WO2008044358A1 - Ensemble d'amorces destiné à la détection d'une levure saccharomyces - Google Patents

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WO2008044358A1
WO2008044358A1 PCT/JP2007/060154 JP2007060154W WO2008044358A1 WO 2008044358 A1 WO2008044358 A1 WO 2008044358A1 JP 2007060154 W JP2007060154 W JP 2007060154W WO 2008044358 A1 WO2008044358 A1 WO 2008044358A1
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sequence
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Nobuyuki Hayashi
Satoshi Yoshida
Keiko Kanai
Shigehito Ikushima
Toshiko Minato
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Kirin Beer Kabushiki Kaisha
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
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    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor
    • C12N15/1006—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor by means of a solid support carrier, e.g. particles, polymers
    • C12N15/1013—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor by means of a solid support carrier, e.g. particles, polymers by using magnetic beads
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    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers

Definitions

  • the present invention relates to a primer set for detecting Saccharomyces yeasts, and more particularly to a LAMP method primer set and a PCR method primer set for detecting Saccharomyces yeasts.
  • the present invention also relates to a method for detecting and quantifying Saccharomyces yeasts using this primer set.
  • Saccharomyces yeasts are widely used for the production of alcoholic beverages such as beer, wine, sake, shochu, whiskey, as well as bread. Saccharomyces cerevisiae is used in the production of top-fermented beer such as ale, wine, sake, fruit wine such as cider, and distilled spirits such as shochu and whiskey. Saccharomyces bavanus (Saccharomvces bavanus) is used in the production of wine, sherry, or foaming wine. The bottom fermenting yeast used in the manufacture of Pilsner-type beer is now classified as Saccharomvces pastorianus (Kurtzman, CP.
  • Saccharomyces yeasts may also be separated in soft drinks, especially fruit juice drinkability.
  • Saccharomyces yeast grows in a product, it has a great influence on the industry. Therefore, a technique for rapidly detecting and identifying these yeasts is important for quality control.
  • the Saccharomyces yeast isolated from the product is a yeast that was used in the manufacturing process, it may be caused by a leak in the upstream power of the manufacturing process or a defective filtration process. If this is the case, there may be a cause such as poor cleaning of the filling machine or accumulation in the piping. Therefore, the technology to identify yeast that has been separated from the product when contaminated is important to clarify the goals to be addressed.
  • Saccharomyces 'Pastorianus, Saccharomyces' Celepische, Saccharomyces 'Banus are taxonomically related, and SaccharomYces sensu stncto and ⁇ together with several yeasts such as Saccharomyces' Paradocus and Saccharomyces-Mikatae.
  • Saccharomyces'Pastorianus, Saccharomyces' Celepische, Saccharomyces 'Banus are taxonomically related, and SaccharomYces sensu stncto and ⁇ together with several yeasts such as Saccharomyces' Paradocus and Saccharomyces-Mikatae.
  • ⁇ * 3 ⁇ 4 forming a scientific gnole (Naumov, GI et al .: Int. J. Syst. Evol. Microbiol, 2000, vol.
  • Saccharomyces' Pastorianus Saccharomyces cereviche and Saccharomyces bayanus are considered to be formed by crossing, and it has been confirmed to be a hybrid of both at gene level and chromosome level (Kielland-Brandt, MC et al .: Genetics of brewing yeast. The Yeast, 2nd ean, vol. 6, pp223—254, Edit ed by Wheals, et al., Academic Press, New York, Ryu, S.— L. et al .: Yeast, 1996, vol .12, 757, Tamai, Y.e t al: Yeast, 1998, vol.
  • Known methods include karyotype analysis, mitochondrial DNA restriction enzyme cleavage analysis, rRNA gene nucleotide sequence analysis, rDNA restriction enzyme cleavage analysis, UP-PCR, isozyme analysis, PCR-temperature gradient gel electrophoresis, and real-time PCR.
  • PCR and real-time PCR require advanced temperature control and fluorescence observation, expensive equipment is required. Also, PCR requires electrophoresis, staining, photography, etc. after the reaction, and it takes time to determine the results after the gene amplification process.
  • RAPD PCR, amplification product restriction enzyme treatment, nucleotide sequence analysis, isozyme analysis, temperature gradient gel electrophoresis, etc. require more time and troublesome operations than normal PCR, and are performed in daily microbial testing operations. There was a problem with that.
  • Saccharomyces' Pastorianus is a subgenome derived from Saccharomyces cerevisiae
  • the present inventors identified the positions of chromosome translocations in the right arm of chromosome XVI, the right arm of chromosome III, and the left arm of chromosome VII of Saccharomyces pastorianus, and analyzed the genome around the translocation position. .
  • the present inventors have also succeeded in developing a primer set that can accurately detect Saccharomyces yeast based on the information.
  • the invention relating to the chromosomal translocation of the right arm of chromosome XVI is the first embodiment and the second embodiment, the invention relating to the chromosomal translocation of the right arm of chromosome m is the third aspect, and the invention relating to the chromosomal translocation of the chromosome left arm is a fourth aspect.
  • the present inventors have recently analyzed the genome of a bottom fermentation yeast belonging to Saccharomyces' Pastorianus, and the Sc type XVI chromosome of the bottom fermentation yeast caused a translocation to the L g chromosome within the ORF of GPH1 in the right arm. Furthermore, we found that the translocation again occurred within the ORF of QCR2 toward the right arm end, and returned to the Sc type. That is, the present inventors have found that in the bottom fermenting yeast, only the Lg-type nucleotide sequence exists in the region sandwiched between GPH1 and QCR2 on the right arm of chromosome XVI.
  • the present inventors designed a LAMP primer set for detecting Saccharomyces pastorianus based on the sequence of the Lg-type MET16 gene (SEQ ID NO: 6) present in the region between GPH1 and QCR2. It was found that Saccharomyces pastorianus can be accurately detected by the primer set.
  • the sequence of the Lg-type MET16 gene has been previously disclosed in a public database, and is a novel sequence.
  • the polynucleotide represented by at least 10 bases that hybridizes to the polynucleotide represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 6 or the complementary sequence of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 6 is used.
  • a probe or primer for detecting Saccharomyces past QEi comprising a polynucleotide of at least 10 bases that hybridizes to a polynucleotide to be detected.
  • a LAMP method primer set for detecting Saccharomyces cerevisiae 'Pastorianus comprising two or more of the above-mentioned primers.
  • a PCR method primer set for detecting Saccharomyces pastorinus comprising two or more of the above-mentioned primers.
  • a LAMP method primer set for detecting Saccharomyces pastorinus comprising the following polynucleotide: represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 A polynucleotide of at least 10 bases that hybridizes to a polynucleotide represented by a polynucleotide (FIP) or a complementary sequence of the base sequence;
  • FEP polynucleotide
  • the present inventors also designed a PCR primer set for detecting Saccharomyces' Pastorianus based on the chromosomal translocation position of the right arm of chromosome XVI of bottom fermenting yeast, and Saccharomyces. Pastorianus was determined by the primer set. I found it to be detected accurately.
  • At least 10 bases that hybridize to the polynucleotide represented by the base sequence of SEQ ID NO: 27 or the polynucleotide represented by the complementary sequence of the base sequence are at least 10 bases that hybridize to the polynucleotide represented by the base sequence of SEQ ID NO: 27 or the polynucleotide represented by the complementary sequence of the base sequence.
  • a polynucleotide of Saccharomyces' Path Trianus comprising a polynucleotide represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 28 or a polynucleotide of at least 10 nucleotides that hybridizes to the polynucleotide represented by the complementary sequence of the nucleotide sequence.
  • a PCR primer set for use in detection is provided.
  • a polynucleotide of at least 10 bases that hybridizes to a polynucleotide represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 30 or a polynucleotide represented by the complementary sequence of the nucleotide sequence, for the detection of Saccharomyces pastorianus PCR primer sets to be used are provided.
  • a PCR method primer set used for detection of Saccharomyces' Pastorianus, wherein one primer is a polynucleotide represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 6.
  • a PCR primer set is provided, which is a polynucleotide of at least 10 bases that hybridizes to either the Sc-type base sequence outside the region between GPH 1 and QCR2 on the right arm of chromosome No. 1 or its complementary sequence.
  • a method for detecting Saccharomyces pastorians comprising the step of performing a nucleic acid amplification reaction by the LAMP method using the LAMP method primer set of the first aspect. Is done.
  • a method for detecting Saccharomyces pastorians comprising the step of performing a nucleic acid amplification reaction by PCR using the PCR method primer set according to the first aspect.
  • a method for detecting Saccharomyces pastorinus which further comprises a step of detecting a hybrid of the hybridization of the hybrid using the probe of the first aspect.
  • the present inventors have found that in the bottom fermenting yeast, the region sandwiched between GPH1 and QCR2 on the right arm of chromosome XVI has only an Lg-type base sequence.
  • the Sc-type nucleotide sequence in the region narrowed between GPH1 and QCR2 in the right arm of XVI dyed body does not exist in Saccharomyces' Pastorianus Saccharomyces bayanus, but in Saccharomyces cerevisiae It turned out to be specific.
  • the present inventors designed a LAMP method primer set for detecting Saccharomyces cerevisiae based on the sequence of the Sc-type MET16 gene present in the region between GPH1 and QCR2, and based on the primer set, Saccharomyces cerevisiae It was found that can be detected accurately.
  • a LAMP method primer set used for the detection of Saccharomyces cerevisiae comprising the following polynucleotide: A polynucleotide of at least 10 bases that hybridizes to a polynucleotide represented by the polynucleotide (FIP) or a complementary sequence of the base sequence thereof;
  • a method for detecting Saccharomyces cerevisiae comprising the step of performing a nucleic acid amplification reaction by the LAMP method using the LAMP method primer set of the second aspect. Is done.
  • the present inventors have found that Lg type III chromosome of bottom fermenting yeast is translocated with Sc type chromosome at the MAT locus of the right arm, and that the bottom arm of fermenting yeast contains the right arm of chromosome III.
  • MAT sitting force we found that only Sc-type nucleotide sequence exists at the right arm end.
  • the MAT locus of the right arm of chromosome No. 1 and the Lg base sequence from the right arm end to the right arm end do not exist in Saccharomyces cerevisiae Saccharomyces patrianus.
  • the base sequence of Saccharomyces bayanus corresponding to was found to be specific to Saccharomyces bayanus.
  • the present inventors designed a LAMP method primer set for detecting Saccharomyces 'Bayanus based on the sequence of the RAD18 homologous gene present in the region sandwiched from the MAT locus to the terminal, and based on the primer set, Saccharomyces' Bayanus It was found that can be detected accurately.
  • a LAMP method primer set used for detection of Saccharomyces bayanus comprising the following polynucleotide: A polynucleotide of at least 10 bases that hybridizes to a polynucleotide represented by a complementary sequence (FIP) or a complementary sequence of the base sequence thereof;
  • FEP complementary sequence
  • the present inventors also designed a PCR primer set for detecting Saccharomyces' Pastorianus based on the chromosomal translocation position of the right arm of chromosome no. We found that Pastorian could be detected accurately.
  • the polynucleotide and the polynucleotide represented by the base sequence of SEQ ID NO: 24 or a polynucleotide represented by the complementary sequence of the base sequence There is provided a PCR primer set for use in detecting Saccharomyces pastorians comprising a polynucleotide of at least 10 bases to be reduced.
  • the LAMP method primer set of the third aspect is used.
  • a method for detecting Saccharomyces bayanus comprising a step of performing a nucleic acid amplification reaction by the LAMP method.
  • a method for detecting Saccharomyces pastorians comprising the step of performing a nucleic acid amplification reaction by PCR using the PCR method primer set of the third aspect. Is provided.
  • the present inventors have found that the Lg type VII chromosome of bottom fermenting yeast is the KEM1 gene of the left arm.
  • the present inventors also designed a PCR primer set for detecting Saccharomyces' Pastorianus based on the chromosomal translocation position of the left arm of chromosome VII of bottom fermenting yeast, and the Saccharomyces by the set of primers. We found that Pastorian could be detected accurately.
  • a polynucleotide of Saccharomyces' Path Trianus comprising a polynucleotide represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 26 or a polynucleotide of at least 10 nucleotides that hybridizes to the polynucleotide represented by the complementary sequence of the nucleotide sequence.
  • a PCR primer set for use in detection is provided.
  • a method for detecting Saccharomyces pastorinus comprising the step of performing a nucleic acid amplification reaction by PCR using the PCR method primer set of the fourth aspect. Is done.
  • Saccharomyces yeast can be accurately detected at the bacterial species level.
  • the LAMP method primer set according to the present invention comprises LAMP It can be used for nucleic acid amplification reactions by the method, and the target bacterial species can be detected by the presence or absence of amplification products. Therefore, according to the LAMP method primer set of the present invention, Saccharomyces genus yeast can be identified accurately, rapidly and simply at the bacterial species level.
  • the number of bacterial cells in a sample can be further measured. Therefore, according to the LAMP primer set according to the present invention, Saccharomyces 'Pastorianus, Saccharomyces cerevisiae, and Saccharomyces' Bayanus can be accurately quantified.
  • the yeast of the genus Saccharomyces is a causative bacterium that causes turbidity of various beverages such as alcoholic beverages and soft drinks, and the presence or absence of these bacterium can be an index for quality control of various beverages. Therefore, the primer set according to the present invention is useful for quality control of various beverages (for example, alcoholic beverages and soft drinks, especially beer, sparkling wine, wine) and inspection of environmental samples.
  • FIG. 1 is a view showing the reaction specificity of a Saccharomyces pastorianus detection primer set (LGM1LB1) to a species to be detected.
  • the strains used are as follows. Saccharomyces 'cerevisiae NBRC10217, Saccharomyces' Bayanus NBRC11022, Saccharomyces 'Pastorianus NBRC11024, NBRC11023, NBRC10610, Saccharomyces' cerevisia diaceticus DSM70487, Saccharomyces paradoxus NBRC10609, NBRC10609 Saccharomyces ecidas NBRC1128, Saccharomyces cervus NBRC1838, Saccharomyces sporus NBRC0316, Saccharomyces direnensis NBRC0211, Saccharomyces tanoreiberi NBRC1685, Nega: No genomic DNA added.
  • FIG. 2 is a graph showing an approximate curve of the number of colonies formed by Saccharomyces pastorianus and the LAMP detection time using LGM1LB1.
  • the detection time (Threshold time) on the horizontal axis indicates the reaction time when the turbidity exceeds 0.1.
  • FIG. 3 is a diagram showing the reaction specificity of the Saccharomyces genus detection primer set (SSC1LB1) to the species to be detected.
  • the strains used are as follows. Saccharomyces cereviche NBRC10217, Saccharomyces sanonu NBRC11022, Saccharomyces snoanu NBRC11024, NBRC11023, NBRC10610, Saccharomyces' Cerapises NBRC1815, Saccharomyces' NBRC1815, Saccharomyces' NBRC1815 Sporarus NBRC0316, Saccharomyces 'Dilerensis NBRC0211, Saccharomyces' Kluyberg NBRC1685, Nega: Caro without genomic DNA.
  • FIG. 4 is a view showing the reaction specificity of the bottom fermenting yeast detection primer set (SBFY1LF1LB1) to the species to be detected.
  • the strains used are as follows. Saccharomyces 'cerevisiae NBRC10217, Saccharomyces' bayanus NBRC11022, Saccharomyces 'pastori anus NBRC11024, NBRC11023, NBRC10610, Saccharomyces' Kudriavzevi NBRC 1802, Saccharomyces' Excidus NBRC1128, Saccharomyces' Selvazy NBRC1838, Saccharomyces' sporus NBRC0316, Saccharomyces' Direnensis NBRC0211, Saccharomyces' Kryberi NBRC1685, Nega: Genome None
  • the LAMP primer set according to the present invention comprises four types of primers, FIP, F3, BIP, and B3, which correspond to six regions of the target nucleotide sequence.
  • the regions F3c, F2c, Flc, Bl, B2, and B3 are defined in order from the 3 ′ end to the 5 ′ end, respectively.
  • the regions complementary to the F3c, F2c, and Flc regions are F3, F2, and F1, respectively
  • the regions complementary to the Bl, B2, and B3 regions are Blc, B2c, and B3c, respectively.
  • FIP is a primer prepared so as to have an F2 region complementary to the F2c region of the target sequence on the 3 'end side and the same sequence as the Flc region of the target gene on the 5' end side. necessary If this is the case, a restriction enzyme site can be introduced between Flc and F2 of the FIP primer.
  • F3 is a primer prepared to have an F3 region complementary to the F3c region of the target gene.
  • BIP is a primer prepared so as to have a B2 region complementary to the B2c region of the target sequence on the 3 'end side and the same sequence as the Blc region of the target gene on the 5' end side. If necessary, a restriction enzyme site can be introduced between Blc and B2 of the BIP primer.
  • B3 is a primer made to have a B3 region complementary to the B3c region of the target gene.
  • the amplified product can be observed as one band after electrophoresis by treating the amplification product with the restriction enzyme after the nucleic acid amplification reaction by the LAMP method. In this case, if the target sequence has a restriction enzyme site, it is not necessary to introduce the restriction enzyme site into the primer artificially.
  • one or two loop primers may be added in order to accelerate the nucleic acid amplification reaction.
  • loop primers are designed to anneal to the region between F1 and F2, or between B1 and B2, and used in addition to the LAMP reaction system, these primers are used in the nucleic acid amplification process.
  • the nucleic acid reaction proceeds starting from all the loop portions, and the nucleic acid amplification reaction is accelerated (see, for example, JP-A-2002-345499).
  • the polynucleotide represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NOs: 1 to 4, or the LAMP method primer set having homologous polynucleotide power thereof It further comprises, as a loop primer, a polynucleotide (LB) represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 5 or a polynucleotide of at least 10 nucleotides that hybridizes to the polynucleotide represented by the complementary sequence of the nucleotide sequence. Also good.
  • LB polynucleotide represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 5
  • a polynucleotide of at least 10 nucleotides that hybridizes to the polynucleotide represented by the complementary sequence of the nucleotide sequence.
  • the LAMP method primer set of the second aspect includes at least 10 bases that are neutralized to the polynucleotide (LF) represented by the base sequence of SEQ ID NO: 11 or the polynucleotide represented by the complementary sequence of the base sequence.
  • a polynucleotide represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 12 or a polynucleotide represented by a complementary sequence of the nucleotide sequence Either or both of at least 10 base polynucleotides that hybridize to the leotide may be further included as a loop primer.
  • the LAMP method primer set of the third aspect includes at least 10 bases that hybridize to the polynucleotide (LB) represented by the base sequence of SEQ ID NO: 17 or the polynucleotide represented by the complementary sequence of the base sequence. These polynucleotides may further be included as a loop primer.
  • polynucleotides represented by the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 1 to 5 and 7 to 30 but also polynucleotides represented by complementary sequences of the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 1 to 5 and 7 to 30
  • Polynucleotides that hybridize to also be used as primers and probes.
  • the polynucleotide represented by at least 10 bases that hybridizes to the polynucleotide represented by the base sequence of SEQ ID NO: 6 and the polynucleotide represented by the complementary sequence of the base sequence of SEQ ID NO: 6
  • a hybridizing polynucleotide of at least 10 bases can be used as a LAMP primer, a PCR primer, and a probe.
  • “noblybize” means to hybridize to a target polynucleotide and not to substantially hybridize to a polynucleotide other than the target polynucleotide. Nobbridations can be performed under stringent conditions.
  • the “stringent conditions” can be determined depending on the Tm (° C) of the duplex between the primer sequence and its complementary strand, the required salt concentration, etc. It is well known to those skilled in the art to set stringent conditions using fcO (see column f, see J. bambrook, EF Fnsch, T. Maniatis; Molecular Cloning 2nd edition. Cold Spring Harbor Laboratory (1989)).
  • Stringent conditions include a temperature slightly below the Tm determined by the nucleotide sequence (eg, 0 to about 5 ° C below the Tm) in an appropriate buffer normally used for hybridization. ) In this case, it is possible to carry out an hybridization reaction. Stringent conditions also include performing washing after the hybridization reaction with a high-concentration low-salt solution. Examples of stringent conditions include: 6 X SSCZ 0. 05% sodium pyrophosphate solution, 37 ° C (for about 14 base oligonucleotides), 48 ° C (about 17 salts 55 ° C (for oligonucleotides of about 20 bases),
  • a wash condition of 60 ° C (for oligonucleotides of about 23 bases) is included.
  • the nucleotide length of the homologous polynucleotide is at least 10 bases.
  • the nucleotide length of FIP and BIP homologous polynucleotides is preferably at least 30 bases (eg, 30 to 60 bases), more preferably at least 4 bases.
  • It can be 2 bases (for example, 42 to 57 bases).
  • nucleotide length of the homologous polynucleotides of F3, B3, LF, and LB is preferably at least 12 bases (for example, 12 to 30 bases), more preferably at least 18 bases (for example, 18 to 25 bases and 18-30 bases).
  • the nucleotide length of the homologous polynucleotide of the polynucleotide represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NOs: 23 to 30 is preferably at least 15 bases (for example, 1
  • 0 base particularly preferably at least 20 bases (for example, 20-25 bases and 20-30 bases).
  • Each homologous polynucleotide is a polynucleotide comprising at least 10, preferably at least 15, more preferably at least 18, particularly preferably at least 20 nucleotides in a corresponding base sequence. Can be.
  • Examples of the homologous polynucleotides of the polynucleotides represented by the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 1 to 5 and 7 to 30 are as follows.
  • ⁇ FIP homologous polynucleotide represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1: at least 42 (42 to 52) consecutive of SEQ ID NO: 1, more preferably at least 47 (47 to 52)
  • a polynucleotide (nucleotide length may be up to 60 bases, preferably up to 57 bases), comprising a nucleotide (if one or several mutations may be introduced).
  • BIP homologous polynucleotide represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3: at least 36 (36 to 42) consecutive of SEQ ID NO: 3, more preferably at least 38 (38 to 42)
  • a polynucleotide (nucleotide length is 60 bases at a maximum, preferably 53 bases at a maximum, more preferably 47 bases at a maximum). can do).
  • ⁇ B3 homologous polynucleotide represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 4: at least 19 consecutive (19-23) of SEQ ID NO: 4, more preferably at least 21 (21-23)
  • a polynucleotide (nucleotide length may be up to 30 bases, preferably up to 25 bases) comprising a nucleotide (which may have one or several mutations introduced).
  • ⁇ LB homologous polynucleotide represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 5: at least 18 (18-22) contiguous in SEQ ID NO: 5, more preferably at least 20 (20-22)
  • a polynucleotide (nucleotide length may be up to 30 bases, preferably up to 25 bases) comprising a nucleotide (which may have one or several mutations introduced).
  • ⁇ FIP homologous polynucleotide represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 7: at least 38 consecutive (38-47) of SEQ ID NO: 7, more preferably at least 42 (42-47)
  • a polynucleotide (nucleotide length may be up to 60 bases, preferably up to 53 bases), which may comprise one or several mutations.
  • a polynucleotide (nucleotide length is at most 30 bases, preferably at most 25 bases, more preferably at most 23 bases), comprising a nucleotide (if one or several mutations may be introduced) can do).
  • ⁇ BIP homologous polynucleotide represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 9: at least 42 (42-57) contiguous in SEQ ID NO: 9, more preferably at least 47 (47-57) Particularly preferably comprising at least 51 (51-57), most preferably at least 53 (53-57) nucleotides (one or several mutations may be introduced). (Nucleotides can be up to 60 bases in length).
  • ⁇ LF homologous polynucleotide represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 11: at least 19 (19-25) contiguous of SEQ ID NO: 11, more preferably at least 22 (22-25)
  • ⁇ LB homologous polynucleotide represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 12: at least 19 (19-25) consecutive of SEQ ID NO: 12, more preferably at least 22 (22-25)
  • ⁇ FIP homologous polynucleotide represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 13: at least 42 (42-53) consecutive in SEQ ID NO: 12, more preferably at least 48 (48-53)
  • ⁇ F3 homologous polynucleotide represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 14: at least 18 (18-21) consecutive of SEQ ID NO: 13, more preferably at least 19 (19-21)
  • ⁇ BIP homologous polynucleotide represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 15: at least 37 (37-44) consecutive of SEQ ID NO: 14, more preferably at least 42 (42-44)
  • a polynucleotide (nucleotide length is 60 bases at maximum, preferably 53 bases, more preferably 47 bases at the maximum). be able to).
  • ⁇ B3 homologous polynucleotide represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 16: at least 19 consecutive (19-25) of SEQ ID NO: 15, more preferably at least 22 (22-25) Nuku A polynucleotide comprising a leotide (which may have one or several mutations introduced) (nucleotide length can be up to 30 bases).
  • ⁇ LB homologous polynucleotide represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 17: at least 14 (14-18) contiguous of SEQ ID NO: 16, more preferably at least 16 (16-18)
  • ⁇ FIP homologous polynucleotide represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 18: at least 38 (38 to 47) consecutive of SEQ ID NO: 18, more preferably at least 42 (42 to 47)
  • a polynucleotide comprising a nucleotide (with or without one or several mutations introduced) (nucleotide length can be up to 60 bases, preferably up to 53 bases)
  • ⁇ F3 homologous polynucleotide represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 19: at least 18 (18-20) contiguous of SEQ ID NO: 19, more preferably at least 19 (19-20)
  • BIP homologous polynucleotide represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 20: at least 36 (36 to 42) consecutive of SEQ ID NO: 20, more preferably at least 38 (38 to 42)
  • a polynucleotide (nucleotide length is 60 bases at maximum, preferably 53 bases, more preferably 47 bases at the maximum). be able to).
  • ⁇ B3 homologous polynucleotide represented by SEQ ID NO: 21 base sequence: at least 18 (18-20) contiguous in SEQ ID NO: 21, more preferably at least 19 (19-20)
  • the length can be up to 30 bases, preferably up to 25 bases, more preferably up to 22 bases).
  • nucleotide length can be up to 30 bases, preferably up to 25 bases).
  • nucleotide length can be up to 30 bases, preferably up to 25 bases).
  • Nucleotides (which may have one or several mutations introduced) (nucleotide length can be up to 30 bases, preferably up to 25 bases).
  • Each of the 10-base polynucleotides comprises a polynucleotide comprising at least 10 consecutive nucleotides of the complementary sequence of the base sequence of SEQ ID NO: 6, and at least 10 consecutive base sequences of the sequence number 6 It can be a polynucleotide comprising a nucleotide.
  • the polynucleotide prepared based on the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 6 is used as a primer for LAMP method (FIP and BIP)
  • at least 42 of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 6 or its complementary sequence is continuous.
  • a polynucleotide comprising nucleotides (for example, 42 to 57 bases) of nucleotides (one or several mutations may be introduced) (nucleotide length is 60 bases at maximum, preferably 57 bases) Can be used as primers.
  • nucleotide sequence of SEQ ID NO: 6 is used as a LAMP primer (F3, B3, LB, and LF)
  • the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 6 or its complementary sequence A polynucleotide comprising at least 18 contiguous nucleotides (eg, 18-25 nucleotides, one or several mutations may be introduced) (nucleotide length is at most 30 bases, preferably Can be up to 25 bases).
  • the polynucleotide prepared based on the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 6 is used as a PCR method primer, at least 15 consecutive nucleotide sequences of SEQ ID NO: 6 or its complementary sequence (for example, 15-30), more preferably at least 18 (eg 18-24 and 18-30), particularly preferably at least 20 (eg 20-25 and 20-30) nucleotides
  • a polynucleotide comprising a nucleotide length of at most 30 bases, preferably at most 25 bases, more preferably at most 24 bases. can be used as primers.
  • a PCR method primer pair for detecting Saccharomyces pastorianus can be selected. Specifically, in the PCR method, one of two primers is paired with the base sequence of SEQ ID NO: 6, the other primer is paired with a complementary sequence of the base sequence of SEQ ID NO: 6, and one primer is used. The primer can be selected such that the other primer is paired with the extended strand.
  • a LAMP method primer set for detecting Saccharomyces pastorinus can be selected based on the polynucleotide represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 6.
  • the four types of primers necessary to perform the LAMP method namely FIP, F3, BIP, and B3, are designed as described above, and loop primers, ie, LF and LB, are used as necessary.
  • loop primers ie, LF and LB
  • the polynucleotide produced based on the homologous polynucleotide and the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 6 is also a polynucleotide having at least 90%, preferably at least 95% identity with the corresponding nucleotide sequence, respectively. be able to.
  • the identity number can be calculated according to algorithms well known in the art, for example, BLAST (http: //www.ddbj.nig.ac.jp/search/blast-j.html) can be used to calculate identity values.
  • the polynucleotide prepared based on the homologous polynucleotide and the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 6 further comprises a modified nucleotide sequence in which one or several mutations are introduced into the corresponding nucleotide sequence, and It can be a polynucleotide that hybridizes to a polynucleotide represented by a complementary sequence of the corresponding base sequence.
  • the "mutation” can be selected from substitution, deletion, insertion, and addition, which may be the same or different, and preferably one base is replaced with another base. “Single base substitution”, “Single base deletion” to delete one base, “One base insertion” to insert one base, and “Single base addition” to add one base You can also choose the power.
  • the number of mutations can be 1-6, 1, 2, 3, or 4, 1 or 2, or 1.
  • polynucleotide is used to mean DNA, RNA, and PNA (peptide nucleic acid).
  • the polynucleotide constituting the primer set according to the present invention is a nucleic acid chemistry according to a conventional method such as the phosphite 'triester method (Hunkapiller, M. et al., Nature, 310, 105, 1984). It may be prepared by synthesis, or the total DNA of the strain to be detected is obtained, and a DNA fragment containing the desired nucleotide sequence is appropriately obtained by PCR or the like based on the nucleotide sequence disclosed in this specification. You can do it.
  • a specific embodiment of the detection method according to the present invention is a detection method including a step of detecting the presence or absence of a nucleic acid amplification product after performing a nucleic acid amplification reaction by a LAMP method on a nucleic acid sample. It is done. More specifically, it is as follows.
  • a method of detecting Saccharomyces pastorinus is provided, wherein the production of amplification product indicates the presence of Saccharomyces pastorianus.
  • a method for detecting Saccharomyces cerevisiae wherein the production of amplification products indicates the presence of Saccharomyces cerevisiae.
  • the nucleic acid may be extracted after culturing the microbial cells in the sample or without culturing.
  • the preparation of nucleic acid samples such as cell culture and nucleic acid extraction will be described later.
  • nucleic acid amplification step by the LAMP method an amplification reaction is performed on the nucleic acid in the sample.
  • the nucleic acid amplification reaction by the LAMP method will be described later.
  • the species to be detected is present in the sample, a specific target region is amplified and an amplification product is generated.
  • an amplification product is generated, the sample solution subjected to the nucleic acid amplification reaction becomes white turbid, and therefore the presence or absence of the amplification product can be determined by measuring the turbidity of the sample solution.
  • the turbidity measurement in the LAMP method is well known, and turbidity is measured using a commercially available end-point turbidity measurement device (for example, LA-100 manufactured by Terramettas) or a real-time turbidity measurement device (for example, LA-200 manufactured by Terramettas). You can measure the degree.
  • the number of cells in the test sample can be determined by measuring the time until the sample solution reaches a certain turbidity. That is, according to another aspect of the detection method according to the present invention, the nucleic acid amplification reaction is performed on the nucleic acid sample by the LAMP method, and the starting power of the nucleic acid amplification reaction until the sample reaches a certain turbidity. Saccharomyces, including the process of measuring time and determining the number of cells in the sample from that time Methods for the quantification of Pastorianus, Saccharomyces cereviche, and Saccharomyces bayans are provided. Specifically, it is as follows.
  • a method for quantifying Saccharomyces pastorianus comprising:
  • a method for quantifying Saccharomyces cerevisiae comprising:
  • a method for quantifying Saccharomyces bayanus comprising:
  • a calibration curve between the number of bacterial cells and the time to reach a certain turbidity is prepared in advance, and the bacteria in the specimen are measured from the measured time based on the calibration curve.
  • the number of bodies can be obtained.
  • a calibration curve is prepared by preparing samples in which bacterial cells are diluted in stages, and performing a nucleic acid amplification method using the LAMP method for each sample. Plot the time until the degree reaches 0.1 It can be created from what you do.
  • a loop primer (LF and Z or LB) is added to a primer set consisting of FIP, F3, BIP, and B3, and a nucleic acid amplification reaction by the LAMP method. May be implemented.
  • the LAMP method primer set comprising the polynucleotide represented by the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 1 to 4 or homologous polynucleotides thereof.
  • a polynucleotide represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 5 or a homologous polynucleotide thereof may be added and used as a loop primer.
  • the polynucleotide represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 11 or a homologous polynucleotide thereof and the polynucleotide represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 12 are used. Both nucleotides and / or homologous polynucleotides! / May be added and used as loop primers.
  • a polynucleotide represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 17 or a homologous polynucleotide thereof is added and used as a loop primer. It's good.
  • the LAMP method primer set according to the present invention may be used alone or in appropriate combination. By carrying out a combination of the primer sets according to the present invention, it is possible to more accurately distinguish and detect Saccharomyces' nostrianus, Saccharomyces' cerevisiae, and Saccharomyces' bayanus.
  • the LAMP method primer set according to the present invention can be provided alone or in combination in the form of a kit. Therefore, according to the present invention, the LAM P method primer set of the first aspect; the LAMP method primer set of the second aspect; the LAM P method primer set of the third aspect; A detection kit for Saccharomyces yeasts is provided, comprising a selected primer set.
  • the kit according to the present invention including the LAMP primer set includes a reagent (for example, Bst DNA polymerase, a reaction reagent mixture) and an instrument (for example, a reaction tube) necessary for performing a nucleic acid amplification reaction by the LAMP method.
  • a kit according to the present invention including a PCR primer set includes reagents (for example, DNA polymerase, purified water) and instruments (for example, reaction tubes) necessary for carrying out a nucleic acid amplification reaction by PCR! / Hey! /.
  • the LAMP primer set of the first aspect according to the present invention targets the Lg-type MET16 gene and is not homogeneous in its genomic structure! /, And may react with Saccharomyces bayanus.
  • the LAMP method primer set of the third aspect according to the present invention is not present in Saccharomyces cerevisiae Saccharomyces pastorianus, but targets the RAD18 homologous gene of Saccharomyces bayanus and has a high Saccharomyces bayanus. It can be detected with accuracy.
  • the LAMP method primer set according to the first aspect of the present invention and the LAMP method primer set used for detection of Saccharomyces bayanus preferably, the third In combination with the LAMP method primer set of the above embodiment.
  • the LAMP primer set of the first aspect according to the present invention and the LAMP primer set for detecting Saccharomyces bayanus or in the LAMP primer set of the first aspect. If no amplification reaction is observed and an amplification reaction is observed in the LAMP primer set for detecting Saccharomyces banus, it can be determined that Saccharomyces banus exists in the sample.
  • Saccharomyces pastorianus is present in the sample. It can be determined.
  • the LAMP method primer set according to the first aspect of the present invention and the LAMP method primer set used for the detection of Saccharomyces 'Bayanus are combined, and the Saccharomyces' Pastrianus is combined.
  • a detection kit is provided.
  • a nucleic acid amplification reaction is performed by the LAMP method using the LAMP method primer set used for the detection of Saccharomyces' Bajanus. It may further include a step of performing. This step may include a step of performing a nucleic acid amplification reaction by a LAMP method on a nucleic acid sample and a step of detecting the presence or absence of a nucleic acid amplification product.
  • the LAMP method primer set used for detection of Saccharomyces bayanus is preferably the LAMP method primer set according to the third aspect of the present invention.
  • the LAMP method primer set of the first aspect according to the present invention is also used.
  • U preferred to use in combination with LAMP primer sets that can detect Celebici and Saccharomyces' Pastorianus.
  • the LAMP primer for Saccharomyces' Pastorianus according to the first aspect of the present invention has a uniform genome structure and may cross-react with Saccharomyces bayanus.
  • the LAMP primer set for detection of Saccharomyces cerevisiae and Saccharomyces' Pastorianus reacts with the Saccharomyces cerevisiae genome sequence contained in Saccharomyces pastorianus.
  • the LA MP primer set for detecting Saccharomyces cerevisiae and Saccharomyces s. Pastorianus does not react with Saccharomyces s. In this case, if an amplification reaction was observed in both the L.A. primer set for detecting Saccharomyces 'Pastorinus according to the present invention, and the LAMP method primer set for detecting Saccharomyces cerevisiae and Saccharomyces' Pastorianus, the S. It can be determined that Pastorian exists.
  • the Saccharomyces' Bayanus in the sample is used. Can be determined to exist.
  • the LAMP method primer set according to the first aspect of the present invention is combined with the LAMP method primer set used for the detection of Saccharomyces cerevisiae and Saccharomyces pastorianus.
  • a kit for detection of Saccharomyces pastorianus is provided.
  • the LAMP method is used by using the LAMP method primer set used for the detection of Saccharomyces' cereviche and Saccharomyces' Pastorianus.
  • a step of performing a nucleic acid amplification reaction may be further included. This process is applied to the LAMP method for nucleic acid samples. And a step of performing a nucleic acid amplification reaction and a step of detecting the presence or absence of a nucleic acid amplification product.
  • the LAMP method primer set used for detection of Saccharomyces cerevisiae and Saccharomyces' Pastorianus is preferably a LAMP method primer set comprising the following polynucleotides.
  • the LAMP method primer set for detection of Saccharomyces 'selepiche and Saccharomyces' Pastorianus described above is represented by a polynucleotide (LB) represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 22 or a complementary sequence of the nucleotide sequence as a loop primer. It may further comprise a polynucleotide of at least 10 bases that hybridizes to the polynucleotide to be prepared.
  • LB polynucleotide
  • a specific embodiment of the detection method by PCR includes a step of detecting the presence or absence of a nucleic acid amplification product after performing a nucleic acid amplification reaction by PCR on a nucleic acid sample. Including detection methods.
  • a method of detecting Saccharomyces pastorinus is provided, wherein the production of amplification product indicates the presence of Saccharomyces pastorianus.
  • the sample to be subjected to the nucleic acid amplification step by PCR may be extracted after culturing the cells in the sample or without culturing.
  • the preparation of nucleic acid samples such as cell culture and nucleic acid extraction will be described later.
  • nucleic acid amplification step by the PCR method an amplification reaction is performed on the nucleic acid in the sample.
  • Nucleic acid amplification reactions by the PCR method are well known, and those skilled in the art can implement the PCR method by appropriately setting conditions for performing the PCR method and its modification method.
  • a specific embodiment of the detection method using a probe includes a step of detecting the presence or absence of a nucleic acid complex after carrying out hybridization of the probe according to the present invention to a nucleic acid sample.
  • the detection method containing is mentioned.
  • a method of detecting Saccharomyces pastorinus is provided, wherein the formation of a hybridization complex indicates the presence of Saccharomyces pastorinus.
  • the probe can be labeled and used.
  • the label include radioactive elements (for example, 32 P and 14 C), fluorescent compounds (for example, FITC), and molecules involved in enzyme reactions (for example, peroxidase, alkaline phosphatase).
  • Detection of the hybridization complex can be carried out using a known method such as Northern hybridization, Southern hybridization, or colony hybridization.
  • primer sets and kits according to the present invention are suitable for liquors (eg, beer Can be used for quality control of Z, soft drinks (for example, fruit juice drinks) and environmental samples (for example, raw water).
  • liquors eg, beer Can be used for quality control of Z
  • soft drinks for example, fruit juice drinks
  • environmental samples for example, raw water
  • Saccharomyces' Pastorianus, Saccharomyces' Celepische, and Saccharomyces' Banus may be found in the beer and happoshu production process or in the final product as the cause of the degradation fermentation. Therefore, the LAMP method primer set and the PCR method primer set of the first aspect; the LAMP method primer set of the second aspect; the LAMP method primer set and the PCR method primer set of the third aspect; the PCR method of the fourth aspect The primer set; and some or all of these combinations can preferably be used for quality control of beer and happoshu.
  • Saccharomyces' cerepiche 'and Saccharomyces' bayanus may be found in the wine production process or in the final product as yeast species causing quality degradation. Therefore, the LAMP method primer set of the second aspect; the LAMP method primer set of the third aspect; and combinations thereof can be preferably used for wine quality control.
  • Saccharomyces' cerepiche 'and Saccharomyces' bayanus are in the process of producing soft drinks (especially fruit juice drinks)! May be seen in the final product as yeast species causing quality degradation. Therefore, the LAMP method primer set of the second aspect; the LAMP method primer set of the third aspect; and combinations thereof can be preferably used for quality control of soft drinks (especially juice drinks).
  • the LAMP method primer set according to the present invention can be used as a primer for nucleic acid amplification reaction by the LAMP method.
  • the primer set according to the present invention can be used not only as a LAMP method but also as a primer for a nucleic acid amplification reaction obtained by improving the LAMP method.
  • the principle of the LAMP method and a nucleic acid amplification method using the LAMP method are well known. For example, WO00Z28082 and Notomi T. et al., Nucleic Acids Research, 28 (12 ), e63 (2000).
  • Nucleic acid amplification reaction by the LAMP method can be carried out using a commercially available LAMP method gene amplification reagent kit.
  • a commercially available LAMP method gene amplification reagent kit for example, sample DNA, primer solution, and commercially available LAMP method gene amplification reagent kit (for example, Loopamp DNA amplification kit manufactured by Eiken Chemical Co., Ltd.
  • the reagent provided in step (b) is mixed according to the instructions provided with the kit and mixed at a constant temperature (
  • the reaction can be carried out by maintaining the temperature at 60 to 65 ° C for a certain period of time (1 hour as a standard).
  • the nucleic acid amplification reaction by the LAMP method can be carried out through the following steps.
  • the strand-displacing DNA polymerase synthesizes a DNA strand complementary to the truncated DNA starting from the 3 'end of the F2 region of FIP.
  • (V) BIP anneals to the DNA strand that formed a loop in the process of (iv) above, and complementary DNA is synthesized starting from the 3 'end of this BIP. In this process, the loop is peeled off and stretched.
  • the B3 primer anneals outside the BIP, and DNA synthesis extends while peeling the DNA strand from the previously synthesized BIP by the action of the strand-displacement DNA polymerase starting from its 3 'end.
  • Double-stranded DNA is formed in the process of (V) above.
  • nucleic acid amplification reaction by the LAMP method can be carried out by appropriately modifying the above steps.
  • the primer set according to the present invention can also be used for such a modified method!
  • the LAMP primer set according to the present invention causes DNA strand synthesis at the same time as annealing at about 60 to about 65 ° C (eg, 65 ° C). By performing the reaction for about 1 hour by annealing reaction and DNA strand synthesis, the nucleic acid can be amplified 10 9 to 10 1G times. [0145] When the LAMP method primer set according to the present invention is reacted with a sample nucleic acid under the conditions of a nucleic acid amplification reaction by the LAMP method, the target region of the strain to be detected is amplified.
  • the reaction solution becomes cloudy due to the influence of magnesium pyrophosphate formed as a by-product, and therefore the presence or absence of amplification can be visually determined based on this turbidity.
  • the presence or absence of amplification may be optically measured using a turbidity measuring device, or may be detected by detecting the presence or absence of a DNA fragment using agarose gel electrophoresis or the like.
  • nucleic acid amplification If nucleic acid amplification is observed, it means that the target base sequence is present, and represents positive (+) for the species to be detected by the primer set. On the other hand, when nucleic acid amplification is not observed, it means that the target base sequence is not present, and it represents negative (-) for the species to be detected by the primer set.
  • the PCR method primer set according to the present invention can be used for identification of Saccharomyces yeasts using nucleic acid amplification methods such as PCR, RT-PCR, real-time PCR, and in situ PCR.
  • nucleic acid amplification product If a nucleic acid amplification product is observed, it means that the target nucleotide sequence is present, and represents a positive (+) species of bacteria to be detected in the primer set. On the contrary, when nucleic acid amplification is not observed, it means that the target base sequence is not present and represents a negative bacterial species (-) which is the detection target of the primer set.
  • a nucleic acid amplification product in the PCR method, can be detected according to a known method such as agarose gel electrophoresis.
  • a known method such as agarose gel electrophoresis.
  • nucleic acid amplification products can be detected over time in an apparatus in which a thermal cycler and a spectrofluorometer are integrated using an intercalator or a fluorescently labeled probe.
  • Samples to be detected by the primer set and kit according to the present invention include beer, sparkling liquor, wine and other alcoholic beverages; soft drinks such as cider, ramune and carbonated water; environmental samples such as water collected for raw materials ; Semi-finished products collected from the manufacturing process of alcoholic beverages and soft drinks.
  • nucleic acids present in beverage samples and environmental samples for example, a method using a commercially available kit, or treating bacterial cells with an alkaline solution, etc. A method for liberating nucleic acids from bacterial cells by heating at ° C can be selected. If it is necessary to further purify the nucleic acid, the nucleic acid is purified by treatment with phenol Z chloroform, ethanol precipitation, centrifugation, etc., and finally re-dissolved in TE buffer or the like for testing as vertical DNA.
  • European Brewery Convention ANALYTICA-MICROBIOLOGICA-EBC, 2nd ed.
  • Saccharomyces yeast considered to be present in the sample is cultivated in an appropriate medium.
  • DNA is isolated from the colonies formed on the agar medium, and the LAMP method or PCR method using the primer set according to the present invention is performed on the DNA to amplify a specific gene region of Saccharomyces yeast.
  • the presence of the gene amplification product indicates the presence of the bacterial species targeted by the primer set.
  • the cells cultured on the agar plate medium were scraped and suspended in sterilized distilled water. This suspension was centrifuged (15000 rpm, 5 minutes), and the supernatant was discarded. Sterile distilled water was again added to the precipitated cells, suspended, and centrifuged. The supernatant was discarded, and PrepMan Ultra (Applied Biosystems) solution 1001 was added to the resulting cells and heated at 95 ° C. for 10 minutes. Thereafter, the mixture was centrifuged at 15000 rpm for 1 minute, and the supernatant was used as a genomic DNA solution. Alternatively, 0.11 NaOH solution was added to the washed cells and heated at 95 ° C for 10 minutes. Thereafter, the solution was neutralized with 1M Tris buffer (pH 7.0), and the supernatant was used as a genomic DNA solution.
  • 1M Tris buffer pH 7.0
  • the following primers for each strain of Saccharomyces yeast are chemically synthesized by Fujitsu System Solutions' eGenome Order (http://genome.e-mp.jp/index.html) or equivalent method, and TE buffer
  • the solution (pH 8.0) was dissolved to a concentration of 100 M.
  • FIP, BIP primer: 16 M, F3, B3 primer: 2 M, LF, LB primer: 8 ⁇ were mixed and diluted with these solutions.
  • GCTCGAACG (SEQ ID NO: 9) ⁇ 3: GTTGTATGGTACATTGTTTGCATCT (SEQ ID NO: 10) LF: CACTTATATGTAGCTCTTTGTAGGC (SEQ ID NO: 11)
  • a Loopamp DNA amplification kit manufactured by Eiken Chemical Co., Ltd. was used as a gene amplification reagent kit for the LAMP method.
  • genomic DNA solution: 2.51 primer solution: 2.51
  • double concentration reaction buffer: 12.51 primer solution: 2.51
  • Bst DNA polymerase 1 ⁇ 1
  • sterile water 6.5 1 was added to prepare a reaction solution having a total volume of 25 ⁇ 1.
  • the turbidity change during the reaction was measured every 6 seconds. Positive with increased turbidity A negative turbidity was determined as negative.
  • Saccharomyces cerevisiae standard strains containing Saccharomvces sensu stricto strain-specific primers prepared for bottom fermentation yeast Saccharomyces cerepiche and Saccharomyces bayanus Sex was evaluated.
  • SBR2LB1 was used for Saccharomyces cerevisiae var.
  • Diastaticus for Saccharomyces cerevisiae var.
  • SCC1LB1 saccharomyces cerevisiae and Saccharomyces pastels (bottom fermenting yeast) showed an increase in turbidity due to DNA amplification within 60 minutes (Table 1).
  • the primer was reacted with the strain to be detected, amplification occurred within 60 minutes of reaction initiation, and the turbidity in the reaction tube increased (Fig. 1).
  • Kluyveromyces I act is NBRC1090-
  • Candida uti I is NBRC0988
  • D. bruxel I ens is DSM70001 ⁇ One---
  • the primer set according to the present invention prepared for each strain of Saccharomyces yeast can accurately detect the Saccharomyces yeast to be tested at the strain level.
  • yeast power gene fragments were amplified using a common primer, and then the base sequence difference V was often analyzed using a restriction enzyme cleavage pattern, DGGE, etc. These three Saccharomyces yeasts can be identified and detected simply by confirming the presence or absence of gene amplification.
  • the cells of bottom fermenting yeast (BFY70, Saccharomyces' Pastorianus), Saccharomyces' Cereviche NBRC10217, Saccharomyces' Bayanus NBRC 1948 cultured in an agar plate medium with sterilized water in stages
  • the DNA was extracted by the method described above after dilution and subjected to the LAMP method.
  • amplification was observed even from a small amount of cells having a level of 10 2 to 10 3 cfu.
  • the detection time is defined as the time when the turbidity exceeded 0.1 in the LAMP reaction, and the logarithm of the detection time of each primer and the number of colonies formed.
  • R 2 0.98-0.99
  • the approximate curve obtained for LGM1LB1 is shown in FIG.
  • the relationship between the detection limit of each primer and the correlation coefficient of the calibration curve is as shown below.
  • Example 3 Detection from wine and beer
  • Saccharomyces yeast a wine yeast
  • Saccharomyces bayanus NBRC 1948 the number of yeasts contaminated from the outside is far smaller than that of Saccharomyces yeasts. Therefore, a large amount of Saccharomyces cereviche was suspended in wine, diluted with Saccharomyces bayanus NBRC 1948, mixed and washed, collected and then extracted as a primer set.
  • the LAMP method was performed using SBR2LB1 to examine whether Saccharomyces bayanus can be detected.
  • Saccharomyces bayanus can be detected with almost the same detection limit as when suspended in sterilized water, which is related to the reaction inhibition by wine and the presence of Saccharomyces cerevisiae.
  • the same results were obtained when the bottom fermentation yeast was suspended in beer and Saccharomyces bayanus cell dilution was mixed.
  • Beer + bottom fermenting yeast (1 X 10 7 cells) 3.2 x 10 2 cfo
  • Saccharomyces genus detection primer set SSC1LB1
  • bottom fermenting yeast detection primer set SBFY1LF1LB1
  • WO2005Z093059 a primer solution for the LAMP method was prepared.
  • the Saccharomyces detection primer set (SSC1LB1) targets the D2 region of the rRNA gene
  • the bottom fermenting yeast detection primer set SBFY1LF1LB1 targets the melibiase gene.
  • F3 CCGAGTTACAATGGCCTTGG (SEQ ID NO: 37) No. 38)
  • SSC1LB1 reacted with most of the Saccharomyces yeasts tested and could not be distinguished among Saccharomyces yeasts.
  • SBFY1LF1L B1 reacted with Saccharomyces bayanus in addition to bottom fermentation yeast.
  • SBFY1LF1LB1 was designed from the melibiase gene of bottom fermenting yeast, but the region used for the design was considered to have cross-reacted due to the presence of a 96% homologous base sequence in the genome of Saccharomyces bayanus. It was.
  • Example 3 Sc type - L g 3 ⁇ 4 ⁇ chromosome evaluation of PCR methods primers for puncturing the
  • the Sc type XVI chromosome of the bottom fermenting yeast translocated with the Lg type chromosome in the range of the ORF of the right arm GPH1 ORF QCR2.
  • the Lg type III chromosome of the bottom fermenting yeast caused a translocation with the Sc type chromosome from the MAT locus on the right arm to the end of the right arm.
  • Lg type VII chromosome of bottom fermenting yeast is KEM1 gene O in the left arm. A translocation with the Sc-type chromosome occurred from within RF to the end of the left arm.
  • the base sequence on the Sc-type chromosome and the base sequence on the Lg-type chromosome in the form of sandwiching the chromosomal translocation positions of chromosomes III, VII, and XVI of these bottom fermenting yeasts Primers for PCR Were designed and evaluated in various Saccharomyces yeasts.
  • Illjuncl (Lg type side): TGTTGGGGTGTACTATGGTCTTT (SEQ ID NO: 23)
  • VIISL1 (Lg type side): CGACTCAAACTGTATTACTCC (SEQ ID NO: 25)
  • XVISL1 (Lg type side): CGACAGAGTTGACCAGTTTG (SEQ ID NO: 27)
  • XVISL2 (Sc type side): GTTCTTCTTGCAAGATGTGG (SEQ ID NO: 28)
  • XVISL3 (Lg type side): CCTTGGCAGATGTGTTGTAT (SEQ ID NO: 29)
  • XVISL4 (Sc type side): CTTGCCCTTCTTCAAATCCG (SEQ ID NO: 30)

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Description

サッカロミセス属酵母の検出用プライマーセット
発明の分野
[0001] 本発明は、サッカロミセス属酵母の検出用プライマーセットに関し、より詳細には、 サッカロミセス属酵母の検出用の LAMP法プライマーセットおよび PCR法プライマー セットに関する。本発明はまた、このプライマーセットを使用するサッカロミセス属酵母 の検出および定量方法に関する。
背景技術
[0002] サッカロミセス属酵母は、パン製造の他、ビール、ワイン、日本酒、焼酎、ウィスキー 等のアルコール飲料製造に広く用いられている。サッカロミセス'セレピシェ (Sassh^ omvces cerevisiae)はエールのような上面発酵タイプのビール、ワイン、日本酒、サイ ダ一のような果実酒等の醸造酒、また焼酎、ウィスキー等の蒸留酒製造に用いられる 。サッカロミセス'バヤヌス（Saccharomvces bavanus)はワイン、シェリー酒、あるいは発 泡性ワイン等の製造に用いられる。ピルスナータイプのビール製造に用いられる下面 発酵酵母は、現在ではサッカロミセス'パストリアヌス（Saccharomvces pastorianus)に 分類されている（Kurtzman, CP. & Fell, J.W. The Yeasts, A Taxonomic Study, 4th e dition, 1998, Elsevier science B.V., The Netherlands ^ Back, W.： Farbatlas und Han dbuch der Geraenkebiologie , Teil I, 1994, Verlag Hans Carl, Nuernberg^ Barnett, J. A. et al. : Yeasts, characteristics and identification, 3rd edition, 2000, Cambridge Un iversity Press, UK、清酒酵母'麹研究会：「清酒酵母の研究」 2003,新日本印刷，東 京)。このように製造に用いる酵母が適切な酵母力どうか把握するために、サッカロミ セス属酵母の菌種を同定する技術は重要である。
[0003] しかし、これらの酵母がろ過済みの酒類製品に残存したり、あるいは外部から混入 した場合には、過剰に発酵して混濁を起こし、特徴的な臭いを生産し、刺激的な苦い 味に変質させて製品品質に影響を与える（Back, W. : Farbatlas und Handbuch der G eraenkebiologie, Teil I, 1994, Verlag Hans Carl, Nuernberg、 European Brewery Con vention :ANALYTICA - MICROBIOLOGICA - EBC, 2nd ed. 2005 Fachverlag Hans Carl, Nuernberg)。
[0004] また、サッカロミセス属酵母は清涼飲料、特に果汁飲料力もも分離される事がある。
これらの酵母が混入すると、グルコースやサッカロース等の糖から炭酸ガス、エタノー ル、不快な臭気を生成し、製品品質を大きく損ねる（Back, W. : Farbatlas und Handbu ch aer ueraen eoiologie, Teil II, 1999, Verlag Hansし arl, Nuernberg; 0
このようにサッカロミセス属酵母が製品中で増殖すると産業に与える影響が大き 、 ために、これら酵母を迅速に検出'同定する技術は、品質管理上重要である。また製 品から分離されたサッカロミセス属酵母が製造工程で使用していた酵母である場合 には、製造工程上流力 のリーク、ろ過工程不良等に原因があると考えられ、外部か ら混入した酵母であった場合には充填機の洗浄不良や配管中の溜まり等の原因が 考えられる。従って、汚染があつたときに製品から分離された酵母を同定する技術は 、対処する目標を明確にするために重要である。
[0005] し力し、サッカロミセス'パストリアヌス、サッカロミセス'セレピシェ、サッカロミセス'バ ャヌスは分類学的に非常に近縁であり、サッカロミセス'パラドクサス、サッカロミセス- ミカタエ等の数種の酵母とともに SaccharomYces sensu stnctoと ヽつ: ^*¾学上のグノレ ープを形成している（Naumov, G.I. et al. : Int. J. Syst. Evol. Microbiol, 2000, vol. 50 , 1931-1942) oさらにサッカロミセス'パストリアヌスは、サッカロミセス'セレピシェとサ ッカロミセス ·バヤヌスの交雑により形成した種であると考えられており、遺伝子レベル 、染色体レベルで両者のハイブリッドであることが確認されている（Kielland-Brandt, M.C. et al.： Genetics of brewing yeast. The Yeast, 2nd ean, vol. 6, pp223— 254, Edit ed by Wheals, et al., Academic Press, New York、 Ryu, S.— L. et al. : Yeast, 1996, vol .12, 757、 Tamai, Y. et al : Yeast, 1998, vol. 14, 923—933、 Tamai, Y. et al : Yeast, 2 000, vol. 16, 1335-1343)。伝統的な酵母の同定法としては形態学的、生理学的、生 化学的手法が用いられ、特に様々な糖の資化能、発酵能を調査する事が多いが、 Sa ccharomvces sensu に属する菌種は表現型的に互 、に非常に似通って 、るた め、このような伝統的な方法では区別する事は難しい（Naumova, E.S. et al. :Antonie van Leeuwenhoek, 2003, vol. 83, 155-166)。これらの株を見分ける分子生物学的な アプローチとしては、 PCRフィンガープリンティング、 DNA/DNA再結合キネテイク ス、核型解析、ミトコンドリア DNA制限酵素切断解析、 rRNA遺伝子塩基配列解析、 rDNA制限酵素切断解析、 UP— PCR、アイソザィム解析、 PCR—温度勾配ゲル電 気泳動、リアルタイム PCR等が知られている。
[0006] これまでに、サッカロミセス属酵母の FLOl遺伝子の一部を PCR法で増幅させる、 あるいは rRNA遺伝子の一部を PCR法で増幅させ、 RFLPでサッカロミセス属酵母 かそれ以外の属の酵母か、あるいは醸造用酵母か非醸造用酵母か識別する方法が 開発された（特開平 11— 56366号公報)。また、下面発酵ビール酵母の 26S rRN A遺伝子と 5S rRNA遺伝子とのスぺーサー領域の配列が 2種類存在すると 、う知 見に基づ 、て、それぞれに対して特異的な PCRプライマーセットが開発された (特開 2001— 8684号公報）。更に、下面発酵酵母の検出のために、 1^ー 1^01の?^末端 部分と酵母第 IX番染色体の遺伝子が連結した Lg— FLOl類似遺伝子に特異的な プライマーが開発された (特開 2002— 233382号公報)。
[0007] しかし、 PCRやリアルタイム PCRは高度な温度制御や蛍光観察が必要なため、高 価な機器を必要とする。また PCRは反応後に電気泳動、染色、写真撮影等が必要で あり、遺伝子増幅工程後の結果判定までに時間がかかる。さらに RAPD PCR、増 幅産物の制限酵素処理、塩基配列解析、アイソザィム解析、温度勾配ゲル電気泳動 等は通常の PCR以上に時間と煩雑な操作が必要であり、日々の微生物検査業務の 中で行うことには問題があった。
[0008] 一方、サッカロミセス'パストリアヌスは、サッカロミセス'セレピシェ由来のサブゲノム
(Sc型）と、サッカロミセス'バヤヌス由来のサブゲノム (Lg型）を併せ持つている力 最 近の研究によると、下面発酵酵母では、 Sc型の XVI番染色体の右腕の一部が存在 しないこと、 Lg型の III番染色体の右腕の一部が存在しないこと、 Lg型の VII番染色 体の左腕の一部が存在しな 、ことが報告されて 、る（梅基直行ら「ビール酵母の物理 地図作成と比較ゲノム科学」第 24回 日本分子生物学会年会（2001)； Nakao et al. Pr oceedings of the 29th EBC Congress (2003) ;中尾嘉宏：ィ匕学と生物， 2005, vol. 43, No. 9, 559- 561 ;および特開 2004— 283169号公報）。し力し、サッカロミセス'パスト リアヌスの染色体転座に関する詳細な情報は依然として得られて 、な 、のが現状で めつに。 [0009] また、サッカロミセス'パストリアヌス検出用 LAMP (loop mediated isothermal amplifi cation)法プライマーセットが開発されているが（WO2005Z093059号公報）、検出 精度の点で更に改善の余地を残すものであった。
発明の概要
[0010] 本発明者らは、サッカロミセス.パストリアヌスの XVI番染色体右腕、 III番染色体右 腕、および VII番染色体左腕の染色体転座の位置を特定するとともに、転座位置周 辺のゲノムを分析した。本発明者らは、また、その情報に基づいてサッカロミセス属酵 母を正確に検出できるプライマーセットを開発することに成功した。
[0011] 以下、 XVI番染色体右腕の染色体転座に関連する発明を第一の態様および第二 の態様とし、 m番染色体右腕の染色体転座に関連する発明を第三の態様とし、 VII 番染色体左腕の染色体転座に関連する発明を第四の態様とする。
[0012] 第一の餱様
本発明者らは、今般、サッカロミセス'パストリアヌスに属する下面発酵酵母のゲノム 解析を行い、下面発酵酵母の Sc型の XVI番染色体は、右腕の GPH1の ORF内で L g型染色体へ転座を起こし、更に、右腕末端方向の QCR2の ORF内で再度転座し、 Sc型に戻っていることを見いだした。すなわち、本発明者らは、下面発酵酵母中に は XVI番染色体右腕の GPH1と QCR2に挟まれた領域は Lg型の塩基配列しか存在 しないことを見いだした。
[0013] 本発明者らは、 GPH1と QCR2に挟まれた領域に存在する Lg型 MET16遺伝子の 配列（配列番号 6)に基づいて、サッカロミセス ·パストリアヌス検出用 LAMP法プライ マーセットを設計し、そのプライマーセットによってサッカロミセス'パストリアヌスを正 確に検出できることを見いだした。 Lg型 MET16遺伝子の配列は、これまでに公のデ ータベースにぉ 、て開示されて 、な 、新規な配列である。
[0014] すなわち、本発明の第一の態様によれば、配列番号 6の塩基配列で表されるポリヌ クレオチドにハイブリダィズする少なくとも 10塩基のポリヌクレオチド、または配列番号 6の塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダィズする少なくとも 1 0塩基のポリヌクレオチドからなる、サッカロミセス'パストリアヌス（Saccharomvces past QEi )検出用プローブまたはプライマーが提供される。 [0015] 本発明の第一の態様によれば、また、二種以上の上記プライマーからなる、サッカ 口ミセス'パストリアヌス検出用 LAMP法プライマーセットが提供される。
[0016] 本発明の第一の態様によれば、また、二種以上の上記プライマーからなる、サッカ 口ミセス'パストリアヌス検出用 PCR法プライマーセットが提供される。
[0017] 本発明の第一の態様によれば、好ましくは、下記ポリヌクレオチドを含んでなる、サ ッカロミセス'パストリアヌス検出用 LAMP法プライマーセットが提供される： 配列番号 1の塩基配列で表されるポリヌクレオチド (FIP)またはその塩基配列の相補 配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダィズする少なくとも 10塩基のポリヌクレオ チド；
配列番号 2の塩基配列で表されるポリヌクレオチド (F3)またはその塩基配列の相補 配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダィズする少なくとも 10塩基のポリヌクレオ チド；
配列番号 3の塩基配列で表されるポリヌクレオチド (BIP)またはその塩基配列の相補 配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダィズする少なくとも 10塩基のポリヌクレオ チド;および
配列番号 4の塩基配列で表されるポリヌクレオチド (B3)またはその塩基配列の相補 配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダィズする少なくとも 10塩基のポリヌクレオ チド。
[0018] 本発明者らは、また、下面発酵酵母の XVI番染色体右腕の染色体転座位置に基 づいて、サッカロミセス'パストリアヌス検出用 PCR法プライマーセットを設計し、その プライマーセットによってサッカロミセス.パストリアヌスを正確に検出できることを見い だした。
[0019] すなわち、本発明の第一の態様によれば、配列番号 27の塩基配列で表されるポリ ヌクレオチドまたはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダ ィズする少なくとも 10塩基のポリヌクレオチドと、配列番号 28の塩基配列で表される ポリヌクレオチドまたはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブ リダィズする少なくとも 10塩基のポリヌクレオチドとを含んでなる、サッカロミセス'パス トリアヌスの検出に用いられる PCR法プライマーセットが提供される。 [0020] 本発明の第一の態様によれば、また、配列番号 29の塩基配列で表されるポリヌクレ ォチドまたはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダィズ する少なくとも 10塩基のポリヌクレオチドと、配列番号 30の塩基配列で表されるポリヌ クレオチドまたはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダィ ズする少なくとも 10塩基のポリヌクレオチドとを含んでなる、サッカロミセス ·パストリア ヌスの検出に用いられる PCR法プライマーセットが提供される。
[0021] 本発明の第一の態様によれば、また、サッカロミセス'パストリアヌスの検出に用いら れる PCR法プライマーセットであって、一方のプライマーが配列番号 6の塩基配列で 表されるポリヌクレオチドにハイブリダィズする少なくとも 10塩基のポリヌクレオチド、ま たは配列番号 6の塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダィズ する少なくとも 10塩基のポリヌクレオチドであり、もう一方のプライマーが下面発酵酵 母の XVI番染色体右腕の GPH 1と QCR2に挟まれた領域外の Sc型塩基配列または その相補配列のいずれかにハイブリダィズする少なくとも 10塩基のポリヌクレオチド である、 PCR法プライマーセットが提供される。
[0022] 本発明の第一の態様によれば、第一の態様の LAMP法プライマーセットを用いて LAMP法により核酸増幅反応を実施する工程を含んでなる、サッカロミセス'パストリ アヌスの検出方法が提供される。
[0023] 本発明の第一の態様によれば、また、第一の態様の PCR法プライマーセットを用い て PCR法により核酸増幅反応を実施する工程を含んでなる、サッカロミセス'パストリ アヌスの検出方法が提供される。
[0024] 本発明の第一の態様によれば、更に、第一の態様のプローブを用いてノ、イブリダイ ゼーシヨン複合体を検出する工程を含んでなる、サッカロミセス'パストリアヌスの検出 方法が提供される。
[0025] 第二の餱様
本発明者らは、下面発酵酵母中には XVI番染色体右腕の GPH1と QCR2に挟ま れた領域は Lg型の塩基配列しか存在しないことを見いだした。すなわち、 XVI番染 色体右腕の GPH1と QCR2に狭まれた領域の Sc型の塩基配列は、サッカロミセス' パストリアヌスゃサッカロミセス ·バヤヌスには存在せず、サッカロミセス ·セレピシェに 特異的であることが判明した。
[0026] 本発明者らは、 GPH1と QCR2に挟まれた領域に存在する Sc型 MET16遺伝子の 配列に基づいて、サッカロミセス'セレピシェ検出用 LAMP法プライマーセットを設計 し、そのプライマーセットによってサッカロミセス'セレピシェを正確に検出できることを 見いだした。
[0027] すなわち、本発明の第二の態様によれば、下記ポリヌクレオチドを含んでなる、サッ カロミセス ·セレピシェの検出に用いられる LAMP法プライマーセットが提供される： 配列番号 7の塩基配列で表されるポリヌクレオチド (FIP)またはその塩基配列の相補 配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダィズする少なくとも 10塩基のポリヌクレオ チド；
配列番号 8の塩基配列で表されるポリヌクレオチド (F3)またはその塩基配列の相補 配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダィズする少なくとも 10塩基のポリヌクレオ チド；
配列番号 9の塩基配列で表されるポリヌクレオチド (BIP)またはその塩基配列の相補 配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダィズする少なくとも 10塩基のポリヌクレオ チド;および
配列番号 10の塩基配列で表されるポリヌクレオチド (B3)またはその塩基配列の相 補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダィズする少なくとも 10塩基のポリヌクレ ォチド。
[0028] 本発明の第二の態様によれば、第二の態様の LAMP法プライマーセットを用いて LAMP法により核酸増幅反応を実施する工程を含んでなる、サッカロミセス'セレビ シェの検出方法が提供される。
[0029] 第三の餱様
本発明者らは、下面発酵酵母の Lg型の III番染色体は、右腕の MAT座で Sc型染 色体と転座を起こしていること、そして、下面発酵酵母中には III番染色体右腕の MA T座力も右腕末端にかけて Sc型の塩基配列しか存在しな 、ことを見 、だした。すな わち、 ΠΙ番染色体右腕の MAT座力も右腕末端にかけての Lg型の塩基配列は、サッ カロミセス ·セレピシェゃサッカロミセス ·パストリアヌスには存在しな 、ため、その領域 に相当するサッカロミセス ·バヤヌスの塩基配列はサッカロミセス ·バヤヌスに特異的 であることが判明した。
[0030] 本発明者らは、 MAT座から末端に挟まれた領域に存在する RAD18相同遺伝子 の配列に基づいて、サッカロミセス'バヤヌス検出用 LAMP法プライマーセットを設計 し、そのプライマーセットによってサッカロミセス'バヤヌスを正確に検出できることを見 いだした。
[0031] すなわち、本発明の第三の態様によれば、下記ポリヌクレオチドを含んでなる、サッ カロミセス'バヤヌスの検出に用いられる LAMP法プライマーセットが提供される： 配列番号 13の塩基配列で表されるポリヌクレオチド (FIP)またはその塩基配列の相 補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダィズする少なくとも 10塩基のポリヌクレ ォチド；
配列番号 14の塩基配列で表されるポリヌクレオチド (F3)またはその塩基配列の相 補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダィズする少なくとも 10塩基のポリヌクレ ォチド；
配列番号 15の塩基配列で表されるポリヌクレオチド (BIP)またはその塩基配列の相 補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダィズする少なくとも 10塩基のポリヌクレ ォチド；および
配列番号 16の塩基配列で表されるポリヌクレオチド (B3)またはその塩基配列の相 補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダィズする少なくとも 10塩基のポリヌクレ ォチド。
[0032] 本発明者らは、また、下面発酵酵母の ΠΙ番染色体右腕の染色体転座位置に基づ いて、サッカロミセス'パストリアヌス検出用 PCR法プライマーセットを設計し、そのブラ イマ一セットによってサッカロミセス.パストリアヌスを正確に検出できることを見いだし た。
[0033] すなわち、本発明の第三の態様によれば、配列番号 23の塩基配列で表されるポリ ヌクレオチドまたはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダ ィズする少なくとも 10塩基のポリヌクレオチドと、配列番号 24の塩基配列で表される ポリヌクレオチドまたはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブ リダィズする少なくとも 10塩基のポリヌクレオチドとを含んでなる、サッカロミセス'パス トリアヌスの検出に用いられる PCR法プライマーセットが提供される。
[0034] 本発明の第三の態様によれば、第三の態様の LAMP法プライマーセットを用いて
LAMP法により核酸増幅反応を実施する工程を含んでなる、サッカロミセス'バヤヌ スの検出方法が提供される。
[0035] 本発明の第三の態様によれば、また、第三の態様の PCR法プライマーセットを用い て PCR法により核酸増幅反応を実施する工程を含んでなる、サッカロミセス'パストリ アヌスの検出方法が提供される。
[0036] 第四の餱様
本発明者らは、下面発酵酵母の Lg型の VII番染色体は、左腕の KEM1遺伝子の
ORF内で Sc型染色体と転座を起こしていることを見いだした。すなわち、本発明者ら は、下面発酵酵母中には、 VII番染色体左腕の KEM1遺伝子座力も左腕末端にか けて Sc型の塩基配列しか存在しな 、ことを見 、だした。
[0037] 本発明者らは、また、下面発酵酵母の VII番染色体左腕の染色体転座位置に基づ いて、サッカロミセス'パストリアヌス検出用 PCR法プライマーセットを設計し、そのブラ イマ一セットによってサッカロミセス.パストリアヌスを正確に検出できることを見いだし た。
[0038] すなわち、本発明の第四の態様によれば、配列番号 25の塩基配列で表されるポリ ヌクレオチドまたはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダ ィズする少なくとも 10塩基のポリヌクレオチドと、配列番号 26の塩基配列で表される ポリヌクレオチドまたはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブ リダィズする少なくとも 10塩基のポリヌクレオチドとを含んでなる、サッカロミセス'パス トリアヌスの検出に用いられる PCR法プライマーセットが提供される。
[0039] 本発明の第四の態様によれば、第四の態様の PCR法プライマーセットを用いて PC R法により核酸増幅反応を実施する工程を含んでなる、サッカロミセス'パストリアヌス の検出方法が提供される。
[0040] 本発明によるプライマーセットによれば、サッカロミセス属酵母を菌種レベルで正確 に検出することができる。特に、本発明による LAMP法プライマーセットは、 LAMP 法による核酸増幅反応に使用することができ、増幅産物の有無により対象菌種を検 出することができる。従って、本発明による LAMP法プライマーセットによれば、サッ カロミセス属酵母を、菌種レベルで、正確、迅速、かつ簡便に識別することができる。
[0041] 本発明による LAMP法プライマーセットによれば、更に、試料中の菌体数を測定す ることができる。従って、本発明による LAMP法プライマーセットによれば、サッカロミ セス 'パストリアヌス、サッカロミセス'セレビシェ、およびサッカロミセス'バヤヌスを、正 確に定量することができる。
[0042] サッカロミセス属酵母は、酒類および清涼飲料などの各種飲料を混濁させる原因菌 であり、これらの菌の存在 '不存在は各種飲料の品質管理の指標となりうる。従って、 本発明によるプライマーセットは、各種飲料 (例えば、酒類および清涼飲料、特に、ビ ール、発泡酒、ワイン)の品質管理や環境試料の検査に有用である。
図面の簡単な説明
[0043] [図 1]サッカロミセス.パストリアヌス検出用プライマーセット（LGM1LB1)の検出対象 菌種への反応特異性を示した図である。使用菌株は次の通りである。サッカロミセス' セレビシェ NBRC10217、サッカロミセス'バヤヌス NBRC11022、サッカロミセス' パストリアヌス NBRC11024、 NBRC11023、 NBRC10610、サッカロミセス'セレビ シェ ·ディアスタティカス DSM70487、サッカロミセス ·パラドクサス NBRC10609、 サッカロミセス ·カリオカヌス NBRC10947、サッカロミセス'ミカタエ NBRC1815、サ ッカロミセス ·クドリアヴゼヴィ NBRC1802、サッカロミセス ·ェクシダス NBRC1128、 サッカロミセス'セルバジー NBRC1838、サッカロミセス'ゥ -スポラス NBRC0316、 サッカロミセス ·ダイレネンシス NBRC0211、サッカロミセス ·タノレイベリ NBRC1685、 Nega：ゲノム DNA無添加。
[図 2]サッカロミセス'パストリアヌスのコロニー形成数と LGM1LB1による LAMP法検 出時間の近似曲線を示した図である。横軸の検出時間（Threshold time)は、濁度が 0. 1を超えたときの反応時間を示す。
[図 3]サッカロミセス属検出用プライマーセット（SSC1LB1)の検出対象菌種への反 応特異性を示した図である。使用菌株は次の通りである。サッカロミセス'セレピシェ NBRC10217,サッカロミセス'ノ ャヌス NBRC11022、サッカロミセス'ノ ストリアヌ ス NBRC11024、 NBRC11023、 NBRC10610、サッカロミセス'セレピシェ 'ディア スタティカス DSM70487、サッカロミセス'パラドクサス NBRC10609、サッカロミセス' カリオカヌス NBRC10947、サッカロミセス'ミカタエ NBRC1815、サッカロミセス'ク ドリアヴゼヴィ NBRC1802、サッカロミセス'ェクシダス NBRC1128、サッカロミセス' セルバジー NBRC1838、サッカロミセス'ゥ -スポラス NBRC0316、サッカロミセス' ダイレネンシス NBRC0211、サッカロミセス'クルィベリ NBRC1685、 Nega:ゲノム DNA無添カロ。
[図 4]下面発酵酵母検出用プライマーセット (SBFY1LF1LB1)の検出対象菌種へ の反応特異性を示した図である。使用菌株は次の通りである。サッカロミセス'セレビ シェ NBRC10217、サッカロミセス'バヤヌス NBRC11022、サッカロミセス'パストリ アヌス NBRC11024、 NBRC11023、 NBRC10610、サッカロミセス'セレピシェ · ディアスタティカス DSM70487、サッカロミセス'ノ ラドクサス NBRC10609、サッカロ ミセス ·カリオカヌス NBRC10947、サッカロミセス'ミカタエ NBRC1815、サッカロミ セス 'クドリアヴゼヴィ NBRC 1802、サッカロミセス'ェクシダス NBRC1128、サッカロ ミセス'セルバジー NBRC1838、サッカロミセス'ゥ -スポラス NBRC0316、サッカロ ミセス'ダイレネンシス NBRC0211、サッカロミセス'クルィベリ NBRC1685、 Nega: ゲノム DNA無添加。
発明の具体的説明
[0044] プライマーおよびプライマーセット
本発明による LAMP法プライマーセットは、 FIP、 F3、 BIP、および B3の 4種類の プライマーからなり、これらのプライマーは標的ヌクレオチド配列の 6つの領域に対応 している。具体的には、標的塩基配列について、 3 '末端側から 5'末端側に向力つて 順番に F3c、 F2c、 Flc、 Bl、 B2、 B3という領域をそれぞれ規定し、この 6領域に対 し、 4種類のプライマー、すなわち FIP、 F3、 BIPおよび B3を作製する。ここで、 F3c 、 F2c、 Flcの各領域に相補的な領域はそれぞれ F3、 F2、 F1であり、また Bl、 B2、 B3の各領域に相補的な領域はそれぞれ Blc、 B2c、 B3cである。
[0045] FIPは、標的配列の F2c領域と相補的な F2領域を 3'末端側にもち、 5'末端側に 標的遺伝子の Flc領域と同じ配列を持つように作製されたプライマーである。必要な らば、 FIPプライマーの Flcと F2の間に制限酵素部位を導入することもできる。
[0046] F3は、標的遺伝子の F3c領域と相補的な F3領域をもつように作製されたプライマ 一である。
[0047] BIPは、標的配列の B2c領域と相補的な B2領域を 3'末端側にもち、 5'末端側に 標的遺伝子の Blc領域と同じ配列を持つように作製されたプライマーである。必要な らば、 BIPプライマーの Blcと B2の間に制限酵素部位を導入することもできる。
[0048] B3は、標的遺伝子の B3c領域と相補的な B3領域をもつように作製されたプライマ 一である。
[0049] FIPおよび BIPプライマーに制限酵素部位が含まれる場合、 LAMP法による核酸 増幅反応後に増幅産物を制限酵素で処理することによって、電気泳動後に 1つのバ ンドとして観察することができる。この場合、もし標的配列に制限酵素部位があれば、 プライマーに人為的に制限酵素部位を導入しなくてもよい。
本発明による LAMP法プライマーセットの実施に当たっては、核酸の増幅反応を 加速するためにループプライマー（LFプライマーまたは LBプライマー）を 1種類ある いは 2種類追加してもよい。ループプライマーを F1—F2間の領域、あるいは B1— B 2間の領域にァニールするように設計し、 LAMP法反応系に追加して使用すると、こ れらのプライマーが核酸増幅工程で利用されていないループ部分に結合することに より、全てのループ部分を起点として核酸反応が進み、核酸増幅反応が加速される（ 例えば、特開 2002— 345499号公報参照）。
[0050] 具体的には、第一の態様の LAMP法プライマーセットのうち、配列番号 1〜4の塩 基配列で表されるポリヌクレオチドまたはそれらの相同ポリヌクレオチド力 なる LAM P法プライマーセットは、配列番号 5の塩基配列で表されるポリヌクレオチド (LB)また はその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダィズする少なくと も 10塩基のポリヌクレオチドを、ループプライマーとして、更に含んでいてもよい。
[0051] 第二の態様の LAMP法プライマーセットは、配列番号 11の塩基配列で表されるポ リヌクレオチド (LF)またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにノヽ イブリダィズする少なくとも 10塩基のポリヌクレオチド；および配列番号 12の塩基配列 で表されるポリヌクレオチド (LB)またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌク レオチドにハイブリダィズする少なくとも 10塩基のポリヌクレオチドのいずれか一方あ るいは両方を、ループプライマーとして、更に含んでいてもよい。
[0052] 第三の態様の LAMP法プライマーセットは、配列番号 17の塩基配列で表されるポ リヌクレオチド (LB)またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハ イブリダィズする少なくとも 10塩基のポリヌクレオチドを、ループプライマーとして、更 に含んでいてもよい。
[0053] 本発明では、配列番号 1〜5および 7〜30の塩基配列で表されるポリヌクレオチド のみならず、配列番号 1〜5および 7〜30の塩基配列の相補配列で表されるポリヌク レオチドにハイブリダィズするポリヌクレオチド (本明細書にぉ 、て「相同ポリヌクレオ チド」と言うことがある)も、プライマーやプローブとして用いることができる。
[0054] 本発明では、また、配列番号 6の塩基配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダ ィズする少なくとも 10塩基のポリヌクレオチド、および配列番号 6の塩基配列の相補 配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダィズする少なくとも 10塩基のポリヌクレオ チドを、 LAMP法プライマー、 PCR法プライマー、およびプローブとして使用できる。
[0055] 本明細書にぉ 、て「ノヽイブリダィズする」とは、標的ポリヌクレオチドにハイブリダィズ し、標的ポリヌクレオチド以外のポリヌクレオチドには、実質的にはハイブリダィズしな いことを意味する。ノ、イブリダィゼーシヨンは、ストリンジェントな条件下で実施すること ができる。ここで「ストリンジェントな条件」は、プライマー配列とその相補鎖との二重鎖 の Tm (°C)および必要な塩濃度などに依存して決定でき、プローブとなる配列を選択 した後にそれに応じたストリンジヱントな条件を設定することは当業者に周知の技術 で fcO (f列 は、 J. bambrook, E. F. Fnsch, T. Maniatis; Molecular Cloning 2nd editi on.Cold Spring Harbor Laboratory(1989)等参照）。ストリンジェントな条件としては、ハ イブリダィゼーシヨンに通常用いられる適切な緩衝液中で、ヌクレオチド配列によって 決定される Tmよりわずかに低い温度（例えば、 Tmよりも 0〜約 5°C低い温度）におい てノ、イブリダィゼーシヨン反応を実施することが挙げられる。ストリンジェントな条件とし てはまた、ハイブリダィゼーシヨン反応後の洗浄を高濃度低塩濃度溶液で実施するこ とが挙げられる。ストリンジェントな条件の例としては、 6 X SSCZ0. 05%ピロリン酸 ナトリウム溶液中で、 37°C (約 14塩基のオリゴヌクレオチドについて）、 48°C (約 17塩 基のオリゴヌクレオチドにつ 、て）、 55°C (約 20塩基のオリゴヌクレオチドにつ 、て）、
60°C (約 23塩基のオリゴヌクレオチドについて）の洗浄条件が挙げられる。
[0056] 相同ポリヌクレオチドのヌクレオチド長は、少なくとも 10塩基である。
[0057] LAMP法プライマーでは、 FIPおよび BIPの相同ポリヌクレオチドのヌクレオチド長 は、好ましくは、少なくとも 30塩基 (例えば、 30〜60塩基）、より好ましくは少なくとも 4
2塩基 (例えば、 42〜57塩基）とすることができる。
[0058] また、 F3、 B3、 LF、および LBの相同ポリヌクレオチドのヌクレオチド長は、好ましく は、少なくとも 12塩基 (例えば、 12〜30塩基）、より好ましくは、少なくとも 18塩基 (例 えば、 18〜25塩基および 18〜30塩基）とすることができる。
[0059] PCR法プライマーでは、配列番号 23〜30の塩基配列で表されるポリヌクレオチド の相同ポリヌクレオチドのヌクレオチド長は、好ましくは、少なくとも 15塩基 (例えば、 1
5〜30塩基）、より好ましくは、少なくとも 18塩基 (例えば、 18〜24塩基および 18〜3
0塩基）、特に好ましくは、少なくとも 20塩基 (例えば、 20〜25塩基および 20〜30塩 基)とすることができる。
[0060] 相同ポリヌクレオチドは、それぞれ、対応する塩基配列の連続する少なくとも 10個、 好ましくは少なくとも 15個、より好ましくは少なくとも 18個、特に好ましくは少なくとも 2 0個のヌクレオチドを含んでなるポリヌクレオチドであることができる。
[0061] 配列番号 1〜5および 7〜30の塩基配列で表されるポリヌクレオチドの相同ポリヌク レオチドの例を示すと以下の通りである。
[0062] ·配列番号 1の塩基配列で表される FIPの相同ポリヌクレオチド：配列番号 1の連続す る少なくとも 42個（42〜52個）、より好ましくは、少なくとも 47個（47〜52個）のヌクレ ォチド（1または数個の変異が導入されて 、てもよ 、）を含んでなるポリヌクレオチド（ ヌクレオチド長は最大で 60塩基、好ましくは最大で 57塩基とすることができる)。
[0063] ·配列番号 2の塩基配列で表される F3の相同ポリヌクレオチド：配列番号 2の連続す る少なくとも 15個（15〜19個）、より好ましくは、少なくとも 18個（18〜19個）のヌクレ ォチド（1または数個の変異が導入されて 、てもよ 、）を含んでなるポリヌクレオチド（ ヌクレオチド長は最大で 30塩基、好ましくは最大で 25塩基、より好ましくは最大で 21 塩基とすることができる)。 [0064] ·配列番号 3の塩基配列で表される BIPの相同ポリヌクレオチド：配列番号 3の連続す る少なくとも 36個（36〜42個）、より好ましくは、少なくとも 38個（38〜42個）のヌクレ ォチド（1または数個の変異が導入されて 、てもよ 、）を含んでなるポリヌクレオチド（ ヌクレオチド長は最大で 60塩基、好ましくは最大で 53塩基、より好ましくは最大で 47 塩基とすることができる)。
[0065] ·配列番号 4の塩基配列で表される B3の相同ポリヌクレオチド：配列番号 4の連続す る少なくとも 19個（19〜23個）、より好ましくは、少なくとも 21個（21〜23個）のヌクレ ォチド（1または数個の変異が導入されて 、てもよ 、）を含んでなるポリヌクレオチド（ ヌクレオチド長は最大で 30塩基、好ましくは最大で 25塩基とすることができる)。
[0066] ·配列番号 5の塩基配列で表される LBの相同ポリヌクレオチド：配列番号 5の連続す る少なくとも 18個（18〜22個）、より好ましくは、少なくとも 20個（20〜22個）のヌクレ ォチド（1または数個の変異が導入されて 、てもよ 、）を含んでなるポリヌクレオチド（ ヌクレオチド長は最大で 30塩基、好ましくは最大で 25塩基とすることができる)。
[0067] ·配列番号 7の塩基配列で表される FIPの相同ポリヌクレオチド：配列番号 7の連続す る少なくとも 38個（38〜47個）、より好ましくは、少なくとも 42個（42〜47個）のヌクレ ォチド（1または数個の変異が導入されて 、てもよ 、）を含んでなるポリヌクレオチド（ ヌクレオチド長は最大で 60塩基、好ましくは最大で 53塩基とすることができる)。
[0068] ·配列番号 8の塩基配列で表される F3の相同ポリヌクレオチド：配列番号 8の連続す る少なくとも 18個（18〜22個）、より好ましくは、少なくとも 19個（19〜22個）のヌクレ ォチド（1または数個の変異が導入されて 、てもよ 、）を含んでなるポリヌクレオチド（ ヌクレオチド長は最大で 30塩基、好ましくは最大で 25塩基、より好ましくは最大で 23 塩基とすることができる)。
[0069] ·配列番号 9の塩基配列で表される BIPの相同ポリヌクレオチド：配列番号 9の連続す る少なくとも 42個（42〜57個）、より好ましくは、少なくとも 47個（47〜57個）、特に好 ましくは、少なくとも 51個（51〜57個）、最も好ましくは、少なくとも 53個（53〜57個） のヌクレオチド（1または数個の変異が導入されていてもよい）を含んでなるポリヌクレ ォチド (ヌクレオチド長は最大で 60塩基とすることができる）。
[0070] ·配列番号 10の塩基配列で表される B3の相同ポリヌクレオチド:配列番号 10の連続 する少なくとも 19個（19〜25個）、より好ましくは、少なくとも 22個（22〜25個）のヌク レオチド（1または数個の変異が導入されていてもよい）を含んでなるポリヌクレオチド (ヌクレオチド長は最大で 30塩基とすることができる)。
[0071] ·配列番号 11の塩基配列で表される LFの相同ポリヌクレオチド：配列番号 11の連続 する少なくとも 19個（19〜25個）、より好ましくは、少なくとも 22個（22〜25個）のヌク レオチド（1または数個の変異が導入されていてもよい）を含んでなるポリヌクレオチド (ヌクレオチド長は最大で 30塩基とすることができる)。
[0072] ·配列番号 12の塩基配列で表される LBの相同ポリヌクレオチド:配列番号 12の連続 する少なくとも 19個（19〜25個）、より好ましくは、少なくとも 22個（22〜25個）のヌク レオチド（1または数個の変異が導入されていてもよい）を含んでなるポリヌクレオチド (ヌクレオチド長は最大で 30塩基とすることができる)。
[0073] ·配列番号 13の塩基配列で表される FIPの相同ポリヌクレオチド：配列番号 12の連 続する少なくとも 42個（42〜53個）、より好ましくは、少なくとも 48個（48〜53個）の ヌクレオチド（1または数個の変異が導入されて 、てもよ 、）を含んでなるポリヌクレオ チド (ヌクレオチド長は最大で 60塩基、好ましくは最大で 57塩基とすることができる）
[0074] ·配列番号 14の塩基配列で表される F3の相同ポリヌクレオチド:配列番号 13の連続 する少なくとも 18個（18〜21個）、より好ましくは、少なくとも 19個（19〜21個）のヌク レオチド（1または数個の変異が導入されていてもよい）を含んでなるポリヌクレオチド (ヌクレオチド長は最大で 30塩基、好ましくは最大で 25塩基、より好ましくは最大で 2 3塩基とすることができる）。
[0075] ·配列番号 15の塩基配列で表される BIPの相同ポリヌクレオチド：配列番号 14の連 続する少なくとも 37個（37〜44個）、より好ましくは、少なくとも 42個（42〜44個）の ヌクレオチド（1または数個の変異が導入されて 、てもよ 、）を含んでなるポリヌクレオ チド (ヌクレオチド長は最大で 60塩基、好ましくは最大で 53塩基、より好ましくは最大 で 47塩基とすることができる）。
[0076] ·配列番号 16の塩基配列で表される B3の相同ポリヌクレオチド:配列番号 15の連続 する少なくとも 19個（19〜25個）、より好ましくは、少なくとも 22個（22〜25個）のヌク レオチド（1または数個の変異が導入されていてもよい）を含んでなるポリヌクレオチド (ヌクレオチド長は最大で 30塩基とすることができる)。
[0077] ·配列番号 17の塩基配列で表される LBの相同ポリヌクレオチド:配列番号 16の連続 する少なくとも 14個（14〜18個）、より好ましくは、少なくとも 16個（16〜18個）のヌク レオチド（1または数個の変異が導入されていてもよい）を含んでなるポリヌクレオチド (ヌクレオチド長は最大で 30塩基、好ましくは最大で 25塩基、より好ましくは最大で 2 2塩基とすることができる）。
[0078] ·配列番号 18の塩基配列で表される FIPの相同ポリヌクレオチド：配列番号 18の連 続する少なくとも 38個（38〜47個）、より好ましくは、少なくとも 42個（42〜47個）の ヌクレオチド（1または数個の変異が導入されて 、てもよ 、）を含んでなるポリヌクレオ チド (ヌクレオチド長は最大で 60塩基、好ましくは最大で 53塩基とすることができる）
[0079] ·配列番号 19の塩基配列で表される F3の相同ポリヌクレオチド:配列番号 19の連続 する少なくとも 18個（18〜20個）、より好ましくは、少なくとも 19個（19〜20個）のヌク レオチド（1または数個の変異が導入されていてもよい）を含んでなるポリヌクレオチド (ヌクレオチド長は最大で 30塩基、好ましくは最大で 25塩基、より好ましくは最大で 2 2塩基とすることができる）。
[0080] ·配列番号 20の塩基配列で表される BIPの相同ポリヌクレオチド：配列番号 20の連 続する少なくとも 36個（36〜42個）、より好ましくは、少なくとも 38個（38〜42個）の ヌクレオチド（1または数個の変異が導入されて 、てもよ 、）を含んでなるポリヌクレオ チド (ヌクレオチド長は最大で 60塩基、好ましくは最大で 53塩基、より好ましくは最大 で 47塩基とすることができる）。
[0081] ·配列番号 21塩基配列で表される B3の相同ポリヌクレオチド：配列番号 21の連続す る少なくとも 18個（18〜20個）、より好ましくは、少なくとも 19個（19〜20個）のヌクレ ォチド（1または数個の変異が導入されて 、てもよ 、）を含んでなるポリヌクレオチド（ ヌクレオチド長は最大で 30塩基、好ましくは最大で 25塩基、より好ましくは最大で 22 塩基とすることができる)。
[0082] ·配列番号 22の塩基配列で表される LBの相同ポリヌクレオチド：配列番号 22の連続 する少なくとも 18個（18〜20個）、より好ましくは、少なくとも 19個（19〜20個）のヌク レオチド（1または数個の変異が導入されていてもよい）を含んでなるポリヌクレオチド (ヌクレオチド長は最大で 30塩基、好ましくは最大で 25塩基、より好ましくは最大で 2 2塩基とすることができる）。
[0083] ·配列番号 23の塩基配列で表されるポリヌクレオチドの相同ポリヌクレオチド：配列番 号 17の連続する少なくとも 19個（19〜23個）、より好ましくは、少なくとも 21個（21〜 23個）のヌクレオチド（1または数個の変異が導入されて 、てもよ 、）を含んでなるポリ ヌクレオチド (ヌクレオチド長は最大で 30塩基、好ましくは最大で 25塩基とすることが できる)。
[0084] ·配列番号 24の塩基配列で表されるポリヌクレオチドの相同ポリヌクレオチド：配列番 号 18の連続する少なくとも 20個（20〜24個）、より好ましくは、少なくとも 22個（22〜 24個）のヌクレオチド（1または数個の変異が導入されて 、てもよ 、）を含んでなるポリ ヌクレオチド (ヌクレオチド長は最大で 30塩基、好ましくは最大で 25塩基とすることが できる)。
[0085] ·配列番号 25の塩基配列で表されるポリヌクレオチドの相同ポリヌクレオチド：配列番 号 19の連続する少なくとも 18個（18〜21個）、より好ましくは、少なくとも 19個（19〜 21個）のヌクレオチド（1または数個の変異が導入されて 、てもよ 、）を含んでなるポリ ヌクレオチド (ヌクレオチド長は最大で 30塩基、好ましくは最大で 25塩基とすることが できる)。
[0086] ·配列番号 26の塩基配列で表されるポリヌクレオチドの相同ポリヌクレオチド：配列番 号 20の連続する少なくとも 14個（14〜18個）、より好ましくは、少なくとも 16個（16〜 18個）のヌクレオチド（1または数個の変異が導入されて 、てもよ 、）を含んでなるポリ ヌクレオチド (ヌクレオチド長は最大で 30塩基、好ましくは最大で 25塩基、より好まし くは最大で 23塩基とすることができる）。
[0087] ·配列番号 27の塩基配列で表されるポリヌクレオチドの相同ポリヌクレオチド：配列番 号 21の連続する少なくとも 16個（16〜20個）、より好ましくは、少なくとも 18個（18〜 20個）のヌクレオチド（1または数個の変異が導入されて 、てもよ 、）を含んでなるポリ ヌクレオチド (ヌクレオチド長は最大で 30塩基、好ましくは最大で 25塩基、より好まし くは最大で 23塩基とすることができる）。
[0088] ·配列番号 28の塩基配列で表されるポリヌクレオチドの相同ポリヌクレオチド：配列番 号 22の連続する少なくとも 16個（16〜20個）、より好ましくは、少なくとも 18個（18〜 20個）のヌクレオチド（1または数個の変異が導入されて 、てもよ 、）を含んでなるポリ ヌクレオチド (ヌクレオチド長は最大で 30塩基、好ましくは最大で 25塩基、より好まし くは最大で 23塩基とすることができる）。
[0089] ·配列番号 29の塩基配列で表されるポリヌクレオチドの相同ポリヌクレオチド：配列番 号 23の連続する少なくとも 16個（16〜20個）、より好ましくは、少なくとも 18個（18〜 20個）のヌクレオチド（1または数個の変異が導入されて 、てもよ 、）を含んでなるポリ ヌクレオチド (ヌクレオチド長は最大で 30塩基、好ましくは最大で 25塩基、より好まし くは最大で 23塩基とすることができる）。
[0090] ·配列番号 30の塩基配列で表されるポリヌクレオチドの相同ポリヌクレオチド：配列番 号 24の連続する少なくとも 16個（16〜20個）、より好ましくは、少なくとも 18個（18〜 20個）のヌクレオチド（1または数個の変異が導入されて 、てもよ 、）を含んでなるポリ ヌクレオチド (ヌクレオチド長は最大で 30塩基、好ましくは最大で 25塩基、より好まし くは最大で 23塩基とすることができる）。
[0091] 本発明では、配列番号 6の塩基配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダィズす る少なくとも 10塩基のポリヌクレオチド、および配列番号 6の塩基配列の相補配列で 表されるポリヌクレオチドにハイブリダィズする少なくとも 10塩基のポリヌクレオチドは 、それぞれ、配列番号 6の塩基配列の相補配列の連続する少なくとも 10個のヌクレオ チドを含んでなるポリヌクレオチド、および配列番号 6の塩基配列の連続する少なくと も 10個のヌクレオチドを含んでなるポリヌクレオチドとすることができる。
[0092] 配列番号 6の塩基配列に基づ 、て作製されたポリヌクレオチドを LAMP法プライマ 一 (FIPおよび BIP)として用いる場合には、配列番号 6の塩基配列またはその相補 配列の連続する少なくとも 42個（例えば、 42〜57塩基）のヌクレオチド（1または数個 の変異が導入されて 、てもよ 、）を含んでなるポリヌクレオチド (ヌクレオチド長は最大 で 60塩基、好ましくは最大で 57塩基とすることができる）をプライマーとして使用でき る。 [0093] 配列番号 6の塩基配列に基づ 、て作製されたポリヌクレオチドを LAMP法プライマ 一（F3、 B3、 LB、および LF)として用いる場合には、配列番号 6の塩基配列または その相補配列の連続する少なくとも 18個（例えば、 18〜25個）のヌクレオチド（1また は数個の変異が導入されて 、てもよ 、）を含んでなるポリヌクレオチド (ヌクレオチド長 は最大で 30塩基、好ましくは最大で 25塩基とすることができる）をプライマーとして使 用できる。
[0094] 配列番号 6の塩基配列に基づ 、て作製されたポリヌクレオチドを PCR法プライマー として用いる場合には、配列番号 6の塩基配列またはその相補配列の連続する少な くとも 15個（例えば、 15〜30個）、より好ましくは、少なくとも 18個（例えば、 18〜24 個および 18〜30個）、特に好ましくは、少なくとも 20個（例えば、 20〜25個および 2 0〜30個）のヌクレオチド（1または数個の変異が導入されて 、てもよ 、）を含んでなる ポリヌクレオチド (ヌクレオチド長は最大で 30塩基、好ましくは最大で 25塩基、より好 ましくは最大で 24塩基とすることができる）をプライマーとして使用できる。
[0095] 本発明にお 、ては、配列番号 6の塩基配列で表されるポリヌクレオチドに基づ ヽて 、サッカロミセス'パストリアヌスを検出するための PCR法プライマーペアを選択するこ とができる。具体的には、 PCR法においては、二つのプライマーの一方が配列番号 6 の塩基配列に対合し、他方のプライマーが配列番号 6の塩基配列の相補配列に対 合し、かつ一方のプライマーにより伸長された伸長鎖にもう一方のプライマーが対合 するようにプライマーを選択できる。
[0096] 本発明にお 、ては、また、配列番号 6の塩基配列で表されるポリヌクレオチドに基 づいて、サッカロミセス'パストリアヌスを検出するための LAMP法プライマーセットを 選択することができる。具体的には、 LAMP法の実施に必要な 4種類のプライマー、 すなわち、 FIP、 F3、 BIP、および B3を、前述のように設計し、必要に応じてループ プライマー、すなわち、 LFおよび LBを使用することもできる。
[0097] 相同ポリヌクレオチドおよび配列番号 6の塩基配列に基づいて作製されたポリヌクレ ォチドは、また、それぞれ、対応する塩基配列と少なくとも 90%、好ましくは少なくとも 95%の同一性を有するポリヌクレオチドであることができる。同一性の数値は、当業 界において周知のアルゴリズムに従って算出することができ、例えば、 BLAST (http: //www.ddbj.nig.ac.jp/search/blast-j.html)を使用して同一性の数値を算出すること ができる。
[0098] 相同ポリヌクレオチドおよび配列番号 6の塩基配列に基づ 、て作製されたポリヌクレ ォチドは、更に、対応するの塩基配列に 1または数個の変異が導入された改変塩基 配列からなり、かつ対応するの塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハ イブリダィズするポリヌクレオチドであることができる。
[0099] ここで「変異」は、同一または異なっていてもよぐ置換、欠失、挿入、および付加か ら選択でき、好ましくは、ある 1個の塩基を他の 1個の塩基に置換する「一塩基置換」 、ある 1個の塩基を欠失させる「一塩基欠失」、ある 1個の塩基を挿入する「1塩基挿 入」、およびある 1個の塩基を付加する「一塩基付加」力も選択できる。また、変異の 個数は、 1〜6個、 1、 2、 3、または 4個、 1または 2個、あるいは 1個とすることができる
[0100] 本発明にお 、て「ポリヌクレオチド」とは DNA、 RNA、および PNA (peptide nucleic acid)を含む意味で用いられる。
[0101] 本発明によるプライマーセット等を構成するポリヌクレオチドは、例えばホスファイト' トリエステル法（Hunkapiller,M.et al., Nature, 310,105, 1984)等の通常の方法に準じ て、核酸の化学合成を行うことにより調製してもよいし、検出対象の菌株の全 DNAを 取得し、本明細書に開示されるヌクレオチド配列に基づいて目的のヌクレオチド配列 を含む DNA断片を PCR法等で適宜取得してもよ ヽ。
[0102] 本発明による検出方法の具体的な態様としては、核酸試料に対して LAMP法によ る核酸増幅反応を実施した後、核酸増幅産物の有無を検出する工程を含む検出方 法が挙げられる。より具体的には、以下の通りである。
[0103] 本発明による第一の態様によれば、
(a)本発明による第一の態様の LAMP法プライマーセットを用いて、試料中の核酸 につ ヽて LAMP法により核酸増幅反応を実施する工程；および
(b)増幅産物の有無を検出する工程
を含んでなり、増幅産物の生成がサッカロミセス ·パストリアヌスの存在を示す、サッカ 口ミセス'パストリアヌスの検出方法が提供される。 [0104] 本発明による第二の態様によれば、
(c)本発明による第二の態様の LAMP法プライマーセットを用いて、試料中の核酸 につ ヽて LAMP法により核酸増幅反応を実施する工程；および
(d)増幅産物の有無を検出する工程
を含んでなり、増幅産物の生成がサッカロミセス'セレピシェの存在を示す、サッカロミ セス ·セレピシェの検出方法が提供される。
[0105] 本発明による第三の態様によれば、
(e)本発明による第三の態様の LAMP法プライマーセットを用いて、試料中の核酸 につ ヽて LAMP法により核酸増幅反応を実施する工程；および
(f)増幅産物の有無を検出する工程
を含んでなり、増幅産物の生成がサッカロミセス'バヤヌスの存在を示す、サッカロミセ ス 'バヤヌスの検出方法が提供される。
[0106] LAMP法による核酸増幅工程に供される試料は、試料中の菌体を培養してから核 酸を抽出しても、培養せずに核酸を抽出してもよい。菌体の培養や核酸の抽出など 核酸試料の調製にっ 、ては後述する。
[0107] LAMP法による核酸増幅工程では、試料中の核酸に対して増幅反応が実施され る。 LAMP法による核酸増幅反応につ ヽては後述する。
[0108] 試料中に検出対象菌種が存在する場合には、標的とする特定の領域が増幅され、 増幅産物が生成する。増幅産物が生成した場合には、核酸増幅反応が実施された 試料溶液が白濁することから、試料溶液の濁度を測定することにより増幅産物の有無 を決定することができる。 LAMP法における濁度の測定は周知であり、市販のエンド ポイント濁度測定装置 (例えば、テラメッタス社製 LA— 100)やリアルタイム濁度測定 装置 (例えば、テラメッタス社製 LA— 200)を用いて濁度の測定をすることができる。
[0109] 後記実施例で示すように、試料溶液がある一定の濁度に達するまでの時間を測定 することにより、検定試料中の菌体数を決定することができる。すなわち、本発明によ る検出方法の別の面によれば、核酸試料に対して LAMP法による核酸増幅反応を 実施するとともに、核酸増幅反応の開始力 試料がある一定の濁度に達するまでの 時間を測定し、その時間から検体中の菌体数を求める工程を含む、サッカロミセス · パストリアヌス、サッカロミセス'セレピシェ、およびサッカロミセス'バヤヌスの定量方 法が提供される。具体的には、以下の通りである。
[0110] 本発明による第一の態様によれば、
(a)本発明による第一の態様の LAMP法プライマーセットを用いて、試料中の核酸 について LAMP法により核酸増幅反応を実施する工程；
(b' )核酸増幅反応の開始から一定の濁度に達するまでの時間を測定する工程;お よび
(b")測定した時間から検体中の菌体数を求める工程
を含んでなる、サッカロミセス ·パストリアヌスの定量方法が提供される。
[0111] 本発明による第二の態様によれば、
(c)本発明による第二の態様の LAMP法プライマーセットを用いて、試料中の核酸 について LAMP法により核酸増幅反応を実施する工程；
(d' )核酸増幅反応の開始から一定の濁度に達するまでの時間を測定する工程;お よび
(d")測定した時間から検体中の菌体数を求める工程
を含んでなる、サッカロミセス ·セレピシェの定量方法が提供される。
[0112] 本発明による第三の態様によれば、
(e)本発明による第三の態様の LAMP法プライマーセットを用いて、試料中の核酸 について LAMP法により核酸増幅反応を実施する工程；
(f ' )核酸増幅反応の開始から一定の濁度に達するまでの時間を測定する工程;およ び
(f")測定した時間から検体中の菌体数を求める工程
を含んでなる、サッカロミセス'バヤヌスの定量方法が提供される。
[0113] 本発明による定量方法においては、菌体数と一定の濁度に達するまでの時間との 検量線を予め作成しておき、この検量線に基づいて、測定した時間から検体中の菌 体数を求めることができる。検量線は、例えば、菌体を段階的に希釈した試料を準備 し、それぞれについて LAMP法による核酸増幅法を実施し、菌体のコロニー形成数 の対数に対して、核酸増幅反応の開始から濁度が 0. 1になるまでの時間をプロット すること〖こより作成することができる。
[0114] 本発明による検出方法および定量方法においては、 FIP、 F3、 BIP、および B3か らなるプライマーセットに、ループプライマー（LFおよび Zまたは LB)を追加して、 L AMP法による核酸増幅反応を実施してもよい。具体的には、本発明による第一の態 様の検出方法および定量方法のうち、配列番号 1〜4の塩基配列で表されるポリヌク レオチドまたはそれらの相同ポリヌクレオチドからなる LAMP法プライマーセットにお いては、配列番号 5の塩基配列で表されるポリヌクレオチドまたはその相同ポリヌクレ ォチドを、ループプライマーとして、追加し、使用してもよい。本発明による第二の態 様の検出方法および定量方法にお!、ては、配列番号 11の塩基配列で表されるポリ ヌクレオチドまたはその相同ポリヌクレオチドおよび配列番号 12の塩基配列で表され るポリヌクレオチドまたはその相同ポリヌクレオチドの!/、ずれか一方ある!/、は両方を、 ループプライマーとして、追加し、使用してもよい。本発明による第三の態様の検出 方法および定量方法にお!、ては、配列番号 17の塩基配列で表されるポリヌクレオチ ドまたはその相同ポリヌクレオチドを、ループプライマーとして、追加し、使用してもよ い。
[0115] 本発明による LAMP法プライマーセットは、それぞれ単独で使用しても、適宜組み 合わせて使用してもよい。本発明によるプライマーセットを組み合わせて実施すること により、サッカロミセス'ノ ストリアヌスと、サッカロミセス'セレピシェと、サッカロミセス' バヤヌスとをより正確に区別して検出することが可能となる。
[0116] 本発明による LAMP法プライマーセットは、また、単独で、あるいは組み合わせて、 キットの形態で提供することができる。従って、本発明によれば、第一の態様の LAM P法プライマーセット；第二の態様の LAMP法プライマーセット；第三の態様の LAM P法プライマーセット；およびこれらの一部または全部の組み合わせ力もなる群力 選 択されるプライマーセット含んでなる、サッカロミセス属酵母の検出キットが提供される
[0117] LAMP法プライマーセットを含む本発明によるキットは、 LAMP法による核酸増幅 反応の実施に必要な試薬 (例えば、 Bst DNAポリメラーゼ、反応用試薬混合液)や 器具 (例えば、反応用チューブ）を含んで!/、てもよ!/、。 [0118] PCR法プライマーセットを含む本発明によるキットは、 PCR法による核酸増幅反応 の実施に必要な試薬 (例えば、 DNAポリメラーゼ、精製水）や器具 (例えば、反応用 チューブ）を含んで!/、てもよ！/、。
[0119] 本発明による第一の態様の LAMP法プライマーセットは、 Lg型 MET16遺伝子を 標的にしており、ゲノム構造的に均一ではな!/、サッカロミセス ·バヤヌスと反応する可 能性がある。一方、本発明による第三の態様の LAMP法プライマーセットは、サッカ 口ミセス ·セレピシェゃサッカロミセス ·パストリアヌスには存在しな 、、サッカロミセス · バヤヌスの RAD18相同遺伝子を標的にしており、サッカロミセス'バヤヌスを高い精 度で検出することができる。従って、サッカロミセス'パストリアヌスをより正確に検出し たい場合には、本発明による第一の態様の LAMP法プライマーセットと、サッカロミセ ス ·バヤヌスの検出に用 、られる LAMP法プライマーセット (好ましくは、第三の態様 の LAMP法プライマーセット）とを組み合わせて使用することが好ましい。この場合、 本発明による第一の態様の LAMP法プライマーセットと、サッカロミセス'バヤヌス検 出用 LAMP法プライマーセットとの両方で増幅反応が認められた場合、あるいは第 一の態様の LAMP法プライマーセットに増幅反応が認められず、サッカロミセス ·バ ャヌス検出用 LAMP法プライマーセットに増幅反応が認められた場合には、試料中 にサッカロミセス.バヤヌスが存在すると判断することができる。本発明による第一の 態様の LAMP法プライマーセットに増幅反応が認められ、サッカロミセス'バヤヌス検 出用 LAMP法プライマーセットに増幅反応が認められな力つた場合には、試料中に サッカロミセス ·パストリアヌスが存在すると判断することができる。
[0120] 従って、本発明によれば、本発明による第一の態様の LAMP法プライマーセットと 、サッカロミセス'バヤヌスの検出に用いられる LAMP法プライマーセットとを組み合 わせて含んでなる、サッカロミセス'パストリアヌスの検出用キットが提供される。
[0121] 本発明によればまた、本発明による第一の態様のサッカロミセス'パストリアヌスの検 出方法において、サッカロミセス'バヤヌスの検出に用いられる LAMP法プライマー セットを用いて LAMP法により核酸増幅反応を実施する工程を更に含んでいてもよ い。この工程は、核酸試料に対して LAMP法による核酸増幅反応を実施する工程と 、核酸増幅産物の有無を検出する工程と有していてもよい。 [0122] 上記において、サッカロミセス'バヤヌスの検出に用いられる LAMP法プライマーセ ットは、好ましくは、本発明による第三の態様の LAMP法プライマーセットである。
[0123] 本発明による第一の態様の LAMP法プライマーセットを用いてサッカロミセス'パス トリアヌスを正確に検出した場合には、また、本発明による第一の態様の LAMP法プ ライマーセットを、サッカロミセス 'セレビシェおよびサッカロミセス'パストリアヌスを検 出できる LAMP法プライマーセットと組み合わせて使用することが好ま U、。本発明 による第一の態様のサッカロミセス'パストリアヌス用 LAMP法プライマーは、ゲノム構 造が均一でな!、サッカロミセス ·バヤヌスと交差反応することがある。サッカロミセス ·セ レビシェおよびサッカロミセス'パストリアヌス検出用 LAMP法プライマーセットは、サ ッカロミセス ·パストリアヌスに含まれるサッカロミセス ·セレピシェのゲノム配列と反応 するが、サッカロミセス'バヤヌスはこのサッカロミセス'セレピシェのゲノム配列を持た ないため、サッカロミセス'セレピシェおよびサッカロミセス'パストリアヌス検出用 LA MP法プライマーセットはサッカロミセス'バヤヌスとは反応しない。この場合、本発明 によるサッカロミセス'パストリアヌス検出用 LAMP法プライマーセットと、サッカロミセ ス ·セレビシェおよびサッカロミセス'パストリアヌス検出用 LAMP法プライマーセットと の両方で増幅反応が認められた場合には、試料中にサッカロミセス ·パストリアヌスが 存在すると判断することができる。本発明によるサッカロミセス'パストリアヌス検出用 L AMP法プライマーで増幅反応が起こり、サッカロミセス'セレピシェおよびサッカロミ セス 'パストリアヌス検出用 LAMP法プライマーセットで増幅反応が認められない場 合には、試料中にサッカロミセス'バヤヌスが存在すると判断することができる。
[0124] 従って、本発明によれば、本発明による第一の態様の LAMP法プライマーセットと 、サッカロミセス ·セレピシェおよびサッカロミセス ·パストリアヌスの検出に用いられる L AMP法プライマーセットとを組み合わせて含んでなる、サッカロミセス ·パストリアヌス の検出用キットが提供される。
[0125] 本発明によればまた、本発明による第一の態様のサッカロミセス'パストリアヌスの検 出方法において、サッカロミセス'セレピシェおよびサッカロミセス'パストリアヌスの検 出に用いられる LAMP法プライマーセットを用いて LAMP法により核酸増幅反応を 実施する工程を更に含んでいてもよい。この工程は、核酸試料に対して LAMP法に よる核酸増幅反応を実施する工程と、核酸増幅産物の有無を検出する工程と有して いてもよい。
[0126] 上記において、サッカロミセス'セレピシェおよびサッカロミセス'パストリアヌスの検 出に用いられる LAMP法プライマーセットは、好ましくは、下記ポリヌクレオチドを含 んでなる LAMP法プライマーセットである。
配列番号 18の塩基配列で表されるポリヌクレオチド (FIP)またはその塩基配列の相 補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダィズする少なくとも 10塩基のポリヌクレ ォチド；
配列番号 19の塩基配列で表されるポリヌクレオチド (F3)またはその塩基配列の相 補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダィズする少なくとも 10塩基のポリヌクレ ォチド；
配列番号 20の塩基配列で表されるポリヌクレオチド (BIP)またはその塩基配列の相 補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダィズする少なくとも 10塩基のポリヌクレ ォチド；および
配列番号 21の塩基配列で表されるポリヌクレオチド (B3)またはその塩基配列の相 補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダィズする少なくとも 10塩基のポリヌクレ ォチド。
[0127] 上記のサッカロミセス'セレピシェおよびサッカロミセス'パストリアヌスの検出用 LA MP法プライマーセットは、ループプライマーとして、配列番号 22の塩基配列で表さ れるポリヌクレオチド (LB)またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチ ドにハイブリダィズする少なくとも 10塩基のポリヌクレオチドを更に含んでいてもよい。
[0128] 本発明による検出方法のうち PCR法による検出方法の具体的な態様としては、核 酸試料に対して PCR法による核酸増幅反応を実施した後、核酸増幅産物の有無を 検出する工程を含む検出方法が挙げられる。
[0129] より具体的には、
(g)本発明による第一の態様、第三の態様、または第四の態様の PCR法プライマー セットを用いて、試料中の核酸について PCR法により核酸増幅反応を実施する工程 ；および (h)増幅産物の有無を検出する工程
を含んでなり、増幅産物の生成がサッカロミセス ·パストリアヌスの存在を示す、サッカ 口ミセス'パストリアヌスの検出方法が提供される。
[0130] PCR法による核酸増幅工程に供される試料は、試料中の菌体を培養してから核酸 を抽出しても、培養せずに核酸を抽出してもよい。菌体の培養や核酸の抽出など核 酸試料の調製につ!、ては後述する。
[0131] PCR法による核酸増幅工程では、試料中の核酸に対して増幅反応が実施される。
PCR法による核酸増幅反応は周知であり、当業者であれば PCR法およびその改変 方法の実施条件等を適宜設定し、 PCR法を実施することができる。
[0132] 本発明による検出方法のうちプローブによる検出方法の具体的な態様としては、核 酸試料に対する本発明によるプローブのハイブリダィゼーシヨンを実施した後、核酸 複合体の有無を検出する工程を含む検出方法が挙げられる。
[0133] より具体的には、
(i)本発明による第一の態様のプローブと、試料中の核酸とを接触させる工程；およ び
(j)ハイブリダィゼーシヨン複合体の有無を検出する工程
を含んでなり、ハイブリダィゼーシヨン複合体の生成がサッカロミセス'パストリアヌスの 存在を示す、サッカロミセス'パストリアヌスの検出方法が提供される。
[0134] プローブを用いた検出法においては、プローブを標識して用いることができる。標 識としては、例えば、放射性元素 (例えば、 32Pおよび14 C)、蛍光化合物 (例えば、 FI TC)、酵素反応に関与する分子 (例えば、ペルォキシダーゼ、アルカリフォスファタ一 ゼ）が挙げられる。
[0135] ハイブリダィゼーシヨン複合体の検出は、ノーザンハイブリダィゼーシヨン、サザンハ イブリダィゼーシヨン、コロニーハイブリダィゼーシヨン等の周知の方法を用いて実施 できる。
[0136] 本発明によるプライマーセットを用いて核酸増幅反応を実施すると、酒類や清涼飲 料の品質低下の原因となるサッカロミセス属酵母を菌種レベルで正確に識別すること ができる。従って、本発明によるプライマーセットおよびキットは、酒類 (例えば、ビー ル、発泡酒、ワイン、果実酒、 日本酒）および Zまたは清涼飲料 (例えば、果汁飲料） の品質管理や、環境試料 (例えば、原料用水)の検査に用いることができる。
[0137] サッカロミセス'パストリアヌス、サッカロミセス'セレピシェ、およびサッカロミセス'バ ャヌスは、ビールおよび発泡酒の製造工程あるいは最終製品に、品質劣化の原因酵 母種として見いだされることがある。従って、第一の態様の LAMP法プライマーセット および PCR法プライマーセット；第二の態様の LAMP法プライマーセット；第三の態 様の LAMP法プライマーセットおよび PCR法プライマーセット；第四の態様の PCR法 プライマーセット；並びにこれらの一部または全部の組み合わせは、好ましくは、ビー ルおよび発泡酒の品質管理に用いることができる。
[0138] サッカロミセス'セレピシェおよびサッカロミセス'バヤヌスは、ワインの製造工程ある いは最終製品に、品質劣化の原因酵母種として見いだされることがある。従って、第 二の態様の LAMP法プライマーセット；第三の態様の LAMP法プライマーセット；お よびこれらの組み合わせは、好ましくは、ワインの品質管理に用いることができる。
[0139] サッカロミセス'セレピシェおよびサッカロミセス'バヤヌスは、清涼飲料 (特に、果汁 飲料)の製造工程ある!、は最終製品に、品質劣化の原因酵母種として見!、だされる ことがある。従って、第二の態様の LAMP法プライマーセット；第三の態様の LAMP 法プライマーセット；およびこれらの組み合わせは、好ましくは、清涼飲料 (特に、果 汁飲料)の品質管理に用いることができる。
[0140] LAMP法による核？^ jfe ]^
本発明による LAMP法プライマーセットは、 LAMP法による核酸増幅反応のプライ マーとして用いることができる。本発明によるプライマーセットはまた、 LAMP法のみ ならず、 LAMP法を改良した核酸増幅反応のプライマーとしても用いることができる。 LAMP法の原理およびそれを利用した核酸増幅方法は周知であり、 LAMP法によ る核酸増幅反応の実施に当たっては、例えば、 WO00Z28082号公報や Notomi T. et al.， Nucleic Acids Research, 28(12),e63(2000)の開示を参照することができる。
[0141] LAMP法による核酸増幅反応は、市販の LAMP法遺伝子増幅試薬キットに従つ て実施することができる力 例えば、サンプルの DNA、プライマー溶液、および巿販 の LAMP法遺伝子増幅試薬キット（例えば、栄研化学社製 Loopamp DNA増幅キッ ト)で提供される試薬を、キットに添付されて ヽる説明書に従って混合して一定温度（
60〜65°C)に保ち、一定時間（標準で 1時間）反応させることにより実施できる。
[0142] LAMP法による核酸増幅反応は、以下のような工程を経て実施することができる。
(i)鎖置換型 DNAポリメラーゼの働きにより、 FIPの F2領域の 3'末端を起点として铸 型 DNAと相補的な DNA鎖が合成される。
(ii) FIPの外側に、 F3プライマーがァニールし、その 3，末端を起点として鎖置換型 D NAポリメラーゼの働きによって、先に合成されている FIPからの DNA鎖を剥がしな 力 DNA合成が伸長する。
(iii) F3プライマーカゝら合成された DNA鎖と铸型 DNAが二本鎖となる。
(iv) FIP力 先に合成された DNA鎖は、 F3プライマーからの DNA鎖によって剥がさ れて一本鎖 DNAとなる力 この DNA鎖は、 5 '末端側に相補的な領域 Flc、 F1をも ち、自己ァニールを起こし、ループを形成する。
(V)上記（iv)の過程でループを形成した DNA鎖に対し、 BIPがァニールし、この BIP の 3'末端を起点として相補的な DNAが合成される。この過程でループが剥がされて 伸びる。さらに、 BIPの外側に B3プライマーがァニールし、その 3'末端を起点として 鎖置換型 DNAポリメラーゼの働きによって、先に合成された BIPからの DNA鎖を剥 力 Sしながら DNA合成が伸長する。
(vi)上記 (V)の過程で二本鎖 DNAが形成される。
(vii)上記 (V)の過程で剥がされた BIPから合成された DNA鎖は両端に相補的な配 列を持っため、自己ァニールし、ループを形成してダンベル様の構造となる。
(viii)上記ダンベル構造の DNA鎖を起点として、 FIP次!、で BIPのァ- リングを介 して所望 DNAの増幅サイクルが行われる。
[0143] LAMP法による核酸増幅反応は、上記の工程を適宜改変して実施できることは当 業者に自明であろう。本発明によるプライマーセットはそのような改変された方法にも 用!/、ることができる。
[0144] 本発明による LAMP法プライマーセットは、約 60〜約 65°C (例えば 65°C)におい てアニーリングと同時に DNA鎖の合成も起こす。アニーリング反応および DNA鎖合 成により約 1時間反応を行うことにより 109〜101G倍に核酸を増幅させることができる。 [0145] 本発明による LAMP法プライマーセットを LAMP法による核酸増幅反応の条件の 下で試料核酸と反応させると、検出対象の菌株のターゲット領域が増幅される。この ような増幅反応が起こると、副産物として形成されるピロリン酸マグネシウムの影響で 反応液が白濁するため、この濁度に基づき増幅の有無が目視により判定できる。増 幅の有無は、濁度測定装置を用いて濁度を光学的に測定してもよぐまた、ァガロー スゲル電気泳動法などを利用して DNA断片の有無を確認し検出してもよい。
[0146] 核酸増幅が観察されるならば、標的塩基配列が存在することを意味し、プライマー セットの検出対象である菌種陽性（+ )を表す。逆に、核酸増幅が観察されない場合 には、標的塩基配列が不存在であることを意味し、プライマーセットの検出対象であ る菌種陰性（-)を表す。
[0147] PCR法による^^ jfe ]^
本発明による PCR法プライマーセットは、 PCR法、 RT—PCR法、リアルタイム PCR 法、 in situ PCR等の核酸増幅法を利用して、サッカロミセス属酵母の識別に用い ることがでさる。
[0148] 核酸増幅物が観察されるならば、標的塩基配列が存在することを意味し、プライマ 一セットの検出対象である菌種陽性（+ )を表す。逆に、核酸増幅が観察されない場 合には、標的塩基配列が不存在であることを意味し、プライマーセットの検出対象で ある菌種陰性（-)を表す。
[0149] PCR法では、ァガロースゲル電気泳動など周知の方法に従って核酸増幅物を検 出することができる。また、リアルタイム PCR法では、インターカレーターや蛍光標識 プローブを使用し、サーマルサイクラ一と分光蛍光光度計とが一体化された装置に おいて、核酸増幅物を経時的に検出することができる。
[0150] 枪出対象試料 その調製
本発明によるプライマーセットおよびキットの検出の対象となる試料としては、ビー ル、発泡酒、ワインなどの酒類;サイダー、ラムネ、炭酸水などの清涼飲料;原料用に 採取された水等の環境試料;酒類や清涼飲料等の製造工程カゝら採取された半製品 などが挙げられる。
[0151] これらを LAMP法や PCR法の試料として用いる場合には、試料中に存在する菌の 濃縮、分離、および培養、菌体からの核酸分離、核酸の濃縮などの操作を前処理と して実施してもよい。試料中に存在する菌の濃縮や分離の方法としては、ろ過、遠心 分離などが挙げられ、適宜選択できる。また試料から濃縮、分離した菌を、さらに培 養して菌数を増やしてもよい。培養には、対象とする酵母株の増殖に適切な寒天固 体培地や液体培地を用いることができ、また対象とする酵母菌株を選択するために 硫酸銅などの薬剤を添加してもよい。飲料試料や環境試料などに存在する菌体、あ るいは培養した菌体力 核酸を遊離させるためには、例えば、市販のキットを使用す る方法や、アルカリ溶液などによって菌体を処理し、 100°Cでの加熱により菌体から 核酸を遊離させる方法を選択することができる。また、核酸を更に精製する必要があ れば、フエノール Zクロ口ホルム処理、エタノール沈殿や遠心等により核酸の精製を 行 、、最終的に TE緩衝液などに再溶解させ铸型 DNAとして試験に供してもょ ヽ（E uropean Brewery Convention:ANALYTICA - MICROBIOLOGICA - EBC, 2nd ed. 2005 Fachverlag Hans Carl, Nuernberg、 Rolfsら： PCR - Clinical diagnostics and rese arch, Springer- Verlag, Berlin, 1992、大嶋泰治ら：蛋白 核酸 酵素， vol. 35, 2523- 2541, 1990)。
[0152] 本発明によるプライマーセットおよびキットを用いたサッカロミセス属酵母の検出は、 例えば、以下のように実施することができる。
[0153] まず、試料中に存在すると考えられるサッカロミセス属酵母を適切な培地で増菌培 養する。次いで、寒天培地上に形成されたコロニーから DNAを分離し、この DNAに 対して本発明によるプライマーセットを用いた LAMP法または PCR法を実施し、サッ カロミセス属酵母の特定遺伝子領域を増幅する。遺伝子増幅産物の存在は、プライ マーセットが標的とする菌種の存在を示す。
実施例
[0154] 以下、実施例に基づいて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例 に限定されるものではない。
[0155] ¾施例 ί：サッカロミセス の檢
(a)ゲノム DNA抽出法
寒天平板培地上で培養した菌体をかき取り、滅菌蒸留水に懸濁した。この懸濁液 を遠心分離 (15000rpm、 5分間)し、上澄みを捨てた。沈殿した菌体に再度滅菌蒸 留水を添加、懸濁し、遠心分離した。上澄みを捨て、得られた菌体に PrepMan Ult ra (アプライドバイオシステムズ社製）の溶液 100 1を添カ卩し、 95°C、 10分間加熱し た。その後、 15000rpm、 1分間遠心分離し、上澄みをゲノム DNA溶液として使用し た。あるいは洗浄した菌体に 0. IN NaOH溶液を 100 1添カ卩し、 95°C、 10分間加 熱した。その後、 1M Tris緩衝液 (pH7. 0)を用いて中和し、上澄みをゲノム DNA 溶液として使用した。
(b) LAMP用プライマー
以下のサッカロミセス属酵母各菌種用プライマーを、富士通システムソリューション ズ社の eGenome Order (http://genome.e-mp.jp/index.html)、あるいはそれと同等の 方法で化学合成し、 TE緩衝液 (pH8. 0)で 100 Mの濃度になるように溶解した。 これらの溶液を、 FIP、 BIPプライマー： 16 M、 F3、 B3プライマー： 2 M、 LF、 LB プライマー： 8 μ Μとなるように混合し、希釈した。
[下面発酵酵母検出用プライマーセット (LGM1LB1) ]
TGCC (配列番号 1)
F3 : TCACCATCGACATGCTGTC (配列番号 2) 号 3)
Β3 : CCATAGGAAATCACCGTACTTCG (配列番号 4)
LB : ATGTTTATAAGCCAGATGGATG (配列番号 5)
[サッカロミセス.セレピシェ検出用プライマーセット（SCM1LF2LB1) ]
(配列番号 7)
F3 : TGACAAGTACGATTATCTGGCC (配列番号 8)
GCTCGAACG (配列番号 9) Β3 : GTTGTATGGTACATTGTTTGCATCT (配列 番号 10) LF: CACTTATATGTAGCTCTTTGTAGGC (配列番号 11)
LB : AAAAATAAATCCATTGATCAATTGG (配列番号 12)
[サッカロミセス.バヤヌス検出用プライマーセット（SBR2LB1) ]
TCGCC (配列番号 13)
F3 : CCAGGCTCATAAAGGAAGCAA (配列番号 14) 番号 15)
B3 : CTGCATCTGTTAAATCTTCATTTGG (配列番号 16)
LB : CAAATGGAGGAGGGGCAA (配列番号 17)
[サッカロミセス.セレピシェおよびサッカロミセス.パストリアヌス検出用プライマーセッ ト（SCC1LB1) ] 配列番号 18)
F3 : ACGAAGATGAGAAAGAGGCG (配列番号 19) 号 20)
B3 : GTGCTGTATGCTCGTTTTCG (配列番号 21)
LB : GAGCAAGGGGACGAAGGTGA (配列番号 22)
[0157] (c) LAMP増幅反応溶液調製
LAMP法のための遺伝子増幅試薬キットとして、栄研化学社製 Loopamp DNA 増幅キットを使用した。反応用チューブに、ゲノム DNA溶液： 2. 5 1、プライマー溶 液： 2. 5 1、 2倍濃度反応用緩衝液： 12. 5 1、 Bst DNAポリメラーゼ： 1 μ 1、滅菌 水： 6. 5 1を添加し、全量 25 μ 1の反応液を調製した。
[0158] (d) LAMP反応
LAMP反応には、テラメッタス社製リアルタイム濁度計 LA— 200、あるいは栄研ィ匕 学社製 LA— 320Cを使用した。反応チューブをセットし、 65°C—定 (ボンネットは 75
°C)で反応させ、その間の濁度変化を 6秒毎に計測した。濁度が上昇するものを陽性 、濁度の上昇が認められないものを陰性とした。
[0159] (e)各菌種用プライマーの特異性評価
下面発酵酵母、サッカロミセス'セレピシェ、サッカロミセス'バヤヌスに対して作成し たそれぞれの菌種特異的なプライマーにっ ヽて Saccharomvces sensu strictoの各菌 種を含むサッカロミセス属酵母標準株を使って LAMP法で特異性を評価した。その 結果、 LGM1LB1を用いた場合はサッカロミセス'パストリアヌス（下面発酵酵母）に、 SCM1LF2LB1を用いた場合はサッカロミセス'セレピシェとサッカロミセス'セレビシ ェ 'アイフスタアイカス (Saccharomvces cerevisiae var. diastaticus)に、 SBR2LB1を 用いた場合はサッカロミセス'バヤヌスに、 SCC1LB1を用いた場合にサッカロミセス' セレピシェとサッカロミセス'パストリアヌス（下面発酵酵母）に、反応開始 60分以内に DNA増幅に伴う濁度の上昇が見られた (表 1)。また、プライマーが検出対象にして いる菌株と反応させた場合に、反応開始力 60分以内に増幅が起こり、反応チュー ブ内の濁度が上昇した（図 1)。
[0160] 表 ί :各糠サッカロミセス属酵揚標準株 使ったプライマーの評価 (マス内の数字:増 が走 3こるまでの ]^き間、 一： ]^ 80 > [^に なし、 nt : not tested) [表 1]
各種サッカロミセス属酵母標準株 LGM1LB1 SCM1LF2LB1 SBR2LB1 SCC1LB1
S. cerevisiae NBRC10217 一 40分 - 20分
S. bayanus NBRC11022 一 一 30分 一
S. bayanus NBRC1 48 一 一 40分 一
S. bayanus NBRC0615 一 一 40分 一
S. bayanus NBRC10563 - 一 40分 -
S. pastor i anus NBRC11024 40分 一 ― 20分
S. pastor i anus NBRC11023 40分 一 一 30分
S. pastor i anus NBRC10610 40分 一 一 30分
S. diastaticus DSM70487 ― 40分 一 20分
S. paradoxus NBRC10609 一 一 一 一
S. paradoxus NBRC0259 一 一 一 一
S, paradoxus NBRC10695 - - 一 一
S, cariocanus NBRC10947 一 一 一 一
S. mikatae NBRC1815 一 一 - -
S, kudriavzevii NBRC1802 - - 一 一
S. exiguus NBRC1128 一 一 一 一
S. servazzi i NBRC1838 一 ― 一 一
S, unisporus NBRC0316 一 ― 一 一
S. dairenensis NBRC0211 ― 一 - 一
S. kluyveri NBRC1685 一 一 一 一
[0161] さらに、 LGM1LB1、 SCM1LF2LB1、 SBR2LB1について各種酵母標準株、ビ ール醸造用酵母、ビール工場分離野生酵母、ワイン分離野生酵母株を使用して各 プライマーの特異性を評価したところ、各プライマーが検査対象にして 、る株以外か らはほとんど増幅が見られな力つた (表 2、表 3、および表 4)。
[0162] 表 2:各糠酵¾標準株 つ プライマーの評 (マス内の数字:増幅が走 B-るまで の ]^時間、 一 ： ^ 80分以内に増幅かし
[表 2] 各種酵母標準株 LGM1LB1 SCM1LF2LB1 SBR2LB1 SCC1LB1
Pichia anoma 1 a NBRC0127 一 一 一 一 i II iopsis saturnus N8RC0941 - 一 一 一
Kluyveromyces I act is NBRC1090 - 一 一 一
Candida uti I is NBRC0988 一 ― 一 一
C. boidjnii ATCC48180 一 - 一 一
Zygosaccharomyces ba i I i i NBRC1137 一 一 - 一
Dekkera anoma I a DSM70727 一 一 一 一
D. bruxel I ens is DSM70001 ― 一 - -
D. bruxel I ens is ATCC64276 ― - - 一
D. ousters i ana DS 70736 一 一 ― -
Brettanomyces naardenensis隱 CI 588 一 一 ― 一 表 3：各糠ビール醸诰用酵傲、ビール醸诰所 離野牛酵傲株 体ったプライマーの 評価 (マス内の数字:增幅が こるまでの 時間、 - : 80分以内に増幅なし) [表 3]
Figure imgf000038_0001
表 4：各糠ワイン分離野牛酵揚株を使ったプライマーの評価 (マス内の数字；増幅が こるまでの 時間、 ： 80分以内に増幅な 1
關 ワイン野生酵母 LGM1LB1 SCM1LF2LB1 SBR2LB1 SCC1LB1
乙 bailii WLY9 一 一 一 一
S. cerevisiae WLY10 - 40分 一 20分
P. membranifaciens WLY13 一 一 一 一
Lodderomyces elongisporus WLY14 一 一 一 一
Aureobasidium pul lulans WLY15 一 一 一 一
Rhodospor idium f luviale WLY16 ― - 一 -
P. anomala WLY17 一 一 一 一
P. gui 11 iermondi i WLY18 一 - 一 一
[0165] 以上により、サッカロミセス属酵母各菌種に対して作成した本発明によるプライマー セットは、検査対象とするサッカロミセス属酵母を菌種レベルで正確に検出できること が示された。従来の報告では共通プライマーを用いて酵母力 遺伝子断片を増幅し 、その後塩基配列の違 V、を制限酵素切断パターンや DGGE等で解析することが多 かったが、本発明によるプライマーを用いれば、遺伝子増幅の有無を確認するだけ でこれら 3種のサッカロミセス属酵母が同定 '検出できる。
[0166] 実施例 2:LAMP法の枪出限界
LAMP法の増幅効率を検討するために、寒天平板培地で培養した下面発酵酵母 (BFY70、サッカロミセス'パストリアヌス）、サッカロミセス'セレビシェ NBRC10217、 サッカ口ミセス 'バヤヌス NBRC 1948の菌体を滅菌水で段階的に希釈して上記した 方法で DNA抽出し、これを LAMP法に供した。その結果、 LAMP法では 102〜103 cfuレベルの少ない菌体量からも増幅が観察された。
また、菌体の各段階の希釈液力も抽出したゲノム DNAを使ったときに LAMP反応 で濁度が 0.1を越えた時間を検出時間として、各プライマーの検出時間とコロニー形 成数の対数をグラフにしたところ、累乗近似により高い相関係数の近似曲線を描くこ とが出来た (R2=0.98-0.99)。 LGM1LB1について得られた近似曲線は図 2に 示される通りである。また、各プライマーの検出限界と検量線の相関係数との関係は 下記に示される通りである。これを検量線とすることにより、 102〜107cfuあるいは 103 〜107cfuの範囲で、サンプル中のサッカロミセス属酵母の存在を定量的にある程度 推測することが可能であることが示された。
[各プライマーの検出限界と検量線の相関係数] 檢出限界 檢量線沂似式 麟線相匪 )
LGM1LB1 5.2 x 102 cfo y = 28179χ— 2·4。39 0.992
SCM1LF2LB1 4.4 x 103 cfo y = 6875x— 1 8959 0.981
SBR2LB1 1.9 x 102 cfo y = 1431.3x— 1 8361 0.982
[0167] 実施例 3：ワインおよびビールからの検出
ワイン製造では、通常、果汁にワイン酵母であるサッカロミセス属酵母を多量に添加 して発酵させるが、外部から汚染する酵母の菌数はサッカロミセス属酵母に比べると 圧倒的に少ない。そこでワインに多量のサッカロミセス'セレピシェを懸濁し、そこへヮ インで希釈して作成したサッカロミセス ·バヤヌス NBRC 1948の菌体希釈液を混合し て集菌洗浄後、まとめて DNA抽出し、プライマーセットとして SBR2LB1を使用して L AMP法を実施し、サッカロミセス'バヤヌスが検出可能カゝどうか検討した。その結果、 ワインによる反応阻害およびサッカロミセス'セレピシェの存在に関係なぐ滅菌水に 懸濁した場合とほとんど同じ検出限界でサッカロミセス ·バヤヌスが検出出来ることが わかった。また、ビールに下面発酵酵母を懸濁して、サッカロミセス'バヤヌスの菌体 希釈液を混合した場合でも同じ結果が得られた。
サッカロミセス'バヤヌスの枪出限界
ワイン +サッカロミセス'セレピシェ（5 X 107 cells) 3.9 x 102 cfo
ビール +下面発酵酵母（1 X 107 cells) 3.2 x 102 cfo
[0168] u：特許文献にあるプライマーの評価
(a)特許文献のプライマー
土屋らの特許文献 (WO2005Z093059号公報）に記載されて ヽた以下のサッカ 口ミセス属検出用プライマーセット (SSC1LB1)および下面発酵酵母検出用プライマ 一セット（SBFY1LF1LB1)を、実施例 1 (b)と同様に LAMP法用プライマー溶液を 調製した。サッカロミセス属検出用プライマーセット（SSC1LB1)は rRNA遺伝子の D2領域を、下面発酵酵母検出用プライマーセット（SBFY1LF1LB1)はメリビアー ゼ遺伝子を標的としている。
[サッカロミセス属検出用プライマーセット（SSC1LB1) ] F3 : AGACCGATAGCGAACAAGTA (配列番号 32) 号 33)
B3： CTTGGTCCGTGTTTCAAGAC (配列番号 34)
LB : CAAGGATGCTGGCATAATGGTT (配列番号 35)
[下面発酵酵母検出用プライマーセット (SBFY1LF1LB1) ] 号 36)
F3： CCGAGTTACAATGGCCTTGG (配列番号 37) 号 38)
B3 : CCTTGTCTGCAACGAGTGT (配列番号 39)
LF: GGCAAATGTGTTCCAATTGTC (配列番号 40)
LB： GGACTAAAGGATTTGGGTTACAC (配列番号 41)
[0169] 実施例 1 (c)および (d)の記載に従って、上記プライマーセットを用いて、 LAMP法 により各種菌株の検出を行った。結果は図 3および図 4に示される通りであった。
[0170] (b)プライマーの評価
その結果、 SSC1LB1は試験したサッカロミセス属酵母のほとんどの菌種と反応し、 サッカロミセス属酵母の中での識別は出来ないことが分力つた。また、 SBFY1LF1L B1は下面発酵酵母以外にサッカロミセス ·バヤヌスと反応した。 SBFY1LF1LB1は 下面発酵酵母のメリビアーゼ遺伝子から設計されているが、設計に使用された領域 はサッカロミセス.バヤヌスのゲノム中にも 96%相同性がある塩基配列が存在してい たため、交差反応したと考えられた。
[0171] 実施例 3： Sc型- Lg¾ ^色体 を刺用した PCR法プライマーの評価
上述したように、下面発酵酵母の Sc型の XVI番染色体は、右腕の GPH1の ORF 内力 QCR2の ORF内の範囲で Lg型染色体と転座を起こして 、た。下面発酵酵母 の Lg型の III番染色体は、右腕の MAT座から右腕末端まで Sc型染色体と転座を起 こしていた。また、下面発酵酵母の Lg型の VII番染色体は、左腕の KEM1遺伝子 O RF内から左腕末端まで Sc型染色体と転座を起こして ヽた。これらの下面発酵酵母 の III番染色体、 VII番染色体、 XVI番染色体の染色体転座位置を挟み込む形で、 S c型染色体側の塩基配列、および Lg型染色体側の塩基配列力 PCR法用プライマ 一を設計し、各種サッカロミセス属酵母で評価した。
[0172] PCR法にはタカラバイオ社製 Ex Taqを用いた。 PCRに用いた各プライマーの塩 基配列は次の通りである。
[III番染色体転座領域用プライマーセット（増幅産物:約 3. 2kb) ]
Illjuncl (Lg型側）： TGTTGGGGTGTACTATGGTCTTT (配列番号 23)
IIIjunc2 (Sc型側）： ACAAAGAATGATGCTAAGAATTGA (配列番号 24)
[VII番染色体転座領域用プライマーセット (増幅産物:約 350bp) ]
VIISL1 (Lg型側）： CGACTCAAACTGTATTACTCC (配列番号 25)
VIISL2 (Sc型側）： AATTTTGATGTTCAAGCG (配列番号 26)
[XVI番染色体転座領域用プライマーセット（増幅産物： XVISL1— 2約 720bp、 XV
ISL3— 4約 630bp) ]
XVISL1 (Lg型側）： CGACAGAGTTGACCAGTTTG (配列番号 27)
XVISL2 (Sc型側）： GTTCTTCTTGCAAGATGTGG (配列番号 28)
XVISL3 (Lg型側）： CCTTGGCAGATGTGTTGTAT (配列番号 29)
XVISL4 (Sc型側）： CTTGCCCTTCTTCAAATCCG (配列番号 30)
[0173] これらの試薬をタカラバイオ社製 Ex Taqの説明書に従って混合し (全量 15 1)、 サーマルサイクラ一にセットして 94°C · 30秒、 55°C · 30秒、 72°C · 1分（ΠΙ番染色体 転座領域用プライマーセットの場合は、 72°Cを 2分とした)の温度プログラムを 30回 繰り返して PCR反応を実施した。その結果、各 PCRプライマーセットを下面発酵酵母 に使用した際に予想された分子量のバンドが出現した。増幅産物の有無は表 5に示 される通りである。
[0174] 表 5 :各糠サッカロミセス属酵傲株を使ったプライマーの評価（+：增幅あり、—：增幅
[表 5] llljund - 2 VIISL1-2 XVISL1-2 X ISL3-4 下面発酵酵母 BFY70 + + + + 下面発酵酵母 BFY84 + + + + 下面発酵酵母 BFY85 + + + + 下面発酵酵母 W34/70 + + + + 下面発酵酵母 BFY427 + + + + 下面発酵酵母 BFY253 + + + +
S. cerevisiae S288C 一 一 一 一
S. bayanus NBRC11022 - ― 一 一

Claims

請求の範囲
[1] 配列番号 6の塩基配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダィズする少なくとも 1 0塩基のポリヌクレオチド、または配列番号 6の塩基配列の相補配列で表されるポリヌ クレオチドにハイブリダィズする少なくとも 10塩基のポリヌクレオチド力もなる、サッカ 口ミセス'パストリアヌス (Saccharomvces Dastorianus)枪出用プローブまたはプライマ
[2] 請求項 1に記載の二種以上のプライマーカもなる、サッカロミセス'パストリアヌス ( ccharomvces Dastorianus；板出用 LAMP法プフィマーセット。
[3] 下記ポリヌクレオチドを含んでなる、請求項 2に記載の LAMP法プライマーセット： 配列番号 1の塩基配列で表されるポリヌクレオチド (FIP)またはその塩基配列の相補 配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダィズする少なくとも 10塩基のポリヌクレオ チド；
配列番号 2の塩基配列で表されるポリヌクレオチド (F3)またはその塩基配列の相補 配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダィズする少なくとも 10塩基のポリヌクレオ チド；
配列番号 3の塩基配列で表されるポリヌクレオチド (BIP)またはその塩基配列の相補 配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダィズする少なくとも 10塩基のポリヌクレオ チド;および
配列番号 4の塩基配列で表されるポリヌクレオチド (B3)またはその塩基配列の相補 配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダィズする少なくとも 10塩基のポリヌクレオ チド。
[4] 配列番号 5の塩基配列で表されるポリヌクレオチド (LB)またはその塩基配列の相 補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダィズする少なくとも 10塩基のポリヌクレ ォチドを更に含んでなる、請求項 3に記載の LAMP法プライマーセット。
[5] 請求項 1に記載の二種以上のプライマーカもなる、サッカロミセス'パストリアヌス ( ccharomvces Dastorianus；板出用 PCR法プフィマーセット。
[6] 下記ポリヌクレオチドを含んでなる、サッカロミセス ·セレビシェ (Saccharomvces cere visiae.)の検出に用いられる LAMP法プライマーセット： 配列番号 7の塩基配列で表されるポリヌクレオチド (FIP)またはその塩基配列の相補 配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダィズする少なくとも 10塩基のポリヌクレオ チド；
配列番号 8の塩基配列で表されるポリヌクレオチド (F3)またはその塩基配列の相補 配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダィズする少なくとも 10塩基のポリヌクレオ チド；
配列番号 9の塩基配列で表されるポリヌクレオチド (BIP)またはその塩基配列の相補 配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダィズする少なくとも 10塩基のポリヌクレオ チド;および
配列番号 10の塩基配列で表されるポリヌクレオチド (B3)またはその塩基配列の相 補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダィズする少なくとも 10塩基のポリヌクレ ォチド。
[7] 下記ポリヌクレオチドのいずれか一方あるいは両方を更に含んでなる、請求項 6に 記載の LAMP法プライマーセット：
配列番号 11の塩基配列で表されるポリヌクレオチド (LF)またはその塩基配列の相 補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダィズする少なくとも 10塩基のポリヌクレ ォチド；および
配列番号 12の塩基配列で表されるポリヌクレオチド (LB)またはその塩基配列の相 補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダィズする少なくとも 10塩基のポリヌクレ ォチド。
[8] 下記ポリヌクレオチドを含んでなる、サッカロミセス'バヤヌス (Saccharomvces bavanu の検出に用いられる LAMP法プライマーセット：
配列番号 13の塩基配列で表されるポリヌクレオチド (FIP)またはその塩基配列の相 補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダィズする少なくとも 10塩基のポリヌクレ ォチド；
配列番号 14の塩基配列で表されるポリヌクレオチド (F3)またはその塩基配列の相 補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダィズする少なくとも 10塩基のポリヌクレ ォチド； 配列番号 15の塩基配列で表されるポリヌクレオチド (BIP)またはその塩基配列の相 補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダィズする少なくとも 10塩基のポリヌクレ ォチド；および
配列番号 16の塩基配列で表されるポリヌクレオチド (B3)またはその塩基配列の相 補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダィズする少なくとも 10塩基のポリヌクレ ォチド。
[9] 配列番号 17の塩基配列で表されるポリヌクレオチド (LB)またはその塩基配列の相 補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダィズする少なくとも 10塩基のポリヌクレ ォチドを更に含んでなる、請求項 8に記載のプライマーセット。
[10] 下記ポリヌクレオチドを含んでなる、サッカロミセス ·パストリアヌス（Saccharomvces D astorianus)の枪出に用いられる PCR法プライマーセット：
配列番号 23の塩基配列で表されるポリヌクレオチドまたはその塩基配列の相補配列 で表されるポリヌクレオチドにハイブリダィズする少なくとも 10塩基のポリヌクレオチド; および
配列番号 24の塩基配列で表されるポリヌクレオチドまたはその塩基配列の相補配列 で表されるポリヌクレオチドにハイブリダィズする少なくとも 10塩基のポリヌクレオチド
[11] 下記ポリヌクレオチドを含んでなる、サッカロミセス ·パストリアヌス（Saccharomvces D astorianus)の枪出に用いられる PCR法プライマーセット：
配列番号 25の塩基配列で表されるポリヌクレオチドまたはその塩基配列の相補配列 で表されるポリヌクレオチドにハイブリダィズする少なくとも 10塩基のポリヌクレオチド; および
配列番号 26の塩基配列で表されるポリヌクレオチドまたはその塩基配列の相補配列 で表されるポリヌクレオチドにハイブリダィズする少なくとも 10塩基のポリヌクレオチド
[12] 下記ポリヌクレオチドを含んでなる、サッカロミセス ·パストリアヌス（Saccharomvces p astorianus)の検出に用いられる PCR法プライマーセット：
配列番号 27の塩基配列で表されるポリヌクレオチドまたはその塩基配列の相補配列 で表されるポリヌクレオチドにハイブリダィズする少なくとも 10塩基のポリヌクレオチド； および
配列番号 28の塩基配列で表されるポリヌクレオチドまたはその塩基配列の相補配列 で表されるポリヌクレオチドにハイブリダィズする少なくとも 10塩基のポリヌクレオチド
[13] 下記ポリヌクレオチドを含んでなる、サッカロミセス ·パストリアヌス（Saccharomvces p astorianus)の検出に用いられる PCR法プライマーセット：
配列番号 29の塩基配列で表されるポリヌクレオチドまたはその塩基配列の相補配列 で表されるポリヌクレオチドにハイブリダィズする少なくとも 10塩基のポリヌクレオチド； および
配列番号 30の塩基配列で表されるポリヌクレオチドまたはその塩基配列の相補配列 で表されるポリヌクレオチドにハイブリダィズする少なくとも 10塩基のポリヌクレオチド
[14] 配列番号 6の塩基配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダィズする少なくとも 1 0塩基のポリヌクレオチド、および配列番号 6の塩基配列の相補配列で表されるポリヌ クレオチドにハイブリダィズする少なくとも 10塩基のポリヌクレオチド力 それぞれ、配 列番号 6の塩基配列の相補配列の連続する少なくとも 10個のヌクレオチドを含んで なるポリヌクレオチド、および配列番号 6の塩基配列の連続する少なくとも 10個のヌク レオチドを含んでなるポリヌクレオチドである、請求項 1に記載のプローブまたはブラ イマ一。
[15] 配列番号 6の塩基配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダィズする少なくとも 1 0塩基のポリヌクレオチド、および配列番号 6の塩基配列の相補配列で表されるポリヌ クレオチドにハイブリダィズする少なくとも 10塩基のポリヌクレオチド力 それぞれ、配 列番号 6の塩基配列の相補配列と少なくとも 90%の同一性を有するポリヌクレオチド 、および配列番号 6の塩基配列と少なくとも 90%の同一性を有するポリヌクレオチド である、請求項 1に記載のプローブまたはプライマー。
[16] 配列番号 6の塩基配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダィズする少なくとも 1 0塩基のポリヌクレオチド、および配列番号 6の塩基配列の相補配列で表されるポリヌ クレオチドにハイブリダィズする少なくとも 10塩基のポリヌクレオチド力 それぞれ、配 列番号 6の塩基配列の相補配列において 1または数個のヌクレオチドが改変された 改変塩基配列からなり、かつ配列番号 6の塩基配列で表されるポリヌクレオチドにノ、 イブリダィズするポリヌクレオチド、および配列番号 6の塩基配列にぉ 、て 1または数 個のヌクレオチドが改変された改変塩基配列からなり、かつ配列番号 6の塩基配列の 相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダィズするポリヌクレオチドである、請 求項 1に記載のプローブまたはプライマー。
[17] 配列番号 1〜5、 7〜17または 23〜30の塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレ ォチドにハイブリダィズする少なくとも 10塩基のポリヌクレオチドが、それぞれ、対応 する塩基配列の連続する少なくとも 10個のヌクレオチドを含んでなるポリヌクレオチド である、請求項 3、 4、および 6〜 13のいずれか一項に記載のプライマーセット。
[18] 配列番号 1〜5、マ〜 17、または 23〜30の塩基配列の相補配列で表されるポリヌク レオチドにハイブリダィズする少なくとも 10塩基のポリヌクレオチド力 それぞれ、対応 する塩基配列と少なくとも 90%の同一性を有するポリヌクレオチドである、請求項 3、 4、および 6〜 13のいずれか一項に記載のプライマーセット。
[19] 配列番号 1〜5、マ〜 17、または 23〜30の塩基配列の相補配列で表されるポリヌク レオチドにハイブリダィズする少なくとも 10塩基のポリヌクレオチド力 それぞれ、対応 する塩基配列にぉ 、て、 1または数個のヌクレオチドが改変された改変塩基配列から なり、かつ対応する塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダィズ するポリヌクレオチドである、請求項 3、 4、および 6〜 13のいずれか一項に記載のプ ライマーセット。
[20] 請求項 2〜4のいずれか一項に記載のプライマーセットと、サッカロミセス'バヤヌス の検出に用いられる LAMP法プライマーセットとを組み合わせて含んでなる、サッカ 口ミセス'パストリアヌスの検出用キット。
[21] サッカロミセス'バヤヌスの検出に用いられる LAMP法プライマーセットが、請求項 8 または 9の LAMP法プライマーセットである、請求項 20に記載のキット。
[22] 請求項 2〜4のいずれか一項に記載の LAMP法プライマーセットと、サッカロミセス
•セレビシェおよびサッカロミセス'パストリアヌスの検出に用いられる LAMP法プライ マーセットとを組み合わせて含んでなる、サッカロミセス'パストリアヌスの検出用キット
[23] サッカロミセス ·セレピシェおよびサッカロミセス ·パストリアヌスの検出に用いられる L AMP法プライマーセットが下記ポリヌクレオチドを含んでなる LAMP法プライマーセ ットである、請求項 22に記載の検出キット：
配列番号 18の塩基配列で表されるポリヌクレオチド (FIP)またはその塩基配列の相 補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダィズする少なくとも 10塩基のポリヌクレ ォチド；
配列番号 19の塩基配列で表されるポリヌクレオチド (F3)またはその塩基配列の相 補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダィズする少なくとも 10塩基のポリヌクレ ォチド；
配列番号 20の塩基配列で表されるポリヌクレオチド (BIP)またはその塩基配列の相 補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダィズする少なくとも 10塩基のポリヌクレ ォチド；および
配列番号 21の塩基配列で表されるポリヌクレオチド (B3)またはその塩基配列の相 補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダィズする少なくとも 10塩基のポリヌクレ ォチド。
[24] サッカロミセス ·セレピシェおよびサッカロミセス ·パストリアヌスの検出に用いられる L AMP法プライマーとして、配列番号 22の塩基配列で表されるポリヌクレオチド (LB) またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダィズする少 なくとも 10塩基のポリヌクレオチドを更に含んでなる、請求項 23に記載の検出キット。
[25] 請求項 2〜4のいずれか一項に記載のプライマーセットを用いて LAMP法により核 酸増幅反応を実施する工程を含んでなる、サッカロミセス'パストリアヌスの検出方法
[26] サッカロミセス'バヤヌスの検出に用いられる LAMP法プライマーセットを用 、て LA MP法により核酸増幅反応を実施する工程を更に含んでなる、請求項 25に記載の検 出方法。
[27] サッカロミセス'バヤヌスの検出に用いられる LAMP法プライマーセットが、請求項 8 または 9の LAMP法プライマーセットである、請求項 26に記載の検出方法。
[28] サッカロミセス ·セレピシェおよびサッカロミセス ·パストリアヌスの検出に用いられる L
AMP法プライマーセットを用いて LAMP法により核酸増幅反応を実施する工程を更 に含んでなる、請求項 25に記載の検出方法。
[29] サッカロミセス ·セレピシェおよびサッカロミセス ·パストリアヌスの検出に用いられる L
AMP法プライマーセットが、下記ポリヌクレオチドを含んでなるプライマーセットであ る、請求項 28に記載の検出方法：
配列番号 18の塩基配列で表されるポリヌクレオチド (FIP)またはその塩基配列の相 補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダィズする少なくとも 10塩基のポリヌクレ ォチド；
配列番号 19の塩基配列で表されるポリヌクレオチド (F3)またはその塩基配列の相 補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダィズする少なくとも 10塩基のポリヌクレ ォチド；
配列番号 20の塩基配列で表されるポリヌクレオチド (BIP)またはその塩基配列の相 補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダィズする少なくとも 10塩基のポリヌクレ ォチド；および
配列番号 21の塩基配列で表されるポリヌクレオチド (B3)またはその塩基配列の相 補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダィズする少なくとも 10塩基のポリヌクレ ォチド。
[30] サッカロミセス ·セレピシェおよびサッカロミセス ·パストリアヌスの検出に用いられる L AMP法プライマーとして、配列番号 22の塩基配列で表されるポリヌクレオチド (LB) またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダィズする少 なくとも 10塩基のポリヌクレオチドを更に含んでなる、請求項 29に記載の検出方法。
[31] 請求項 5に記載の PCR法プライマーセットまたは請求項 10〜 13のいずれか一項 に記載の PCR法プライマーセットを用いて PCR法により核酸増幅反応を実施するェ 程を含んでなる、サッカロミセス'パストリアヌスの検出方法。
[32] 請求項 1に記載のプローブを用いてハイブリダィゼーシヨン複合体を検出する工程 を含んでなる、サッカロミセス'パストリアヌスの検出方法。
[33] 請求項 6または 7に記載の LAMP法プライマーセットを用いて LAMP法により核酸 増幅反応を実施する工程を含んでなる、サッカロミセス'セレピシェの検出方法。
[34] 請求項 8または 9に記載の LAMP法プライマーセットを用いて LAMP法により核酸 増幅反応を実施する工程を含んでなる、サッカロミセス'バヤヌスの検出方法。
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