WO2009101959A1 - 新規化合物ラクノクロモニン（ｌａｃｈｎｏｃｈｒｏｍｏｎｉｎ）類化合物 - Google Patents

新規化合物ラクノクロモニン（ｌａｃｈｎｏｃｈｒｏｍｏｎｉｎ）類化合物 Download PDF

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WO2009101959A1
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dimethyl sulfoxide
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Inventor
Kazuki Yano
Isshin Tanaka
Takahiro Miyauchi
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Daiichi Sankyo Company, Limited
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Publication date
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
    • C12P17/02—Oxygen as only ring hetero atoms
    • C12P17/06—Oxygen as only ring hetero atoms containing a six-membered hetero ring, e.g. fluorescein
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D311/00—Heterocyclic compounds containing six-membered rings having one oxygen atom as the only hetero atom, condensed with other rings
    • C07D311/02—Heterocyclic compounds containing six-membered rings having one oxygen atom as the only hetero atom, condensed with other rings ortho- or peri-condensed with carbocyclic rings or ring systems
    • C07D311/04—Benzo[b]pyrans, not hydrogenated in the carbocyclic ring
    • C07D311/22—Benzo[b]pyrans, not hydrogenated in the carbocyclic ring with oxygen or sulfur atoms directly attached in position 4
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
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    • C12N1/145—Fungal isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/645—Fungi ; Processes using fungi

Definitions

  • the present invention relates to a novel compound having an effect of treating or preventing inflammation, lifestyle-related diseases and adult diseases, a pharmaceutical containing the compound as an active ingredient, a method for producing the compound, a novel microorganism producing the compound, and the like.
  • the inventors of the present invention have conducted extensive research for the purpose of searching for substances having a lifestyle-related disease and adult disease-preventing action, and have found a novel compound isolated and purified from a microorganism culture, thereby completing the present invention.
  • the present invention includes: (1) The following general formula (I):
  • R 1 is CH 3
  • R 2 is OH
  • R 3 is H
  • R 4 is CH 3
  • R 5 is CH (CH 3 ) (CH 2 ) 2 OH, CH (CH 3 ) CH (OH) CH 3 or CH (CH 3 ) CH 2 CH 3 is shown.
  • 1 H-nuclear magnetic resonance spectrum The 1 H-nuclear magnetic resonance spectrum measured in deuterated dimethyl sulfoxide using the tetramethylsilane signal (0.00 ppm) as an internal standard is shown below.
  • a compound having the following physicochemical properties or a salt thereof 1) Material properties: colorless powder, aqueous solution is weakly acidic, 2) Solubility: soluble in acetone, methanol, dimethyl sulfoxide, insoluble in water, ethyl acetate, hexane 3) Molecular formula: C 15 H 18 O 4 4) Molecular weight: 262 (measured by ESI mass spectrometry) 5) The accurate mass [M + Na] + measured by the high-resolution ESI mass spectrum method is as follows.
  • 1 H-nuclear magnetic resonance spectrum The 1 H-nuclear magnetic resonance spectrum measured in deuterated dimethyl sulfoxide using the tetramethylsilane signal (0.00 ppm) as an internal standard is shown below.
  • 13 C-nuclear magnetic resonance spectrum The 13 C-nuclear magnetic resonance spectrum measured in deuterated dimethyl sulfoxide using the deuterated dimethyl sulfoxide signal (39.5 ppm) as an internal standard is shown below. 7.8, 9.2, 11.8, 17, 9, 27.3, 36.8, 110.4, 113.4, 114.3, 114.6, 123.2, 155.0, 159.
  • the compound according to any one of (1) to (4) is cultured from the culture product of the compound according to any one of (1) to (4) belonging to the genus Lachnum. Collecting the compound according to any one of (1) to (4), (6)
  • the production strain of the compound according to any one of (1) to (4) belonging to the genus Lachnum is Lachnum virginium SANK10207 strain (FERM BP-10913).
  • the manufacturing method described (7) A microorganism belonging to the genus Lachnum and producing the compound according to any one of (1) to (4), (8) The microorganism according to (7), which is Lachnum virusine SANK10207 strain (FERM BP-10913), (9) A pharmaceutical comprising the compound according to any one of (1) to (4) or a pharmacologically acceptable salt thereof as an active ingredient, (10) The medicament according to (9), which is a therapeutic or prophylactic agent for inflammation, lifestyle-related diseases or adult diseases, About.
  • lacnochromonin (English name: “lachnochromonin”) A in the general formula (I), R 1 is CH 3 , R 2 is OH, R 3 is H, R 4 is CH 3 , R 5 represents a compound represented by CH (CH 3 ) (CH 2 ) 2 OH, or a compound having the physicochemical properties described in (2) above.
  • “Lacnochromonin B” means that in the above general formula (I), R 1 is CH 3 , R 2 is OH, R 3 is H, R 4 is CH 3 , R 5 is CH (CH 3 ) CH (OH) CH 3 Or a compound having the physicochemical properties described in (3) above.
  • “Lachnochromonin C” means that in the above general formula (I), R 1 is CH 3 , R 2 is OH, R 3 is H, R 4 is CH 3 , R 5 is CH (CH 3 ) CH 2 CH 3
  • R 1 is CH 3
  • R 2 is OH
  • R 3 is H
  • R 4 is CH 3
  • R 5 is CH (CH 3 ) CH 2 CH 3
  • the compound represented, or the compound which has the physicochemical property as described in said (4) is shown.
  • lacnochromonins compounds These three compounds are collectively referred to as “lacnochromonins compounds” and sometimes referred to as “compounds of the present invention”.
  • the compound of the present invention can be converted into a salt by a method well known to those skilled in the art using a base.
  • the present invention also includes these salts.
  • the salt of the compound of the present invention is used as a pharmaceutical, it is not particularly limited as long as it is used medically and is pharmacologically acceptable. There is no particular limitation as long as it can be used.
  • salts include alkali metal salts such as sodium salt, potassium salt and lithium salt; alkaline earth metal salts such as calcium salt and magnesium salt; aluminum salt, iron salt, zinc salt and copper Metal salts such as salts, nickel salts and cobalt salts; inorganic salts such as ammonium salts; t-octylamine salts, dibenzylamine salts, morpholine salts, glucosamine salts, phenylglycine alkyl ester salts, ethylenediamine salts, N-methylglu Camin salt, guanidine salt, diethylamine salt, triethylamine salt, dicyclohexylamine salt, N, N'-dibenzylethylenediamine salt, chloroprocaine salt, procaine salt, diethanolamine salt, N-benzyl-phenethylamine salt, piperazine salt, tetramethylammonium salt , Tris (Hydro Shimechiru) organic amine
  • the compound of the present invention and a salt thereof may be combined with water or a solvent by being left in the atmosphere or mixed with water or an organic solvent to form a hydrate or a solvate.
  • hydrates and solvates are also included in the present invention.
  • the lacnochromonins compounds of the present invention have various steric structures.
  • equal and unequal mixtures of these stereoisomers are all represented by a single structural formula, however, the compounds of the present invention are composed of these stereoisomers and two or more stereoisomers. All mixtures of isomers are also included.
  • R 1 is CH 3
  • R 2 is OH
  • R 3 is H
  • R 4 is CH 3
  • R 5 is CH (CH 3 ) (CH 2 ).
  • R 1 is CH 3
  • R 2 is OH
  • R 3 is H
  • R 4 is CH 3
  • R 5 is CH (CH 3) CH (OH ) CH 3
  • the optical rotation in methanol is [ ⁇ ] D 27 + 88.7 ° (c 1.00, methanol).
  • R 1 is CH 3
  • R 2 is OH
  • R 3 is H
  • R 4 is CH 3
  • R 5 is CH (CH 3 ) CH 2 CH 3
  • a compound in which the optical rotation in methanol is [ ⁇ ] D 27 + 58.6 ° (c 1.00, methanol).
  • the lacnochromonins compound of the present invention can be isolated and purified from a culture of a microorganism producing the substance according to a conventional method.
  • the microorganism producing the compound of the present invention is not particularly limited, but is preferably a fungus, more preferably a strain belonging to the genus Lachnum, such as Lachnum virginum SANK10207 (hereinafter referred to as Lactum virginium). Simply referred to as “SANK10207 strain”).
  • the SANK10207 strain was isolated from offspring spores collected in Nagano Prefecture. In order to observe the bacteriological properties of the bacterium, culture was performed on the following media. The composition of each medium used is described below.
  • PDA medium Growth on PDA medium is 20-24 mm at 23 ° C. for 3 weeks of culture.
  • the fungus is fluffy, often radially fluted, white, and may have exudate on the surface of the fungus.
  • the reverse side is grayish orange (5B5) to yellowish white (4A2).
  • Growth on MEA medium is 29-30 mm at 23 ° C. for 3 weeks of culture. The fungus seems to be wooly in the center, but is crushed and thin and white. There is no change on the back side.
  • the aerial hyphae in PDA and MEA media are 1 to 3 ⁇ m wide, thin-walled, smooth and colorless. Often, hyphae with oil droplets attached to the wall are observed. Concubines and conidia are not formed.
  • the mycological properties of the dried fruit body specimens used for isolation were observed.
  • the mycological properties of the dried specimen are as follows.
  • the baby's disc is scattered, superficial, has a handle, the hair is white, and the other parts are light yellow.
  • the disk surface has a diameter of 0.6 mm or less and has a bowl shape or a disk shape.
  • the handle is 0.4 mm or less in length. ⁇
  • the outer skin layer forms a short-form fungus tissue.
  • the hair is 95 ⁇ m or less in length, 3 to 4 ⁇ m in width, cylindrical, generally rough, thin walled, colorless, blunt at the tip and often slightly enlarged.
  • the baby cub is 44 to 58 ⁇ 3.5 to 5 ⁇ m, cylindrical rod-shaped, 8-spore, and its tip turns blue with the Melzer reagent.
  • the ascospore is 6 to 10.5 ⁇ 1.5 to 2 ⁇ m, cylindrical to long spindle, single cell, thin wall, smooth.
  • the side yarns extend from 40 to 64 ⁇ 3.5 to 5 ⁇ m, a die, 19 ⁇ m or less from the child's heel.
  • the above bacteriological properties of this bacterium are described by Spooner, “Lachnum virginium” (Spooner B. M. (1987), Helotiales of Australia, H., B. , Vol. 116: pp. 534-539), this strain was identified as Lachnum virginium.
  • the SANK10207 strain was internationally deposited on September 26, 2007 at the Patent Organism Depositary, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, 1-1-1 East Tsukuba, Ibaraki, Japan. The deposit number is FERM BP-10913.
  • the SANK10207 strain referred to in the present invention includes all mutants thereof.
  • the mutant strain encompassed by the SANK10207 strain of the present invention is a strain characterized by producing lacnochromonins A, B and C.
  • these mutant strains include those obtained by genetic methods such as recombination, transduction, transformation, etc., but all such mutant strains are present as long as they produce a lacnochromonin compound.
  • the mutant10207 strain of the invention that is, all of the mutant strains of SANK10207 that produce a lacnochromonin compound and strains that are not clearly distinguished from them are included in the SANK10207 strain.
  • the lacnochromonins compound of the present invention can be produced by culturing a bacterium producing the substance.
  • the culture of the SANK10207 strain can be usually performed using a medium such as that used for the production of secondary metabolites of microorganisms.
  • a medium contains a carbon source, a nitrogen source and an inorganic salt that can be assimilated by the microorganism.
  • the carbon source include glucose, fructose, maltose, sucrose, mannitol, glycerin, dextrin, oats, rye, barley, brown rice, corn starch, potato, corn flour, soybean oil, cottonseed oil, molasses, citric acid, tartaric acid Etc.
  • carbon sources can be used alone or in combination.
  • the amount of the carbon source added to the medium varies depending on other components in the medium, but is usually 1 to 10% by weight of the medium amount.
  • nitrogen sources include soy flour, bran, falling raw flour, cottonseed flour, casein hydrolyzate, pharmamine, fish meal, corn steep liquor, peptone, meat extract, yeast, yeast extract, malto extract, gelatin, nitric acid Examples thereof include sodium, ammonium nitrate, ammonium sulfate, sodium L-glutamate and the like, and these nitrogen sources can be used alone or in combination.
  • the addition amount of the nitrogen source varies depending on other components in the medium, but is usually in the range of 0.2 to 10% by weight, preferably 0.2 to 6% by weight of the medium amount.
  • the nutrient inorganic salt for example, salts capable of obtaining ions such as sodium ion, potassium ion, ammonium ion, calcium ion, phosphate ion, sulfate ion, chloride ion and carbonate ion are used.
  • salts containing trace amounts of metals such as calcium, cobalt, manganese, magnesium, and molybdenum can also be used.
  • vitamin B1 which can assimilate a microbe, vitamins like biotin, a microbial growth promoting substance like thiamine, etc. as needed.
  • a carbon source, a nitrogen source, a nutrient mineral salt, a cell growth promoting substance, and the like are generally used in combination, but need not be in a pure form, and those having a lower purity may be used.
  • an antifoaming agent such as silicone oil, polyalkylene glycol ether, vegetable oil, animal oil, or surfactant may be added to the medium as necessary. It is particularly preferable to add these antifoaming agents during liquid culture.
  • the pH of the medium varies depending on the components of the medium, the growth temperature, and the like, but may be any pH that is usually used for producing a fermentation product.
  • Lactonochrominin A, B and C can be obtained by aerobically culturing the SANK10207 strain.
  • Examples of such a culture method include a culture method using a solid medium, a shaking culture method, a stirring culture method, and an aeration stirring culture method.
  • the growth temperature of the fungus varies depending on the components of the medium, pH and the like, but is usually 15 ° C. to 30 ° C., and the range of 20 to 28 ° C. is good for growth.
  • 20-26 ° C. is suitable for the production of the lacnochromonins A, B and C.
  • static culture at 20 to 26 ° C. (preferably 23 ° C.) for 10 days or longer.
  • Cultivation is started in a conical flask by a single-stage or multi-stage bacterial growth process.
  • a carbon source, a nitrogen source, a trace amount of growth factor, inorganic salts and trace metals can be used in combination.
  • After adding a sterilized preculture medium to the Erlenmeyer flask and inoculating the SANK10207 strain is it shaken at 20 to 26 ° C. (preferably 23 ° C.) for 5 to 10 days (preferably 7 days) in a constant temperature incubator? By shaking until fully grown.
  • a part or all of the grown preculture solution is used to inoculate a preculture medium or a production culture medium in the next stage.
  • Production culture is started by inoculating the culture medium for production culture in an Erlenmeyer flask containing a sterile production culture medium or a plastic bag for solid culture. Production culture is carried out by shaking the Erlenmeyer flask containing the inoculated production culture medium at a constant temperature for several days or until fully grown. Alternatively, the culture vessel containing the solid medium is allowed to stand at a certain temperature for several days or until it grows sufficiently, and production culture is performed.
  • a suitable jar or tank fermenter equipped with a stirrer and an aeration device.
  • the medium can be prepared in a jar or tank fermenter, heated to 121 ° C., sterilized, and then cooled before use.
  • Cultivation is performed by inoculating a pre-cultured medium in a production culture medium in a jar or tank fermenter and aeration and stirring at 9 to 35 ° C. (preferably 15 ° C. to 33 ° C., optimally 23 ° C.). it can.
  • This method is suitable for obtaining large amounts of compounds.
  • the target compound After completion of the culture, by extracting and purifying using the obtained culture, the filtrate or supernatant obtained by centrifugation of the culture, or filtration, and the cells, or using the whole culture, The target compound can be obtained.
  • the amount of lacnochromonin A, B and C produced as the culture progresses is determined by extracting a part of the culture solution, extracting the compound, performing high performance liquid chromatography, and measuring the compound. Can be monitored. Lactonochromin A, B and C present in the solid culture are extracted with 50 to 100% hydrous acetone or acetone, hydrous methanol or methanol, and the solid part is filtered using diatomaceous earth as a filter aid, or centrifuged. The obtained filtrate can be extracted and purified from the obtained filtrate using high-performance liquid chromatography as an index, utilizing its physicochemical properties.
  • the lacnochromonins A, B and C present in the liquid part of the culture liquid, the fungus body, or both are all cultivated products or the fungus body and other solid parts are removed from the diatomaceous earth. Separation by filtration using a filter aid or centrifugation, and extraction and purification from the obtained filtrate or supernatant and bacterial cells using high-performance liquid chromatography as an index and using their physicochemical properties it can.
  • Lactonochrominins A, B and C present in the filtrate or supernatant are organic solvents that are not miscible with water under neutral or acidic conditions, for example, ethyl acetate, chloroform, ethylene chloride, methylene chloride, butanol alone or Extraction and purification can be performed by a combination thereof.
  • an adsorbent for example, activated carbon or Amberlite XAD-2, XAD-4 (Rohm and Haas Co., Ltd.), which is an adsorption resin, Diaion HP-10, etc.
  • the impurities in the liquid containing the target compound are adsorbed on the adsorbent and removed by obtaining the passing liquid, or the target compound is adsorbed to wash away the impurities, followed by methanol water, acetone water, butanol.
  • the target compound can be extracted and purified by eluting the target compound with water or the like.
  • Lactonochrominins A, B and C present in the microbial cells are obtained by extracting with 50 to 90% aqueous acetone or aqueous methanol, removing the organic solvent by concentration, and then performing extraction and purification in the same manner as above. be able to.
  • the target compound can be extracted by adding an appropriate amount (preferably a final concentration of 50%) of acetone or methanol after completion of the culture. After completion of the extraction, the target compound can be extracted and purified by performing a filtration operation using diatomaceous earth as a filter aid, and performing the same extraction and purification operation as the filtrate.
  • the solution containing the lacnochromonins A, B and C extracted and purified by the above method is silica gel, Sephadex LH-20 (manufactured by Amersham Biosciences), Florisil, Cosmosil (manufactured by Nacalai Tesque). Partition column chromatography using a carrier; Adsorption column chromatography using a carrier such as Diaion HP-20 and CHP20P (Mitsubishi Chemical Corporation); Sephadex G-10 (Amersham Biosciences Co., Ltd.) It can be further purified by gel filtration chromatography using Toyopearl HW40F (Tosoh Co., Ltd.) and the like; and high performance liquid chromatography using normal phase and reverse phase columns.
  • the lacnochromonins A, B and C of the present invention can be separated and purified.
  • the present invention relates to a medicament containing, as an active ingredient, lacnochromonin A, B and C or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • Lachnochromonins A, B and C have antioxidant activity, antitumor activity, anti-inflammatory activity, antiallergic activity, osteogenesis promoting activity and / or bone resorption inhibiting activity.
  • Reactive oxygen species is a general term for oxygen molecules with unpaired electrons (radicals) in the molecule, or related substances, and it has a very strong oxidizing power and is used to protect against bacteria that have invaded the body. Excessive reactive oxygen species are believed to damage DNA and contribute to aging, carcinogenesis, lifestyle-related diseases and the like. The function of suppressing the excessive generation of reactive oxygen species also exists in the living body, but the function decreases with aging. Antioxidants have a function to suppress the generation of reactive oxygen species, and are expected to prevent aging, carcinogenesis, lifestyle-related diseases and the like.
  • Inflammatory action is a protective immune response against harmful events such as invasion of foreign bodies and damage caused by it, but excessive expression of inflammatory mediators such as inflammatory cytokines and nitric oxide (NO)
  • inflammatory mediators such as inflammatory cytokines and nitric oxide (NO)
  • TNF- ⁇ tumor necrosis factor
  • NO nitric oxide
  • NO nitric oxide
  • NO nitric oxide
  • NO nitric oxide
  • NO nitric oxide
  • NO nitric oxide
  • TNF- ⁇ tumor necrosis factor
  • NO is used to protect against the invasion of pathogens and viruses and the damage caused by it, but excessive NO damages cells and causes carcinogenesis and worsening of inflammatory diseases.
  • NO reacts with O 2 radicals in the living body and changes to peroxynitrite (ONOO-) having stronger cytotoxic activity.
  • CSAIDs cytokine-suppressed anti-inflammatory drugs
  • An allergic reaction is also an excessive immune reaction, which is classified from type I to type V according to the mechanism of its occurrence, among which hay fever and atopic dermatitis are classified as type I.
  • type I allergy a foreign substance serving as an antigen binds to IgE, which is a kind of immunoglobulin bound to mast cells and basophils, whereby physiologically active substances such as histamine are released from these cells.
  • IgE is a kind of immunoglobulin bound to mast cells and basophils, whereby physiologically active substances such as histamine are released from these cells.
  • physiologically active substances cause vasodilation and increased permeability, and symptoms such as edema and pruritus appear. Therefore, if the release of histamine and the like from mast cells and its action can be suppressed, it can be expected that the onset of type I allergy will be alleviated / reduced.
  • Osteoporosis is a disease in which the balance of bone metabolism is lost, bone formation and bone resorption increase, bone mass and bone quality decrease, and fracture risk increases. Osteoporosis is broadly divided into primary osteoporosis caused by aging and decreased estrogen due to menopause, and secondary osteoporosis caused by rheumatoid arthritis, hyperparathyroidism, and steroids and immunosuppressive drugs.
  • the Candidate substances for osteoporosis therapeutics include substances that promote bone formation or substances that suppress enhanced bone resorption, and the compounds of the present invention have such activity.
  • the medicament containing the compound of the present invention is useful as a therapeutic or prophylactic agent for cancer, allergy, inflammation, osteoporosis, lifestyle-related diseases and / or adult diseases.
  • the present invention also relates to a method for treating or preventing cancer, allergy, osteoporosis, lifestyle-related diseases and / or adult diseases by administering the medicament.
  • the present invention relates to the use of lacnochromonin A, B and C or a pharmaceutically acceptable salt thereof for the manufacture of a therapeutic or prophylactic agent for cancer, allergy, osteoporosis, lifestyle-related diseases and / or adult diseases.
  • the lacnochromonins A, B and C of the present invention or pharmacologically acceptable salts thereof can be administered in various forms.
  • the administration form include oral administration by tablets, capsules, granules, emulsions, pills, powders, syrups (solutions), etc., or injections (intravenous, intramuscular, subcutaneous or intraperitoneal administration), Examples include parenteral administration such as instillation and suppository (rectal administration).
  • These various preparations are usually used in the pharmaceutical preparation technical field such as excipients, binders, disintegrants, lubricants, flavoring agents, solubilizers, suspension agents, coating agents, etc. as main ingredients in accordance with conventional methods. It can be formulated with the resulting adjuvant.
  • excipients such as lactose, sucrose, sodium chloride, glucose, urea, starch, calcium carbonate, kaolin, crystalline cellulose, silicic acid; water, ethanol, propanol, simple syrup, glucose Solution, starch solution, gelatin solution, carboxymethylcellulose, shellac, methylcellulose, potassium phosphate, polyvinylpyrrolidone, etc .; dried starch, sodium alginate, agar powder, laminaran powder, sodium bicarbonate, calcium carbonate, polyoxyethylene sorbitan fatty acid Disintegrators such as esters, sodium lauryl sulfate, monoglyceride stearate, starch, lactose; disintegrators such as sucrose, stearin, cocoa butter, hydrogenated oil; quaternary ammonium salts, sodium lauryl sulfate Moisturizers such as glycerin and starch; Adsorbents such as starch
  • the tablet which gave the normal coating for example, a sugar-coated tablet, a gelatin-encapsulated tablet, an enteric-coated tablet, a film-coated tablet, a double tablet, and a multilayer tablet.
  • excipients such as glucose, lactose, cocoa butter, starch, hydrogenated vegetable oil, kaolin, talc; binders such as gum arabic powder, tragacanth powder, gelatin, ethanol; laminaran agar Disintegrants such as can be used.
  • a carrier conventionally known in this field can be widely used as a carrier, and examples thereof include polyethylene glycol, cocoa butter, higher alcohol, esters of higher alcohol, gelatin, semi-synthetic glyceride and the like.
  • solutions, emulsions or suspensions When used as an injection, it can be used as a solution, emulsion or suspension. These solutions, emulsions or suspensions are preferably sterilized and isotonic with blood.
  • the solution used for the production of these solutions, emulsions or suspensions is not particularly limited as long as it can be used as a diluent for medical use.
  • water, ethanol, propylene glycol, ethoxylated isostearyl alcohol, polyoxylated isoforms are used. Examples include stearyl alcohol and polyoxyethylene sorbitan fatty acid esters.
  • a sufficient amount of sodium chloride, glucose or glycerin may be included in the preparation to prepare an isotonic solution, and a normal solubilizing agent, buffer, soothing agent, etc. may be included. You may go out.
  • the above-mentioned preparation may contain a coloring agent, a preservative, a fragrance, a flavoring agent, a sweetening agent, and the like as required, and may further contain other medicines.
  • the amount of the active ingredient compound contained in the preparation is not particularly limited and is appropriately selected within a wide range, but is usually 170% by weight, preferably 1 to 30% by weight, based on the total composition.
  • the amount used varies depending on symptoms, age, body weight, administration method, dosage form, etc., but is usually 2000 mg (preferably 100 mg) as an upper limit per day for adults, and 0.1 mg (preferably as the lower limit) 1 mg, more preferably 10 mg) can be administered once a day or divided into several times according to symptoms.
  • a novel compound having an antioxidant activity, an antitumor activity, an anti-inflammatory activity, an antiallergic activity, an osteogenesis promoting activity, and / or a bone resorption inhibiting activity is provided.
  • Example 1 Cultivation of SANK10207 strain (1) Preparation of frozen seed The hyphae of SANK10207 strain grown on a PDA slant medium shown in Table 3 to be described later was scraped together with agar using platinum ears, and physiological saline Suspended in The above-mentioned bacterial suspension was aseptically inoculated into a 100 mL Erlenmeyer flask containing 20 mL of the medium shown in Table 4 which will be sterilized at 121 ° C. for 30 minutes. In seed culture, the culture was shaken on a rotary shaker at 23 ° C. and 210 rpm for 6 days.
  • Glucose and agar were added to this potato boiled liquid, and finally adjusted to 1000 mL with tap water. pH: No adjustment. Sterilization: Sterilized at 121 ° C. for 20 minutes.
  • Composition of seed culture and preculture medium ⁇ Glycerin 30g Glucose 30g 20g soluble starch 10g soy flour Gelatin 2.5g Yeast extract 2.5g NH 4 NO 3 2.5g Agar 3g Antifoaming agent (CB442) 0.1g ⁇
  • Tap water was added to the above components so that the final volume was 1000 mL. pH: adjusted to about 6.5 with 25% aqueous sodium hydroxide solution.
  • the suspension was allowed to stand for 24 hours, Celite 545 (22.7 kg) was added, and the mixture was filtered with a filter press (manual press type filter press TFP-310-8, manufactured by Tokyo Engineering Industry Co., Ltd.).
  • the obtained acetone extract (990 L) was concentrated under reduced pressure, and acetone was distilled off.
  • the pH of the concentrated liquid (550 L) was adjusted to 2.9 with 75% concentrated sulfuric acid (260 mL), and then extraction was performed by adding ethyl acetate (250 L).
  • the aqueous layer after fractionation was extracted again by adding ethyl acetate (250 L), and the organic layers obtained by the two extraction operations were combined.
  • This organic layer (530 L) was washed with 0.2 M aqueous solution of disodium hydrogenphosphate (150 L), and further washed with 25% brine (100 L) to obtain a washed organic layer (500 L).
  • the washed organic layer was concentrated under reduced pressure, and anhydrous sodium sulfate (about 1 kg) was added to the resulting concentrated liquid (27.5 L), followed by dehydration for about 2 hours. After removing anhydrous sodium sulfate by filtration, the filtrate was concentrated to dryness under reduced pressure to obtain an oily substance (450 g).
  • DPPH radical elimination rate measurement test DPPH radical is a relatively stable radical, and has a maximum absorption at 517 nm. Can be evaluated. Specifically, DPPH and a test substance are mixed and reacted in a solvent, and then the absorbance at 517 nm is measured. The DPPH radical elimination rate by the test substance can be calculated by the following method, and the higher the elimination rate, the higher the test substance has a higher antioxidant effect.
  • DPPH radical scavenging rate (AB) / (CD)
  • Active oxygen removal active xanthine oxidase, its substrate hypoxanthine and test substance are mixed and reacted in a phosphate buffer, and the generated active oxygen is measured to thereby reduce the active oxygen removal effect of the test substance. Can be evaluated.
  • a luminescent method using a luminescent reagent or 5,5-dimethyl-1-pyrroline-N-oxide (DMPO) or N-tert-butyl- ⁇ -phenylnitrone (PBN) as a radical scavenger is used.
  • DMPO 5,5-dimethyl-1-pyrroline-N-oxide
  • PBN N-tert-butyl- ⁇ -phenylnitrone
  • ESR electron spin resonance
  • Cancer cell lines used in this test are shown below, but the cells used in the test of anti-tumor activity of the novel compounds of the present invention, lacnochromonins A, B and C are limited to these. Is not to be done. Cancer cell lines used in the test: HeLa (cervical cancer), HGC-27 (gastric cancer), MCF-7 (breast cancer), HepG2 (hepatocellular carcinoma), U937 (leukemia cancer), CACO2 (colon cancer) More specifically, the anticancer activity of the novel compounds of the present invention, lacnochromonins A, B and C can be evaluated by the following method.
  • Cell growth inhibition test Various cancer cells are seeded in a 96-well microplate, and after adding a test substance, they are cultured for several hours to several days.
  • Cell growth inhibitory activity includes methods for measuring mitochondrial dehydrogenase activity such as 3- (4,5-dimethyl-2-thiazolyl) -2,5-diphenyl-2H-tetrazole bromide (MTT) method, tritium-labeled thymidine, etc. Can be evaluated by a method of measuring the amount of incorporation into DNA. By setting the cell growth (control) of the test substance-free group to 100%, the cell growth rate when the test substance is added can be calculated, and the cancer cell growth inhibitory activity of the test substance can be evaluated.
  • mitochondrial dehydrogenase activity such as 3- (4,5-dimethyl-2-thiazolyl) -2,5-diphenyl-2H-tetrazole bromide (MTT) method, tritium-labeled thymidine, etc.
  • Apoptosis-inducing activity test a) Detection of DNA ladder A test substance is added to various cancer cells and incubated at 37 ° C. for several minutes to several hours. Adherent cells are washed as they are with phosphate buffered saline (PBS), and floating cells are collected by centrifugation and then washed with PBS. Each cell lysate contains a surfactant such as Triton-X100. Lyse the cells with RNA and protein are degraded using RNase, proteinase K, etc., 5M saline and isopropanol are added, and the mixture is allowed to stand overnight at ⁇ 20 ° C. to precipitate DNA.
  • PBS phosphate buffered saline
  • the DNA precipitated by centrifugation is precipitated, redissolved with Tris-ethylenediaminetetraacetic acid buffer (TE buffer), and then subjected to agarose gel electrophoresis. After electrophoresis, DNA is developed with a fluorescent reagent, and the apoptosis-inducing activity of cancer cells by the test substance can be evaluated by evaluating the generation of a DNA ladder using an imaging analyzer or the like.
  • a test substance is added to various cancer cells and incubated at 37 ° C. for several minutes to several hours.
  • a Hoechst 33342 solution (Calbiochem; final concentration 0.1 ⁇ g / mL) is added, and the mixture is further incubated for 2 hours, and observed with a fluorescence microscope (Ultra violet: excitation light 330-380 nm, observation light 420 nm). By observing granular fluorescence accompanying chromatin aggregation, the chromatin aggregation promoting activity of the test substance can be evaluated.
  • the anti-inflammatory activity of the novel compounds of the present invention can be evaluated by inflammatory cytokine and nitric oxide (NO) production inhibition tests.
  • inflammatory cytokine and nitric oxide (NO) production inhibition tests An example of the test method is given below.
  • IL-6 production inhibitory activity of Lactonochromonin A was measured under the conditions of a DMEM medium as a medium, a cell number at the time of adjustment of 1 ⁇ 10 5 cells / mL, and a culture period of 3 days after addition of the test compound. Suppression rate was 16.6% in ml, 30% at 40 ng / ml, 38.7% at 120 ng / ml.
  • the inhibition rate of IL-6 production was calculated by a calculation formula for the inhibition rate of cytokine production described later. ⁇ 3-2. NO production suppression> Regarding NO production, the Grease method (L. J. Ignarro, et.al., (1987), Endothelium-derived relaxed factor produced and released from fragile and vein is nitride, US. C. .84: pp. 9265-9269).
  • the antiallergic activity of the novel compounds of the present invention, lacnochromonins A, B and C can be evaluated by a histamine release inhibition test or the like.
  • An example of the test method is given below. After Wistar male rats are decapitated and bled, 10 mL of Hank's solution containing 10 U / mL heparin is injected into the abdominal cavity, massaged well, and the intraperitoneal fluid is collected. The obtained intraperitoneal fluid is overlaid on a 40% Ficoll solution, left at room temperature for 30 minutes, and then centrifuged to collect mast cells on the Ficoll layer.
  • the rat peritoneal mast cells can be obtained by suspending the mast cells in PBS, repeating washing by centrifugation three or four times, and then suspending again in PBS.
  • Rat peritoneal mast cells are adjusted to 2 ⁇ 10 6 cells / mL and 1.8 mL / tube with PBS and allowed to stand at 37 ° C. for 10 minutes.
  • 0.1 mL of a test substance is added, and further 0.1 mL of 10 ⁇ g / mL compound 48/80 (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) is added and reacted for 10 minutes. Stop the reaction by cooling with ice and centrifuge to prepare the supernatant and sediment.
  • the histamine release rate from rat peritoneal mast cells can be calculated by the following formula.
  • Test Example 5 Osteogenesis Promoting Activity The osteogenesis promoting activity of the novel compounds of the present invention, lacnochromonins A, B and C can be evaluated by the following osteoblast differentiation test. Alkaline phosphatase (ALP) is an osteoblast differentiation marker.
  • ALP Alkaline phosphatase
  • the osteoblast differentiation promoting activity can be evaluated by obtaining an increase rate of osteoblast ALP activity. More specifically, the rate of increase in ALP activity of osteoblasts can be evaluated by the following method.
  • a mouse bone marrow-derived osteoblast cell line, ST2 (RIKEN Cell Bank, RCB0224) was suspended in ⁇ -MEM medium (hereinafter abbreviated as ⁇ MEM) containing 10% fetal bovine serum, and this suspension was suspended in 4,000 cells / well. Then, dispense 100 ⁇ L each into a 96-well microplate and incubate in a CO 2 incubator for 24 hours.
  • ALP activity increase rate (%) absorbance value when sample is added / absorbance value when sample is not added ⁇ 100.
  • Bone resorption inhibitory activity Tartrate-resistant acid phosphatase is a marker of osteoclast differentiation, and the inhibitory activity of osteoclast differentiation is evaluated by determining the TRAP activity inhibition rate of the test substance. I can do it. More specifically, the TRAP activity inhibition rate can be evaluated by the following test. Ddy mice are euthanized by cervical dislocation and the spleen is removed. Spleen cells are collected from the removed spleen, and cell pellets are collected by centrifugation, and then erythrocytes are destroyed with NH 4 Cl-containing Tris-HCl buffer (erythrocyte disruption solution).
  • the erythrocyte destruction solution is removed by centrifugation, and the cells are suspended in ⁇ MEM. After washing with ⁇ MEM twice by centrifugation, the cells can be resuspended in ⁇ MEM to obtain a mouse spleen cell suspension.
  • the ⁇ MEM to which the test substance is added is dispensed into a 96-well plate at 100 ⁇ L / well.
  • Mouse spleen cells (4 ⁇ 10 5 cells / 50 ⁇ L / well) and ST2 cells (10 4 cells / 50 ⁇ L / well) were mixed with 2 ⁇ 10 ⁇ 8 M active vitamin D 3 , 2 ⁇ 10 ⁇ 7 M. Seed suspended in ⁇ MEM with dexamethasone.
  • TRAP activity inhibition rate (%) (1 ⁇ absorbance value when sample is added / absorbance value when sample is not added) ⁇ 100.
  • the compounds of the present invention are useful as therapeutic and / or ameliorating agents for inflammation, lifestyle-related diseases or adult diseases.

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Abstract

【課題】 　炎症、生活習慣病及び成人病の治療及び／又は予防作用を有する新規化合物を提供すること。 【解決手段】 下記一般式(Ｉ)で表される化合物等。 [式中、Ｒ１はＣＨ３、Ｒ２はＯＨ、Ｒ３はＨ、Ｒ４はＣＨ３、Ｒ５はＣＨ（ＣＨ３）（ＣＨ２）２ＯＨ，ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ３またはＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ３を示す。] 

Description

新規化合物ラクノクロモニン（ｌａｃｈｎｏｃｈｒｏｍｏｎｉｎ）類化合物
　本発明は、炎症、生活習慣病及び成人病の治療または予防作用を有する新規化合物、該化合物を有効成分として含有する医薬、該化合物の製造方法、該化合物を生産する新規微生物等に関する。
　近年、フラボン、イソフラボン、フラボノール、フラバノン、フラバノール、フラバン-3,4-ジオール、フラバン-3-オール、アントシアニジンなどに代表されるクロモン骨格を有する化合物は、抗酸化作用、抗癌作用、抗アレルギー作用、抗炎症作用、骨粗鬆症予防効果などの様々な薬理作用を有することから、生活習慣病、成人病などを代表とする様々な疾患の予防薬又は治療薬として注目を集めている（非特許文献１）。また、多くのクロモン骨格を有する化合物は、食物中に含有されており、様々な食品添加物や栄養補助成分としても使用されていることから、安全性が高いことが期待される。
　しかし、いずれの化合物においても必ずしも十分な薬理学的効果は得られないことから、医薬として用いられているものは、塩酸フラボキサート（非特許文献２）、イプリフラボン（非特許文献３）など数例に過ぎず、殆どの場合、医薬としての実用化には至っていない。

Ｒ．Ｊ．Ｎｉｊｖｅｌｄｔ　ｅｔ．　ａｌ．，（２００１）"Ｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ：　ａ　ｒｅｖｉｅｗ　ｏｆ　ｐｒｏｂａｂｌｅ　ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ　ｏｆ　ａｃｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｐｏｔｅｎｔｉａｌ　ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．"　Ａｍ．　Ｊ．　Ｃｌｉｎ．　Ｎｕｔｒ．ｖｏｌ．７４：ｐｐ．４１８－４２５ Ｒ．Ｒｕｆｆｍａｎ，（１９８８）、"Ａ　ｒｅｖｉｅｗ　ｏｆ　ｆｌａｖｏｘａｔｅ　ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｔｒｅａｔｍｅｎｔ　ｏｆ　ｕｒｇｅ　ｉｎｃｏｎｔｉｎｅｎｃｅ．"、Ｊ．　Ｉｎｔ．　Ｍｅｄ．　Ｒｅｓ．、ｖｏｌ．１６：ｐ．３１７－３３０ Ａ．　Ｋａｔｈｌｅｅｎ（１９９９），"Ｉｐｒｉｆｌａｖｏｎｅ：　Ａｎ　Ｉｍｐｏｒｔａｎｔ　Ｂｏｎｅ－Ｂｕｉｌｄｉｎｇ　Ｉｓｏｆｌａｖｏｎｅ．"，Ａｌｔｅｒｎ．　Ｍｅｄ．　Ｒｅｖ．，ｂｏｌ．４：ｐ．１０－２２
　本発明者等は、生活習慣病、成人病予防作用を有する物質を探索する目的で、鋭意研究を行い、微生物培養物中より単離・精製された新規化合物を見出し、本発明を完成した。
　本発明は； 
（１）　下記一般式(Ｉ)：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
 [式中、Ｒ１はＣＨ３、Ｒ２はＯＨ、Ｒ３はＨ、Ｒ４はＣＨ３、Ｒ５はＣＨ（ＣＨ３）（ＣＨ２）２ＯＨ，ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ３またはＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ３を示す。] で表わされる化合物またはその塩、

（２）　下記の物理化学的性状を有する化合物またはその塩、
１）物質の性状：無色粉末、水溶液は弱酸性を呈する、
２）溶解性：アセトン、メタノール、ジメチルスルホキシド、酢酸エチルに可溶、水、ヘキサンに不溶
３）分子式：Ｃ１５Ｈ１８Ｏ４
４）分子量：２６２（ＥＳＩマススペクトル法により測定）
５）高分解能ＥＳＩマススペクトル法により測定した精密質量、[Ｍ＋Ｈ]＋は次に示す通りである。
実測値：２６３．１２８３
計算値：２６３．１２８３
６）旋光度：[α]Ｄ ２７　＋７０．４°（c １．００,　メタノール）
７）紫外部吸収スペクトル：
　ＭｅＯＨ中で測定した紫外部吸収スペクトルは、以下に示す極大吸収を示す。
λmax MeOHｎｍ（ε）　２２９（２１４００），２４６（１５９００），２５４（１５４００），２９８（１２７００）
８）赤外吸収スペクトル：
　ＫＢｒ錠剤法で測定した赤外吸収スペクトルは、以下に示す極大吸収を示す。
３２９８，３１６７，２９８１，２９６３，２９４６，１６３０，１５９７，１５１９，１４３４，１４０７，１３８１，１３２８，１３００，１２８８，１２５９，１２０８，１１８７，１１６７，１１２８，１０９５，１０６４，９７５，９４７，８５３，８３７，７９７，７８３，７０２，６６７，６３２，５５１，４６３，４３４ｃｍ－１
９）１Ｈ－核磁気共鳴スペクトル：
　重ジメチルスルホキシド中、テトラメチルシランのシグナル（０．００ｐｐｍ）を内部標準として測定した１Ｈ－核磁気共鳴スペクトルは、以下に示すとおりである。
１．２７（３Ｈ，ｄ，J＝７．０Ｈｚ），１．７５（１Ｈ，ｍ），１．８９（１Ｈ，ｍ），１．９５（３Ｈ，ｓ），２．２１（３Ｈ，ｓ），３．２８（１Ｈ，ｍ），３．３５（１Ｈ，ｍ），３．４３（１Ｈ，ｍ），６．９１（１Ｈ，ｄ，J＝８．５Ｈｚ），７．７０（１Ｈ，ｄ，J＝８．５Ｈｚ）ｐｐｍ
１０）１３Ｃ－核磁気共鳴スペクトル：
　重ジメチルスルホキシド中、重ジメチルスルホキシドのシグナル（３９．５ｐｐｍ）を内部標準として測定した１３Ｃ－核磁気共鳴スペクトルは、以下に示すとおりである。
７．８，９．０，１８．０，３１．９，３７．２，５８．４，１１０．４，１１３．４，１１４．１，１１４．７，１２３．２，１５５．１，１５９．７，１６６．５，１７６．７ｐｐｍ

（３）　下記の物理化学的性状を有する化合物またはその塩、
１）物質の性状：無色粉末、水溶液は弱酸性を呈する、
２）溶解性：アセトン、メタノール、ジメチルスルホキシドに可溶、水、酢酸エチル、ヘキサンに不溶
３）分子式：Ｃ１５Ｈ１８Ｏ４
４）分子量：２６２（ＥＳＩマススペクトル法により測定）
５）高分解能ＥＳＩマススペクトル法により測定した精密質量、[Ｍ＋Ｎａ]＋は次に示す通りである。
実測値：２８５．１０９４
計算値：２８５．１１０３
６）旋光度：[α]Ｄ ２７　＋８８．７°（c １．００,　メタノール）
７）紫外部吸収スペクトル：
　ＭｅＯＨ中で測定した紫外部吸収スペクトルは、以下に示す極大吸収を示す。
λmax MeOHｎｍ（ε）　２２９（２３６００），２４６（１７２００），２５４（１６４００），２９８（１３９００）ｎｍ
８）赤外吸収スペクトル：
　ＫＢｒ錠剤法で測定した赤外吸収スペクトルは、以下に示す極大吸収を示す。
３２４３，２９７６，２９３１，１７３８，１６３２，１５９２，１５１７，１４３２，１３７５，１３２６，１２５５，１１９５，１１４９，１１１５，１０９９，１０３５，１０１２，９６３，９２０，９０４，８３２，７８２，７２１，６８０，６４４，６１９，５３８，５１５，４９５，４７８，４５０ｃｍ－１
９）１Ｈ－核磁気共鳴スペクトル：
　重ジメチルスルホキシド中、テトラメチルシランのシグナル（０．００ｐｐｍ）を内部標準として測定した１Ｈ－核磁気共鳴スペクトルは、以下に示すとおりである。
１．１８（３Ｈ，ｄ，J＝６．５Ｈｚ），１．２０（３Ｈ，ｄ，J＝８．０Ｈｚ），１．９４（３Ｈ，ｓ），２．２０（３Ｈ，ｓ），３．０２（１Ｈ，ｍ），３．９２（１Ｈ，ｍ），６．９１（１Ｈ，ｄ，J＝８．５Ｈｚ），７．７０（１Ｈ，ｄ，J＝８．５Ｈｚ）ｐｐｍ
１０）１３Ｃ－核磁気共鳴スペクトル：
　重ジメチルスルホキシド中、重ジメチルスルホキシドのシグナル（３９．５ｐｐｍ）を内部標準として測定した１３Ｃ－核磁気共鳴スペクトルは、以下に示すとおりである。
７．９，９．４，１４．０，２１．１，４３．６，６８．３，１１０．５，１１３．３，１１４．８，１１５．０，１２３．２，１５５．１，１５９．５，１６５．９，１７６．８ｐｐｍ

（４）　下記の物理化学的性状を有する化合物またはその塩、
１）物質の性状：無色粉末、水溶液は弱酸性を呈する、
２）溶解性：アセトン、メタノール、ジメチルスルホキシドに可溶、酢酸エチルに難溶、水、ヘキサンに不溶
３）分子式：Ｃ１５Ｈ１８Ｏ３
４）分子量：２４６（ＥＳＩマススペクトル法により測定）
５）高分解能ＥＳＩマススペクトル法により測定した精密質量、[Ｍ＋Ｈ]＋は次に示す通りである。
実測値：２４７．１３３３
計算値：２４７．１３３４
６）旋光度：[α]Ｄ ２７　＋５８．６°（c １．００,　メタノール）
７）紫外部吸収スペクトル：
　ＭｅＯＨ中で測定した紫外部吸収スペクトルは、以下に示す極大吸収を示す。
λmax MeOHｎｍ（ε）　２２９（２３１００），２４６（１７１００），２５４（１６５００），２９８（１３６００）
８）赤外吸収スペクトル：
　ＫＢｒ錠剤法で測定した赤外吸収スペクトルは、以下に示す極大吸収を示す。
３０９８，２９６８，２９３９，２８７８，２７２４，２６２２，１６３１，１５８４，１４２９，１４１４，１３７３，１３３７，１２９７，１２５７，１２１７，１２００，１１８２，１１６４，１１０６，１０７１，１０１８，９５８，８３５，７８４，７２１，５３４，４５６，４３９ｃｍ－１
９）１Ｈ－核磁気共鳴スペクトル：
　重ジメチルスルホキシド中、テトラメチルシランのシグナル（０．００ｐｐｍ）を内部標準として測定した１Ｈ－核磁気共鳴スペクトルは、以下に示すとおりである。
０．８６（３Ｈ，ｔ，J＝７．５Ｈｚ），１．２６（３Ｈ，ｄ，J＝６．５Ｈｚ），１．６４（１Ｈ，ｍ），１．７４（１Ｈ，ｍ），１．９５（３Ｈ，ｓ），２．２１（３Ｈ，ｓ），３．０５（１Ｈ，ｍ），６．９２（１Ｈ，ｄ，J＝８．５Ｈｚ），７．７０（１Ｈ，ｄ，J＝８．５Ｈｚ）ｐｐｍ
１０）１３Ｃ－核磁気共鳴スペクトル：
　重ジメチルスルホキシド中、重ジメチルスルホキシドのシグナル（３９．５ｐｐｍ）を内部標準として測定した１３Ｃ－核磁気共鳴スペクトルは、以下に示すとおりである。
７．８，９．２，１１．８，１７，９，２７．３，３６．８，１１０．４，１１３．４，１１４．３，１１４．６，１２３．２，１５５．０，１５９．７，１６６．４，１７６．７ｐｐｍ

（５）　ラクヌム（Ｌａｃｈｎｕｍ）属に属する、（１）乃至（４）のいずれかに記載の化合物の生産菌を培養し、その培養物より（１）乃至（４）のいずれかに記載の化合物を採取することを特徴とする、（１）乃至（４）のいずれかに記載の化合物の製造方法、

（６）　ラクヌム（Ｌａｃｈｎｕｍ）属に属する、（１）乃至（４）のいずれかに記載の化合物の生産菌がラクヌム　バージネウム（Ｌａｃｈｎｕｍ　ｖｉｒｇｉｎｅｕｍ）ＳＡＮＫ１０２０７株（ＦＥＲＭ　ＢＰ－１０９１３）である、（５）に記載の製造方法、

（７）　ラクヌム（Ｌａｃｈｎｕｍ）属に属し、（１）乃至（４）のいずれかに記載の化合物を生産することを特徴とする微生物、

（８）　ラクヌム　バージネウム（Ｌａｃｈｎｕｍ　ｖｉｒｇｉｎｅｕｍ）ＳＡＮＫ１０２０７株（ＦＥＲＭ　ＢＰ－１０９１３）である、（７）に記載の微生物、

（９）　（１）乃至（４）のいずれかに記載の化合物もしくはその薬理学的に許容される塩を有効成分として含有する医薬、

（１０）　炎症、生活習慣病若しくは成人病の治療薬又は予防薬である（９）に記載の医薬、
に関する。
　本発明において、「ラクノクロモニン（英文名：”ｌａｃｈｎｏｃｈｒｏｍｏｎｉｎ”）Ａ」とは、上記一般式（Ｉ）中、Ｒ１がＣＨ３、Ｒ２がＯＨ、Ｒ３がＨ、Ｒ４がＣＨ３、Ｒ５がＣＨ（ＣＨ３）（ＣＨ２）２ＯＨであらわされる化合物、又は、上記（２）に記載の物理化学的性状を有する化合物を示す。「ラクノクロモニンＢ」とは上記一般式（Ｉ）中、Ｒ１がＣＨ３、Ｒ２がＯＨ、Ｒ３がＨ、Ｒ４がＣＨ３、Ｒ５がＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ３であらわされる化合物、又は、上記（３）に記載の物理化学的性状を有する化合物を示す。「ラクノクロモニンＣ」とは、上記一般式（Ｉ）中、Ｒ１がＣＨ３、Ｒ２がＯＨ、Ｒ３がＨ、Ｒ４がＣＨ３、Ｒ５がＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ３であらわされる化合物、又は、上記（４）に記載の物理化学的性状を有する化合物を示す。
　これら３つの化合物を総称して「ラクノクロモニン類化合物」といい、「本発明の化合物」ということもある。
　本発明の化合物は、塩基を用いて当業者に周知の方法により塩にすることができる。本発明はこれらの塩も包含する。本発明の化合物の塩を医薬として使用する場合、医学的に使用され、薬理学的に許容されるものであれば特に限定はなく、また、医薬以外の用途に用いる場合には、該用途に用いることのできるものであれば、特に限定されない。
　そのような塩としては、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、リチウム塩、のようなアルカリ金属塩；カルシウム塩、マグネシウム塩、のようなアルカリ土類金属塩；アルミニウム塩、鉄塩、亜鉛塩、銅塩、ニッケル塩、コバルト塩等の金属塩；アンモニウム塩のような無機塩；ｔ－オクチルアミン塩、ジベンジルアミン塩、モルホリン塩、グルコサミン塩、フェニルグリシンアルキルエステル塩、エチレンジアミン塩、Ｎ－メチルグルカミン塩、グアニジン塩、ジエチルアミン塩、トリエチルアミン塩、ジシクロヘキシルアミン塩、Ｎ，Ｎ’－ジベンジルエチレンジアミン塩、クロロプロカイン塩、プロカイン塩、ジエタノールアミン塩、Ｎ－ベンジル－フェネチルアミン塩、ピペラジン塩、テトラメチルアンモニア塩、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン塩のような有機アミン塩；グリシン塩、リジン塩、アルギニン塩、オルニチン塩、アスパラギン塩のようなアミノ酸塩等が挙げられる。好適には、薬理学的に許容される塩であり、より好適には、ナトリウム塩、カリウム塩、アンモニウム塩である。
　また、本発明の化合物およびその塩は、大気中に放置したり、水又は有機溶媒と混和したりすることによって水又は溶媒と結合し、水和物又は溶媒和物を形成する場合があるが、これらの水和物及び溶媒和物も本発明に含まれる。
　更に、本発明のラクノクロモニン類化合物は、種々の立体構造を有する。本発明においては、これらの立体異性体の等量および非等量混合物が、全て単一の構造式で示されているが、本発明の化合物は、これらの立体異性体および２つ以上の立体異性体の混合物をも、全て含むものである。好適には、ラクノクロモニンＡとしては上記一般式（Ｉ）中、Ｒ１がＣＨ３、Ｒ２がＯＨ、Ｒ３がＨ、Ｒ４がＣＨ３、Ｒ５がＣＨ（ＣＨ３）（ＣＨ２）２ＯＨであらわされ、且つ、メタノール中の旋光度が[α]Ｄ ２７　＋７０．４°（c １．００,　メタノール）を示す化合物である。また、ラクノクロモニンＢとしては上記一般式（Ｉ）中、Ｒ１がＣＨ３、Ｒ２がＯＨ、Ｒ３がＨ、Ｒ４がＣＨ３、Ｒ５がＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ３であらわされ、且つ、メタノール中の旋光度が[α]Ｄ ２７　＋８８．７°（c １．００,　メタノール）を示す化合物である。また、ラクノクロモニンＣとしては、上記一般式（Ｉ）中、Ｒ１がＣＨ３、Ｒ２がＯＨ、Ｒ３がＨ、Ｒ４がＣＨ３、Ｒ５がＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ３であらわされ、且つ、メタノール中の旋光度が[α]Ｄ ２７　＋５８．６°（c １．００,　メタノール）を示す化合物である。
　本発明のラクノクロモニン類化合物は、該物質を生産する微生物の培養物から、常法に従って単離・精製することが出来る。本発明のラクノクロモニン類化合物を生産する微生物としては、特に限定されないが、好適には真菌であり、より好適にはラクヌム属（Ｌａｃｈｎｕｍ）に属する菌株、例えばラクヌム　バージネウム（Ｌａｃｈｎｕｍ　ｖｉｒｇｉｎｅｕｍ）ＳＡＮＫ１０２０７株（以下、単に「ＳＡＮＫ１０２０７株」と称する）をあげることができる。
ＳＡＮＫ１０２０７株は、長野県で採集した子実体の子のう胞子より分離された。
本菌の菌学的性状を観察するため、次の各培地上で培養を行った。使用した各培地の組成を以下に記載する。
［表１］
ＰＤＡ培地（ポテトデキストロース寒天（Ｐｏｔａｔｏ　Ｄｅｘｔｒｏｓｅ　Ａｇａｒ）培地）
――――――――――――――――――――――――――――――――――
ポテトデキストロース寒天培地「ニッスイ」（日水製薬（株）製）　３９ｇ
寒天　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　     　     ５ｇ
蒸留水　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　   　     １０００ｍＬ
――――――――――――――――――――――――――――――――――

［表２］
ＭＥＡ培地（マルトエキス寒天培地）
―――――――――――――――
マルトエキス　　　１２．５ｇ
寒天　　　　　　　 ２０ｇ
蒸留水　　　　１０００ｍＬ
―――――――――――――――

ＳＡＮＫ１０２０７株の上記各培地上の培養における菌学的性状は次の通りである。なお、ここで色調の表示は「メチューン・ハンドブック・オブ・カラー、第三編（Ｋｏｒｎｅｒｕｐ　Ａ．＆　Ｗａｎｓｃｈｅｒ　Ｊ．　Ｈ．　（１９７８）　Ｍｅｔｈｕｅｎ　ｈａｎｄｂｏｏｋ　ｏｆ　ｃｏｌｏｕｒ（３ｒｄ．　ｅｄｉｔｉｏｎ）．　Ｅｒｙｅ　Ｍｅｔｈｕｅｎ，　Ｌｏｎｄｏｎ））」　に従った。
ＰＤＡ培地上での成長は、２３℃、３週間の培養で２０乃至２４ｍｍである。菌そうは綿毛状、しばしば放射状に溝があり、白色を呈し、菌そう表面に浸出液を有することがある。裏面はグレイッシュオレンジ（５Ｂ５）乃至イエロイッシュホワイト（４Ａ２）を呈する。
ＭＥＡ培地上での成長は、２３℃、３週間の培養で２９乃至３０ｍｍである。菌そうは、中心部で羊毛状だが全体に圧伏し薄く、白色を呈する。裏面は変化なし。
ＰＤＡ培地とＭＥＡ培地での気菌糸は幅１乃至３μｍ、薄壁、平滑、無色である。しばしば油滴状のものが壁に付着した菌糸が観察される。子のう盤及び分生子は形成されない。
　ＳＡＮＫ１０２０７株を同定するため、分離に供試した子実体乾燥標本の菌学的性状を観察した。その乾燥標本の菌学的性状は次の通りである。
子のう盤は散生、表在し、柄を有し、毛は白色でその他の部分は淡黄色を呈する。盤面は直径０．６ｍｍ以下、碗状乃至円盤状である。柄は長さ０．４ｍｍ以下である。托外皮層は短形菌組織を形成する。毛は長さ９５μｍ以下、幅３乃至４μｍ、円筒形、全体に粗面、薄壁、無色、先端は鈍頭でしばしばやや肥大する。子のうは４４乃至５８×３．５乃至５μｍ、円筒状棍棒形、８胞子性、その先端はメルツァー試薬にて青変する。子のう胞子は６乃至１０．５×１．５乃至２μｍ、円筒形乃至長紡錘形、単細胞、薄壁、平滑である。側糸は４０乃至６４×３．５乃至５μｍ、やり型、子のうのより１９μｍ以下で伸長する。
本菌の以上のような菌学的性状は、以下に示すスプーナー著、「ラクヌム　バージネウム（Ｌａｃｈｎｕｍ　ｖｉｒｇｉｎｅｕｍ）（Ｓｐｏｏｎｅｒ　Ｂ．　Ｍ．　（１９８７）　Ｈｅｌｏｔｉａｌｅｓ　ｏｆ　Ａｕｓｔｒａｌａｓｉａ：　Ｇｅｏｇｌｏｓｓａｃｅａｅ，　Ｑｒｂｉｌｉａｃｅａｅ，　Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａｃｅａｅ，　Ｈｙａｌｏｓｃｙｐｈａｃｅａｅ．　Ｂｉｂｌ．　Ｍｙｃｏｌ．，ｖｏｌ．１１６：ｐｐ．５３４－５３９）」の記載に一致したため、本菌株を、ラクヌム　バージネウム（Ｌａｃｈｎｕｍ　ｖｉｒｇｉｎｅｕｍ）と同定した。
なお、ＳＡＮＫ１０２０７株は、平成１９年９月２６日付で日本国茨城県つくば市東１－１－１の独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに国際寄託され、受託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ－１０９１３を付与された。
周知の通り、真菌類は自然界において、又は人工的な操作（例えば、紫外線照射、放射線照射、化学薬品処理等）により、変異を起こしやすく、本発明のＳＡＮＫ１０２０７株もその点は同じである。本発明にいうＳＡＮＫ１０２０７株は、その全ての変異株を包含する。好適には本発明のＳＡＮＫ１０２０７株に包含される変異株は、ラクノクロモニンＡ、Ｂ及びＣを生産することを特徴とする菌株である。
また、これらの変異株の中には、遺伝的方法、たとえば組み換え、形質導入、形質転換等により得られたものも含まれるが、ラクノクロモニン類化合物を産生する限りにおいてそのような変異株も全て本発明のＳＡＮＫ１０２０７株に包含される。即ち、ラクノクロモニン類化合物を生産するＳＡＮＫ１０２０７株の変異株およびそれらと明確に区別されない菌株は全てＳＡＮＫ１０２０７株に包含される。
本発明のラクノクロモニン類化合物は、該物質の生産菌を培養することにより製造することができる。ＳＡＮＫ１０２０７株の培養は、通常、微生物の二次代謝産物の製造に使用されるような培地を用いて行うことができる。そのような培地は、微生物が資化できる炭素源、窒素源及び無機塩を含有する。
炭素源としては、例えば、グルコース、フラクトース、マルトース、シュークロース、マンニトール、グリセリン、デキストリン、オート麦、ライ麦、大麦、玄米、トウモロコシデンプン、ジャガイモ、トウモロコシ粉、大豆油、綿実油、糖蜜、クエン酸、酒石酸等をあげることができる。これらの炭素源は単独または組み合わせて用いることができる。
培地に加える炭素源の量は、培地中の他の成分により異なるが、通常、培地量の１乃至１０重量％である。
窒素源としては、例えば、大豆粉、フスマ、落下生粉、綿実紛、カゼイン加水分解物、ファーマミン、魚粉、コーンスチープリカー、ペプトン、肉エキス、イースト、イーストエキス、マルトエキス、ゼラチン、硝酸ナトリウム、硝酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、Ｌ－グルタミン酸ナトリウム等が挙げられ、これらの窒素源は単独または組み合わせて用いることができる。窒素源の添加量は、培地中の他の成分により異なるが、通常、培地量の０．２乃至１０重量％の範囲であり、好適には０．２乃至６重量％である。
栄養無機塩としては、例えば、ナトリウムイオン、カリウムイオン、アンモニウムイオン、カルシウムイオン、リン酸イオン、硫酸イオン、塩化物イオン、炭酸イオン等のイオンを得ることのできる塩類が使用される。また、カルシウム、コバルト、マンガン、マグネシウム、モリブデン等の金属を微量含む塩類も使用することができる。
また、菌の資化しうるビタミンＢ１、ビオチンのようなビタミン類、チアミンのような菌体増殖促進物質等を、必要に応じて添加してもよい。
炭素源、窒素源、栄養無機塩および菌体増殖促進物質等は、一般に組み合わせて用いるが、純粋な形態である必要はなく、より純度の低いものを用いてもよい。
栄養培地が泡立つ場合などには、必要に応じて、シリコンオイル、ポリアルキレングリコールエーテル、植物油、動物油、界面活性剤のような消泡剤を培地に添加してもよい。
特に、液体培養に際しては、これらの消泡剤を添加することが好適である。
培地のｐＨは、培地の成分、生育温度等により異なるが、醗酵生成物を生産するために通常用いられるｐＨであればよい。
ラクノクロモニンＡ、Ｂ及びＣは、ＳＡＮＫ１０２０７株を好気的に培養することにより得られる。このような培養法としては、例えば、固形培地を用いた培養法、振盪培養法、攪拌培養法又は通気撹拌培養法等が挙げられる。
菌の生育温度は、培地の成分、ｐＨ等により異なるが、通常、１５℃乃至３０℃であり、２０乃至２８℃の範囲が生育に良好である。ラクノクロモニンＡ、Ｂ及びＣの生産には、２０乃至２６℃が好適である。
固形培地を用いた培養においては、２０乃至２６℃（好適には、２３℃）で１０日以上静地培養を行なうのが好適である。
培養は、三角フラスコ中で一段階または複数段階の菌の発育工程により開始する。前培養には炭素源、窒素源、微量の生育因子、無機塩類および微量金属類を併用できる。三角フラスコに滅菌した前培養用培地を加え、ＳＡＮＫ１０２０７株を植菌した後、定温インキュベーター中で２０乃至２６℃（好適には２３℃）、５乃至１０日間（好適には７日間）振盪するか、充分に成長するまで振盪することにより行う。生育した前培養液の一部または全部は、次段階の前培養用培地または生産培養用培地に植菌するために使用される。生産用培養は、滅菌した生産培養用培地を含む三角フラスコや固体培養用プラスチックバッグ中の生産培養用培地に、該前培養液を接種することにより開始する。接種した生産培養用培地を含む三角フラスコを一定温度で数日間または充分に成長するまで振盪することにより生産培養を行なう。または、固形培地を含む培養容器を一定温度で数日間または充分に成長するまで静置して、生産培養を行なう。
　大量培養には、撹拌機、通気装置を備えた適当なジャーまたはタンク醗酵槽で培養するのが好ましい。培地は、ジャーまたはタンク醗酵槽の中で作製することができ、１２１℃に加熱して滅菌後、冷却して使用する。培養は、ジャーまたはタンク醗酵槽内の生産培養用培地に前培養液を接種し、９乃至３５℃（好適には１５℃乃至３３℃、最適には２３℃）で通気撹拌して行うことができる。この方法は多量の化合物を得るのに適している。
　培養終了後、得られた培養物、培養物の遠心分離、もしくはろ過操作によって得られるろ液または上清、および菌体を用いて、あるいは培養物全体を用いて、抽出、精製することにより、目的の化合物を得ることができる。
　培養の経過に伴って生産されるラクノクロモニンＡ、Ｂ及びＣの量は、培養液の一部を採取した後、該化合物を抽出し、高速液体クロマトグラフィーを実施し、該化合物を測定することにより、モニターすることができる。
固体培養物中に存在するラクノクロモニンＡ、Ｂ及びＣは、５０乃至１００％の含水アセトンまたはアセトン、含水メタノールまたはメタノールにより抽出し、固形部分を、珪藻土をろ過助剤とするろ過操作、または遠心分離によって分別し、得られたろ液から、高速液体クロマトグラフィーを指標にして、その物理化学的性状を利用し、抽出、精製することができる。
　液体培養の場合、培養終了後、培養液中の液体部分、菌体内、またはその双方に存在するラクノクロモニンＡ、Ｂ及びＣは、培養終了物の全て、あるいは菌体、その他の固形部分を珪藻土をろ過助剤とするろ過操作または遠心分離によって分別し、得られたろ液または上清および菌体中から、高速液体クロマトグラフィーを指標にして、その物理化学的性状を利用し、抽出精製することができる。
　ろ液または上清中に存在するラクノクロモニンＡ、Ｂ及びＣは、中性乃至酸性条件下で、水と混和しない有機溶剤、例えば、酢酸エチル、クロロホルム、塩化エチレン、塩化メチレン、ブタノール等の単独またはそれらの組み合わせにより、抽出精製することができる。吸着剤を使用して抽出精製する場合には、例えば、活性炭または吸着用樹脂であるアンバーライトＸＡＤ－２、ＸＡＤ－４（ローム・アンド・ハース（株）製）等や、ダイヤイオンＨＰ－１０、ＨＰ－２０、ＣＨＰ２０Ｐ、ＨＰ－５０、セパビーズＳＰ－２０７（三菱化学（株）製）等を使用して抽出精製することもできる。この場合、目的化合物を含む液の不純物を吸着剤に吸着させ、その通過液を得ることにより取り除くか、または、目的化合物を吸着させて不純物を洗い流した後、メタノール水、アセトン水、ブタノ－ル水等を用いて目的化合物を溶出させることにより、目的化合物を抽出精製することができる。
　菌体内に存在するラクノクロモニンＡ、Ｂ及びＣは、５０乃至９０％の含水アセトンまたは含水メタノールにより抽出し、濃縮操作により有機溶剤を除去した後、上記と同様に抽出精製操作を行うことにより、得ることができる。例えば、培養終了後に適当量（好ましくは終濃度５０％）のアセトンまたはメタノールを添加することにより、目的の化合物を抽出することができる。抽出終了後、珪藻土をろ過助剤とするろ過操作を行ない、得られた抽出液をろ液と同様な抽出精製操作を行うことにより、目的の化合物を抽出精製することができる。
　上記の方法により抽出精製されたラクノクロモニンＡ、Ｂ及びＣを含む溶液は、シリカゲル、セファデックスＬＨ－２０（アマシャムバイオサイエンス（株）製）、フロリジル、コスモシル（ナカライテスク（株）製）のような担体を用いた分配カラムクロマトグラフィー；ダイヤイオンＨＰ－２０、ＣＨＰ２０Ｐ（三菱化学（株）製）のような担体を用いた吸着カラムクロマトグラフィー；セファデックスＧ－１０（アマシャムバイオサイエンス（株）製）、トヨパールＨＷ４０Ｆ（トーソー（株）製）などを用いたゲルろ過クロマトグラフィー；および順相、逆相カラムを用いた高速液体クロマトグラフィー等により、更に精製することができる。
　以上の分離、精製の手段を単独または適宜組み合わせ、場合によっては反復して用いることにより、本発明のラクノクロモニンＡ、Ｂ及びＣを分離精製することができる。
　以上、ラクノクロモニンＡ、Ｂ及びＣの製造法の代表的な方法を説明したが、製造方法はこれらに限定されず、既に当業者に知られているこれら以外の製造方法を用いることもできる。
　本発明は、ラクノクロモニンＡ、Ｂ及びＣまたはその薬学的に許容される塩を有効成分として含有する医薬に関する。ラクノクロモニンＡ、Ｂ及びＣは、抗酸化活性、抗腫瘍活性、抗炎症活性、抗アレルギー活性、骨形成促進活性、及び／又は、骨吸収抑制活性を有する。
　呼吸などで体内に取り込まれた酸素の一部は、ストレスや紫外線などにより活性酸素種になる。活性酸素種は分子内に不対電子（ラジカル）を持つ酸素分子、又はその関連物質の総称で、非常に酸化力が強く、生体に侵入した細菌などに対して防御的に使用されるが、過剰な活性酸素種はＤＮＡを損傷し、老化や発癌、生活習慣病などの一因になると考えられている。活性酸素種の過剰生成を抑える機能は生体内にも存在するが、その機能は加齢に伴い低下する。抗酸化剤には活性酸素種の生成を抑える働きがあり、老化や発癌、生活習慣病などの予防効果が期待される。
　炎症作用とは、本来異物の侵入やそれに起因する障害といった、生体にとって有害な事象に対する防御的免疫反応であるが、炎症性サイトカインや一酸化窒素（ＮＯ）などの炎症性メディエーターの過剰な発現は、生体自身にも多大な損傷を与える可能性がある。例えば、炎症性サイトカインの一つである腫瘍壊死因子（ＴＮＦ－α）は、活性化好中球の血管内皮細胞への付着を促進し、血管内皮細胞の傷害を引き起こす。またＮＯは、病原体やウィルスの侵入やそれに起因する障害の防御に用いられるが、過剰なＮＯは細胞を障害し、発癌や炎症性疾患の悪化の原因となる。またＮＯは、生体内のＯ２ラジカルと反応し、より細胞障害活性が強いペロキシナイトライト（ＯＮＯＯ-）に変化する。このような過剰な炎症性メディエーターの抑制薬は、サイトカイン抑制抗炎症薬（ＣＳＡＩＤ）と呼ばれる。
　アレルギー反応も過剰な免疫反応の一つで、その発生機序により、Ｉ型からＶ型までに分類され、その中で、花粉症やアトピー性皮膚炎はＩ型に分類される。Ｉ型アレルギーにおいては、肥満細胞や好塩基球に結合した免疫グロブリンの一種である、IgEに抗原となる異物が結合する事により、これらの細胞からヒスタミンなどの生理活性物質が放出される。それらの生理活性物質により、血管の拡張・透過性亢進などが起こり、浮腫、掻痒などの症状があらわれる。従って、肥満細胞からのヒスタミンなどの放出や、その作用を抑える事が出来れば、Ｉ型アレルギーの発症を緩和・軽減させる事が期待できる。
骨では、骨芽細胞による骨形成と破骨細胞による骨吸収が絶えず繰り返されて、組織が再構築されている（骨リモデリング）。骨粗鬆症は、この骨代謝のバランスが崩れ、骨形成の低下や骨吸収の亢進により、骨量と骨質が低下して骨折のリスクが増大する疾患である。骨粗鬆症は、加齢、閉経によるエストロゲンの低下等を病因とする、原発性骨粗鬆症と、関節リウマチ、副甲状腺機能亢進症、及びステロイドや免疫抑制剤等の服用による、二次性骨粗鬆症に大別される。骨粗鬆症治療薬の候補物質としては、骨形成を促進する物質、あるいは亢進した骨吸収を抑制する物質が考えられ、本発明の化合物はこのような活性を有する。
すなわち、本発明の化合物を含有する医薬は、癌、アレルギー、炎症、骨粗鬆症、生活習慣病及び／又は成人病の治療薬或は予防薬として有用である。
また、本発明は、該医薬を投与することによる、癌、アレルギー、骨粗鬆症、生活習慣病及び／又は成人病の治療或いは予防方法に関する。更に、本発明は、癌、アレルギー、骨粗鬆症、生活習慣病及び／又は成人病の治療薬或いは予防薬を製造するためのラクノクロモニンＡ、Ｂ及びＣまたはその薬学的に許容される塩の使用に関する。
　本発明のラクノクロモニンＡ、Ｂ及びＣまたはその薬理学的に許容される塩は、種々の形態で投与することができる。その投与形態としては、例えば、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、乳剤、丸剤、散剤、シロップ剤（液剤）等による経口投与、または注射剤（静脈内、筋肉内、皮下または腹腔内投与）、点滴剤、坐剤（直腸投与）等による非経口投与を挙げることができる。これらの各種製剤は、常法に従って主薬に賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、矯味矯臭剤、溶解補助剤、懸濁剤、コーティング剤等の医薬の製剤技術分野において通常使用し得る補助剤を用いて製剤化することができる。
　錠剤として使用する場合、担体として、例えば、乳糖、白糖、塩化ナトリウム、グルコース、尿素、デンプン、炭酸カルシウム、カオリン、結晶セルロース、ケイ酸等の賦形剤；水、エタノール、プロパノール、単シロップ、グルコース液、デンプン液、ゼラチン溶液、カルボキシメチルセルロース、セラック、メチルセルロース、リン酸カリウム、ポリビニルピロリドン等の結合剤；乾燥デンプン、アルギン酸ナトリウム、寒天末、ラミナラン末、炭酸水素ナトリウム、炭酸カルシウム、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸モノグリセリド、デンプン、乳糖等の崩壊剤；白糖、ステアリン、カカオバター、水素添加油等の崩壊抑制剤；第４級アンモニウム塩類、ラウリル硫酸ナトリウム等の吸収促進剤；グリセリン、デンプン等の保湿剤；デンプン、乳糖、カオリン、ベントナイト、コロイド状ケイ酸等の吸着剤；精製タルク、ステアリン酸塩、硼酸末、ポリエチレングリコール等の潤沢剤等を使用することができる。また、必要に応じ通常の剤皮を施した錠剤、例えば糖衣錠、ゼラチン被包錠、腸溶被錠、フィルムコーティング錠あるいは二重錠、多層錠とすることができる。
　丸剤として使用する場合、担体として、例えば、グルコース、乳糖、カカオバター、デンプン、硬化植物油、カオリン、タルク等の賦形剤；アラビアゴム末、トラガント末、ゼラチン、エタノール等の結合剤；ラミナラン寒天等の崩壊剤等を使用することができる。
　坐剤として使用する場合、担体としてこの分野で従来公知のものを広く使用でき、例えばポリエチレングリコール、カカオバター、高級アルコール、高級アルコールのエステル類、ゼラチン、半合成グリセリド等を挙げることができる。
　注射剤として使用する場合、液剤、乳剤または懸濁剤として使用することができる。これらの液剤、乳剤または懸濁剤は、殺菌され、血液と等張であることが好ましい。これら液剤、乳剤または懸濁剤の製造に用いる溶液は、医療用の希釈剤として使用できるものであれば特に限定はなく、例えば、水、エタノール、プロピレングリコール、エトキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル類等を挙げることができる。なお、この場合、等張性の溶液を調製するのに充分な量の食塩、グルコースまたはグリセリンを製剤中に含んでいてもよく、また通常の溶解補助剤、緩衝剤、無痛化剤等を含んでいてもよい。
　また、上記の製剤には、必要に応じて、着色剤、保存剤、香料、風味剤、甘味剤等を含めることもでき、更に、他の医薬品を含めることもできる。
　上記製剤に含まれる有効成分化合物の量は、特に限定されず広範囲に適宜選択されるが、通常、全組成物中１７０重量％、好ましくは１乃至３０重量％含む。
　使用量としては、症状、年齢、体重、投与方法および剤形等によって異なるが、通常は成人に対して１日あたり、上限として２０００ｍｇ（好ましくは１００ｍｇ）であり、下限として０．１ｍｇ（好ましくは１ｍｇ、さらに好ましくは１０ｍｇ）を症状に応じて、一日１回または数回に分けて投与することができる。
　本発明により、抗酸化活性、抗腫瘍活性、抗炎症活性、抗アレルギー活性、骨形成促進活性、及び／又は、骨吸収抑制活性を有する新規な化合物が提供される。
　次に、実施例、試験例及び製剤例を挙げて本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれに限定されない。
（実施例１）ＳＡＮＫ１０２０７株の培養
（１）凍結シードの作製
後述の表３に示したＰＤＡ斜面培地上に生育させたＳＡＮＫ１０２０７株の菌糸を、白金耳をもちいて寒天ごと掻き取り、生理食塩水で懸濁した。１２１℃にて３０分間滅菌した、後述の表４の培地２０ｍＬを入れた１００ｍＬ容三角フラスコに、上記の菌懸濁液を無菌的に植菌した。種培養に際しては、ロータリー振盪機で２３℃、２１０ｒｐｍ、６日間振盪培養した。得られた種培養液に無菌的に２０ｍＬの２０％グリセリン液を入れ混合し、１．５ｍＬを抜き取って２ｍＬ容クライオチューブに無菌的に注ぎ入れ、終濃度１０％グリセリン液として－８０℃で凍結保存した（以下、凍結保存した種培養液を「凍結シード」という）。
［表３］
ＰＤＡ斜面培地の組成
―――――――――――――――――――
ジャガイモ　　　　　　　　　２００ｇ
グルコース　　　　　　　　　　１０ｇ
寒天　　　　　　　　　　　　　 ２０ｇ
水道水　　　　　　　　　　１０００ｍＬ
―――――――――――――――――――
調製法：皮をむいたジャガイモ２００g を１～２ｃｍの采の目に切り、１０００ｍＬの水に入れ、1時間煮沸した後、ろ過した。このジャガイモ煮出し液にグルコース、寒天を添加し、最終的に水道水で１０００ｍＬに調整して使用した。
ｐＨ：無調整。
滅菌：１２１℃にて２０分間滅菌した。

［表４］
　種培養及び前培養用培地の組成
――――――――――――――――――――
グリセリン　　　　　　　　　　    ３０ｇ
グルコース　　　　　　　　　  ３０ｇ
可溶性デンプン　　　　　　２０ｇ
大豆粉　　　　　　　　　　　  １０ｇ
ゼラチン　　　　　　　　　　　  ２．５ｇ
イーストエキス　　　　　　　　 ２．５ｇ
ＮＨ４ＮＯ３　　　　　　　　　    ２．５ｇ
寒天　　　　　　　　　　　　　   ３ｇ
消泡剤（ＣＢ４４２）　　　　　   ０．１ｇ
――――――――――――――――――――
調製法：上記成分に、最終容量が１０００ｍＬとなるように水道水を加え、使用した。
ｐＨ：２５％水酸化ナトリウム水溶液で約６．５に調整。
（２）第一前培養
５００ｍＬ容三角フラスコに仕込んだ前記表４の培地、８０ｍＬを、１２１℃にて３０分間滅菌した後、室温で融解した前項（１）で作製した凍結シード２本の全量を無菌的に植菌した。第一前培養に際しては、ロータリー振盪機で２３℃、２１０ｒｐｍ、４日間振盪培養した。
（３）第二前培養
２Ｌ容三角フラスコに仕込んだ前記表４の培地、５００ｍＬを１２１℃にて３０分間滅菌した後、前項（２）で得られた第一前培養液、１２．５ｍＬを無菌的に植菌した。第二前培養に際しては、ロータリー振盪機で２３℃、２１０ｒｐｍ、３日間振盪培養した。
（４）第三前培養
３０Ｌ容ジャー醗酵槽に仕込んだ前記表４の培地、１８Ｌを１２１℃にて３０分間滅菌した後、前項（３）で得られた第二前培養液全量を無菌的に植菌した。第三前培養に際しては、該醗酵槽に平羽根タービン翼を２枚装着し、２３℃、１ｖｖｍ、１００ｋＰａ（Ｇ）で培養液中の溶存酸素濃度が５ｐｐｍ以上を保持するように、攪拌回転数を調節しながら培養した。
（５）主醗酵
６００Ｌ容タンク醗酵槽に仕込んだ、後述の表５に記した主醗酵用培地（Ａ）、４００Ｌを１２１℃にて２０分間滅菌した後、前項（４）の条件で３日間培養して得られた第三前培養液、１０Ｌを無菌的に植菌した。主醗酵に際しては、６００Ｌ容醗酵槽に平羽根タービン翼を２枚装着し、２３℃、１ｖｖｍ、１００ｋＰａ（Ｇ）で培養液中の溶存酸素濃度が５ｐｐｍ以上を保持するように攪拌回転数を調節しながら、１７日間培養した。（主醗酵１）
３０Ｌ容ジャー醗酵槽に仕込んだ、後述の表５に記した主発酵用培地（Ａ）、１８Ｌを１２１℃にて２０分間滅菌した後、前項（４）の条件で３日間培養して得られた第三前培養液、０．４５Ｌを無菌的に植菌した。主発酵に際しては、３０Ｌ容発酵槽に平羽根タービン翼を２枚装着し、２３℃、１ｖｖｍ、１００ｋＰａ（Ｇ）で培養液中の溶存酸素濃度が５ｐｐｍ以上を保持するように攪拌回転数を調節しながら、１７日間培養した。（主醗酵２）
同様に、３０Ｌ容ジャー醗酵槽に仕込んだ、後述の表５に記した主発酵用培地（Ａ）、１８Ｌを１２１℃にて２０分間滅菌した後、前項（４）の条件で２日間培養して得られた第三前培養液、０．４５Ｌを無菌的に植菌した。主発酵に際しては、３０Ｌ容発酵槽に平羽根タービン翼を２枚装着し、２３℃、１ｖｖｍ、１００ｋＰａ（Ｇ）で培養液中の溶存酸素濃度が５ｐｐｍ以上を保持するように攪拌回転数を調節しながら、１８日間培養した。（主醗酵３）
３０Ｌ容ジャー醗酵槽に仕込んだ、後述の表６に記した主発酵用培地（Ｂ）、１８Ｌを１２１℃にて２０分間滅菌した後、前項（４）の条件で３日間培養して得られた第三前培養液、０．４５Ｌを無菌的に植菌した。主発酵に際しては、３０Ｌ容発酵槽に平羽根タービン翼を２枚装着し、２３℃、１ｖｖｍ、１００ｋＰａ（Ｇ）で培養液中の溶存酸素濃度が５ｐｐｍ以上を保持するように攪拌回転数を調節しながら、１７日間培養した。（主醗酵４）
同様に、３０Ｌ容ジャー醗酵槽に仕込んだ、後述の表６に記した主発酵用培地（Ｂ）、１８Ｌを１２１℃にて２０分間滅菌した後、前項（４）の条件で２日間培養して得られた第三前培養液、０．４５Ｌを無菌的に植菌した。主発酵に際しては、３０Ｌ容発酵槽に平羽根タービン翼を２枚装着し、２３℃、１ｖｖｍ、１００ｋＰａ（Ｇ）で培養液中の溶存酸素濃度が５ｐｐｍ以上を保持するように攪拌回転数を調節しながら、１８日間培養した。（主醗酵５）
［表５］
主醗酵培地（Ａ）の組成
――――――――――――――――――――
グリセリン　　　　　　　　　   ３０ｇ
グルコース　　　　　　　　　  ３０ｇ
可溶性デンプン　　　　　　　２０ｇ
ゼラチン　　　　　　　　　　　  ２．５ｇ
イーストエキス　　　　　　　　 ２．５ｇ
ＮＨ４ＮＯ３　　　　　　　　　   ２．５ｇ
消泡剤（ＣＢ４４２）　　　　　 ０．１ｇ
――――――――――――――――――――
調製法：上記成分に、最終容量が１０００ｍＬとなるように水道水を加え、使用した。
ｐＨ：２５％水酸化ナトリウム水溶液で約６．５に調整

［表６］
主発酵培地（Ｂ）の組成
―――――――――――――――――――――――――
グリセリン　　　　　　　　　　   ３０ｇ
グルコース　　　　　　　　　　  ３０ｇ
可溶性デンプン　　　　　　　　２０ｇ
ゼラチン　　　　　　　　　　　   ２．５ｇ
カツオエキス　　　　　　　　　 ５ｇ
ＮＨ４ＮＯ３　　　　　　　　　   ２．５ｇ
消泡剤（ＣＢ４４２）　　　　　 ０．１ｇ
―――――――――――――――――――――――――
調製法：上記成分に、最終容量が１０００ｍＬとなるように水道水を加え、使用した。
ｐＨ：２５％水酸化ナトリウム水溶液で約６．５に調整。
（実施例２）ラクノクロモニンＡ、Ｂ及びＣの単離・精製
　以下の精製においては、表７に示す条件でＨＰＬＣを用いることにより、ラクノクロモニン類化合物をモニターした。
［表７］
ラクノクロモニン類化合物モニター条件
―――――――――――――――――――――――――――――
カラム：カデンツァ（Ｃａｄｅｎｚａ）ＣＤ-Ｃ１８（３μｍ）：４．６φ×７５ｍｍ　(インタクト（株）製)
　溶媒：Ａ液；０．０１％蟻酸を含む１０ｍＭ蟻酸アンモニウム水
Ｂ液；０．０１％蟻酸を含むアセトニトリル
開始から３分；Ａ：Ｂ＝７：３
３分から７分；Ａ：Ｂ＝９：１１
　流速：１．２ｍＬ／分
　検出：紫外部吸収２３０ｎｍ
　保持時間：　Ａ；３．３分、Ｂ；３．８分、Ｃ；６．１分
―――――――――――――――――――――――――――――

　実施例１の主醗酵１乃至５により得られた培養終了液を合併した後（５２０Ｌ）、該合併液にアセトン（５２０Ｌ）を添加し、約４時間攪拌し、縣濁液を得た。該縣濁液を２４時間静置した後、セライト ５４５（２２．７ｋｇ）を加え、フィルタープレス（手動圧搾式フィルタープレスＴＦＰ－３１０－８型、東京エンジニアリング工業株式会社製）でろ過を行った。
得られたアセトン抽出液（９９０Ｌ）を減圧濃縮し、アセトンを留去した。濃縮液（５５０Ｌ）のｐＨを７５％濃硫酸（２６０ｍＬ）で２．９に調整した後、酢酸エチル（２５０Ｌ）を加えて抽出を行った。分画後の水層に再度酢酸エチル（２５０Ｌ）を加えて抽出し、２度の抽出操作で得られた有機層を合併した。この有機層（５３０Ｌ）を０．２Ｍリン酸水素二ナトリウム水溶液（１５０Ｌ）で洗浄後、更に２５％食塩水（１００Ｌ）で洗浄し、洗浄有機層（５００Ｌ）を得た。この洗浄有機層を減圧濃縮し、得られた濃縮液（２７．５Ｌ）に無水硫酸ナトリウム（約１ｋｇ）を加えて約２時間脱水した。ろ過により無水硫酸ナトリウムを除去した後、ろ液を減圧下、濃縮乾固し、油状物質（４５０ｇ）が得られた。
この油状物質を、ヘキサン：酢酸エチル＝１：１溶液（１．８Ｌ）に溶解した後、ヘキサン：酢酸エチル＝３：２溶液で平衡化したシリカゲル（Ｓｉｌｉｃａ　ｇｅｌ　６０（０．０６３－０．２００　ｍｍ）、Ｍｅｒｃｋ社製）カラム（１０Ｌ）に供与した。カラムをヘキサン：酢酸エチル＝１：１（６０Ｌ）で展開し、溶出液を１０Ｌ毎に分画した（フラクション（以降Ｆｒ．と略記）１乃至６）ところ、ラクノクロモニンＣを主成分とするＦｒ．２及び３の合併画分（２０Ｌ）が得られた。
引き続きカラムを該溶媒（２０Ｌ）で洗浄後、カラムをヘキサン：酢酸エチル＝１：４（６０Ｌ）で展開し、溶出液を５Ｌ毎に分画した（Ｆｒ．７乃至１８）ところ、ラクノクロモニンＢを主成分とするＦｒ．７乃至９の合併画分（１５Ｌ）と、ラクノクロモニンＡを主成分とするＦｒ．１１乃至１６の合併画分（３０Ｌ）が得られた。
上記のＦｒ．２乃至３の合併画分を減圧濃縮した後、冷却し、ラクノクロモニンＣを晶析させた後、ろ過により得られた結晶を真空乾燥し、ラクノクロモニンＣの無色結晶粉末(１５ｇ)が得られた。
上記のＦｒ．７乃至９の合併画分を減圧濃縮した後、冷却し、ラクノクロモニンＢを晶析させた後、ろ過により得られた結晶を真空乾燥し、ラクノクロモニンＢの無色結晶粉末(５．７ｇ)が得られた。
上記のＦｒ．１１乃至１６の合併画分を減圧濃縮した後、冷却し、ラクノクロモニンＡを晶析させた後、ろ過により得られた粗結晶を真空乾燥し、ラクノクロモニンＡの粗結晶粉末(７２ｇ)が得られた。この粗結晶粉末に酢酸エチル：メタノール９：１溶液（１Ｌ）を添加した後、不溶物を、メタノール（２００ｍＬ）を添加して完全に再溶解させた。該溶液を減圧濃縮、冷却させることで再晶析を行った。ろ過により得られた結晶を真空乾燥し、ラクノクロモニンＡの無色結晶粉末(６９ｇ)が得られた。
（試験例１）抗酸化活性
本発明の新規化合物、ラクノクロモニンＡ，Ｂ及びＣの抗酸化活性は、以下の方法で評価できる。
（ｉ）１－Ｄｉｐｈｅｎｙｌ－２－ｐｉｃｒｙｌｈｙｄｒａｚｙｌ（ＤＰＰＨ）ラジカルの消去率測定試験
ＤＰＰＨラジカルは、比較的安定なラジカルで、５１７ｎｍに最大吸収を持ち、このラジカルを用いて被検物質の抗酸化作用を評価できる。具体的には、ＤＰＰＨと被験物質を溶媒中で混合して反応させた後、５１７ｎｍの吸光度を測定する。被験物質によるＤＰＰＨラジカルの消去率は、以下の方法で算出する事が出来，この消去率が高いほど該被験物質が高い抗酸化作用を有することを示す。
ＤＰＰＨラジカル消去率＝（Ａ－Ｂ）／（Ｃ－Ｄ）
Ａ：ＤＰＰＨラジカルと被験物質を添加した時の吸光度
Ｂ：被験物質のみを添加した時の吸光度
Ｃ：ＤＰＰＨのみを添加した時の吸光度
Ｄ：何も添加しなかった時の吸光度

（ｉｉ）活性酸素除去活性
キサンチンオキシダーゼ、その基質であるヒポキサンチン及び被験物質をリン酸緩衝液中で混合して反応させ、生成する活性酸素を測定する事により、被験物質による活性酸素除去効果を評価する事が出来る。活性酸素の測定法には、発光試薬を用いた発光法や、ラジカル捕捉剤として５，５－ｄｉｍｅｔｈｙｌ－１－ｐｙｒｒｏｌｉｎｅ－Ｎ－ｏｘｉｄｅ（ＤＭＰＯ）またはＮ－ｔｅｒｔ－ｂｕｔｙｌ―α―ｐｈｅｎｙｌｎｉｔｒｏｎｅ（ＰＢＮ）を使用して、ラジカル化合物の生成量をｅｌｅｃｔｒｏｎ　ｓｐｉｎ　ｒｅｓｏｎａｎｃｅ（ＥＳＲ）で測定する方法などがある。
（試験例２）抗腫瘍活性
本試験に用いる癌細胞系として、以下に例を挙げるが、本発明の新規化合物、ラクノクロモニンＡ，Ｂ及びＣの抗腫瘍活性の試験に用いる細胞は、これらに限定されるものではない。
試験に用いる癌細胞株：　ＨｅＬａ（子宮頚部癌）、ＨＧＣ－２７（胃癌）、ＭＣＦ－７（乳腺癌）、ＨｅｐＧ２　（肝細胞癌）、Ｕ９３７（白血病癌）、ＣＡＣＯ２（大腸癌）
本発明の新規化合物、ラクノクロモニンＡ，Ｂ及びＣの抗癌作用は、より具体的には以下の方法で評価出来る。
（ｉ）癌細胞増殖阻害試験
各種癌細胞を９６穴マイクロプレートに播種し、被験物質を添加した後に、数時間～数日間培養する。細胞増殖阻害活性は、３－（４，５－ｄｉｍｅｔｈｙｌ－２－ｔｈｉａｚｏｌｙｌ）－２，５－ｄｉｐｈｅｎｙｌ－２Ｈ－ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ　ｂｒｏｍｉｄｅ（ＭＴＴ）法などのミトコンドリアデヒドロゲナーゼ活性を測定する方法や、トリチウム標識したチミジンなどの、ＤＮＡへの取り込み量を測定する方法などで評価する事が出来る。被験物質無添加群の細胞増殖（コントロール）を１００％として、被験物質添加時の細胞増殖率を算出し、被験物質の癌細胞増殖阻害活性を評価することが出来る。
（ｉｉ）アポトーシス誘導活性試験
ａ）ＤＮＡラダーの検出
各種癌細胞に被験物質を添加して、数分乃至数時間、３７℃でインキュベートする。付着細胞については、そのままリン酸塩緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）にて洗浄し、浮遊細胞は、遠心分離により回収した後にＰＢＳで洗浄し、それぞれＴｒｉｔｏｎ－Ｘ１００などの界面活性剤を含む細胞溶解液にて細胞を溶解させる。ＲＮａｓｅ、ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ　Ｋなどを用いてＲＮＡと蛋白質を分解した後、５Ｍ食塩水及びイソプロパノールを加え、－２０℃で一晩放置する事により、ＤＮＡを析出させる。遠心分離にて析出したＤＮＡを沈殿させ、トリス－エチレンジアミン四酢酸緩衝液（ＴＥ緩衝液）にて再溶解させた後、アガロースゲル電気泳動に供する。電気泳動後、ＤＮＡを蛍光試薬にて発色させ、イメージングアナライザーなどを用いてＤＮＡラダーの生成を評価することによって、被検物質による癌細胞のアポトーシス誘導活性を評価することが出来る。
ｂ）クロマチン凝集の検出
２４穴プレート上で、各種癌細胞に被験物質を添加して、数分乃至数時間、３７℃でインキュベートする。ヘキスト３３３４２溶液（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ；最終濃度０．１μｇ／ｍＬ）を添加し、更に２時間インキュベートして、蛍光顕微鏡（Ｕｌｔｒａ　ｖｉｏｌｅｔ：　励起光３３０－３８０ｎｍ，観察光４２０ｎｍ）で観察する。クロマチン凝集に伴う、顆粒状の蛍光を観察する事により、被検物質のクロマチン凝集促進活性を評価することが出来る。
（試験例３）抗炎症活性
本発明の新規化合物、ラクノクロモニンＡ，Ｂ及びＣの抗炎症活性は、炎症性サイトカイン及び一酸化窒素（ＮＯ）産生抑制試験で評価することが出来る。
以下にその試験方法の一例を挙げる。
＜３－１．炎症性サイトカイン抑制＞
マウスマクロファージ様細胞株、ＲＡＷ２６４．７（ＲＩＫＥＮ　Ｃｅｌｌ　Ｂａｎｋ，　ＲＣＢ０５３５)を、１０％ウシ胎児血清を含有するＨａｍ’ｓ培地又はＤＭＥＭ培地にて１乃至５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬに調整した後、９６穴プレートに２００μＬずつ分注し、ＣＯ２インキュベーター中で１時間培養して細胞を接着させる。マウスＩＦＮ－γ（最終濃度：０．３３ｎｇ／ｍＬ）及びＬＰＳ（最終濃度：１００ｎｇ／ｍＬ）の存在下及び非存在下で、各種濃度の被験化合物を添加した細胞を、ＣＯ２インキュベーター中で１乃至３日間培養後、培養上清を採取し、ＩＬ－１β、ＩＬ－６、ＴＮＦ－αなどの炎症性サイトカインの濃度を、市販のＥＬＩＳＡキットで測定する。
実際にラクノクロモニンＡのＩＬ－６産生抑制活性を、培地としてＤＭＥＭ培地、調整時細胞数が１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬ、被験化合物添加後の培養期間が３日間の条件で測定したところ、13ng/mlで抑制率16.6％、40ng/mlでは30％、120ng/mlでは38.7％と良好な抑制活性が確認された。
　なお、IL-6産生の抑制率は、後述するサイトカイン産生の抑制率の算出式により算出した。

＜３－２．ＮＯ産生抑制＞
ＮＯ産生については、グリース法（Ｌ．Ｊ．Ｉｇｎａｒｒｏ，　ｅｔ．ａｌ．，（１９８７），Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｕｍ－ｄｅｒｉｖｅｄ　ｒｅｌａｘｉｎｇ　ｆａｃｔｏｒ　ｐｒｏｄｕｃｅｄ　ａｎｄ　ｒｅｌｅａｓｅｄ　ｆｒｏｍ　ａｒｔｅｒｙ　ａｎｄ　ｖｅｉｎ　ｉｓ　ｎｉｔｒｉｃ　ｏｘｉｄｅ，　Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，ｖｏｌ．８４：ｐｐ．９２６５－９２６９参照）で定量することによって、評価出来る。
　炎症性サイトカイン及び一酸化窒素（ＮＯ）産生の抑制率は、次式により算出することが出来る。
抑制率（％）＝｛１－（Ｘ－Ｙ）／（Ｚ－Ｙ）｝×１００
　Ｘ：試験化合物の存在下で、ＩＦＮ－γとＬＰＳにより誘導される、炎症性サイトカインあるいはＮＯ２ －の量
Ｙ：試験化合物、ＩＦＮ－γ及びＬＰＳがない状態で誘導される、炎症性サイトカインあるいはＮＯ２ －の量
Ｚ：ＩＦＮ－γとＬＰＳにより誘導される、炎症性サイトカインあるいはＮＯ２ －の量。
（試験例４）抗アレルギー活性
本発明の新規化合物、ラクノクロモニンＡ，Ｂ及びＣの抗アレルギー作用は、ヒスタミン遊離抑制試験などで評価することが出来る。
以下にその試験方法の一例を挙げる。
Ｗｉｓｔａｒ系雄性ラットを断頭・瀉血した後、１０Ｕ／ｍＬのヘパリン含有ハンクス液１０ｍＬを腹腔内に注入して、良くマッサージし、腹腔内液を採取する。得られた腹腔内液を４０％フィコール溶液に重層して、室温で３０分間放置後、遠心分離し、フィコール層上の肥満細胞を集める。この肥満細胞をＰＢＳに懸濁し、遠心分離による洗浄を３、４回繰り返した後、再びＰＢＳに懸濁することにより、ラット腹腔肥満細胞を得ることが出来る。
ラット腹腔肥満細胞を、ＰＢＳで２×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ、１．８ｍＬ／ｔｕｂｅになるよう調整し、３７℃で１０分間静置する。次に被験物質０．１ｍＬを加え、さらに１０μｇ／ｍＬのｃｏｍｐｏｕｎｄ４８／８０（和光純薬工業社製）を０．１ｍＬ加えて１０分間反応させる。氷冷により反応を停止し、遠心分離して上清と沈渣を調製する。この上清と残渣中のヒスタミン含量は、ショアーらの論文（Ｐ．Ａ．ＳＨＯＲＥ，ｅｔ　ａｌ．，（Ａ　ＭＥＴＨＯＤ　ＦＯＲ　ＴＨＥ　ＦＬＵＯＲＯＭＥＴＲＩＣ　ＡＳＳＡＹ　ＯＦ　ＨＩＳＴＡＭＩＮＥ　ＩＮ　ＴＩＳＳＵＥＳ　　Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ　Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．（１９５９）１２７：ｐ．１８２－１８６））に記載された、蛍光法で定量することによって評価出来る。
　ラット腹腔肥満細胞からのヒスタミン遊離率は、次式によって算出する事が出来る。
　ヒスタミン遊離率（％）＝上清のヒスタミン量／（上清のヒスタミン量＋沈渣のヒスタミン量）×１００
遊離抑制率（％）＝｛１－（検体存在下のヒスタミン遊離率－自発遊離率＊）／（検体非存在下のヒスタミン遊離率－自発遊離率）｝×１００
＊自発遊離率：ｃｏｍｐｏｕｎｄ４８／８０無添加でのヒスタミン遊離率。
（試験例５）骨形成促進活性
本発明の新規化合物、ラクノクロモニンＡ，Ｂ及びＣの骨形成促進活性は、以下の骨芽細胞分化試験により評価する事が出来る。
アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）は、骨芽細胞の分化マーカーであり、被験物質の添加により、・骨芽細胞のＡＬＰ活性増加率を求める事により、骨芽細胞の分化促進活性を評価する事が出来る。より具体的には、骨芽細胞のＡＬＰ活性増加率は、以下の方法で評価する事が出来る。
マウス骨髄由来の骨芽細胞株、ＳＴ２（ＲＩＫＥＮ　Ｃｅｌｌ　Ｂａｎｋ，　ＲＣＢ０２２４）を、１０％牛胎児血清含有α－ＭＥＭ培地（以下αＭＥＭと略す）に懸濁し、この懸濁液を、４，０００ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌになるように、９６穴マイクロプレートに１００μＬずつ分注し、ＣＯ２インキュベーター中で２４時間培養する。その後、被験物質を添加したαＭＥＭ、１００μＬを各ウェルに加えて、更に３日間培養した後、細胞のＡＬＰ活性を、ｐ－ニトロフェニルリン酸（PNPP）を基質として、４０５ｎｍの吸光度（吸光度値）で測定する。被験物質のＡＬＰ活性増加率（％）は、以下の式で算出出来る。

ＡＬＰ活性増加率（％）＝検体添加時の吸光度値／検体非添加時の吸光度値×１００。
（試験例６）骨吸収抑制活性
酒石酸耐性酸性ホスファターゼ（ＴＲＡＰ）は、破骨細胞分化のマーカーであり、被験物質のＴＲＡＰ活性抑制率を求める事により、破骨細胞分化の抑制活性を評価する事が出来る。より具体的には、ＴＲＡＰ活性抑制率は以下の試験で評価する事が出来る。
ｄｄｙマウスを頚椎脱臼により安楽死させ、脾臓を摘出する。摘出した脾臓から脾臓細胞を採取し、遠心分離により細胞のペレットを集めた後、ＮＨ４Ｃｌ含有トリス－塩酸緩衝液（赤血球破壊液）で赤血球を破壊する。遠心分離にて赤血球破壊液を除去し、αＭＥＭにて細胞を懸濁する。遠心分離によるαＭＥＭでの洗浄を２回繰り返した後、αＭＥＭに細胞を再懸濁して、マウス脾臓細胞懸濁液を得ることが出来る。
被験物質を添加したαＭＥＭを、９６ウェルプレートに１００μＬ／ｗｅｌｌで分注する。これに、マウス脾臓細胞（４×１０５ｃｅｌｌｓ／５０μＬ／ｗｅｌｌ）とＳＴ２細胞（１０４ｃｅｌｌｓ／５０μＬ／ｗｅｌｌ）とを、２×１０－８Ｍ活性型ビタミンＤ３、２×１０－７Ｍデキサメサゾンを加えたαＭＥＭに懸濁させて播種する。この細胞縣濁液を、ＣＯ２インキュベーター中で１週間培養した後、各ウェルのＴＲＡＰ活性を、ＰＮＰＰを基質として、４０５ｎｍの吸光度（吸光度値）で測定する。被験物質のＴＲＡＰ活性抑制率（％）は、以下の式で算出出来る。

ＴＲＡＰ活性抑制率（％）＝（１－検体添加時の吸光度値／検体非添加時の吸光度値）×１００。
（製剤例）カプセル剤
　　　ラクノクロモニンＡ　　　　　　１００ｍｇ
　　　乳糖　　　　　　　　　　　　 　 １００ｍｇ
　　　トウモロコシ澱粉　　　　　　１４８．８ｍｇ
　　　ステアリン酸マグネシウム　　 １．２ｍｇ
－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－
　　　全量　　　　　　　　　　　　　   ３５０ｍｇ
　上記処方の粉末を混合し、６０メッシュのふるいに通した後、この粉末をゼラチンカプセルに入れ、カプセル剤とする。
本発明の化合物は、炎症、生活習慣病または成人病の治療薬及び／又は改善薬として有用である。

Claims (10)

  1. 下記一般式(Ｉ)：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
     [式中、Ｒ１はＣＨ３、Ｒ２はＯＨ、Ｒ３はＨ、Ｒ４はＣＨ３、Ｒ５はＣＨ（ＣＨ３）（ＣＨ２）２ＯＨ，ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ３またはＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ３を示す。] で表わされる化合物またはその塩。
  2. 下記の物理化学的性状を有する化合物またはその塩、
    １）物質の性状：無色粉末、水溶液は弱酸性を呈する、
    ２）溶解性：アセトン、メタノール、ジメチルスルホキシド、酢酸エチルに可溶、水、ヘキサンに不溶
    ３）分子式：Ｃ１５Ｈ１８Ｏ４
    ４）分子量：２６２（ＥＳＩマススペクトル法により測定）
    ５）高分解能ＥＳＩマススペクトル法により測定した精密質量、[Ｍ＋Ｈ]＋は次に示す通りである。
    実測値：２６３．１２８３
    計算値：２６３．１２８３
    ６）旋光度：[α]Ｄ ２７　＋７０．４°（c １．００,　メタノール）
    ７）紫外部吸収スペクトル：
    　ＭｅＯＨ中で測定した紫外部吸収スペクトルは、以下に示す極大吸収を示す。
    λmax MeOHｎｍ（ε）　２２９（２１４００），２４６（１５９００），２５４（１５４００），２９８（１２７００）
    ８）赤外吸収スペクトル：
    　ＫＢｒ錠剤法で測定した赤外吸収スペクトルは、以下に示す極大吸収を示す。
    ３２９８，３１６７，２９８１，２９６３，２９４６，１６３０，１５９７，１５１９，１４３４，１４０７，１３８１，１３２８，１３００，１２８８，１２５９，１２０８，１１８７，１１６７，１１２８，１０９５，１０６４，９７５，９４７，８５３，８３７，７９７，７８３，７０２，６６７，６３２，５５１，４６３，４３４ｃｍ－１
    ９）１Ｈ－核磁気共鳴スペクトル：
    　重ジメチルスルホキシド中、テトラメチルシランのシグナル（０．００ｐｐｍ）を内部標準として測定した１Ｈ－核磁気共鳴スペクトルは、以下に示すとおりである。
    １．２７（３Ｈ，ｄ，J＝７．０Ｈｚ），１．７５（１Ｈ，ｍ），１．８９（１Ｈ，ｍ），１．９５（３Ｈ，ｓ），２．２１（３Ｈ，ｓ），３．２８（１Ｈ，ｍ），３．３５（１Ｈ，ｍ），３．４３（１Ｈ，ｍ），６．９１（１Ｈ，ｄ，J＝８．５Ｈｚ），７．７０（１Ｈ，ｄ，J＝８．５Ｈｚ）ｐｐｍ
    １０）１３Ｃ－核磁気共鳴スペクトル：
    　重ジメチルスルホキシド中、重ジメチルスルホキシドのシグナル（３９．５ｐｐｍ）を内部標準として測定した１３Ｃ－核磁気共鳴スペクトルは、以下に示すとおりである。
    ７．８，９．０，１８．０，３１．９，３７．２，５８．４，１１０．４，１１３．４，１１４．１，１１４．７，１２３．２，１５５．１，１５９．７，１６６．５，１７６．７ｐｐｍ。
  3. 下記の物理化学的性状を有する化合物またはその塩、
    １）物質の性状：無色粉末、水溶液は弱酸性を呈する、
    ２）溶解性：アセトン、メタノール、ジメチルスルホキシドに可溶、水、酢酸エチル、ヘキサンに不溶
    ３）分子式：Ｃ１５Ｈ１８Ｏ４
    ４）分子量：２６２（ＥＳＩマススペクトル法により測定）
    ５）高分解能ＥＳＩマススペクトル法により測定した精密質量、[Ｍ＋Ｎａ]＋は次に示す通りである。
    実測値：２８５．１０９４
    計算値：２８５．１１０３
    ６）旋光度：[α]Ｄ ２７　＋８８．７°（c １．００,　メタノール）
    ７）紫外部吸収スペクトル：
    　ＭｅＯＨ中で測定した紫外部吸収スペクトルは、以下に示す極大吸収を示す。
    λmax MeOHｎｍ（ε）　２２９（２３６００），２４６（１７２００），２５４（１６４００），２９８（１３９００）ｎｍ
    ８）赤外吸収スペクトル：
    　ＫＢｒ錠剤法で測定した赤外吸収スペクトルは、以下に示す極大吸収を示す。
    ３２４３，２９７６，２９３１，１７３８，１６３２，１５９２，１５１７，１４３２，１３７５，１３２６，１２５５，１１９５，１１４９，１１１５，１０９９，１０３５，１０１２，９６３，９２０，９０４，８３２，７８２，７２１，６８０，６４４，６１９，５３８，５１５，４９５，４７８，４５０ｃｍ－１
    ９）１Ｈ－核磁気共鳴スペクトル：
    　重ジメチルスルホキシド中、テトラメチルシランのシグナル（０．００ｐｐｍ）を内部標準として測定した１Ｈ－核磁気共鳴スペクトルは、以下に示すとおりである。
    １．１８（３Ｈ，ｄ，J＝６．５Ｈｚ），１．２０（３Ｈ，ｄ，J＝８．０Ｈｚ），１．９４（３Ｈ，ｓ），２．２０（３Ｈ，ｓ），３．０２（１Ｈ，ｍ），３．９２（１Ｈ，ｍ），６．９１（１Ｈ，ｄ，J＝８．５Ｈｚ），７．７０（１Ｈ，ｄ，J＝８．５Ｈｚ）ｐｐｍ
    １０）１３Ｃ－核磁気共鳴スペクトル：
    　重ジメチルスルホキシド中、重ジメチルスルホキシドのシグナル（３９．５ｐｐｍ）を内部標準として測定した１３Ｃ－核磁気共鳴スペクトルは、以下に示すとおりである。
    ７．９，９．４，１４．０，２１．１，４３．６，６８．３，１１０．５，１１３．３，１１４．８，１１５．０，１２３．２，１５５．１，１５９．５，１６５．９，１７６．８ｐｐｍ。
  4. 下記の物理化学的性状を有する化合物またはその塩、
    １）物質の性状：無色粉末、水溶液は弱酸性を呈する、
    ２）溶解性：アセトン、メタノール、ジメチルスルホキシドに可溶、酢酸エチルに難溶、水、ヘキサンに不溶
    ３）分子式：Ｃ１５Ｈ１８Ｏ３
    ４）分子量：２４６（ＥＳＩマススペクトル法により測定）
    ５）高分解能ＥＳＩマススペクトル法により測定した精密質量、[Ｍ＋Ｈ]＋は次に示す通りである。
    実測値：２４７．１３３３
    計算値：２４７．１３３４
    ６）旋光度：[α]Ｄ ２７　＋５８．６°（c １．００,　メタノール）
    ７）紫外部吸収スペクトル：
    　ＭｅＯＨ中で測定した紫外部吸収スペクトルは、以下に示す極大吸収を示す。
    λmax MeOHｎｍ（ε）　２２９（２３１００），２４６（１７１００），２５４（１６５００），２９８（１３６００）
    ８）赤外吸収スペクトル：
    　ＫＢｒ錠剤法で測定した赤外吸収スペクトルは、以下に示す極大吸収を示す。
    ３０９８，２９６８，２９３９，２８７８，２７２４，２６２２，１６３１，１５８４，１４２９，１４１４，１３７３，１３３７，１２９７，１２５７，１２１７，１２００，１１８２，１１６４，１１０６，１０７１，１０１８，９５８，８３５，７８４，７２１，５３４，４５６，４３９ｃｍ－１
    ９）１Ｈ－核磁気共鳴スペクトル：
    　重ジメチルスルホキシド中、テトラメチルシランのシグナル（０．００ｐｐｍ）を内部標準として測定した１Ｈ－核磁気共鳴スペクトルは、以下に示すとおりである。
    ０．８６（３Ｈ，ｔ，J＝７．５Ｈｚ），１．２６（３Ｈ，ｄ，J＝６．５Ｈｚ），１．６４（１Ｈ，ｍ），１．７４（１Ｈ，ｍ），１．９５（３Ｈ，ｓ），２．２１（３Ｈ，ｓ），３．０５（１Ｈ，ｍ），６．９２（１Ｈ，ｄ，J＝８．５Ｈｚ），７．７０（１Ｈ，ｄ，J＝８．５Ｈｚ）ｐｐｍ
    １０）１３Ｃ－核磁気共鳴スペクトル：
    　重ジメチルスルホキシド中、重ジメチルスルホキシドのシグナル（３９．５ｐｐｍ）を内部標準として測定した１３Ｃ－核磁気共鳴スペクトルは、以下に示すとおりである。
    ７．８，９．２，１１．８，１７，９，２７．３，３６．８，１１０．４，１１３．４，１１４．３，１１４．６，１２３．２，１５５．０，１５９．７，１６６．４，１７６．７ｐｐｍ。
  5. ラクヌム（Ｌａｃｈｎｕｍ）属に属する、請求項１乃至４のいずれかに記載の化合物の生産菌を培養し、その培養物より請求項１乃至４のいずれかに記載の化合物を採取することを特徴とする、請求項１乃至４のいずれかに記載の化合物の製造方法。
  6. ラクヌム（Ｌａｃｈｎｕｍ）属に属する、請求項１乃至４のいずれかに記載の化合物の生産菌がラクヌム　バージネウム（Ｌａｃｈｎｕｍ　ｖｉｒｇｉｎｅｕｍ）ＳＡＮＫ１０２０７株（ＦＥＲＭ　ＢＰ－１０９１３）である、請求項５に記載の製造方法。
  7. ラクヌム（Ｌａｃｈｎｕｍ）属に属し、請求項１乃至４のいずれかに記載の化合物を生産することを特徴とする微生物。
  8. ラクヌム　バージネウム（Ｌａｃｈｎｕｍ　ｖｉｒｇｉｎｅｕｍ）ＳＡＮＫ１０２０７株（ＦＥＲＭ　ＢＰ－１０９１３）である、請求項７に記載の微生物。
  9. 請求項１乃至４のいずれかに記載の化合物もしくはその薬理学的に許容される塩を有効成分として含有する医薬。
  10. 炎症、生活習慣病若しくは成人病の治療薬又は予防薬である請求項９に記載の医薬。
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