WO2008047941A1

WO2008047941A1 - Méthode de dosage immunologique d'un composant urinaire et réactif à utiliser pour cette méthode

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Publication number: WO2008047941A1
Application number: PCT/JP2007/070675
Authority: WO
Inventors: Kyoko Hiramatsu; Keiichi Takahashi; Masao Kawakita; Mari Yanagiya; Mieko Kosaka
Original assignee: Tokyo Metropolitan Organaization For Medical Research; Tokyo Metropolitan Government
Priority date: 2006-10-17
Filing date: 2007-10-17
Publication date: 2008-04-24
Also published as: EP2098864A4; JP2008101924A; EP2098864A1; EP2098864B1; JP5317040B2

Description

明細書尿中成分の免疫学的測定方法およびそれに用いるための試薬技術分野

本発明は、尿中成分の免疫学的測定方法および該測定に用いるための試薬に関する。背景技術

臨床検査などの分野において、物質の測定を行うための方法の一つとして、免疫学的な測定法が利用されている。免疫学的測定法としては、法、 E I A 法、免疫比濁法、ラテックス凝集法、金属コロイド凝集法などの多くの方法がある。これらの測定法では、生体試料中の被測定物質である抗原（または抗体）とそれに対する抗体（または抗原）との間における抗原抗体反応を利用している。臨床検査の分野の各種検査では、自動化および測定時間の短縮が図られており、この中でもラテックス凝集法および金属コロイド凝集法は、反応液の分離や洗浄を行わないため、自動化に適している。これらの免疫学的測定においては、標準品を測定して得た測定値（例えば、吸光度）と濃度との関係を表す検量線と、検体中の被測定物質の測定値とを比較することによって、被測定物質の濃度を求める。生体試料中の被測定物質を測定した場合に検量線の濃度域を超える力、または超えると想定される場合には、検量線の濃度範囲となるように、生体試料を希釈液で希釈する必要がある。また、これらの測定においては、測定の正確性を確認するために、あらかじめ用意されたコントロール液を測定する場合もある。このような標準品の溶液、希釈液、およびコントロール液には、一般的に、生理食塩水や緩衝液が使用される。

し力し、生理食塩水や緩衝液は、測定する生体試料とは成分、粘度、比重などの性状が異なるために、生体試料と、標準品、希釈された検体、またはコント口ールとでは反応性に差が生じ、正確に測定できず、真の値との乖離が生じるという問題がある。そのため、生体試料と同一の反応性を有する、標準品（溶液）、希釈液、またはコントロールを調製する必要が生じる。

生体試料として尿を用いた被測定物質の検出および測定は、尿の採取が容易であるため、注目されている。例えば、尿中に存在するジァセチルスペルミンは、腫瘍マーカーの 1つであり、その測定には、免疫学的方法が利用されている ( 「ヒラマツ（Hiramatsu, K.) ら，ジャーナル 'ォブ ·バイオケミストリー (J. Biochem.) , 1998年，第 1 24巻， p. 231— 236」および特開 2006-38594号公報を参照）。ジァセチルスペルミンの測定用試薬の一つとして、「尿中ジァセチルスペルミン測定試薬用 E L I S Aキット」力株式会社トランスジエニック（販売、フナコシ株式会社）より市販されている。

生体試料として尿を用いた被測定物質の免疫学的測定においても、標準液、希釈液などに生理食塩水や緩衝液を用いると、免疫反応性に差が生じ、正確に測定できず、真の値との乖離が生じるという問題がある。発明の開示

本発明の目的は、尿中成分の免疫学的測定において、尿検体中または尿希釈検体中の被測定物質の量を正確に測定するための方法、ならびに該方法で使用できる試薬を提供することである。

すなわち、本発明は以下のとおりである。

本発明は、尿中成分の免疫学的測定に用いるための試薬を提供し、この試薬は、尿素、チォシアン化カリウム、グァニジン塩酸塩、イミダゾール、ヒダントイン、馬尿酸および尿酸ナトリゥムからなる群より選ばれる物質を少なくとも 1種類含有する。

1つの実施態様では、上記試薬中の蛋白質の濃度が 0. 01〜1WZV%である。さらなる実施態様では、上記蛋白質はゥシ血清アルブミンである。

1つの実施態様では、上記試薬中の塩の濃度が 0. 01〜 10W/V%である。ある実施態様では、上記試薬は、標準液、希釈液または反応用試薬である。本発明はまた、上記試薬を含む、尿中成分測定用試薬キットを提供する。

さらに、本発明は、尿中成分の量を免疫学的に測定する方法を提供し、この方法は、 ( a ) 尿検体または尿検体と希釈液との混合液に反応用試薬を添加じて反応液を生成し、免疫学的反応による変化または生成物を測定する工程、

( b ) 標準液または標準液と希釈液との混合液に該反応用試薬を添加して反応液を生成し、免疫学的反応による変化または生成物を測定する工程、および

( c ) ( a ) の測定結果と（b ) の測定結果とを比較して、該尿検体中の尿中成分の量を決定する工程を含み、

ここで該希釈液、該標準液および該反応用試薬からなる群より選ばれる試薬の少なくとも 1つが、尿素、チォシアン化カリウム、グァニジン塩酸塩、イミダゾール、ヒダントイン、馬尿酸および尿酸ナトリウムからなる群より選ばれる物質の少なくとも 1種類を含有し、該（b ) で生成した反応液に、該物質が含まれる。

1つの実施態様では、上記（b ) で生成した反応液中の蛋白質の濃度が 0 . 0 0 0 2 5〜0 . 0 3 W/V%である。さらなる実施態様では、上記蛋白質はゥシ血清アルブミンである。

別の実施態様では、上記（b ) で生成した反応液中の塩の濃度が 0 . 0 0 0 2 5〜0 . 3 WZV%である。

1つの実施態様では、上記尿はヒトの尿である。

1つの実施態様では、上記尿中成分は、ジァセチルスペルミンである。

1つの実施態様では、上記免疫学的測定は、凝集法によるものである。さらなる実施態様では、上記凝集法は、ラテックス凝集法または金コロイド凝集法である。図面の簡単な説明

図 1は、種々の濃度の添加尿素を含む希釈液および標準液を使用した場合の尿中ジァセチルスペルミン濃度の測定値を示すグラフである。

図 2は、尿中ジァセチルスペルミン濃度と尿素含有希釈液および標準液を使用して測定した吸光度との関係を示すグラフである。

図 3は、種々の物質を添加した希釈液および標準液を使用した場合の尿中ジァセチルスペルミン濃度の測定値を示すグラフである。発明を実施するための最良の形態

以下、本発明を詳細に説明する。本発明の範囲はこれらの説明に拘束されることはなく、以下の例示以外についても、本発明の趣旨を損なわない範囲で適宜変更し実施し得る。

なお、本明細書は、本願優先権主張の基礎となる特願 2 0 0 6 - 2 8 2 2 7 8 号明細書の全体を包含する。また、本明細書において引用された全ての刊行物、例えば先行技術文献、及び公開公報、特許公報その他の特許文献は、参照として本明細書に組み込まれる。 .

本明細書を通して、溶液中の含有量を示すために記載した％は、特に記載がない限り、 wzv%を表す。

1 . 尿中成分の免疫学的測定のための試薬

本発明の試薬として、標準液、希釈液、および反応用試薬が挙げられる。

標準液とは、尿中に存在する物質（以下、「尿中成分」ともいう）の免疫学的測定において、被測定物質の検量線（以下、「標準曲線」ともいう）作成のために用いる溶液をいい、所定の濃度の被測定物質を含有する。標準液は、単一の濃度の被測定物質を含有する溶液であっても、複数の濃度の被測定物質を含有する複数の溶液であってもよい。

希釈液とは、尿検体中の被測定物質の濃度が検量線の濃度域の範囲内となるように、尿検体または標準液を希釈するために用いる溶液をいう。希釈液は、通常、検体を希釈するために使用されるが、溶解して標準液を調製するためあるいは標準液を希釈して種々の濃度の被測定物質を含む溶液を調製するために使用してもよい。

反応用試薬は、被測定物質に対応する免疫学的パートナーを含む試薬溶液であり得る。競合法の場合は、被測定物質に対応する免疫学的パートナーを含む試薬溶液および被測定物質と競合する物質を含む試薬溶液であり得る。

本発明によれば、尿中成分の免疫学的測定のために、特に標準品について、尿中成分の免疫学的反応を生じさせるための反応液中に、尿素、チォシアン化カリゥム、グァニジン塩酸塩、イミダゾール、ヒダントイン、馬尿酸、および尿酸ナトリウムの少なくとも 1種類の物質が含有されればよい。したがって、尿中成分の免疫学的測定に用いられる希釈液、標準液、および反応用試薬のうちのいずれかが上記物質を含有していればよい。

以下、本発明の試薬を、希釈液、標準液、および反応用試薬について個々に説明するが、これは、尿中成分の免疫学的測定に用いられる希釈液、標準液、および反応用試薬の全てが上記物質を含まなければならないことを意味するわけではない。

本発明の標準液または希釈液は、尿素、チォシアン化カリウム、グァニジン塩酸塩、イミダゾール、ヒダントイン、馬尿酸、および尿酸ナトリウム（尿酸ナトリウム塩）の少なくとも 1種を含有する。これらの物質は、単独でも、または組み合わせても含有され得る。これらの物質は、標準液または希釈液中での免疫反応の反応性を、尿検体の場合と差がないか、またはほとんど差がないようにできる濃度で含有される。被測定物質の測定値と真の値との乖離率が土 1 5%以内となるような濃度が好ましい。より好ましくは、 ± 10%以内であり、さらに好ましくは、 ± 8%以内である濃度である。例えば、上記物質を単独で含有させる場合、尿素は、 0. 2〜 1 2%、更に好ましくは 0. 5〜 1 0%；チォシアン化力リウムは、 0. 2〜1 2%、更に好ましくは 0. 5〜： 10%；グァニジン塩酸塩は、 0. 2〜： I 2 %、更に好ましくは 0. 5〜： 10 %；イミダゾールは、 0. 2 〜 1 2 %、更に好ましくは 0. 5〜 10 % ；ヒダントインは、 0. 2〜： I 2 %、更に好ましくは 0. 5〜； 10% ;馬尿酸は、 0. 00 1〜0. 2 %、更に好ましくは 0. 005〜0. 1 %；そして尿酸ナトリウムは、 0. 001〜0. 2%、更に好ましくは 0. 005〜0. 1 %の濃度で含有され得る。これらの物質を組み合わせて使用する場合は、上記の各濃度の 1 10の濃度でも含有され得る。これらの溶液は、蛋白質もまた含有し得る。好ましくは、 0. 01〜1%、更に好ましくは 0. 05〜0. 5%の濃度である。蛋白質としては、アルブミン、カゼイン、グロブリン、へモシァニン、サイログロブリンなどが挙げられる。その中でも、好ましいのはアルブミンであり、特に好ましいのは牛血清アルブミン (B S A) である。

これらの溶液は、塩もまた含有し得る。好ましくは、 0. 01〜10%、更に好ましくは 0. 05〜5%の濃度である。塩としては、塩化ナトリウム、塩化力リゥムなどの無機塩などが挙げられる。

これらの溶液は、 pHの維持のために、緩衝剤を含有し得る。緩衝剤としては、例えば、リン酸緩衝液、トリス塩酸緩衝液、コハク酸緩衝液、あるいはダリシルグリシン、 ME S (2— （N—モノホリノ）エタンスルホン酸）、 HE PE S (N— 2—ヒドロキシェチノレ一ピペラジン一 N，一エタンスルホン酸）、 TES (N—トリス（ヒドロキシメチル）メチルー 2—アミノエタンスルホン酸）、 M OP S (3— (N—モノホリノ）プロパンスルホン酸）、 P I PES (ピペラジン一 1， 4—ビス（2—エタンスルホン酸））などのグッド緩衝液が好適に用いられる。 pHは、 3. 0〜7. 0であることが好ましい。緩衝剤の使用濃度は、終濃度として 5〜50 OmMであることが好ましい。

その他の含有成分として、防腐剤としてのアジ化ナトリウム、キレート剤としての EDTAなどや、有機酸類、糖類、アミノ酸類を含有してもよい。

標準液は、検体の比較のために使用されるため、好ましい濃度の被測定物質を含有し得る。標準液は、希釈液に被測定物質を好ましい濃度となるように添加することによつても調製できる。例えば、被測定物質がジァセチルスペルミンである場合には、標準液には、測定に好ましい濃度のジァセチルスペルミンが含有される。好ましい濃度は、 0〜1 000 nMである。一般に、検量線作成のためには、異なる濃度の被測定物質を含む標準液が必要であり、該濃度の選択は当業者により適宜行われ、標準液は、希釈液で適宜希釈され得る。

上記標準液および希釈液は、測定の正確性を確認するためのコントロール液としても使用可能である。

本発明の反応用試薬は、尿素、チォシアン化カリウム、グァニジン塩酸塩、ィミダゾール、ヒダントイン、馬尿酸、および尿酸ナトリウムの少なくとも 1種を含有する。これらの物質は、単独でも、または組み合わせても含有され得る。これらの物質は、検体または標準液に希釈液を添加する場合または添加しない場合のいずれにおいても、検体または標準液に反応用試薬を添加して反応させる場合に、検体および標準液のそれぞれにおける免疫反応の反応性に差がないか、またはほとんど差がないようにできる濃度で含有される。被測定物質の測定値と真の値との乖離率が ± 1 5%以内となるような濃度が好ましい。より好ましくは、 ± 10%以内であり、さらに好ましくは、 ± 8%以内である濃度である。被測定物質の測定のために 2種以上の反応用試薬が必要な場合、反応用試薬のいずれかまたは全部（すなわち、少なくとも 1つの反応用試薬）に上記物質を含有し得る。反応用試薬は、例えば、単独では、尿素は、 0. 1〜3%、更に好ましくは 0. 5〜2%；チオシアン化カリウムは、 0. 1〜3%、更に好ましくは 0. 5〜 2%；グァニジン塩酸塩は、 0. 1〜3%、更に好ましくは 0. 5〜'2%；イミダゾールは、 0. ：!〜 3 %、更に好ましくは 0. 5〜 2 %；ヒダントインは、 0. 1〜3%、更に好ましくは 0. 5〜2%；馬尿酸は、 0. 0005〜0. 2%、更に好ましくは 0. 0007〜0. 1 %；そして尿酸ナトリウムは、 0. 000 5〜0. 2%、更に好ましくは 0. 0007〜0. 1 %の濃度で含有され得る。これらの物質を組み合わせて使用する場合は、上記の各濃度の 1ノ10の濃度でも含有され得る。

上記物質を含むこと以外は、反応用試薬は、必要に応じて、被測定物質の測定について公知の組成を有し得る。例えば、上記標準液または希釈液と同様に、防腐剤、キレート剤、有機酸類、糖類、アミノ酸類などを含有してもよレ、。

2. 尿中成分測定用キット

上記で説明した希釈液、標準液および反応用試薬は、尿中成分の免疫学的測定のために、これらの少なくとも 1つを含むキットとしてもよレ、。

本発明のキッ卜に含まれる標準液は、好ましい最大濃度の被測定物質を含む 1 つの溶液であり得る。これを継代希釈して使用し、より低い濃度の標準液を調製してもよい。あるいは、本発明のキットは、検量線作成用に数種の濃度の被測定物質を含む各溶液を標準液として含んでもよい。

本発明のキットは、上記物質を含む標準液の代わりに、標準液を調製するための被測定物質の標品と上記物質を含む希釈液とをともに含んでもよい。もちろん、上記物質を含む希釈液は、所定の濃度の被測定物質を含む標準液とともに含んで、標準液および検体の希釈のために使用してもよい。

本発明のキットは、上記物質を含む反応用試薬を単独で:^み、通常の標準液および zまたは希釈液を用いても、あるいは上記物質を含む標準液およびまたは上記物質を含む希釈液と合わせて含んでもよい。

本発明のキットは、上記物質を含む希釈液、標準液または反応用試薬のような試薬に加えて、被測定物質の免疫学的測定に必要な他の成分（試薬または器具）をさらに含み得る。測定の手順を示す指示書もまた、含まれ得る。

3 . 尿中成分の免疫学的測定方法

尿中成分免疫学的測定は、被測定物質（例えば、抗原または抗体）とそれに対応する免疫学的パートナー（例えば、上記抗原に対する抗体または上記抗体に対する抗原）との間の免疫反応を利用する。免疫学的測定には、被測定物質とこれに対応する免疫学的パートナーとの免疫反応を検出することにより、直接的に被測定物質を検出する方法、および被測定物質とその競合物質を共存させて競合免疫反応を検出することにより、間接的に被測定物質を検出する方法がある。尿検体を、被測定物質に対応する免疫学的パートナーを含む反応用試薬と合わせて (競合法の場合は、さらに被測定物質と競合する物質を含む反応用試薬と合わせて）、反応液を生成し、反応液中での免疫学的反応による変化または生成物の量を測定し、該尿検体中に含まれる被測定物質の量を測定する。測定手段としては、光学的手段が好適に用いられ得る。

被測定物質の量（通常、濃度）は、標準品（通常、溶液の形態である）を尿検体の代わりに用いて反応液を生成し、反応液中での免疫学的反応による変化または生成物の量を測定し、この測定結果と尿検体での測定結果とを比較することにより決定され得る。例えば、少なくとも 2濃度の標準品を尿検体の代わりに用いて、免疫学的反応による変化または生成物の量を測定し、これらの測定値（例えば、吸光度）と被測定物質の量との関係を示す検量線を作成し、尿検体中の被測定物質の測定値を検量線と比較することによって、尿検体中の被測定物質の量を決定し得る。尿検体中の被測定物質を測定した場合に検量線の濃度域を超えるか、または超えると想定される場合には、検量線の濃度範囲となるように、希釈液で尿検体を希釈し得る。

本発明の方法では、測定値と真の値との乖離が生じないようにするために、特に標準品について、尿中成分の免疫学的反応を生じさせるための反応液中に、尿素、チォシアン化カリウム、グァニジン塩酸塩、イミダゾール、ヒダントイン、馬尿酸、尿酸ナトリゥムの中から選ばれる少なくとも 1種類の物質が含有されればよい。このため、希釈液、標準液、および反応用試薬の少なくとも 1つが、上記物質を含有する。最終的に、上記反応液中に、例えば、単独では、尿素は、 0. 0056〜0. 34%、更に好ましくは 0. 0 14〜 0. 28% ;チオシァン化カリウムは、 0. 0056〜0. 34%、更に好ましくは 0. 0 14〜0. 2 8%；グァニジン塩酸塩は、 0. 0056〜0. 34 %、更に好ましくは 0. 0 14〜0. 28%；イミダゾールは、 0. 0056〜0. 34%、更に好ましくは 0. 014〜 0. 28 %；ヒダントインは、 0. 0056〜 0. 34 %、更に好ましくは 0. 014〜◦. 28% ;馬尿酸は、 0. 000028〜0. 005 6%、更に好ましくは 0. 00014〜0. 0028%；尿酸ナトリウムは、 0. 000028〜0. 0056 %、更に好ましくは 0. 000 14〜0. 002 8%含まれ得る。これらの物質が組み合わせて使用される場合は、上記の各濃度の 1 10の濃度でも含有され得る。

上記反応液中には、蛋白質もまた含有され得る。好ましくは、 0. 00025 〜0. 03%、更に好ましくは 0. 001〜0. 01 %の濃度である。蛋白質としては、アルブミン、カゼイン、グロブリン、へモシァニン、サイログロブリンなどが挙げられる。その中でも、好ましいのはアルブミンであり、特に好ましいのは牛血清アルブミン（BSA) である。

上記反応液中には、塩もまた含有され得る。好ましくは、 0. 00025〜0. 3%、更に好ましくは 0. 001〜0. 1%の濃度である。塩としては、塩化ナトリゥム、塩化カリゥムなどの無機塩などが挙げられる。

尿中成分の測定試薬として上記物質を含有する反応用試薬を用いる場合、尿検体の希釈には精製水や生理食塩水や緩衝液を用いてもよい。

本発明の方法において、測定のための尿としては各種動物の尿が対象になるが、好ましくはヒトの尿である。

本発明において免疫学的に測定される尿中成分は、尿中に存在し得る、免疫学的に測定可能な物質であれば特に限定されない。タンパク質、脂質、多糖類などの高分子であっても測定対象となり得る。免疫学的に測定可能な物質としては、例えば、各種抗原、抗体、レセプター、酵素なども含まれる。例えば、ジァセチルスペルミンが挙げられる。

本発明に適用される免疫学的測定法としては、 R I A法、 E I A法、免疫比濁法、ラテックス凝集法、金属コロイド凝集法などが挙げられる。金属コロイド凝集法で用いられる金属コロイドとしては、金、銀、セレンなどのコロイドがありいずれでもよく、利用しやすい点からは、金コロイドが好ましい。反応液の分離や洗浄操作を行わない検査の自動化が容易な免疫凝集法が好ましく、特にラテツクス凝集法ゃ金コロイド凝集法が好ましい。反応液の分離や洗浄操作を行わない免疫凝集法では、検体や標準液などの溶液成分が測定の最後まで反応液中に保持されるので、本発明の試薬の使用はより好適である。

例えば、抗原（または抗体）である被測定物質を測定する場合、ラテックス凝集法、金属コロイド凝集法では、被測定物質である抗原（または抗体）に対する抗体（または抗原）を、担体のラテックスや金属コロイドに予め結合させておく。例えば、金コロイド凝集法の場合、あらかじめ金コロイドと結合させた標識抗体 (または標識抗原）力被測定物質である抗原（または抗体）を介して凝集する。その際に生じる色差（色調変化）を光学的に測定し、抗原量または抗体量を測定する。

ジァセチルスペルミンが免疫学的に測定される場合、好ましくは、特開 2 0 0 6— 3 8 5 9 4号公報に記載の方法が用いられる。以下、実施例に基づいて本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらによって限定されるものではない。

まず、本実施例で使用した免疫学的測定を、以下に説明する（参考例 1〜6 ) 。〔参考例 1〕

<ァセチルスペルミン結合 B S Aの調製〉

ァセチルスペルミン結合 B S Aを、「ヒラマツ（Hiramatsu, K.) ら，ジャーナル ·ォブ ·バイオケミストリー（J. Biochem.) ， 1 9 9 8年，第 1 2 4卷， p . 2 3 1— 2 3 6」に記載の方法に準じて調製した。まず、担体蛋白質である B SA200mgと S—ァセチルメルカプト無水コハク酸 1 5mgとを 0. 1M リン酸緩衝液（pH7. 0) 中で混合し、室温で 30分間攪拌して、 S—ァセチルメル力プトコハク酸（AMS)— B S A複合体を作製した。これとは別に、二価性架橋試薬である GMB S 45 mgと N—ァセチルスペルミン · 3塩酸塩 147 mgとをテトラヒドロフラン Z 50 mMリン酸緩衝液（ p H 7. 0 ) (1 : 1 ( v/v) ) 中で室温にて 30分間混合して、ァセチルスペルミン一 GMB結合物を作製した。次いで、 AMS— B S A20 Omgにヒドロキシルァミン塩酸塩 4. 2m gを加え、メノレカプトスクシ二ルー B S A (MS— B SA) とした。次いで、ァセチルスペルミン一 GMB結合物と MS— B S Aとを混合して、 N—ァセチルスペルミンがァシルアミド結合した免疫抗原ァセチルスペルミン一GMB — B SAを作製した。このようにしてァセチルスペルミンを担体にァシルアミド結合させることにより、ジァセチルスペルミン類似化合物を側鎖として多数有する免疫抗原を作製した。

ァセチルスペルミン結合 B S Aの濃度は、 1111 §7111しの8 S A溶液の 280 nmにおける吸光度（光路長 l cm) である A₂₈。を 0. 66として、 A ₂₈₀値に基づいて算出した。

〔参考例 2〕

<抗ジァセチルスペルミンモノクローナル抗体の調製 >

上記参考例 1で得たァセチルスペルミン結合 B S Aとアジュバントとの混和物をマウスに投与した。投与は、 2週間間隔で 4回免疫を行った。免疫する最終日の 4日後に抗体産生細胞を採取した。

次に、採取した抗体産生細胞とミエローマ細胞との細胞融合を行い、ハイプリドーマを得た。細胞融合は、血清を含まない動物細胞培養用培地（RPMI— 1 640培地）で、 1 X 10⁶〜 1 X 1 0⁷個 ZmLの抗体産生細胞と 2 X 1 0⁵〜 2 X 10⁶個/ mLのミエローマ細胞とを混合し、細胞融合促進剤（1 000〜 600 OD aのポリエチレングリコール）を添加した状態で融合させた。細胞融合後、細胞から目的とするハイプリドーマを選択した。このために、細胞懸濁液をゥシ胎児血清含有 R PM I - 1640培地で希釈し、マイクロタイタープレートにまいた。各ゥヱルに HAT選択培地を加え培養し、 2週間程度で生育した細胞をハイプリドーマとして得た。増殖してきたハイプリドーマの培養上清の一部を採集し、酵素免疫測定法によって、ジァセチルスペルミンに反応する抗体をスクリ一二ングした。融合細胞は、限界希釈法によりクローニングを行った。ジァセチルスペルミンに強い反応性を示し、かつ（1) Nしァセチルスペルミジンとの交差反応が 0. 1%以下、および/または（2) 尿中のジァセチルスペルミン類似物質との交差反応による測定結果への干渉の総和が 5%以下である抗体を産生するハイプリドーマを選択し、樹立した。樹立したハイプリドーマから、 3 7°Cにて、 5%。0₂濃度で7〜14日の培養によってモノクローナル抗体を採取した。採取した抗体を、硫安塩析法により精製した。

〔参考例 3〕

<金コロイド液の調製 >

95°Cの蒸留水 1 Lに 1 0%塩化金酸溶液 2mLを攪拌しながら加え、 1分後に 2%クェン酸ナトリウム溶液 1 OmLを加え、さらに 20分間攪拌した後 3 0°Cに冷却した。冷却後、 0. 1M炭酸カリウム溶液で p H 7. 1に調節した。

〔参考例 4〕

<第 1試薬の調製 >

上記参考例 1で調製したァセチルスペルミン結合 B SA66. 0 n g/mL, 2. 0%塩化ナトリウム、および 1. 85%ポリエチレングリコール 20000 (P EG) (P EG濃度は、測定感度を出すため、ロットにより若干異なつた。）を含む、 0. 2%EDTA、 0. 2%TWEEN80、 0. 0 G 1 %DT T、 0. 025% 1—チォグリセロールおよび 0. 0 1 %アジ化ナトリウムを含む 25 OmM ME S (ρ Η6. 2 ) を調製し、第 1試薬とした。

〔参考例 5〕

<第 2試薬の調製 >

上記参考例 2で調製した抗ジァセチルスペルミン抗体を、 0. 05%アジ化ナトリウムを含む 10 mM HE PES (p H 7. 1) で希釈し、 40 gZmL の濃度にした。この液 1 0 OmLを上記参考例 3で調製した金コロイド液 1 Lに加え、冷蔵下で 2時間攪拌した。この混合物に、 5. 46%マンニトール、 0. 5 % B S A、および 0. 05 %ァジ化ナトリウムを含む 1 0 mM HE PE S (p H 7. 1) を 1 1 OmL添加し、 37 °Cで 90分間攪拌し、 8, 000回転で 40分間遠心分離し、上清を除去した。得られた残渣に、 3%マンニトール、 0. 1%B SA、および 0. 05 %アジ化ナトリウムを含む 5 mM HE P E S (pH7. 5) (A溶液）を約 1 L加え、抗体結合金コロイドを分散させた後、 8, 000回転で 40分間遠心分離し、上清を除去した。残渣を A溶液に分散させ、この抗ジァセチルスペルミン抗体結合金コロイドの分散液を精製水で 30倍希釈したときに 540 nmでの吸光度が 1. 0となるように A溶液を添加し、抗体結合金コロイド原液とした。

さらに、抗体結合金コロイド原液を A溶液で 3倍希釈して、抗ジァセチルスべルミン抗体結合金コロイド試薬を調製し、第 2試薬とした。

〔参考例 6〕

<尿中ジァセチルスペルミンの測定〉

ジァセチルスペルミン含有尿検体 7 μ Lおよび上記参考例 4で調製した第 1試薬 180 /z Lを混合 ·攪拌し、 37°Cで約 5分加温した。次いで、上記参考例 5 で調製した第 2試薬 60 μ Lを添加 ·攪拌した後、日立 7070形自動分析装置により主波長 546 nmおよび副波長 660 nmで測光ポイント 1 8から 3 1の二ボイント測定を行って、二ボイント間の吸光度差を求めた。 '測定時間は約 10 分間であった。

標準曲線を作成するために、希釈液を用いて標準液を調製した。必要に応じて、ジァセチルスペルミン含有尿検体の調製のために希釈液を用いた。

〔実施例 1〕

<尿検体中のジァセチルスペルミンの測定に対する標準液および希釈液の尿素濃度の影響〉 - 本実施例においては、尿検体中のジァセチルスペルミンの測定に対する標準液および希釈液の尿素濃度の影響を調べた。

( 1 - 1. 尿素を含む標準液および希釈液に関する検討）

0. 3%B SA、 0. 9%塩化ナトリウム、および 0. 2M ME S (p H 6. 2) を含む溶液に、尿素を 0%、 0. 01%、 0. 05%、 0. 1%、 0. 5%、 1%、 5%、 1 0%、 1 5%、 20%、 25%、および 30 %になるようにそれぞれ添加した。得られたそれぞれの尿素溶液を希釈液とした。種々の尿素濃度の希釈液を用いて、ジァセチルスペルミンを、 O nM、 10 nM、 50 nM、 20 0 nM、 400 nM、および 1 000 n M含む標準液を調製した。一方、尿検体として、ジァセチルスペルミンを 1 54 nM含有することを、上記第 1試薬（参考例 4) および第 2試薬（参考例 5) により測定し、質量分析法にて定量された標準品を用いて作成した標準曲線により値付けして確認した、健常人プール尿を用いた。上記各尿素濃度につき 6点の標準液および尿検体について、日立 707 0形自動分析装置にて、第 1試薬および第 2試薬を添加して吸光度差を測定し、各尿素濃度における標準曲線から、尿検体中のジァセチルスペルミン濃度をそれぞれ求めた。この測定値と真の値との乖離率から尿素の最適な添加濃度を決定した。この結果を、表 1および図 1に示す。

表 1より、尿素濃度が 0%の場合、ジァセチルスペルミン 1 54 nM尿検体は、 1 7 1. 3 nMと測定され、真の値との乖離率が + 1 1.3%であった。 0. 0 1%では + 1 2. 2%、 0. 05%では + 1 3.4%、 0. 1%では + 1 8.3% であり、真の値との乖離率が高い値を示した。 0. 5%では + 7. 4%、 1%は + 7. 4 %、 5 %は一 1. 0 %、 10 %は _ 8. 5 %となり、真の値との乖離率は ± 10%以内に収束していた。また、 1 5%以上になると、 1 5%以上の減少が見られた。このことから尿素を適量加えることにより、測定値が真の値に近づくことカゎ力つた。

図 1は、横軸に希釈液中の尿素添加濃度（％) を示し、縦軸にジァセチルスべルミン濃度の測定値（nM) を示す。尿検体中のジァセチルスペルミン濃度の真の値である 1 54 nMのバーもまた示した。図 1から、約 0. 5%〜約 10%の尿素添加が有効であると考えられる。

尿素有効濃度幅をさらに細かく検討した。 0. 3%B SA、 0. 9%塩化ナトリウム、および 0. 2M ME S (pH6. 2) を含む溶液に、尿素を 0. 1 %、 0. 2%、 0. 3%、 0. 4%、 1 1%、 1 2%、 1 3%、 14%、および 1 5 %になるようにそれぞれ添加した。得られたそれぞれの尿素溶液を希釈液とした。種々の尿素濃度の希釈液を用いて、ジァセチルスペルミンを、 O nM、 10 nM、 50 nM、 200 nM、 400 nM、および 1 000 nM含む標準液を調製した。一方、尿検体として、ジァセチルスペルミンを 1 20 nM、および 23 8 nM含有することを、上記第 1試薬（参考例 4) および第 2試薬（参考例 5) により測定し、質量分析法にて定量された標準品を用いて作成した標準曲線により値付けして確認した、 2種の健常人プール尿を用いた。上記各尿素濃度につき 6点の標準液および尿検体について、日立 7070形自動分析装置にて、第 1試薬および第 2試薬を添加して吸光度差を測定し、各尿素濃度における標準曲線から、尿検体中のジァセチルスペルミン濃度をそれぞれ求めた。この測定値と真の値との乖離率から尿素の最も適した添加濃度を決定した。この結果を表 2に示す。

表 2

表 2より、尿素濃度が 0. 1%の場合、ジァセチルスペルミン 1 20 nM尿検体は、 1 38. 2 nMと測定され、真の値との乖離率が + 1 5. 1%であった。一方、 0. 2%では + 1 2. 9%、 0. 3%では + 1 1. 2%、 0. 4%では + 9. 1 %であり、真の値との乖離率が士 1 5 %未満であり、尿素添加有効範囲内であった。さらに、 1 5%では 238 nM尿検体は 187. 9 nMと測定され、真の値との乖離率が一 21. 1 %、また、 14%では— 1 9. 3%、 1 3%では - 18. 4%であった。一方、 12%は 206. 5 nMと測定され、真の値との乖離率は— 1 3. 8%であり、乖離率 ± 1 5%以内に収束していた。

以上の結果をまとめると、乖離率 ± 1 5%内に収まる尿素の有効範囲は 0. 2 〜： 1 2%であると考えられる。

(1-2. BS Aを含む標準液および希釈液に関する検討）

上記 1— 1の結果を受けて、尿素の含有量を 5%とした。したがって、 5%尿素、 0. 9%塩化ナトリウム、 0. 2M MES (p H 6. 2) を含む溶液に、 83 を0%、 0. 01%、 0. 1%、 0. 3%、 1%、および 3%になるようにそれぞれ添加した。得られたそれぞれの B S A溶液を希釈液とした。種々の B S A濃度の希釈液を用いて、ジァセチルスペルミンを、 O nM、 10 nM, 50 nM、 200 nM、 400 nM、および 1 000 n M含む標準液を調製した。一方、尿検体として、ジァセチルスペルミンを 1 54 nM含有することを、上記第 1試薬（参考例 4) および第 2試薬（参考例 5) により測定し、質量分析法にて定量された標準品を用いて作成した標準曲線により値付けして確認した、健常人プール尿を用いた。上記各 B S A濃度につき 6点の標準液および尿検体について、日立 7070形自動分析装置にて、第 1試薬および第 2試薬を添加して吸光度差を測定し、各 B S A濃度における標準曲線から、尿検体中のジァセチルスペルミン濃度をそれぞれ求めた。真の値に対する測定値の割合（一致率）から B SAの添加濃度について検討した。この結果を表 3に示す。表 3

上記表 3からわかるように、 B S A濃度が 3 %の場合に若干測定値の低下が見られた以外は、ほぼ 100%の値を示した。

〔実施例 2〕

<尿中ジァセチルスペルミンの測定〉

本実施例では、 5%尿素、 0. 3%83八、ぉょび0. 9%塩化ナトリウムを含む 0. 2M MES (pH6. 2) を希釈液として使用した。この希釈液を用いて、ジァセチルスペルミンを、 O nM、 1 0 nM、 50 n M、 200 nM、 4 00 nM、および 1000 nM含む標準液を調製した。これらの 6点の標準液から標準曲線を作成した。結果を図 2に示す。図 2の横軸は、ジァセチルスペルミンの濃度（nM) を示し、そして縦軸は、吸光度（ODX 10000) を示す。図 2から明らかなように、尿中ジァセチルスペルミン濃度に応じ吸光度の低下が見られた。

一方、尿検体として、ジァセチルスペルミンを 1 54 nMおよび 240 n M含有することを、上記第 1試薬（参考例 4) および第 2試薬（参考例 5) により測定し、質量分析法にて定量された標準品を用いて作成した標準曲線により値付けして確認した、 2種の健常人プール尿を用いた。尿検体 A ( 1 54 nM) および B (240 nM) 中のジァセチルスペルミン濃度を測定した（n = 4) 。結果を表 4に示す。表 4

上記表 4から明らかなように、 5%尿素、 0. 3%B SA、 0. 9%塩化ナトリウムを含む 0. 2M ME S (pH6. 2) を標準液および希釈液として使用した場合には、得られた測定値は、真のジァセチルスペルミン濃度との誤差があまりなかった。このように、上記溶液を標準液および希釈液として使用することにより、尿検体のマトリックスの影響を無視でき、生理食塩水を使用する場合に生じるような測定乖離が回避され得る。〔実施例 3〕

<標準液を調製するための液中成分の検討 >

本実施例では、ジァセチルスペルミン測定において検体に正確な測定値を与えるのに有効である可能性がある物質を用いて標準液を調製し、これを用いて尿検体中のジァセチルスペルミン濃度を測定した。

まず、 0. 3%B SA、 0. 9%塩化ナトリウム、 0. 2M ME S (p H 6. 2) を含む溶液に、以下の濃度となるように各試験物質をそれぞれ添加し、希釈液を得た： 1%チォシアン化カリウム（KSCN) 、 1%グァニジン塩酸塩（G d n H C 1 ) 、 1 %イミダゾ一ル、 1 %ヒダントイン、 0. 05 %馬尿酸または 0. 05%尿酸ナトリウム（尿酸 _Na) 。ポジティブコントロールとして、 1%尿素を添加した溶液、ネガティブコントロールとして、 B SA、塩化ナトリゥム、 ME S以外の物質を含まない溶液（ベース）、また、生理食塩水（0. 9%Na C 1 ) を用いた。これらの希釈液を用いて、ジァセチルスペルミンを、 O nM、 10 nM、 50 n M、 200 n M、 400 n M、および Ι Ο Ο Ο ηΜ含む標準液を調製した。一方、尿検体として、ジァセチルスペルミンを 1 54 nM 含有することを、上記第 1試薬（参考例 4) および第 2試薬（参考例 5) により測定し、質量分析法にて定量された標準品を用いて作成した標準曲線により値付けして確認した、健常人プール尿を用いた。上記各物質につき 6点の標準液および尿検体について、日立 7070形自動分析装置にて、第 1試薬および第 2試薬を添加して吸光度差を測定し、各物質における標準曲線から、尿検体中のジァセチルスペルミン濃度をそれぞれ求めた。結果を表 5および図 3に示す（図 3は、表 5の結果をグラフ化したものであり、横軸は添加物質を示し、縦軸はジァセチルスペルミン濃度の測定値（nM) を示す）。表 5

表 5および図 3に示すように、ネガティブコントロールであるべ一'スを用いた場合、 1 54 nM尿検体は 1 71. 3 nMと測定され、真の値との乖離率は + 1 1.3%となり、 10%を超えるものであった。また、生理食塩水（0. 9% N a C 1 ) においても 1 70. 9 nMと高値を示し、 10 %を超える乖離が見られた。これに対し、 1%イミダゾール、 1%ヒダントイン、 0. 05%尿酸ナトリゥム、 0. 05%馬尿酸、 1 %グァニジン塩酸塩、または 1 %チォシアン化カリゥム添加による測定値は、それぞれ 1 68. 1 nM、 1 66. O nM、 1 63. 8 nM, 1 63. 4 nM、 1 59. 4 nM、および 147. 7 nMとなり、 1% 尿素添加時の測定値 165. 4 nMに近い結果が得られ、真の値との乖離率は土 10%以内であった。〔実施例 4〕

<第 1試薬への尿素の添加 >

尿素を第 1試薬に添加した場合の効果について検討した。

詳しくは、まず、第 1試薬（参考例 4) に尿素を 0. 2%または 1%となるように添加した。尿検体として、ジァセチルスペルミンをそれぞれ 475. 3 nM (検体 A) 、 477. 1 nM (検体 B) 、 6 1 2. 2 nM (検体 C) および 57 7. 5 nM (検体 D) 含有することを、上記第 1試薬（参考例 4) および第 2試薬（参考例 5) により測定し、質量分析法にて定量された標準品を用いて作成した標準曲線により値付けして確認した尿検体を用い、それぞれ精製水で 5倍希釈した。

5%尿素、 0. 3%B SA、および 0. 9 %塩化ナトリウムを含む 0. 2M ME S (p H 6. 2) を希釈液として用いて、ジァセチルスペルミンを、 O nM 10 nM、 50 nM、 200 nM、 400 nM、および 1000 nM含む標準液を調製した。これらの 6点の標準液から標準曲線を作成した。

尿素添加した第 1試薬を用いて、希釈した尿検体中のジァセチルスペルミン濃度を測定した。結果を表 6に示す。表 6

表 6から、 0. 2%尿素添加または 1 %尿素添加の第 1試薬を用いて、精製水で 5倍希釈した尿検体を測定した結果、両者とも表示値に対して 90%以上の一致がみられた。このことより、試薬自体に尿素を添加しても、検体に真の測定値を与えることが可能であることが示される。産業上の利用可能性

本発明によれば、尿中成分を免疫学的に測定する際に、被測定物質（該尿中成分）の量をより正確に測定できる。診断指標または早期診断マーカーとして用いられ得る物質において、その物質の量で陽性か否かが決定される場合、より正確な診断が可能となる。例えば、ジァセチルスペルミンは、簡便かつ安価に使用可能な金コロイド法を用いて好適に測定され得るが、この方法においてもさらに精度が上昇し、より利用しやすいものとなる。

Claims

請求の範囲

1. 尿中成分の免疫学的測定に用いるための試薬であって、尿素、チォシアン化力リゥム、グァニジン塩酸塩、ィミダゾール、ヒダントイン、馬尿酸および尿酸ナトリウムからなる群より選ばれる物質を少なくとも 1種類含有する、前記

2. 前記試薬中の蛋白質の濃度が 0. 01〜1WZV%である、請求項 1に記載の試薬。

3. 前記蛋白質がゥシ血清アルブミンである、請求項 2に記載の試薬。

4. 前記試薬中の塩の濃度が 0. 01〜10^¥ ％である、請求項 1〜3のいずれか 1項に記載の試薬。

5. 前記試薬が、標準液、希釈液または反応用試薬である、請求項 1〜4のいずれか 1項に記載の試薬。

6. 前記尿がヒトの尿である、請求項 1〜5のいずれか 1項に記載の試薬。

7. 前記尿中成分がジァセチルスペルミンである、請求項 1〜6のいずれか 1項に記載の試薬。

8. 前記免疫学的測定が凝集法によるものである、請求項 1〜 7のいずれか 1項に記載の試薬。

9. 前記凝集法がラテックス凝集法または金コロイド凝集法である、請求項 8に記載の試薬。

10. 請求項 1〜9のいずれか 1項に記載の試薬を含む、尿中成分測定用試薬キッ卜。

1 1. 尿中成分の量を免疫学的に測定する方法であって、

(a) 尿検体または尿検体と希釈液との混合液に反応用試薬を添加して反応液を生成し、免疫学的反応による変化または生成物を測定する工程、

(c) (a) の測定結果と（b) の測定結果とを比較して、該尿検体中の該尿中成分の量を決定する工程を含み、ここで該希釈液、該標準液および該反応用試薬からなる群より選ばれる試薬の少なくとも 1つが、尿素、チォシアン化カリウム、グァニジン塩酸塩、イミダゾール、ヒダントイン、馬尿酸および尿酸ナトリウムからなる群より選ばれる物質の少なくとも 1種類を含有し、該（b) で生成した反応液に、該物質が含まれる、前記方法。

12. 前記（b) で生成した反応液中の蛋白質の濃度が 0. 00025〜0. 0 3WZV%である、請求項 1 1に記載の方法。

13. 前記蛋白質がゥシ血清アルブミンである、請求項 12に記載の方法。

14. 前記（b) で生成した反応液中の塩の濃度が 0. 00025〜0. 3WZ V%である、請求項 1 1〜13のいずれか 1項に記載の方法。

15:. 前記尿がヒトの尿である、請求項 1 1〜14のいずれか 1項に記載の方法。

16. 前記尿中成分がジァセチルスペルミンである、請求項 1 1〜15のいずれか 1項に記載の方法。

1 7. 前記免疫学的測定が凝集法によるものである、請求項 1 1〜16のいずれか 1項に記載の方法。

18. 前記凝集法がラテックス凝集法または金コロイド凝集法である、請求項 1 7に記載の方法。