルおよびポリテトラフルオロエチレンからなる群から選択された少なくとも一つのポリマーである、請求の範囲２４記載の製造方法。
  26. 前記金属が、ステンレス、チタンおよびアルミニウムからなる群から選択された少なくとも一つである、請求の範囲２４記載の製造方法。
  27. 前記（Ｄ）工程における加熱温度が、５０～１３０℃である、請求の範囲１記載の製造方法。
  28. 前記（Ｄ）工程における加熱時間が、１～３０分である、請求の範囲１記載の製造方法。
  29. 前記核酸が、ＤＮＡおよびＲＮＡの少なくとも一方である、請求の範囲１記載の製造方法。
  30. 前記ＤＮＡが、ゲノムＤＮＡおよびミトコンドリアＤＮＡの少なくとも一方である、請求の範囲２９記載の製造方法。
  31. 核酸増幅方法により、目的配列の核酸増幅物を製造する方法であって、
    下記（ａ）および（ｂ）工程を含むことを特徴とする核酸増幅物の製造方法。
    （ａ）請求の範囲１記載の核酸試料の製造方法により、細胞を含む細胞試料から核酸試料を回収する工程
    （ｂ）前記（ａ）工程で回収した前記核酸試料中の核酸を鋳型として、核酸増幅方法により、前記鋳型における目的配列の核酸増幅物を製造する工程
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