WO2008054030A1 - IgG-BINDING PEPTIDE - Google Patents

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WO2008054030A1
WO2008054030A1 PCT/JP2007/071754 JP2007071754W WO2008054030A1 WO 2008054030 A1 WO2008054030 A1 WO 2008054030A1 JP 2007071754 W JP2007071754 W JP 2007071754W WO 2008054030 A1 WO2008054030 A1 WO 2008054030A1
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human igg
peptide tag
peptide
acid
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PCT/JP2007/071754
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Inventor
Yuji Ito
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Kagoshima University
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Publication date
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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6854—Immunoglobulins
    • G01N33/6857—Antibody fragments
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
    • C07K1/22—Affinity chromatography or related techniques based upon selective absorption processes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/06—Linear peptides containing only normal peptide links having 5 to 11 amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/08—Linear peptides containing only normal peptide links having 12 to 20 amino acids
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    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6854—Immunoglobulins

Definitions

  • the present invention relates to a peptide having binding affinity for human IgG, and a method for detecting and purifying human IgG using the same. Background technology
  • Antibody drugs are attracting attention as the most reliable molecular target drugs, and new drug fields are rapidly expanding.
  • Most antibody drugs currently being developed or used use antibodies belonging to the immunoglobulin G (IgG) class.
  • IgG immunoglobulin G
  • anti-Fc antibodies and protein A / G that specifically bind to the Fc region of IgG antibodies have often been used for detection and purification of IgG antibodies (Non-patent Documents 1 and 2).
  • anti-Fc antibodies produced by the hybridoma technology or animal immunization are not only expensive but also have drawbacks such as being easily denatured during labeling.
  • Protein A / G has the disadvantages that it cannot distinguish IgG from different species and does not bind to human IgG3.
  • protein A / G is usually isolated from bacteria, so the possibility of contamination with endotoxins such as LPS is a major problem in the use of protein A column in the purification of antibody drugs. .
  • acid denaturation of the antibody occurs when the antibody is eluted from the column using an acidic solution, resulting in a significant decrease in yield or purification.
  • the quality of the antibody is lowered. It is very important to develop a new method that can specifically detect and purify human IgG while overcoming the problems associated with antibody purification using protein A / G.
  • Peptide Fc-III has a Kd value of 185 nM in binding affinity to IgG antibody, but Dias et al.'S improved peptide FcBP-2 reduces the Kd value to about 2 nM, which is extremely bound It was shown to be a strong peptide.
  • the dissociation rate constant koff of FcBP- 2 is 10-2 sec- 1 .
  • the dissociation rate is usually of the koff of antibodies: comparison with the value of (10- 3 ⁇ 10- 5 SecT 1 ), very fast.
  • Patent Document 3 A wide variety of human IgG Fc-binding peptides are disclosed in Patent Document 3. However, for purification / detection of human IgG that can retain sufficient binding to any subclass of human IgG and does not show significant binding to IgG from other species. No suitable peptide is described in Patent Document 3.
  • Patent Document 1 Japanese Patent Laid-Open No. 2 0 0 4-1 8 7 5 6 3
  • Patent Document 2 International Publication WO 0 1/0 4 5 7 4 6 Pamphlet
  • Patent Document 3 International Publication WO 0 2/0 8 6 0 7 0 Pamphlet
  • Non-patent document 1 Ey P. L., et al., Immunohchemistry (1978) 15, p.429-436
  • Non-patent document 2 Akerstrom B., et al., J. Immunol., (1985) 135, p.2589-
  • Non-patent document 3 Fassina G., et al., J. Mol. Recognit. (1996) 9, p.564-
  • Non-Patent Document 4 Fassina G., et al., J. Mol. Recognit. (1998) 11, p.12
  • Non-Patent Document 5 Ehrlich G. K. and Bailon P., J. Mol. Recognit. (1998) 1
  • Non-Patent Document 6 Krook M., Mosbach K., and Ramstrom 0., J. Immunol. Met hods (1998) 221, p.151-157
  • Non-patent document 7 Verdoliva A. et al., Chembiochem (2005) 6, p.1242-1253
  • Non-patent document 8 DeLano WL, et al., Science (2000) 287, p.1279-1283
  • Non-patent document 9 Dias RL, et al., J. Am. Chem. Soc. (2006) 128, p.272
  • An object of the present invention is to provide a peptide that has a specific binding activity for human IgG and can be suitably used for purification or detection of human IgG.
  • the present invention includes the following.
  • amino acid sequence represented by Formula I is a) and b):
  • Particularly preferred examples of the peptide tag of [1] above include those consisting of the following amino acid sequences 1) to 11).
  • the peptide tag of [1] above preferably binds to acid-denatured human IgG.
  • a labeling substance may be added to the peptide tag of [1] above.
  • a fusion protein comprising a protein linked to the peptide tag of [1] above.
  • [6] A vector comprising the DNA of [5] above.
  • a method for detecting a human IgG or a fragment containing its Fc region in a sample comprising the following steps a) to:
  • step b) a step of contacting the peptide tag of [1] above with an acid-treated sample, and c) a step of measuring the binding between the peptide tag and a fragment containing human IgG or its Fc region, which was generated in step b).
  • a method for purifying a fragment containing human IgG or its Fc region in a sample comprising the following steps a) and b):
  • step b) A step of separating the human IgG or the fragment containing the Fc region thereof bound to the peptide tag in step a) from the sample.
  • step b) A step of removing the human IgG bound to the peptide tag in step a) or a fragment containing the Fc region thereof from the trial.
  • a protein purification method comprising the following steps a) to:
  • step b) contacting the sample of step a) with acid-treated human IgG or a fragment containing its Fc region, thereby binding the fusion protein to the fragment containing human IgG or its Fc region;
  • step b) A step of separating the fusion protein bound to the human IgG or a fragment containing the Fc region thereof in step b) from the sample.
  • the peptide tag of the present invention can specifically bind to human IgG, and in particular, can bind well to acid-denatured human IgG.
  • This specification includes the contents described in the specification of Japanese Patent Application No. 2 0 06-2 9 5 5 6 which is the basis of the priority of the present application.
  • Figure 1 shows the enrichment of IgG-specific phage (black bars) by biopanning for human IgG antibodies. The par shown in each round indicates phages that bind to hIgG, gelatin, and BSA from the left.
  • FIG. 2 shows the binding specificity of the obtained IgG-specific phage clone for human IgG.
  • the bars shown for each phage are hIgG, hIgA, hIgE, Shows binding to hIgM, mIgG, mIgA, mIgE, hTF, HSA, BSA, and gelatin.
  • Figure 3 is a diagram showing the binding activity to human IgG isotypes of the resulting IgG-specific phage clones (IgGl, IgG2, I g G3 , IgG4).
  • the bar shown for each phage shows binding to hIgGl, hIgG2, hIgG3, hIgG4, BSA ⁇ mlgGl, mIgG2b, and mIgG3 from the left.
  • Figure 4 is a diagram showing inhibition of pro-Ting A for binding to human I g G obtained IgG-specific phage clones.
  • the bars shown for each phage are from the left: 0 ng / uenore, 15 ng / uenore, 30 ng / uenore, 60 ng, / wenore, 125 ng / uenore, 250 ng / well, 500 ng / well protein A (SpA ) Shows human IgG binding properties.
  • FIG. 5 shows the binding activity of IgG-specific phage clones to human IgG under reducing and oxidizing conditions.
  • the bars shown for each experimental group indicate the human IgG binding properties of phages added with 0 mM (not added), 30 mM, 50 mM GSSG or DTT from the left.
  • FIG. 6 shows the binding specificity of human IgG-specific synthetic peptide to human IgG.
  • the par shown for each synthetic peptide shows binding to hI g G, hlgG-Fc, hIgA, h IgE, mIgG, mIgA, mIgE, hTF, FBS, HSA, gelatin, BSA from the left
  • Fig. 7 G shows the binding activity of IgG-specific synthetic peptides to human IgG isotype antibodies.
  • the bar shown for each synthetic peptide shows binding to hIgG1, hIgG2, hIgG3, hIgG4, and BSA from the left.
  • FIG. 8 is a diagram showing the results of surface plasmon resonance analysis on the binding of various human IgG-specific synthetic peptides and human IgG.
  • the horizontal axis represents time (seconds), and the vertical axis represents response units (RU).
  • FIG. 8A is a diagram showing the results of surface plasmon resonance analysis relating to the binding of human IgG-specific synthetic peptide IMGpep-1 to human IgG.
  • FIG. 8B shows the results of surface plasmon resonance analysis of the binding of human IgG-specific synthetic peptide IMGpep-1E6Q to human IgG.
  • FIG. 8C shows the results of surface plasmon resonance analysis of the binding of human IgG-specific synthetic peptide IMGpe p- 4 and human IgG.
  • FIG. 8A is a diagram showing the results of surface plasmon resonance analysis relating to the binding of human IgG-specific synthetic peptide IMGpep-1 to human IgG.
  • FIG. 8B shows the results
  • FIG. 8D shows the results of surface plasmon resonance analysis of the binding of human IgG-specific synthetic peptide IMGpep-4K6R to human IgG.
  • Figure 9 is a photograph showing the results of immunoprecipitation of human IgG antibody using magnet beads immobilized with a human IgG-specific synthetic peptide and human IgG-specific phage clone.
  • FIG. 10 is a photograph showing the results of immunoprecipitation of hlgG antibody after acid treatment using a human IgG-specific synthetic peptide.
  • Figure 1 1 shows the reactivity with the acid treatment (treatment P H2. 7, the treatment temperature 40 ° C) after I gG samples and Sen search Tsu peptide Fc-III or IMGpep-4K6R immobilized on flop
  • the horizontal axis represents time (seconds), and the vertical axis represents response units (RU).
  • RU response units
  • Fig. 12 shows changes in the rate of acid-denatured human IgG production in response to acid treatment conditions.
  • white bars, black bars, and diagonal bars represent samples with 20 ° C, 30 ° C, and 40 ° C incubation temperatures during acid treatment, respectively.
  • FIG. 13 shows the separation of acid-denatured human IgG using an IMGpep-4K6R-immobilized column.
  • the solid line represents an acid-treated anti-HER2 human IgG antibody sample
  • the broken line represents an untreated anti-thigh 2 human IgG antibody sample (Herceptin)
  • the dotted line represents BSA.
  • FIG. 14 is a diagram showing a CD spectrum of human IgG (acid-denatured human IgG) having acid-denatured conformation.
  • the solid line represents untreated IgG, and the dotted line represents purified acid-denatured IgG.
  • FIG. 15 shows the results of molecular sieve chromatography of acid-denatured human anti-IL-6 receptor antibody MRA.
  • Fig. 15 A Untreated human IgG (anti-IL-6 receptor human antibody MRA)
  • B Acid-treated (pH 2.7, 30 ° C, 10 min) human IgG (MRA)
  • C Acid-denatured MRA purified through a Piotinized IMGpep-4K6R immobilized column
  • D Acid-treated (pH 2.7, 30 ° C, 10 min) human IgG (MRA) on IMGPep-4K6R immobilized column Pass-through fraction obtained by applying (MRA remaining unmodified).
  • Figure 16 shows the immobilization of IMGpep-4K6R peptide on the fraction separated from acid-treated human IgG sample by IMGep-4K6R peptide immobilization column chromatography It is a figure which shows the result of the immunoprecipitation experiment by a bead.
  • Lane 1 untreated antibody MRA
  • lane 2 antibody MRA sample treated for 10 minutes at pH 2.2, 4 ° C
  • lane 3 purified acid-denatured MRA ( PH 2.2, 10 minutes at 4 ° C) Absorption fraction obtained by passing the treated antibody MRA sample through an IMGpep-4K6R peptide-immobilized column)
  • Lane 4 pH 2.2, 10 minutes at 4 ° C
  • FIG. 17 is a graph showing the content of acid-modified human IgG relative to the total IgG in human IgG antibody drugs and immunoglobulin preparations.
  • FIG. 18 is a photograph showing the detection results of dot blotting of acid-treated IgG (human MRA) using the IMGpep-4K6R peptide (anti-human IgG peptide) of the present invention.
  • K6R (N) is an untreated acid IgG detected with the IMGpep_4K6R peptide
  • Fc- ⁇ ( ⁇ ) is an untreated acid IgG detected with the Fc-III peptide
  • K6R (A) is an acid-treated human IgG (pH 2.8, 40 ° C, 10 min incubation) detected with IMGpep-4K6R peptide
  • CS (N) is acid-treated with IMGpep-ICS peptide.
  • the present invention provides a peptide tag that specifically binds to the Fc region of human immunoglobulin G (IgG), particularly the Fc region of acid-denatured human immunoglobulin G, and detection of human IgG using the peptide tag.
  • the present invention relates to a purification or removal method.
  • peptide tag refers to a target molecule (here, a human IgG or a fragment containing an Fc region thereof or a label thereof) utilizing the specific binding property to the target molecule. This means a peptide for use in detection, capture, purification (including concentration), separation and removal.
  • the peptide tag according to the present invention is a sequence in which three arbitrary amino acid residues are sandwiched between three amino acid sequences GY-W and W-GL, which are common motifs (G-Y-W-X-X-X -A short-chain peptide comprising a peptide sequence in which one cysteine residue is arranged on each side of a 9- or 10-amino acid sequence containing W-G-L) or a similar sequence thereof.
  • This similar sequence has a sequence highly homologous to the above peptide sequence, and at least one motif sequence of GYW and W-G-L, and the sequence pattern W-X-X-X -W stands for the conserved amino acid sequence.
  • Such similar sequences include, for example, the amino acid sequence C- (X) 0 _ 2- (F or Y) -WXXXW- (G or Q)-(L or I)-(X) 0 _ 2 -C Power S is mentioned.
  • (X). — 2 is a sequence in which 0 to 2 consecutive amino acid residues X are consecutive.
  • an IgG-binding peptide tag according to the present invention has the following formula I: c- (x) n -wxxxw- (x) m -c (I)
  • X ⁇ X ⁇ X in Formula I is a cysteine Including residues, and a) and b) below:
  • amino acid sequence satisfying either or both of these is represented as a peptide comprising at least
  • the peptide tag is preferably a peptide consisting of 11 to 16 amino acids, preferably 11 to 14 amino acids.
  • X-X-X in formula I is preferably a 3-amino acid sequence that does not contain any cysteine residues. Further, X—X—X in Formula I is preferably a triamino acid sequence that does not contain any tribtophan residues.
  • the amino acid sequences shown in the present specification are expressed using ordinary amino acid three-letter code or single-letter code. That is, for example, in the above formula I, C represents a cysteine residue (Cys), and W represents a tryptophan residue (Trp).
  • X represents any one amino acid residue
  • (X) n and (X) m represent any amino acid residue
  • X W represents each of n and m consecutive arrays.
  • X-X-X represents a sequence of three consecutive amino acid residues.
  • G represents a glycine residue (Gly)
  • Y represents a tyrosine residue (Tyr)
  • L represents a leucine residue (Leu).
  • Za and Zb are each 0 or 1 or more amino acid residues (preferably excluding cysteine residues)]
  • a human IgG-binding peptide tag consisting of an amino acid sequence satisfying one or both of the above.
  • (X) p and / or (X) q in formula II are preferably composed of any amino acid residue other than cysteine residues.
  • the peptide tag of the present invention represented by the formula I or II includes both Za-G-YW and W-G-L-Zb sequences shown in a) and b) above, human IgG It may exhibit higher binding affinity for the Fc region.
  • Particularly preferred examples of the peptide tag of the present invention include those consisting of the following amino acid sequences. These amino acid sequences are represented using the single letter code for amino acids.
  • CTGFWEREWGLC SEQ ID NO: 2
  • GCTGFWEREWGLCG (SEQ ID NO: 8)
  • a disulfide bond is formed between two cysteine residues (0) contained in the sequence.
  • This disulfide bond is formed under non-reducing conditions (for example, 10 mM to 50 mM). Formed in the presence of oxidized glutathione) but not under reducing conditions (eg, in the presence of 10 mM to 50 mM dithiothreitol)
  • the peptide tag of the present invention has a compact cyclic structure due to the formation of a disulfide bond. Form.
  • the peptide tag of the present invention exhibits high binding activity to the Fc region of acid-denatured human immune globulin G (IgG) antibody, and such acid-denatured (acid-denatured) human IgG (total Antibody) and fragments containing its Fc region.
  • Human IgG undergoes digestion with papain or the like, and is cleaved into two Fab fragments (an arm portion including a variable region and a constant region) and an Fc fragment (a trunk portion including a constant region).
  • the Fc fragment of an IgG antibody is a fragment of about half of the two H-chain carboxyl-terminal sides of the antibody fragment obtained by cleaving IgG with papain enzyme (the CH2 domain and CH3 domains, which are constant regions). Are connected to each other by two disulfide bonds.
  • the Fc region refers to a region in the H chain composed of a CH2 domain and a CH3 domain contained in this Fc fragment.
  • the “fragment containing the Fc region of human IgG” may be a protease-degraded fragment of human IgG (typically, papain or trypsin-degraded fragment), or human IgG It may be a part of human IgG that contains the Fc region but is not a protease-degraded fragment.
  • the “fragment containing the Fc region of human IgG” can be a part of IgG containing one or more H chain fragments consisting of CH2 domain and CH3 domain.
  • the acid-denatured human immunoglobulin G igG means that the normal IgG antibody conformation (structure) is modified by acid treatment to have a specific (special) conformation.
  • Human immune globulin Or human immune globulin G having the same conformation with or without acid treatment.
  • this acid-denatured human immunoglobulin G (IgG) it is preferable that a randomized structure is observed, while the secondary structure such as the / 3 sheet structure is mostly retained. That is, acid-denatured human immunoglobulin G (IgG) appears to have a denatured intermediate state conformation.
  • the acid treatment is not limited, but is preferably exposed to immune globulin G under the conditions of pH 3.5 or lower, for example, pHl. 5 to 2.7, more preferably pHL 5 to 2.1. Means that.
  • This acid treatment is preferably performed by incubating immunoglobulin G at 4 ° C to 50 ° C, preferably 20 to 50 ° C, more preferably 30 ° C to 40 ° C under the acidic conditions. Yes.
  • This acid treatment step can be, for example, 1-3 minutes or longer, for example 5-10 minutes.
  • the pH of the solution may be neutralized by adding a basic solution such as Tris.
  • the pH of the solution containing the antibody can be adjusted to pH 1 and incubated for 5 minutes, and then the pH of the solution can be neutralized, but this is not a limitation. Absent.
  • human immunoglobulin G which has a denatured conformation equivalent to that produced by acid treatment, can be stored for example in human IgG frozen or refrigerated, or stored for long periods under neutral pH conditions. It can also occur by introducing mutations or adding or removing sugar chains to human IgG, but is not limited thereto.
  • the acid-denatured human immunoglobulin G of the present invention may or may not retain its antigen binding activity.
  • Typical human IgG preparations such as commercially available polyclonal human IgG antibody products, may contain some amount of acid-denatured human immunoglobulin G.
  • a purified human IgG product eluted from a protein A column or the like with an acidic eluate usually contains acid-denatured human immunoglobulin G.
  • the peptide tag of the present invention exhibits high binding activity to any of IgGl IgG2, IgG3 and IgG4, which are human IgG subclasses (isotypes).
  • the peptide tag of the present invention exhibits a particularly high binding activity to acid-denatured human IgG of each subclass.
  • the peptide tag of the present invention also exhibits a high binding activity to acid-denatured human IgG oligomers (for example, dimer and trimer).
  • the peptide tag of the present invention preferably does not show binding activity to human immunoglobulin classes other than IgG (eg, IgA, IgE, IgM, etc.).
  • the peptide tag of this invention preferably also does not show binding activity to various classes and subclasses of immunoglobulins of animals other than humans (eg, mice). Therefore, the peptide tag of the present invention can bind very specifically to acid-denatured human IgG or its Fc region. Since the peptide tag of the present invention competitively inhibits the binding of protein A to human IgG, it binds near the junction of the CH2 domain and CH3 domain in the IgG Fc region, which is the protein A binding site. Conceivable.
  • the peptide tag of the present invention can be produced by any peptide chemical synthesis method known to those skilled in the art, such as liquid phase synthesis method, solid phase synthesis method, and Fmoc method (K'el ley et al., Genetics Engineering Principles and Methods, Setlow, JK eds., Plenum Press NY. (1990) Vol. 12, p. 1-19; Stewart et al., Sol id-Phase Peptide Syn thesis (1989) WH Freeman Co .; Houghten, Proc Natl. Acad. Sci. USA (198 5) 82: p. 5132, "Seminar in Experimental Chemistry 1 Protein IV” (1992), edited by the Japanese Biochemical Society, Tokyo Chemistry, etc.).
  • the peptide may be produced by a recombination method using a DNA encoding the peptide tag of the present invention, a phage display method, or the like.
  • the target peptide tag can be produced by incorporating DNA encoding the amino acid sequence of the peptide tag of the present invention into an expression vector, introducing it into a host cell and culturing.
  • the produced peptide tag can be further separated by a conventional method, for example, gel chromatography, ion column chromatography, absorptive chromatography, reverse phase column chromatography, ammonium sulfate, alcohol, etc. It can be recovered or purified by immunoadsorption method or the like.
  • the peptide tag of the present invention preferably forms a disulfide bond under non-reducing conditions.
  • to form a disulfide bond by causing the peptide tag of the present invention prepared undergone allowed to air oxidation in buffer solution of P H8 Can.
  • a labeling substance may be added to the peptide tag of the present invention.
  • a peptide tag to which a labeling substance is added or human IgG bound to the peptide tag can be detected with high sensitivity and ease.
  • labeling substances include, but are not limited to, piotin, iminobiotin, digoxigenin, fluorescent proteins, fluorescent dyes, chemiluminescent dyes, enzymes, and radioisotopes. Specific examples include biotin, iminobiotin, digoxigenin, green fluorescent protein (GFP), yellow fluorescent protein (YFP), equorin, and fluorescein. Protein labeling methods using these labeling substances are well known to those skilled in the art.
  • the peptide tag of the present invention can be biotinylated with a commercially available reagent such as Sulfo-NHS-LC-Biotin (Pierce) to add biotin to the peptide tag.
  • the labeling substance may be added to the peptide tag of the present invention via a linker.
  • the linker can be any substance that can form a connecting part between a protein and a peptide, such as a peptide, a fatty acid, or a fatty acid ester.
  • the linker may be inserted between the peptide tag and the protein as a spacer for preventing the formation of the three-dimensional structure of the protein or as a cleavable linking moiety containing a protease recognition site.
  • the present invention relates to a recombinant bacteriophage displaying the peptide tag of the present invention.
  • recombinant butteriophages can be prepared using phage display methods known to those skilled in the art.
  • recombinant DNAs obtained by incorporating various DNAs encoding the peptide tags of the present invention into vectors for producing phage display libraries such as T7 phage vectors, packaging them into pacteriophages, and amplifying them.
  • the peptide tag of the present invention can be displayed on pacteriophage.
  • the present invention also relates to a fusion protein consisting of a protein linked to the peptide tag of the present invention.
  • the peptide tag of the present invention can be used as an affinity tag for the output / purification of a protein by being linked (added) to any protein, preferably the N-terminal or C-terminal.
  • the peptide tag of the present invention may be linked to the target protein via a linker. Les.
  • This linker may be any substance that can constitute a protein-peptide linkage, for example, a cleavable linkage comprising a protease recognition site.
  • These fusion proteins can be easily isolated using the specific binding properties of human IgG or its Fc region (particularly acid-denatured human IgG or its Fc region) and the peptide tag of the present invention. it can.
  • Such a fusion protein can be prepared, for example, by gene recombination methods well known to those skilled in the art.
  • a gene encoding the protein and a DNA encoding the peptide tag are inserted into an expression vector or an expression cassette so that the reading frame matches, and the gene is introduced into a host cell and expressed while culturing.
  • the produced protein can be recovered.
  • Proteins to be fused with the peptide tag of the present invention include, but are not limited to, amyloglycosidase, amylase, enzyme, isoamylase, protease, papain, pepsin, rennin senorelase, pectin 1 to i, Reno ' ⁇ , Lacta "—ir.
  • the present invention also relates to a solid phase carrier on which the peptide tag of the present invention is immobilized.
  • Suitable solid phase carriers used to immobilize peptide tags include, but are not limited to, for example, polystyrene, polyethylene, polypropylene, polyester, polyacrylonitrile, styrene-butadiene copolymer, (meth) acrylic acid ester.
  • substrates such as W-type polymers, resins such as fluororesins and silica gel resins, polymer compounds such as cross-linked dextran, polysaccharides, and agarose, glass, metals, magnetic substances, and combinations thereof.
  • the shape of such a solid support is, for example, any shape such as a tray, sphere, fiber, particle, bar, board, container, cell, microplate, test tube, membrane, gel, chip (sensor chip, etc.) It's okay.
  • Specific examples include magnetic (magnet) beads, glass beads, polystyrene beads, sepharose beads, polystyrene plates, glass plates, polystyrene tubes, and the like. Immobilization of the peptide of the present invention on these solid phase carriers can be performed using methods well known to those skilled in the art, for example, physical adsorption method, covalent bond method, ion bond method and the like.
  • the solid phase carrier on which the peptide tag of the present invention is immobilized is not limited.
  • the solid phase carrier on which the peptide tag of the present invention is immobilized is packed in a column such as an affinity chromatography column and used to detect, capture, purify or separate human IgG with high efficiency. be able to.
  • human IgG can be bound to the peptide tag on the solid phase carrier with high efficiency by acid-treating the sample containing human IgG and then bringing it into contact with such a solid phase carrier.
  • a human IgG-containing sample is contacted with such a solid phase carrier to specifically capture the acid-denatured human IgG in the sample and remove it from the sample. Can be purified with a more uniform quality.
  • the above-mentioned force ram filled with the solid phase carrier of the present invention is also included in the present invention.
  • the present invention also relates to a nucleic acid (especially DNA) encoding the peptide tag of the present invention.
  • DNA encoding the amino acid sequence represented by SEQ ID NOs: 1-11, for example, is a preferred embodiment of the present invention.
  • DNA can be easily handled in the form of a recombinant vector by inserting and ligating it into an appropriate vector.
  • the vector into which the DNA encoding the peptide tag of the present invention is inserted is not particularly limited as long as it can replicate in the host cell.
  • a viral vector such as a phage vector, a phage medium vector, or a cosmid vector.
  • plasmid vector Etc The present invention also provides a vector comprising DNA encoding such a peptide tag.
  • Phage vectors include, but are not limited to, T7 phage display vectors (T7SelectlO-3b, T7Selectl-lb ⁇ T7Selectl-2a T7Selectl-2b, T7S elect 2c, etc. (Novagen)), L phage vectors (Charon4A, Charon21A) , EMBL3, EMBL4, e gtl0, e gtll, ⁇ ZAP, e ZAPII, etc.).
  • any animal virus vector such as retrovirus or vaccinia virus, and any insect virus vector such as Pacu mouth virus can be used.
  • cosmid vectors include, but are not limited to, Lorist 6, Charomid9-20, and Charomid9-42.
  • plasmid vectors include, but are not limited to, plasmids derived from E. coli (eg, pET22b (+), pBR322, pBR325, pUC118, pUC119, pUC18, pUC19, pBluuescript, etc.), plasmids derived from Bacillus subtilis ( For example, pUB110, pTP5, etc.) and yeast-derived plasmids (eg, YEpl3, YCp50, etc.).
  • E. coli eg, pET22b (+), pBR322, pBR325, pUC118, pUC119, pUC18, pUC19, pBluuescript, etc.
  • Bacillus subtilis For example, pUB110, pTP5, etc.
  • yeast-derived plasmids eg, YEpl3, YCp50, etc.
  • a fusion protein comprising the DNA fragment encoding the peptide tag of the present invention and having a restriction enzyme cleavage site for inserting a gene encoding another protein added with the peptide tag of the present invention as a labeling tag
  • Vectors for producing a DNA are also included in the range of vectors containing DNA encoding the peptide tag of the present invention.
  • the purified vector DNA is cleaved with an appropriate restriction enzyme, and the DNA encoding the peptide tag of the present invention is inserted into the exposed restriction enzyme site. ⁇ The method of inserting and connecting with a frame is adopted.
  • the recombinant vector of the present invention is also preferably prepared as a recombinant expression vector so that the DNA encoding the peptide tag is expressed as a peptide having good activity in the host.
  • various commercially available expression vectors corresponding to various host organisms can be used.
  • Expression vectors usually include various elements essential for expression in host organisms such as transcription promoters, terminators, and ribosome binding sites, as well as cis elements such as selectable markers, reboter genes, polylinkers, enhancers, and the like.
  • a additional Useful sequences such as Danal and ribosome binding sequences (SD sequences) may be linked as necessary.
  • SD sequences As the selection marker, for example, dihydrofolate reductase gene, ampicillin resistance gene, neomycin resistance gene and the like can be used.
  • the vector is preferably an expression vector containing a promoter.
  • a transformant transformed, single cell, callus, tissue, etc.
  • a vector containing the DNA encoding the peptide tag of the present invention is prepared and cultured under conditions capable of expression.
  • the peptide tag can be produced by recovering the peptide tag of the present invention produced in a cultured cell or culture solution.
  • the present invention also includes such a transformant and a method for producing the peptide of the present invention using the transformant.
  • any host cell such as bacteria such as Escherichia coli and Bacillus subtilis, yeast cells, insect cells, animal cells (eg, mammalian cells), plant cells and the like can be used.
  • transformation For transformation, generally used methods such as calcium phosphate method, electroporation method, lipofection method, particle gun method, PEG method and the like can be applied. Selection of transformants is performed using force S, which can be performed according to a conventional method, usually using a selectable marker or reporter protein incorporated in the recombinant vector used.
  • the method for culturing the transformant of the present invention is carried out according to a conventional method used for culturing host organisms.
  • a medium for cultivating transformants obtained using microorganisms such as E. coli and yeast cells as a host contains a carbon source, nitrogen source, inorganic salts, etc. that can be assimilated by the host microorganism, and the culture of the transformants is performed.
  • the medium can be efficiently used, either a natural medium or a synthetic medium may be used.
  • antibiotics such as ampicillin and tetracycline may be added to the medium.
  • an inducer When cultivating a host organism (microorganism) transformed with an expression vector using an inducible promoter, an inducer may be added to the medium as necessary.
  • a microorganism transformed with an expression vector using the Lac promoter When cultivating microorganisms transformed with isopropyl-1-thio-j3-D-galactoside (IPTG), etc., and with an expression vector using trp promoter, acetyl-1-acetate (IAA), etc. You may add to.
  • the culture conditions are not particularly limited, but are preferably performed under conditions suitable for the host organism used for transformation.
  • the cell After cultivation, if the expressed peptide tag of the present invention is produced in the host cell, the cell is destroyed. On the other hand, when the peptide tag of the present invention is secreted extracellularly, the culture solution is used as it is, or the cells are removed by centrifugation or the like to obtain a culture supernatant. The peptide tag of the present invention is contained in the obtained liquid. In the present invention, instead of performing transformation, a cell-free translation system may be used to produce the peptide tag of the present invention.
  • Cell-free translation system refers to in vitro transcription such as in a test tube by adding reagents such as amino acids necessary for translation to a suspension obtained by mechanically disrupting the cell structure of a host organism such as E. coli. It constitutes a translation system or an in vitro translation system. As cell-free translation systems, kits that can be used advantageously are commercially available.
  • the produced peptide tag of the present invention is produced by a general biochemical method used for isolation and purification of peptides, such as ammonium sulfate precipitation, gel chromatography, ion exchange chromatography, affinity chromatography.
  • a general biochemical method used for isolation and purification of peptides such as ammonium sulfate precipitation, gel chromatography, ion exchange chromatography, affinity chromatography.
  • reverse phase chromatography alone or in appropriate combination, it can be isolated from the above culture (cell disruption fluid, culture fluid, or culture supernatant thereof) or from a cell-free translation system solution.
  • the culture supernatant or lysate supernatant collected or concentrated using a centrifugal separator, an ultrafiltration filter, etc., or the supernatant is further dialyzed after ammonium sulfate fractionation.
  • the solution obtained in this manner may be used as it is for an Ig G binding test or the like.
  • the peptide tag of the present invention that can specifically bind to a human IgG Fc region, particularly an acid-denatured human IgG Fc region, human IgG in the sample or its Fc It is possible to detect, capture, purify or separate a fragment containing a region with high sensitivity.
  • the peptide tag of the present invention acid-denatured human in a sample
  • a fragment containing IgG or its Fc region can be detected, captured, purified, or removed with high sensitivity.
  • the binding state of the peptide tag of the present invention to a fragment containing human IgG or its Fc region can be expressed by using, as indicators, the dissociation constant Kd, the affinity constant Ka, the association rate constant ka, the dissociation rate constant kd, and the like.
  • the dissociation constant Kd and affinity constant are indicators of the binding affinity between two molecules in equilibrium, that is, the strength of the bond, and the dissociation constant Kd is the reciprocal of the power constant Ka. And the smaller the value of the dissociation constant Kd, the stronger the bond.
  • the speed of the bond / dissociation reaction between two molecules in an equilibrium state is also expressed as a binding rate constant ka (also expressed as kon) and a dissociation rate constant kd (also expressed as k off) obtained by reaction kinetic analysis. Indicated by The association rate constant ka is the reciprocal of the dissociation rate constant kd.
  • dissociation rate constant ka the quicker the dissociation, meaning that the bound state is held for a shorter period of time. Therefore, even when the dissociation constants Kd are equivalent, they slowly associate but slowly dissociate (both values of ka and kd are small), and they rapidly associate and dissociate (values of ka and kd). Both are very different from each other.
  • dissociation constants Kd, affinity constants Ka, association rate constants ka, and dissociation rate constants kd which indicate the binding state of the peptide tag of the present invention to human IgG, are arbitrary molecular interactions well known to those skilled in the art. It can be determined using measurement methods.
  • the binding state of the peptide tag of the present invention to human IgG (or a fragment containing the Fc region of human IgG) is preferably measured by surface plasmon resonance spectral analysis.
  • the surface plasmon resonance spectrum analysis can be performed using, but not limited to, the BIAC0RE system (BIAC0RE), which is a biosensor (biological intermolecular analyzer), for example, BI AC0RE2000.
  • the BIAC0RE system is an analytical device that can monitor the interaction (binding and dissociation) of biomolecules in real time without using labels, based on the principle of surface plasmon resonance spectrum (SPR). Learn more about the principle of surface plasmon resonance (For example, Setsuko Hashimoto, “Explanation of Biomolecular Interactions Using Surface Plasmon Resonance Phenomenon”, Analysis, May 1997, (1997)) Issue, pages 362-368). To briefly explain the principle used in this device, a substance is bound / dissociated on a gold film, and the change in the refractive index of reflected light due to the mass change on the chip due to the binding / dissociation is measured. It calculates the amount of material bound on the gold film.
  • SPR surface plasmon resonance spectrum
  • a glass substrate on which a gold film called a sensor chip is attached is placed in the middle of a flow path for flowing a sample or a reagent so as to be exposed to the flow. While flowing a sample etc. on the path, condensing 760nm polarized light in a wedge shape with a prism etc. on one sensor chip, reflecting it on the gold film, and monitoring the refractive index of the reflected light, the substance on the gold film The change in the angle of the surface plasmon resonance spectrum is shown in proportion to the change in the amount of binding.
  • the ligand is first flowed into the flow channel to immobilize the ligand in advance on the gold film of the sensor chip, and then the site where the ligand is not bound is locked and then the binding / dissociation reaction with the ligand is performed.
  • the amount of binding between ligand and analyte can be calculated from the amount of change.
  • the change in the angle of the surface plasmon resonance spectrum is defined as 1000 response units (RU), and the refractive index of the reflected light is based on the value in units of response units (RU value). Represents changes.
  • one response unit corresponds to a mass change of lpg / lmm 2 on the sensor chip surface.
  • the amount of substance binding to the gold film on the sensor chip can be calculated from the difference between the RU value before the substance binding (before addition) and when the binding is completed. Therefore, using the BIAC0RE system, the binding amount between a ligand (for example, the peptide tag of the present invention) and an analyte (for example, an IgG antibody in a sample) can be determined as the RU value per lmm 2 of sensor chip.
  • the amount of binding (RU value) corresponds to the ability of the analyte to bind to the ligand.
  • This analysis usually involves analysis software BIA evaluation (Bi acore).
  • CM5 glass surface A gold film (typically 50 nm) force is occupied by a shell, and a dextran layer (typically lOOnm) is provided on top of it.
  • CM4 CM3, CI SA, Series S, NTA, Ll, and HPA.
  • the ligand may be immobilized on the sensor chip, for example, according to the manufacturer's instruction manual of the BIAC0RE system. For example, it can be performed by amine coupling to the sensor chip CM5.
  • the immobilization method may be, for example, a physical adsorption method or a covalent bond adsorption. For example, it can be immobilized by binding a piotinylated peptide tag to streptavidin on sensor chip SA.
  • sensor chip SA BIACORE
  • biotinylated peptide (50 M) is allowed to flow through the flow path (flow cell etc.) and is immobilized in dextran on the sensor chip.
  • a sample (analyte solution) containing acid-denatured human IgG is allowed to flow through the flow path, and the amount of binding between peptide tag (ligand) on the chip and human IgG (analyte) in the sample is determined. calculate.
  • a sample analyte solution
  • human IgG analyte
  • Running buffer HBS-T buffer
  • the RU value obtained by subtracting the RU value before binding from the RU value after binding for example, the acid-denatured human IgG IgG and ligand It can be used as a value indicating the binding amount per 1 to 2 with the peptide tag, that is, the binding ability of the peptide tag to acid-denatured human IgG.
  • the dissociation constant Kd, the affinity constant Ka, the association rate constant ka, and the dissociation rate constant kd indicating the binding state between the peptide tag of the present invention and acid-denatured human IgG are determined according to the above conditions. It is especially preferable to obtain it by resonance spectrum analysis.
  • the dissociation constant Kd relating to the binding between the peptide tag of the present invention and acid-denatured human IgG is preferably 0. 1 ⁇ ⁇ 50 ⁇ , for example 10nM ⁇ 50nM.
  • the binding power of the peptide tag of the present invention to acid-denatured human IgG is considerably stronger than many conventional IgG-binding peptides.
  • the dissociation rate constant kd for binding the peptide tag with an acid denatured type human IgG of the present invention preferably l (T 3 sec -.
  • a 1 ⁇ 10- 5 se c- 1 dissociation rate constant kd value is substantially equal to the general dissociation rate constant (10- 4 to 1 0 one 6 sec-of human IgG, Bae Puchidotagu of the present invention can be sufficiently retained binding to acid-denatured human IgG Indicated.
  • non-reducing conditions means disulfide binding. It means a reductive state that does not cause cleavage.
  • Non-reducing conditions means that, for example, a reducing agent that cleaves a disulfide bond (eg, DTT) is not included in the reaction system in an amount that causes such cleavage.
  • a reducing agent that cleaves a disulfide bond eg, DTT
  • the peptide tag of the present invention by utilizing the high binding property of the peptide tag of the present invention to acid-denatured human IgG as described above, it is possible to successfully detect a human IgG or a fragment containing the Fc region thereof in a sample. it can. Since the peptide tag of the present invention can stably maintain binding to the acid-denatured human IgG Fc region, detection with high sensitivity becomes possible.
  • the present invention provides the following steps a) to:
  • step b) measuring the binding between the peptide tag and the fragment containing human IgG or its Fc region generated in step b);
  • the present invention also relates to a method for detecting a human IgG or a fragment containing the Fc region thereof in a sample.
  • This detection method of the present invention can be applied to any sample containing or possibly containing human IgG or a fragment containing the Fc region of human IgG.
  • suitable samples include: Although not intended, biological samples such as blood, body fluids (saliva, semen, tears, digestive fluid, ascites, etc.), tissues, tissue fluids, cells, cell extracts, and cultures are included. This biological sample may be a clinical test specimen.
  • Other examples of suitable samples include a culture supernatant of a monoclonal human IgG-producing hybridoma, and an immunological measurement sample.
  • the sample is preferably contacted with the peptide tag in an acid-denatured state. Therefore, before contacting with the peptide tag, the IgG in the sample is acid-denatured by acid treatment as described above.
  • the acid-treated sample is preferably neutralized before contacting with the peptide tag.
  • the sample may be originally prepared or collected under acidic conditions, and such a sample may be used as an “acid-treated sample” by omitting the acid treatment step.
  • the sample is preferably brought into contact with the peptide tag of the present invention in a state prepared in a liquid form such as a solution or a suspension.
  • the acid-treated sample may be added to the peptide tag of the present invention, and vice versa.
  • the contact between the peptide tag of the present invention and the acid-treated sample is preferably performed under non-reducing conditions.
  • the binding between the peptide tag and the fragment containing human IgG or its Fc region, which occurred in step a) means a significant difference caused by the contact between the peptide tag of the present invention and the acid-treated sample. This means that the amount of peptide tag is mainly bound to acid-denatured human IgG or a fragment containing its Fc region. Binding between the peptide tag and human IgG or a fragment containing the Fc region thereof can be measured by any intermolecular interaction measurement method well known to those skilled in the art.
  • Such measurement methods include, but are not limited to, immunoprecipitation method, gel shift assembly, ELISA method, surface plasmon resonance analysis, quartz crystal microbalance method (Quartz Crystal Microbalance (QCM); Author, "Quartz Vibrating Microbalance", Surface Technology, Vol. 45- No. 10, (1994) p. 1003- 1008, US Patent 5869763), Fluorescence Correlation Analysis (Flu) orescencce Correlation Spectroscopy (FCS), other items such as fluorescence intensity distribution analysis (F1 uorescence intensity distribution analysis (FIMDA)), and phase cross-correlation spectroscopy (FxCS).
  • QCM Quadrat Crystal Microbalance
  • F1 uorescence intensity distribution analysis F1 uorescence intensity distribution analysis
  • FxCS phase cross-correlation spectroscopy
  • human IgG or a fragment containing its Fc region is present in a sample alone or in a state bound to another substance such as a labeling substance. Can be detected.
  • human IgG, etc. fused to an arbitrary protein end, human IgG, etc., displayed on a phage vector, human IgG, etc. immobilized on a solid phase carrier can be detected.
  • such a detection of a fragment containing human IgG or its Fc region bound to another substance is also included in the “detection of human IgG or a fragment containing its Fc region”.
  • This method is particularly useful for human Fc fusion proteins (fusion proteins of human Fc fragments and arbitrary proteins) often used in biochemistry and molecular biology, for example, the extracellular domain of the TNF receptor and human Fc. It can also be suitably used for detection of fusion proteins with Fc fragments.
  • a fragment containing human IgG or its Fc region in a sample can also be successfully separated or purified.
  • the peptide tag of the present invention can stably retain the binding to the acid-denatured human IgG Fc region, it can be separated or purified with high recovery efficiency.
  • the present invention provides the following steps a) and b):
  • step a) contacting the peptide tag of the present invention with an acid-treated sample, thereby binding a fragment containing human IgG or its Fc region in the sample to the peptide tag; b) A step of separating the human IgG or Fc region fragment bound to the peptide tag in step a) from the sample,
  • This IgG separation or purification method of the present invention can be applied to any sample containing or possibly containing human IgG or a fragment containing the Fc region of human IgG.
  • the sample is as described in the detection method above, and similarly, it is preferably contacted with the peptide tag in an acid-denatured state. Therefore, the sample is acid-denatured by acid treatment as described above before contacting with the peptide tag.
  • the sample may be originally prepared or collected under acidic conditions, and such a sample can also be used as an “acid-treated sample”.
  • the acid-treated sample is preferably neutralized before contacting with the peptide tag.
  • the acid-treated sample may be added to the peptide tag of the present invention, and vice versa.
  • the contact between the peptide tag of the present invention and the acid-treated sample is preferably performed under non-reducing conditions.
  • human IgG or a fragment containing the Fc region bound to the peptide tag by the contact is well known to those skilled in the art used for separation and purification of biomolecules. It can be separated from the sample by the method. For example, if a peptide tag immobilized on a solid phase carrier such as a column, plate, or sensor chip is used, the solid phase carrier after washing is washed under conditions that do not release the peptide tag. A fragment containing human IgG or its Fc region bound to a peptide tag on a carrier can be separated from other components in the sample.
  • a solid phase carrier such as a column, plate, or sensor chip
  • the magnetic bead after contact is taken out of the sample with a magnet and preferably further washed to obtain a magnetic tag on the magnetic bead.
  • a fragment containing human IgG or its Fc region bound to the peptide tag can be separated from other components in the sample.
  • This separation step is performed simultaneously (or in parallel) or continuously with the contact step between the peptide tag of the present invention and the sample. It may be done automatically.
  • human IgG in the applied sample solution is brought into contact with and bound to the immobilized peptide tag.
  • other components in the sample solution flow out without being bound to the peptide tag, and are separated from the human IgG etc. bound to the peptide tag.
  • the presence of the IgG or the like may be confirmed by Western blotting or the like.
  • the fragment containing human IgG or its Fc region is not limited, but can also be released from the peptide tag by placing it under acidic conditions, for example. Such an acidic condition can be easily adjusted by those skilled in the art.
  • an acidic solution such as glycine-hydrochloric acid (pH 2.1) can be prepared by using a human IgG bound to a peptide tag or its Fc region. May be added to the fragment containing.
  • a fragment containing human IgG or its Fc region may be separated from the peptide tag by dialysis.
  • the human IgG released from the peptide tag or a fragment containing the Fc region thereof may be further purified using protein purification methods (such as various chromatographic methods and immunoprecipitation methods) well known to those skilled in the art.
  • a fragment containing human IgG or its Fc region which is present alone in a sample, or a human IgG or fragment containing its Fc region bound to another substance such as a labeling substance is preferably separated or separated.
  • human IgG fused to an arbitrary protein end human IgG displayed on a phage vector, human IgG immobilized on a solid phase support such as magnetic beads, etc.
  • the method of the present invention is particularly useful for the human Fc fusion protein (a fusion protein of a human Fc fragment and an arbitrary protein) often used in the fields of biochemistry and molecular biology, such as the extracellular domain of the TNF receptor.
  • the acid-denatured human IgG or its Fc region originally present in the sample is contained. Fragments can be captured and separated (removed) from the sample. Using this method, for example, it is possible to purify human IgG to a uniform and high purity by removing mixed acid-denatured human IgG or a fragment containing its Fc region from a sample containing human IgG. it can.
  • the present invention includes, for example, the following steps a) and b):
  • step b) A step of removing the human IgG or the fragment containing the Fc region thereof bound to the peptide tag in step a) from the sample.
  • the present invention also includes, for example, the following steps a) to c):
  • the peptide tag of the present invention is contacted with a sample containing a human IgG or a fragment containing an Fc region thereof, whereby the acid-denatured human IgG in the sample or a fragment containing the Fc region thereof is copied. Binding to the peptide tag,
  • step b) a step of separating the acid-modified human IgG bound to the peptide tag in step a) or a fragment containing the Fc region thereof from the sample,
  • the present invention also relates to a method for purifying a human IgG or a fragment containing the Fc region thereof.
  • Such removal method of acid-denatured human IgG etc. can overcome various problems of conventional human IgG purification technology.
  • purification method of human IgG etc. can overcome various problems of conventional human IgG purification technology.
  • an acidic solution typically PH 2.1 to 2.7.
  • some antibodies are denatured mainly by acid treatment at the time of elution, and as a result, the quality of the obtained antibody product is lowered.
  • a relatively complicated operation such as an ion exchange method or a gel filtration method is further required.
  • the peptide tag of the invention for example the peptide of the invention
  • an affinity column to which a tide tag is immobilized acid-denatured IgG antibodies can be efficiently removed in a single step.
  • the yield is greatly reduced (60-80) when the antibody is eluted from the column with an acidic (typically 112.1-2.7) solution. %) Is also a problem. This is considered to be due to the fact that antibodies that have been modified by acid treatment and have changed conformation tend to aggregate, and the aggregated antibodies bind to the resin and are not easily eluted.
  • the acid-denatured antibody and the peptide tag of the present invention to which PEG or sugar has been added can be quickly bound in the column so that the antibody can be recovered without being adsorbed on the column resin.
  • the bound peptide tag of the present invention can be removed from the recovered antibody by dialysis or the like.
  • the protein to which the peptide tag is added can be specifically separated.
  • the peptide tag according to the present invention is added to the target protein, and the protein is separated and purified using acid-treated human IgG or fragments containing its Fc region. It also provides a way to
  • the present invention provides the following steps-c):
  • step b) contacting the sample prepared in step a) with acid-treated human IgG or a fragment containing the Fc region thereof, thereby binding the fusion protein to the fragment containing the human IgG or its Fc region;
  • step b) separating the fusion protein bound to the fragment containing human IgG or its Fc region in step b) from the sample;
  • the present invention relates to a method for purifying a protein.
  • the above fusion protein refers to a protein to which the peptide tag of the present invention is preferably added (linked) to the N-terminus or C-terminus.
  • the fusion protein may have a linker containing a cleavable linking moiety (for example, a protease site) between the peptide tag and the protein of interest.
  • the fusion protein can be prepared by linking the peptide tag of the present invention to any protein to be separated and purified, preferably at the N-terminus or C-terminus, for example, by recombinant methods. More specifically, for example, a set in which a DNA fragment encoding a protein of interest is inserted in frame on the 5 ′ side or 3 ′ side of the DNA encoding the peptide tag of the present invention incorporated in a vector.
  • a recombinant expression vector is prepared, introduced into a host cell to produce a transformant, cultured under conditions capable of expression (for example, in the presence of an expression inducer), and the produced fusion protein is cultured in the culture. By recovering from the solution or cultured cells, a single polypeptide comprising a peptide tag and a protein portion can be obtained as a fusion protein.
  • such a fusion protein is first prepared, and a sample containing it is prepared.
  • the sample is preferably, but not limited to, a liquid preparation such as a solution or suspension.
  • the fragment containing human IgG or its Fc region is preferably acid-treated before contacting with the sample.
  • the acid treatment may be performed as described above.
  • the acid treatment may be performed by adjusting a solution containing human IgG or a fragment containing the Fc region thereof to pHl. 5 to 2.7 and treating for at least 5 minutes. it can.
  • the fragments containing human IgG or its Fc region are changed to an acid-denatured form, and the capture efficiency of the fusion protein having the peptide tag of the present invention can be greatly improved.
  • the acid-treated sample is preferably neutralized before contacting with a fusion protein having a peptide tag.
  • a fusion protein having a peptide tag When the sample containing the fusion protein prepared as described above is brought into contact with such an acid-treated human IgG or a fragment containing the Fc region thereof, the fusion protein in the sample is acid-denatured via a peptide tag. Binds to the human IgG or the fragment containing its Fc region.
  • the contact process between the sample as described above and the acid-treated human IgG or a fragment containing the Fc region thereof, and the step of separating the fusion protein from the sample are basically the detection or purification method of the present invention described above. You can do it in the same way.
  • the fusion protein when the fusion protein has a linker containing a cleavable linking moiety (for example, a protease recognition site), the fusion protein is separated from the sample and then subjected to a cleavage operation such as protease treatment. It is also possible to separate the peptide tag from the target protein, and collect and purify them alone.
  • a linker containing a cleavable linking moiety for example, a protease recognition site
  • the target protein can be easily and specifically separated and purified with high trap efficiency.
  • the present invention includes a peptide tag of the present invention, a recombinant bacteriophage presenting the peptide tag, a fusion protein comprising a protein linked to the peptide tag, a solid phase carrier having the peptide tag immobilized thereon, and the peptide tag.
  • a kit for detecting or purifying a fragment containing a human IgG or human IgG Fc region containing at least one of a vector containing the encoded DNA and a transformant containing the vector can be suitably used for providing the peptide tag of the present invention in the above-described method for detecting or purifying human IgG or the like of the present invention.
  • the present invention provides at least one of a DNA encoding the peptide tag of the present invention, a vector containing the DNA encoding the peptide tag of the present invention (in particular, an expression vector), and a transformant including the vector.
  • a kit for producing a purified tag fusion protein that can be easily purified using the binding property to acid-denatured human IgG.
  • Purification tag refers to additional peptide sequences that facilitate the purification of proteins, such as His and GST tags.
  • “Purified tag fusion protein” refers here specifically to a fusion protein to which the peptide tag of the present invention has been added (linked).
  • an expression vector comprising a DNA fragment in which DNA encoding the protein of interest is linked in-frame with DNA encoding the peptide tag of the present invention is placed under expression conditions.
  • a fusion protein linked with the peptide tag of the present invention can be produced.
  • Polyclonal human IgG antibodies, polyclonal human antibodies IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, polyclonal human IgA antibodies, polyclonal human IgE antibodies, polyclonal mouse antibodies IgG, IgA, IgE used in the following examples are from Sigma We purchased more.
  • the formation of disulfide (SS) bonds between cysteine residues of the peptide was performed by air oxidation in a pH 8 buffer, and then confirmed using reverse phase HPLC and MALDI-T0F mass spectrometry.
  • SS disulfide
  • C-(X) w. -A library that displays random peptides showing the eight amino acid sequence patterns of C or (X) 3-C- (X) 8 _ 10 -C- (X) 3 on T7 phage
  • the T7Selectl 0-3b vector (Novagen) was constructed and the T7Select (R ) System Manual (Novagen) was constructed. See Krumpe LR, et al., Proteomics, (2006) 6 (15): p. 4210-4222, and T7 Select (R) System Manual (Novagen) for details on the construction of the 7 phage random peptide library.
  • -C represents a peptide sequence in which any 8 to 10 consecutive amino acid residues (X) are sandwiched between the N-terminal and C-terminal cystine residues (Cys).
  • X -C- ⁇ -iXX ⁇ means any three consecutive amino acid residues from the N-terminus to the C-terminus, a cysteine residue (Cy s), or any continuous 8-10 It represents a peptide sequence in which amino acid residues, cysteine residues, and any three consecutive amino acid residues are linked.
  • the T7Select Cloning Kit (Novagen) was used to clone the DNA fragment population that encodes the above random peptide into the T7SelectlO-3b vector.
  • the library was constructed by packaging it into phage and amplifying it.
  • the above peptide was fused to the C-terminal side of T7 1.0B capsid protein (approximately 348 amino acids) and expressed, and presented on the phage surface.
  • Each well of a 96-well microplate (Nunc, Maxisorp) is coated with human IgG (500 ng / 10 0 ⁇ 1 / well; serum-derived polyclonal antibody (same below)), and 0.5% BS A is added. And blocked.
  • the phage library (5.0 X 10 1Q pfu) prepared in 1) above dissolved in PBS containing 0.5% BSA was added and reacted at room temperature for 1 hour. After the reaction, the well was washed with PBS / 0.1% Tween20 (PBST), E. coli B LT5615 was added, collected after phage infection, and cultured for phage growth.
  • Phages were recovered from the supernatant after culture with 10% (W / V) PEG and used for further panning. This biopanning process was repeated for a total of 5 rounds to enrich for phage that specifically bound to human IgG. In the wel washing process, washing was repeated 5 times in the 1st to 3rd rounds and 10 times in the 4th and 5th rounds. The concentration of the surfactant Tw een 20 contained in the washing solution, first, in the second round was 1% 0., third, 0. 3% in the fourth round, the 0.5 5% in the fifth round Raised. After 5 rounds of biopanning, phages were added to the plates seeded with E. coli BLT5615 to infect, and phages were formed to clone the phages.
  • T7 phage bound to human IgG on the well was detected by a color reaction using TMB solution (Wako Chemicals). Detection was performed by measuring absorbance at 450 nm using an ELISA plate reader (ImmunoMini NJ-2300, InterMed, Tokyo, Japan).
  • Figure 1 shows the enrichment process of phage binding to human IgG in each round, as evaluated in this ELISA test.
  • Figure 1 shows that in the C-(X) 8 _ 1Q -C type library, significant enrichment of human IgG-binding phage occurred in the fourth round.
  • -In the C- (X) 3 type library effective enrichment of human IgG-binding phage was not observed (Fig. 1).
  • Neither library showed sufficient enrichment of BSA-binding phages.
  • upstream primer 5′-GGAGCTGTCGTATTCCA GTC-3 ′ and downstream primer: 5, AACCCCTCAAGACCCGTTTA-3 were used.
  • Table 1 the amino acid sequences of peptides presented by phage clones that showed binding activity to human IgG were classified into 6 types (hG-1 ⁇ ! IG-6 peptides) shown in Table 1 below. . These six peptides were considered to bind specifically to human IgG. Furthermore, all of these six types of peptide sequences were shown to contain at least one of two common motifs, GYW and WGL, consisting of 3 amino acid sequences, between the N-terminal and C-terminal cysteine residues. . In Table 1, each peptide sequence is listed using the amino acid single letter code. table 1
  • Example 1 Among the phage clones isolated in Example 1, representative phage clones Gl to G-6 displaying the peptides hG-l to hG-6, respectively, were subjected to the same ELISA test as in Example 1. The binding specificity for human IgG (hlgG) was evaluated. Control proteins include human IgA (hlgA), IgE (hlgE), IgM (hlgM), mouse IgG
  • Phage clones G-1 to G-6 all show a very high binding specificity for human IgG (black bars in Fig. 2), although there are some differences in strength. Almost no binding activity was observed against IgA, IgE, IgM, mouse IgG, IgA, IgE ThF, HSA, BSA, and other control proteins including gelatin. Therefore, the peptide hG- presented by the phage clones G-1 to G_6! ⁇ hG-6 was shown to bind specifically to human IgG and not substantially bind to other classes of antibodies, antibodies from other species, or other proteins.
  • SPR analysis was performed on phage clones Gl, G-2 and G-4, which showed stronger binding activity.
  • SPR analysis was performed with BIAcore2000 (BIAcore) at 25 ° C, and the necessary reagents and sensor chips were purchased from BIAcore.
  • Human IgG (ligand) was immobilized on the sensor chip CM5 according to the amine coupling protocol recommended by the manufacturer.
  • a sensor chip CM5 immobilized with human IgA or IgE was also prepared. The immobilization reaction was performed under the condition of pH5, and the immobilization amount was adjusted so that RU (response unit) was in the range of 1500-2000.
  • Protein A Staphylococcus aur known to specifically bind to the Fc fragment of IgG to identify the binding site of phage clone G- ;! to G-6 in human IgG eus-derived cell wall constituent protein
  • This ELISA test was basically performed in the same manner as in Example 1. Specifically, human IgG coated with human IgG (lOOng / 50 ⁇ 1 / well) was blocked with 0.5% BSA, and T7 phage clones G_1 to G-6 (5 X 10 1Q pfu / Well) and various concentrations of SpA were added simultaneously and incubated at room temperature for 1 hour before detection. SpA addition concentrations were Ong / Wenore, 15 ng / well, 30 ng / well, 60 ng / well, 125 ng / well, 250 ng / well, and 500 ng / well.
  • a human IgG coated with human IgG 100 ng / 50 1 / tuol was blocked with 0.5% BSA, and GSSG or DTT (50, 30, 10 mM) and T7 phage clone were added to this well. Detection was performed after adding G-1 previously reacted for 1 hour and incubating at room temperature for 1 hour. The results are shown in Fig. 5.
  • biotinylated IMGpep-lE6Q biotin spacer GCGYWRSQWGLCG
  • Q (Gin) for “E (Glu)” located between the common motifs GYW and WGL in the IMGpep-1 sequence.
  • biotinylated IMGpep-4K6R Pieris '——GCTGYWPRAWGLCG
  • K (Lys) located between the common motifs GYW and WGL in the IMGpep_4 sequence with “R (Arg)”. did.
  • biotinylated IMGpep-lCS biotin-spacer ⁇ GSGYWRSEWGLSG
  • C cysteine residues
  • S serine
  • the obtained biotinylated synthetic peptide was assayed for binding activity to human IgG by ELISA test.
  • the ELISA test was basically performed in the same manner as in Example 1. Specifically, to a well coated with human IgG (100 ng / 50 i 1 / well), 0.5% BSA was added for blocking, followed by the addition of pyotinylated synthetic peptide and Al force re-phospho. Tase-labeled streptavidin (SA-AP) previously mixed at a molar ratio of 4: 1 was added and allowed to react for 1 hour. Para-trophenyl phosphate (Wako) was used for coloring. Detection was performed by measuring the absorbance at 405 nm.
  • human IgG As a positive control for human IgG, an Fc fragment of hlgG was used.
  • IMGpep-1 and IMGpep-4 bind specifically to human IgG and bind to the Fc fragment of human IgG, similar to phage clones G-1 to G-6 shown in the above examples. It has been shown.
  • IMGpep-1 E6Q and IMGpep-4K6R with one amino acid residue were significantly increased in binding activity compared to their original peptides IMGpep-1 and IMGpep-4. It was done.
  • IMGpep-ICS in which two cysteine residues are substituted with serine residues, has almost lost its binding activity to human IgG. Therefore, as with phage clones G-1 to G-6, these synthetic residues
  • the peptide was also shown to require the formation of intramolecular disulfide bonds for specific binding to IgG.
  • IMGpep- 1E6Q and IMGpep- 4K6R also showed strong binding activity against human IgGl ⁇ I g G4, and elevated binding activity compared to IMGpe P _l ⁇ Pi IMGpep- 4 Indicated.
  • IMGpep-lCS the binding activity to IgGl to IgG4 was almost lost.
  • IMGpep-1, IMGpeplE6Q, IMGpep4, IMGpep-4 thigh pyotinylated synthetic peptides
  • the immobilization amount was adjusted so that the RU (response unit) was in the range of 1500-2000.
  • various concentrations (660nM, 330nM, 165nM, 82nM, 41nM) of human IgG (analyte) were placed at a flow rate of lO Ai l / min in a flow cell equipped with the above sensor chip SA to which a biotinylated peptide was immobilized.
  • the binding reaction between human IgG and peptide was measured. Subsequently, the dissociation reaction was measured by washing with a running buffer (HBS-T). 0.2 M glycine-HC1 buffer (pH 2.7) was used for washing and elution of the bound analyte from the sensor chip. The binding parameters were analyzed using BIAevaluation Version 3.2 software.
  • the dissociation constants Kd of the binding reaction between IMGpep-l, IMGpep-1E6Q, IMGpep4 or IMGpep-4K6R and human IgG obtained from this sensorgram are 17, 21, 28 and 24 nM, respectively.
  • the coupling rate constant ka is 2.0 X 10 4 M ⁇ sec -1 , 1.5 X 10 4 M ⁇ sec " 1 , 1. 4 X 10 4 M— ⁇ ec 1 , 1. 6 X 10 4 M ⁇ sec "1, dissociation rate constant kd is, 3. 4 X 10- 4 sec one 1, 3. 1 X 10- 4 sec- 4. 1 X 1 0- 4 sec- 3. 8 X 10" 4 Calculated as sec— 1 .
  • biotinylated IMGpep-ICS in which the cysteine residue of IMGpep-1 was substituted with a serine residue to prevent cyclization due to disulfide bond formation was immobilized on the sensor chip as a control ligand and used for analysis.
  • human IgG was allowed to flow through the flow cell, no increase in the response signal derived from binding was observed.
  • Synthetic peptide IMGpep-1 (GCGYWRSEWGLCG; SEQ ID NO: 7) and IMGpep- 2 (GCT) designed based on the amino acid sequence of peptides presented by phage clones G-1 and G- 2 GFWEREWGLCG; SEQ ID NO: 8) was synthesized by the Fmoc method and purified by reverse phase ram and used in the following experiments.
  • Tosyl group-activated M450 Dynabeads magnetic beads 3 mg were subjected to ultracentrifugation of the above cloned T7 phage G-1 (1.0 X 10 12 pfu) or synthetic peptide IM Gpep-1 (I50 nmol) According to the manufacturer's recommended protocol, it was immobilized via a covalent bond to its terminal amino group. After blocking the beads with a PBS solution containing 0.5% BSA, add it to 1 ml of hlgG / BSA / PBS (hlgG: 10 g / ml, BSA: lmg / ml) and add it at room temperature for 1 hour. The reaction was conducted while mixing by stirring.
  • phage clone G-1 415 type is a phage displaying G-1 peptide in all of 415 G10 proteins constituting the capsid of T7 phage.
  • anti-hlgG goat (Fab,) 2 fragment, wild-type T7 phage, and BSA were also used for immunoprecipitation and detection.
  • lane 1 anti-hlgG goat (Fab ') 2 fragment
  • lane 2 wild-type T7 phage
  • lane 3 phage G-1
  • lane 4 phage G-1415
  • lane 5 BSA
  • Lane 6 IMGpep—1, Lane 7: IMGpep_2.
  • Lanes 8 and 9 were directly applied with BSA and human IgG, respectively, as controls.
  • Fig. 9 lane 1: anti-hlgG goat (Fab ') 2 fragment
  • lane 2 wild-type T7 phage
  • lane 3 phage G-1
  • lane 4 phage G-1415
  • lane 5 BSA
  • Lane 6 IMGpep—1
  • Lane 7 IMGpep_2.
  • Lanes 8 and 9 were directly applied with BSA and human IgG, respectively, as controls.
  • Fig. 9 Lanes 8 and 9 were directly applied with BSA and human IgG, respectively, as controls.
  • the synthetic peptide IMGpep-1 showed significantly higher human IgG trapping efficiency than IM Gpep_2.
  • the results of human IgG binding levels shown by IMGpep-1 and IMGpep-2 by this immunoprecipitation assay were confirmed by ELISA tests for phage clones G-1 and G-2 based on the sequence of these synthetic peptides. It correlated with the result of IgG binding activity. No human IgG was detected in the lanes using empty beads with nothing immobilized.
  • Example 8 Effect of acid treatment on human IgG immunoprecipitation using the peptide of the present invention Streptavidin M280 Dynabeads Magnetbiz (Dynal) 4 mg, biotinylated synthetic peptide IMGpep-4K6R ( lOOnmol) was mixed at 400 ° C 1 and blocked with a PBS solution containing 0.5% BSA.
  • hlgG purified from human serum with SpA Sepharose beads (manufactured by Amersham Pharmacia Biotech) (pH 2.2 at elution), polyclonal human IgG (hlgG) antibody (Sigma), anti-IL-6 receptor MRA (human Anti-interleukin 6 receptor monoclonal antibody (manufactured by Chugai Pharmaceutical Co., Ltd.), anti-HER2 human antibody (Herceptin), or human serum was treated with 0.1 M glycine-HC1 solution (pHl. 5) for 5 minutes. Later, Tris was added to neutralize the pH.
  • the acid treated sample (antibody samples lm g / PBS solution of lO g / ml containing BSA in ml, human serum samples prepared in PBS solution was diluted 20-fold), and as blocking the 0.2 mg of the beads were added and allowed to react at room temperature for 1 hour with stirring. After the reaction, beads were collected, washed 3 times with PBST, SDS-sample buffer was added, SDS-PAGE was performed, the gel was stained with CBB, and immunoprecipitated hlgG was visualized.
  • the same reaction was performed without acid treatment (untreated) using the same antibody and serum sample, and polyclonal mouse IgG antibody. Furthermore, a similar control experiment was performed using empty beads on which biotinylated IMGpep-4K6R was not immobilized.
  • FIG. Fig. 10 A M: molecular weight marker (83, 62, 47, 32, 25 kDa), lane 1: hlgG purified from human serum with SpA Sepharose beads (PH2.2 at elution), lane 2: untreated polyclonal hlgG antibody, lane 3: acid-treated polyclonal hlgG antibody, lane 4: untreated Treated anti-IL-6 receptor MRA, lane 5: acid-treated anti-IL-6 receptor MRA, lane 6: untreated anti-HER2 human antibody (Herceptin), lane 7: acid-treated anti-HER2 human antibody (Herceptin) Herceptin), lane 8: untreated human serum, lane 9: acid-treated human serum, lane 10: polyclonal mouse IgG antibody.
  • M molecular weight marker (83, 62, 47, 32, 25 kDa)
  • lane 1 hlgG purified from human serum with SpA Sepharose beads (PH2.2 at elution)
  • FIG. 10B shows the result of reacting empty streptavidin M280 Dynabeads magnetic beads, in which only the piotin is reacted without immobilizing the pyotinylated peptide, with the antibody or serum sample.
  • Fig. 10B shows the result of reacting empty streptavidin M280 Dynabeads magnetic beads, in which only the piotin is reacted without immobilizing the pyotinylated peptide, with the antibody or serum sample.
  • M molecular weight marker (83, 62, 47, 32, 25 kDa)
  • lane 1 hlgG purified from human serum with SpA sepharose beads ( ⁇ 2 ⁇ 2 at elution)
  • lane 2 Acid-treated polyclonal h IgG antibody
  • Lane 3 Acid-treated anti-IL-6 receptor MRA
  • Lane 4 Acid-treated anti-HER2 human antibody (Herceptin)
  • Lane 5 Acid-treated human serum
  • Lane 10 Polyclonal nanomus IgG antibody.
  • the amount of higG recovered by the beads to which the peptide of the present invention was immobilized was significantly increased by performing acid treatment in all the prepared samples containing hlgG.
  • hi gG was not recovered at all in the empty beads to which the peptide was not immobilized. This indicates that the increased recovery of acid-treated antibodies is not due to, for example, increased nonspecific adsorption to beads. From the above results, it was shown that immunoprecipitation of human IgG by the peptide of the present invention can be promoted by acid treatment of human IgG.
  • the human IgG to which the peptide of the present invention specifically binds has a specific conformation that can be induced by acid treatment. That is, the peptide of the present invention can specifically recognize the Fc region of acid-denatured human IgG.
  • human IgG having such a specific (acid-denatured) conformation was hardly detected in untreated human serum, but a commercially available antibody reagent. It was found that it is contained in a certain amount in the antibody drug.
  • the peptide of the present invention or the peptide It was considered that the human IgG, which was shown to bind to the phage clone displaying, also had the same conformation as that induced by acid treatment.
  • an acid-treated IgG sample was placed in each of the flow cell with the sensor chip immobilized with biotinylated IMGpep-4K6R and the single cell with the sensor chip immobilized with biotinylated Fc-III peptide.
  • the binding reaction on the sensor chip was measured at a flow rate of 20 ⁇ l / min.
  • the response value on the sensor chip immobilized with biotinylated IMGp ep-4K6R indicates the content of acid-denatured human IgG.
  • the Fc-III peptide recognizes human IgG with native conformation obtained under neutral conditions, but also recognizes acid-denatured human IgG induced under acidic conditions.
  • the SPR response value on the sensor chip on which the piotinylated Fc-III peptide is immobilized represents the total amount of antibody in the IgG sample injected into the SPR.
  • the amount of acid-denatured human IgG in the acid-treated human IgG sample was converted to a pyotinylated product against the SPR response value on the sensor chip to which biotinylated Fc-II I peptide was immobilized. Evaluation was made by calculating the ratio of SPR response values on the sensor chip immobilized with IMGpep-4K6R (production rate of acid-denatured human IgG).
  • acid IgG-treated human IgG samples were prepared and tested as follows. First prepared by adding 20 ⁇ 1 of 1M glycine-HC1 of various pH (1.5, 2.1, 2.7) to anti-HER2 human antibody (125 ig / ml, 0.1 M NaCl solution) 80 1 Reaction liquid (I gG 40 ⁇ g / ml, 250 nM) at various temperatures (20, 30 and 40 ° C) for 10 minutes, and then add 1 Tris-HCl (pH 8.7) to 30 ⁇ 1 ( For samples added with ⁇ 2.7 glycine-HC1, 20 Ai l) was added and neutralized. After neutralization, the antibody solution was diluted to 250 nM with a running buffer and then injected onto the sensor chip for SPR analysis. After neutralization and before injection onto the sensor chip, the pH was confirmed with a pH test paper.
  • Figure 11 shows an example of an SPR sensorgram showing the reactivity of a human IgG sample acid-treated at pH 2.7 and 40 ° C with Fc-III peptide and IMGpep-4K6R.
  • the production rate of acid-denatured IgG was calculated based on the value of b / a ratio a / b in the figure.
  • An antibody sample was prepared in the same manner as in Example 9 by acid-treating an anti-HER2 human antibody (Herceptin) under the conditions of incubation at pH 2.7, 40 ° C. for 10 minutes.
  • biotinylated IMGPep-4K6R peptide biotin spacer G
  • Example 10 The acid-denatured anti-HER2 human IgG eluted in Example 10 was collected, immediately neutralized with 1M Tris-HC1 buffer (pH 8.7), and dialyzed against PBS. I went. The purified IgG sample thus obtained was characterized.
  • Figure 14 shows the circular dichroism spectrum (CD spectrum) measured for this purified sample.
  • the absorption maximum near 205 nm increased compared to untreated human IgG, suggesting that the content of random structures increased.
  • the negative absorption derived from the / 3 sheet structure of the immunoglobulin domain around 215 nm showed almost the same amount of absorption as that of untreated human IgG. Therefore, in the acid-denatured human IgG, the random structure increased, but it was thought that most of the three-sheet structure of the whole antibody was retained.
  • Human anti-human IL-6 receptor monoclonal IgG antibody (MRA; —generic name: tocil izumab, Chugai Pharmaceutical) isolated from acid-treated samples MRA (acid-denatured) Type MRA), the apparent molecular weight was analyzed by molecular sieve chromatography.
  • humanized anti-human IL-6 receptor IgG antibody (2000 ⁇ g / ml, PBS solution)
  • 100 ⁇ l of 1 ⁇ -glycine-HC1 of ⁇ ⁇ 2.7 to 20 ⁇ 1 and then incubate at 30 ° C for 10 minutes, then add 1M Tris-HCl (pH 8.7) 1.
  • an acid-treated antibody sample was obtained.
  • a Piotin® IMGPep-4K6R peptide-immobilized column was prepared in the same manner as in Example 10, and an acid-treated antibody sample was injected into the column at a flow rate of 0.4 ml / min.
  • the purified acid-denatured MRA was subjected to molecular sieve chromatography using a HiLoad Sperdex 200 16/60 column (GE Healthcare).
  • the untreated MRA, the acid-treated antibody sample, and the flow-through fraction (unmodified MRA) obtained by injecting the acid-treated antibody sample onto the pyotinylated IMGPep-4K6R peptide immobilization column, Each was subjected to molecular sieve chromatography using a HiLoad Sperdex 200 16/60 column (GE Healthcare).
  • Purified acid-denatured MRA has an increased oligomer peak (Figure 15 C) and appears to contain higher amounts of dimers and trimers. However, about 65% of the refined acid-modified MRA is still a monomer, indicating that acid-modified MRA does not produce aggregates due to the progress of denaturation ( Figure 15 C). ) In addition, almost no oligomer was observed in the flow-through fraction of the acid-treated antibody sample that passed through the IMGPep-4K6R peptide-immobilized column (FIG. 15D).
  • the content of human IgG having acid-denatured conformation was evaluated using the same method as disclosed in Example 9. Specifically, a human IgG solution such as antibody drug or immunoglobulin preparation prepared at ⁇ wg / ml is injected into a cell equipped with an SPR sensor chip to which IMGpep-4K6R and Fc-III peptides are separately immobilized. The binding reaction on the sensor chip was measured. The content of acid-denatured IgG was calculated from the ratio a / b of the response value a in the cell immobilized with IMGpep-4K6R peptide to the response value b in the cell immobilized with Fc_III peptide.
  • the two antibody drugs examined had a low content of acid-modified IgG of 0.5% or less.
  • immunoglobulin preparations showed a high content of 3% or more. This difference is thought to be due to the difference in the purification method of human IgG used in manufacturing each preparation.
  • Acid-treated human MRA was detected on the membrane using the peptide IMGpep-4K6R of the present invention and the IMGpep-ICS peptide. Specifically, acid-treated human MRA (IgG), untreated human MRA (IgG), 1.5 ng, 3 ng, 6 ng, 12.5 ng, 25 ng, 50 ng, and lOOng per spot, respectively. Spot on a nitrocellulose membrane with and dry for 5 minutes, then 0.5 ° /. Bocking was performed for 2 hours at room temperature after adding BSA.
  • acid-treated human MRA was added to human anti-human IL-6 receptor IgG antibody (MR A) (2000.U g / ml, PBS solution) 100 1 and ⁇ ⁇ ⁇ 2.8 1M glycine ⁇ It was prepared by adding 10 ⁇ l of HC1 and further incubating at 40 ° C. for 10 minutes, followed by neutralization by adding 30 l of 1M Tris-HCl (pH 8.7).
  • MR A human anti-human IL-6 receptor IgG antibody
  • the peptide tag of the present invention can be used in a method for detecting, purifying, or separating human IgG that can capture human IgG or a fragment containing the Fc region thereof with high efficiency.
  • the peptide tag of the present invention can be used particularly for detection and removal of acid-denatured human IgG. Sequence listing free text
  • SEQ ID Nos: 1 to 12 and 15 to 16 are synthetic peptides.
  • SEQ ID Nos: 13 to 14 are primers.

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Description

明 細 書
IgG結合性ぺプチド 技 術 分 野
本発明は、 ヒ ト IgGに対して結合親和性を有するペプチド、 及びそれを用いる ヒ ト IgGの検出及び精製方法に関する。 背 景 技 術
現在、 米国では 10種類を超える抗体が医薬品として販売されている。 抗体医薬 は、 最も確実性の高い分子標的医薬として注目されており、 新しい医薬品分野を 急速に拡大している。 現在開発中又は使用されている抗体医薬のほとんどは免疫 グロブリン G (IgG) クラスに属する抗体を用いるものである。 これまで、 IgG抗 体の検出や精製には、 IgG抗体の Fc領域に特異的に結合する、 抗 Fc抗体やプロテ イン A/Gがしばしば使用されてきた （非特許文献 1及ぴ 2 ) 。 しかし、 ハイプリ ドーマ技術あるいは動物免疫化によって作製される抗 Fc抗体には、 高価であるだ けでなく、 ラベル化の際に変性しやすいことなどの欠点がある。 一方、 プロティ ン A/Gは、 異なる生物種由来の IgGを区別できず、 またヒ ト IgG3には結合しないと いう欠点がある。 さらにプロテイン A/Gは、 通常は細菌から単離されるため、 LPS などのエンドトキシンが混入する可能性がある点が、 抗体医薬の精製におけるプ 口ティン Aカラムの使用上の大きな問題となっている。 さらに、 プロテイン Aカラ ムを用いて抗体の精製を行う場合、 酸性溶液を用いてカラムから抗体を溶出する 際に酸による抗体の変性が生じ、 その結果として収率が大幅に低下したり、 精製 抗体の品質が低下したりする問題もある。 このような抗 IgG抗体ゃプロティン A/G を用いた抗体精製法が持つ問題を克服し、 ヒ ト IgGを特異的に検出及び精製でき る新しい手法の開発は、 非常に重要である。
IgG精製に用いられうる IgG結合性ペプチドは、 これまでに多数が報告されてい る。 Fassinaらは、 合成多量体ペプチドライブラリをスクリーニングし、 ビォチ ン標識免疫グロプリンとの相互作用についてプロティン Aと競合するプロティン A ミミックペプチドを同定した （非特許文献 3及ぴ 4 ) 。 また、 Ehrlishらは、 12m erまたは 7merの直鎖ぺプチドを提示する M13ファージディスプレイライブラリ力 ら、 プロティン Aミミックな配列を有する Fc結合性ぺプチドを単離した （非特許 文献 5 ) 。 Krookらも、 直鎖 lOmerぺプチドを提示するランダムべプチド HJSE5フ ァージライブラリを IgGと反応させ、 プロテイン Aで溶出することにより、 プロテ イン Aアナログペプチドを同定したことを報告している （非特許文献 6 ) 。 2005 年には、 Verdolivaらが、 環状の合成ペプチドライブラリから、 IgG抗体ヒンジ部 に近い領域を認識し、 Fc T/ RIIIと IgG Fcとの反応を競合阻害するようなペプチド モチーフを報告している （非特許文献 7 ) 。 また鈴木らは、 IgG Fcフラグメント に結合性を有するペプチドを記載し、 それらを利用した IgG検出方法を開示して いる （特許文献 1 ) 。 し力 し、 これらのペプチドモチーフはいずれも、 IgG抗体 の精製/検出用のタグとして充分な IgG結合親和性を有するものとはいえない。 一方 2000年に、 DeLanoらが、 環状ペプチドを提示する M13ファージライブラリ を用いて、 Fc- IIIペプチド （DCA醫 LGELVWCT；配列番号 1 5 ) を始めとする、 ヒ ト IgG Fcフラグメント上のヒンジ領域に結合親和性を有するポリペプチド配列を 報告した （非特許文献 8及び特許文献 2 ) 。 さらに 2006年に、 このペプチド Fc- 1 IIの環状形成をより安定化するようなエンジニアリングが Diasらによつて行われ た （非特許文献 9 ) 。 Delanoらのペプチド Fc- IIIが示す IgG抗体との結合親和性 は Kd値で 185nMであるが、 Diasらの改良ぺプチド FcBP- 2では、 Kd値は約 2nMまで低 下し、 それが極めて結合力の強いペプチドであることが示された。 しかし速度論 的.なパラメータの解析からは、 FcBP - 2の解離速度定数 koffは 10— 2 sec— 1となった。 この解離速度は抗体の通常の koff (10— 3〜： 10— 5 SecT1) の値に比べ、 非常に速い。 このことは、 ぺプチド FcBP- 2を抗体の精製や検出用のタグとして使用したとして も、 解離速度の速さにより、 ペプチド FcBP- 2と抗体との結合は速やかに解離して しまうため、 その結合を保持できないことを意味する。 従って FcBP - 2は、 ヒ ト Ig G精製/検出の用途には適さない。
多種多様なヒ ト IgG Fc結合性ペプチドが特許文献 3に開示されている。 しかし、 ヒ ト IgGのいずれのサブクラスに対しても結合を十分に保持することができ、 か つ他生物種の IgGに対しては有意な結合を示さないような、 ヒ ト IgG精製/検出に 好適なぺプチドは、 特許文献 3にも記載されていない。
特許文献 1 特開 2 0 0 4— 1 8 7 5 6 3号公報
特許文献 2 国際公開 WO 0 1/0 4 5 7 4 6号パンフレツト
特許文献 3 国際公開 WO 0 2/0 8 6 0 7 0号パンフレツト
非特許文献 1 ： Ey P. L.， et al.， Immunohchemistry (1978) 15， p.429-436 非特許文献 2 ： Akerstrom B. , et al.， J. Immunol. , (1985) 135， p.2589 -
2592
非特許文献 3 ： Fassina G. , et al. , J. Mol. Recognit. (1996) 9， p.564-
569
非特許文献 4 ： Fassina G. , et al. , J. Mol. Recognit. (1998) 11， p.12
8-133
非特許文献 5 ： Ehrlich G. K. and Bailon P. , J. Mol. Recognit. (1998) 1
1, .121-125
非特許文献 6 ： Krook M.， Mosbach K.， and Ramstrom 0. , J. Immunol. Met hods (1998) 221, p.151-157
非特許文献 7 ： Verdoliva A. et al. , Chembiochem (2005) 6， p.1242 - 1253 非特許文献 8 ： DeLano W. L. , et al. , Science (2000) 287， p.1279-1283 非特許文献 9 ： Dias R. L.， et al. , J. Am. Chem. Soc. (2006) 128， p.272
6-2732 発 明 の 開 示
本発明は、 ヒ ト IgGに対し特異的な結合活性を有する、 ヒ ト IgGの精製又は検出 に好適に使用可能なぺプチドを提供することを目的とする。
本発明者らは、 上記課題を解決するため鋭意検討を重ねた結果、 ある特定の配 列パターンを有する短いペプチドが、 ヒ ト IgG抗体の各サブクラス （IgGl〜： tgG4 ) に対し高い結合活性を示す一方、 マウスなどの抗体には有意な結合を示さず種 特異性を有することを見出した。 さらにこれらのペプチドについて、 ヒ ト IgG抗 体との結合における解離速度が遅く、 その結合をより保持しやすいことも示され た。 さらに、 これらのペプチドとヒト IgG抗体との結合は、 ヒト IgG抗体の酸処理 により顕著に促進されることも示された。 本発明はこれらの知見に基づいて完成 されたものである。
すなわち、 本発明は以下を包含する。
[1] 下記式 I：
c- (X) n-w-x-x-x-w- (X) m-c (I)
[式中、 n及び mはそれぞれ 1以上の整数であり、 かつ n+m=4又は 5である] で表されるアミノ酸配列であって、 式 I中の X- X- Xがシスティン残基を含まず、 か つ以下の a)及び b) ：
a) 式 I中の（X) n_Wが、 Za- G- Y-Wである
b) 式 I中の W- (X) raが、 W - G - L- Zbである
[Za及ぴ Zbはそれぞれ 0個又は 1個以上のァミノ酸残基である ]
のいずれか又は両方を満たすアミノ酸配列を少なくとも含む、 11〜16アミノ酸長 のヒ ト IgG結合性ぺプチドタグ。
このペプチドタグにおいては、 式 Iで表されるアミノ酸配列が、 前記 a)及び b) ：
a) 式 I中の（X) n-Wが、 Za- G- Y- Wである
b) 式 I中の W- が、 W-G- L-Zbである
[Za及び Zbはそれぞれ 0個又は 1個以上のアミノ酸残基である]
の両方を満たすことがより好ましい。
上記 [1]のペプチドタグの特に好適な例としては、 以下の 1)〜： 11)のアミノ酸配 列からなるものが挙げられる。
1) CGYWRSEWGLC (配列番号 1 )
2) CTGFWEREWGLC (配列番号 2 )
3) CLYWPRLWGLC (配列番号 3 )
4) CTGYWPKAWGLC · (配列番号 4 )
5) CYWA丽 GLLGC (配列番号 5 )
6) CGYWADV QIHC (配列番号 6 )
7) GCGYWRSEWGLCG (配列番号 7 )
8) GCTGFWEREWGLCG (配列番号 8 ) 9) GCTGYWPKAWGLCG (配列番号 9 )
10) GCGYWRSQWGLCG (配列番号 1 0 )
11) GCTGYWPRAWGLCG (配列番号 1 1 )
上記 [1]のペプチドタグにおいては、 式 I中の 2つのシスティン残基 （C) の間に ジスルフィド結合が形成されることが好ましい。
上記 [1]のペプチドタグは、 好ましくは、 酸変性型ヒ ト IgGに結合するものであ る。
上記 [1]のぺプチドタグには、 標識物質が付加されていてもよい。
[2] 上記 [1]のぺプチドタグを提示した組換えパクテリオファージ。
[3] 上記 [1]のペプチドタグと連結されたタンパク質からなる融合タンパク質。
[4] 上記 [1]のペプチドタグを固定化した固相担体。
[5] 上記 [1]のペプチドタグをコードする DNA。
[6] 上記 [5]の DNAを含むベクター。
[7] 上記 [6] ベクターを含む形質転換体。
[8] 以下の工程 a)〜 を含む、 試料中のヒ ト IgG又はその Fc領域を含む断片を検 出する方法：
a) 試料を酸処理する工程、
b) 上記 [1]のペプチドタグを酸処理した試料と接触させる工程、 及ぴ c) 工程 b)で生じた、 ペプチドタグとヒト IgG又はその Fc領域を含む断片との結 合を測定する工程。
この検出方法では、 表面プラズモン共鳴解析により前記結合を測定することが 好適である。
[9] 以下の工程 a)'及ぴ b)を含む、 試料中のヒト IgG又はその Fc領域を含む断片 を精製する方法：
a) 上記 [1]のペプチドタグを酸処理した試料と接触させて、 それにより試料中 のヒト IgG又はその Fc領域を含む断片をぺプチドタグに結合させる工程、
b) 工程 a)でペプチドタグに結合したヒ ト IgG又はその Fc領域を含む断片を、 試 料から分離する工程。
[10] 以下の工程 a)及び b)を含む、 試料から酸変性型ヒト IgG又はその Fc領域を 含む断片を除去する方法：
a) 上記 [1]のペプチドタグを試料と接触させる工程、 及ぴ
b) 工程 a)でペプチドタグに結合したヒト IgG又はその Fc領域を含む断片を、 試 科から除去する工程。
[11] 以下の工程 a)〜 を含む、 タンパク質の精製方法：
a) 上記 [1]のペプチドタグを連結したタンパク質からなる融合タンパク質を作 製し、 それを含む試料を調製する工程、
b) 工程 a)の試料を酸処理したヒ ト IgG又はその Fc領域を含む断片と接触させて、 それにより融合タンパク質をヒ ト IgG又はその Fc領域を含む断片と結合させるェ 程、
c) 工程 b)でヒ ト IgG又はその Fc領域を含む断片に結合した融合タンパク質を、 試料から分離する工程。
[12] 上記 [1]のペプチドタグ、 上記 [2]の組換えバタテリオファージ、 上記 [4]の 固相担体、 上記 [6]のベクター、 及ぴ上記 [7]の形質転換体からなる群より選択さ れる少なくとも 1つを含む、 ヒ ト IgG又はヒ ト IgG Fc領域を含む断片を検出又は 精製するためのキット。
本発明のペプチドタグは、 ヒ ト IgGと特異的に結合することができ、 特に、 酸 変性したヒ ト IgGに良好に結合することができる。 本明細書は、 本願の優先権の基礎となる特願 2 0 0 6— 2 9 9 5 6 6号の明細 書に記載された内容を包含する。
図面の簡単な説明
図 1は、 ヒ ト IgG抗体に対するバイオパンユングによる IgG特異的ファージ （黒 塗りのバー） の濃縮を示した図である。 各ラウンドにおいて示したパーは、 左か ら hIgG、 ゼラチン、 BSAに結合性を示したファージを示す。
図 2は、 得られた IgG特異的ファージクローンのヒ ト IgGに対する結合特異性を 示した図である。 各ファージについて示したバーは、 左から hIgG、 hIgA、 hIgE、 hIgM、 mIgG、 mIgA、 mIgE、 hTF、 HSA、 BSA、 ゼラチンに対する結合性を示す。
図 3は、 得られた IgG特異的ファージクローンのヒ ト IgGアイソタイプ （IgGl、 IgG2、 IgG3、 IgG4) に対する結合活性を示した図である。 各ファージについて示 したバーは、 左から hIgGl、 hIgG2、 hIgG3、 hIgG4、 BSAヽ mlgGl, mIgG2b、 mIgG3 に対する結合性を示す。
図 4は、 得られた IgG特異的ファージクローンのヒ ト IgGへの結合に対するプロ ティン Aの阻害を示した図である。 各ファージについて示したバーは、 左から 0 n g/ウエノレ、 15 ng/ウエノレ、 30 ng/ウエノレ、 60 ng,/ウエノレ、 125 ng/ウエノレ、 250 n g/ゥヱル、 500 ng/ゥエルのプロテイン A (SpA) を添加した場合のヒ ト IgG結合性 を示す。
図 5は、 還元条件下及ぴ酸化条件下での IgG特異的ファージクローンのヒト IgG への結合活性を示した図である。 各実験群について示したバーは、 左から 0 mM ( 添加せず） 、 30 mM、 50 mMの GSSG又は DTTを添加したファージのヒ ト IgG結合性を 示す。
図 6は、 ヒ ト IgG特異的合成ペプチドのヒ ト IgGに対する結合特異性を示した図 である。 各合成ペプチドについて示したパーは、 左から hIgG、 hlgG - Fc、 hIgA、 h IgE、 mIgG、 mIgA、 mIgE、 hTF、 FBS、 HSA、 ゼラチン、 BSAに対する結合性を示す, 図 7は、 ヒ ト IgG特異的合成ペプチドのヒト IgGアイソタイプ抗体に対する結合 活性を示した図である。 各合成ペプチドについて示したバーは、 左から hIgGl、 h IgG2、 hIgG3、 hIgG4、 BSAに対する結合性を示す。
図 8は、 各種ヒ ト IgG特異的合成ペプチドとヒ ト IgGとの結合に関する表面ブラ ズモン共鳴解析の結果を示す図である。 横軸は時間 （秒） 、 縦軸はレスポンスュ ニット （RU) を表す。 図 8 Aは、 ヒ ト IgG特異的合成ペプチド IMGpep - 1とヒ ト IgG との結合に関する表面プラズモン共鳴解析の結果を示す図である。 図 8 Bは、 ヒ ト IgG特異的合成ペプチド IMGpep- 1E6Qとヒ ト IgGとの結合に関する表面プラズモ ン共鳴解析の結果を示す図である。 図 8 Cは、 ヒ ト IgG特異的合成ペプチド IMGpe p -4とヒ ト IgGとの結合に関する表面プラズモン共鳴解析の結果を示す図である。 図 8 Dは、 ヒ ト IgG特異的合成ペプチド IMGpep- 4K6Rとヒト IgGとの結合に関する 表面プラズモン共鳴解析の結果を示す図である。 図 9は、 ヒ ト IgG特異的合成ペプチド及ぴヒ ト IgG特異的ファージクローンを固 定化したマグネッ トビーズを用いたヒ ト IgG抗体の免疫沈降の結果を示す写真で める。
図 1 0は、 ヒ ト IgG特異的合成ペプチドを用いた酸処理後の hlgG抗体の免疫沈 降の結果を示す写真である。
図 1 1は、 酸処理 （処理 PH2. 7、 処理温度 40°C) 後の I gGサンプルとセンサーチ ップ上に固定化したぺプチド Fc- III又は IMGpep-4K6Rとの反応性を示す SPRセンサ 一グラムを例示する図である。 横軸は時間 （秒） 、 縦軸はレスポンスユニット （ RU) を表す。 図中の bと aの比率 a/bの値に基づいて、 酸変性型コンフオメーショ ンを有する IgG (酸変性型 IgG) の生成率を算出した。 図中、 実線は Fc- III固定化 センサーチップ上に結合したヒ ト IgG、 破線は IMGpep- 4K6R固定化センサーチップ 上に結合したヒ ト IgGの量を示す。
図 1 2は、 酸処理条件に応じた酸変性型ヒ ト IgGの生成率の変化を示す図であ る。 図中、 白のバー、 黒塗りバー、 斜線パーは、 それぞれ、 酸処理時のインキュ ベーシヨン温度が 20°C、 30°C、 40°Cのサンプルを表す。
図 1 3は、 IMGpep-4K6R固定化カラムによる酸変性型ヒ ト IgGの分離を示す図で ある。 図中、 実線が、 酸処理した抗 HER2ヒト IgG抗体サンプルを、 破線が未処理 の抗腿 2ヒト IgG抗体サンプル (ハーセプチン) を、 点線が BSAを表す。
図 1 4は、 酸変性型コンフオメーシヨンを有するヒ ト IgG (酸変性型ヒト IgG) の CDスぺク トルを示す図である。 実線が未処理の IgGを、 点線が精製した酸変性 型 IgGを表す。
図 1 5は、 酸変性型ヒ ト抗 IL - 6レセプター抗体 MRAの分子篩クロマトグラフィ 一の結果を示す図である。 図 1 5 A：未処理のヒ ト IgG (抗 IL - 6レセプターヒ ト 抗体 MRA) 、 B ：酸処理 （pH 2. 7、 30°C、 10分） したヒ ト IgG (MRA) 、 C ： ピオ チン化 IMGpep- 4K6R固定化カラムを通して精製された酸変性型 MRA、 D ：酸処理 （ pH 2. 7、 30°C、 10分） したヒ ト IgG (MRA) を IMGPep- 4K6R固定化カラムにァプラ ィして得られた素通り画分 （未変性のまま残存した MRA) 。
図 1 6は、 酸処理したヒ ト IgGサンプルから IMGep- 4K6Rペプチド固定化カラム クロマトグラフィーにより分離した画分に対する、 IMGpep-4K6Rぺプチド固定化 ビーズによる免疫沈降実験の結果を示す図である。 レーン 1 ：未処理の抗体 MRA、 レーン 2 ： pH2. 2、 4°Cで 10分間処理した抗体 MRAサンプル、 レーン 3 ：精製され た酸変性型 MRA (PH2. 2、 4°Cで 10分間処理をした抗体 MRAサンプルを IMGpep- 4K6R ペプチド固定化カラムに通過させて得られた吸着画分） 、 レーン 4 ： pH2. 2、 4°C で 10分間処理した抗体 MRAサンプルをピオチン化 IMGPep- 4K6Rぺプチド固定化カラ ムに通過させて得られる素通り画分。
図 1 7は、 ヒ ト IgG抗体医薬や免疫グロブリン製剤中の、 全 IgG量に対する酸変 性型ヒ ト IgGの含有率を示す図である。
図 1 8は、 本発明の IMGpep-4K6Rペプチド （抗ヒ ト IgGペプチド） を用いた、 酸 処理した IgG (ヒ ト MRA) のドットブロッテイングの検出結果を示す写真である。 図中、 K6R (N)は、 IMGpep_4K6Rペプチドで検出した酸処理をしていないヒ ト IgG； Fc - ΙΠ (Ν)は、 Fc- IIIペプチドで検出した酸処理をしていないヒ ト IgG； K6R (A)は、 IMGpep- 4K6Rペプチドで検出した酸処理 （pH2. 8、 40°C、 10分インキュベート） し たヒ ト IgG ; CS (N)は、 IMGpep- ICSペプチドで検出した酸処理をしていないヒ ト Ig Gを示す。 発明を実施するための最良の形態
以下、 実施例を用いて本発明をさらに具体的に説明する。 但し、 本発明の技術 的範囲はこれら実施例に限定されるものではなレ、。 以下、 本発明を詳細に説明する。
1 . 本発明のペプチドタグ
本発明は、 ヒ ト免疫グロブリン G (IgG) の Fc領域、 特に酸変性型ヒト免疫グロ プリン Gの Fc領域に対して特異的に結合するペプチドタグと、 それを利用したヒ ト IgGの検出、 精製又は除去方法に関する。
本発明において 「ペプチドタグ」 とは、 その標的分子 （ここでは、 ヒ ト IgG若 しくはその Fc領域を含む断片又はそれらの標識物等） への特異的結合性を利用し て、 該標的分子の検出、 捕捉、 精製 （濃縮などを含む） 、 分離除去などに使用す るためのぺプチドを意味する。 本発明にかかるぺプチドタグは、 共通モチーフである 3アミノ酸配列 G-Y - Wと W- G-Lの間に 3個の任意のアミノ酸残基が挟まれた配列 （G- Y- W- X- X- X- W- G- L) を含 む 9又は 10アミノ酸長の配列の両側にシスティン残基が 1つずつ配置されたぺプチ ド配列又はその類似配列を含む、 短鎖長のペプチドである。 この類似配列とは、 上記べプチド配列と相同性の高い配列を有し、 かつ上記 G-Y-Wと W - G - Lのうち少な くとも一方のモチーフ配列と、 上記配列パターン W - X- X- X - Wとが保存されている ァミノ酸配列を意味する。 そのような類似配列としては、 例えば、 ァミノ酸配列 C- (X) 0_2- (F又は Y) -W-X-X-X-W- (G又は Q) - (L又は I) - (X) 0_2- C力 S挙げられる。 ここで (X)。— 2は、 任意のアミノ酸残基 Xが 0〜2個連続している配列である。
より一般的には、 本発明にかかる IgG結合性ぺプチドタグは、 下記式 I： c- (x) n-w-x-x-x-w- (x) m-c (I)
[式中、 n及び mはそれぞれ 1以上の整数であり、 かつ n+m=4又は 5である] で表されるアミノ酸配列であって、 さらに、 式 I中の X - X- Xがシスティン残基を含 まず、 かつ以下の a)及ぴ b) ：
a) 式 I中の（X) n- Wが、 Za_G- Y- Wである
b) 式 I中の W- (X) raが、 W- G - L- Zbである
[Za及び Zbはそれぞれ 0個又は 1個以上 （具体的には、 n + m=4又は 5を満たすよう に最大 2個である） のアミノ酸残基 （好ましくはシスティン残基を除く） である ]
のいずれか又は両方を満たすァミノ酸配列、 を少なくとも含むぺプチドとして表 される。 またこのペプチドタグとしては、 11〜16アミノ酸長、 好ましくは 11〜： 14 アミノ酸長からなるぺプチドが好ましい。
なお式 I中の X- X- Xは、 好ましくはシスティン残基を 1個も含まない 3アミノ酸配 列である。 さらに式 I中の X-X- Xは、 トリブトファン残基を 1個も含まない 3ァミノ 酸配列であることも好ましい。
原則として、 本明細書中に示すアミノ酸配列 （例えば、 上記式 I) は、 通常の アミノ酸の 3文字表記又は 1文字表記を用いて表している。 すなわち、 例えば上 記式 I中、 Cはシスティン残基 （Cys) 、 Wはトリプトファン残基 （Trp) を表す。 また Xは任意の 1個のアミノ酸残基を表し、 （X) n及び（X) mは任意のアミノ酸残基 X W がそれぞれ n個、 そして m個連続した配列を表す。 また X- X- Xは連続した 3個のアミ ノ酸残基の配列を表す。 さらに Gはグリシン残基 （Gly) 、 Yはチロシン残基 （Tyr ) 、 Lはロイシン残基 （Leu) を表す。
さらに、 本発明のより好適なペプチドタグは、 以下の通りである ：
下記式 II ：
(X) -C- (X) -W-X-X-X-W- (X) ra-C— (X) q (II)
[式中、 p = 0又は 1であり、 n及ぴ mはそれぞれ 1以上の整数であり、 かつ n+m=4 又は 5であり、 q=0又は 1である]
で表されるアミノ酸配列であって、 式 II中の X-X - Xがシスティン残基を含まず、 かつ以下の a)及び b) ：
a) 式 II中の（X) n- Wが、 Za-G- Y - Wである
b) 式 II中の W- (Χ) πが、 W- G-L - Zbである
[Za及ぴ Zbはそれぞれ 0個又は 1個以上のアミノ酸残基 （好ましくはシスティン残 基を除く） である]
のいずれか又は両方を満たすアミノ酸配列からなる、 ヒ ト IgG結合性ペプチドタ グ。 '
式 II中の（X) p及び Z又は（X) qは、 存在しなくてもょレ、 (p, q = 0の場合) ある いは式 ΙΓ中の（X) p及ぴ Z又は（X) qが、 それぞれ 1個のグリシン残基 (G) であるこ とも好ましい。 特に式 II中の（X) p及び/又は（X) qは、 システィン残基以外の任意 のアミノ酸残基からなることが好ましい。
ここで、 式 I又は IIによって表される本発明のペプチドタグは、 上記 a)及び b) に示す Za- G- Y-W及ぴ W- G - L- Zbの配列を両方含む場合、 ヒ ト IgG Fc領域に対してよ り高い結合親和性を示し得る。
本発明のペプチドタグの特に好適な例として、 以下のアミノ酸配列からなるも のが挙げられる。 なおこれらのアミノ酸配列はアミノ酸の 1文字表記を用いて表 されている。
CGYWRSEWGLC (配列番号 1 )
CTGFWEREWGLC (配列番号 2 )
CLYWPRLWGLC (配列番号 3 ) CTGYWPKAWGLC (配列番号 4 )
CYWAVRWGLLGC (配列番号 5 )
CGYWADVWQIHC (配列番号 6 )
GCGYWRSEWGLCG (配列番号 7 )
GCTGFWEREWGLCG (配列番号 8 )
GCTGYWPKAWGLCG (配列番号 9 )
GCGYWRSQWGLCG (配列番号 1 0 )
GCTGYWPRAWGLCG (配列番号 1 1 )
本発明のぺプチドタグにおいては、 その配列に含まれる 2つのシスティン残基 (0 の間でジスルフイ ド結合が形成されることが好ましい。 このジスルフイ ド 結合は、 非還元条件下 （例えば、 10mM〜50mM酸化型グルタチオン存在下） では 形成されるが還元条件下 (例えば、 10mM〜50mM ジチオスレィ トール存在下) で は形成されない。 ジスルフイ ド結合が形成されることにより、 本発明のペプチド タグはコンパクトな環状構造を形成する。
本発明のペプチドタグは、 特に、 酸変性したヒ ト免疫グロプリン G (IgG) 抗体 の Fc領域に対して高い結合活性を示し、 そのような酸変性形態 （酸変性型） のヒ ト IgG (全抗体） やその Fc領域を含む断片と、 強力に結合することができる。 ヒ ト IgGは、 パパイン等による消化を受けて、 2つの Fab断片 （可変領域と定常 領域を含む腕部分） と、 Fc断片 （定常領域を含む体幹部） に切断される。 IgG抗 体の Fc断片は、 IgGをパパイン酵素で切断することによって得られる抗体断片の うち、 2本の H鎖のカルボキシル末端側の約半分の断片 （定常領域である CH2ドメ ィン及び CH3ドメインからなる) が互いに 2つのジスルフィ ド結合によって連結さ れたものである。 一方、 本発明において Fc領域とは、 この Fc断片に含まれる CH2 ドメインと CH3ドメインからなる H鎖内の領域を言う。 なお、 本明細書において 「 ヒ ト IgGの Fc領域を含む断片」 とは、 ヒ ト IgGのプロテアーゼ分解断片 （典型的に は、 パパイン又はトリプシン分解断片） であってもよいし、 ヒ ト IgGの Fc領域を 含むがプロテアーゼ分解断片ではないヒ ト IgGの一部分であってもよい。 「ヒ ト I gGの Fc領域を含む断片」 は、 CH2ドメインと CH3ドメインからなる H鎖断片を 1つ又 は 2つ以上含む IgGの一部分でありうる。 本発明において、 酸変性型ヒ ト免疫グロブリン G (igG) とは、 酸処理により通 常の IgG抗体のコンフオメーシヨン （構造） が変性して特定の （特殊な） コンフ オメーションを有するようになったヒ ト免疫グロプリン。、 又は酸処理の有無に かかわらずそれと同等のコンフオメーションを有するヒ ト免疫グロプリン Gを指 す。 この酸変性型ヒト免疫グロブリン G (IgG) においては、 ランダム化した構造 がー部認められる一方で、 /3シート構造などの二次構造は大部分が保持されてい ることが好ましい。 すなわち、 酸変性型ヒ ト免疫グロブリン G (IgG) は、 変性中 間状態のコンフオメーシヨンを有するものと思われる。 ここで酸処理とは、 限定 するものではないが、 好ましくは pH3. 5以下、 例えば pHl. 5〜2. 7、 より好ましく は pHL 5〜2. 1の条件下に免疫グロプリン Gが曝露されることを意味する。 この酸 処理は、 前記酸性条件下で免疫グロブリン Gを 4°C〜50°C、 好ましくは 20〜50°C、 より好ましくは 30°C〜40°Cでィンキュベートすることによって行うことが好まし い。 この酸処理工程は、 例えば 1〜3分又はそれ以上、 例えば 5分〜 10分にわたる ものでありうる。 IgG含有溶液をそのような酸性条件とした後、 例えばトリスな どの塩基性溶液の添加により溶液の pHを中和してもよい。.一例として、 抗体を含 有する溶液の pHを pHl. 5に調整して 5分間ィンキュベートすることにより酸処理し た後、 溶液の pHを中和することができるが、 これに限定されるものではない。 一 方、 酸処理によって生じるのと同等の変性コンフオメーシヨンを有するヒ ト免疫 グロブリン Gは、 例えば、 ヒ ト IgGを冷凍又は冷蔵保存したり、 中性 pH条件下で長 期保存したりすることによつても生じうるし、 またヒ ト IgGに変異を導入したり 糖鎖を付加又は除去したりすることによつても生じうるが、 これらに限定される ものではない。 本発明の酸変性型ヒト免疫グロブリン Gは、 その抗原結合活性を 保持していても、 いなくてもよい。 一般的なヒ ト IgG調製物、 例えば市販のポリ クローナルヒ ト IgG抗体製品などには、 ある程度の量の酸変性型ヒ ト免疫グロブ リン Gが含まれ得る。 特に、 プロテイン Aカラムなどから酸性溶出液を用いて溶出 したヒ ト IgG精製品には、 通常、 酸変性型ヒ ト免疫グロブリン Gが混在する。
本発明のペプチドタグは、 ヒト IgGのサブクラス （アイソタイプ） である IgGl IgG2、 IgG3及ぴ IgG4のいずれに対しても高い結合活性を示す。 本発明のペプチド タグは、 酸変性型の各サブクラスのヒ ト IgGに対して特に高い結合活性を示す。 本発明のペプチドタグはまた、 酸変性型ヒ ト IgGのオリゴマー （例えば、 ダイマ 一やトリマーなど） に対して'も高い結合活性を示す。
さらに本発明のペプチドタグは、 好ましくは、 IgG以外のヒ ト免疫グロブリン クラス （例えば IgA、 IgE、 IgM等） に対して結合活性を示さない。 本癸明のぺプ チドタグはまた、 好ましくは、 ヒ ト以外の動物 （例えば、 マウス） の各種クラス 及ぴサブクラスの免疫グロプリンに対しても結合活性を示さない。 従って本発明 のペプチドタグは、 特に酸変性型のヒ ト IgG又はその Fc領域に対して非常に特異 的に結合することができる。 なお、 本発明のペプチドタグはプロテイン Aによる ヒ ト IgGへの結合を競合阻害することから、 プロテイン Aの結合部位である IgG Fc 領域中の CH2ドメインと CH3ドメインの連結部付近に結合するものと考えられる。 本発明のペプチドタグは、 当業者に周知の液相合成法、 固相合成法、 Fmoc法な どの任意のペプチド化学合成法によって作製することができる （K'el ley et al. , Genetics Engineering Principles and Methods, Setlow, J. K. eds. , Plenum Press NY. (1990) Vol. 12, p. 1-19； Stewart et al.， Sol id-Phase Peptide Syn thesi s (1989) W. H. Freeman Co.； Houghten, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (198 5) 82： p. 5132、 「新生化学実験講座 1 タンパク質 IV」 （1992) 日本生化学会編， 東京化学同人などを参照されたい） 。 自動ペプチド合成機によるペプチド合成 も一般的に行われている。 あるいは、 本発明のペプチドタグをコードする DNAを 用いた組換え法やファージディスプレイ法などによって、 ぺプチドを製造しても よい。 例えば本発明のペプチドタグのアミノ酸配列をコードする DNAを発現べク ター中に組み込み、 宿主細胞中に導入し培養することにより、. 目的のペプチドタ グを製造することができる。 製造されたペプチドタグは、 さらに、 常法により、 例えば、 ゲルクロマトグラフィー、 イオンカラムクロマトグラフィー、 アブイ二 ティークロマトグラフィー、 逆相カラムクロマトグラフィー、 硫安、 アルコール などを使用した溶解度差に基づく分画手法、 免疫吸着法などにより、 回収又は精 製することができる。
本発明のペプチドタグについては、 非還元条件下においてジスルフィ ド結合を 形成させることが好ましい。 例えば、 調製した本発明のペプチドタグを PH8の緩 衝液中に放置して空気酸化を受けさせることによりジスルフィ ド結合を形成させ ることができる。
本発明のペプチドタグには、 標識物質が付加されていてもよい。 標識物質が付 加されたペプチドタグ又はそのペプチドタグと結合したヒ ト IgGは、 高感度かつ 容易に検出することができる。 標識物質としては、 限定するものではないが、 例 えば、 ピオチン、 イミノビォチン、 ジゴキシゲニン、 蛍光タンパク質、 蛍光色素、 化学発光色素、 酵素、 放射性同位元素などがある。 具体的には例えば、 ビォチン、 イミノビォチン、 ジゴキシゲニン、 緑色蛍光タンパク質 （GFP) 、 黄色蛍光タン パク質 (YFP) 、 ェクオリン、 フルォレセィンなどが挙げられる。 これらの標識 物質を用いたタンパク質の標識方法は当業者には周知である。 例えば本発明のぺ プチドタグを Sulfo- NHS- LC- Biotin (Pierce) などの市販の試薬を用いてビォチ ン化修飾することによりぺプチドタグにビォチンを付加することもできる。 標識 物質は、 リンカーを介して本発明のぺプチドタグに付加されていてもよい。 この リンカ一は、 ペプチド、 脂肪酸、 脂肪酸エステルなどの、 タンパク質とペプチド との連結部を構成できる任意の物質であり うる。 リンカ一は、 タンパク質の立体 構造形成を阻害しないためのスぺーサ一として、 あるいはプロテアーゼ認識部位 を含む切断可能な連結部分として、 ペプチドタグとタンパク質との間に挿入され たものでもよい。
さらに本発明は、 本発明のぺプチドタグを提示した組換ぇバクテリオファージ にも関する。 このような組換えバタテリオファージは、 当業者に公知のファージ ディスプレイ法を用いて作製することができる。 例えば、 本発明のぺプチドタグ をコードする各種 DNAを T7ファージベクターなどのファージディスプレイライブ ラリ作製用のベクターに組み込み、 それをパクテリオファージ中にパッケージン グし、 増幅させることにより、 得られる組換えパクテリオファージに本発明のぺ プチドタグを提示させることができる。
本発明はまた、 本発明のペプチドタグと連結されたタンパク質からなる融合タ ンパク質にも関する。 本発明のぺプチドタグは、 任意のタンパク質の好ましくは N末端又は C末端に連結 （付加） されることにより、 そのタンパク質の 出/精製 用のァフィ二ティータグとして利用できる。 この融合タンパク質においては、 本 発明のぺプチドタグがリンカーを介して目的のタンパク質に連結されていてもよ レ、。 このリンカ一は、 タンパク質とペプチドとの連結部を構成できる任意の物質 であってよく、 例えば、 プロテアーゼ認識部位を含む切断可能な連結部分であつ てもよい。 これらの融合タンパク質は、 ヒト IgG又はその Fc領域 （特に、 酸変性 型ヒ ト IgG又はその Fc領域） と本発明のペプチドタグとの特異的結合性を利用し て、 容易に単離することができる。
上記のような融合タンパク質は、 例えば当業者に周知の遺伝子組換え法により 作製することができる。 例えば、 該タンパク質をコードする遺伝子と該ペプチド タグをコードする DNAとを、 読み枠が合うように発現ベクター中又は発現カセッ ト中に挿入し、 それを宿主細胞に導入し、 培養しながら発現させて、 産生される タンパク質を回収すればよい。 本発明のペプチドタグと融合させるべきタンパク 質としては、 限定するものではないが、 アミログリコシダーゼ、 アミラーゼ、 ィ ンべノレターゼ、 イソアミラーゼ、 プロテアーゼ、 パパイン、 ペプシン、 レンニン セノレラーセ、 ぺクチナ1 ~· i 、 リノ ' ίτ、 ラクタ"— ir . グノレコースォキシダーセ、 リゾチーム、 グルコースィソメラーゼ、 キモ トリプシン、 トリプシン、 チトクロ ーム、 セァプローゼ、 セラチオペプチダーゼ、 ヒアノレ口ニダ一ゼ、 ブロメライン, ゥロキナーゼ、 へモコアグラーゼ、 サーモライシン、 ウレァ一ゼ等の酵素；イン ターフェロン、 インターロイキン等のサイ ト力イン ； インスリン、 グノレ力ゴン、 セクレチン、 ガス トリン、 コレシス トキニン、 才キシトシン、 バソプレツシン、 成長ホルモン、 甲状腺刺激ホルモン、 プロラタチン、 黄体形成ホルモン、 濾胞刺 激ホルモン、 副腎皮質刺激ホルモン、 甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン、 黄体形 成ホルモン放出ホルモン、 副腎皮質刺激ホルモン放出ホルモン、 成長ホルモン放 出ホノレモン、 ソマ トスタチン等のホノレモン ； エンドノレフィン、 エンケフアリン、 ダイノルフィン等のオビオイ ドぺプチド ； フィプリノ一ゲン、 プロ トロンビン等 の血液凝固因子； SSI等のプロテアーゼインヒビター； さらに、 アルブミン、 グ ロブリン、 グロビン、 ケラチン、 コラーゲン等が挙げられる。
本発明は、 本発明のペプチドタグを固定化した固相担体にも関する。 ペプチド タグを固定化するのに用いる好適な固相担体としては、 限定するものではないが 例えば、 ボリスチレン、 ポリエチレン、 ポリプロピレン、 ポリエステル、 ポリア タリ ロニトリル、 スチレン一ブタジエン共重合体、 （メタ） アクリル酸エステル W 類ポリマー、 フッ素樹脂やシリカゲル系樹脂などの樹脂、 架橋デキス トラン、 ポ リサッカライド、 ァガロース等の高分子化合物、 ガラス、 金属、 磁性物質及びこ れらの組み合わせなどの基材が挙げられる。 そのような固相担体の形状は、 例え ば、 トレー、 球、 繊維、 粒子、 棒、 盤、 容器、 セル、 マイクロプレート、 試験管、 膜、 ゲル、 チップ （センサーチップなど） 等の任意の形状でよい。 具体的には例 えば、 磁性 （マグネッ ト） ビーズ、 ガラスビーズ、 ポリスチレンビーズ、 セファ ロースビーズ、 ポリスチレンプレート、 ガラスプレート、 ポリスチレンチューブ などが挙げられる。 これら固相担体への本発明のペプチドの固定化は、 当業者に 周知の方法を用いて行うことができ、 例えば物理的吸着法、 共有結合法、 イオン 結合法等によって行うことができる。
このように本発明のペプチドタグを固定化した固相担体は、 限定するものでは ないが、 例えば、 ヒ ト IgGを検出、 捕捉、 精製、 又は分離等するために、 特に酸 変性型ヒ ト IgGを検出、 捕捉、 精製、 又は除去するために、 好適に使用できる。 例えば、 本発明のペプチドタグを固定化した固相担体は、 ァフィ二ティークロマ トグラフィーカラム等のカラムに充填して、 ヒ ト IgGを高効率に検出、 捕捉、 精 製又は分離するために用いることができる。 より具体的な例としては、 ヒ ト IgG 含有試料を酸処理した後に、 そのような固相担体と接触させることにより、 ヒ ト IgGを高効率に固相担体上のぺプチドタグに結合させることができる。 あるいは、 ヒ ト IgG含有試料をそのような固相担体と接触させて、 該試料中の酸変性型ヒ ト I gGを特異的に捕捉し、 該試料からそれを除去することにより、 ヒ ト IgGをより均 一な品質で精製することもできる。 本発明の固相担体を充填した上記のような力 ラムも、 本発明に包含される。
本発明は、 本発明のペプチドタグをコードする核酸 （特に DNA) にも関する。 特に、 例えば配列番号 1〜1 1で示されるアミノ酸配列をコードする DNAは、 本 発明の好ましい態様である。 このような DNAは、 適当なベクター中に挿入し連結 することにより、 組換えベクターの形態で容易に取り扱うことができる。 本発明 のぺプチドタグをコードする DNAが挿入されるベクターは、 宿主細胞中で複製可 能なものであれば特に限定されないが、 例えば、 ファージベクターなどのウィル スベクター、 ファージミ ドベクター、 コスミ ドベクター又はプラスミ ドベクター 等が挙げられる。 本発明は、 このようなペプチドタグをコードする DNAを含むベ クタ一も提供する。
ファージベクターとしては、 限定するものではないが、 T7ファージディスプレ ィベクター （T7SelectlO- 3b、 T7Selectl-lbヽ T7Selectl-2a T7Selectl - 2b、 T7S electト 2c等 (Novagen) ) 、 ； Lファージベクター (Charon4A, Charon21A、 EMBL3 EMBL4、 え gtl0、 え gtll、 λ ZAP, え ZAPII等） が挙げられる。 またレトロウィル ス又はワクシニアウィルスなどの任意の動物ウィルスベクター、 パキュ口ウィル スなどの任意の昆虫ウィルスベクターを用いることもできる。 コスミ ドベクター としては、 限定するものではないが、 Lorist 6、 Charomid9- 20、 Charomid9 - 42な どが挙げられる。
プラスミ ドベクターとしては、 限定するものではないが、 大腸菌由来のプラス ミ ド （例えば pET22b (+)、 pBR322、 pBR325、 pUC118、 pUC119、 pUC18、 pUC19、 pBl uescript等） 、 枯草菌由来のプラスミ ド （例えば pUB110、 pTP5等）、 酵母由来の プラスミ ド （例えば YEpl3、 YCp50等）などが挙げられる。
本発明のペプチドタグをコードする DNA断片を含み、 かつ他のタンパク質をコ ードする遺伝子を挿入するための制限酵素切断部位を有するような、 本発明のぺ プチドタグを標識タグとして付加した融合タンパク質を作製するためのベクター も、 本発明のぺプチドタグをコ一ドする DNAを含むベクターの範囲に含まれる。 ベクター中にペプチドタグをコードする DNAを挿入するには、 まず、 精製され たべクタ一 DNAを適当な制限酵素で切断し、 露出した制限酵素部位に本発明のぺ プチドタグをコードする DNAをィン · フレームで挿入し連結する方法などが採用 される。
本発明の組換えベクターは、 ぺプチドタグをコードする DNAが宿主内で良好な 活性を有するぺプチドとして発現されるように、 組換え発現ベクターとして作製 することも好ましい。 この組換え発現ベクターを作製するために、 様々な宿主生 物に対応して各種が市販されている発現ベクターを用いることができる。 発現べ クタ一には、 通常、 転写プロモーター、 ターミネータ一、 リボソーム結合部位な どの宿主生物における発現に必須な各種エレメントの他、 選択マーカー、 リボー ター遺伝子、 ポリ リンカ一、 ェンハンサーなどのシスエレメント、 ポリ A付加シ ダナル、 リボソーム結合配列 （SD配列） 等の有用な配列を必要に応じて連結して もよい。 選択マーカーとしては、 例えばジヒ ドロ葉酸還元酵素遺伝子、 アンピシ リン耐性遺伝子、 ネオマイシン耐性遺伝子等が用いられうる。
以上のようなベクターには、 本発明のペプチドタグをコードする DNAを、 適切 に発現されるような位置及び向きで連結することが好ましい。 本発明のペプチド タグを組換え法により発現させる場合には、 ベクターはプロモーターを含む発現 ベクターであることが好ましい。
本発明は、 本発明のぺプチドタグをコードする DNAを含むベクターを導入した 形質転換体 （形質転換された、 単細胞、 カルス又は組織等） を作製し、 それを発 現可能な条件下で培養し、 培養細胞又は培養液中に産生された本発明のぺプチド タグを回収することにより、 該ペプチドタグを製造することができる。 本発明は、 このような形質転換体及ぴ該形質転換体を用いた本発明のぺプチドを製造する方 法も包含する。
形質転換には、 大腸菌や枯草菌等の細菌、 酵母細胞、 昆虫細胞、 動物細胞 （例 えば、 哺乳動物細胞） 、 植物細胞等、 任意の宿主細胞を使用できる。
形質転換には、 一般的に行われている手法、 例えば、 リン酸カルシウム法、 ェ レク トロポレーション法、 リポフエクション法、 パーティクルガン法、 PEG法等 を適用することができる。 形質転換体の選択は、 常法に従って行うことができる 力 S、 通常は使用した組換えベクターに組み込まれた選択マーカー又はリポーター タンパク質を利用して行う。
本発明の形質転換体を培養する方法は、 宿主生物の培養に用いられる通常の方 法に従って行われる。 例えば、 大腸菌や酵母細胞等の微生物を宿主として得られ た形質転換体を培養する培地としては、 宿主微生物が資化し得る炭素源、 窒素源、 無機塩類等を含有し、 形質転換体の培養を効率的に行える培地であれば、 天然培 地、 合成培地のいずれを用いてもよい。 培地には、 必要に応じてアンピシリンや テトラサイクリン等の抗生物質を添加してもよい。
プロモーターとして誘導性のものを用いた発現べクタ一で形質転換した宿主生 物 （微生物） を培養する場合は、 必要に応じてインデューサーを培地に添加して もよい。 例えば、 Lacプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物 を培養するときにはイソプロピル- 1 -チォ- j3 -D-ガラクトシド（IPTG)等を、 trp プロモーターを用いた発現べクタ一で形質転換した微生物を培養するときにはィ ンド一ル酢酸（IAA)等を培地に添加してもよい。
培養条件は特に限定されないが、 好ましくは形質転換に用いる宿主生物に適し た条件下で行われる。
培養後、 発現された本発明のぺプチドタグが宿主細胞内に生産される場合には その細胞を破碎する。 一方、 その本発明のペプチドタグが細胞外に分泌される場 合には、 培養液をそのまま使用するか、 遠心分離等により細胞を除去し、 培養上 清を得る。 得られた液中に、 本発明のペプチドタグが含まれる。 本発明では、 形 質転換を行う代わりに、 無細胞翻訳系を使用して本発明のペプチドタグを生産し てもよい。
「無細胞翻訳系」 とは、 大腸菌等の宿主生物の細胞構造を機械的に破壊して得 た懸濁液に、 翻訳に必要なアミノ酸などの試薬を加え、 試験管中などの in vitro 転写翻訳系又は in vitro翻訳系を構成したものである。 無細胞翻訳系としては、 有利に使用可能なキットが市販されている。
産生された本発明のぺプチドタグは、 ぺプチドの単離精製に用いられる一般的 な生化学的方法、 例えば硫酸アンモニゥム沈殿、 ゲルクロマトグラフィー、 ィォ ン交換ク口マトグラフィー、 ァフィ二ティークロマトグラフィー、 逆相クロマト グラフィ一等を単独で又は適宜組み合わせて用いることにより、 上記培養物中 （ 細胞破砕液、 培養液、 又はそれらの培養上清中'） あるいは無細胞翻訳系の溶液中 から単離精製することができる。 しかしながら、 場合により、 遠心分離や限外濾 過型フィルタ一等を用いて採取又は濃縮した培養上清や溶菌液上清、 あるいはそ れらの上清をさらに硫安分画後に透析にかけるなどして得た溶液を、 そのまま I g G結合性試験等に使用してもよい。
2 . ペプチドタグの IgG結合性及びそれを利用したヒ ト IgGの検出、 精製、 捕捉又 は分離
本発明では、 ヒ ト IgG Fc領域、 特に酸変性型のヒト IgG Fc領域に特異的に結合 できる本発明のペプチドタグを用いることにより、 試料中のヒ ト IgG又はその Fc 領域を含む断片を高感度に検出、 捕捉、 精製又は分離'等 ΐ "ることができる。 特に 本発明では、 本発明のペプチドタグを用いることにより、 試料中の酸変性型ヒ ト
IgG又はその Fc領域を含む断片を高感度に検出、 捕捉、 精製、 又は除去等するこ とができる。
ヒト IgG又はその Fc領域を含む断片に対する本発明のペプチドタグの結合状態 は、 解離定数 Kd、 ァフィ二ティー定数 Ka、 結合速度定数 ka、 及ぴ解離速度定数 kd などを指標として表すことができる。
解離定数 Kd及ぴァフィニティー定数 は、 平衡状態にある 2分子間の結合親和 性、 すなわち結合の強さを示す指標であり、 解離定数 Kdはァフィユティー定数 Ka の逆数である。 そして解離定数 Kdの値が小さいほど、 結合が強いことを意味する。 一方、 平衡状態にある 2分子間の結合 ·解離反応の速さは、 反応速度論的解析に よって求められる結合速度定数 ka (konとも表記される） 及び解離速度定数 kd (k offとも表記される） によって示される。 結合速度定数 kaは解離速度定数 kdの逆 数である。 解離速度定数 kaの値が大きいほど、 すみやかに解離し、 結合状態がよ り短期間しか保持されないことを意味する。 従って同等の解離定数 Kdを示す場合 でも、 ゆっく り会合するがゆっく り解離する場合 （kaと kdの値が共に小さい） と、 速やかに会合し速やかに解離する場合 （kaと kdの値が共に大きい） とがあり、 そ れぞれの結合保持状態は全く異なる。
ヒ ト IgGに対する本発明のぺプチドタグの結合状態を示すこれらの解離定数 Kd、 ァフィ二ティー定数 Ka、 結合速度定数 ka、 及び解離速度定数 kdなどは、 当業者に 周知の任意の分子間相互作用測定法を用いて決定することができる。 特に本発明 においては、 ヒ ト IgG (又はヒ ト IgGの Fc領域を含む断片） に対する本発明のぺプ チドタグの結合状態を、 表面プラズモン共鳴スぺク トル解析によって測定するこ とが好ましい。 表面プラズモン共鳴スペク トル解析は、 限定するものではないが、 バイオセンサー （生体分子間相互解析装置） である BIAC0REシステム （BIAC0RE社 ) 、 例えば BI AC0RE2000を用いて行うことができる。
BIAC0REシステムとは、 表面プラズモン共鳴スペク トル （SPR) の原理に基づき、 生体分子の相互作用 （結合および解離） を、 標識を用いることなく、 リアルタイ ムでモニターできる解析装置である。 表面プラズモン共鳴の原理については詳細 な解説書が多数刊行されている （例えば、 橋本せつ子著、 「表面プラズモン共鳴 現象を利用する生体分子相互作用の解説」 、 分析 1997年 5月号、 （1997) (社）に 本分析化学会発行、 362〜368頁など） 。 この装置で用いる原理を簡単に説明すれ ば、 金膜上で物質を結合/解離させて、 その結合/解離によるチップ上の質量変 化に伴う反射光の屈折率の変化を測定することにより、 金膜上に結合した物質の 量を算出するというものである。 より具体的には、 該装置では、 センサーチップ と呼ばれる金膜が貼られたガラス基板が、 試料や試薬を流す流路の途中にその流 れに曝露されるように設置されており、 その流路に試料等を流しながら、 センサ 一チップに 760nmの偏光をプリズム等でくさび型に集光させ、 金膜上で反射させ て、 その反射光の屈折率をモニターすると、 金膜上の物質の結合量の変化に比例 して、 表面プラズモン共鳴スぺクトルの角度の変化が示される。 そこで BIAC0RE システムでは、 まずリガンドを流路に流して予めセンサーチップの金膜上にリガ ンドを固定化し、 次いでリガンドが結合していない部位をプロッキングした後、 そのリガンドとの結合/解離反応を調べるべき物質 （アナライ ト） を流路に流し つつ、 経時的に反射光の屈折率をモニターすることにより、 その変化量から、 リ ガンドとアナライ トとの結合量を算出することができる。 このシステムでは、 表 面プラズモン共鳴スぺタトノレの角度 0. 1° の変化を 1000レスポンスユニット （RU ) と定義し、 レスポンスユニットを単位とする値 （RU値） に基づいて反射光の屈 折率の変化を表す。 ここで 1レスポンスユニット （RU) はセンサーチップ表面上 での lpg/ lmm2の質量変化に相当する。 すなわち、 センサーチップ上の金膜への 物質の結合量は、 物質の結合前 （添加前） の時点と結合完了時点の RU値の差から 算出できる。 従って BIAC0REシステムを用いれば、 リガンド （例えば、 本発明の ペプチドタグ） とアナライ ト （例えば、 試料中の IgG抗体） との結合量をセンサ 一チップ lmm2当たりの RU値として求めることができ、 その結合量 （RU値） がリガ ンドへのアナライ トの結合能に相当する。 表面プラズモン共鳴スペク トル解析で は、 その結合能 （結合量） の変化を示す結合曲線に基づいて、 その初速度から結 合速度定数 ka及び解離速度定数 kdを求めることができ、 さらにその結合速度定数 ka及ぴ解離速度定数 kdの値から解離定数 Kd及びァフィニティ一定数 Kaを求めるこ とができる （Kd=kd/ka) 。 この解析には通常は解析ソフ ト BIA evaluation (Bi acore) を用いる。
なお BIACOREシステムで使用されうるセンサーチップには、 該チップに固定化 する物質 （リガンド） 、 固定化方法、 使用目的などに応じていくつかの種類があ り、 例えば、 最もスタンダードな CM5 (ガラス面に金膜 （典型的には 50nm) 力 S貝占 られ、 その上にデキストラン層 （典型的には lOOnm) を備える。 アミノ基、 チォ ール基、 アルデヒ ド基を介してリガンドを固定化する） 以外にも、 CM4、 CM3、 CI SA， Series S、 NTA、 Ll、 HPAなどがある。
本発明においてセンサーチップへのリガンドの固定化は、 例えば BIAC0REシス テムのメーカー使用説明書に従って実施すればよいが、 例えばセンサーチップ CM 5へのアミンカップリングによって行うことができる。 固定化方法は、 例えば、 物理的吸着による方法または共有結合による吸着であってもよい。 例えば、 セン サーチップ SA上のストレプトァビジンへのピオチン化ぺプチドタグの結合によつ て固定化することもできる。 一例として、 センサーチップとしてセンサーチップ SA (BIACORE社） を用いる場合には、 ビォチン化したペプチド （50 M) を流路 （ フロ一セル等) に流し、 センサ一チップ上のデキストラン中に固定化されたスト レプトアビジンにペプチドを固定化する。 次いで、 例えば酸変性型ヒ ト IgGを含 む試料 (アナライ ト溶液) を流路に流し、 チップ上のぺプチドタグ (リガンド) と、 試料中のヒ ト IgG等 （アナライ ト） との結合量を算出する。 限定するもので はないが、 この解析に使用できる BIAC0RE2000の測定条件の一例を下記に示す。
ラン-ング緩衝液： HBS- Tバッファー
流速： 10 μ 1/分 '
反応温度： 25°C
再生溶液： 0. 2M ダリシン- HC1緩衝液 （PH 2. 7)
リ ンド固定化量： 400〜1000 RU
固定化反応時の pH： pH7. 0
このような測定で得られた結合 Z解離曲線に基づき、 結合後の RU値から結合前 の RU値を差レ引いた RU値を、 例えば、 アナライ トである酸変性型ヒ ト IgGとリガ ンドであるべプチドタグとの 1讓2当たりの結合量、 すなわちそのべプチドタグの 酸変性型ヒ ト IgGへの結合能を示す値として用いることができる。 本発明のペプチドタグと、 酸変性型ヒ ト IgGとの結合状態を示す解離定数 Kd、 ァフィ二ティー定数 Ka、 結合速度定数 ka、 及ぴ解離速度定数 kdは、 上記のような 条件に従って表面プラズモン共鳴スぺク トル解析により求めることが特に好まし レ、。 この解析によれば、 本発明のペプチドタグと酸変性型ヒ ト IgG (例えば、 ポ リクローナルヒ ト IgG (Sigma社） 中の酸変性型ヒ ト IgG) との結合に関する解離 定数 Kdは、 好ましくは 0. 1ηΜ〜50ηΜ、 例えば 10nM〜50nMである。 これは、 本発明 のペプチドタグの酸変性型ヒ ト IgGとの結合力は、 従来の多くの IgG結合性ぺプチ ドと比べるとかなり強いことを示している。 一方、 本発明のペプチドタグと酸変 性型ヒ ト IgGとの結合についての解離速度定数 kdは、 好ましくは l(T3sec -1〜 10— 5se c— 1である。 この解離速度定数 kd値は、 ヒ ト IgGの一般的な解離速度定数 （10— 4〜1 0一6 sec— とほぼ同等であり、 本発明のぺプチドタグは酸変性型ヒ ト IgGに対する 結合を十分保持できることが示される。
本発明のペプチドタグとヒ ト¾(}、 特に酸変性型ヒ ト IgGとは、 非還元条件下で 上記のような結合を示す。 本発明において 「非還元条件下」 とは、 ジスルフイ ド 結合の開裂が引き起こされないような還元的状態を意味する。 より具体的には、
「非還元条件下」 とは、 例えば、 ジスルフイ ド結合を開裂させる還元剤 （例えば、 DTT) 、 その開裂を引き起こすような量で反応系に含まれないことを意味する。 本発明では、 以上のような本発明のペプチドタグの酸変性型ヒト IgGへの高い 結合性を利用して、 試料中のヒ ト IgG又はその Fc領域を含む断片を成功裡に検出 することができる。 本発明のペプチドタグは酸変性型ヒト IgG Fc領域との結合を 安定に保持できるため、 高い感度での検出が可能になる。
例えば本発明は、 以下の工程 a)〜 ：
a) 試料を酸処理する工程、
b) 本発明のぺプチドタグを酸処理した試料と接触させる工程、
c) 工程 b)で生じた、 ペプチドタグとヒ ト IgG又はその Fc領域を含む断片との結 合を測定する工程、
を含む、 試料中のヒ ト IgG又はその Fc領域を含む断片を検出する方法にも関する。 本発明のこの検出方法は、 ヒ ト IgG又はヒ ト IgGの Fc領域を含む断片を含むか又 は含む可能性がある任意の試料に適用できる。 好適な試料の例としては、 限定す るものではないが、 血液、 体液 （唾液、 精液、 涙、 消化液、 腹水など） 、 組織、 組織液、 細胞、 細胞抽出液、 培養物などの生体試料が挙げられる。 この生体試料 は、 臨床検査標本であってもよい。 好適な試料の他の例としては、 モノクローナ ルヒ ト IgG産生ハイプリ ドーマの培養上清、 免疫学的測定サンプルも挙げられる。 試料は、 酸変性した状態でペプチドタグと接触させることが好ましい。 そのため、 ぺプチドタグと接触させる前に、 上述したような酸処理により試料中の IgG等を 酸変性させる。 酸処理した試料は、 ペプチドタグと接触させる前に pHを中和する ことが好ましい。 あるいは試料は、 もともと酸性条件下で調製又は採取されたも のであってもよく、 そのような試料については酸処理工程を省略して 「酸処理し た試料」 として用いることもできる。 また試料は、 溶液又は懸濁液などの液体状 に調製された状態で、 本発明のぺプチドタグと接触させることが好ましい。
本発明のペプチドタグを試料と接触させるには、 例えば、 酸処理した試料を本 発明のペプチドタグに添加すればよく、 その逆でもよい。 本発明のペプチドタグ と酸処理した試料との接触は、 非還元条件下で行うことが好ましい。 結合検出に 用いる手法によっては、 本発明のペプチドタグを試料と接触させた後、 本発明の ぺプチドタグから、 未結合物質を洗浄又は分画等によって除去することが好まし い。 試料中にヒ ト IgG又はその Fc領域を含む断片が存在すれば、 試料を酸処理し た後に本発明のペプチドタグをその試料と接触させることにより、 試料中のヒ ト IgG又はその Fc領域を含む断片の少なくとも一部が酸変性型になり、 それと本発 明のペプチドタグが高効率で結合することになる。 ここで 「工程 a)で生じた、 ぺ プチドタグとヒ ト IgG又はその Fc領域を含む断片との結合」 とは、 本発明のぺプ チドタグと酸処理した試料との接触によって生じた、 有意な量のぺプチドタグが 主に酸変性型ヒ ト IgG又はその Fc領域を含む断片と結合している状態を意味する。 ペプチドタグとヒト IgG又はその Fc領域を含む断片との結合は、 当業者に周知 の任意の分子間相互作用測定法によつて測定することができる。 そのような測定 法としては、 限定するものではないが、 例えば免疫沈降法、 ゲルシフトアツセィ、 ELISA法、 表面プラズモン共鳴解析、 水晶振動子マイクロバランス法 （Quartz Cr ystal Microbalance (QCM) ；瀬尾眞浩著、 「水晶振動微量天秤法」 、 表面技術、 Vol. 45- No. 10、 (1994) p. 1003- 1008、 米国特許 5869763) 、 蛍光相関解析法 （Flu orescencce Correlation Spectroscopy; FCS) 、 他項目蛍光強度分布解析法 (F1 uorescence Intensity Multiple Distribution analysis (FIMDA) ) 、 相 _ΐ fe 角军析法 (Fluorescence Cross-Correlation Spectroscopy (FxCS) ) などカ挙げ られる。 これらの方法は当業者に周知であり、 またそれぞれの方法に対応した測 定機器や測定用試薬も多数販売されている。 本発明においては、 例えば検出後に ペプチドタグと結合したヒ ト IgGを分離精製可能な点で、 表面プラズモン共鳴解 析を用いて結合を測定することが特に好ましい。 上記結合の測定は、 本発明のぺ プチドタグと酸処理した試料とを接触させる工程と同時に又は連続的に行っても , よい。 .
測定の結果、 上記結合が認められた場合は、 試料中に含まれるヒ ト IgG又はそ の Fc領域を含む断片の存在を検出できたことになる。
この方法によれば、 ヒ ト IgG又はその Fc領域を含む断片が、 試料中に単独で存 在していても、 標識物質などの他の物質に結合した状態で存在していても、 うま く検出することができる。 本発明の方法により、 任意のタンパク質末端に融合さ れたヒ ト IgG等、 ファージベクターに提示されたヒ ト IgG等、 固相担体に固定化さ れたヒ ト IgG等も、 検出できる。 本発明では、 このように他の物質と結合したヒ ト IgG又はその Fc領域を含む断片を検出する場合も、 「ヒ ト IgG又はその Fc領域を 含む断片の検出」 に含めるものとする。
この方法は、 特に、 生化学分野や分子生物学分野でよく利用されるヒ ト Fc融合 タンパク質 （ヒ ト Fc断片と任意のタンパク質との融合タンパク質） 、 例えば、 TN Fレセプターの細胞外ドメインとヒ ト Fc断片との融合タンパク質などの検出にも、 好適に使用できる。
本発明では、 本発明のペプチドタグの酸変性型ヒ ト IgGへの高い結合性を利用 して、 試料中のヒ ト IgG又はその Fc領域を含む断片を成功裡に分離又は精製する こともできる。 本発明のペプチドタグは酸変性型ヒト IgG Fc領域との結合を安定 に保持できるため、 高い回収効率での分離又は精製が可能になる。
例えば本発明は、 以下の工程 a)及ぴ b) ：
a) 本発明のペプチドタグを酸処理した試料と接触させて、 それにより試料中 のヒ ト IgG又はその Fc領域を含む断片をぺプチドタグに結合させる工程、 b) 工程 a)でペプチドタグに結合したヒ ト IgG又はその Fc領域を含む断片を、 試 料から分離する工程、
を含む、 試料中のヒ ト IgG又はその Fc領域を含む断片を精製する方法にも関する。 本発明のこの IgG分離又は精製方法は、 ヒ ト IgG又はヒ ト IgGの Fc領域を含む断 片を含むか又は含む可能性がある任意の試料に適用できる。 試料については、 上 記検出方法に記載した通りであり、 同様に、 酸変性した状態でペプチドタグと接 触させることが好ましい。 そのため、 ペプチドタグと接触させる前に、 上述した ような酸処理により試料を酸変性させる。 あるいは試料は、 もともと酸性条件下 で調製又は採取されたものであってもよく、 そのような試料も 「酸処理した試料 」 として用いることができる。 酸処理した試料は、 ペプチドタグと接触させる前 に pHを中和することが好ましい。
本発明のペプチドタグを試料と接触させるには、 例えば、 酸処理した試料を本 発明のペプチドタグに添加すればよく、 その逆でもよい。 本発明のペプチドタグ と酸処理した試料との接触は、 非還元条件下で行うことが好ましい。 本発明のぺ プチドタグを酸処理した試料と接触させることにより、 試料中のヒ ト IgG又はそ の Fc領域を含む断片の少なくとも一部が酸変性型になり、 それと本発明のぺプチ ドタグが結合することになる。
本発明のぺプチドタグを酸処理した試料と接触させた後、 その接触によりぺプ チドタグに結合したヒ ト IgG又はその Fc領域を含む断片を、 生体分子の分離精製 に用いられる当業者に周知の手法により、 試料から分離することができる。 例え ば、 カラム、 プレート、 センサーチップなどの固相担体に固定化されたペプチド タグを用いた場合であれば、 接触後の固相担体をぺプチドタグが遊離しない条件 で洗浄することにより、 固相担体上のペプチドタグに結合したヒ ト IgG又はその F c領域を含む断片を、 試料中の他の成分から分離することができる。 あるいは、 磁性ビーズのような固相担体に固定化されたぺプチドタグを用いた場合には、 接 触後の磁性ビーズ等を試料から磁石などで取り出し、 好ましくはさらに洗浄する ことにより、 磁性ビーズ上のペプチドタグに結合したヒ ト IgG又はその Fc領域を 含む断片を、 試料中の他の成分から分離することができる。 この分離工程は、 本 発明のペプチドタグと試料との接触工程と同時に （又は並行して） あるいは連続 的に行ってもよい。 例えば、 本発明の方法において例えば表面プラズモン共鳴解 析法ゃクロマトグラフィ一法を用いる場合には、 アプライされた試料溶液中のヒ ト IgG等が固定化されたぺプチドタグに接触し結合してそこに保持されるのと同 時に、 試料溶液中の他の成分はペプチドタグに結合されずに流出し、 ペプチドタ グに結合したヒ ト IgG等とは分離される。
試料から分離された、 ペプチドタグに結合したヒト IgG又はその Fc領域を含む 断片については、 その IgG等の存在をウェスタンブロッティング等により確認し てもよい。
必要に応じて、 分離したペプチドタグと酸変性型ヒト IgG又はその Fc領域を含 む断片との結合体 （conjugate) から、 さらにヒ ト IgG又はその Fc領域を含む断片 を遊離させ、 単離することもできる。 ヒ ト IgG又はその Fc領域を含む断片は、 限 定するものではないが、 例えば酸性条件下に置くことによって、 ペプチドタグか ら遊離させることもできる。 そのような酸性条件は、 当業者であれば容易に調整 することができるが、 例えばグリシン-塩酸 （pH2. 1) などの酸性の溶液を、 ぺプ チドタグと結合したヒ ト IgG又はその Fc領域を含む断片に添加すればよい。 ヒ ト I gG又はその Fc領域を含む断片は、 透析法によりべプチドタグから分離させてもよ い。 ペプチドタグから遊離させたヒ ト IgG又はその Fc領域を含む断片は、 当業者 に周知のタンパク質精製法 （各種クロマトグラフィー法、 免疫沈降法など） を用 いてさらに精製してもよい。
この方法により、 試料中に単独で存在しているヒ ト IgG又はその Fc領域を含む 断片も、 標識物質などの他の物質に結合したヒト IgG又はその Fc領域を含む断片 も、 好適に分離又は精製することができる。 本発明の方法により、 任意のタンパ ク質末端に融合されたヒ ト IgG等、 ファージベクターに提示されたヒ ト IgG等、 磁 性ビーズなどの固相担体に固定化されたヒ ト IgG等も、 分離又は精製できる。 本 発明の方法は、 特に、 生化学分野や分子生物学分野でよく利用されるヒ ト Fc融合 タンパク質 （ヒ ト Fc断片と任意のタンパク質との融合タンパク質） 、 例えば、 TN Fレセプターの細胞外ドメインとヒ ト Fc断片との融合タンパク質などの分離又は 精製にも、 好適に使用できる。 本発明では、 このように他の物質と結合したヒ ト IgG又はその Fc領域を含む断片を精製する場合も、 「ヒ ト IgG又はその Fc領域を含 む断片の精製」 に含めるものとする。
さらに本発明では、 本発明のペプチドタグの酸変性型ヒ ト IgG又はその Fc領域 への高い結合性を利用して、 試料中にもともと存在する酸変性型ヒ ト IgG又はそ の Fc領域を含む断片を捕捉し、 該試料から分離 （除去） することもできる。 この 方法を利用すれば、 例えば、 ヒト IgGを含有する試料から、 混在する酸変性型の ヒト IgG又はその Fc領域を含む断片を除去し、 ヒ ト IgGを均一かつ高純度に精製す ることができる。
従って、 本発明は例えば、 以下の工程 a)及び b) ：
a) 本発明のペプチドタグを試料と接触させる工程、 及び
b) 工程 a)でペプチドタグに結合したヒ ト IgG又はその Fc領域を含む断片を、 試 料から除去する工程。
を含む、 試料から酸変性型ヒ ト IgG又はその Fc領域を含む断片を除去する方法に も関する。
また本発明は、 例えば、 以下の工程 a)〜c) ：
a) 本発明のペプチドタグを、 ヒ ト IgG又はその Fc領域を含む断片を含有する試 料と接触させて、 それにより該試料中の酸変性型ヒ ト IgG又はその Fc領域を含む 断片をぺプチドタグに結合させる工程、
b) 工程 a)でペプチドタグに結合した酸変性型ヒ ト IgG又はその Fc領域を含む断 片を、 試料から分離する工程、
c) 前記分離後の試料を揉取する工程、
を含む、 ヒ ト IgG又はその Fc領域を含む断片の精製方法にも関する。
このような酸変性型ヒ ト IgG等の除去法 （ヒ ト IgG等の精製法） は、 従来のヒ ト IgG精製技術の様々な問題を克服することができる。 例えば、 抗体医薬等の抗体 生産におけるプロテイン Aカラムを用いたヒ ト抗体の精製においては、 酸性 （典 型的には PH2. 1〜2. 7) の溶液を用いてカラムから抗体を溶出することが一般的で ある。 しかしこの方法では主として溶出時の酸処理により一部の抗体が変性し、 その結果、 得られる抗体製品の品質が低下する。 そして、 このようにして変性し た抗体を除去するためには、 通常、 イオン交換法やゲルろ過法などの比較的煩雑 な操作をさらに必要とする。 しかし本発明のペプチドタグ、 例えば本発明のぺプ チドタグを固定化したァフィ二ティカラムを用いれば、 一段階の操作により、 酸 変性した IgG抗体を効率的に除去することができる。 また、 プロティン Aカラムを 用いたヒ ト抗体の精製においては、 酸性 （典型的には 112. 1〜2. 7) 溶液で抗体を カラムから溶出する場合、 収率が大幅に低下 （60〜80%) するという問題もある。 これは、 酸処理により変性しコンフオメーシヨンが変化した抗体が凝集しやすく なること、 そのように凝集した抗体は樹脂と結合して溶出されにくくなることに 起因するものと考えられる。 本発明では、 このようなヒ ト IgGの回収率の低下を 避けるため、 本発明のペプチドタグに例えば可溶化能の高 、PEGや糖を付加し、 それを酸性溶出液に添加することにより、 酸変性した抗体と PEGや糖を付加した 本発明のペプチドタグとをカラム中で速やかに結合させて、 抗体がカラム樹脂に 吸着されることなく回収されるようにすることができる。 回収した抗体からは、 透析操作などにより、 結合した本発明のペプチドタグを除去することもできる。
3 . その他の実施形態
ぺプチドタグの IgG結合性を利用したタンパク質の精製
本発明のペプチドタグと酸変性型ヒ ト IgGとの高い結合性を利用すれば、 その ペプチドタグが付加 （連結） されたタンパク質を特異的に分離することができる。 本発明では、 このことを利用して、 本発明にかかるペプチドタグを目的のタンパ ク質に付加し、 そのタンパク質を、 酸処理したヒ ト IgG又はその Fc領域を含む断 片を用いて分離精製する方法も提供する。
例えば本発明は、 以下の工程 〜 c) ：
a) 本発明のぺプチドタグを連結したタンパク質からなる融合タンパク質を作 製し、 'それを含む試料を調製する工程、
b) 工程 a)で調製した試料を酸処理したヒ ト IgG又はその Fc領域を含む断片と接 触させて、 それにより融合タンパク質を該ヒ ト IgG又はその Fc領域を含む断片と 結合させる工程、
c) 工程 b)でヒ ト IgG又はその Fc領域を含む断片に結合した融合タンパク質を、 試料から分離する工程、
を含む、 タンパク質の精製方法に関する。 上記の融合タンパク質は、 本発明のペプチドタグが、 好ましくは N末端または C 末端に付加 （連結） されたタンパク質を言う。 この融合タンパク質は、 ペプチド タグと目的のタンパク質との間に、 切断可能な連結部分 （例えばプ口テァーゼ認 織部位） を含むリンカ一を有していてもよい。
融合タンパク質は、 分離精製すべき任意のタンパク質の好ましくは N末端又は C 末端に、 例えば組換え法などにより、 本発明のペプチドタグを連結することによ り作製することができる。 より具体的には、 例えば、 ベクター中に組み込まれた 本発明のぺプチドタグをコードする DNAの 5'側又は 3'側に、 目的のタンパク質を コードする DNA断片をイン · フレームで揷入した組換え発現ベクターを作製し、 それを宿主細胞に導入して形質転換体を作製し、 発現可能な条件下 （例えば、 発 現誘導物質の存在下） で培養し、 産生された融合タンパク質をその培養液又は培 養細胞から回収することにより、 ぺプチドタグとタンパク質部分とからなる一本 のポリぺプチドを融合タンパク質として取得することができる。
本発明の方法では、 好ましくは、 まずそのような融合タンパク質を作製し、 そ れを含む試料を調製する。 試料は、 限定するものではないが、 好ましくは溶液又 は懸濁液などの液体調製物であることが好ましい。
一方、 ヒト IgG又はその Fc領域を含む断片は、 ビーズ、 カラム、 プレートなど の固相担体に固定化したものを用いることがより好ましい。 ヒ ト IgG又はその Fc 領域を含む断片は、 試料と接触させる前に、 酸処理しておくことが好ましい。 酸 処理は、 上述の通り行えばよいが、 例えば、 ヒ ト IgG又はその Fc領域を含む断片 を含有する溶液を pHl. 5〜 2. 7に調整して少なくとも 5分間処理することによって 行うことができる。 このような酸処理により、 ヒ ト IgG又はその Fc領域を含む断 片が酸変性型に変化し、 本発明のぺプチドタグを有する融合タンパク質の捕捉効 率を大幅に向上させることができる。 酸処理した試料は、 ペプチドタグを有する 融合タンパク質と接触させる前に pHを中和することが好ましい。 このような酸処 理したヒ ト IgG又はその Fc領域を含む断片に、 上記の通り調製した融合タンパク 質を含む試料を接触させると、 試料中の融合タンパク質が、 ペプチドタグを介し て、 酸変性型となったヒ ト IgG又はその Fc領域を含む断片に結合する。
この方法では、 そのようにしてヒ ト IgG又はその Fc領域を含む断片に結合した 融合タンパク質を、 さらに試料から分離することが好ましい。
以上のような試料と酸処理したヒ ト IgG又はその Fc領域を含む断片との接触ェ 程、 及ぴ融合タンパク質の試料からの分離工程は、 基本的には上述した本発明の 検出又は精製方法と同様にして行えばよい。
さらに、 融合タンパク質が切断可能な連結部分 （例えば、 プロテアーゼ認識部 位） を含むリンカ一を有する場合には、 融合タンパク質を試料から分離した後、 さらにプロテアーゼ処理などの切断操作に供して本発明のぺプチドタグと目的の タンパク質とを切り離し、 それらを単独で回収及ぴ精製することもできる。
この本発明のタンパク質精製方法によれば、 目的のタンパク質を、 高いトラッ プ効率で簡便かつ特異的に分離精製することができる。
ャット
本発明は、 本発明のペプチドタグ、 そのペプチドタグを提示した組換えバクテ リオファージ、 そのべプチドタグに連結されたタンパク質からなる融合タンパク 質、 そのペプチドタグを固定化した固相担体、 そのペプチドタグをコードする DN Aを含むベクター、 及ぴそのベクターを含む形質転換体のうち少なくとも 1つを 含む、 ヒ ト IgG又はヒト IgG Fc領域を含む断片を検出又は精製するためのキット も提供する。 本キットは、 上記の本発明のヒ ト IgG等の検出又は精製方法におい て、 本発明のぺプチドタグを提供するために好適に使用することができる。
さらに本発明は、 本発明のペプチドタグをコードする DNA、 本発明のペプチド タグをコードする DNAを含むベクター (特に、 発現ベクター） 、 及ぴそのべクタ 一を含む形質転換体のうち少なくとも 1つを含む、 酸変性型ヒ ト IgGとの結合性 を利用して容易に精製可能な精製タグ融合タンパク質を製造するためのキットを 提供する。 「精製タグ」 とは、 Hisタグや GSTタグなどの、 タンパク質のアブイ- ティー精製を容易にする付加的べプチド配列を意味する。 「精製タグ融合タンパ ク質」 は、 ここでは特に、 本発明のペプチドタグが付加 （連結） された融合タン パク質を指す。
本キットを利用して、 目的のタンパク質をコードする DNAを本発明のペプチド タグをコードする DNAとイン · フレームで連結した DNA断片を含む発現ベクターを 作製し、 それを発現条件下に置くことにより （例えば、 その発現ベクターを用い て宿主細胞を形質転換し、 得られた形質転換体を発現誘導物質の存在下で培養す ることにより） 、 本発明のペプチドタグが連結された融合タンパク質を生産する ことができる。 実 施 例
以下、 実施例を用いて本発明をさらに具体的に説明する。 但し、 本発明の技術 的範囲はこれら実施例に限定されるものではない。
なお、 下記実施例で用いたポリクローナルヒ ト IgG抗体、 ポリクローナルヒ ト 抗体 IgGl、 IgG2、 IgG3、 IgG4、 ポリクローナルヒ ト IgA抗体、 ポリクローナルヒ ト IgE抗体、 ポリクローナルマウス抗体 IgG、 IgA、 IgEは、 Sigma社より購入した。 また、 ペプチドのシスティン残基間のジスルフィ ド （S- S) 結合の形成は、 pH8の 緩衝液中での空気酸化によって行い、 その後、 逆相 HPLCと MALDI- T0F質量分析を 用いて確認した。 [実施例 1 ] ヒ ト抗体結合モチーフの探索
1) T7ファージランダムペプチドライブラリの構築
C - (X) w。- C又は（X) 3-C- (X) 8_10-C- (X) 3の 8つのアミノ酸配列パタ一ンを示すラン ダムなペプチドを T7ファージ上に提示 （display) するライブラリを、 T7Selectl 0-3b ベクター (Novagen) を用レヽ、 T7Select(R) System Manual (Novagen) ίこ従つ て、 それぞれ構築した。 Τ7ファージランダムペプチドライブラリの作製の詳細に ついては Krumpe LR, et al. , Proteomics, (2006) 6 (15)： p. 4210-4222、 及び T7 Select (R) System Manual (Novagen) を参照されたい。 なお C- (X) 8 t。- Cとは、 N末 端及び C末端のシスティ.ン残基 （Cys) の間に連続した 8〜10個の任意のアミノ酸 残基 （X) が挟まれたペプチド配列を表す。 また（X -C- ^-iXX^とは、 N末端 から C末端に向かって、 連続した 3個の任意のアミノ酸残基、 システィン残基 （Cy s) 、 連続した 8〜10個の任意のアミノ酸残基、 システィン残基、 及ぴ連続した 3 個の任意のアミノ酸残基が連結したぺプチド配列を表す。
簡単に説明すると、 T7Select Cloning Kit (Novagen) を用いて、 上記ランダ ムぺプチドをコ一ドする DNA断片集団を T7SelectlO- 3bベクター中にクローニング W 200 し、 それをファージ中にパッケージングし、 増幅することにより、 ライブラリを 作製した。 作製したライブラリにおいては、 上記ペプチドが T7 1.0Bキヤプシドタ ンパク質 （約 348アミノ酸） の C末端側に融合されて発現され、 ファージ表面に提 示された。
2) ヒト IgGに対するバイオパンニング
96穴のマイクロプレート （Nunc, Maxisorp) の各ゥエルにヒ ト IgG (500 ng/10 0〃 1/ゥエル；血清由来ポリクローナル抗体 （以下同じ） ) をコートし、 0. 5%BS Aを添加してブロッキングした。 そのゥヱルに、 0. 5%BSAを含む PBS中に溶解した 上記 1)で作製したファージライブラリ （5. 0 X 101Qpfu) を加え、 室温で 1時間反 応させた。 反応後のゥェルを PBS/0. 1% Tween20 (PBST) で洗浄した後、 大腸菌 B LT5615を加え、 ファージ感染後に回収して、 ファージ増殖のため培養した。 10% (W/V) PEGによって培養後の上清からファージを回収し、 それをさらに次のパン ニングに用いた。 このバイオパンニングプロセスを合計 5ラウンド繰り返して、 ヒ ト IgGに特異的に結合するファージを濃縮した。 ゥエル洗浄工程では、 第 1〜 第 3ラウンドでは 5回、 第 4、 5ラウンドでは 10回の洗浄を繰り返した。 洗浄液 に含まれる界面活性剤 Tween20の濃度は、 第 1、 第 2ラウンドでは 0. 1%としたが、 第 3、 第 4ラウンドでは 0. 3%、 第 5ラウンドでは 0. 5%に上昇させた。 5回のバ ィォパンニングの後、 大腸菌 BLT5615を播いたプレートにファージを添加して感 染させ、 ファ一ジ 'プラークを形成させてファージをクローン化した。
3) ELISA試験
96穴のマイクロプレート （Nunc, Maxisorp) のゥエルに、 0. 1M NaHC03溶液中に 溶解したヒ ト IgG (100 ng/SO 1/ゥヱル） をコートし、 PBSに溶解した 0. 5% BSA を添加してブロッキングした。 コントロールタンパク質としては、 ヒ ト IgGの代 わりに BSA (ゥシ血清アルブミン） を PBSに溶解して用いた。 ブロッキングした各 ゥエルに、 上記 2)の各ラウンドで得た Ί7ファージ集団 （5 X 101Q pfu/ゥヱル） を 加えて 1時間反応させた後、 PBS/0. 1% Tween20 (PBST) で 3回洗浄した。 洗浄後 のゥエルにはピオチン化マウス抗 T7ファージ抗体 （Novagen) を添加し、 次いで H RPで標識したストレプトアビジン （SA- HRP) (Jackson Immuno Research) を添 カロした。 さらに、 TMB溶液 (Wako Chemicals) を用いた呈色反応により、 ゥエル 上のヒ ト IgGに結合した T7ファージを検出した。 検出は、 450nmでの吸光度を ELIS Aプレー卜リーダー (ImmunoMini NJ - 2300, InterMed, Tokyo, Japan) を用レヽて 測定することにより行った。
この ELISA試験で評価した、 各ラウンドにおけるヒ ト IgGに結合するファージの 濃縮経過を、 図 1に示した。 図 1より、 C - (X) 8_1Q- Cタイプのライブラリでは、 第 4ラウンドにヒ ト IgG結合ファージの著しい濃縮が起こったことがわかる。 一方、 (X) 3- C- (X) ^。- C- (X) 3タイプのライブラリでは、 効果的なヒ ト IgG結合ファージの 濃縮がみられなかった （図 1 ) 。 またいずれのライブラリでも、 BSA結合ファー ジの十分な濃縮は認められなかった。
そこで次に、 上記の ( - ）^。- Cタイプの第 5ラウンド後の混合集団からクロー シ化した個々のファージクローンについて、 ヒ ト IgGに対する結合活性を、 上記 と同様の ELISA試験によって評価した。 その結果、 40クローン中 25クローンにつ いて、 ヒ ト IgGへの特異的結合活性が認められた。 そこで、 結合活性が示された ファージクローンが提示するぺプチドのァミノ酸配列を決定するため、 ファージ DNAの G10キヤプシドタンパク質遺伝子の 3'側に連結されたぺプチドコード DNAに ついて、 ABI DNAシークェンサ一 373A- 36Sを用いて塩基配列決定を行った。 シー クエンス反応用のプライマーとしては、 上流プライマー： 5' -GGAGCTGTCGTATTCCA GTC- 3'、 及ぴ下流プライマー： 5，- AACCCCTCAAGACCCGTTTA- 3，を用いた。 配列決定 の結果、 ヒ ト IgGへの結合活性が示されたファージクローンが提示するペプチド のァミノ酸配列は、 下記表 1の 6種類 （hG-1〜！ iG-6ぺプチド） に分類された。 こ れら 6種類のペプチドは、 ヒ ト IgGに特異的に結合すると考えられた。 さらにこれ ら 6種類のペプチド配列はいずれも、 N末端及び C末端のシスティン残基の間に、 3 アミノ酸配列からなる GYWと WGLという 2つの共通モチーフの少なく とも一方を含 むことが示された。 表 1中、 各ペプチド配列は、 アミノ酸 1文字表記を用いて記 载されている。 表 1
ぺプチド ァミノ酸配列 配列番号
C GYWRSE GL C
CTGFWERE GL C 2
C LYWPRLIWGLI C 3
CTIGYI¾PKA^GL] C 4
c YWAVR^GL|LGC 5
C IGYW隱 QIH C 6
Figure imgf000037_0001
[実施例 2 ] ヒ ト IgGへの結合特異性の評価
1) ELISA試験による評価
実施例 1で単離されたファージクローンのうち、 ぺプチド hG- l〜hG - 6をそれぞ れ提示する代表的なファージクローン G-l〜G-6について、 実施例 1と同様の ELIS A試験によりヒ ト IgG (hlgG) に対する結合特異性を評価した。 コントロールタン パク質としては、 ヒ トの IgA (hlgA) 、 IgE (hlgE) 、 IgM (hlgM) 、 マウスの IgG
(mlgG) 、 IgA (mlgA) 、 IgE (mlgE) 、 ヒ ト トランスフェリン （hTF) 、 ヒ ト血 清アルブミン (HSA) 、 ゥシ血清アルブミン (BSA) 、 ゼラチンを用いた。 その結 果を図 2に示す。
ファージクローン G- 1〜G- 6はいずれも、 ある程度の強弱の差はあるものの、 ヒ ト IgGに対して非常に高い結合特異性を示し （図 2中、 黒塗りのバー） 、 ヒ トの I gA、 IgE, IgM, マウスの IgG、 IgA, IgE ThF、 HSA, BSA、 ゼラチンを含む他のコ ントロールタンパク質に対してはほとんど結合活性を示さなかった。 従ってファ ージクローン G - 1〜G_6が提示するペプチド hG-：！〜 hG-6は、 ヒ ト IgGに特異的に結 合し、 他のクラスの抗体や他の生物種の抗体、 あるいは他のタンパク質には実質 的に結合しないことが示された。
さらにファージクローン G - 1〜G - 6について、 ヒ ト IgGのアイソタイプ （サブク ラス） である hIgGl〜hIgG4に対する結合活性も、 上記と同様の ELISA試験で確認 した。 コントロールタンパク質としては、 マウス IgGアイソタイプである IgGl、 I gG2b及び IgG3、 そして BSAを用いた。 その結果を図 3に示す。 図 3に示される通 り、 ファージクローン G - l〜G-6は、 ヒ ト IgGのいずれのアイソタイプにも強く結 合した。 一方 G- l〜G-6は、 BSAにはもちろん、 いずれのマウス IgGアイソタイプに も有意な結合活性を示さなかった。
2) 表面プラズモン共鳴解析による評価
より強い結合活性が認められたファージクローン G-l、 G-2及ぴ G- 4について、 表面プラズモン共鳴 （SPR) 解析を行った。 SPR解析は、 BIAcore2000 (BIAcore) にて 25°Cにて行い、 必要な試薬とセンサーチップは、 BIAcore社のものを購入し て用いた。 ヒ ト IgG (リガンド） を、 製造元が推奨するァミンカップリングプロ トコールに従って、 センサーチップ CM5上に固定化した。 コントロールとして、 ヒ ト IgA又は IgEを固定化したセンサーチップ CM5も調製した。 固定化反応は、 pH5 の条件で行い、 固定化量は、 RU (レスポンスユニット） が 1500〜2000の範囲内に なるように調整した。 次いで超遠心によって精製した T7ファージクローン G-l、 G- 2又は G- 4 (アナライ ト） を、 1. 0 X 10upfu/mlで、 ヒ ト IgGを固定化したセンサ 一チップを備えたフローセルに 10 μ 1/minの流速で注入し、 ヒ ト IgGとの結合反応 を測定した。 その後、 ランニング緩衝液 （HBS- T [バッファー組成： 10mM HEPES, 0. 15M NaCl, 3. 4 mM EDTA, 0. 005% Tween 20 (pH7. 4) ] ) で洗浄することによ り、 解離反応を測定した。 結合したアナライ トのセンサーチップからの洗浄溶出 には、 0. 2 M グリシン- HC1緩衝液 （ρΗ2· 7) を用いた。 結合パラメータの解析は BIAevaluation Version 3. 2ソフ卜ウェアを用レヽて行った。
この結果、 クローン G- 1、 G- 2及び G-4はいずれも、 センサーチップに固定化さ れたヒ ト IgGに対して特異的な結合を示したが、 固定化されたヒ ト IgAや IgEに対 しては結合しなかった。 この結果は、 上記の ELISA試験による結合特異性評価の 結果とよく一致した。
[実施例 3 ] hlgG中の結合部位の推定
ヒ ト IgG内のファージクローン G -;!〜 G- 6の結合部位を同定するために、 IgGの Fc 断片と特異的に結合することが知られるプロテイン A (SpA； Staphylococcus aur eus由来の細胞壁構成タンパク質） との競合 ELISA試験を行った。 この ELISA試験 は基本的には実施例 1と同様にして行った。 具体的には、 ヒ ト IgG (lOOng/50 ^ 1 /ゥエル） をコートしたゥエルを 0. 5%BSAでブロッキングし、 このゥエルに、 T7 ファ一ジクローン G_1〜G - 6 (5 X 101Qpfu/ゥエル） と各種濃度の SpAとを同時に添 加し、 室温で一時間インキュベーションした後に、 検出を行った。 SpAの添加濃 度は、 Ong/ウエノレ、 15ng/ゥエル、 30ng/ゥエル、 60ng/ゥエル、 125ng/ゥエル、 2 50ng/ゥエル、 500ng/ゥエルとした。
この結果を図 4に示す。 図 4に示される通り、 G- 1〜G- 6によるいずれのヒ ト Ig G抗体への結合も、 SpAの添加濃度が高くなるほど強く阻害された。 この結果から、 G- l〜G-6は、 IgG内の SpA結合部位と同じ部位か又はその近傍を認識し結合してい ることが示された。 SpAはヒ ト IgG Fcの CH2ドメインと CH3ドメインの連結部に結 合することが知られていることから、 ファージクローン G -;！〜 G-6もその連結部付 近に結合すると考えられた。 [実施例 4 ] ジスルフィ ド結合の評価
上記実施例で得たファージクローンが提示するぺプチドについて、 ヒ ト IgG結 合活性におけるその分子内ジスルフィ ド結合の意義を評価するため、 ジチオスレ ィトール （DTT) 存在下の還元的条件と、 酸化型グルタチオン （GSSG) 存在下の 酸化的条件において、 T7ファージクローンの hlgGへの結合活性を ELISAで評価し た。 この ELISA試験は基本的には実施例 1と同様にして行った。 具体的には、 ヒ ト IgG (100ng/50 1/ゥ工ル） をコートしたゥエルを 0· 5%BSAでブロッキングし、 このゥエルに、 GSSG又は DTT (50、 30、 10mM) と T7ファージクローン G - 1とを前も つて 1時間前から反応させておいたものを添加し、 室温で一時間ィンキュベーシ ヨンした後に、 検出を行った。 その結果を図 5に示す。
図 5に示される通り、 還元的条件下 （ジスルフイド結合が開裂する） では 10 m M以上の DTT濃度で G-1はほぼ完全にヒト IgGへの結合活性を失ったのに対し、 酸化 的条件下 （ジスルフィ ド結合が形成される） では、 いずれの GSSG濃度でも G-1の ヒ ト IgG結合活性に変化はみられなかった。 なお、 これらの条件下でもファージ の大腸菌への感染性には何ら変化は認められなかったことから、 還元条件下での ファージクローン G- 1の IgG結合活性の低下は、 ファージ粒子の崩壊等によるもの ではなく、 G - 1に提示されているぺプチド hG-lにおける分子内ジスルフィ ド結合 (S - S結合） の開裂によって生じたと考えられた。
以上の結果から、 上記実施例で得たファージクローンが提示するぺプチドにお いては、 そのシスティン残基間での分子内ジスルフイ ド結合 （S- S結合） の形成 、 ヒ ト IgGに対する結合活性において重要な役割を持っていることがわかった。
[実施例 5 ] 合成べプチドのヒ ト IgGへの結合活性
上記実施例で特に高い IgG結合活性が示されたファージクローン G-1及ぴ G - 4が 提示するペプチドのアミノ酸配列に基づき、 合成ペプチドを設計及び合成し、 そ れを常法によりビォチン化して、 ビォチン化 IMGpep- 1 (ピオチンースぺーサ——
GCGYWRSEWGLCG) 、 及ぴビォチン化 IMGpep_4 (ピオチンースぺーサ GCTGYWPKA
WGLCG) を作製した。 また、 IMGpep- 1配列中の共通モチーフ GYWと WGLの間に位置 する 「E (Glu) 」 を 「Q (Gin) 」 に置換したビォチン化 IMGpep-lE6Q (ビォチン ースぺーサ GCGYWRSQWGLCG) を作製した。 また、 IMGpep_4配列中の共通モチ ーフ GYWと WGLの間に位置する 「K (Lys) 」 を 「R (Arg) 」 に置換したビォチン化 IMGpep-4K6R (ピオチンースぺーサ'—— GCTGYWPRAWGLCG) を作製した。 さらに、 I MGpep- 1配列の 2つのシスティン残基 （C) をセリン （S) に置換したビォチン化 I MGpep-lCS (ビォチン—スぺーサ^ GSGYWRSEWGLSG) を合成した。 なお合成ぺプ チド IMGpep_l (GCGYWRSEWGLCG；配列番号 7 ) 、 IMGpep- 4 (GCTGYWPRAWGLCG；配 列番号 9 ) 、 IMGpep- 1E6Q (GCGYWRSQWGLCG；配列番号 1 0 ) 、 IMGpep- 4K6R (GCT GYWPRAWGLCG；配列番号 1 1 ) 、 IMGpep- ICS (GSGYWRSEWGLSG；配列番号 1 2 ) は Fmoc法により合成し、 逆相カラムで精製した。 次いで、 それらの N末端のァミノ 基を Sulfo_NHS- LC - Biotin (Pierce) を用いてピオチン化修飾することにより、 ビォチン化した。
得られたビォチン化合成ペプチドについて、 ヒ ト IgGに対する結合活性を ELISA 試験にてアツセィした。 ELISA試験は、 基本的には実施例 1と同様にして行った。 具体的には、 ヒ ト IgG (100ng/50 i 1/ゥエル） でコートしたゥエルに、 0. 5%BSA を添加してブロッキングした後、 ピオチン化合成ぺプチドとアル力リフォスファ ターゼ標識ストレプトアビジン （SA- AP) をあらかじめ 4： 1のモル比で混合したも のを加えて、 1時間反応させた。 呈色にはパラ-トロフエニルリン酸 （Wako) を 用いた。 検出は、 405nmの吸光度を測定することによって行った。 ヒ ト IgGの陽性 コントロールとしては、 hlgGの Fc断片を用いた。 他のコントロールタンパク質と しては、 ヒ トの IgA、 IgE、 マウスの IgG、 IgA、 IgE、 hTF、 ゥシ胎仔血清 （FBS) 、 HSA、 BSA、 ゼラチンを用いた。
その結果を図 6に示す。 IMGpep- 1及び IMGpep- 4は、 上記実施例で示したファー ジクローン G - 1〜G- 6と同様に、 ヒ ト IgGに特異的に結合すること、 またヒ ト IgGの Fc断片に結合することが示された。 さらに、 1アミノ酸残基を置換した IMGpep-1 E6Qと IMGpep- 4K6Rについては、 その元のペプチド IMGpep - 1及び IMGpep - 4と比較し て、 いずれも有意に結合活性が大幅に上昇したことが示された。 一方、 2つのシ スティン残基をセリン残基に置換した IMGpep - ICSでは、 ヒ ト IgGとの結合活性が ほぼ消失したことから、 ファージクローン G- 1〜G- 6と同様に、 これら合成べプチ ドにおいても、 IgGとの特異的結合において分子内ジスルフィ ド結合の形成が必 要であることが示された。
また、 上記のビォチン化合成ペプチドについて、 ヒ ト IgGのアイソタイプであ る hIgGl〜hIgG4に対する結合活性を、 同様に ELISA試験にてアツセィした。 ヒ ト I gGのコントロールタンパク質としては、 BSAを用いた。 その結果を図 7に示す。 I MGpep- 1及ぴ IMGpep- 4は、 上記実施例で示したファージクローン G_1〜G- 6と同様 に、 ヒト IgGl、 IgG2、 IgG3N IgG4のいずれに対しても強い結合活性を示した。 1 アミノ酸残基を置換した IMGpep- 1E6Qと IMGpep- 4K6Rも、 ヒ ト IgGl〜IgG4に対して 強い結合活性を示し、 かつ、 IMGpeP_l及ぴ IMGpep- 4と比べて上昇した結合活性を 示した。 IMGpep-lCSについては、 IgGl〜IgG4に対する結合活性がほぼ消失してい た。
以上の結果から、 実施例 1で同定されたペプチド配列又は共通モチーフを含む その類似配列からなる合成ペプチドが、 ヒ ト IgG抗体 （特に、 その Fc領域） に対 して特異的に結合できることが実証された。
[実施例 6 ] 本発明のペプチドとヒト IgGとの結合に関する速度論的結合解析 合成ペプチド IMGpep- 1、 IMGpep - 1E6Q、 IMGpep - 4、 IMGpep- 4K6Rとヒ ト IgGとの 間の結合について、 表面プラズモン共鳴 （SPR) を用いて速度論的結合解析を行 つた。 SPR解析は、 BIAcore2000 (BIAcore) にて 25°Cにて行い、 必要な試薬とセ ンサーチップは、 BIAcore社のものを購入して用いた。 4種のピオチン化合成ぺプ チド （IMGpep - 1、 IMGpeplE6Q、 IMGpep4、 IMGpep- 4腿） 50 μ M溶液 (pH5) をセン サーチップ SA上に流すことにより、 該チップ上に固定化した。 固定化量は、 RU ( レスポンスユニット） が 1500〜2000の範囲内になるように調整した。 次いで各種 濃度 （660nM、 330nM、 165nM、 82nM、 41nM) のヒ ト IgG (アナライ ト） を、 ビォチ ン化ペプチドを固定化した上記センサーチップ SAを備えたフローセルに lO Ai l/mi nの流速で注入し、 ヒ ト IgGとペプチドとの結合反応を測定した。 その後、 ラン二 ング緩衝液 （HBS- T) で洗浄することにより、 解離反応を測定した。 結合したァ ナライ トのセンサーチップからの洗浄溶出には、 0. 2 M グリシン- HC1緩衝液 （pH 2. 7) を用いた。 結合パラメータの解析は、 BIAevaluation Version 3. 2ソフトゥ エアを用いて行った。
上記 SPR解析により得られたセンサーグラムを、 図 8 A〜Dに示す。 このセン サーグラムから求めた IMGpep-l、 IMGpep - 1E6Q、 IMGpep4又は IMGpep- 4K6Rとヒ ト I gGとの間の結合反応の解離定数 Kdは、 それぞれ、 17、 21、 28、 24 nMであり、 さ らに結合速度定数 kaは、 2. 0 X 104 M^sec-1, 1. 5 X 104 M^sec"1, 1. 4 X 104 M—^ec一1、 1. 6 X 104 M^sec"1, 解離速度定数 kdは、 3. 4 X 10— 4 sec一1、 3. 1 X 10— 4 sec— 4. 1 X 1 0— 4 sec— 3. 8 X 10"4 sec—1と算出された。
一方、 ジスルフィ ド結合形成による環状化が生じないように IMGpep- 1のシステ ィン残基をセリン残基に置換したビォチン化 IMGpep- ICSをコントロールリガンド としてセンサーチップに固定化して使用し、 アナライ トとしてヒ ト IgGをフロー セルに流した場合には、 結合に由来するレスポンスシグナルの増加は全く見られ なかった。
[実施例 7 ] 本発明のペプチドをタグとして用いたヒ ト IgGの免疫沈降
ファージクローン G-1及ぴ G - 2が提示するぺプチドのアミノ酸配列に基づいて設 計した合成ペプチド IMGpep- 1 (GCGYWRSEWGLCG；配列番号 7 ) 及ぴ IMGpep- 2 (GCT GFWEREWGLCG；配列番号 8 ) は、 Fmoc法により合成し逆相力ラムで精製して、 以 下の実験に用いた。
トシル基活性化 M450 Dynabeadsマグネットビーズ 3mg (Dynal) に、 超遠心精 製した上記のクローン化 T7ファージ G - 1 (1. 0 X 1012 pfu) 、 又は合成ペプチド IM Gpep-1 (I50nmol) を、 製造元推奨のプロ トコールに従って、 その末端アミノ基 への共有結合を介して固定化した。 そのビーズを、 0. 5%BSAを含む PBS溶液でブ ロッキングした後、 1mlの hlgG/BSA/PBS (hlgGは 10 g/ml、 BSAは lmg/ml) に添加 し、 それを室温で 1時間、 撹拌により混合しながら反応させた。 ビーズを 3回 PBST で洗浄後、 SDS-サンプル緩衝液を加え、 SDS- PAGEを行って分画した。 続いて、 ビ ォチン化抗 hlgGャギポリクローナル抗体 (Goat Anti- hlgG - pAb- biotin； Pharmin gen) と SA - HRPを用いてゥヱスタンプロッテイング解析を行うことにより、 ビー ズに結合して免疫沈降したヒ ト IgGを検出した。
また、 ファージ G-1又は IMGpep- 1の代わりにファージクローン G-1 415型又は IM Gpep- 2を用いて、 同様に免疫沈降反応を行い、 ヒ ト IgGを検出した。 ここで、 フ ァージクローン G-1 415型 （Novagen) とは、 T7ファージのキヤプシドを構成する 415個の G10タンパク質の全てにおいて G-1ぺプチドを提示したファージである。 さらに、 ファージ G- 1又は IMGpep - 1のコントロールとして、 抗 hlgGャギ（Fab，） 2フ ラグメント、 野生型 T7ファージ、 BSAも同様に用いて免疫沈降反応及ぴ検出を行 つた。
結果を図 9に示す。 図 9中、 レーン 1 ：抗 hlgGャギ（Fab' ) 2フラグメント、 レ ーン 2 ：野生型 T7ファージ、 レーン 3 ： ファージ G- 1、 レーン 4 ： ファージ G- 1 4 15型、 レーン 5 ： BSA、 レーン 6 ： IMGpep— 1、 レーン 7 ： IMGpep_2。 レーン 8及 ぴ 9には、 コントロールとして、 それぞれ BSA、 ヒ ト IgGを直接アプライした。 図 9に示される通り、 野生型 T7ファージ又は BSAを固定化したビーズでは免疫 沈降したヒ ト IgGは認められなかったのに対し、 ファージ G-l、 ファージ G-1 415 型、 IMGpep- 1、 IMGpep- 2をそれぞれ固定化したビーズでは免疫沈降したヒ ト IgG がはっきりと認められた。 また、 ファージ G - 1 415型を固定化したビーズを用い た場合、 ファージ G-1の場合と比較して、 より多量のヒ ト IgGが検出された。 この ことは、 415個の G10タンパク質全てにおいて G - 1ぺプチドを提示しているファー ジ G- 1 415型が、 その G-lペプチドの提示数に応じて増加した数のヒ ト IgGをトラ ップし、 免疫沈降したことを示している。 さらに、 合成ペプチド IMGpep - 1は、 IM Gpep_2よりも明らかに高いヒ ト IgGトラップ効率を示した。 この免疫沈降アツセ ィによって IMGpep - 1と IMGpep- 2が示したヒ ト IgG結合量の結果は、 それら合成ぺ プチドの配列のベースとしたファージクローン G- 1及び G-2について ELISA試験で 確認した I gG結合活性の結果と相関していた。 何も固定化していない空ビーズを 用いた場合のレーンでは、 ヒ ト IgGは全く検出されなかった。
以上の結果から、 上記合成ペプチドを用いて、 ヒ ト IgGを特異的に免疫沈降さ せることができることが示された。
[実施例 8 ] 本発明のペプチドを用いたヒ ト IgG免疫沈降における酸処理の効果 ス トレプトアビジン M280 Dynabeadsマグネッ トビ一ズ （Dynal) 4 mgに、 ビォ チン化合成ぺプチド IMGpep- 4K6R (lOOnmol) を 400 ί 1にて混合することにより 固定化し、 0. 5%BSAを含む PBS溶液でブロッキングした。
一方、 SpAセファロースビーズ (アマシャムフアルマシアバイオテク社製) で ヒト血清から精製した hlgG (溶出時 pH2. 2) 、 ポリクローナルヒ ト IgG (hlgG) 抗体 (Sigma) 、 抗 IL-6レセプター MRA (ヒ ト化抗ィンターロイキン 6レセプター モノクローナル抗体、 中外製薬社製） 、 抗 HER2ヒ ト抗体 （ハーセプチン） 、 又は ヒト血清を、 0. 1 M グリシン- HC1溶液中 （pHl. 5) で 5分間にわたり処理した後、 トリスを添加して pHを中和した。 このようにして酸処理した試料 （抗体試料は lm g/mlの BSAを含む lO g/mlの PBS溶液中、 ヒト血清試料は 20倍希釈した PBS溶液中 に調製） に、 上記の通りブロッキングしたビーズを 0. 2 mg加え、 それを室温で 1 時間、 撹拌により混合しながら反応させた。 反応後、 ビーズを回収し、 PBSTで 3 回洗浄後、 SDS-サンプル緩衝液を加え、 SDS-PAGEを行い、 ゲルを CBB染色して、 免疫沈降した hlgGを可視化した。 コントロール実験としては、 同じ抗体及ぴ血清 試料、 並びにポリクローナルマウス IgG抗体を用いて、 酸処理せずに （未処理で ) 同じ反応を実施した。 さらに、 ビォチン化 IMGpep- 4K6Rを固定化していない空 ビーズを用いて、 同様のコントロール実験を行った。
結果を図 1 0に示す。 図 1 0 A中、 M：分子量マーカー （83、 62、 47、 32、 25 kDa) 、 レーン 1 ： SpAセファロースビーズでヒ ト血清から精製した hlgG (溶出 時の PH2. 2) 、 レーン 2 ：未処理のポリクローナル hlgG抗体、 レーン 3 ：酸処理 したポリクローナル hlgG抗体、 レーン 4 ：未処理の抗 IL- 6レセプター MRA、 レー ン 5 ：酸処理した抗 IL- 6レセプター MRA、 レーン 6 ：未処理の抗 HER2ヒ ト抗体 （ ハーセプチン） 、 レーン 7 ：酸処理した抗 HER2ヒ ト抗体 （ハーセプチン） 、 レー ン 8 :未処理のヒ ト血清、 レーン 9 ：酸処理したヒ ト血清、 レーン 1 0 ： ポリク ローナルマウス IgG抗体。 図 1 0 Bには、 ピオチン化ペプチドを固定化せずピオ チンのみを反応させた空のストレプトアビジン M280 Dynabeadsマグネットビーズ を上記抗体又は血清試料と反応させた結果を示す。 図 1 0 B中、 M：分子量マー カー （83、 62、 47、 32、 25 kDa) 、 レーン 1 ： SpAセファロースビーズでヒ ト血 清から精製した hlgG (溶出時の ρΗ2· 2) 、 レーン 2 ：酸処理したポリクローナル h IgG抗体、 レーン 3 ：酸処理した抗 IL- 6レセプター MRA、 レーン 4 ：酸処理した抗 HER2ヒ ト抗体 （ハーセプチン） 、 レーン 5 ：酸処理したヒ ト血清、 レーン 1 0 ： ポリクローナノレマゥス IgG抗体。
図 1 0に示される通り、 調製したすべての hlgGを含むサンプルにおいて、 酸処 理を行うことにより、 本発明のぺプチドを固定したビーズによって回収される hi gG量が顕著に増大した。 一方、 ペプチドを固定化していない空のビーズでは、 hi gGは全く回収されなかった。 このことは、 酸処理した抗体の回収率の向上が、 例 えば、 ビーズに対する非特異的吸着の増加によるものではないことを示している。 以上の結果から、 本発明のペプチドによるヒ ト IgGの免疫沈降は、 ヒ ト IgGを酸 処理することによって促進できることが示された。
本実施例の結果からは、 本発明のペプチドが特異的に結合するヒ ト IgGが、 酸 処理によって誘導することができる特定のコンフオメーションを有するものであ ることも示された。 すなわち本発明のペプチドは、 酸変性した形態のヒ ト IgGの F c領域を特異的に認識することができる。 図 1 0から分かるように、 このような 特定の （酸変性型の） コンフオメーシヨンを有するヒ ト IgGは、 未処理のヒ ト血 清中にはほとんど検出されなかったが、 市販の抗体試薬や抗体医薬中にはある程 度の量で含まれることが分かった。
本実施例を考慮すると、 上記実施例 1 ~ 7において本発明のぺプチド又はそれ を提示するファージクローンとの結合が示されたヒ ト IgGも、 酸処理によって誘 導されるのと同様のコンフオメーションを有していたことが考えられた。
[実施例 9 ] 各種酸処理条件下での酸変性型ヒ ト IgGの生成
酸性条件下で誘導されるコンフオメーシヨン （酸変性型コンフオメーシヨン） を有するヒ ト IgGコンフォーマー （酸変性型ヒ ト IgG) の生成に影響を与える因子 として、 特に pHと温度に関して詳細な検討を行った。 その際に、 酸変性型コンフ オメーションを有する分子種の含有量を評価するために、 ピオチン化 IMGpep- 4K6
Rぺプチド (ピオチンースぺーサ GCTGYWPRAWGLCG) とビォチン化 Fc-IIIぺプ チド （ビォチン一スぺーサ^ DCAWHLGELVWCT； Fc-IIIぺプチドについては非特 許文献 8を参照） を、 実施例 2と同様にして表面プラズモン共鳴スペク トル （SP
R) のセンサーチップ上にそれぞれ固定化した。
次いで、 ビォチン化 IMGpep- 4K6Rを固定化したセンサーチップを備えたフロー セル、 及びビォチン化 Fc- IIIぺプチドを固定化したセンサーチップを備えたフ口 一セルのそれぞれに、 酸処理した IgGサンプルを流速 20 μ 1/minで流し、 センサー チップ上での結合反応を測定した。
ビォチン化 IMGp ep - 4K6Rを固定化したセンサーチップ上でのレスポンス値は、 酸変性型ヒ ト IgGの含有量を示す。 一方、 Fc - IIIペプチドは、 中性条件下で得ら れる未変性コンフオメーシヨンを有するヒ ト IgGを認識するが、 同時に酸性条件 下で誘導される酸変性型ヒ ト IgGも認識することから、 ピオチン化 Fc-IIIぺプチ ドを固定化したセンサーチップ上での SPRレスポンス値は、 SPRに注入した I gGサ ンプル中の抗体全体量を表す。
そこで、 酸処理後のヒ ト IgGサンプル中の酸変性型ヒ ト IgGの含有量を、 ビォチ ン化 Fc- II Iぺプチドを固定化したセンサーチップ上での SPRレスポンス値に対す る、 ピオチン化 IMGpep- 4K6Rを固定化したセンサーチップ上での SPRレスポンス値 の比率 （酸変性型ヒ ト IgGの生成率） を算出することにより、 評価した。
この SPR解析では、 各種条件で酸処理したヒ ト IgGサンプルを以下のようにして 調製し、 試験した。 まず、 抗 HER2ヒ ト抗体 （125 i g/ml、 0. 1M NaCl溶液） 80 1 に各種 pH (1. 5、 2. 1、 2. 7) の 1M グリシン- HC1を20 μ 1加えて調製した反応液 (I gG 40 ^ g/ml , 250 nM) を、 さらに各種温度 （20、 30、 40°C) にて 10分間インキ ュベーションし、 その後、 1 Tri s-HCl (pH 8. 7)を 30 μ 1 (ρΗ2. 7のグリシン- HC1 を加えたサンプルについては、 20 Ai l) 加えて中和した。 中和後、 抗体溶液をラ ンユングバッファ一で 250 nMまで希釈した後に、 センサーチップ上に注入し、 SP R解析を行った。 なお中和後とセンサーチップ上への注入前に pH試験紙にて pHの 確認を行った。
図 1 1には、 pH2. 7及び 40°Cで酸処理したヒ ト IgGサンプルと Fc- IIIペプチド及 ぴ IMGpep - 4K6Rとの反応性を示す SPRセンサーグラムを一例として示す。 図中の b と aの比率 a/bの値に基づき、 酸変性型 IgGの生成率を算出した。
各種酸処理条件について酸変性型 IgGの生成率を調べた結果を図 1 2にまとめ た。 pH2. 7、 20°Cで酸処理した場合、 酸変性型 IgGの生成率は 5%程度であつたが、 pHを 2. 1、 さらに 1. 5に下げると、 生成率はそれぞれ 7. 8%、 12. 8%へと少し上昇し た。 一方、 処理 pH 2. 7の場合、 処理温度を 20°Cから 30° (：、 そして 40°Cへと上昇さ せると、 生成率は急激に上昇してそれぞれ 9. 7%、 40%となった。 40°Cでのその生 成率は、 pHを 2. 1、 そして 1. 5へと下げても大きく変化することは無く、 40%程度 を維持した。 このことから、 酸変性型 IgGの生成率は、 pHの相違によっても影響 を受けるが、 少なくともこの pH領域 （pH 1. 5〜2. 7) においては温度に対する感 受性がより高いことが示された。 [実施例 1 0 ] 酸処理した IgGサンプル中の酸変性型 IgGの分離
次に、 酸処理したヒ ト IgGサンプル中の酸変性型 IgGと未変性 IgGの分離を、 IMG pep- 4K6Rを固定化したカラムを用いて行った。
抗体サンプルは、 実施例 9と同様にして、 抗 HER2ヒ ト抗体 （ハーセプチン） を pH2. 7、 40°C、 10分間のインキュベーションという条件下で酸処理することによ り調製した。 また、 ビォチン化 IMGPep- 4K6Rペプチド （ビォチンースぺーサ G
CTGYWPRA GLCG) の溶液 （500 μ Μ, lml) を HiTrap Streptavi din HPカラム （GE Healthcare) に注入することにより、 IMGPep - 4I½Rを固定化したカラムを作製し た。 この IMGPep- 4K6R固定化カラムに、 0. 4ml/minの流速で、 抗体サンプルを注入 した後、 0. 1M NaCl含有2 OmMリン酸緩衝生理食塩水 （PBS、 ρΗ7. θ) から 0. IM NaCl 含有 0. 1M グリシン- HCl (pH2. 5) までのグラジェント溶出を行った。 その結果を 図 1 3に示す。
図 1 3に示される通り、 主として未変性コンフオメーションを有すると思われ る未処理の抗 HER2ヒ ト IgGサンプルが IMGpep- 4K6R固定化カラムを素通りしている のに対し、 酸処理した抗 HER2ヒ ト IgGサンプルでは、 約 35%の IgGがー且カラムに 吸着された後、 酸性グラジェント溶出で約 10分の溶出時間にて溶出された。 この ようにして溶出された IgGは、 大部分が酸変性型コンフオメーションを有する抗 H ER2ヒ ト IgGと考えられる。 [実施例 1 1 ] 本発明のペプチドを用いて分離した酸変性型の抗 HER2ヒ ト IgGの 特性解析
実施例 1 0において溶出された酸変性型の抗 HER2ヒ ト IgGを分取し、 それを直 ちに 1M Tris - HC1緩衝液 （pH8. 7) によって中和し、 さらに PBSに対して透析を行 つた。 そのようにして得られた精製 IgGサンプルについて、 その特性解析を行つ た。
図 1 4には、 この精製サンプルについて測定した円偏光二色性スぺク トル （CD スぺク トル） を示す。 酸変性型ヒ ト IgGでは、 未処理のヒ ト IgGに比べ、 205nm付 近の吸収極大が増加しており、 ランダム構造の含有量が増加したことが推定され た。 一方、 215nm付近の、 免疫グロプリンドメインの /3シート構造に由来する負 の吸収は、 未処理のヒ ト IgGとほぼ同等の吸収量を示した。 従って、 酸変性型ヒ ト IgGでは、 ランダムな構造が増加しているが、 抗体全体の ]3シート構造は大部 分保持されていると考えられた。
[実施例 1 2 ] 本発明のペプチドを用いた酸変性型 IgGの除去
ヒ ト化抗ヒ ト IL - 6レセプターモノクローナル IgG抗体 （MRA；—般名 ： トシリズ マプ （tocil izumab) 、 中外製薬） を酸処理したサンプルから分離した酸変性型 コンフオメーシヨンを有する MRA (酸変性型 MRA) について、 分子篩クロマトダラ フィ一によりそのみかけの分子量を解析した。
まず、 ヒ ト化抗ヒ ト IL-6レセプター IgG抗体 （MRA) (2000 ^ g/ml, PBS溶液） 200 μ 1に、 ρΗ 2. 7の 1 Μグリシン- HC1を 20 μ 1加え、 さらに 30°Cにて 10分間インキ ュベーシヨンを行った後、 1M Tris-HCl (pH 8. 7) 1を加えて中和することに より、 酸処理した抗体サンプルを得た。 また、 実施例 1 0と同様にしてピオチン ィ匕 IMGPep- 4K6Rぺプチド固定化カラムを作製し、 そのカラムに 0. 4ml/minの流速で、 酸処理した抗体サンプルを注入した後、 0. 1M NaCl含有 20mMリン酸緩衝生理食塩 水 （PBS、 pH7. 0) から 0. 1M NaCl含有 0. 1M グリシン- HC1 (pH2. 5) までのグラジ ェント溶出を行った。 このようにして溶出した IgGは、 精製された酸変性型のヒ ト化抗ヒ ト IL- 6レセプター IgG抗体 （MRA) である。
続いて、 精製された酸変性型 MRAを、 HiLoad Sperdex 200 16/60 カラム （GE H ealthcare) を用いた分子篩クロマトグラフィーに供した。 同様に、 未処理の MRA、 酸処理した抗体サンプル、 酸処理した抗体サンプルをピオチン化 IMGPep- 4K6Rぺ プチド固定化カラムに注入して得られた素通り画分 （未変性のままの MRA) も、 それぞれ HiLoad Sperdex 200 16/60 カラム （GE Healthcare) を用いた分子篩ク 口マトグラフィ一に供した。 カラムからの溶出は、 流速 1· 0 ml/minにて 0. 15M Na C1含有 50mM リン酸緩衝液 （pH 7. 0) を用いて行った。 その結果を図 1 5に示す。 図に示された通り、 未処理のヒ ト抗 IL- 6レセプター抗体 MRAは、 ほぼすべてが モノマーの IgGであった （図 1 5 A) 。 一方、 酸処理した抗体サンプル中には、 モノマーよりも早く溶出されるダイマー又はトリマーのピークが若干生じており、 酸処理によって IgG抗体のオリゴマー化が引き起こされたことが示された （図 1 5 B；) 。
精製された酸変性型 MRAでは、 オリゴマーのピークが増加しており （図 1 5 C ) 、 より多い量のダイマーやトリマーを含むものと思われる。 しかし一方で、 精 製された酸変性型 MRAのうち約 65%は依然としてモノマーであり、 酸変性型 MRAは、 変性の進行により凝集体を生じるわけではないことも示された （図 1 5 C ) 。 また、 酸処理した抗体サンプルの IMGPep- 4K6Rペプチド固定化カラムを通した 素通り画分には、 オリゴマーはほとんど見られなかった （図 1 5 D ) 。
これらの結果から、 ビォチン化 IMGpep - 4K6R固定化力ラムを用いることにより、 酸変性型コンフオメーシヨンを有するヒ ト IgG MRA、 特にそのオリ ゴマーを、 効 率的に抗体サンプルから除去できることが示された。 そこで次に、 実施例 1 0で行つたように、 IMGPep-4K6R固定化力ラムクロマト グラフィ一により、 酸処理したヒ ト IgGサンプルを酸変性型 IgGと未変性 IgGとに 分離することによって、 酸変性型 IgGを実際に抗体サンプルから十分に除去でき るかどうかを確認する試験を行った。 未処理の MRA、 酸処理した MRAサンプル （pH 2. 2、 4°Cで 10分間の酸処理） 、 酸処理した MRAサンプルをビォチン化 IMGPep- 4K6R ぺプチド固定化カラムに通過させて得られる素通り画分、 精製された酸変性型 MR A (pH2. 2、 4°Cで 10分間の酸処理をしたヒ ト IgGサンプルを IMGpep-4K6Rペプチド 固定化カラムに通過させて得られた吸着画分） の各サンプルについて、 実施例 8 で用いたのと同様の方法で、 IMGpep- 4K6Rぺプチドを用いた免疫沈降実験を行い、 マグネットビーズに固定化されたペプチドと共に沈降した IgGを 12. 5% SDS-PAGE にかけ、 次いで CBB染色して観察した。 結果を図 1 6に示す。
図 1 6に示される通り、 未処理の MRA抗体は、 IMGpep-4K6Rペプチドによって免 疫沈降されなかった （レーン 1 ) 。 しかし酸処理した MRA (レーン 2 ) 及び精製 された酸変性型 MRA (レーン 3 ) には、 酸変性型コンフオメーシヨンを有する IgG が含まれることがはっきりと示された。 一方、 素通り画分 （レーン 4、 図 1 5 D と同じ画分） においては免疫沈降が全く観察されなかったことから、 IMGpep- 4K6 Rぺプチド固定化カラムによって素通り画分からは酸変性型 IgGが十分に除去され たことが示された。 [実施例 1 3 ] 市販 IgG製品中の酸変性型 IgGの含有率の測定
いくつかの市販の抗体医薬や免疫グロブリン製剤等について、 酸変性型コンフ オメーシヨンを有するヒ ト IgGの含有率を、 実施例 9に開示したのと同様の方法 を用いて評価した。 具体的には、 ^ w g/mlに調製した抗体医薬や免疫グロブリン 製剤等のヒ ト IgG溶液を、 IMGpep - 4K6Rと Fc - IIIペプチドを別々に固定化した SPR のセンサーチップを備えたセルに注入し、 センサーチップ上での結合反応を測定 した。 Fc_IIIぺプチドを固定化したセルでのレスポンス値 bに対する IMGpep- 4K6R ぺプチドを固定化したセルでのレスポンス値 aの比率 a/bから、 酸変性型 IgGの含 有率を算出した。
図 1 7に示すように、 検討した 2つの抗体医薬 （図 1 7中、 A社 Xヒ ト抗体医 薬、 B社 Yヒ ト抗体医薬） では、 いずれも 0, 5%以下とその酸変性型 IgGの含有率 は低かった。 一方、 免疫グロプリン製剤では、 いずれも 3 %以上と高い含有率を 示した。 この違いは、 それぞれの製剤を製造する際に使用したヒ ト IgGの精製法 の違いによるものと考えられる。
[実施例 1 4 ] 本発明のペプチドによる IgG検出感度の検討
本発明のペプチド IMGpep- 4K6R、 ならびに IMGpep- ICSペプチドを用いて、 酸処 理したヒ ト MRA (IgG) のメンブレン上での検出を行った。 具体的には、 酸処理し たヒ ト MRA (IgG) 、 未処理のヒ ト MRA (IgG) を、 1スポットあたり各々 1. 5ng、 3 ng、 6ng、 12. 5ng、 25ng、 50ng、 及び lOOngでニトロセルロース膜上にスポッ トし、 5分間乾燥させた後、 0. 5°/。BSAを添加して室温にて 2時間かけてプロッキングを行 つた。 ここで、 酸処理したヒ ト MRAは、 ヒ ト化抗ヒ ト IL- 6レセプター IgG抗体 （MR A) (2000.U g/ml, PBS溶液） 100 1に、 ρΗ 2. 8の 1Mグリシン - HC1を 10 μ 1加え、 さらに 40°Cにて 10分間インキュベーションを行った後、 1M Tris-HCl (pH 8. 7) 30 lを加えて中和することによって調製したものである。
次に、 ビォチン化 IMGpep- 4K6Rペプチド又はピオチン化 Fc- IIIペプチド、 もし くは IMGpep- ICSと、 HRPコンジュゲート SA (ストレプトアビジン） （120nM) とを モル比 4 ： 1で前もって混合し、 それを上記の通りブロッキングしたメンブレン に加えて 1時間反応させた。 0. 1% TVeen20含有 PBSで 3回洗浄した後、 化学発光 試薬 （Chemi- Lumi One, Nakalai Tesque) を加えて、 LAS - 1000イメージアナライ ザ一 （Fuji Fi lm) にて画像を検出した。 この結果を図 1 8に示す。
未処理のヒ ト MRA (IgG) のブロッテイングに対する検出では、 IMGpep- 4K6Rぺ プチドは 1. 5 ng/mlのスポットも検出はできるものの、 その全体的なシグナル強 度はかなり弱かった （K6R (N)を参照） 。 同じ未処理の MRAサンプルを Fc- ΠΙぺプ チドを用いて検出すると、 高濃度のスポッ トに対しては高い検出強度が得られる ものの検出限界はなお 6ng/スポットであった （Fc_III (N)を参照） 。 一方、 酸処 理により酸変性型 IgGを多量に含むようになった抗体サンプル （K6R (A)を参照） では、 IMGpep- 4K6Rぺプチドによる IgGの検出感度と検出強度は共に格段に増強さ れ、 1. 5 ng/mlの抗体サンプルも十分に検出が可能であった。 尚、 コントロール として用いた IMGpep- ICSペプチドでは、 未処理のヒ ト MRA (IgG) に対するスポッ トは、 まったく検出されなかった。
このように、 酸処理することにより、 本発明のペプチドによるヒ ト IgG検出感 度を格段に増強させることができた。 この結果から、 本発明のペプチドを用いた 酸処理を利用したヒ ト IgG抗体の検出方法が非常に高感度であり有用であること が示された。 本明細書中で引用した全ての刊行物、 特許及び特許出願はその全体を参照によ り本明細書中に組み入れるものとする。
.産業上の利用の可能性
本発明のペプチドタグは、 高効率にヒ ト IgG又はその Fc領域を含む断片を捕捉 することができるヒ ト IgGの検出、 精製又は分離方法に用いることができる。 本 発明のペプチドタグは、 特に、 酸変性型ヒ ト IgGの検出や除去のために用いるこ とができる。 配列表フリーテキスト
配列番号 1〜 1 2及び 1 5〜 1 6は、 合成べプチドである。
配列番号 1 3〜1 4は、 プライマーである。

Claims

1 . 下記式 I：
c一（X) n-w-x-x-x-w- (x)m-c (I)
[式中、 n及び mはそれぞれ 1以上の整数であり、 かつ n + m=4又は 5である] で表されるアミノ酸配列であって、 式 I中の X - X- Xがシスティンを含まず、 かつ以 下の a)及ぴ b) ： 一
a) 式 I中の（X) n- Wが、 Za - G- Y - Wである
b) 式 I中の W- (X) mが、 W - G - L- Zbである
の
[Za及び Zbはそれぞれ 0個又は 1個以上のアミノ酸残基である]
のいずれか又は両方を満たすアミノ酸配列を少なくとも含む、 11 16アミノ酸長 囲
のヒ ト IgG結合性ぺプチドタグ。
2 . 式 Iで表されるアミノ酸配列が、 前記 a)及ぴ b) ：
a) 式 I中の（X) n-Wが、 Za - G- Y-Wである
b) 式 I中の W- が、 W - G-L- Zbである
[Za及び Zbはそれぞれ 0個又は 1個以上のアミノ酸残基である]
の両方を満たす、 請求項 1に記載のぺプチドタグ。 3 . 以下の：!）〜 11)のいずれかのアミノ酸配列からなる、 請求項 1又は 2記載の ぺプチドタグ。
1) CGYWRSEWGLC (配列番号 1 )
2) CTGFWEREWGLC (配列番号 2 )
3) CLYWPRLWGLC (配列番号 3 )
4) CTGYWPKAWGLC (配列番号 4 )
5) CYWAVRWGLLGC (配列番号 5 )
6) CGYWADVWQIHC (配列番号 6 )
7) GCGYWRSEWGLCG (配列番号 7 )
8) GCTGFWEREWGLCG (配列番号 8 ) 9) GCTGYWPKAWGLCG (配列番号 9 )
10) GCGYWRSQWGLCG (配列番号 1 0 )
11) GCTGYWPRAWGLCG (配列番号 1 1 ) 4 . 式 I中の 2つのシスティン残基の間にジスルフイ ド結合が形成される、 請求項 1〜 3のいずれか 1項に記載のぺプチドタグ。
5 . 酸変性型ヒ ト IgGに結合する、 請求項 1〜4のいずれか 1項に記載のぺプチ ドタグ。
6 . 標識物質が付加されている、 請求項 1〜 5のいずれか 1項に記載のペプチド タグ。
7 · 請求項 1〜 6のいずれか 1項に記載のぺプチドタグを提示した組換えバクテ リオファージ。
8 . 請求項 1〜6のいずれか 1項に記載のぺプチドタグと連結されたタンパク質 からなる融合タンパク質。
9 . 請求項 1〜6のいずれか 1項に記載のペプチドタグを固定化した固相担体。
1 0 . 請求項 1〜 5のいずれか 1項記載のペプチドタグをコードする DNA。
1 1 . 請求項 1 0に記載の DNAを含むベクター。
1 2 . 請求項 1 1に記載のベクターを含む形質転換体。
1 3 . 以下の工程 a)〜 を含む、 試科中のヒ ト IgG又はその Fc領域を含む断片を 検出する方法： a) 試料を酸処理する工程、
b) 請求項 1〜6のいずれか 1項に記载のぺプチドタグを酸処理した試料と接 触させる工程、 及ぴ
c) 工程 b)で生じた、 ペプチドタグとヒ ト IgG又はその Fc領域を含む断片との結 合を測定する工程。
1 4 . 表面プラズモン共鳴解析により前記結合を測定する、 請求項 1 3に記載の 方法。
1 5 . 以下の工程 a)及び b)を含む、 試料中のヒ ト IgG又はその Fc領域を含む断片 を精製する方法：
a) 請求項 1〜 6のいずれか 1項に記載のぺプチドタグを酸処理した試料と接 触させて、 それにより試料中のヒ ト IgG又はその Fc領域を含む断片をペプチドタ グに結合させる工程、
b) 工程 a)でペプチドタグに結合したヒ ト IgG又はその Fc領域を含む断片を、 試 料から分離する工程。
1 6 . 以下の工程 a)及び b)を含む、 試料から酸変性型ヒ ト IgG又はその Fc領域を 含む断片を除去する方法：
a) 請求項 1〜6のいずれか 1項に記載のペプチドタグを試料と接触させるェ 程、 及ぴ
b) 工程 a)でペプチドタグに結合したヒ ト IgG又はその Fc領域を含む断片を、 試 料から除去する工程。
1 7 . 以下の工程 a)〜 を含む、 タンパク質の精製方法：
a) 請求項 1〜6のいずれか 1項に記載のぺプチドタグを連結したタンパク質 からなる融合タンパク質を作製し、 それを含む試料を調製する工程、
b) 工程 a)の試料を酸処理したヒ ト IgG又はその Fc領域を含む断片と接触させて、 それにより融合タンパク質をヒ ト IgG又はその Fc領域を含む断片と結合させるェ 程、
c) 工程 b)でヒ ト IgG又はその Fc領域を含む断片に結合した融合タンパク質を、 試料から分離する工程。
1 8 . 請求項 1〜 6に記載のぺプチドタグ、 請求項 Ίに記載の組換えパクテリォ ファージ、 請求項 9に記載の固相担体、 請求項 1 1に記載のベクター、 及ぴ請求 項 1 2に記載の形質転換体からなる群より選択される少なくとも 1つを含む、 ヒ ト IgG又はヒ ト IgG Fc領域を含む断片を検出又は精製するためのキット。
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