WO2009110507A1 - サッカロマイセス・セレビシエ変異株、及び該変異株を用いたｒｎａ高含有酵母の製造方法 - Google Patents

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saccharomyces cerevisiae
yeast
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culture
rna content
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佳津恵 山本
松本　健史
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アサヒビール株式会社
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    • C12P1/00—Preparation of compounds or compositions, not provided for in groups C12P3/00 - C12P39/00, by using microorganisms or enzymes
    • C12P1/02—Preparation of compounds or compositions, not provided for in groups C12P3/00 - C12P39/00, by using microorganisms or enzymes by using fungi
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
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    • C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
    • C12N1/16—Yeasts; Culture media therefor
    • C12N1/18—Baker's yeast; Brewer's yeast
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    • C12P19/34—Polynucleotides, e.g. nucleic acids, oligoribonucleotides
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    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/645—Fungi ; Processes using fungi
    • C12R2001/85—Saccharomyces
    • C12R2001/865—Saccharomyces cerevisiae

Definitions

  • the present invention relates to a Saccharomyces cerevisiae mutant having a high RNA content, a method for producing an RNA-rich yeast using the mutant, a culture of the mutant, and a yeast extract.
  • Saccharomyces yeasts such as brewer's yeast and baker's yeast contain natural vitamin B groups, amino acids, minerals, etc. in a well-balanced manner, and are effectively used in addition to being used for producing beer and bread.
  • dry yeast has been used in Japan for many years as a pharmaceutical, food material, seasoning, etc., and is recognized as a material with high nutritional value and safety. In recent years, it has also been widely used as a raw material yeast for yeast extract.
  • Yeast extract is prepared from a yeast culture and contains abundant amino acids and has been used as a food additive such as a seasoning for imparting umami and richness.
  • a seasoning for imparting umami and richness.
  • the demand for yeast extract as a seasoning is increasing.
  • Yeast extract prepared from yeast containing abundant taste components can be expected to be used as a better seasoning, and therefore, development of yeasts containing more taste components has been actively conducted.
  • RNA ribonucleic acid
  • inosinic acid or guanylic acid which are nucleic acid-like taste components
  • yeast extract containing abundant nucleic acid-tasting components and enhanced umami components
  • RNA-rich yeast For example, (1) Candida utilis mutant strain having low temperature sensitivity and producing and accumulating RNA of 20% by weight or more per cell weight, and aerobically cultivating the mutant strain, the yeast A method for producing a yeast with a high RNA content that produces and accumulates 20% by weight or more of RNA in a microbial cell is disclosed (for example, see Patent Document 1). Also, (2) a novel yeast strain Candida tropicalis having a very high RNA content in the bacterial cells and the yeast strain are cultured, and RNA is extracted from the cultured bacterial cells. A method for producing yeast RNA is disclosed (for example, see Patent Document 2). JP-A-11-196859 Japanese Patent Publication No.55-49837
  • the yeasts disclosed in Patent Documents 1 and 2 are yeasts with a high RNA content, but they are Candida yeasts. In Saccharomyces yeasts, particularly Saccharomyces cerevisiae, which are widely used for foods, No known high RNA mutants were known. Furthermore, the yeast disclosed in Patent Document 1 is sensitive to low temperature, and its proliferative ability is reduced when the culture temperature is 30 ° C. or lower. By culturing under the culture conditions in which this proliferative ability is somewhat reduced, RNA is highly accumulated in yeast cells, and there is a problem that the optimum conditions for growth and the optimum conditions for RNA accumulation are different.
  • the present invention provides a Saccharomyces cerevisiae mutant having a high RNA content and good growth, a method for producing a high RNA yeast using the mutant, and a culture and yeast extract of the mutant. For the purpose.
  • the present inventors screened a yeast strain having a high RNA content from a yeast library of Saccharomyces cerevisiae, and then backcrossed the yeast strain to obtain an RNA content. Saccharomyces cerevisiae ABYC1591 strain having a high growth rate and good growth was found and the present invention was completed.
  • the present invention provides a Saccharomyces cerevisiae mutant having an RNA content of 14% by weight or more per dry cell weight.
  • the present invention also provides the Saccharomyces cerevisiae mutant strain according to (1) above, wherein the RNA content is 18% by weight or more per dry cell weight.
  • the present invention provides the Saccharomyces cerevisiae mutant strain according to (1) or (2) above, wherein the Saccharomyces cerevisiae mutant strain is ABYC1591 strain (FERM BP-10925). To do.
  • the present invention provides a method for cultivating the Saccharomyces cerevisiae mutant strain according to any one of (1) to (3) above, wherein 14% by weight or more of RNA per dry cell weight is contained in the mutant strain. It is intended to provide a method for producing a yeast with a high RNA content.
  • the present invention also provides a culture of the Saccharomyces cerevisiae mutant according to any one of (1) to (3) above.
  • the present invention also provides a yeast extract prepared from the culture of the Saccharomyces cerevisiae mutant according to any one of (1) to (3) above.
  • this invention provides the yeast extract of said (6) characterized by the RNA content being 35 weight% or more.
  • this invention provides the yeast extract of said (6) characterized by the total content of inosinic acid (IMP) and guanylic acid (GMP) being 20 weight% or more. .
  • the Saccharomyces cerevisiae mutant of the present invention is a yeast having a high RNA content and good growth. Therefore, by culturing the Saccharomyces cerevisiae mutant, a yeast with a high RNA content can be easily produced. Further, the culture and yeast extract of the Saccharomyces cerevisiae mutant have a sufficiently high RNA content, so that the umami is enhanced and is very suitable as a seasoning.
  • the dry cell weight means the weight after the cells are dried.
  • the yeast culture is first centrifuged to collect the cells as a precipitate. This can be determined by measuring the weight of the collected cells after washing twice with a centrifugal separation and then drying at 105 ° C. for 5 hours.
  • the RNA content per dry cell weight of the Saccharomyces cerevisiae mutant of the present invention can be determined by a method usually performed when the RNA content in a microorganism is quantified.
  • the Saccharomyces cerevisiae mutant of the present invention is characterized in that the RNA content is 14% by weight or more per dry cell weight. This is because when the RNA content per dry cell weight is as high as 14% by weight or more, the RNA content of the culture or yeast extract obtained from this Saccharomyces cerevisiae mutant can be easily increased. In the Saccharomyces cerevisiae mutant of the present invention, the RNA content is more preferably 18% by weight or more per dry cell weight. Such a Saccharomyces cerevisiae mutant can be obtained, for example, as follows.
  • each Saccharomyces cerevisiae yeast was inoculated into 10 mL of YPD medium (2% peptone, 1% yeast extract, 2% glucose) and pre-cultured overnight in a 30 ° C. incubator.
  • the obtained preculture was inoculated into 50 mL of YPD medium so that the initial bacterial count was 1 ⁇ 10 7 cells / mL, and cultured with shaking at 200 rpm in a 30 ° C. incubator for 16 hours.
  • the cells were collected from the obtained culture, and the RNA content in the cells was measured in the same manner as in Example 1 described later. As a result, the RNA content in most yeasts was less than about 10% by weight per dry cell weight, and 5 strains were 10% by weight or more. In addition to these five strains, one strain that was less than about 10% by weight per dry cell weight was selected as a control. The RNA content of each of the 6 selected strains was measured again by the same method. Table 1 shows the RNA content in each yeast obtained as a result of the measurement.
  • RNA content in one strain was about 8% by weight per dry cell weight, but the other five strains were all 10% by weight or more.
  • No. The 4 strains 3 to 6 were all 14% by weight or more, and were found to be yeasts with high RNA content.
  • no. Six strains were about 17.8% by weight and had a very high RNA content.
  • RNA content of each yeast was measured in the same manner as Example 1 described later. The growth of each yeast was judged by centrifuging the cultured medium at 15,000 rpm and calculating the cell concentration per 100 mL of the medium from the dry weight of the cells obtained as a precipitate.
  • Table 2 shows No. It is the table
  • the growth of each strain was expressed as the cell concentration after culture. From this result, the backcrossed end strain is No. Although it was a yeast with a high RNA content like the 6 parent strains, it was clear that the growth was sufficiently improved compared to the parent strain.
  • the obtained backcrossed strain and No. Six strains were crossed to produce a mutant strain. Measure the growth and RNA content of the obtained mutant strain, select the mutant strain with good growth and RNA content of 14% by weight or more per dry cell weight, and high RNA content
  • the yeast of the present invention having excellent growth properties was obtained.
  • the obtained yeast was named ABYC1591 strain.
  • Bacteriological properties of ABYC1591 strain ABYC1591 strain is identical to the general mycological properties of Saccharomyces cerevisiae, except that the RNA content is 14% by weight or more per dry cell weight.
  • a colony obtained by culturing ABYC1591 strain on a YPD plate medium containing 2% agar at 30 ° C. for 2 days has the following morphological characteristics. (1) Size: about 2 mm in diameter, (2) color tone: white to cream color, (3) shape: circular bulge in a half-lens shape on all edges, (4) surface shape: smooth, (5) transparency: opaque (6) Viscosity: butter-like.
  • the ABYC1591 strain thus obtained is a Saccharomyces cerevisiae mutant having an RNA content of 14% by weight or more per dry cell weight, and is a Saccharomyces cerevisiae mutant of the present invention.
  • the ABYC1591 strain is a Saccharomyces cerevisiae mutant newly produced by crossing the spore obtained by the tetramolecular analysis with the IFO10611 strain in the present invention, and has a much higher RNA content than the known strain.
  • this yeast strain has an unprecedented property that it has good growth properties. Therefore, the applicant deposits ABYC1591 strain as a new yeast in the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology Patent Biological Deposit Center (1st, 1st East, 1-chome, Tsukuba, Ibaraki, Japan, 6th zip code (305-8565)) did.
  • the acceptance number is FERM BP-10925, and the acceptance date is October 19, 2007.
  • a yeast with a high RNA content can be easily produced.
  • the medium used for culturing the Saccharomyces cerevisiae mutant of the present invention is not particularly limited as long as it contains a carbon source, a nitrogen source, an inorganic salt, and the like, and the Saccharomyces cerevisiae mutant can grow. Any medium usually used for culturing yeasts such as Saccharomyces cerevisiae can be used.
  • Examples of the carbon source contained in the medium for culturing the Saccharomyces cerevisiae mutant of the present invention include, for example, glucose, sucrose, acetic acid, ethanol, molasses, and sulfite pulp waste liquid that are used for normal microorganism culture. 1 or 2 or more types selected from the group which consists of can be used.
  • the nitrogen source may be a nitrogen-containing inorganic salt or a nitrogen-containing organic substance. For example, one or more selected from the group consisting of urea, ammonia, ammonium sulfate, ammonium chloride, ammonium phosphate, corn steep liquor (CSL), casein, yeast extract, and peptone can be used.
  • a phosphoric acid component such as lime superphosphate or phosphorous acid
  • a potassium component such as potassium chloride or potassium hydroxide
  • a magnesium component such as magnesium sulfate or magnesium hydrochloride, or the like
  • inorganic salts such as zinc, copper, manganese, and iron ions may be used.
  • vitamins, nucleic acid-related substances and the like may be appropriately added to the medium for culturing the Saccharomyces cerevisiae mutant of the present invention. Examples of such a medium include a YPD medium.
  • the culture format is not particularly limited, and can be appropriately determined in consideration of the culture scale, the intended use of the obtained culture, and the like. For example, it may be applied to an agar plate medium and cultured, or may be cultured in a liquid medium.
  • Examples of the culture format in the liquid medium include batch culture, fed-batch culture, and continuous culture.
  • the culture format in the liquid medium include batch culture, fed-batch culture, and continuous culture.
  • fed-batch culture or continuous culture is preferably performed.
  • the culture conditions of the Saccharomyces cerevisiae mutant of the present invention are not particularly limited, and can be cultured under conditions generally used when culturing Saccharomyces yeasts.
  • the culture temperature is preferably 20 to 40 ° C, more preferably 25 to 35 ° C.
  • the pH of the medium is preferably 3.5 to 8.0, and more preferably 4.0 to 6.0.
  • the Saccharomyces cerevisiae mutant of the present invention is preferably cultured under aerobic conditions in the same manner as other Saccharomyces yeasts.
  • the aeration condition is preferably 0.5 to 2 vvm, more preferably 0.8 to 1.5 vvm.
  • Saccharomyces of the present invention can be obtained by batch culture using YPD medium under the conditions of 25 to 35 ° C., stirring number of 180 to 400 rpm, aeration rate of 0.8 to 1.5 vvm, and pH of 4.0 to 5.0.
  • the RNA content of the cerevisiae mutant can be 14% by weight or more per dry cell weight.
  • the RNA content of the Saccharomyces cerevisiae mutant of the present invention can be 18% by weight or more per dry cell weight.
  • a culture having a sufficiently high RNA content can be obtained as compared with the case where a known strain of Saccharomyces cerevisiae is used. For this reason, a yeast extract with a high nucleic acid content with an RNA content of 35% by weight or more can be prepared by using the culture.
  • a good yeast extract in which the total content of inosinic acid (IMP) and guanylic acid (GMP) is 20% by weight or more and the umami component is enhanced can be prepared.
  • the preparation of the yeast extract from the culture of the Saccharomyces cerevisiae mutant of the present invention is not particularly limited, and any of the preparation methods commonly used for preparing the yeast extract may be used.
  • the preparation method include a self-digestion method that solubilizes cells by using a proteolytic enzyme or the like inherent in yeast cells, and an enzyme decomposition that solubilizes cells by adding an enzyme preparation derived from microorganisms or plants.
  • hot water extraction method to solubilize cells by immersing in hot water for a certain period of time acid / alkaline decomposition method to solubilize cells by adding various acids or alkalis, freezing and thawing once
  • acid / alkaline decomposition method to solubilize cells by adding various acids or alkalis
  • freezing and thawing once There are a freeze-thaw method for crushing bacterial cells by performing the above, a physical crushing method for crushing bacterial cells by physical stimulation, and the like.
  • physical stimulation used in the physical crushing method include ultrasonic treatment, homogenization under high pressure, and grinding by mixing with a solid material such as glass beads.
  • dry yeast cells having a high RNA content can be obtained by subjecting the culture of the Saccharomyces cerevisiae mutant of the present invention to a drying treatment.
  • the method for drying the culture is not particularly limited, and any of the methods commonly used for preparing dry yeast cells may be used. Examples of the preparation method include freeze-drying method, spray drying method, drum drying method and the like.
  • a dry yeast powder having a high RNA content and excellent handleability can be obtained.
  • the culture itself of the Saccharomyces cerevisiae mutant of the present invention, and a preparation prepared from the culture such as yeast extract and dried yeast cells can be used particularly suitably as food additives such as seasonings.
  • the food or drink to be added is not particularly limited, and examples thereof include alcoholic beverages, soft drinks, fermented foods, seasonings, soups, breads, and confectionery.
  • the culture and the like can be consumed as a supplement or the like by processing into soft capsules, hard capsules, tableted tablets or the like.
  • Example 1 Production of yeast with high RNA content
  • ABYC1591 strain was inoculated into a 2% agar-containing YPD plate medium, and left to stand overnight in a 30 ° C incubator to prepare a subculture plate. Stored at 4 ° C.
  • a platinum loop ABYC1591 strain colony was collected from the subculture plate, inoculated into 50 mL of YPD medium, and cultured overnight at 30 ° C. as a preculture solution. Thereafter, 1.5 L of YPD medium is added to a 5 L jar fermenter (manufactured by Maruhishi Bioengineer), and a preculture is further added, so that the initial bacterial count becomes 1 ⁇ 10 7 cells / mL.
  • RNA content in the microbial cells was specifically measured by the method described below.
  • the collected culture was centrifuged to recover the contained yeast as a precipitate and washed with distilled water. Thereafter, a sample suspended by adding an appropriate amount of distilled water so that the absorbance at 660 nm (OD 660 ) was about 50 to 100 was used as a measurement sample. 250 ⁇ L of the measurement sample and 250 ⁇ L of 3.3 M sodium chloride solution were mixed and heated at 100 ° C. for 1 hour.
  • Both the blank solution and the sample solution were ultrafiltered using an Ultrafree (registered trademark) -MC centrifugal filter unit (10,000 NMWL, manufactured by Millipore), and the nucleic acid content in each solution was determined using HPLC. It was measured. The nucleic acid component was calculated as the disodium salt heptahydrate.
  • the HPLC was performed under the following conditions.
  • HPLC apparatus LC-10ADVP (manufactured by Shimadzu Corporation)
  • Flow rate 1.0 mL / min
  • Detection wavelength 254 nm Analysis time: 30 minutes
  • Table 3 is a table showing the time after the start of culture and the RNA content of the bacterial cells in the culture.
  • the RNA content of the bacterial cells in the culture was the largest at 9 hours after the start of the culture, and was 21.4% by weight. Further, even at 18 hours after the start of the culture, the content was very high at 16.3% by weight.
  • the known strain of Saccharomyces cerevisiae is usually 10% by weight or less at 18 hours after the start of culture. That is, it is clear from the results of Example 1 that the Saccharomyces cerevisiae mutant of the present invention is a yeast with a very high RNA content.
  • Example 2 Preparation of yeast extract First, in the same manner as in Example 1, the ABYC1591 strain was inoculated and cultured in a YPD medium, and a culture 18 hours after the start of the culture was obtained. When the amount of RNA contained in the ABYC1591 strain in the obtained culture was measured in the same manner as in Example 1, it was 14.6% by weight per dry cell weight. Next, by centrifuging the culture, the contained yeast was recovered as a precipitate and washed with distilled water. Thereafter, an appropriate amount of distilled water was added so that the bacterial cell concentration was 10 to 15% to prepare a yeast suspension.
  • the yeast suspension was prepared so as to have a pH of 5, a cell wall lytic enzyme was added, and the mixture was kept at 50 ° C. for 17 hours. Thereafter, the yeast suspension is centrifuged to recover the supernatant extract, adjusted to pH 5.5, RNase and deaminase are added, and the enzyme is incubated at 50 ° C. for 17 hours. Reaction was performed. After inactivating the enzyme at 80 ° C., the yeast extract was prepared by filtration, sterilization, and drying. When the RNA content in the obtained yeast extract was measured in the same manner as in Example 1, it was 43.4% by weight. Moreover, the total content of inosinic acid and guanylic acid as taste components was 24.4% by weight. From this result, it is clear that a good yeast extract with a high RNA content can be prepared by using the Saccharomyces cerevisiae mutant of the present invention.
  • RNA content in the yeast extract prepared from the culture of S288C strain was 17.2% by weight, and the total content of inosinic acid and guanylic acid as the taste components was 7.9% by weight.
  • yeast extracts prepared in Example 2 and the yeast extract prepared in Comparative Example 1 were dissolved in 40% hot water to 1% each to prepare a yeast extract solution.
  • yeast extract solutions were tasted, the yeast extract solution of Example 2 was thicker and deeper than the yeast extract solution of Comparative Example 1.
  • both yeast extracts were added so that it might become 1% with respect to commercially available consomme soup, respectively.
  • the yeast extract-added soup of Example 2 showed a better taste with a deeper taste than the yeast extract-added soup of Comparative Example 1.
  • the Saccharomyces cerevisiae mutant of the present invention has a high RNA content, and by culturing the mutant, a yeast culture or yeast extract having a high RNA content can be easily produced, particularly in the food field. It can be used.

Abstract

　本発明により、ＲＮＡ含量が乾燥菌体重量当たり１４重量％以上であることを特徴とする、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）変異株、サッカロマイセス・セレビシエＡＢＹＣ１５９１株（ＦＥＲＭ　ＢＰ－１０９２５）が提供される。また、前記いずれかに記載のサッカロマイセス・セレビシエ変異株を培養し、当該変異株菌体内に、乾燥菌体重量当たり１４重量％以上のＲＮＡを含有させることを特徴とする、ＲＮＡ高含有酵母の製造方法、前記いずれかに記載のサッカロマイセス・セレビシエ変異株の培養物、及び該培養物から調製した酵母エキスが提供される。本発明のサッカロマイセス・セレビシエ変異株は、ＲＮＡ含有量が高く、かつ増殖性が良好である。

Description

サッカロマイセス・セレビシエ変異株、及び該変異株を用いたＲＮＡ高含有酵母の製造方法
　本発明は、ＲＮＡ含量が高いサッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）変異株、該変異株を用いたＲＮＡ高含有酵母の製造方法、並びに、該変異株の培養物及び酵母エキスに関する。
　本願は、２００８年３月６日に日本に出願された特願２００８－０５６８４０号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
　ビール酵母やパン酵母を始めとするサッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）酵母は、天然のビタミンＢ群、アミノ酸、ミネラル等をバランス良く含有しており、ビールやパンの製造に使われる以外にも有効活用されている。例えば、乾燥酵母は我が国において長年にわたって医薬品、食品原料、調味料などとして使われており、栄養価と安全性の高い素材として認知されている。また、近年は酵母エキスの原料酵母としても広く用いられている。
　酵母エキスとは、酵母の培養物から調製され、アミノ酸等を豊富に含むものであり、従来から、旨味やコクを付与するための調味料等のような食品添加剤として使用されている。特に昨今の天然志向の高まりから、調味料としての酵母エキスの需要は増加傾向にある。呈味成分を豊富に含む酵母から調製された酵母エキスは、より優れた調味料として使用し得ることが期待できるため、呈味成分をより多く含む酵母の開発が盛んに行われている。
　例えば、ＲＮＡ（リボ核酸）を酵素処理等することにより、核酸性呈味成分であるイノシン酸やグアニル酸を生成することができる。このため、ＲＮＡを多く含む酵母を用いて酵母エキスを調製することにより、核酸性呈味成分を豊富に含み、旨味成分が増強された酵母エキスを得ることができる。
　ＲＮＡ高含有酵母を得るために、様々な方法が開示されている。例えば、（１）低温感受性を有し、ＲＮＡを菌体重量当たり２０重量％以上生成蓄積するキャンディダ・ウチリス（Ｃａｎｄｉｄａ　ｕｔｉｌｉｓ）変異株と、該変異株を好気的に培養して、該酵母菌体内に２０重量％以上のＲＮＡを生成蓄積せしめるＲＮＡ高含有酵母の製造方法が開示されている（例えば、特許文献１参照。）。また、（２）菌体中のＲＮＡ含有率が極めて高い新酵母菌株キャンディダ・トロピカリス（Ｃａｎｄｉｄａ　ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）と、該酵母菌株を培養し、その培養菌体からＲＮＡを抽出することを特徴とする酵母ＲＮＡの製造方法が開示されている（例えば、特許文献２参照。）。
特開平１１－１９６８５９号公報 特公昭５５－４９８３７号公報
　特許文献１及び２において開示されている酵母は、いずれもＲＮＡ高含有酵母であるものの、キャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）酵母であり、食用として汎用されているサッカロマイセス酵母、特にサッカロマイセス・セレビシエにおいては、このようなＲＮＡ高含有変異株について知られてはいなかった。
　さらに、特許文献１において開示されている酵母は、低温感受性であり、培養温度が３０℃以下となると増殖性が低下するが、この増殖性がやや低下した培養条件下で培養することにより、該酵母菌体内にＲＮＡを高蓄積させるものであり、増殖の至適条件とＲＮＡ蓄積の至適条件とが異なるという問題がある。
　本発明は、ＲＮＡ含有量が高く、かつ増殖性が良好なサッカロマイセス・セレビシエ変異株、該変異株を用いたＲＮＡ高含有酵母の製造方法、並びに、該変異株の培養物及び酵母エキスを提供することを目的とする。
　本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究した結果、サッカロマイセス・セレビシエの酵母ライブラリーからＲＮＡ含有量の高い酵母株をスクリーニングした後、該酵母株を戻し交配することにより、ＲＮＡ含有量が高く、かつ増殖性が良好なサッカロマイセス・セレビシエＡＢＹＣ１５９１株を見出し、本発明を完成させた。
（１）　本発明は、ＲＮＡ含量が乾燥菌体重量当たり１４重量％以上であることを特徴とする、サッカロマイセス・セレビシエ変異株を提供するものである。
（２）　また、本発明は、ＲＮＡ含量が乾燥菌体重量当たり１８重量％以上であることを特徴とする、前記（１）に記載のサッカロマイセス・セレビシエ変異株を提供するものである。
（３）　また、本発明は、サッカロマイセス・セレビシエ変異株が、ＡＢＹＣ１５９１株（ＦＥＲＭ　ＢＰ－１０９２５）であることを特徴とする、前記（１）又は（２）に記載のサッカロマイセス・セレビシエ変異株を提供するものである。
（４）　また、本発明は、前記（１）～（３）のいずれかに記載のサッカロマイセス・セレビシエ変異株を培養し、当該変異株菌体内に、乾燥菌体重量当たり１４重量％以上のＲＮＡを含有させることを特徴とする、ＲＮＡ高含有酵母の製造方法を提供するものである。
（５）　また、本発明は、前記（１）～（３）のいずれかに記載のサッカロマイセス・セレビシエ変異株の培養物を提供するものである。
（６）　また、本発明は、前記（１）～（３）のいずれかに記載のサッカロマイセス・セレビシエ変異株の培養物から調製した酵母エキスを提供するものである。
（７）　また、本発明は、ＲＮＡ含量が３５重量％以上であることを特徴とする、前記（６）記載の酵母エキスを提供するものである。
（８）　また、本発明は、イノシン酸（ＩＭＰ）及びグアニル酸（ＧＭＰ）の合計含量が２０重量％以上であることを特徴とする、前記（６）記載の酵母エキスを提供するものである。
　本発明のサッカロマイセス・セレビシエ変異株は、ＲＮＡ含有量が高く、かつ増殖性が良好な酵母である。このため、該サッカロマイセス・セレビシエ変異株を培養することにより、簡便にＲＮＡ高含有酵母を製造することができる。また、該サッカロマイセス・セレビシエ変異株の培養物及び酵母エキスは、ＲＮＡ含有量が十分に高いため、旨味が増強されており、調味料として非常に好適である。
　本発明においては、乾燥菌体重量とは、菌体を乾燥させた後の重量を意味する。乾燥後の菌体重量は、例えば、まず、酵母の培養物を遠心分離処理することにより、菌体を沈殿として回収する。回収した菌体を遠心分離操作により２回水洗した後、１０５℃で５時間乾燥させた後の重量を測定することにより、求めることができる。また、本発明のサッカロマイセス・セレビシエ変異株の乾燥菌体重量当たりのＲＮＡ含量は、微生物中のＲＮＡ含量を定量する場合に通常行われる方法により求めることができる。
　本発明のサッカロマイセス・セレビシエ変異株は、ＲＮＡ含量が乾燥菌体重量当たり１４重量％以上であることを特徴とする。乾燥菌体重量当たりのＲＮＡ含量が１４重量％以上と高いことにより、このサッカロマイセス・セレビシエ変異株から得られる培養物や酵母エキス等のＲＮＡ含量を、容易に高くすることができるためである。本発明のサッカロマイセス・セレビシエ変異株においては、ＲＮＡ含量が乾燥菌体重量当たり１８重量％以上であることがより好ましい。
　このようなサッカロマイセス・セレビシエ変異株は、例えば、以下のようにして取得することができる。
１．ＲＮＡ高含有サッカロマイセス・セレビシエ変異株のスクリーニング
　本発明者らは、まず、市販の酵母を含む約２００株の入手可能なサッカロマイセス・セレビシエ酵母の、それぞれのＲＮＡ含有量を測定した。具体的には、各サッカロマイセス・セレビシエ酵母を、それぞれ１０ｍＬのＹＰＤ培地（２％ペプトン、１％酵母エキス、２％グルコース）に植菌し、３０℃のインキュベーター中で一晩前培養した。得られた前培養液を初発菌数が１×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように５０ｍＬのＹＰＤ培地に植菌し、３０℃のインキュベーター中で１６時間、攪拌数２００ｒｐｍで振とう培養した。
　得られた培養物から、菌体を回収し、該菌体中のＲＮＡ含有量を後記実施例１と同様にして測定した。
　この結果、大部分の酵母中のＲＮＡ含有量は、乾燥菌体重量当たり約１０重量％未満であり、１０重量％以上であった株は５株であった。これらの５株に加え、対照として乾燥菌体重量当たり約１０重量％未満であった１株を選抜した。
　選抜された６株のそれぞれのＲＮＡ含有量を再度同じ方法により測定した。測定の結果得られた各酵母中のＲＮＡ含有量を表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　表１に示したように、Ｎｏ．１株中のＲＮＡ含有量は乾燥菌体重量当たり約８重量％程度であったが、その他の５株はいずれも１０重量％以上であった。中でもＮｏ．３～６の４株はいずれも１４重量％以上であり、ＲＮＡ高含有酵母であることが明らかとなった。
　特にＮｏ．６株は、約１７．８重量％であり、非常にＲＮＡ含有量が高かった。
２．Ｎｏ．６株の改良
　最もＲＮＡ含有量が高かったＮｏ．６株は、一倍体酵母であり、安定性に問題があった。一方、Ｎｏ．６株の親株は、二倍体酵母であったが、非常に増殖性が悪く、工業上利用性に劣る酵母であった。
　そこで、Ｎｏ．６株に対して、その親株を用いて戻し交配をすることにより、増殖性が良好であり、二倍体で安定なＲＮＡ高含有変異株を作製した。
　具体的には、まず、Ｎｏ．６株の親株に対して四分子解析（Ｔｅｔｒａｄ　Ａｎａｌｙｓｉｓ）を行い、増殖性が良好であり、かつＲＮＡ含有量が乾燥菌体重量当たり１４重量％以上である胞子を選抜した。この選抜された胞子とＮｏ．６株を掛け合わせて、再度四分子解析を行い、増殖が良好であり、かつＲＮＡ含有量が乾燥菌体重量当たり１４重量％以上である胞子を選抜した。この選抜された胞子を、戻し交配終了株とした。
　なお、各酵母のＲＮＡ含有量は後記実施例１と同様にして測定した。また、各酵母の増殖性は、培養後の培地を１５，０００ｒｐｍにおいて遠心分離処理し、沈殿として得られた菌体の乾燥重量から、培地１００ｍＬ当たりに対する菌体濃度を算出し、判断した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　表２は、Ｎｏ．６株の親株と戻し交配終了株の増殖性とＲＮＡ含量を測定した結果を示した表である。各株の増殖性は、培養後の菌体濃度として表した。この結果から、戻し交配終了株は、Ｎｏ．６株の親株と同様にＲＮＡ高含有酵母であったが、親株よりも増殖性が十分に改善されていることが明らかである。
　次に、得られた戻し交配終了株とＮｏ．６株を掛け合わせて変異株を作製した。得られた変異株の増殖性とＲＮＡ含有量を測定し、増殖性が良好であり、かつＲＮＡ含有量が乾燥菌体重量当たり１４重量％以上である変異株を選抜し、ＲＮＡ高含有であり、かつ増殖性にも優れた本発明の酵母を得た。なお、得られた酵母を、ＡＢＹＣ１５９１株と名付けた。
３．ＡＢＹＣ１５９１株の菌学的性質
　ＡＢＹＣ１５９１株は、ＲＮＡ含量が乾燥菌体重量当たり１４重量％以上であること以外は、サッカロマイセス・セレビシエの一般的な菌学的性質と同一である。
　ＡＢＹＣ１５９１株を２％寒天含有ＹＰＤ平板培地にて、３０℃で２日間培養して得られたコロニーは、下記の形態的特徴を有する。
（１）大きさ：直径約２ｍｍ、（２）色調：白～クリーム色、（３）形状：全縁で半レンズ状に隆起した円形、（４）表面形状：スムース、（５）透明度：不透明、（６）粘稠性：バター様。
　このようにして得られたＡＢＹＣ１５９１株は、ＲＮＡ含量が乾燥菌体重量当たり１４重量％以上であるサッカロマイセス・セレビシエ変異株であり、本発明のサッカロマイセス・セレビシエ変異株である。
　また、ＡＢＹＣ１５９１株は、本発明において、四分子解析により得られた胞子とＩＦＯ１０６１１株とを掛け合わせることにより新規に作製されたサッカロマイセス・セレビシエ変異株であり、公知株よりも遥かにＲＮＡ含量が高くかつ増殖性が良好であるという従来にない性質を有する酵母株である。そこで、出願人は、ＡＢＹＣ１５９１株を、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（日本国　茨城県つくば市東１丁目１番地１　中央第６（郵便番号　３０５－８５６６））に新規酵母として寄託した。受託番号はＦＥＲＭ　ＢＰ－１０９２５であり、受託日は２００７年１０月１９日である。
　本発明のサッカロマイセス・セレビシエ変異株を培養し、当該変異株菌体内に、乾燥菌体重量当たり１４重量％以上のＲＮＡを含有させることにより、ＲＮＡ高含有酵母を簡便に製造することができる。本発明のサッカロマイセス・セレビシエ変異株の培養に用いられる培地は、炭素源、窒素源、及び無機塩等を含み、サッカロマイセス・セレビシエ変異株が増殖可能な培地であれば特に限定されるものではなく、通常サッカロマイセス・セレビシエ等の酵母の培養に用いられるいずれの培地も用いることができる。
　本発明のサッカロマイセス・セレビシエ変異株を培養するための培地に含有される炭素源としては、例えば、通常の微生物の培養に利用されるグルコース、蔗糖、酢酸、エタノール、糖蜜、及び亜硫酸パルプ廃液等からなる群より選択される１又は２種以上を用いることができる。また、窒素源としては、含窒素無機塩であってもよく、含窒素有機物であってもよい。例えば、尿素、アンモニア、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、コーンスティプリカー（ＣＳＬ）、カゼイン、酵母エキス、及びペプトン等からなる群より選択される１又は２種以上を用いることができる。また、無機塩としては、過リン酸石灰やリン安等のリン酸成分、塩化カリウムや水酸化カリウム等のカリウム成分、硫酸マグネシウムや塩酸マグネシウム等のマグネシウム成分等を用いることができる。その他、亜鉛、銅、マンガン、鉄イオン等の無機塩を使用してもよい。さらに、本発明のサッカロマイセス・セレビシエ変異株を培養するための培地には、ビタミン、核酸関連物質等を適宜添加しても良い。このような培地として、例えば、ＹＰＤ培地等が挙げられる。
　培養形式は、特に限定されるものではなく、培養スケール、得られた培養物の使用用途等を考慮して適宜決定することができる。例えば、寒天平板培地に塗布して培養してもよく、液体培地中で培養してもよい。液体培地における培養形式として、回分培養、流加培養、連続培養等が挙げられる。例えば、継代培養の場合には、簡便であるため、寒天平板培地上で培養することや、適当な液体培地中で回分培養することが好ましい。また、工業的にＲＮＡ高含有酵母を製造し、培養物を量産する場合には、流加培養又は連続培養を行うことが好ましい。
　また、本発明のサッカロマイセス・セレビシエ変異株の培養条件は、特に限定されるものではなく、サッカロマイセス酵母を培養する場合に一般的に用いられる条件により培養することができる。例えば、培養温度は２０～４０℃であることが好ましく、２５～３５℃であることがより好ましい。また、培地のｐＨは３．５～８．０であることが好ましく、４．０～６．０であることがより好ましい。特に、工業的に培養物を量産する場合には、培地中のｐＨを定期的に測定し、ｐＨ４．０～６．０に維持するよう調整することが好ましい。その他、本発明のサッカロマイセス・セレビシエ変異株は、他のサッカロマイセス酵母と同様に好気的条件で培養することが好ましい。例えば、回分培養においては、通気量の条件は０．５～２ｖｖｍであることが好ましく、０．８～１．５ｖｖｍであることがより好ましい。
　例えば、ＹＰＤ培地を用いて、２５～３５℃、撹拌数１８０～４００ｒｐｍ、通気量０．８～１．５ｖｖｍ、ｐＨ４．０～５．０の条件で回分培養を行うことにより、本発明のサッカロマイセス・セレビシエ変異株のＲＮＡ含量を、乾燥菌体重量当たり１４重量％以上にすることができる。これらの培養条件に加えて、培養時間を７～１２時間とすることにより、本発明のサッカロマイセス・セレビシエ変異株のＲＮＡ含量を、乾燥菌体重量当たり１８重量％以上にすることができる。
　本発明のサッカロマイセス・セレビシエ変異株を培養することにより、サッカロマイセス・セレビシエの公知株を用いた場合よりも、十分にＲＮＡ含有量が高い培養物を得ることができる。このため、該培養物を用いることにより、ＲＮＡ含量が３５重量％以上という核酸含量の高い酵母エキスを調製することができる。特に、イノシン酸（ＩＭＰ）及びグアニル酸（ＧＭＰ）の合計含量が２０重量％以上であり、旨味成分が増強された良好な酵母エキスを調製することもできる。
　本発明のサッカロマイセス・セレビシエ変異株の培養物からの酵母エキスの調製は、特に限定されるものではなく、酵母エキスを調製する場合に通常行われている調製方法のいずれを用いてもよい。該調製方法として、例えば、酵母菌体内に本来あるタンパク質分解酵素等を利用して菌体を可溶化する自己消化法、微生物や植物由来の酵素製剤を添加して菌体を可溶化する酵素分解法、熱水中に一定時間浸漬することにより菌体を可溶化する熱水抽出法、種々の酸あるいはアルカリを添加して菌体を可溶化する酸・アルカリ分解法、凍結・融解を１回以上行うことにより菌体を破砕する凍結融解法、物理的な刺激により菌体を破砕する物理的破砕法等がある。物理的破砕法において用いられる物理的刺激としては、例えば、超音波処理、高圧下におけるホモジェナイズ、グラスビーズ等の固形物との混合による磨砕等がある。
　その他、本発明のサッカロマイセス・セレビシエ変異株の培養物を、乾燥処理することにより、ＲＮＡ含有量が高い乾燥酵母菌体を得ることができる。該培養物を乾燥処理する方法は、特に限定されるものではなく、乾燥酵母菌体を調製する場合に通常行われている調製方法のいずれを用いてもよい。該調製方法として、例えば、凍結乾燥法、スプレードライ法、ドラムドライ法等がある。さらに、得られた乾燥酵母菌体を粉末状に加工することにより、取り扱い性に優れたＲＮＡ含有量が高い乾燥酵母菌末を得ることができる。
　本発明のサッカロマイセス・セレビシエ変異株の培養物自体や、酵母エキス、乾燥酵母菌体等の該培養物から調製された調製物は、調味料等の食品添加物として、特に好適に用いることができる。添加される飲食品は、特に限定されるものではなく、例えば、アルコール飲料、清涼飲料、発酵食品、調味料、スープ類、パン類、菓子類等を挙げることができる。その他、該培養物等は、ソフトカプセル剤やハードカプセル剤、打錠剤等に加工することにより、サプリメント等として摂食することもできる。
　次に実施例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
［実施例１］　ＲＮＡ高含有酵母の製造
　まず、２％寒天含有ＹＰＤ平板培地に、ＡＢＹＣ１５９１株を植菌し、３０℃のインキュベーターにて一晩静置培養行い、継代培養プレートを作製し、４℃にて保存した。
　該継代培養プレートから１白金耳のＡＢＹＣ１５９１株コロニーを採取し、５０ｍＬのＹＰＤ培地に植菌し、３０℃で１晩培養したものを前培養液とした。その後、５Ｌ容量のジャーファーメンター（丸菱バイオエンジ社製）に、１．５ＬのＹＰＤ培地を入れ、さらに、前培養液を添加して、初発菌数が１×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように植菌し、３０℃、撹拌数２００ｒｐｍ、通気量１ｖｖｍとして、回分培養を行った。回分培養時の培地中のｐＨは、アンモニア水を用いて４．５に維持した。
　培養開始後９～２１時間目に、５０ｍＬの培養物（ＡＢＹＣ１５９１株含有ＹＰＤ培地）を分取し、該培養物中のＡＢＹＣ１５９１株に含有されるＲＮＡ量を測定した。なお、菌体中のＲＮＡ含量は、具体的には、以下に述べる方法により測定した。
　まず、分取した培養物を遠心分離処理することにより、含有されていた酵母を沈殿として回収し、蒸留水で洗浄した。その後、６６０ｎｍの吸光度（ＯＤ６６０）が５０～１００程度となるように適量の蒸留水を加えて懸濁したものを、測定サンプルとした。２５０μＬの測定サンプルと、２５０μＬの３．３Ｍの塩化ナトリウム溶液とを混合し、１００℃で１時間加熱した。室温まで放冷後、７５０ｍＬの蒸留水を添加したものをブランク溶液とした。
　次に、１５０μＬのブランク溶液に、２００μＬの０．１Ｍリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ５．３）、５０μＬの０．０１Ｍ塩化亜鉛溶液、１００μＬの３９．７Ｕ／ｍＬヌクレアーゼＰ１溶液（ヤマサ社製）をそれぞれ添加し、６０℃で２時間反応させて、該ブランク溶液中の核酸を分解した。分解後の溶液をサンプル溶液とした。
　ブランク溶液とサンプル溶液の両液を、Ｕｌｔｒａｆｒｅｅ（登録商標）－ＭＣ遠心式フィルターユニット（１０，０００ＮＭＷＬ、ミリポア社製）を用いて限外濾過し、各溶液中の核酸含量を、ＨＰＬＣを用いて測定した。核酸成分は２ナトリウム塩７水和物として計算した。なお、ＨＰＬＣは、下記の条件にて行った。
　ＨＰＬＣ装置：ＬＣ－１０ＡＤＶＰ（島津製作所製）
　カラム：日立ゲル＃３０１３－Ｎ充填カラム
　検出器：ＳＰＤ－１０ＡＶＰ（島津製作所製）
　移動相：６７ｍＭ　ＮＨ４Ｃｌ、１０ｍＭ　ＫＨ２ＰＯ４、２０ｍＭ　Ｋ２ＨＰＯ４、６％アセトニトリル溶液
　インジェクション：１０μＬ
　カラム温度：３５℃
　流量：１．０ｍＬ／ｍｉｎ
　検出波長：２５４ｎｍ
　分析時間：３０分間
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　表３は、培養開始後の時間と培養物中の菌体のＲＮＡ含量を示した表である。この結果、培養物中の菌体のＲＮＡ含量は、培養開始後９時間の時点で、最も含有量が多くなり、２１．４重量％であった。また、培養開始後１８時間の時点でも１６．３重量％と非常に高い含有量を示した。後記比較例１に示すように、サッカロマイセス・セレビシエの公知株は、培養開始後１８時間の時点で、通常１０重量％以下である。つまり、実施例１の結果から、本発明のサッカロマイセス・セレビシエ変異株が非常にＲＮＡ含量の高い酵母であることが明らかである。
［実施例２］　酵母エキスの調製
　まず、実施例１と同様にして、ＹＰＤ培地にＡＢＹＣ１５９１株を植菌して培養し、培養開始後１８時間目の培養物を得た。得られた培養物中のＡＢＹＣ１５９１株に含有されるＲＮＡ量を、実施例１と同様にして測定したところ、乾燥菌体重量当たり１４．６重量％であった。
　次に、この培養物を遠心分離処理することにより、含有されていた酵母を沈殿として回収し、蒸留水で洗浄した。その後、菌体濃度が１０～１５％となるように適量の蒸留水を加えて酵母懸濁液を作成した。殺菌後、ｐＨ５となるように該酵母懸濁液を調製し、細胞壁溶解酵素を添加して、５０℃で１７時間保温した。その後、該酵母懸濁液を遠心分離処理することにより、上清エキスを回収し、ｐＨ５．５となるように調製後、ＲＮＡ分解酵素及び脱アミノ酵素を添加して、５０℃で１７時間酵素反応を行った。８０℃達温にて酵素を失活させた後、濾過・殺菌し、乾燥させて酵母エキスを調製した。
　得られた酵母エキス中のＲＮＡ含量を、実施例１と同様にして測定したところ、４３．４重量％であった。また、呈味成分であるイノシン酸及びグアニル酸の合計含量は２４．４重量％であった。
　この結果から、本発明のサッカロマイセス・セレビシエ変異株を用いることにより、ＲＮＡ含量の高い良好な酵母エキスを調製し得ることが明らかである。
［比較例１］　酵母エキスの調製
　ＡＢＹＣ１５９１株に代えて、サッカロマイセス・セレビシエＳ２８８Ｃ株を用いた以外は、実施例１と同様にして、培養物を得た。得られた培養物中のＳ２８８Ｃ株に含有されるＲＮＡ量を、実施例１と同様にして測定したところ、乾燥菌体重量当たり８．５重量％であった。
　次に、実施例２と同様にして、この培養物から酵母エキスを調製し、酵母エキス中のＲＮＡ含量を測定した。この結果、Ｓ２８８Ｃ株の培養物から調製された酵母エキス中のＲＮＡ含量は１７．２重量％であり、呈味成分であるイノシン酸及びグアニル酸の合計含量は７．９重量％であった。
　なお、実施例２において調製された酵母エキスと、比較例１において調製された酵母エキスの官能評価を実施した。
　具体的には、両酵母エキスを、４０度のお湯に対しそれぞれ１％になるように溶解し、酵母エキス溶解液を調製した。これらの酵母エキス溶解液を試飲したところ、実施例２の酵母エキス溶解液は、比較例１の酵母エキス溶解液に比べて、濃厚で旨味に深みがあった。
　また、両酵母エキスを、市販コンソメスープに対しそれぞれ１％となるように添加した。この結果、実施例２の酵母エキス添加スープは、比較例１の酵母エキス添加スープに比べて、より旨味の深い良好な味を示した。
　これらの結果は、実施例２の酵母エキスが、ＲＮＡ含量とイノシン酸及びグアニル酸の合計含量において、比較例１の酵母エキスの２倍以上有しているためと推察される。
　本発明のサッカロマイセス・セレビシエ変異株は、ＲＮＡ含量が高く、該変異株を培養することにより、簡便にＲＮＡ含有量の高い酵母培養物や酵母エキス等を製造することができるため特に食品分野等で利用が可能である。

Claims (8)

  1. 　ＲＮＡ含量が乾燥菌体重量当たり１４重量％以上であることを特徴とする、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）変異株。
  2. 　前記ＲＮＡ含量が乾燥菌体重量当たり１８重量％以上であることを特徴とする、請求項１記載のサッカロマイセス・セレビシエ変異株。
  3. 　前記サッカロマイセス・セレビシエ変異株が、ＡＢＹＣ１５９１株（ＦＥＲＭ　ＢＰ－１０９２５）であることを特徴とする、請求項１又は２記載のサッカロマイセス・セレビシエ変異株。
  4. 　請求項１～３のいずれか1項に記載のサッカロマイセス・セレビシエ変異株を培養し、当該変異株菌体内に、乾燥菌体重量当たり１４重量％以上のＲＮＡを含有させることを特徴とする、ＲＮＡ高含有酵母の製造方法。
  5. 　請求項１～３のいずれか1項に記載のサッカロマイセス・セレビシエ変異株の培養物。
  6. 　請求項１～３のいずれか1項に記載のサッカロマイセス・セレビシエ変異株の培養物から調製した酵母エキス。
  7. 　前記ＲＮＡ含量が３５重量％以上であることを特徴とする、請求項６記載の酵母エキス。
  8. 　イノシン酸（ＩＭＰ）及びグアニル酸（ＧＭＰ）の合計含量が２０重量％以上であることを特徴とする、請求項６記載の酵母エキス。
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