WO2008066162A1 - Jeu d'amorces pour l'amplification du gène cyp2c19, réactif pour l'amplification du gène cyp2c19 comprenant ledit jeu d'amorces et utilisation du réactif - Google Patents
Jeu d'amorces pour l'amplification du gène cyp2c19, réactif pour l'amplification du gène cyp2c19 comprenant ledit jeu d'amorces et utilisation du réactif Download PDFInfo
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Description
明 細 書
CYP2C19遺伝子増幅用プライマーセット、それを含む CYP2C19遺伝 子増幅用試薬およびその用途
技術分野
[0001] 本発明は、 CYP2C19遺伝子を増幅するためのプライマーセット、それを含む CYP 2C19遺伝子増幅用試薬およびその用途に関する。
背景技術
[0002] チトクローム P450は、スーパーファミリーに分類される酵素群であって、多くのサブ ファミリー（例えば、 CYP1A、 CYP1B、 CYP2C, CYP2D、 CYP2E、 CYP3A等） が存在する。中でも、ヒト CYP2Cサブファミリーのアイソザィムである CYP2C19は、 薬剤代謝に関与する酵素として知られている。そして、 CYP2C19をコードする遺伝 子（CYP2C 19遺伝子）の変異が、 CYP2C 19の基質薬物（抗てんかん剤）である（S )ーメフエニトイン（S— Mep)の代謝が極めて低!/、酵素欠損者（PMs)力、ら明らかにな つている。この PMsに関与する重要な遺伝子多型としては、 CYP2C19 * 2および C YP2C19 * 3が知られている。前者は、ェキソン 5のグァニン（681位）がアデニンと なる変異であって、 splicing defectの原因となり、遺伝情報の翻訳開始部位が変 化する。後者は、ェキソン 4のグァニン（636位）がアデニンとなる変異であって、終始 コドンへの変化により翻訳が変異部位で中断される。 日本人を含むアジア人は、この 2種類の多型を解析することで、ほぼ 100%、 PMsを判断でき、また、白人において も約 85%存在していることから、人種を問わず主要な多型と考えられている。
[0003] また、これらの CYP2C19遺伝子多型（CYP2C19 * 2、 CYP2C19 * 3)について は、前述の PMs以外に、例えば、催眠鎮静剤であるジァゼバムから N—脱メチル体（ ノルジァゼバム）への代謝や、オメブラゾール（OPZ)、ランソプラゾール、ラベプラゾ ール等のプロトンポンプ阻害剤（PPI)、抗てんかん剤フエニトイン (PHT)、三環系抗ぅ つ剤イミブラミン、催眠鎮静剤へキソバルビタール、マラリア治療薬プログァニンル、 筋弛緩剤カリソプロドール等の代謝についても影響を及ぼすことが明らかになつてい る。特に、 PPIの 1種である OPZに対しては、これらの CYP2C19遺伝子多型（CYP
2C19 * 2、 CYP2C19 * 3)力 薬剤応答として、 OPZ、クラリスロマイシンおよびァ モキシリンの 3剤併用により、へリコパクターピロリ菌の除菌率を向上させることが報告 されている。このため、 CYP2C19遺伝子について 2つの多型 CYP2C19 * 2および CYP2C19 * 3を調べることは、薬剤による副作用を予測し、より良い効果を示す薬 剤の投与条件を決定するために、極めて重要である。
[0004] 他方、あらゆる疾患の原因や、個体間の疾患易罹患性 (疾患のかかり易さ）、個体 間における薬効の違い等を遺伝子レベルで解析する方法として、点突然変異、いわ ゆる一塩基多型（SNP)の検出が広く行われて!/、る。点突然変異の一般的な検出方 法としては、（1)試料の標的 DNAについて、検出対象配列に相当する領域を PCR ( Polymerase chain reaction)により増幅させ、その全遺伝子配列を解析する Dir ect Sequencing法、（2)試料の標的 DNAについて、検出対象配列に相当する領 域を PCRにより増幅させ、前記検出対象配列における目的の変異の有無により切断 作用が異なる制限酵素によってその増幅産物を切断し、電気泳動することでタイピン グを行う RFLP解析、（3) 3'末端領域に目的の変異が位置するプライマーを用いて PCRを行い、増幅の有無によって変異を判断する ASP— PCR法等があげられる。
[0005] しかしなら、これらの方法は、例えば、試料から抽出した DNAの精製、電気泳動、 制限酵素処理等が必須であるため、手間やコストがかかってしまう。また、 PCRを行 つた後、反応容器を一旦開封する必要があるため、前記増幅産物が次の反応系に 混入し、解析精度が低下するおそれがある。さらに、 自動化が困難であるため、大量 のサンプルを解析することができない。また、前記（3)の ASP— PCR法については、 特異性が低!/ヽとレ、う問題もある。
[0006] このような問題から、近年、点突然変異の検出方法として、標的核酸とプローブとか ら形成される二本鎖核酸の融解温度（Tm： melting temperature)を解析する方 法が実用化されている。このような方法は、例えば、 Tm解析、または、前記二本鎖の 融解曲線の解析により行われることから、融解曲線解析と呼ばれている。これは、以 下のような方法である。すなわち、まず、検出目的の点突然変異を含む検出対象配 列に相補的なプローブを用いて、検出試料の標的一本鎖 DNAと前記プローブとの ハイブリッド（二本鎖 DNA)を形成させる。続いて、このハイブリッド形成体に加熱処
理を施し、温度上昇に伴うハイブリッドの解離 (融解）を、吸光度等のシグナルの変動 によって検出する。そして、この検出結果に基づいて Τιι^直を決定することにより、点 突然変異の有無を判断する方法である。 Tm値は、ハイブリッド形成体の相同性が高 い程高ぐ相同性が低い程低くなる。このため、点突然変異を含む検出対象配列とそ れに相補的なプローブとのハイブリッド形成体について予め Tm値 (評価基準値）を 求めておき、検出試料の標的一本鎖 DNAと前記プローブとの Tm値 (測定値）を測 定する。前記測定値が評価基準値と同じであれば、マッチ、すなわち標的 DNAに点 突然変異が存在すると判断でき、測定値が評価基準値より低ければ、ミスマッチ、す なわち標的 DNAに点突然変異が存在しないと判断できる。そして、この方法によれ ば、 自動化も可能である。
しかしながら、このような Tm解析を利用した検出方法についても、 PCRにおいて、 検出目的部位を含む領域を特異的且つ効率的に増幅できなければならないという 問題がある。特に、チトクローム P450は、前述のように、スーパーファミリーに分類さ れる酵素群であって、同じサブファミリー（CYP2Cサブファミリー）に属する分子種に は、非常に相同性の高いアイソザィムが存在し、それらをコードする配歹 IJも極めて類 似している。このため、 PCRにおいて、 CYP2C19以外のアイソザィムのコード遺伝 子までもが増幅されるおそれがある。また、このように他のアイソザィムのコード遺伝 子までも増幅された場合、例えば、 CYP2C19遺伝子の特定の多型（CYP2C19 * 2または CYP2C19 * 3)の解析（非特許文献 1および非特許文献 2)において、解析 結果の信頼性を低下させる原因にもなる。そして、このように、 1つのサンプルを解析 するにも多大な労力を伴うため、大量のサンプルを解析することは実用的ではないと いう問題もある。
非特許文献 1 : PMID : 8195181 J Biol Chem. 1994 Jun 3 ; 269 (22) : 15 419- 22.
非特許文献 2 : PMID : 7969038 Mol Pharmacol. 1994 Oct ; 46 (4) : 594— 8.
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0008] そこで、本発明は、遺伝子増幅法により CYP2C19遺伝子の目的領域を特異的に 増幅するためのプライマーセットの提供を目的とする。
課題を解決するための手段
[0009] 前記目的を達成するために、本発明のプライマーセットは、遺伝子増幅法により CY P2C19遺伝子を増幅するためのプライマーセットであって、下記（1)および（2)の少 なくとも一方のプライマーセットを含むことを特徴とする。
プライマーセット（1)
下記（F1)のオリゴヌクレオチドからなるフォワードプライマーおよび下記（R1)のオリ ゴヌクレオチドからなるリバースプライマーを含む一対のプライマーセット
(F1)配列番号 1の塩基配列における 1341番目のアデニン塩基 (A)を 1塩基目とし て 5'方向に向力、つて 25〜41塩基目までの領域と同じ配列である少なくとも一つのォ リゴヌクレオチドであって、前記アデニン塩基 (A)を 3'末端とするオリゴヌクレオチド (R1)配列番号 1の塩基配列における 1442番目のグァニン塩基（G)を 1塩基目とし て 3'方向に向かって 19〜24塩基目までの領域に相補的な少なくとも一つのオリゴヌ クレオチドであって、前記 1442番目のグァニン塩基（G)に相補的なシトシン塩基（C プライマーセット（2)
下記（F2)のオリゴヌクレオチドからなるフォワードプライマーおよび下記（R2)のオリ ゴヌクレオチドからなるリバースプライマーを含む一対のプライマーセット
(F2)配列番号 1の塩基配列における 143番目のアデニン塩基 (A)を 1塩基目として 5'方向に向かって 23〜37塩基目までの領域と同じ配列である少なくとも一つのオリ ゴヌクレオチドであって、前記アデニン塩基 (A)を 3'末端とするオリゴヌクレオチド (R2)配列番号 1の塩基配列における 231番目のチミン塩基 (T)を 1塩基目として 3' 方向に向かって 18〜30塩基目までの領域に相補的な少なくとも一つのオリゴヌタレ ォチドであって、前記 231番目のチミン塩基 (T)に相補的なアデニン塩基 (A)を 3'
[0010] また、本発明の遺伝子増幅用試薬は、遺伝子増幅法により CYP2C19遺伝子を増 幅するための試薬であって、前記本発明の CYP2C19遺伝子増幅用プライマーセッ
トを含むことを特徴とする。
[0011] 本発明の増幅産物の製造方法は、遺伝子増幅法により CYP2C19遺伝子の増幅 産物を製造する方法であって、下記 (I)工程を含むことを特徴とする。
(I)試料中の核酸を铸型として、本発明の CYP2C19遺伝子増幅用プライマーセット を用いて、反応液中で、前記 CYP2C19遺伝子の増幅を行う工程
[0012] 本発明の多型解析方法は、 CYP2C19遺伝子における検出対象部位の多型を解 析する方法であって、下記 (i)〜（iv)工程を含むことを特徴とする。
(i)本発明の増幅産物の製造方法により、 CYP2C19遺伝子における検出対象部位 を含む領域を反応液中で増幅させる工程
(ii)前記 (i)工程における増幅産物と、前記検出対象部位にハイブリダィズ可能なプ ローブとを含む反応液を準備する工程
(iii)前記反応液の温度を変化させ、前記増幅産物と前記プローブとのハイブリッド形 成体の融解状態を示すシグナル値を測定する工程
(iv)温度変化に伴う前記シグナル値の変動から、前記検出対象部位の多型を決定 する工程
発明の効果
[0013] 本発明のプライマーセットによれば、 CYP2C19遺伝子における検出目的の多型（ CYP2C19 * 2または CYP2C19 * 3)が発生する部位を含む目的領域を、反応液 中で特異的且つ高効率で増幅することができる。このため、前述のような従来法とは 異なり、手間やコストを低減することが可能となる。また、このように CYP2C19遺伝子 の特定の多型が発生する検出対象部位を含む領域を特異的に増幅できることから、 例えば、さらに、検出対象部位を含む検出対象配列に相補的なプローブを使用する ことで、前記反応液を用いてそのまま Tm解析を行い、前記多型をタイピングすること が可能となる。また、 1つの反応液で、前記目的領域の増幅や多型のタイピングが可 能であることから、操作の自動化も可能になる。さらに、本発明のプライマーセットを 用いれば、例えば、夾雑物が含まれる試料 (例えば、全血や口腔粘膜等）であっても 、前処理を省略できるため、より迅速且つ簡便に増幅反応を行うことができる。また、 本発明のプライマーセットを用いれば、従来よりも優れた増幅効率で増幅反応が行え
るため、増幅反応も短縮化が可能である。したがって、本発明のプライマーセットやこ れを含む試薬、ならびにこれらを用いた増幅産物の製造方法によれば、 CYP2C19 遺伝子の多型を迅速かつ簡便に解析できることから、医療分野においてきわめて有 効といえる。
図面の簡単な説明
[0014] [図 1]図 1は、本発明の実施例 1における Tm解析の結果を示すグラフである。
[図 2]図 2は、本発明の実施例 2における Tm解析の結果を示すグラフである。
発明を実施するための最良の形態
[0015] < CYP2C19遺伝子増幅用プライマーセット〉
本発明の CYP2C19遺伝子増幅用プライマーセットは、前述のように、前記プライ マーセット（1)および（2)の少なくとも一方のプライマーセットを含むことを特徴とする 。少なくともいずれかのプライマーセットを含むことによって、例えば、 CYP2C19遺 伝子における特定の目的領域を特異的に増幅することが可能である。
[0016] 本発明の CYP2C19遺伝子増幅用プライマーセットは、例えば、前記プライマーセ ット（1)および（2)のうちいずれか 1種類のみを含んでもよいし、プライマーセット（1) および（2)の両方を含んでもよい。後述するが、プライマーセット（1)により特異的に 増幅し得る目的領域は、 CYP2C19遺伝子において、多型 CYP2C19 * 2が発生す る部位を含む領域であり、プライマーセット（2)により特異的に増幅し得る目的領域は 、 CYP2C19遺伝子において、多型 CYP2C19 * 3が発生する部位を含む領域であ
[0017] 前述のように、 CYP2C19遺伝子のこれら 2種類の多型は、全て薬剤代謝に影響を 与える多型として知られていることから、いずれ力、 1種類だけでなぐ 2種類全ての多 型を調べることが重要視されている。し力、しながら、従来法では、 1つの反応系におい て複数の配列を解析することができないという問題がある。これは、前述のように、 CY P2Cには多くのアイソザィムが存在するため、 PCRにおいて、 CYP2C19以外のアイ ソザィムのコード遺伝子までもが増幅されることが原因と考えられる。このため、 CYP 2C19遺伝子の 2種類の多型（CYP2C19 * 2および CYP2C19 * 3)の 2種類全て を調べるには、それぞれの多型が生じる部位を含む領域を、別個の反応系において
各々増幅させ、得られた増幅産物を別個に解析する必要がある。このように、従来の 方法では、 CYP2C遺伝子の中でも CYP2C19遺伝子のみを铸型とし、且つ、 CYP 2C 19遺伝子において、前記多型が生じる部位をそれぞれ含む 2種類の目的領域の みを特異的に増幅させることは極めて困難である。そして、このように、 1つのサンプ ルを解析するにも多大な労力を伴うため、大量のサンプルを解析することは実用的で はないという問題がある。これに対して、本発明の CYP2C19遺伝子増幅用プライマ 一セットによれば、前記プライマーセット（1)および（2)の 2種類全てを含む場合であ つても、それぞれの目的領域を、同一反応液において同時に且つ特異的に増幅す ること力 Sできる。このため、前述の従来法とは異なり、手間やコストを低減することが可 能となる。また、このように同一反応液において 2つの目的領域が特異的に増幅され ることから、例えば、それぞれの目的領域における検出対象配列に相補的なプロ一 ブを使用することで、前記反応液を用いてそのまま Tm解析を行い、前記 2種類の多 型をそれぞれタイピングすることが可能となる。このように、 CYP2C19遺伝子におけ る 2種類の多型を同一反応液で解析することが可能となることから、本発明の CYP2 C19遺伝子増幅用プライマーセットは、例えば、プライマーセット（1)および（2)のい ずれ力、 1種類を含む場合はもちろんのこと、両方を含むことも好ましい。このような CY P2C19遺伝子プライマーセットを用いて、 1つの目的領域はもちろんのこと、 2つの 目的領域を同時に増幅すれば、従来よりも効率よぐ CYP2C19遺伝子の多型解析 を fiうこと力 Sできる。
[0018] なお、以下、フォワードプライマーを Fプライマー、リバースプライマーを Rプライマー ということがある。
[0019] 前記プライマーセット（1)は、前述のように、下記（F1)のオリゴヌクレオチドからなる フォワードプライマーおよび下記（R1)のオリゴヌクレオチドからなるリバースプライマ 一を含む一対のプライマーセットである。
(F1)配列番号 1の塩基配列における 1341番目のアデニン塩基 (A)を 1塩基目とし て 5'方向に向力、つて 25〜41塩基目までの領域と同じ配列である少なくとも一つのォ リゴヌクレオチドであって、前記アデニン塩基 (A)を 3'末端とするオリゴヌクレオチド (R1)配列番号 1の塩基配列における 1442番目のグァニン塩基（G)を 1塩基目とし
て 3'方向に向かって 19〜24塩基目までの領域に相補的な少なくとも一つのオリゴヌ クレオチドであって、前記 1442番目のグァニン塩基（G)に相補的なシトシン塩基（C
[0020] 配列番号 1に示す塩基配列は、ヒト染色体 10における CYP2C19遺伝子のェキソ ン 4およびェキソン 5を含むゲノム DNAの配列であって、配列番号 1において;!〜 16 1の領域がェキソン 4、 1323〜； 1449の領域力 Sェキソン 5を示し、その間はイントロン を示す。
[0021] 前記プライマーセット（1)は、配列番号 1における 1342番目〜 1441番目の領域を 含む DNA鎖ならびにその相補鎖を増幅させるためのプライマーセットである。この領 域内の 1361番目の塩基（配列番号 1における 1361番目の塩基）は、 CYP2C19の 機能に影響を与える点突然変異（1361G、 1361A)の存在が知られており、この多 型力 前述の CYP2C19 * 2である。本発明において、この部位の多型は、ホモ接合 体の場合、 1361G/G, 1361A/A,ヘテロ接合体の場合、 1361G/Aで表すこと 力できる。なお、配列番号 1における 1361番目の塩基は、 CYP2C19遺伝子の mR NAにおけるェキソン 5の 681番目の塩基に相当するため、 CYP2C19 * 2の多型と して、例えば、 681G/G, 681A/A, 681G/Aとして表すこともできる。以下、この プライマーセット（1)を、「CYP2C19 * 2用プライマーセット」ともいう。なお、 CYP2C 19 * 2の多型のみを解析する場合には、 CYP2C19 * 2用プライマーセットのみを使 用すればよい。
[0022] 本発明において、プライマーセット（1)の F1プライマーおよび R1プライマーは、 DN Aポリメラーゼによる増幅の開始点を決定する役割を果たす 3'末端の塩基が、前述 の条件を満たしていればよい。このように各プライマーの 3'末端の塩基を固定するこ とによって、プライマーセット（1)が、例えば、類似する他のアイソザィムの遺伝子（例 えば、 CYP2C8、 CYP2C9、 CYP2C17、 CYP2C18遺伝子等）に結合することを 十分に防止することができる。
[0023] このように、 F1プライマーおよび R1プライマーは、その 3'末端の塩基が固定されて いればよいことから、各プライマーの長さ自体は特に制限されず、一般的な長さに適 宜調整すること力できる。プライマーの長さの一例としては、例えば、 13〜50merの
範囲であり、好ましくは 14〜45merであり、より好ましくは 15〜40merである。具体 例として、前記 F1プライマーは、配列番号 1の塩基配列における 1341番目のアデ二 ン塩基 (A)を 1塩基目として 5 '方向に向力、つて 25〜41塩基目（好ましくは、 27-38 塩基目、より好ましくは 29〜34塩基目）までの領域と同じ配列である少なくとも一つ のオリゴヌクレオチドであることが好ましい。また、前記 R1プライマーは、配列番号 1の 塩基配列における 1442番目のグァニン塩基 (G)を 1塩基目として 3 '方向に向かつ て 19〜24塩基目（好ましくは、 20〜23塩基目、より好ましくは 20〜22塩基目）まで の領域に相補的な少なくとも一つのオリゴヌクレオチドであることが好ましい。なお、 F 1プライマーと R1プライマーの 3 '末端が固定されていることから、プライマーから伸長 する領域は、例えば、前述のように配列番号 1における 1342番目〜 1441番目の領 域である力 S、得られる増幅産物の全体の長さは使用するプライマーの長さに応じて変 化する。
[0024] また、 R1プライマーは、配列番号 1に示す塩基配列に対して、 F1プライマーは、前 記塩基配列の相補鎖に対して、それぞれ完全に相補なオリゴヌクレオチドでなくとも よい。すなわち、各プライマーにおける 3 '末端の塩基を除く部分において、完全に相 補なオリゴヌクレオチドと 1個〜 5個の塩基が異なっていてもよい。
[0025] 以下に、 F1プライマーと R1プライマーの具体例を示す力 本発明は、これには限 定されない。また、これらの F1プライマーと R1プライマーとの組み合わせは何ら制限 されないが、これらの中でも、配列番号 3または配列番号 12のオリゴヌクレオチドから なる F1 'プライマーと配列番号 20または配列番号 22のオリゴヌクレオチドからなる R1 'プライマーとを含むプライマーセット（1 ' )が特に好ましい。なお、下記表における「T m (°C)」は、下記表の配列と完全に相補的な配列とがハイブリッドした場合の Tm (°C )であり、 MELTCALCソフトウェア（http : //www. meltcalc. com/)により、パ ラメーターをオリゴヌクレオチド濃度 0· 2 Μ、ナトリウム当量（Na eq. ) 50mMとし て算出した値である（以下、同様）。前記 Tm値は、例えば、従来公知の MELTCAL Cソフトウェア（http : //www. meltcalc. com/)等により算出でき、また、隣接法 (Nearest Neighbor Method)によって決定することもできる（以下、同様）。
[0026] [表 1]
プライ 配列 Tm (°C) 配列番号
5 -ataaattattgttttctcttagatatgcaataattttccca-3' 56.7 2
5 -taaattattgttttctcttagatatgcaataattttccca-3' 56.6 3
5 -aaattattgttttctcttagatatgcaataattttccca-j' 56.8 4
5 -aattattgttttctcttagatatgcaataattttccca-j' 56.6 5
D -attattgttttctcttagatatgcaataattttccca-3' 56.3 6
5'-ttattg tttctcttagatatgcaataattttccca-3' 56.2 7 o -tattgttttctcttagatatgcaataattttccca-3' 55.9 8
F1プライ 5'-attgttttctcttagatatgcaataattttccca-3' 56.1 9 CYP2C1 9 2用 5'-ttgttttctcttagatatgcaataattttccca-3' 56 10
5 ' - tgttttctctta gatatgcaata attttc c c a - 3 ' 557 1 1
5'-gttttctcttagatatgcaataattttccca-3' 54.6 12
5'-ttttctcttagatatgcaataattttccca-3' 53.7 13
5'-tttctcttagatatgcaataattttccca-3' 53.3 14
5'-ttctcttagatatgcaataattttccca-3' 52.8 15
5'-tctcttagatatgcaataattttccca-3' 52.3 16
5'-ctcttagatatgcaataattttccca-3' 51.2 17
5'-tcttagatatgcaataattttccca-3' 50.2 18
5'-tcccgaggg tg tgatgtccatc-3' 60.1 19
5'-cccgagggttgttgatgtccatc-3' 59.1 20
R1プライ 5'-ccgagggttgttgatgtccatc-3' 57.1 21 CYP2C1 9 2用 5'一 cgagggttgttgatgtccatc - 3' 55 22
5'-gagggttgttgatgtccatc-3' 52.2 23
5 a ggg tg tgatgtc catc—3 ' 51 24
[0027] つぎに、前記プライマーセット（2)は、前述のように、下記（F2)のオリゴヌクレオチド 力、らなるフォワードプライマーおよび下記（R2)のオリゴヌクレオチドからなるリバース プライマーを含む一対のプライマーセットである。
(F2)配列番号 1の塩基配列における 143番目のアデニン塩基 (A)を 1塩基目として 5'方向に向かって 23 37塩基目までの領域と同じ配列である少なくとも一つのオリ ゴヌクレオチドであって、前記アデニン塩基 (A)を 3'末端とするオリゴヌクレオチド (R2)配列番号 1の塩基配列における 231番目のチミン塩基 (T)を 1塩基目として 3' 方向に向かって 18 30塩基目までの領域に相補的な少なくとも一つのオリゴヌタレ ォチドであって、前記 231番目のチミン塩基 (T)に相補的なアデニン塩基 (A)を 3'
[0028] 前記プライマーセット（2)は、配列番号 1における 144番目〜 230番目の領域を含 む DNA鎖ならびにその相補鎖を増幅させるためのプライマーセットである。この領域 内の 155番目の塩基（配列番号 1における 155番目の塩基）は、 CYP2C19の機能 に影響を与える点突然変異（155G 155A)の存在が知られており、この多型が、前 述の CYP2C19 * 3である。本発明において、この部位の多型は、ホモ接合体の場
合、 155G/G、 155A/A、ヘテロ接合体の場合、 155G/Aで表すことができる。 なお、配列番号 1における 155番目の塩基は、 CYP2C19遺伝子の mRNAにおけ るェキソン 4の 636番目の塩基に相当するため、 CYP2C19 * 3の多型として、例え ば、 155G/G、 155A/A、 155G/Aとして表すこともできる。以下、このプライマー セット（2)を、「CYP2C19 * 3用プライマーセット」ともいう。なお、 CYP2C19 * 3の 多型のみを解析する場合には、 CYP2C19 * 3用プライマーセットのみを使用すれ ばよい。
[0029] 本発明において、プライマーセット（2)の F2プライマーおよび R2プライマーは、前 記プライマーセット（1)と同様の理由から、 DNAポリメラーゼによる増幅の開始点を 決定する役割を果たす 3'末端の塩基が、前述の条件を満たしていればよい。このた め、 F2プライマーおよび R2プライマーの長さ自体は特に制限されず、前述と同様の 長さが例示できる。具体例として、前記 F2プライマーは、配列番号 1の塩基配列にお ける 143番目のアデユン塩基 (A)を 1塩基目として 5'方向に向かって 23〜37塩基 目（好ましくは、 25〜35塩基目、より好ましくは 27〜33塩基目）までの領域と同じ配 列である少なくとも一つのオリゴヌクレオチドであることが好ましい。また、前記 R2ブラ イマ一は、配列番号 1の塩基配列における 231番目のチミン塩基 (T)を 1塩基目とし て 3，方向に向力、つて 18〜30塩基目（好ましく (ま、 19〜27塩基目、より好ましく (ま 20 〜25塩基目 )までの領域に相補的な少なくとも一つのオリゴヌクレオチドであることが 好ましい。
[0030] また、 R2プライマーは、配列番号 1に示す塩基配列に対して、 F2プライマーは、前 記塩基配列の相補鎖に対して、それぞれ完全に相補なオリゴヌクレオチドでなくとも よい。すなわち、各プライマーにおける 3'末端の塩基を除く部分において、完全に相 補なオリゴヌクレオチドと 1個〜 5個の塩基が異なっていてもよい。
[0031] 以下に、 F2プライマーと R2プライマーの具体例を示す力 本発明は、これには限 定されない。また、これらの F2プライマーと R2プライマーとの組み合わせは何ら制限 されないが、これらの中でも、配列番号 27または配列番号 32のオリゴヌクレオチドか らなる F2'プライマーと配列番号 40または配列番号 48のオリゴヌクレオチドからなる R2'プライマーとを含むプライマーセット（2' )が特に好ましい。
[0032] [表 2]
[0033] また、前述したプライマーセット（1)および（2)の各プライマーは、例えば、増幅反 応の反応温度を上げるために、従来公知の任意の配列を 5 '末端に付加したものでも よい。
[0034] このようなプライマーセット（1)および（2)の少なくとも一つを含む本発明の CYP2C 19遺伝子増幅用プライマーセットは、例えば、全血試料等の生体試料における CYP 2C 19遺伝子を増幅させる際に使用することが好ましい。特に、本発明の CYP2C19 遺伝子増幅用プライマーセットを、後述するような多型の検出用プローブとともに使 用する際には、遺伝子増幅用反応液における全血試料の添加割合を 0.；!〜 0. 5体 積％とすること力 S好ましレ、。この点については、後述する。
[0035] < CYP2C19遺伝子増幅用試薬〉
本発明の CYP2C19遺伝子増幅用試薬は、前述のように、遺伝子増幅法により C
YP2C19遺伝子を増幅するための試薬であって、本発明の CYP2C19遺伝子増幅 用プライマーセットを含むことを特徴とする。本発明の CYP2C19遺伝子増幅用試薬 は、本発明のプライマーセットを含むことが特徴であり、これ以外の組成等について は何ら制限されない。
[0036] 本発明の CYP2C19遺伝子増幅用試薬は、例えば、本発明のプライマーセットを 用いた遺伝子増幅法により得られる増幅産物を検出するために、さらに、 CYP2C19 遺伝子の検出対象部位にハイブリダィズ可能なプローブを含んでもよ!/、。前述のよう に本発明のプライマーセットによれば、例えば、それに含まれるプライマーセット（1) および（2)の種類に応じて、遺伝子増幅法によって CYP2C19遺伝子における 1つ または 2つの目的領域の増幅産物が得られる。このため、前記各目的領域における 検出対象配列に相補的なプローブを共存させることによって、例えば、増幅の有無 や検出対象部位の遺伝子型（多型）等を、後述する方法によって検出することが可能 である。このようなプローブやその利用方法に関しては、後の多型の解析方法におい て説明する。また、本発明の CYP2C19遺伝子増幅用試薬は、全血等の生体試料 における CYP2C19遺伝子を増幅させる際に使用することが好ましい。特に、本発明 の CYP2C19遺伝子増幅試薬を、前述のようなプローブとともに使用する際には、遺 伝子増幅用反応液における全血試料の添加割合を 0. ；!〜 0. 5体積％とすることが 好ましい。なお、本発明において、「検出対象配列」とは、多型が発生する部位 (検出 対象部位）を含む配列を意味する。
[0037] 本発明の CYP2C19遺伝子増幅用試薬の形態は、特に制限されず、例えば、本発 明の CYP2C 19遺伝子増幅用プライマーセットを含有する液体試薬でもよいし、使 用前に溶媒で懸濁する乾燥試薬であってもよい。また、 CYP2C19遺伝子増幅用プ ライマーセットの含有量も、特に制限されない。
[0038] <増幅産物の製造方法〉
本発明の増幅産物の製造方法は、前述のように、遺伝子増幅法により CYP2C19 遺伝子の増幅産物を製造する方法であって、下記 (I)工程を含むことを特徴とする。
(I)試料中の核酸を铸型として、本発明の CYP2C19遺伝子増幅用プライマーセット を用いて、反応液中で、前記 CYP2C19遺伝子の増幅を行う工程
[0039] このように本発明のプライマーセットを用いて増幅反応を行うことによって、前述のよ うに、 CYP2C19遺伝子の目的領域を増幅させることができる。また、本発明の CYP 2C 19遺伝子増幅用プライマーセットが、前記プライマーセット（1)および（2)の両方 を含む場合は、 CYP2C19における 2つの検出対象部位をそれぞれ含む 2つの目的 領域を、同一反応液中で同時に増幅させることができる。本発明により増幅させる目 的領域は、前述のように、各多型（CYP2C19 * 2および CYP2C19 * 3)が発生す る検出対象部位をそれぞれ含む領域である。なお、本発明の増幅産物の製造方法 においては、本発明のプライマーセットを使用することが特徴であって、遺伝子増幅 法の種類や条件等は何ら制限されなレ、。
[0040] 前記遺伝子増幅法としては、前述のように特に制限されず、例えば、 PCR (Polym erase Chain Reaction)法、 NASBA (Nucleic acid sequence based amp lification)法、 TMA (Transcription— mediated amplification)法、 SDA (Str and Displacement Amplification)法等があげられる力 PCR法が好ましい。な お、以下、 PCR法を例にあげて、本発明を説明するが、これには制限されない。
[0041] 本発明を適用する試料としては、例えば、铸型となる核酸を含んでいればよぐ特 に制限されないが、例えば、夾雑物が含まれる試料に適用することが好ましい。前記 夾雑物が含まれる試料としては、例えば、全血、口腔内細胞（例えば、口腔粘膜）、 爪や毛髪等の体細胞、生殖細胞、喀痰、羊水、パラフィン包埋組織、尿、胃液 (例え ば、胃洗浄液）等や、それらの懸濁液等があげられる。本発明のプライマーセットを用 いた増幅産物の製造方法によれば、例えば、様々な夾雑物が含まれる試料 (特に、 全血や口腔内細胞等の生体試料）であっても、その影響を受け難ぐ CYP2C19遺 伝子の前記目的領域を特異的に増幅することができる。このため、本発明によれば、 従来法では困難であった全血等の夾雑物の多い試料であっても、例えば、精製等の 前処理を行うことなぐそのまま使用することが可能である。したがって、試料の前処 理の観点からも、従来法よりさらに迅速に増幅産物を調製することが可能といえる。
[0042] 前記反応液における試料の添加割合は、特に制限されな!/、。具体例として、前記 試料が生体試料 (例えば、全血試料）の場合、前記反応液における添加割合の下限 1S 例えば、 0. 01体積％以上であることが好ましぐより好ましくは 0. 05体積％以上
、さらに好ましくは 0. 1体積％以上である。また、前記添加割合の上限も、特に制限 されないが、例えば、 2体積％以下が好ましぐより好ましくは 1体積％以下、さらに好 ましくは 0. 5体積％以下である。
[0043] また、後述するような光学的検出を目的とする場合、特に、標識化プローブを用い た光学的検出を行う場合、全血試料のような生体試料の添加割合は、例えば、 0. 1 〜0. 5体積％に設定することが好ましい。 PCR反応においては、通常、 DNA変性（ 一本鎖 DNAへの解離）のために熱処理が施される力 この熱処理によって試料に含 まれる糖やタンパク質等が変性し、不溶化の沈殿物や濁り等が発生するおそれがあ る。このため、増幅産物の有無や検出対象部位の遺伝子型（多型）を光学的手法に より確認する場合、このような沈殿物や濁りの発生が、測定精度に影響を及ぼす可能 性がある。し力、しながら、反応液における全血試料の添加割合を前述の範囲に設定 すれば、メカニズムは不明であるが、例えば、変性による沈殿物等の発生による影響 を十分に防止することができるため、光学的手法による測定精度を向上できる。また 、全血試料中の夾雑物による PCRの阻害も十分に抑制されるため、増幅効率をより 一層向上することができる。したがって、本発明のプライマーセットの使用に加えて、 さらに、全血試料等の試料の添加割合を前述の範囲に設定することによって、より一 層、試料の前処理の必要性を排除できる。
[0044] また、前記反応液中の全血試料の割合は、前述のような体積割合 (例えば、 0.；!〜 0. 5体積0 /0)ではなぐヘモグロビン（以下、「Hb」という）の重量割合で表すこともで きる。この場合、前記反応液における全血試料の割合は、 Hb量に換算して、例えば 、 0. 565〜； 113g/Lの範囲カ好ましく、より好ましく (ま 2. 825-56. 5g/Lの範囲、 さらに好ましくは 5. 65-28. 25 g/Lの範囲である。なお、前記反応中における 全血試料の添加割合は、例えば、前記体積割合と Hb重量割合の両方を満たしても よいし、いずれか一方を満たしてもよい。
[0045] 全血としては、例えば、溶血した全血、未溶血の全血、抗凝固全血、凝固画分を含 む全血等の!/、ずれであってもよ!/、。
[0046] 本発明にお!/、て、試料に含まれる標的核酸は、例えば、 DNAである。前記 DNA は、例えば、生体試料等の試料に元来含まれる DNAでもよいし、遺伝子増幅法によ
り増幅させた増幅産物 DNAであってもよい。後者の場合、前記試料に元来含まれて いる RNA (トータル RNA、 mRNA等）から逆転写反応（例えば、 RT— PCR(Revers e Transcription PCR) )により生成させた cDNAがあげられる。
[0047] 本発明の増幅産物の製造方法において、遺伝子増幅反応の開始に先立ち、前記 反応液にさらにアルブミンを添加することが好ましい。このように、アルブミンを添加す れば、例えば、前述のような沈殿物や濁りの発生による影響をより一層低減すること ができ、且つ、増幅効率もさらに向上することができる。具体的には、前記 (I)工程の 増幅反応や、一本鎖 DNAへの解離工程前に、アルブミンを添加することが好ましい
〇
[0048] 前記反応液におけるアルブミンの添加割合は、例えば、 0. 0；!〜 2重量％の範囲で あり、好ましくは 0. ；!〜 1重量％であり、より好ましくは 0. 2〜0. 8重量％である。前記 アルブミンとしては、特に制限されず、例えば、ゥシ血清アルブミン（BSA)、ヒト血清 アルブミン、ラット血清アルブミン、ゥマ血清アルブミン等があげられ、これらはいずれ 力、 1種類でもよ!/ヽし 2種類以上を併用してもよレ、。
[0049] つぎに、本発明の増幅産物の製造方法に関し、全血試料について、 DNAを標的 核酸とし、前記プライマーセット（1)および（2)の両方を含む本発明の CYP2C19遺 伝子増幅用プライマーセットを用いた PCRにより、 CYP2C19遺伝子の 2つの領域の 増幅産物を製造する例をあげて説明する。なお、本発明は、本発明のプライマーセッ トを使用することが特徴であり、他の構成ならびに条件は何ら制限されない。
[0050] まず、 PCR反応液を調製する。本発明のプライマーセットの添加割合は、特に制限 されないが、プライマーセット（1)および（2)の Fプライマーを、それぞれ 0· 1〜2 111 ol/Lとなるように添加することが好ましぐより好ましくは 0· 25-1. S mol/Lであ り、特に好ましくは 0. 5〜1〃11101/しである。また、プライマーセット（1)および（2)の Rプライマーを、それぞれ 0. 1〜2〃11101/しとなるように添加することが好ましぐより 好ましく (ま 0. 25—1. 5 11101/しであり、特に好ましく (ま 0. 5〜1 mol/Lである。 各プライマーセットにおける Fプライマーと Rプライマーとの添加割合（F : R、モル比） は、特に制限されないが、例えば、 1 : 0. 25〜； 1 : 4が好ましく、より好ましくは 1 : 0. 5 〜； 1 : 2である。
[0051] 反応液における全血試料の割合は、特に制限されないが、前述の範囲が好ましい 。全血試料は、そのまま反応液に添加してもよいし、予め、水や緩衝液等の溶媒で希 釈してから反応液に添加してもよい。全血試料を予め希釈する場合、その希釈率は 特に制限されず、例えば、反応液での最終的な全血添加割合が前記範囲となるよう に設定できる力 ί列え (ま、、 100〜2000倍で り、好ましく (ま 200〜 000倍である。
[0052] 前記反応液における他の組成成分は、特に制限されず、従来公知の成分があげら れ、その割合も特に制限されない。前記組成成分としては、例えば、 DNAポリメラー ゼ、ヌクレオチド (ヌクレオシド三リン酸 (dNTP) )および溶媒があげられる。また、前 述のように前記反応液はさらにアルブミンを含有することが好ましい。なお、前記反応 液にぉレ、て、各組成成分の添加順序は何ら制限されな!/、。
[0053] 前記 DNAポリメラーゼとしては、特に制限されず、例えば、従来公知の耐熱性細菌 由来のポリメラーゼが使用できる。具体例としては、テルムス ·アクアティカス（Therm us aauaticus)由来 DNAポリメラーゼ（来国特許第 4. 889, 818号および同第 5, 079, 352^-) (商品名 Taaポリメラーゼ）、テルムス ·テルモフィラス（Thermus ther moOhilus)由来 DNAポリメラーゼ（WO 91/09950) (rTth DNA polymerase )、ピロコッカス ·フリオサス（Pyrococcus fiiitaiS)由来 DNAポリメラーゼ（WO 9 2/9688) (Pfu DNA polymerase： Stratagenes社製）、テルモコッカス'リトラリ ス (Thermococcus litoralis)由来 DNAポリメラーゼ（EP— A 455 430) (商標 V ent : Biolab New England社製）等が商業的に入手可能であり、中でも、テルムス •アクアティカス (Thermus aauaticus)由来の耐熱性 DNAポリメラーゼが好まし!/ヽ
〇
[0054] 前記反応液中の DNAポリメラーゼの添加割合は、特に制限されな!/、が、例えば、 5 〜50U/mLであり、好ましくは;!〜 100U/mLであり、より好ましくは 20〜30U/m Lである。なお、 DNAポリメラーゼの活性単位（U)は、一般に、活性化サケ精子 DN Aを铸型プライマーとして、活性測定用反応液中、 74°Cで、 30分間に lOnmolの全 ヌクレオチドを酸不溶性沈殿物に取り込む活性力 S1Uである。前記活性測定用反応 液の糸且成は、例えば、 25mM TAPS buffer (pH9. 3、 25。C)、 50mM KC1、 2 mM MgCl、 ImMメノレカプトエタノーノレ、 200 μ M dATP、 200 μ M dGTP、 2
00 M dTTP、 100 M「 a— 32P」dCTP、 0. 25mg/mL活性化サケ精子 DNA である。
[0055] 前記ヌクレオシド三リン酸としては、通常、 dNTP (dATP、 dCTP、 dTTP)があげら れる。前記反応液中の dNTPの添加割合は、特に制限されないが、例えば、 0. 01 〜； lmmol/Lであり、好ましくは 0· 05—0. 5mmol/Lであり、より好ましくは 0· ；!〜 0. 3mmolZLでめる。
[0056] 前記溶媒としては、例えば、 Tris-HCl, Tricine, MES、 MOPS, HEPES、 CA PS等の緩衝液があげられ、市販の PCR用緩衝液や市販の PCRキットの緩衝液等が 使用できる。
[0057] また、前記 PCR反応液は、さらに、へパリン、ベタイン、 KC1、 MgCl、 MgSO、グリ
2 4 セロール等を含んでもよぐこれらの添加割合は、例えば、 PCR反応を阻害しない範 囲で設定すればよい。
[0058] 反応液の全体積は、特に制限されず、例えば、使用する機器 (サーマルサイクラ一 )等に応じて適宜決定できる力 通常、 1〜500 しであり、好ましくは 10〜； 100 し である。
[0059] つぎに、 PCRを行う。 PCRのサイクル条件は特に制限されないが、例えば、（1)全 血由来二本鎖 DNAの 1本鎖 DNAへの解離、（2)プライマーのアニーリング、 （3)プ ライマーの伸長（ポリメラーゼ反応）は、それぞれ以下の通りである。また、サイクル数 も特に制限されないが、下記（1)〜（3)の 3ステップを 1サイクルとして、例えば、 30サ イタル以上が好ましい。上限は特に制限されないが、例えば、合計 100サイクル以下 、好ましくは 70サイクル以下、さらに好ましくは 50サイクル以下である。各ステップの 温度変化は、例えば、サーマルサイクラ一等を用いて自動的に制御すればよい。本 発明のプライマーセットを使用した場合、前述のように増幅効率に優れるため、従来 の方法によれば 50サイクルに 3時間程度を要していたのに対して、本発明によれば、 約 1時間程度（好ましくは 1時間以内）で 50サイクルを完了することも可能である。
[0060] [表 3]
温度 （°C〉 および時間 （秒）
(1) 1本鎖 DNAの解離 例えば、 90~99¾、 1 ~1 20秒
好ましくは、 92~95°C、 1 ~60秒
(2) プライマーの 例えば、 40~70°C、 1 ~300秒
ァニーリング 好ましくは、 50~70°C、 5~60秒
(3) 伸長反応 例えば、 50 ~ 80°C、 1 ~ 300秒
好ましくは、 50~75°C、 5~60秒
[0061] 以上のようにして、 CYP2C19遺伝子の 2つの領域に相補的な増幅産物を製造す ること力 Sできる。なお、 2つの目的領域のうちいずれ力、 1つに相補的な増幅産物を製 造する場合には、例えば、プライマーセット（1)および（2)のうち目的領域に対応する いずれ力、 1種類のプライマーセットを含む、本発明の CYP2C19遺伝子増幅用プライ マーセットを使用すればょレ、。
[0062] 本発明の増幅産物の製造方法は、さらに、前述の増幅反応によって得られた目的 領域の増幅産物を検出する工程を含んでもよい。これによつて、増幅産物の有無や 、 CYP2C19遺伝子の前記目的領域における遺伝子型（多型 CYP2C19 * 2または CYP2C19*3)を検出することもできる。増幅産物の有無は、従来公知の方法により 確認できる。具体的には、例えば、前記 (I)工程において、前記反応液に、さらに、 C YP2C19遺伝子の検出対象部位にハイブリダィズ可能なプローブ（例えば、蛍光標 識化プローブ）を添加しておき、さらに、（II)工程として、前記反応液について、前記 プローブにおける蛍光標識の蛍光強度を測定することによって確認できる。また、増 幅させる目的領域力 ¾つの場合には、例えば、前記 (I)工程において、前記反応液 に、さらに、 CYP2C19遺伝子の各検出対象部位にハイブリダィズ可能なプローブ（ 例えば、蛍光標識化プローブ）を 2種類添加しておき、さらに、（Π)工程として、前記 反応液について、各プローブにおける各蛍光標識の蛍光強度を測定することによつ て確認できる。なお、 CYP2C19遺伝子における多型 CYP2C19*2および CYP2 C19* 3の検出については、本発明の一形態として、以下に説明する。
[0063] <CYP2C19遺伝子の多型解析方法〉
本発明の CYP2C19遺伝子の多型解析方法は、 CYP2C19遺伝子における検出 対象部位の多型を解析する方法であって、下記 (i)〜（iv)工程を含むことを特徴とす
(i)本発明の増幅産物の製造方法により、 CYP2C19遺伝子における検出対象部位 を含む領域を反応液中で増幅させる工程
(ii)前記 (i)工程における増幅産物と、前記検出対象部位にハイブリダィズ可能なプ ローブとを含む反応液を準備する工程
(iii)前記反応液の温度を変化させ、前記増幅産物と前記プローブとのハイブリッド形 成体の融解状態を示すシグナル値を測定する工程
(iv)温度変化に伴う前記シグナル値の変動から、前記検出対象部位の多型を決定 する工程
[0064] このように本発明のプライマーセットを用いて増幅産物を製造することによって、前 述のように CYP2C19遺伝子における多型（CYP2C19 * 2または CYP2C19 * 3) の検出対象部位を含む目的領域を増幅し、前記目的領域における検出対象部位の 多型を解析することができる。
[0065] 前記（ii)工程におけるプローブは、特に制限されず、例えば、多型 CYP2C19 * 2 の発生部位にハイブリダィズするプローブ（以下、「CYP2C19 * 2用プローブ」とも いう）、および、多型 CYP2C19 * 3の発生部位にハイブリダィズするプローブ（以下 、「CYP2C19 * 3用プローブ」ともいう）である。これらのプローブは、前記検出対象 配列を含む検出対象配列に相補的なプローブであることが好ましい。これらのプロ一 ブは、いずれ力、 1種類でもよいし、 2種両方であってもよぐ例えば、本発明の CYP2 C19遺伝子増幅用プライマーセットによって増幅させた目的領域の種類に応じて決 定できる。 2種類のプローブを用いた場合、例えば、同一反応液を用いて、 2つの検 出対象部位の多型を解析することができる。
[0066] 前記多型を検出するためのプローブは、特に制限されず、従来公知の方法によつ て設定できる。例えば、多型の検出対象部位を含む検出対象配列として、 CYP2C1 9遺伝子のセンス鎖の配列に基づいて設計してもよいし、アンチセンス鎖の配列に基 づいて設計してもよい。また、多型の検出対象部位の塩基は、各多型の種類に応じ て適宜決定できる。すなわち、 CYP2C19 * 2の場合、配列番号 1における 1361番 目の塩基に「G」および「A」の多型が知られていることから、例えば、 1361番目が G
である検出対象配列、および、 1361番目が Aである検出対象配列のいずれかに相 補的なプローブ（センス鎖の検出用プローブ）や、そのアンチセンス鎖の配列に相補 的なプローブ（アンチセンス鎖の検出用プローブ）があげられる。また、 CYP2C19 * 3の場合、配列番号 1における 155番目の塩基に「G」および「A」の多型が知られて いることから、例えば、 155番目が Gである検出対象酉己列、および、 155番目が Aであ る検出対象配列のレ、ずれかに相補的なプローブ（センス鎖の検出用プローブ）や、 そのアンチセンス鎖の配列に相補的なプローブ（アンチセンス鎖の検出用プローブ） があげられる。このように、多型が生じる検出対象部位の塩基を前述のようないずれ かの塩基に設定してプローブを設計しても、後述するような方法により、 CYP2C19 遺伝子の各検出対象部位においてどのような多型を示すかを判断することが可能で ある。
[0067] 前記各プローブは、前記（i)工程の後、すなわち、 CYP2C19遺伝子の目的領域 について増幅反応を行った後、増幅反応液に添加することもできるが、容易且つ迅 速に解析を行えることから、前記 (i)工程の増幅反応に先立って、予め反応液に添加 しておくことが好ましい。
[0068] 前記反応液におけるプローブの添加割合は、特に制限されな!/、が、例えば、各プ ローブを 10〜400nmolの範囲となるように添加することが好ましぐより好ましくは 20 〜200nmolである。また、プローブの標識として蛍光色素を用いている場合、例えば 、検出する蛍光強度を調整するために、標識化プローブと同じ配列である未標識プ ローブを併用してもよぐこの未標識プローブは、その 3'末端にリン酸が付加されても よい。この場合、標識化プローブと非標識プローブのモル比は、例えば、 1： 10-10 : 1が好ましい。 CYP2C19 * 2用プローブおよび CYP2C19 * 3用プローブのうち、 非標識プローブをあわせて添加するものは、特に制限されないが、例えば、 CYP2C 19 * 3用プローブについて標識化プローブと非標識プローブとを添加することが好 ましい。前記プローブの長さは、特に制限されず、例えば、 5〜50merであり、好まし くは 10〜30merである。
[0069] Tm値について説明する。二本鎖 DNAを含む溶液を加熱していくと、 260nmにお ける吸光度が上昇する。これは、二本鎖 DNAにおける両鎖間の水素結合が加熱に
よってほどけ、一本鎖 DNAに解離（DNAの融解）することが原因である。そして、全 ての二本鎖 DNAが解離して一本鎖 DNAになると、その吸光度は加熱開始時の吸 光度（二本鎖 DNAのみの吸光度）の約 1. 5倍程度を示し、これによつて融解が完了 したと判断できる。この現象に基づき、融解温度 Tmとは、一般に、吸光度が、吸光度 全上昇分の 50%に達した時の温度と定義される。
[0070] 前記（iii)工程にお!/、て、前記増幅産物と前記プローブとのハイブリッド形成体の融 解状態を示すシグナルの測定は、前述した、 260nmの吸光度測定でもよいが、標識 物質のシグナル測定であってもよい。具体的には、前記プローブとして、標識物質で 標識化された標識化プローブを使用し、前記標識物質のシグナル測定を行うことが 好ましい。前記標識化プローブとしては、例えば、単独でシグナルを示し且つハイブ リツド形成によりシグナルを示さない標識化プローブ、または、単独でシグナルを示さ ず且つハイブリッド形成によりシグナルを示す標識化プローブがあげられる。前者の ようなプローブであれば、検出対象配列とハイブリッド（二本鎖 DNA)を形成して!/、る 際にはシグナルを示さず、加熱によりプローブが遊離するとシグナルを示す。また、 後者のプローブであれば、検出対象配列とハイブリッド（二本鎖 DNA)を形成するこ とによってシグナルを示し、加熱によりプローブが遊離するとシグナルが減少（消失） する。したがって、この標識によるシグナルをシグナル特有の条件（吸収波長等）で検 出することによって、前記 260nmの吸光度測定と同様に、融解の進行ならびに Tm 値の決定を行うことができる。
[0071] 本発明においては、前述のように、同一反応液で増幅させた 2つの領域の増幅産 物について多型を確認することもできる。このため、 2種類のプローブを使用する際に は、それぞれ異なる条件で検出される異なる標識によって標識化されて!/、ること力 S好 ましい。このように異なる標識を使用することによって、同一反応液であっても、検出 条件を変えることによって、各増幅産物を別個に解析することが可能となる。
[0072] 前記標識化プローブにおける標識物質の具体例としては、例えば、蛍光色素（蛍 光団）があげられる。前記標識化プローブの具体例としては、例えば、蛍光色素で標 識され、単独で蛍光を示し且つハイブリッド形成により蛍光が減少（例えば、消光）す るプローブが好ましい。このような蛍光消光現象（Quenching phenomenon)を禾 lj
用したプローブは、一般に、蛍光消光プローブと呼ばれる。中でも、前記プローブとし ては、オリゴヌクレオチドの 3'末端もしくは 5'末端が蛍光色素で標識化されているこ とが好ましぐ標識化される前記末端の塩基は、 Cであることが好ましい。この場合、 前記標識化プローブがハイブリダィズする検出対象配列において、前記標識化プロ ーブの末端塩基 Cと対をなす塩基もしくは前記対をなす塩基から;!〜 3塩基離れた塩 基が Gとなるように、前記標識化プローブの塩基配列を設計することが好ましい。この ようなプローブは、一般的にグァニン消光プローブと呼ばれ、いわゆる QProbe (登録 商標）として知られている。このようなグァニン消光プローブが検出対象配列にハイブ リダィズすると、蛍光色素で標識化された末端の Cが、前記検出対象 DNAにおける Gに近づくことによって、前記蛍光色素の発光が弱くなる（蛍光強度が減少する）とい う現象を示す。このようなプローブを使用すれば、シグナルの変動により、ハイブリダ ィズと解離とを容易に確認すること力 Sできる。
[0073] 前記蛍光色素としては、特に制限されないが、例えば、フルォレセイン、リン光体、 ローダミン、ポリメチン色素誘導体等があげられ、市販の蛍光色素としては、例えば、 BODIPY FL (商標、モレキュラー 'プローブ社製）、 FluorePrime (商品名、アマシ ャムフアルマシア社製）、 Fluoredite (商品名、ミリポア社製）、 FAM (ABI社製）、 Cy 3および Cy5 (アマシャムフアルマシア社製）、 TAMRA (モレキュラープローブ社製） 等があげられる。 2種類のプローブに使用する蛍光色素の組み合わせは、例えば、 異なる条件で検出できればよぐ特に制限されないが、例えば、 Pacific Blue (検出 波長 450〜480nm)および BODIPY FL (検出波長 515〜555nm)の組み合わせ 等があげられる。
[0074] 以下に、多型 CYP2C19 * 2および CYP2C19 * 3を検出するためのプローブの 配列の具体例を示すが、本発明は、これには制限されない。下記プローブ（1)は、 C YP2C19 * 2用プローブの一例であり、アンチセンス鎖を検出するためのプローブで ある。また、下記プローブ（2)は、 CYP2C19 * 3用プローブの一例であり、アンチセ ンス鎖を検出するためのプローブである。
[0075] プローブ（1)
配列番号 1における 1373番目のシトシン塩基（C)を 1塩基目として 5'方向に向かつ
て 16〜28塩基目までの領域と同じ配列である少なくとも一つのオリゴヌクレオチドで あって、前記シトシン塩基を 3，末端とするオリゴヌクレオチド
プローブ（2)
配列番号 1における 146番目のシトシン塩基（C)を 1塩基目として 3'方向に向かって 18〜25塩基目までの領域と同じ配列である少なくとも一つのオリゴヌクレオチドであ つて、前記シトシン塩基を 5'末端とするオリゴヌクレオチド、
および、
配列番号 1における 150番目のシトシン塩基（C)を 1塩基目として 3'方向に向かって 14〜； 19塩基目までの領域と同じ配列である少なくとも一つのオリゴヌクレオチドであ つて、前記シトシン塩基を 5'末端とするオリゴヌクレオチド
の少なくとも一方のオリゴヌクレオチド
[0076] 前記プローブ（1)において、配列番号 1の 1361番目にあたる塩基は、 Aまたは Gで あり、前記プローブ（2)において、配列番号 1の 155番目にあたる塩基は、 Aまたは G である。
[0077] さらに、前記プローブ（1)およびプローブ（2)の具体例を下記表に示す。なお、下 記表における「Tm (°C)」は、下記表の配列と完全に相補的な配列とがハイブリッドし た場合の Tm (。C)であり、 MELTCALCソフトウェア（http : //www. meltcalc. c om/)により、パラメーターをオリゴヌクレオチド濃度 0· 、ナトリウム当量（Na e q. ) 50mMとして算出した値である。
[0078] [表 4]
プロ—ブ 配列 Tm (°C) 配列番号
5 -cattgattatttcccAggaacccataac-o' 56 53
5 -attgattatttcccAggaacccataac-3' 55.1 54
5 -ttgattatttcccAggaacccataac-3' 54.8 55
5 -tgattatttcccAggaacccataac-j' 54,4 56
5'-gattatttcccAggaacccataac-j' 53 57 プローブ（1 ) 5'-attatttcccAggaacccataac 52 58 CYP2C1 9 * 2用 5'-ttatttcccAggaacccataac-3' 51.6 59
5'-tatttcccAggaacccataac-3' 50.9 60
5'-atttcccAggaacccataac-3' 51 61
5'-tttcccAggaacccataac-3' 50.5 62
5'-ttcccAggaacccataac-3' 49.6 63
5'-tcccAggaacccataac-3' 48.6 64
5 '- cccAggaacccataac - 3' 46.7 65
5'-caccccctgAatccaggtaaggcca-3' 63.3 66
5'-caccccctgAatccaggtaaggcc-3' 62.2 67
5'-caccccctgAatccaggtaaggc-3' 60.4 68
5'-caccccctgAatccaggtaagg-3' 57.9 69
5'-caccccctgAatccaggtaag-3' 55.7 70
5'-caccccctgAatccaggtaa-3' 54.7 71 プロ一ブ (2) 5'-caccccctgAatccagg a-3' 54.1 72 CYP2C1 9 * 3ffl 5'-caccccctgAatccaggt-3' 54.4 73
5'-ccctgAatccaggtaaggc-3' 53.4 74
5'-ccctgAatccaggtaagg-3' 49.9 75
5'-ccctgAatccaggtaag-3' 46.8 76
5'-ccctgAatccaggtaa-3' 44.9 77
5 '- ccctgAatccaggta - 3' 43.4 78
5'-ccctgAatccaggt-3' 43.1 79
[0079] 前記表において、プローブ（1)は、配列番号 1における 1361番目が Aである領域と 同じ配列からなり、大文字の塩基が、配列番号 1の 1361番目の塩基に相補的な塩 基を示す。なお、前記プローブ（1)において、前記大文字の塩基は、 rに置き換える こと力 Sでき、前記 rは、 Aおよび Gのいずれでもよい。前記表において、プローブ（2)は 、配列番号 1における 155番目が Aである領域と同じ配列からなり、大文字の塩基が 、配列番号 1における 155番目の塩基を示す。なお、前記プローブ（2)において、前 記大文字の塩基は、 rに置き換えることができ、前記 rは、 Gおよび Aいずれでもよい。 本発明におけるプローブの具体例としては、例えば、前述のように、前記表に示すォ リゴヌクレオチドの相補鎖であってもよレ、。
[0080] 前記プローブは一例であって、本発明はこれには限定されない。これらのプローブ の中でも、 CYP2C19 * 2用プローブとしては、（ΡΙ ' )配列番号 61または配列番号 6 4の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドが好ましぐ CYP2C19 * 3用プローブとして
は、（Ρ2' )配列番号 69または配列番号 76の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドが 好ましい。
[0081] そして、これらのプローブは、例えば、 2種類を使用する際には、前述のように、そ れぞれ異なる蛍光色素（異なる波長で検出される蛍光色素）で標識化することが好ま しい。例えば、前記表に示すプローブをグァニン消光プローブとする場合、 CYP2C 19 * 2用プローブ（P1プローブ）は、 3'末端のシトシンを前述のような蛍光色素（例 えば、 Pacific Blue, TAMRA等）で標識化し、 CYP2C19 * 3用プローブ（P2プロ ーブ）は、 5'末端のシトシンを前述のような蛍光色素（例えば、 BODIPY FL)で標 識化すること力 S好ましい。また、 5'末端に蛍光色素を標識化したプローブは、例えば 、プローブ自体が伸長することを予防するために、その 3'末端に、さらにリン酸基が 付加されてもよい。
[0082] 次に、本発明の検出方法について、一例として、下記プローブを用いて、 CYP2C 19遺伝子における 2つの多型 CYP2C19 * 2および CYP2C19 * 3を検出する方法 を説明する。なお、本発明はこれには制限されない。
[0083] (プローブ）
CYP2C19 * 2用プローブ
5'— atttcccAggaacccataac—（Pacific Blue)— 3' (酉己歹 IJ番号 61)、または、
5'— tcccaggaacccataac— (BODIPY FL)— 3' (配列番号 64)
CYP2C19 * 3用プローブ
5' -(BODIPY FL)-caccccctgAatccaggtaagg-P-3' (配列番号 69)、または
5'— (BODIPY FL)— ccctgAatccaggtaag— P— 3' (配列番号 76)
[0084] まず、前記 2種類の標識化プローブを添加した反応液を用いて、前述のように PCR を行い、同一反応液中で、 CYP2C19遺伝子の 2つの領域を同時に増幅させる。前 記反応液は、例えば、本発明の CYP2C19遺伝子増幅用プライマーセット、 DNAポ リメラーゼ、 dNTP、铸型となる核酸を含む試料、および、前記 2種類のプローブを含 む。この他に、核酸増幅に使用できる種々の添加剤を含んでもよい。
[0085] 次に、得られた増幅産物の解離、および、解離により得られた一本鎖 DNAと前記
標識化プローブとのハイブリダィズを行う。これは、例えば、前記反応液の温度変化 によって fiうことができる。
[0086] 前記解離工程における加熱温度は、前記増幅産物が解離できる温度であれば特 に制限されないが、例えば、 85〜95°Cである。加熱時間も特に制限されないが、通 常、 1秒〜 10分であり、好ましくは 1秒〜 5分である。
[0087] 解離した一本鎖 DNAと前記標識化プローブとのハイブリダィズは、例えば、前記解 離工程の後、前記解離工程における加熱温度を降下させることによって行うことがで きる。温度条件としては、例えば、 40〜50°Cである。
[0088] そして、前記反応液の温度を変化させ、前記増幅産物と前記標識化プローブとの ハイプリッド形成体の融解状態を示すシグナル値を測定する。具体的には、例えば、 前記反応液（前記一本鎖 DNAと前記標識化プローブとのハイブリッド形成体）を加 熱し、温度上昇に伴うシグナル値の変動を測定する。前述のように、末端の C塩基が 標識化されたプローブ（グァニン消光プローブ）を使用した場合、一本鎖 DNAとのハ イブリダィズした状態では、蛍光が減少ほたは消光）し、解離した状態では、蛍光を 発する。したがって、例えば、蛍光が減少ほたは消光）しているハイブリッド形成体を 徐々に加熱し、温度上昇に伴う蛍光強度の増加を測定すればよい。
[0089] 蛍光強度の変動を測定する際の温度範囲は、特に制限されな!/、が、例えば、開始 温度が室温〜 85°Cであり、好ましくは 25〜70°Cであり、終了温度は、例えば、 40〜 105°Cである。また、温度の上昇速度は、特に制限されないが、例えば、 0.；!〜 20 °C /秒であり、好ましくは 0. 3〜5°C/秒である。
[0090] 次に、前記シグナルの変動を解析して Tm値を決定する。具体的には、得られた蛍 光強度から各温度における単位時間あたりの蛍光強度変化量（一 d蛍光強度増加量 /dt)を算出し、最も低い値を示す温度を Tm値として決定できる。また、単位時間当 たりの蛍光強度増加量 (蛍光強度増加量/ 1)が最も高い点を Τι^直として決定するこ ともできる。なお、標識化プローブとして、消光プローブではなぐ単独でシグナルを 示さず且つハイブリッド形成によりシグナルを示すプローブを使用した場合には、反 対に、蛍光強度の減少量を測定すればょレ、。
[0091] 本発明においては、 2つの多型 CYP2C19 * 2および CYP2C19 * 3を検出するた
め、 2種類のプローブの各標識に応じた条件で、それぞれの Tm値を決定する。 CY P2C19 * 2用プローブの Pacific Blueは、例えば、検出波長 450〜480nm、 CYP 2C19 * 3用プローブの BODIPY FLは、例えば、検出波長 515〜555nmで検出 すること力 Sできる。また、標識が TAMRAの場合は、例えば、検出波長 585〜700n mで検出することができる。
[0092] そして、これらの Tm値から、各検出対象部位における遺伝子型を決定する。 Tm解 析において、完全に相補であるハイブリッド（マッチ）は、一塩基が異なるハイブリッド（ ミスマッチ）よりも、解離を示す Tm値が高くなるという結果が得られる。したがって、予 め、前記プローブについて、完全に相補であるハイブリッドの Tm値と、一塩基が異な るハイブリッドの Tm値とを決定しておくことにより、各検出対象部位における遺伝子 型を決定することができる。例えば、検出対象部位の塩基を変異型 (例えば、配列番 号 1における 1361番目の塩基が A)と仮定し、それを含む検出対象配列に相補的な プローブを使用した場合、形成したハイブリッドの Tm値力 完全に相補なハイブリツ ドの Tm値と同じであれば、前記増幅産物の多型は、変異型と判断できる。また、形 成したハイブリッドの Tm値力 S、一塩基異なるハイブリッドの Tm値と同じ（完全に相補 なハイブリッドの Tm値より低い値）であれば、前記増幅産物の多型は、野生型（例え ば、配列番号 1における 1361番目の塩基が G)と判断できる。さらに、両方の Tm値 が検出された場合には、ヘテロ接合体と決定できる。このようにして、各標識化プロ一 ブに対する 2つの Tm値から、多型 CYP2C19 * 2および CYP2C19 * 3の有無を判 断すること力 Sでさる。
[0093] また、本発明においては、前述のように、前記プローブを含む反応液の温度を上昇 させて (ノヽイブリツド形成体を加熱して）、温度上昇に伴うシグナル変動を測定する方 法に代えて、例えば、ハイブリッド形成時におけるシグナル変動の測定を行ってもよ い。すなわち、前記プローブを含む反応液の温度を降下させてハイブリッド形成体を 形成する際に、前記温度降下に伴うシグナル変動を測定してもよい。
[0094] 具体例として、単独でシグナルを示し且つハイブリッド形成によりシグナルを示さな い標識化プローブ (例えば、グァニン消光プローブ）を使用した場合、一本鎖 DNAと プローブとが解離している状態では蛍光を発している力 S、温度の降下によりハイブリツ
ドを形成すると、前記蛍光が減少ほたは消光）する。したがって、例えば、前記反応 液の温度を徐々に降下して、温度下降に伴う蛍光強度の減少を測定すればよい。他 方、単独でシグナルを示さず且つハイブリッド形成によりシグナルを示す標識化プロ ーブを使用した場合、一本鎖 DNAとプローブとが解離して!/、る状態では蛍光を発し ていないが、温度の降下によりハイブリッドを形成すると、蛍光を発するようになる。し たがって、例えば、前記反応液の温度を徐々に降下して、温度下降に伴う蛍光強度 の増加を測定すればよい。
[0095] なお、 CYP2C19遺伝子の 2種類の多型（CYP2C19 * 2または CYP2C19 * 3) のうちいずれ力、 1つの多型を解析する場合には、例えば、プライマーセット（1)および (2)のうち目的領域に対応するいずれ力、 1種類のプライマーセットを含む、本発明の CYP2C19増幅用プライマーセットを使用し、さらに、 目的の検出対象部位にハイブ リダィズする!/、ずれ力、 1種類のプローブを使用すればょレ、。
[0096] つぎに、本発明の実施例について説明する。ただし、本発明は、下記実施例により 制限されない。
実施例 1
[0097] 被検者 4人からへパリンリチウム採血管を用いて採血を行った（サンプル 1〜4)。得 られた血液 10 H Lと蒸留水 90 H Lを混合し、さらに、この混合液 10 Lと蒸留水 90 μ Lとを混合した。これら混合液 10 Lを、下記組成の PCR反応液 40 μ Lに添加し、 サーマルサイクラ一を用いて PCRを行った。 PCRの条件は、 95°Cで 60秒処理した 後、 95°C1秒および 54°C10秒を 1サイクルとして 50サイクル繰り返し、さらに 95°Cで 1秒、 40°Cで 60秒処理した。そして、続けて、温度の上昇速度を C/3秒として、前 記 PCR反応液を 40°Cから 95°Cに加熱していき、経時的な蛍光強度の変化を測定し た。測定波長は、 450〜480nm (蛍光色素 Pacific Blueの検出）、 515〜555nm ( 蛍光色素 BODIPY FLの検出）とした。なお、 50サイクルの PCRに要した時間は、 約 1時間であった。
[0098] [表 5]
(PCR反応液：単位// I )
蒸留水 20. 875
5% N a N3 0. 5
20 % B S A 1
40%グリセロール 3. 1 25
1 0 X G e n e T a q b u f f e r^ 5
2. 5m d N T P s 4
1 0 Om MgC I 2 0. 75
5 j« u CYP2C 19 * 2用プローブ 1
5 jU C Y P 2 C 1 9 * 3用プローブ 1 1
5 μΜ C Y P 2 C 1 9 * 3用プローブ 2 1
1 OOjU CYP2C 1 9 * 2 F 1プライマ一 0. 25
1 OO ^ CYP2C 1 9 * 2 R 1プライマ一 0. 5
1 OOjU C YP2C 1 9 * 3 F2プライマ一 0. 25
1 00 jUM CYP2C 1 9 * 3 R 2プライマー 0. 5
5 U u I Ge n e T a q FP¾ 0. 25
To t a l A O し
* 商品名 G e n e Ta q FP ： 二ツボンジーン社製
[0099] (プローブ）
CYP2C19 * 2用プローブ
5 -atttcccaggaacccataac-(Pacific Blueノ一 3' (目 歹1 J¾"号 61ノ
CYP2C19 * 3用プローブ 1
5'-(BODIPY FL)-caccccctgaatccaggtaagg-P-3' (配列番号 69) CYP2C19 * 3用プローブ 2
5 -caccccctgaatccaggtaagg-P-j' (目 ΰ列番^ "69)
[0100] (プライマーセット）
CYP2C19*2 F1プライマー
5 -gttttctcttagatatgcaataattttccca-j' (酉 ΰ列备号 12)
CYP2C19*2 R1プライマー
5'-cgagggttgttgatgtccatc-3， （酉己歹 IJ番号 22)
CYP2C19*3 F2プライマー
5 -gaaaaattgaatgaaaacatcaggattgta-3 (目己列^ 32)
CYP2C19*3 R2プライマー
5 '-gtacttcagggcttggtcaata-3 ' (酉己歹 IJ番号 48 )
[0101] CYP2C19 * 2用プローブとマッチするハイブリッドの Tm値は 60· 5°C、ミ
のハイブリッドの Tn^直は 53· 0°C、 CYP2C19 * 3用プローブとマッチするハイブリツ ドの Tm値は 66· 5°C、ミスマッチのハイブリッドの Tm値は 60· 0°Cである。
[0102] サンプル 1〜4の結果を図 1に示す。この図は、温度上昇に伴う蛍光強度の変化を 示す Tm解析のグラフであり、縦軸の微分値は「一 d蛍光強度増加量/ dt」を示し、横 軸は温度を示す（以下、同様)。同図に示すように、シグナルのピークから、各サンプ ルにおける CYP2C19 * 2および CYP2C19 * 3の遺伝子型を決定した。これらの実 施例の結果を裏付けるために、被検者 4人について、 RFLP法およびシークェンス法 によって、 CYP2C19 * 2および CYP2C19 * 3の遺伝子型を確認した結果、実施 例と同じ結果が得られた。このように、本発明のプライマーセットを使用することにより 、前処理を施していない全血試料を使用して、 CYP2C19遺伝子の 2つの領域を同 一反応液中で同時に増幅し、且つ、前記同一反応液を用いて 2種類の多型を解析 すること力 Sでさた。
実施例 2
[0103] 被検者 2人から EDTA採血管を用いて採血を行った（サンプル;!〜 2)。得られた血 液 10 11 Lと下記希釈液 A 7011 Lとを混合し、さらに、この混合液 10 Lと下記希釈 液 Β 70 μ Lとを混合した。得られた混合液 10 Lを 95°Cで 5分間加熱処理した後、 下記組成の PCR反応液 46 μ Lに添加し、サーマルサイクラ一を用いて PCRを行つ た。 PCRの条件は、 95°Cで 60秒処理した後、 95°C1秒および 64°C15秒を 1サイク ルとして 50サイクル繰り返し、さらに 95°Cで 1秒、 40°Cで 60秒処理した。そして、続 けて、温度の上昇速度を C/3秒として、前記 PCR反応液を 40°Cから 75°Cに加熱 していき、経時的な蛍光強度の変化を測定した。測定波長は、 515〜555nm (蛍光 色素 BODIPY FLの検出）、および、 585〜700nm (蛍光色素 TAMRAの検出）と した。
[0104] (希釈液 A)
10mM Tris— HCl (pH8)、 0. ImM EDTA, 0. 05% NaN
3、 0. 3% SDS
(希釈液 B)
lOmM Tris— HCl (pH8)、 0· ImM EDTA, 0. 05% NaN
3
[0105] [表 6]
(P CR反応液：単位// I )
蒸留水 1 4. 25
5% N a 0. 5
20% BS A 0. 5
40%グリセロール 1 2. 5
1 0 G e n e T q b u f f e r ¾ 5
2. 5mM d N T P s 4
1 0 OmM Mg C I 2 1. 5
5 μ uM CY P 2 C 1 9 * 2用プローブ 4
5 C Y P 2 C 1 9 * 3用プローブ 2
1 O O iM C Y P 2 C 1 9 * 2 F 1プライマ一 0. 25
1 O O jUM C Y P 2 C 1 9 * 2 R 1プライマ一 0. 5
^ 00 μΜ CY P 2 C 1 9 * 3 F 2プライマ一 0. 25
1 O O jWM CY P 2 C 1 9 * 3 R2プライマ一 0. 5
5 U I G e n e T a q F P -※ 0. 25
T o t a l 6 し
* 商品名 G e n e T a q F P ： 二ツボンジーン社製
[0106] (プローブ）
CYP2C19 * 2用プローブ
5— tcccaggaacccataac— (BODIPY FL— 3' (配列番号 64) CYP2C19 * 3用プローブ
5— Π AMRA)― ccctgaatccaggtaag— P— ό' (配列番号 76)
[0107] (プライマーセット）
CYP2C19*2 F1プライマー
5— taaattattgttttctcttagatatgcaataattttccca— 3 (配列番号 3) CYP2C19*2 R1プライマー
5― cccgagggttgttgatgtccatc— ό' (配列番号 20)
CYP2C19*3 F2プライマー
5― tgatggaaaaattgaatgaaaacatcaggattgta― 3 (配列番号 27)
CYP2C19*3 R2プライマー
5― tcaaaaatgtacttcagggcttggtcaata― 3 (配列番号 40) [0108] CYP2C19 * 2用プローブとマッチするハイブリッド ，m値は 59。C、
ハイブリッドの Tm値は 51°C、 CYP2C19 * 3用プローブ
m値は 58°C、ミスマッチのハイブリッドの Tm値は 50°Cである。
[0109] サンプル 1〜2の結果を図 2に示す。この図は、温度上昇に伴う蛍光強度の変化を
示す Tm解析のグラフであり、縦軸の微分値は d蛍光強度増加量/ dt」を示し、横 軸は温度を示す。同図に示すように、シグナルのピークから、各サンプルにおける C YP2C19 * 2および CYP2C19 * 3の遺伝子型を決定した。これらの実施例の結果 を裏付けるために、被検者 2人について、 RFLP法およびシークェンス法によって、 C YP2C19 * 2および CYP2C19 * 3の遺伝子型を確認した結果、実施例と同じ結果 が得られた。このように、本発明のプライマーセットを使用することにより、前処理を施 していない全血試料を使用して、 CYP2C19遺伝子の 2つの領域を同一反応液中で 同時に増幅し、且つ、前記同一反応液を用いて 2種類の多型を解析することができ た。
産業上の利用可能性
以上のように、本発明のプライマーセットによれば、 CYP2C19遺伝子における特 定の多型（CYP2C19 * 2または CYP2C19 * 3)が生じる部位を含む領域を、特異 的に高効率で増幅することができる。このため、前述のような従来法とは異なり手間 やコストを低減することが可能となる。また、このように多型の検出対象部位を含む領 域が特異的に増幅されることから、例えば、前記検出対象部位を含む検出対象配列 に相補的なプローブを使用することで、前記反応液を用いてそのまま Tm解析を行レ、 、前記多型をタイピングすることが可能となる。また、一つの反応液で増幅やタイピン グが可能であることから、操作の自動化も可能になる。さらに、本発明のプライマーセ ットを用いれば、例えば、夾雑物が含まれる試料 (例えば、全血や口腔粘膜等）であ つても、前処理を省略できるため、より迅速且つ簡便に増幅反応を行うことができる。 また、本発明のプライマーセットを用いれば、従来よりも優れた増幅効率で増幅反応 が行えるため、増幅反応も短縮化が可能である。したがって、本発明のプライマーセ ットゃこれを含む試薬、ならびにこれらを用いた増幅産物の製造方法によれば、 CYP 2C19遺伝子の多型を迅速かつ簡便に解析できることから、医療分野においてきわ めて有効といえる。
Claims
(F1)配列番号 1の塩基配列における 1341番目のアデニン塩基 (A)を 1塩基目とし て 5'方向に向力、つて 25〜41塩基目までの領域と同じ配列である少なくとも一つのォ リゴヌクレオチドであって、前記アデニン塩基 (A)を 3'末端とするオリゴヌクレオチド (R1)配列番号 1の塩基配列における 1442番目のグァニン塩基（G)を 1塩基目とし て 3'方向に向かって 19〜24塩基目までの領域に相補的な少なくとも一つのオリゴヌ クレオチドであって、前記 1442番目のグァニン塩基（G)に相補的なシトシン塩基（C プライマーセット（2)
下記（F2)のオリゴヌクレオチドからなるフォワードプライマーおよび下記（R2)のオリ ゴヌクレオチドからなるリバースプライマーを含む一対のプライマーセット
(F2)配列番号 1の塩基配列における 143番目のアデニン塩基 (A)を 1塩基目として 5'方向に向かって 23〜37塩基目までの領域と同じ配列である少なくとも一つのオリ ゴヌクレオチドであって、前記アデニン塩基 (A)を 3'末端とするオリゴヌクレオチド (R2)配列番号 1の塩基配列における 231番目のチミン塩基 (T)を 1塩基目として 3' 方向に向かって 18〜30塩基目までの領域に相補的な少なくとも一つのオリゴヌタレ ォチドであって、前記 231番目のチミン塩基 (T)に相補的なアデニン塩基 (A)を 3'
[2] 前記プライマーセット（1)および（2)が、それぞれ下記プライマーセット（1 ' )および（
2' )である、請求の範囲 1記載の CYP2C19遺伝子増幅用プライマーセット。
プライマーセット '）
下記（Fl ' )のオリゴヌクレオチドからなるフォワードプライマーおよび下記（R1 ' )の オリゴヌクレオチドからなるリバースプライマーを含む一対のプライマーセット
(F1 ' )配列番号 3の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、および、配列番号 12の塩 基配列からなるオリゴヌクレオチドの少なくとも一方のオリゴヌクレオチド
(R1 ' )配列番号 20の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、および、配列番号 22の 塩基配列からなるオリゴヌクレオチドの少なくとも一方オリゴヌクレオチド
プライマーセット（2' )
下記（F2，）のオリゴヌクレオチドからなるフォワードプライマーおよび下記（R2，）の オリゴヌクレオチドからなるリバースプライマーを含む一対のプライマーセット
(F2' )配列番号 27の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、および、配列番号 32の 塩基配列からなるオリゴヌクレオチドの少なくとも一方のオリゴヌクレオチド
(R2' )配列番号 40の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、および、配列番号 48の 塩基配列からなるオリゴヌクレオチドの少なくとも一方のオリゴヌクレオチド
[3] CYP2C19遺伝子増幅用プライマーセットが、生体試料中の CYP2C19遺伝子を 増幅するためのプライマーセットである、請求の範囲 1記載の CYP2C19遺伝子増幅 用プライマーセット。
[4] 前記生体試料が、全血である、請求の範囲 3記載の CYP2C19遺伝子増幅用ブラ イマ一セット。
[5] 遺伝子増幅法により CYP2C19遺伝子を増幅するための試薬であって、請求の範 囲 1記載の CYP2C19遺伝子増幅用プライマーセットを含むことを特徴とする CYP2 C19遺伝子増幅用試薬。
[6] さらに、 CYP2C19遺伝子の検出対象部位にハイブリダィズ可能なプローブを含む 、請求の範囲 5記載の CYP2C 19遺伝子増幅用試薬。
[7] 前記プローブが、下記（ΡΙ ' )および（Ρ2' )に示すオリゴヌクレオチドの少なくとも一 方のプローブである、請求の範囲 6記載の CYP2C19遺伝子増幅用試薬。
(ΡΙ ' )配列番号 61の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、および、配列番号 64の 塩基配列からなるオリゴヌクレオチドの少なくとも一方のオリゴヌクレオチド
(Ρ2' )配列番号 69の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、および、配列番号 76の
塩基配列からなるオリゴヌクレオチドの少なくとも一方のオリゴヌクレオチド
[8] 前記プローブが、蛍光標識化プローブである、請求の範囲 6記載の CYP2C19遺 伝子増幅用試薬。
[9] 遺伝子増幅法により CYP2C19遺伝子の増幅産物を製造する方法であって、 下記 (I)工程を含むことを特徴とする増幅産物の製造方法。
(I)試料中の核酸を铸型として、請求の範囲 1記載の CYP2C19遺伝子増幅用ブラ イマ一セットを用いて、反応液中で、前記 CYP2C19遺伝子の増幅を行う工程
[10] 前記 (I)工程において、前記反応液に、さらに、 CYP2C19遺伝子の検出対象部 位にハイブリダィズ可能なプローブを添加する、請求の範囲 9記載の増幅産物の製 造方法。
[11] 前記プローブが、下記（ΡΙ ' )および（Ρ2' )に示すオリゴヌクレオチドの少なくとも一 方のプローブである、請求の範囲 10記載の増幅産物の製造方法。
(ΡΙ ' )配列番号 61の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、および、配列番号 64の 塩基配列からなるオリゴヌクレオチドの少なくとも一方のオリゴヌクレオチド
(Ρ2' )配列番号 69の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、および、配列番号 76の 塩基配列からなるオリゴヌクレオチドの少なくとも一方のオリゴヌクレオチド
[12] 前記プローブが、蛍光標識化プローブである、請求の範囲 10記載の増幅産物の 製造方法。
[13] さらに、下記 (II)工程を含む、請求の範囲 12記載の増幅産物の製造方法。
(II)前記反応液について、前記蛍光標識化プローブにおける蛍光標識の蛍光強度
[14] 前記試料が、生体試料である、請求の範囲 9記載の増幅産物の製造方法。
[15] 前記生体試料が、全血である、請求の範囲 14記載の増幅産物の製造方法。
[16] 前記反応液における全血試料の添加割合力 0. ；!〜 0. 5体積％である、請求の範 囲 15記載の増幅産物の製造方法。
[17] CYP2C19遺伝子における検出対象部位の多型を解析する方法であって、
下記 ω〜（iV)工程を含むことを特徴とする多型解析方法。
(i)請求の範囲 9記載の増幅産物の製造方法により、 CYP2C19遺伝子における検 出対象部位を含む領域を反応液中で増幅させる工程
(ii)前記 (i)工程における増幅産物と、前記検出対象部位にハイブリダィズ可能なプ ローブとを含む反応液を準備する工程
(iii)前記反応液の温度を変化させ、前記増幅産物と前記プローブとのハイブリッド形 成体の融解状態を示すシグナル値を測定する工程
(iv)温度変化に伴う前記シグナル値の変動から、前記検出対象部位の多型を決定 する工程
前記 ω工程において、増幅反応に先立って、前記反応液に、前記検出対象部位 にハイブリダィズ可能なプローブを添加する、請求の範囲 17記載の多型解析方法。
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