WO2008018355A1 - biodétecteur, son procédé de fabrication et procédé de détection utilisant le biodétecteur - Google Patents

biodétecteur, son procédé de fabrication et procédé de détection utilisant le biodétecteur Download PDF

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WO2008018355A1
WO2008018355A1 PCT/JP2007/065154 JP2007065154W WO2008018355A1 WO 2008018355 A1 WO2008018355 A1 WO 2008018355A1 JP 2007065154 W JP2007065154 W JP 2007065154W WO 2008018355 A1 WO2008018355 A1 WO 2008018355A1
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WO
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amino acid
peptide
biosensor
linker
biosensor according
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Application number
PCT/JP2007/065154
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English (en)
French (fr)
Inventor
Yoshiroh Akagi
Kazuo Ban
Kyoko Seo
Naoya Ichimura
Atsushi Mizusawa
Original Assignee
Sharp Kabushiki Kaisha
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Sharp Kabushiki Kaisha filed Critical Sharp Kabushiki Kaisha
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Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54353—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals with ligand attached to the carrier via a chemical coupling agent

Definitions

  • Biosensor manufacturing method thereof, and detection method using the biosensor
  • the present invention relates to a biosensor for detecting proteins and the like, and more particularly to a biosensor in which a peptide that is a molecular recognition substance is immobilized on a carrier via a linker.
  • Non-Patent Document 1 Nobuo Karabe, “Biosensor” CMC Publishing 2002
  • Proteins are stable in the living body coexisting with various substance groups, but when isolated, they are affected by the effects of temperature, humidity, ⁇ , oxygen * light * contaminants, dirt, spoilage, etc. There is a risk that the structure may change or be deactivated. Proteins may also denature upon contact with the solid (chip) surface. Furthermore, if an enzyme such as a protease is present in the sample containing the recognition target substance, the protein may be hydrolyzed. Therefore, if an attempt is made to construct a device that eliminates all of these factors, the overall device becomes complicated, resulting in increased equipment troubles and higher costs. Furthermore, since the isolated protein itself is expensive, the above technique using the isolated protein causes an increase in the cost of the biosensor device.
  • peptides have complex three-dimensional structures like proteins! /. Therefore, it is considered useful as a molecular recognition substance because there is no inactivation even if the structure covered by the protein as described above.
  • the peptide is directly fixed to the chip (substrate, etc.), the free movement of the peptide is inhibited and the molecular recognition ability is lost. For this reason, a linker that connects the chip and the peptide with a certain distance between them is indispensable.
  • Patent Document 1 As a technique for immobilizing a peptide on a chip using a linker, the technique of Patent Document 1 is known. is there.
  • Patent Document 1 Japanese Translation of Special Publication 2003—536073
  • Patent Document 1 discloses an anchor segment stably bound to a substrate surface, a peptidomimetic protein binder, a linker segment that connects and separates the anchor segment and the peptidomimetic segment, A protein binding agent comprising: According to this technology, it is said that a protein binding agent can be provided with no risk of inactivation.
  • Patent Document 2 proposes a method using dartalaldehyde (GA) as a linker.
  • Patent Document 2 Japanese Patent Publication No. 61-8942
  • the technique according to Patent Document 2 is a technique for immobilizing a protein such as an antibody or an enzyme on a solid having an amino group such as chitosan via a dartaldehyde.
  • Daltal aldehyde is a compound with excellent reactivity as a linker, while it is also a compound widely used as a disinfectant and inactivates proteins and the like.
  • dartalaldehyde is a substance that lacks flexibility, and there is a possibility that the protein may be hardened during immobilization and the molecular recognition function may be impaired.
  • the smallest unit amino acid coordination IJ essential for detecting the target molecule IJ ( It is reasonable to first identify a peptide) and to use it as a molecular recognition substance, or to obtain a force obtained by degradation of a natural protein or artificially synthesize it. In particular, it is reasonable to artificially synthesize and use a peptide containing the above-mentioned indispensable minimum unit amino acid sequence. Disclosure of the invention
  • the present invention has been made based on the above-described idea. Means for Solving the Problems
  • the present invention aims to provide a use, superiority, and biosensor excellent in molecular recognition, storage stability, and economic efficiency.
  • a biosensor according to a first invention for solving the above-described problem is a biosensor that captures and detects a recognition target substance, and includes a peptide that is a molecular recognition substance, and two or more specific functional groups.
  • the peptide is directly bonded to one specific functional group of the linker, and the carrier is directly bonded to another specific functional group of the linker bonded to the peptide. Therefore, it does not require a complicated reaction step as in Patent Document 1 above.
  • the “peptide” includes not only those in which two or more amino acids are peptide-bonded but also those in which the functional group of the amino acid constituting the peptide is modified.
  • the “specific functional group” means a functional group derived from an epoxy group formed by a reaction between an epoxy group and a functional group that reacts with the epoxy group.
  • the amino group of the peptide reacts with the amino group of amino acid (R 1 -CH 2 (OH) 2 -CH 2 -NHR; R is a linker other than epoxy)
  • R represents a structure other than the amino group of the peptide
  • [CH (OH) 1 CH—] is the specific functional group.
  • the specific functional group present at the binding site between the peptide and the linker differs from the specific functional group present at the binding site between the carrier and the linker. May be.
  • the specific functional group is a reaction-generated functional group of an epoxy group and an amino group.
  • the epoxy group and the amino group rapidly bind to each other, so that it is easy to produce a biosensor.
  • one having two or more epoxy groups as the linker molecule (the molecule from which the linker is derived) and a peptide whose N-terminal amino group is not modified It is preferable to use a compound containing an amino group as a support, using a lysine containing arginine.
  • the linker does not adversely affect the peptide molecular recognition.
  • a hydrocarbon-based structure is preferably used as long as it has hydrophilicity, hydrophobicity, or amphiphilicity.
  • This structure may contain an unsaturated bond, a cyclic structure or an aromatic structure which may have a branched structure.
  • a structure containing oxygen such as an ether group, a carboxyl group, or a carbonyl group may be included.
  • an artificial synthetic peptide can be used as the peptide. Artificial synthetic peptides are preferred because they can reduce costs and improve reproducibility!
  • the artificially synthesized peptide is the same as the amino acid sequence of the hypervariable region of the antibody protein, modified with a partial functional group of the amino acid, and other amino acid sequence at the C-terminal and / or N-terminal A force S is added with an amino acid added or a part of the amino acid sequence changed.
  • the amino acid sequence in the hypervariable region of the antibody protein is the portion where the antigen specificity appears most, the peptide having high antigen specificity can be obtained by using the amino acid sequence of this portion. Therefore, if the amino acid sequence of the hypervariable region is used, the number of amino acids indispensable for detecting the target molecule can be reduced to the minimum necessary. It is possible to reduce the cost and cost for artificial synthesis of high quality peptides.
  • This artificially synthesized peptide is obtained by modifying a part of the amino acid functional group in the amino acid sequence of the hypervariable region of the antibody protein, and adding other amino acids to the C-terminal and / or N-terminal of the amino acid sequence. Or a part of the amino acid sequence modified or a combination of these! /.
  • the amino acid on the C-terminal side and / or the N-terminal side of the artificially synthesized peptide can be a cysteine.
  • the amino-amino group of the N-terminal amino acid of the artificially synthesized peptide is modified, and the C-terminal end of the peptide is modified.
  • the amino acid is an amino acid having a primary amine in the side chain, and the amino group of the C-terminal amino acid and the specific functional group can be combined.
  • an amino group other than the ⁇ -amino group of this amino acid may be modified.
  • amino acid having a primary amine in the side chain lysine is preferably used.
  • the length of the linker is preferably 0.5 to Onm, more preferably 0.8 to 7 ⁇ Onm. If the length of the linker is too small, the carrier and the peptide cannot be sufficiently separated from each other. If the length is too large, the linker may be bent and the molecular recognition function of the peptide may be impaired. .
  • the peptide fixed on the carrier is one kind.
  • the peptides fixed on the carrier are two or more kinds of peptides mixed at random.
  • the recognition target substance has multiple recognition sites
  • multiple types of peptides can be captured by immobilizing multiple types of peptides corresponding to each recognition site.
  • Strength S can strengthen the action.
  • one or more of the multiple types of recognition target substances will be included. Or not contained at all can be determined by a single analysis operation.
  • the carrier may be of any shape! /, But is a substrate, solid particles, membrane, fiber
  • the thin film is chitosan and has a thickness of 50 to 400 nm.
  • a method for producing such a biosensor which focuses on the second invention for solving the above-mentioned problem, is a linker molecule comprising a peptide that is a molecular recognition substance and a hydrocarbon compound having an epoxy group at both ends. And a mixture having a functional group capable of binding to an epoxy group on the surface to directly bond the peptide and the linker molecule, and to bond the linker molecule and the carrier.
  • the step of directly coupling is provided.
  • the peptide amino group and one epoxy group of the linker molecule undergo a binding reaction, and the functional group of the carrier and the other epoxy group of the linker molecule
  • the peptide and the linker molecule can be directly immobilized, and the linker molecule and the carrier can be directly immobilized. Therefore, the manufacturing process can be simplified.
  • a compound having nucleophilicity can be used, and as such a functional group, an amino group, a hydroxyl group, or the like can be used.
  • the concentration of the peptide contained in the mixed solution is 0.001 -2.0 mol.
  • the power S is to be / L.
  • the force S indicates that the concentration of a linker molecule contained in the mixed solution is 0.001-4.0 mol / L.
  • linker molecule is represented by "G (O CH-CHR-) O G; R is a hydrogen atom or
  • n may be a poly (mono) alkylene oxide diglycidyl ether represented by “an integer of 1 or more”.
  • the functional group on the surface of the carrier to be bonded to the epoxy group may be an amino group.
  • the carrier may be a thin film formed by applying a chitosan solution having chitosan in an acid solution to the surface of a substrate, solid particles, fibers, or gel.
  • the chitosan solution can have a viscosity power of 100 to 25 ° C; lOOOPa'S.
  • the film thickness force S of the chitosan thin film can be set to 50 to 400 nm.
  • the detection method that is particularly powerful in the third invention for solving the above-mentioned problem is a method for detecting a recognition target substance using a biosensor in which cysteine is contained in the amino acids constituting the peptide, wherein the peptide Peptide recognition target substance complex is formed by reacting the peptide recognition target substance complex with the peptide recognition target substance complex to react with the antibody material with a fluorescent substance.
  • the protein as the recognition target substance is adsorbed on the surface of the substrate or the like constituting the biosensor by nonspecific adsorption, and the detection signal due to this is also detected. Cannot be measured.
  • the amount of luminescence in the fourth step is measured, and then colloidal gold is introduced, thereby enabling peptide recognition.
  • the recognition target substance is desorbed from the elephant complex, and instead, the colloidal gold and cysteine react. For this reason, light emission is reduced by the amount of the peptide recognition target substance complex. Therefore, the amount of decrease in luminescence can be detected as an accurate amount of protein.
  • a detection method for solving the above-mentioned problem is a method for detecting a recognition target substance using the biosensor, wherein the peptide and the recognition target substance are reacted to generate a peptide.
  • the first step of forming a recognition target substance complex, the peptide-recognition target substance complex, and a peptide having a cysteine added to the end thereof are reacted to form a peptide recognition target substance complex, a cysteine-added peptide.
  • a second step of forming a third step of washing excess cysteine-containing antibody material, a fourth step of adding gold colloid and reacting the cysteine with the gold colloid, and washing the excess gold colloid
  • a special feature is that it comprises a fifth step and, after the sixth step, a sixth step for detecting the color development amount of the colloidal gold.
  • the amount of the recognition target substance can be detected with high accuracy.
  • the biosensor according to the fifth aspect of the present invention for solving the above-described problems includes a peptide as a molecule-capturing substance that captures a specific molecule, a carrier that supports the peptide, and the peptide.
  • the artificial synthetic peptide is directly bonded to one reactive functional group of the linker, and the carrier is bonded to another reactive functional group other than the reactive functional group! / It is characterized by.
  • the peptide is directly bonded to one reactive functional group of the linker, and the carrier is directly bonded to another reactive functional group of the linker bonded to the peptide. Therefore, the structure is excellent in stability, and in this structure, since the peptide protrudes outward through the linker, the trapping efficiency for a specific molecule is high.
  • the "artificial synthetic peptide having a structure different from that of a living immunoglobulin” means that it is not completely identical to all or part of the living immune protein. That is, it means that a different amino acid is added to the whole or part of the amino acid sequence of a living immune protein or that the whole or part of the amino acid sequence of the immune protein is changed.
  • the artificially synthesized peptide includes three or more consecutive amino acid sequences present in a portion corresponding to the hypervariable region of the amino acid sequence of natural immunoglobulin. Can be configured.
  • the amino acid sequence of the hypervariable region of an immunoglobulin is the portion where antigen specificity appears most, and using this portion of the amino acid sequence results in a peptide with high antigen specificity (high ability to capture a specific molecule). can get.
  • an antibody sample to be subjected to amino acid sequence (Edman method) is determined. This amino acid sequence is analyzed from the N-terminus. S, and some proteins are blocked at the N-terminal amino acid, so amino acid sequencing may not be possible. Therefore, select an unblocked antibody sample.
  • [0066] Pick up at least 5 amino acid sequences based on gene sequence information of antibody H chains recorded in gene databases such as EMBL and GenBank, preferably all, and perform homology comparison with them . Sequence position corresponding to hypervariable region of known antibody (generally, 20th to 40th, 50th to 70th, 80th to 120th amino acids counted from the N-terminus of the H and L chains of immunoglobulin molecules) ), And the area where the rate of change expressed by the following formula is 20 or more is determined as the hypervariable area.
  • Some amino acids constituting peptides have functional groups rich in reactivity, and when these functional groups are used as they are, the functional groups react with other than specific molecules, and peptides There is a risk of losing the ability to capture specific molecules. Therefore, it is preferable to modify these functional groups with other functional groups.
  • an amino acid sequence consisting of four consecutive amino acids constituting the hypervariable region of a natural immunoglobulin, and three of the amino acids constituting the amino acid sequence are isoorcinine, phenenorealanine, valine, leucine
  • the hydrophobic amino acid sequence is a hydrophobic amino acid selected from the group consisting of methionine, tryptophan, alanine, glycine, cysteine, and tyrosine, and the other is an amino acid other than the hydrophobic amino acid
  • the artificial synthetic peptide does not include a synthetic hydrophobic amino acid sequence unit in which amino acids other than hydrophobic amino acids in the hydrophobic amino acid sequence are substituted with hydrophobic amino acids. It is the power S that makes it a certain structure.
  • the amino acid sequence is composed of four consecutive amino acids constituting the hypervariable region of a natural immunoglobulin, and three of the amino acids are hydrophobic and the other is non-hydrophobic, By changing the hydrophobic amino acid to a hydrophobic amino acid, it is possible to increase the capturing ability of a specific molecule.
  • the method of selecting four consecutive amino acids that compose the hypervariable region is arbitrary.
  • a part of the functional group of the amino acid constituting the synthetic hydrophobic amino acid unit may be modified with another functional group.
  • Some amino acids constituting peptides have functional groups rich in reactivity. When these functional groups are used as they are, the functional groups react with other than specific molecules, and peptides are used. There is a risk of losing the ability to capture specific molecules. Therefore, it is preferable to modify these functional groups with other functional groups.
  • the amino acid sequence is composed of four consecutive amino acids constituting the hypervariable region of natural immunoglobulin, and three of the amino acids constituting the amino acid sequence are histidine, gnoretamic acid, aspartic acid, gnoletamine, and asparagine.
  • the artificial synthetic peptide comprises a synthetic hydrophilic amino acid sequence unit in which amino acids other than hydrophilic amino acids contained in the hydrophilic amino acid sequence are substituted with hydrophilic amino acids. it can.
  • a non-hydrophilic amino acid sequence consisting of four consecutive amino acids constituting the hypervariable region of a natural immunoglobulin, three of which are hydrophilic and the other is non-hydrophilic.
  • hydrophilic amino acids By changing hydrophilic amino acids to hydrophilic amino acids, the ability to capture specific molecules increases.
  • the “four consecutive amino acids” in the above configuration are not specified in advance as a requirement that they are within the hypervariable region. It means “four consecutive amino acids” arbitrarily selected from within the hypervariable region.
  • a part of the functional group of the amino acid constituting the synthetic hydrophilic amino acid unit may be modified with another functional group.
  • Some amino acids constituting peptides have functional groups rich in reactivity. When this functional group is used as it is, this functional group reacts with other than the specific molecule, and the peptide There is a risk of losing the ability to capture specific molecules. Therefore, it is preferable to modify such a functional group with another functional group.
  • the N-terminal amino acid of the artificially synthesized peptide can be combined with the linker.
  • the amino acid at the N-terminal of the peptide has an ⁇ -amino group that has not reacted with other functional groups.
  • the linker and the peptide are directly linked. Combine with force S.
  • the ⁇ -terminal amino acid of the artificially synthesized peptide is an amino acid having a primary amine in the side chain, and the ⁇ -amino group of the ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ -terminal amino acid is modified,
  • the ability to construct the amino acid at the terminus of the synthetic peptide and the linker is combined with the force S.
  • the ⁇ -amino group of the amino acid at the terminus of the artificially synthesized peptide is modified to eliminate the reactivity. Since the amino acid at the terminus has a primary amine, By binding the primary amine of the side chain and a single linker molecule, it is possible to directly bond the linker and the peptide '.
  • amino acid having a primary amine in the side chain lysine is preferably used.
  • the length of the linker is 2.0 to 6. Onm.
  • the linker When the linker is bound to the amino acid at the N-terminal of the peptide, if the length of the linker is too short or too long, the capturing ability of a specific molecule is lowered, so the above length is preferable. This is because if the length of the linker is too short, the start-up of the peptide will be poor, and if the length of the linker is too long, the leading end of the peptide will be placed against the carrier. It is presumed that this is because it becomes associated with the target molecule.
  • the amino group of the N-terminal amino acid of the artificially synthesized peptide is modified, and the artificially synthesized peptide has a primary amine in the side chain of the amino acid force at the C-terminal. It is an amino acid, and it is a force that makes the structure in which the C-terminal amino acid of the artificially synthesized peptide is linked to the linker.
  • the amino group at the N-terminal amino acid of the artificially synthesized peptide is modified to make it less reactive, but this is because the C-terminal amino acid has a primary amine in the side chain.
  • the linker and the peptide can be directly bound.
  • amino acid having a primary amine in the side chain lysine is preferably used.
  • the length of the linker may be 0.5 to 1.5 nm.
  • the ⁇ -amino group of the N-terminal amino acid of the artificially synthesized peptide is not modified, and the C-terminal amino acid force side chain of the artificially synthesized peptide is an amino acid having a primary amine.
  • the amino acid at the terminus of the artificially synthesized peptide binds to one linker, and the amino acid at the C terminus of the artificially synthesized peptide and the other linker bind to each other.
  • the N-terminal amino acid of the artificially synthesized peptide is an amino acid having a primary amine in a side chain
  • the C-terminal amino acid of the artificially synthesized peptide is lysine or arginine
  • the ⁇ -amino group of the terminal amino acid is modified, the amino acid at the terminus of the artificially synthesized peptide binds to one linker, and the amino acid at the C-terminal of the artificially synthesized peptide and the other linker It can be set as the structure which couple
  • This configuration also allows the peptide to be arranged in a state in which it can easily associate with a specific molecule, thereby increasing the capture ability of the specific molecule.
  • amino acid having a primary amine in the side chain lysine is preferably used.
  • the linker may have a length force of 0.5 to 10 nm.
  • a binding force S between the reactive functional group of the linker and the artificially synthesized peptide may be generated by a reaction between an epoxy group and an amino group.
  • the bond between the reactive functional group of the linker and the carrier may be a structure generated by the reaction of an epoxy group and an amino group.
  • the epoxy group and the amino group rapidly bind to each other, so that the biosensor can be easily produced.
  • one having two or more epoxy groups as a linker molecule (the molecule from which the linker is derived) is modified by modifying the ⁇ -amino group at the N-terminus, It is preferable to use a peptide containing an amino acid having a primary amine in the side chain and a compound having an amino group on the surface as the carrier.
  • the linker may be represented by "one-CH-CHR-; R is a hydrogen atom or
  • a structure having an alkylene oxide structure represented by “indicating an alkyl group” is preferable because an appropriate amphiphilic property can be obtained.
  • the artificially synthesized peptide is a sequence of four consecutive amino acids in the hypervariable region of a natural immunoglobulin, and is isoleucine, phenylalanin, norin, oral isin, methionine. , Tryptophan, alanine, glycine, cysteine, tyrosine, a natural hydrophobic amino acid sequence consisting of four consecutive hydrophobic amino acids selected from the group consisting of It can be set as the structure containing a knit.
  • the artificially synthesized peptide is a sequence of four consecutive amino acids in the hypervariable region of a natural immunoglobulin, and includes histidine, glutamic acid, aspartic acid, glutamine, asparagine, lysine, and arginine.
  • a natural hydrophilic amino acid sequence unit in which four hydrophilic amino acids selected from the group consisting of proline, threonine, and serine are arranged in succession can be used.
  • a biosensor with high structural stability and excellent molecular recognition can be realized at low cost.
  • the biosensor according to the present embodiment includes a peptide 1 that is a molecular recognition substance, a carrier 2 that supports a peptide, and a linker that connects the peptide 1 and the carrier 2. 3 and.
  • the peptide used in the present embodiment is a peptide in which a plurality of amino acids are peptide-bonded, and may be derived from a natural product or may be artificially synthesized. From the viewpoint of sex, it is preferable to use an artificially synthesized peptide. In the case of an artificially synthesized peptide, it is preferable to use a peptide containing three or more consecutive amino acid sequences contained in the hypervariable region after analyzing the amino acid sequence of the hypervariable region of immunoglobulin.
  • the amino acid sequence of the hypervariable region of immunoglobulin is the site where antigen specificity appears most. Therefore, by using a peptide containing three or more consecutive amino acid sequences contained in the amino acid sequence of this immunoglobulin hypervariable region, a peptide with high molecular recognition ability can be realized with the minimum number of amino acids. This can reduce the cost of artificial peptide synthesis.
  • an immunoglobulin A peptide comprising 5 or more contiguous amino acid sequences contained in the amino acid sequence of the hypervariable region, more preferably 8 or more contiguous amino acid sequences contained in the amino acid sequence of the immunoglobulin hypervariable region. Use the containing peptide.
  • Peptides containing 3 or more consecutive amino acid sequences contained in the hypervariable region are partly modified in order to improve molecular recognition and facilitate immobilization with a linker.
  • Other amino acids may be added to the C-terminal and / or N-terminal, and some functional groups of the amino acids constituting the peptide are modified! /
  • the number of amino acid sequences in the hypervariable region is generally said to be about 10, in order to function as a peptide that performs molecular recognition, the number of amino acid sequences in the artificially synthesized peptide is It is preferable to include 3 or more amino acids that are consecutive in the amino acid sequence, more preferably 5 or more, and still more preferably 8 or more.
  • the number of amino acid sequences of the artificially synthesized peptide is preferably about 3 to 30, more preferably about 4 to about 16. As the number of amino acid sequences increases, the cost of synthesis increases accordingly. Therefore, the minimum number of amino acid sequences that can exhibit a molecular supplement function is preferable.
  • synthetic peptides in which some of the amino acids are replaced with hydrophobic amino acids have a higher ability to capture specific molecules than artificial synthetic peptides that are completely identical to the amino acid sequences of the hypervariable regions of natural immunoglobulins. Many.
  • cysteine can be added to the C-terminal and / or N-terminal of the amino acid sequence of the hypervariable region to confer binding to other materials.
  • amino acid sequence of the N-terminal amino acid in the amino acid sequence of the hypervariable region is modified, and an amino acid having a primary amine in the side chain (for example, lysine) is added to the C-terminal to link the peptide. Since the binding site can be limited to this C-terminal amino acid, it is possible to prevent the structure of the amino acid sequence part that performs molecular recognition from being changed by the binding between the peptide and the linker.
  • immunoglobulins include IgG, IgA, IgE, IgM, IgY, IgD, and the like.
  • an IgG antibody is composed of an H chain and an L chain, and a hypervariable region exists in each of the H chain and the L chain.
  • the hypervariable region to be analyzed may be only the H chain or only the L chain, and both the H and L chains may be analyzed.
  • the immunoglobulin used for analysis is not limited to IgG, but may be IgA, IgE, IgM, IgY, etc., and may be a recombinant antibody (such as a single chain antibody) or a phage display. May be.
  • a method for producing an antibody a conventionally used method can be used. For example, a method is used in which an allergen is administered into a test animal such as a mouse, an antibody protein is produced in vivo, and this is isolated and purified.
  • Allergens that produce antibodies are pollen (ragweed, cedar, camodium, bathroom ridalas, canamandara, mugwort, rice, konara, birch, sugar beet, alder, cyper mushroom, suzumenotetsupo, kentucky 31 festa, himega, strawberry , Rose, apple, acacia, yellow sanoretan, willow, ume, bayberry, pear, cosmos, bell pepper, bud, tari, scallop, sparrow camellia, cherry blossom, cherry, nadesico, african calendula, himenotoku, chrysanthemum, insect repellent chrysanthemum, Black pine, ripe pine, ramie, zelkova, tarmi, tambopo, peach, seika takano kirinso, ichiyo, gifted bayshabushi, camellia, statice, rape, gloriosa, mandar
  • a method of determining a hypervariable region using mRNA can also be employed.
  • An example of the procedure of this method is as follows.
  • the linker has a specific functional group (reactive functional group) at both ends, and the peptide and the linker, and the linker and the carrier are directly bonded by the specific functional group.
  • this linker it is preferable to use a hydrocarbon-based compound having a specific functional group consisting of a reaction product of an epoxy group and an amino group at both ends.
  • hydrophilic or hydrophobic or A substance obtained by reacting an amphiphilic hydrocarbon compound having diglycidyl ether having an epoxy group with an amino group at both ends can be used.
  • One of the epoxy groups in the diglycidyl structure is covalently bonded to the amino group of the peptide that performs molecular recognition, and the epoxy group in the other diglycidyl structure is covalently bonded to the functional group of the carrier, thereby The linker and the carrier are directly coupled to each other.
  • the linker molecule is preferably poly (mono) ethylene glycol diglycidyl ether (PEG-DE).
  • PEG-DE poly (mono) ethylene glycol diglycidyl ether
  • the carrier which is not related to the chain length of PEG, does not cure and has no harmful effect, so there is a possibility of inactivating the peptide. Can be lowered.
  • the thickness of the biological membrane is 50A or less, the configuration will be linear, about 100A. It is known that when it becomes length, it will be bent.
  • the length of the linker is preferably 0.5 to 10 nm (5 to! OOA), more preferably 0.8 to 7.0 nm (8 to 70 A).
  • the carrier for immobilizing the peptide described in the present invention may have any shape as long as it has a functional group that reacts with an epoxy group, and the shape of the support that supports the carrier. , Substrates, solid particles, membranes, fibers, gels and the like are preferred.
  • the support having a functional group that reacts with an epoxy group chitosan is particularly preferable because it has a high reactivity with an epoxy group and an amino group is easy to use. Chitosan can be bound to a single molecule of linker, whether as particles, membranes, gels, or solutions. Alternatively, the chitosan solution reacted with the peptide via a linker may be immobilized on a surface of another particle, substrate, fiber, or the like in a film form.
  • a method in which chitosan is dissolved in acetic acid or hydrochloric acid and the substrate or the like is immersed in this solution can be employed.
  • the concentration of the chitosan solution is adjusted to about 2.5%, the acid concentration is adjusted, and the viscosity is 100 to 10OOmPa's at room temperature, preferably 200 to 500mPa's.
  • the film thickness is 50 ⁇ 400nm.
  • the acid is not limited to the above, and the concentration of the chitosan solution is not limited to 2.5%.
  • the substrate for forming the chitosan thin film is not limited to the above, and the film thickness is not limited to the above range.
  • the immersion method is the simplest method for immobilizing an artificially synthesized peptide on a carrier via a linker.
  • the immobilization method is not limited to the dipping method.
  • the concentration of the artificially synthesized peptide contained in the dipping solution is preferably Preferably, it is set to 0.001 ⁇ 2.0 monore /: L, and more preferably 0.001 ⁇ 1.0 monore /: L.
  • the concentration of the linker molecule contained in the immersion liquid is preferably 0.00;! To 4.0 mol / L, more preferably 0.008 to 2.0 monolayer /: L.
  • the mode in which the artificially synthesized peptide is immobilized on the carrier via the linker is not less than one type of artificial peptide immobilized on the carrier, or two or more types that are randomly mixed. Also good.
  • a molecular recognition region A in which a plurality of one type of peptide is immobilized on a carrier and a molecular recognition region B in which a plurality of one type of peptide different from the above are immobilized may be formed. It is possible to have more than 3 molecular recognition regions. Multiple peptides are fixed to one molecule recognition region!
  • a mixed solution of a linker molecule having an epoxy group at both ends and an artificially synthesized peptide is dropped onto the well of an ELISA plate having a chitosan thin film formed on the surface, and at an arbitrary temperature of 4 to 40 ° C. Let stand for hours to days to make a biosensor.
  • the mixed solution of the linker molecule and the peptide is washed with a buffer or the like, a blocking solution (for example, BSA (usi serum albumin) solution) is added, and an arbitrary temperature of 4 to 40 ° C is added. Then, the blocking treatment is performed by leaving it for several hours to several days. After blocking, the well is washed with a phosphate buffer containing a surfactant.
  • a blocking solution for example, BSA (usi serum albumin) solution
  • a phosphate buffer containing allergen protein and BSA is added dropwise to the well at concentrations of 0, 1, 5, and 10 ng / mL, and the reaction is performed at room temperature for 2 hours. Then wash the well in the same way as above.
  • Peroxida was added to the well of the ELISA plate where the artificial peptide was solidified. Add phosphate buffer containing ase-conjugated monoclonal antibody and BSA and leave at 37 ° C for 1 hour. Thereafter, the well is washed with a phosphate buffer containing a surfactant.
  • a substrate that reacts with the enzyme to develop color is added to the well, and the substrate is reacted with phenoloxidase at room temperature for 10 minutes. Thereafter, an enzyme reaction stop solution is added.
  • Examples of other optical detection include the following methods.
  • each process from preparation of a biosensor to a peptide allergen complex formation reaction is the same as that of the said detection method 1 except that a synthetic peptide contains a system, the description is abbreviate
  • the absorbance at 450 nm is measured with a plate reader.
  • allergen protein is adsorbed to the plate part other than peptide by non-specific adsorption, and the color developed thereby is detected as noise.
  • the colloidal gold is preferentially bound to the peptide cysteine over the allergen protein, and the allergen protein is detached from the peptide-allergen protein complex.
  • the absorbance detected by the secondary detection is the absorbance derived from non-specific adsorption. Therefore, by determining the difference between the primary detection and the secondary detection, the force S can be measured to measure the amount of true recognition reaction.
  • the following method is desirable. However, it is not limited to the following method.
  • each process from preparation of a biosensor to a peptide allergen complex formation reaction is the same as that of the said detection method 1, the description is abbreviate
  • the mechanical detection is preferably performed by the following method, but is not necessarily limited to the following method.
  • Prefabricated silicon wafers are processed into strips. Create a strip with a two-stage structure with a width of 1 mm and a length of 3 mm and a base with a width of 5 mm and a length of 10 mm. A piezo element is joined to the boundary between the tip and base, and the opposite side of the base is fixed to a SUS304 jig.
  • a chitosan thin film is formed at the tip, and the artificially synthesized peptide is immobilized on chitosan in the same manner as in detection method 1 above.
  • a resonance frequency of 420 KHz is given to the piezo element.
  • the resonance frequency changes. By converting this frequency change into a substrate-specific reaction weight, the amount of allergen protein can be detected.
  • Electrochemical detection is preferably performed by the following method, but is not necessarily limited to the following method.
  • 5mm X lmm gold electrode or platinum electrode on both ends of 5mm X 3mm plastic substrate Apply poles. Leads are attached to the electrodes at both ends, and a chitosan thin film is formed on the entire plastic substrate.
  • the artificially synthesized peptide is immobilized on chitosan in the same manner as in detection method 1 above.
  • An alternating current of 1 Hz to 1 MHz is arbitrarily applied to the electrodes on both ends of the plastic substrate, and the alternating impedance changes when the artificially synthesized peptide is bound to the allergen protein.
  • the amount of allergen protein can be detected from the amount of change in AC impedance.
  • the antibody that recognizes Cry-Jl derived from Japanese cedar is an IgG antibody, and the hypervariable region of its H chain was analyzed.
  • IgG antibody a mouse monoclonal antibody (Anti Cryjl Mouse # 013, Seikagaku Corporation) was used.
  • the amino acid sequence is analyzed from the N-terminus! /, And some of the proteins are spiders. Some proteins have the N-terminal amino acid blocked (modified), and the N-terminal amino acid is blocked. Amino acid sequence may not be performed. Therefore, the following test was performed to select an unblocked antibody sample from a plurality of antibody samples.
  • Acetylation-TEYTIHWWK (Acetylation is only the ⁇ -amino group of the N-terminal T)
  • Lysine ( ⁇ ) was added to the C terminus of the amino acid sequence of the hypervariable region, and the amino group of the amino acid at the ⁇ end was modified to eliminate the reactivity.
  • the synthetic peptide was immobilized on chitosan thin film using fluorescein-TEYTIHWWK.
  • fluorescein-TEYTIHWWK is 0.34 mmol and polyethylene diglycidyl ether (Denacol EX-850 Nagase ChemteX) is 0.334 mmol.
  • a 10 mL aqueous solution was prepared, and the quartz plate coated with the chitosan film was immersed therein. Immersion time is 18 hours.
  • the quartz plate coated with the chitosan film was dried for 24 hours in a tarine bench. Thereafter, a quartz plate coated with a chitosan film in distilled water was immersed and washed for 24 hours. Drying after washing was performed in a clean bench for 24 hours.
  • the chain structure bonded with 850 is expected to be immobilized in a state of rising from the plane of the chitosan film.
  • Figure 4 shows the expected figure.
  • the reactivity of anti-Cry-J1 antibody heavy chain hypervariable region peptide (acetylated TEYTIHWWK) and pollen allergen protein (Cry-J1) was examined by ELISA.
  • the experimental method can be summarized as follows.
  • MS-3608F amino group binding plate
  • the peptide solution was taken out, 200 L of blocking one (manufactured by Nacalai Testa) was added, and blocking treatment was performed at 4 ° C.
  • the blocking solution was taken out, and the wells were washed with 0.05% Tween20-containing PBS. Wash with PBS containing 20% Tween20 (20 mM Sodium nitrate pH7.40 ⁇ 15MNaCl) was added to 200 wells, and the operation was carried out three times.
  • Pollen allergen Cry—J1 (manufactured by Seikagaku Corporation) was diluted to 0, 1, 5, 10 ng / mL using PBS containing 0.1% BSA, and 100 L each was added to the well. After the addition, the mixture was allowed to stand at room temperature for 2 hours.
  • the peroxidase-conjugated anti-Cry-J1 monoclonal antibody was removed and the wells were washed as in (3).
  • PEG-DG Poly (mono) ethylene glycol diglycidylate as a linker molecule
  • PEG—DG was selected from Nagase ChemteX Corporation Denacol EX series.
  • each of the 96 holes of the ELISA plate was filled with 100 ⁇ L of distilled water and washed three times.
  • Blocking was performed using a blocking one manufactured by Nacalai Testa Co., and the reaction was carried out at room temperature! /, And the time was 24 hours.
  • Acetyl-NH—TEYTIHWWK—COOH is diluted with distilled water to a concentration of 0 g / m, 0.2 ⁇ g / ITLL, 0.5 ⁇ g / mL, 1.0 ⁇ g / mL, 2.0 ⁇ g mL 5.0 mL was prepared.
  • Diluent H 0 ⁇ g / mL, 0.2 ⁇ g / mL, 0.5 ⁇ g / mL, 1.0 ⁇ g / mL, 2.0 ⁇ g / m
  • Anti-cedar pollen antigen are secondary antibody Cry- J1 HRP (HorseRadish Peroxidase) (Seikagaku Corporation) and 0. l% T W was diluted 1000-fold was prepared in een20 containing phosphate buffer, its preparation was added and reacted at room temperature for 1 hour.
  • the color developing solution was subjected to color reaction at room temperature using ELISA POD substrate TMB kit (Nacalai Testa). 30 minutes after adding 100 L of substrate solution, add 100 L of stop solution after reaction. And the absorbance at 450 nm was measured.
  • the linker length is preferably 1.5 nm (15 A) or less.
  • PEG-DG poly (mono) ethylene glycol diglycidyl ether
  • Blocking was performed using a blocking one manufactured by Nacalai Testa Co., and the reaction was performed at room temperature (25 ° C), and the reaction was completed in 24 hours.
  • Acetyl-NH—KTEYTIHWW—COOH is diluted with distilled water to a concentration of 0 g / m, 0.2 ⁇ g / ITLL, 0.5 ⁇ g / mL 1.0 ⁇ g / mL 2.0 ⁇ g mL 5.0 mL was prepared.
  • Diluent H 0 ⁇ g / mL, 0.2 ⁇ g / mL, 0.5 ⁇ g / mL, 1.0 ⁇ g / mL, 2.0 ⁇ g / m
  • the color developing solution was subjected to color reaction using ELISA POD substrate TMB kit (Nacalai Testa). Performed at temperature. 30 minutes after adding 100 L of the substrate solution, 100 L of stop solution after the reaction was added, and the absorbance at 450 nm was measured.
  • the length of the linker is detected when one linker is bonded to the N-terminus of the artificially synthesized peptide and another linker is bonded to the C-terminal amino acid of the artificially synthesized peptide.
  • the effect on sensitivity was investigated.
  • a lysine residue is placed at both ends of the amino acid sequence of the J1 recognition peptide, and the side chain amino group at the C-terminal lysine is acetylated with the ⁇ -amino group at the N-terminal lysine. The group was attached to one other linker. A schematic diagram of this is shown in FIG.
  • each of the 96 holes of the ELISA plate was filled with 100 ⁇ L of distilled water and washed three times.
  • Blocking was performed using a blocking one manufactured by Nacalai Testa, and the reaction was carried out at room temperature (25 ° C).
  • Acetylation-KTEYTIHWWK— COOH is diluted with distilled water to a concentration of 0 ⁇ g / mL
  • the color development reaction was carried out at room temperature using ELISA POD substrate TMB kit (Nacalai Testa). 30 minutes after adding 100 L of substrate solution, add 100 L of stop solution after reaction. And the absorbance at 450 nm was measured.
  • the amino acid sequence of NH—TEYTIHWW—COOH which is the amino acid sequence of the hypervariable region of anti-Cryj—1 immunoglobulin, is a self-aligned sequence TEYT from the N-terminal side. Is expensive. IHWW is highly hydrophobic because I and W are hydrophobic. Triptophan (W) is thought to function as a peptide or protein recognition site in many cases.
  • tyrosine (Y) is changed to hydrophilic glutamic acid (E)
  • histidine ( H) was changed to hydrophobic tryptophan (W)
  • acetylyl NH—TEETIW WWK-COOH (AL1) was artificially synthesized.
  • each of the 96 holes of the ELISA plate was filled with 100 ⁇ L of distilled water and washed three times.
  • Blocking was performed using a blocking one manufactured by Nacalai Testa Co., and the reaction was carried out at room temperature!
  • Reaction of artificially synthesized peptide AL1 was carried out using antigen Cryj 1 dilution 0 ⁇ g / mL, 0.2 ⁇ g / mL, 0. S ⁇ ug / mL 1.
  • O ⁇ ug / mL 2.0 ⁇ g / mL 50 mL of mL and 5.0 g / mL were added dropwise and added fi.
  • Anti-cedar pollen antigen Cry— J1 HRP (Seikagaku Corporation), a secondary antibody, was prepared by diluting 1000 times with a phosphate buffer containing 0 ⁇ l% Tween 20 and 100 L of the prepared solution was added. The room temperature reacted for 1 hour.
  • the color developing solution was subjected to color reaction at room temperature using ELISA POD substrate TMB kit (Nacalai Testa). 30 minutes after adding 100 L of the substrate solution, 100 L of stop solution after the reaction was added, and the absorbance at 450 nm was measured.
  • PEG — DG chain length 1 1.0 A, acetylyl NH— TEETIWWWK — COOH immobilized on solid phase with degree of polymerization n 2, antigen Cry— J1 concentration 0 g / mL, 0.2 gZ Absorbance at 450 nm at mL, 0.5 ⁇ g / mL, 1.0 ⁇ g / mL, 2.0 ⁇ g / mL It became Naozumi.
  • the artificially synthesized Cry-Jl-recognizing peptide acetylyl NH-TEYTIHWWK-COOH (SH1) was subjected to a solid phase reaction according to Example 2.
  • acetyl-NH—TEYTIHWWK—COOH (SHl) and acetyl-NH—TEEETIWWWK—COOH (ALl) showed almost the same reactivity to Cry—J1. It was. The reason for this can be considered that the amino acid sequence has a sufficient ability to recognize Cry—J1 in both hydrophilicity and hydrophobicity. Therefore, the artificially synthesized peptide TEETIWWWK with improved hydrophilicity in some regions and hydrophobicity in some regions is similar to the artificially synthesized peptide TEYTIHWWK with lysine added to the C-terminus of the hypervariable region. It is thought that it only stops showing the recognition ability.
  • biosensor As described above, according to the present invention, it is possible to realize a biosensor that is low in cost and has no fear of deactivation or the like at low cost.
  • This biosensor can be used for environmental measuring instruments, medical examination equipment, etc., and has significant industrial significance.
  • FIG. 1 is a schematic view of a biosensor that can be applied to an embodiment.
  • FIG. 2 is a view showing a homologous comparison between the amino acid sequence measured in Example 1 (Cry—Jl mouse monoclonal antibody IgG (Anti Cry-Jl Mouse # 013 Seikagaku)) and the amino acid sequence described in the database. .
  • FIG. 3 is a graph showing the absorbance in a state of being immobilized on a chitosan membrane via an artificially synthesized peptide, fluorescein-TEYTIHWWK force Denacol EX-850.
  • FIG. 4 is a predicted view of a structure in which an artificially synthesized peptide, fluorescein-TEYTIHWWK, is immobilized on chitosan via a linker.
  • FIG. 5 is a graph showing experimental results in Example 1.
  • FIG. 6 is a graph showing the detection sensitivity of the biosensor according to Example 2.
  • FIG. 7 is a graph showing the detection sensitivity of the biosensor according to Example 3.
  • FIG. 8 is a graph showing the detection sensitivity of the biosensor according to Example 4.
  • FIG. 9 is a schematic view of a biosensor according to Example 4.
  • FIG. 10 is a graph showing the detection sensitivity of the biosensor according to Example 5.

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Description

明 細 書
バイオセンサ及びその製造方法並びに当該バイオセンサを用いた検出 方法
技術分野
[0001] 本発明は、タンパク質等の検出を行うバイオセンサに関し、より詳しくは、分子認識 物質であるペプチドがリンカ一を介して担持体上に固定されたバイオセンサに関する
〇
背景技術
[0002] 近年、分析時間の短縮化や操作の簡略化のために、認識対象物質と特異的に反 応する分子認識物質 (例えば、タンパク質やペプチド）を、マイクロチップの反応領域 に高密度に固定配置する技術が提案されている（例えば、非特許文献 1参照。）。
[0003] 非特許文献 1 :軽部征夫著 「バイオセンサ」シーエムシー出版 2002年
[0004] タンパク質は、さまざまな物質群と共存した生体内においては安定であるが、単離 された場合には、温度 ·湿度 ·ρΗ·酸素 *光*夾雑物質 ·汚れ ·腐敗等の影響によって 構造が変化したり、失活したりするおそれがある。また、タンパク質は、固体（チップ） 表面との接触の際に変性するおそれもある。さらに、認識対象物質を含むサンプル にプロテアーゼ等の酵素が存在すると、タンパク質が加水分解されてしまうおそれも ある。よって、これらの要因を全て排した装置を構成しょうとすると、装置全体が複雑 化するので機器トラブルの増大やコスト高を招く。さらに、単離されたタンパク質はそ れ自体が高価であるので、単離されたタンパク質を用いる上記技術は、バイオセンサ 装置のコスト上昇を招く。
[0005] 他方、ペプチドは、タンパク質のような複雑な 3次元構造をもたな!/、。よって、上記の ようにタンパク質が被る構造変化ゃ失活がないので、分子認識物質として有用である と考えられている。し力、しながら、ペプチドを直接チップ (基板等）に固定すると、ぺプ チドの自由運動が阻害され、分子認識能力を失ってしまう。このため、チップとぺプチ ドとの距離をある程度離した状態で両者をつなぐリンカ一が不可欠となる。
[0006] リンカ一を用いてペプチドをチップに固定する技術としては、特許文献 1の技術が ある。
[0007] 特許文献 1 :特表 2003— 536073号公報
[0008] 特許文献 1は、基板表面に安定に結合したアンカーセグメントと、ペプチド模倣タン パク質結合剤と、該アンカーセグメントおよび該ペプチド模倣セグメントを接続し、そ して分離するリンカ一セグメントと、を含むタンパク質結合剤に関する。この技術によ ると、失活のおそれの無レ、タンパク質結合剤を提供できるとされる。
[0009] しかしながら、特許文献 1にかかる技術は、
(1)ペプチド模倣タンパク質結合剤とリンカ一セグメントの結合、
(2)リンカ一セグメントとアンカーセグメントの結合、
(3)アンカーセグメントと基板との結合、
という 3つの複雑な工程を必要とするため、コスト高になるという問題がある。
[0010] 他方、特許文献 2には、リンカ一としてダルタルアルデヒド（GA)を用いる方法が提 案されている。
[0011] 特許文献 2 :特公昭 61— 8942号公報
[0012] 特許文献 2にかかる技術は、キトサンなどのアミノ基を有する固体に、ダルタルアル デヒドを介して抗体や酵素等のタンパク質を固定化する技術である。ダルタルアルデ ヒドはリンカ一として優れた反応性を有する力 S、一方で消毒薬としても広く用いられて いる化合物でもあり、タンパク質等を失活させる。また、ダルタルアルデヒドは柔軟性 を欠く物質であり、固定化に際して、タンパク質等を硬質化して、分子認識機能を損 なわせるおそれもある。
[0013] ところで、ペプチドを得るためには、天然のタンパク質を分解する方法や人工合成 する方法がある力 天然のタンパク質を分解するためには、先ず特定のタンパク質を 単離し、しかる後に分解する必要があり、天然ペプチドの入手には多大なコストが掛 かる。他方、人工合成する方法は、任意のペプチドをより安価に得ることができる力 検出対象であるタンパク質の分子認識部位以外のペプチドを用いても、 目的とする 分子を検出することができない。また、分子認識に不必要な部分を含むペプチドの 合成は、コスト上昇を招くのみで有益ではない。
[0014] それゆえ、 目的とする分子を検出するのに必要不可欠な最小単位のアミノ酸配歹 IJ ( ペプチド）を先ず特定し、これを天然タンパク質の分解によって得る力、、または人工合 成し、これを分子認識物質として用いるのが合理的である。特に上記必要不可欠な 最小単位のアミノ酸配列を含むペプチドを人工合成して用いるのが合理的である。 発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0015] 本発明は以上のような考えの下になされた発明である。本発明は分子認識性、保 存安定性、経済性に優れた使レ、勝手のょレ、バイオセンサを提供することを目的とす 課題を解決するための手段
[0016] 上記課題を解決するための第 1の発明に係るバイオセンサは、認識対象物質を捕 捉し検知するバイオセンサであって、分子認識物質であるペプチドと、 2以上の特定 官能基を有する炭化水素系化合物からなるリンカ一と、担持体と、を有し、前記ぺプ チドは前記リンカ一の 1つの特定官能基と直接結合し、前記担持体は前記ペプチドと 結合した当該リンカ一の他の 1つの特定官能基と直接結合していることを特徴とする
[0017] この構成によれば、分子認識物質としてペプチドを用いているため、構造安定性が 向上する。
[0018] また、前記ペプチドは前記リンカ一の 1つの特定官能基と直接結合し、前記担持体 は前記ペプチドと結合した当該リンカ一の他の 1つの特定官能基と直接結合している 。よって 4、上記特許文献 1のように複雑な反応工程を必要としない。
[0019] ここで、上記「ペプチド」には、 2以上のアミノ酸がペプチド結合したものは勿論、ぺ プチドを構成するアミノ酸の官能基が修飾されたものも含まれる。また、「特定官能基 」とは、エポキシ基と、エポキシ基と反応する官能基との反応により形成されたェポキ シ基由来の官能基を意味する。例えば、エポキシ基とペプチドのアミノ基とが反応し てアミノアノレコーノレ（R -CH (OH) -CH -NHR； Rはリンカ一のエポキシ以外の
1 2 2 1
構造を示し、 Rはペプチドのアミノ基以外の構造を示す）が生じた場合、 [ CH (OH )一 CH—]が特定官能基となる。なお、ペプチドとリンカ一との結合部位に存在する 特定官能基と、担持体とリンカ一との結合部位に存在する特定官能基が異なってい てもよい。
[0020] 上記構成において、前記特定官能基がエポキシ基とアミノ基との反応生成官能基 である、とすること力 Sでさる。
[0021] この構成によると、エポキシ基とアミノ基とが速やかに結合反応するので、バイオセ ンサの作製が容易である。この構成を実現するため、リンカ一分子（リンカ一の元とな る分子）としてエポキシ基を 2以上有するものを用い、ペプチドとして N末端のアミノ基 が修飾されていないものや、アミノ基を 2つ有するリジン、アルギニンを含むものを用 い、担持体としてアミノ基を有する化合物を用いることが好ましレ、。
[0022] 上記構成においては、前記特定官能基が 2つであり、且つ各々の特定官能基が前 記リンカ一の両末端にそれぞれ配置されている、構成を採用することができる。
[0023] この構成によると、リンカ一がペプチドの分子認識性に悪影響を及ぼすことが無い。
[0024] このようなリンカ一の特定官能基部分以外の構造としては、親水性や疎水性、両親 媒性を持つものであればよぐ好ましくは炭化水素系の構造を用いる。この構造内に は分枝構造を有していてもよぐ不飽和結合、環状構造や芳香族構造が含まれても よい。また、エーテル基、カルボキシル基、カルボニル基等の酸素を含む構造が含ま れていてもよい。中でも、「—〇— CH—CHR—； Rは水素原子又はアルキル基を示 す。」で示されるポリアルキレンオキサイド構造を有するものを用いると、適度な両親 媒性が得られるため、好ましい。
[0025] また、前記ペプチドとして、人工合成ペプチドを用いる、こと力 Sできる。人工合成ぺ プチドは、コストの低減および再現性の向上を図れる点で好まし!/、。
[0026] また、前記人工合成ペプチドは、抗体タンパク質の超可変領域のアミノ酸配列と同 一、アミノ酸の一部の官能基を修飾したもの、アミノ酸配列の C末端及び/又は N末 端に他のアミノ酸を付加したもの、またはアミノ酸配列の一部を変更したものである、 とすること力 Sでさる。
[0027] 抗体タンパク質の超可変領域内のアミノ酸配列は、抗原特異性が最も現れる部分 であるので、この部分のアミノ酸配列を用いると、抗原特異性の高いペプチドが得ら れる。よって、超可変領域のアミノ酸配列を用いると、 目的とする分子を検出するのに 不可欠なアミノ酸数を必要最小限にまで少なくすることができ、これにより分子認識物 質であるペプチドの人工合成に力、かるコストを低減させることができる。
[0028] この人工合成ペプチドは、抗体タンパク質の超可変領域のアミノ酸配列におけるァ ミノ酸の一部の官能基を修飾したもの、アミノ酸配列の C末端及び/又は N末端に他 のアミノ酸を付加したもの、またはアミノ酸配列の一部を変更したものや、これらを組 み合わせたものであってもよ!/、。
[0029] また、上記構成において、人工合成ペプチドの C末端側及び/又は N末端側のァ ミノ酸をシスティンとすることができる。
[0030] また、ペプチドとリンカ一との結合位置を C末端側に限定するために、前記人工合 成ペプチドの N末端のアミノ酸のァミノ基が修飾されており、且つ当該ペプチドの C末 端のアミノ酸が側鎖に第 1級ァミンを有するアミノ酸であり、当該 C末端のアミノ酸のァ ミノ基と前記特定官能基とが結合している、構成とすること力できる。また、ペプチド末 端以外のペプチドに側鎖に第 1級ァミンを有するアミノ酸が含まれる場合、このアミノ 酸の α—ァミノ基以外のアミノ基を修飾してもよい。
[0031] 上記側鎖に第 1級ァミンを有するアミノ酸としては、リジンを用いることが好ましい。
[0032] また、リンカ一の長さは、好ましくは 0. 5〜； ! Onmとし、より好ましくは 0. 8〜7· Onm とする。前記リンカ一の長さが過小であると、十分に担持体とペプチドを離間できず、 過大であるとリンカ一が折れ曲がってしまい、ペプチドの分子認識機能を損なうおそ れがあるカゝらである。
[0033] また、前記担持体上に固定された前記ペプチドが、 1種類である、とすること力 Sでき
[0034] この構成によると、 1種類の認識対象物質を確実に検出できる。
[0035] また、前記担持体上に固定された前記ペプチドが、ランダムに混在する 2種類以上 のペプチドである、とすること力 Sできる。
[0036] この構成によると、以下のような効果を奏する。例えば、認識対象物質に複数の認 識部位がある場合には、それぞれの認識部位に相当する複数種のペプチドを固定 することにより、複数種のペプチドが 1つの認識対象物質を捕捉でき、分子認識作用 をより強めること力 Sできる。また、サンプル中に、複数種の認識対象物質が含まれてい る可能性がある場合には、複数種の認識対象物質のいずれ力、 1つ以上が含まれて いるか、全く含まれていないかを、一回の分析操作で判別できる。
[0037] 上記構成において、前記担持体上に 1種類のペプチドが複数固定されてなる分子 認識領域 Aと、上記とは異なる 1種類のペプチドが複数固定されてなる分子認識領 域 Bと、が形成されている、構成とすること力 Sできる。
[0038] この構成によると、 2種の認識対象物質に対する分析を同時に行うことができる。こ の構成においては、 3以上の分子認識領域が形成されていてもよぐさらに、分子認 識領域 Aに 2種類以上のペプチドが固定され、分子認識領域 Bに分子認識領域 Aと は異なる 2種類以上のペプチドが固定されて!/、てもよ!/、。
[0039] 担持体としては、如何なる形状のものであってもよ!/、が、基板、固体粒子、膜、繊維
、ゲル等を用いることが使い勝手性がよい。しかし、通常、基板等自体の表面にェポ キシ基と結合する官能基を配することが難しい場合があり、この場合には、これらの表 面に、エポキシ基と結合する官能基を有する化合物の薄膜 (この薄膜が担持体となる
)を形成することが好ましい。
[0040] また、前記薄膜が、キトサンであり、その膜厚が 50〜400nmである、とすること力 Sで きる。
[0041] 上記課題を解決するための第 2の発明に力、かるバイオセンサの製造方法は、分子 認識物質であるペプチドと、両末端にエポキシ基を有する炭化水素系化合物からな るリンカ一分子と、を混合した液を、表面にエポキシ基と結合する官能基を有する担 持体と接触させて、前記ペプチドと前記リンカ一分子とを直接結合させ、前記リンカ 一分子と前記担持体とを直接結合させるステップを備えることを特徴とする。
[0042] この構成によると、上記 1つのステップで、ペプチドのァミノ基とリンカ一分子の一方 のエポキシ基とが結合反応し、担持体の官能基と当該リンカ一分子の他方のェポキ シ基とが結合反応するので、ペプチドとリンカ一分子とを直接固定でき、当該リンカ一 分子と担持体とを直接固定できる。よって、製造工程を簡略化できる。
[0043] ここで、エポキシ基と結合する官能基としては、求核性を持った化合物を用いること ができ、このような官能基としてアミノ基、水酸基等を用いることができる。
[0044] 上記構成において、前記混合液に含まれるペプチドの濃度が、 0. 001 -2. 0モル
/Lである、とすること力 Sでさる。 [0045] また、前記混合液に含まれるリンカ一分子の濃度が、 0. 001 -4. 0モル/ Lである とすること力 Sでさる。
[0046] また、前記リンカ一分子が、「G （O CH - CHR- ) O G ; Rは水素原子又
2 n
はアルキル基を示し、 Gはグリシジル基を示す。 nは 1以上の整数」で示されるポリ（モ ノ）アルキレンオキサイドジグリシジルエーテルであるとすることができる。
[0047] また、エポキシ基と結合する前記担持体表面の官能基が、アミノ基であるとすること ができる。
[0048] また、前記担持体は、キトサンを酸溶液に溶力もたキトサン溶液を基板、固体粒子、 繊維、又はゲルの表面に塗布し形成した薄膜であるとすることができる。
[0049] また、前記キトサン溶液の 25°Cでの粘度力 100〜； lOOOPa ' Sであるとすること力 S できる。
[0050] また、前記キトサン薄膜の膜厚力 S、 50〜400nmであるとすること力 Sできる。
[0051] 上記課題を解決するための第 3の発明に力、かる検出方法は、上記ペプチドを構成 するアミノ酸にシスティンが含まれるバイオセンサを用いた認識対象物質の検出方法 であって、前記ペプチドと認識対象物質とを反応させて、ペプチド 認識対象物質 複合体を形成する第 1ステップと、前記ペプチド 認識対象物質複合体と、蛍光物 質付き抗体材料とを反応させて、ペプチド 認識対象物質複合体 蛍光物質付き 抗体材料を形成する第 2ステップと、余剰な蛍光物質付き抗体材料を洗浄する第 3ス テツプと、前記蛍光物質の量を検出する第 4ステップと、金コロイドを添加し、前記ぺ プチドと金コロイドとを反応させる第 5ステップと、余剰な金コロイドと前記蛍光物質付 き抗体材料を洗浄する第 6ステップと、前記第 6ステップの後、再度前記蛍光物質の 量を検出する第 7ステップと、を備え、前記第 4ステップでの蛍光物質の量と前記第 7 ステップでの蛍光物質の量との差より前記認識対象物質の量を測定することを特徴と する。
[0052] タンパク質を検出する場合、バイオセンサを構成する基板等の表面に認識対象物 質であるタンパク質が非特異的吸着により吸着し、これによる検出信号も検出されて しまうため、正確なタンパク質量を測定できない。しかし、上記方法を用いると、第 4ス テツプでの発光量を計測した後、金コロイドを導入することにより、ペプチド 認識対 象物質複合体から認識対象物質が脱離し、代わりに金コロイドとシスティンとが反応 する。このため、ペプチド 認識対象物質複合体の量の分だけ発光が減少する。よ つて、この発光の減少量を正確なタンパク質の量として検出できる。
[0053] 上記課題を解決するための第 4の発明にかかる検出方法は、上記バイオセンサを 用いた認識対象物質の検出方法であって、前記ペプチドと認識対象物質とを反応さ せて、ペプチド 認識対象物質複合体を形成する第 1ステップと、前記ペプチドー認 識対象物質複合体と、システィンが末端に付加されたペプチドとを反応させて、ぺプ チドー認識対象物質複合体 システィン付加ぺプチドを形成する第 2ステップと、余 剰なシスティン含有抗体材料を洗浄する第 3ステップと、金コロイドを添加し、前記シ スティンと金コロイドとを反応させる第 4ステップと、余剰な金コロイドを洗浄する第 5ス テツプと、前記第 6ステップの後、金コロイドの発色量を検出する第 6ステップと、を備 えることを特 ί毁とする。
[0054] この方法によっても、認識対象物質の量を精度よく検出できる。
[0055] 上記課題を解決するための第 5の本発明に力、かるバイオセンサは、特定分子を捕 捉する分子捕捉物質としてのペプチドと、前記ペプチドを担持する担持体と、前記ぺ プチドと前記担持体とを繋ぐリンカ一と、を有し、前記ペプチドが生体の免疫グロプリ ンとは構造の異なる人工合成ペプチドであり、前記リンカ一が少なくとも 2つの反応性 官能基を有する炭化水素系化合物であり、前記リンカ一の 1つの反応性官能基に前 記人工合成ペプチドが直接結合し、当該反応性官能基以外の他の反応性官能基に 前記担持体が結合して!/、ることを特徴とする。
[0056] この構成によれば、分子捕捉物質として天然の免疫グロブリンとは構造が異なる人 工合成ペプチドを用いているため、天然の免疫グロブリンまたは天然の免疫グロブリ ン由来のペプチドをそのまま用いるよりも物理的 ·化学的安定性を向上させることが できるとともに、センサの作製コストを低減させることができる。
[0057] また、前記ペプチドは前記リンカ一の 1つの反応性官能基と直接結合し、前記担持 体は前記ペプチドと結合した当該リンカ一の他の 1つの反応性官能基と直接結合し た構造であるので、構造安定性に優れるとともに、この構造ではリンカ一を介してぺ プチドが外方に突き出た状態になるので、特定分子に対する捕捉効率が高い。 [0058] ここで、「生体の免疫グロブリンとは構造の異なる人工合成ペプチド」とは、生体の 免疫タンパク質の全部または一部と完全同一でないことを意味する。すなわち、生体 の免疫タンパク質の全部または一部のアミノ酸配列に異なるアミノ酸が付加されてい たり、免疫タンパク質の全部または一部のアミノ酸配列が変更されたりするものを意味 する。
[0059] 上記構成にお!/、て、前記人工合成ペプチドは、天然免疫グロブリンのアミノ酸配列 のうち、その超可変領域に該当する部分に存在する連続する 3つ以上のアミノ酸配 列を含む、構成とすること力できる。
[0060] 免疫グロブリンの超可変領域のアミノ酸配列は、抗原特異性が最も現れる部分であ り、この部分のアミノ酸配列を用いると、抗原特異性の高い（特定分子の捕捉能力の 高い）ペプチドが得られる。この高い抗原特異性を得るためには、天然免疫グロプリ ンのアミノ酸配列のうち、少なくともその超可変領域に該当する部分に存在する連続 する 3つのアミノ酸配列を含ませることが好ましい。より好ましくは、連続する 5つ以上 のアミノ酸配列を含ませ、さらに好ましくは連続する 8つ以上のアミノ酸配列を含ませ
[0061] 免疫グロブリンの超可変領域の決定方法について説明する。
[0062] (1)先ずアミノ酸シークェンス（エドマン法）を行う抗体サンプルを決定する。このアミ ノ酸シークェンスは N末端から解析していくものだ力 S、タンパク質の中には N末端アミ ノ酸がブロックされているものがあり、アミノ酸シークェンスが行えない場合がある。そ のため、複数の抗体サンプルの中からブロックされていないものを選択する。
[0063] (2)数残基のアミノ酸シークェンスを行うと、 H鎖、 L鎖のアミノ酸に加え不純物とし て混入するアミノ酸が同時に検出される。このため、検出されたアミノ酸を、 H鎖の構 成要素、 L鎖の構成要素、不純物の 3種類に分ける。
[0064] (3)同一種由来の抗体の基本構造は同じであることが知られており、既知の抗体の H鎖アミノ酸配列を遺伝子データベース（例えば、 GenBank (http：〃 www.genome.jp / dbget—bm/wwwttbfmc^genbank—today) )や KMBL (nttp:// www. genome.jp/ dbget_bi n/www#bfind?emb卜 today) )から全てピックアップし、対象とする抗体種類（サブタイプ )に関するアミノ酸配列について相同比較する。上記（2)で分析したアミノ酸と合致す るアミノ酸配列があれば、その抗体はブロックされていない H鎖をもつことになる。 L鎖 も同様に行い、ブロックの有無を判断する。これにより、アミノ酸シークェンスを行う抗 体サンプルを決定する。
[0065] (4)上記（3)で決定された抗体サンプルを用いて、既知の抗体の超可変領域を含 むよう再度アミノ酸シークェンスを行う。
[0066] (5) EMBLや GenBankなどの遺伝子データベースに収録されている抗体の H鎖 遺伝子配列情報に基づくアミノ酸配列を少なくとも 5以上、好ましくは全てを拾い出し 、それらに対して相同性比較を行う。既知の抗体の超可変領域に当たる配列箇所（ 一般的には、免疫グロブリン分子の H鎖および L鎖の N末端から数えて、およそ 20〜 40番目、 50〜70番目、 80〜； 120番目のアミノ酸）であって、力、つ以下の式で示され る変化率が 20以上の領域を超可変領域と決定する。
[0067] [数 1] レ — ' ' f D', ^し . ™は\:ί i- (！ノヽ.す S. f ' / Ύノ - ,·：· /*■酴び') その位置の最も一般的なァミノ酸の頻度
[0068] 上記構成において、前記 3つ以上のアミノ酸配列を構成するアミノ酸の官能基の一 部が他の官能基で修飾されている、構成とすることができる。
[0069] ペプチドを構成するアミノ酸には、反応性に富んだ官能基を有するものがあり、この 官能基をそのままの状態で用いると、この官能基が特定分子以外と反応して、ぺプ チドの特定分子捕捉能力を失わせるおそれがある。よって、このような官能基を他の 官能基で修飾しておくことが好ましレ、。
[0070] 上記構成において、天然免疫グロブリンの超可変領域を組成する連続する 4つの アミノ酸からなるアミノ酸配列で、当該アミノ酸配列を構成するアミノ酸の 3つがイソ口 イシン、フエニノレアラニン、バリン、ロイシン、メチォニン、トリプトファン、ァラニン、グリ シン、システィン、チロシンからなる群から選択される疎水性アミノ酸であり、他の一つ が前記疎水性アミノ酸以外のアミノ酸である配列を疎水性型アミノ酸配列とするとき、 前記人工合成ペプチドは、前記疎水性型アミノ酸配列中の疎水性アミノ酸以外のァ ミノ酸が疎水性アミノ酸で置換されてなる合成疎水性アミノ酸配列ユニットを含んでな るあのである構成とすること力 Sでさる。
[0071] 天然免疫グロブリンの超可変領域を組成する連続する 4つのアミノ酸からなり、かつ 当該アミノ酸のうち 3つが疎水性であり、他の一つが非疎水性であるアミノ酸配列であ る場合、非疎水性アミノ酸を疎水性アミノ酸に変更することにより、特定分子の捕捉能 力を高めることができる。なお、超可変領域を組成する連続する 4つのアミノ酸の選定 の仕方は任意である。
[0072] 上記構成において、前記合成疎水アミノ酸ユニットを構成するアミノ酸の官能基の 一部が他の官能基で修飾されていることを構成とすることができる。
[0073] ペプチドを構成するアミノ酸には、反応性に富んだ官能基を有するものがあり、この 官能基をそのままの状態で用いると、この官能基が特定分子以外と反応して、ぺプ チドの特定分子捕捉能力を失わせるおそれがある。よって、このような官能基を他の 官能基で修飾しておくことが好ましレ、。
[0074] 上記構成において、天然免疫グロブリンの超可変領域を組成する連続する 4つの アミノ酸からなるアミノ酸配列で、当該アミノ酸配列を構成するアミノ酸の 3つがヒスチ ジン、グノレタミン酸、ァスパラギン酸、グノレタミン、ァスパラギン、リジン、アルギニン、プ 口リン、スレオニン、セリンからなる群より選択される親水性アミノ酸であり、他の一つが 前記親水性アミノ酸以外のアミノ酸である配列を親水性型アミノ酸配列とするとき、前 記人工合成ペプチドは、前記親水性型アミノ酸配列に含まれる親水性アミノ酸以外 のアミノ酸が親水性アミノ酸で置換されてなる合成親水性アミノ酸配列ユニットを含ん でなるものである、構成とすること力 Sできる。
[0075] 天然免疫グロブリンの超可変領域を組成する連続する 4つのアミノ酸からなり、かつ 当該アミノ酸のうち 3つが親水性であり、他の一つが非親水性であるアミノ酸配列であ る場合、非親水性アミノ酸を親水性アミノ酸に変更することにより、特定分子の捕捉能 力が高まる。上記構成における「連続する 4つのアミノ酸」は、超可変領域内にあるこ とが要件である力 予め特定されるものではない。超可変領域内から任意に選定され た「連続する 4つのアミノ酸」を意味する。
[0076] 上記構成においては、前記合成親水アミノ酸ユニットを構成するアミノ酸の官能基 の一部が他の官能基で修飾されている、構成とすることができる。 [0077] ペプチドを構成するアミノ酸には、反応性に富んだ官能基を有するものがあり、この 官能基をそのままの状態で用いると、この官能基が特定分子以外と反応して、ぺプ チドの特定分子捕捉能力を失わせるおそれがある。よって、好ましくはこのような官能 基を他の官能基で修飾しておくのがよい。
[0078] 上記構成において、前記人工合成ペプチドの N末端のアミノ酸と前記リンカ一とが 結合している、構成とすることができる。
[0079] ペプチドの N末端のアミノ酸には、他の官能基と反応していない α—ァミノ基があり 、この α—ァミノ基とリンカ一分子とを結合させることにより、リンカ一とペプチドを直接 結合させること力 Sでさる。
[0080] 上記構成において、前記人工合成ペプチドの Ν末端のアミノ酸が、側鎖に第 1級ァ ミンを有するアミノ酸であり、前記 Ν末端のアミノ酸の α —アミノ基が修飾されており、 前記人工合成ペプチドの Ν末端のアミノ酸と前記リンカ一とが結合して!/、る、構成と すること力 Sでさる。
[0081] この構成を採用すると、人工合成ペプチドの Ν末端のアミノ酸の α—ァミノ基が修 飾されて反応性をなくしている力 Ν末端のアミノ酸が第 1級ァミンを有するため、この アミノ酸の側鎖の第 1級ァミンとリンカ一分子とを結合させることにより、リンカ一とぺプ チド'を直接結合させること力できる。
[0082] 上記側鎖に第 1級ァミンを有するアミノ酸としては、リジンを用いることが好ましい。
[0083] また、ァミノ基の修飾には、ァセチル基を用いることが好ましい。
[0084] これらの構成において、前記リンカ一の長さが、 2. 0〜6. Onmである構成とするこ と力 Sできる。
[0085] リンカ一をペプチドの N末端のアミノ酸と結合させた場合、リンカ一の長さか短すぎ たり、長すぎたりすると、特定分子の捕捉能力が低下するので、上記長さとするのが 好ましい。この原因としては、リンカ一の長さが短すぎると、ペプチドの立ち上がりが 悪ぐまたリンカ一の長さが長すぎたりすると、ペプチドの先端側が担持体に対して寝 るように配置されるため、 目的分子と会合しに《なるためであると推察される。
[0086] 上記構成において、前記人工合成ペプチドの N末端のアミノ酸のァミノ基が修飾さ れており、当該人工合成ペプチドの C末端のアミノ酸力 側鎖に第 1級ァミンを有する アミノ酸であり、前記人工合成ペプチドの C末端のアミノ酸と前記リンカ一とが結合し ている、構成とすること力でさる。
[0087] この構成を採用すると、人工合成ペプチドの N末端のアミノ酸のァミノ基が修飾され て反応性をなくしているが、 C末端のアミノ酸が側鎖に第 1級ァミンを有するため、こ のアミノ酸の側鎖の第 1級ァミンとリンカ一分子とを結合させることにより、リンカ一とぺ プチドを直接結合させることができる。
[0088] 側鎖に第 1級ァミンを有するアミノ酸としては、リジンを用いることが好ましい。
[0089] この構成において、前記リンカ一の長さが、 0. 5〜； 1. 5nmである構成とすることが できる。
[0090] リンカ一をペプチドの C末端のアミノ酸と結合させた場合、理由は定かではないが、 リンカ一の長さが長くなると特定分子の捕捉能力が低下する。これは、リンカ一をぺプ チドの C末端のアミノ酸と結合させた場合には、リンカ一の長さが長くなると、ペプチド が担持体に対して寝るように配置し、特定分子と会合しに《なるためであると推察さ れる。
[0091] 上記構成において、前記人工合成ペプチドの N末端のアミノ酸の α—ァミノ基が修 飾されておらず、当該人工合成ペプチドの C末端のアミノ酸力 側鎖に第 1級ァミンを 有するアミノ酸であり、前記人工合成ペプチドの Ν末端のアミノ酸が一つのリンカ一と 結合し、前記人工合成ペプチドの C末端のアミノ酸と他の一つのリンカ一とが結合し てレヽる構成とすること力 Sできる。
[0092] この構成では、ペプチドの Ν末端のアミノ酸及び C末端のアミノ酸力、それぞれ異な るリンカ一と結合されている力 このように 2つのリンカ一と N末端のアミノ酸及び C末 端のアミノ酸とを結合させると、ペプチドが特定分子と会合しやすい状態に配置され るようになるため、特定分子の捕捉能力が増大する。
[0093] 上記構成において、前記人工合成ペプチドの N末端のアミノ酸が、側鎖に第 1級ァ ミンを有するアミノ酸であり、前記人工合成ペプチドの C末端のアミノ酸がリジン又は アルギニンであり、前記 N末端のアミノ酸の α—ァミノ基が修飾されており、前記人工 合成ペプチドの Ν末端のアミノ酸が一つのリンカ一と結合し、前記人工合成ペプチド の C末端のアミノ酸と他の一つのリンカ一とが結合している構成とすることができる。 [0094] この構成によっても、ペプチドが特定分子と会合しやすい状態に配置されるように なるため、特定分子の捕捉能力が増大する。
[0095] 側鎖に第 1級ァミンを有するアミノ酸としては、リジンを用いることが好ましい。
[0096] これらの構成において、前記リンカ一の長さ力 0. 5〜10nmである構成とすること ができる。
[0097] ペプチドの N末端のアミノ酸と一つのリンカ一とを結合させ、ペプチドの C末端のァ ミノ酸と他の一つのリンカ一とを結合させた場合、理由は定かではないが、特定分子 の捕捉能力は、リンカ一の長さによる影響を受けない。これは、このようにリンカ一とぺ プチドとを結合させた場合には、ペプチドが担持体に対して寝るように配置しないた め、特定分子と会合しやすいためであると推察される。ただし、リンカ一の長さを 0. 5 nm未満とすることは、技術上困難であり、リンカ一の長さを 10nmよりも大きくすると、 コスト高となる。よって、上記範囲内に規制することが好ましい。
[0098] 上記構成において、前記リンカ一の反応性官能基と前記人工合成ペプチドとの結 合力 S、エポキシ基とアミノ基との反応により生じたものである構成とすることができる。
[0099] 上記構成において、前記リンカ一の反応性官能基と前記担持体との結合が、ェポ キシ基とアミノ基との反応により生じたものである構成とすることができる。
[0100] この構成によると、エポキシ基とアミノ基とが速やかに結合反応するので、バイオセ ンサの作製が容易となる。この構成を実現するため、リンカ一分子（リンカ一の元とな る分子）としてエポキシ基を 2以上有するものを用い、 N末端の α—アミノ基が修飾さ れてレ、なレ、ペプチドや、側鎖に第 1級ァミンを有するアミノ酸を含むペプチドを用い、 担持体として表面にアミノ基を有する化合物を用いることが好ましい。
[0101] 上記構成において、前記リンカ一が、「一 Ο— CH -CHR-； Rは水素原子又はァ
2
ルキル基を示す」で示されるアルキレンオキサイド構造を有する構成とすること力 適 度な両親媒性が得られるため好ましい。
[0102] 上記構成にお!/、て、前記人工合成ペプチドは、天然免疫グロブリンの超可変領域 内の連続する 4つのアミノ酸配列であって、イソロイシン、フエ二ルァラニン、ノ リン、口 イシン、メチォニン、トリプトファン、ァラニン、グリシン、システィン、チロシンからなる群 から選択される疎水性アミノ酸が 4つ連続して配列された天然疎水性アミノ酸配列ュ ニットを含む構成とすることができる。
[0103] この構成によると、天然疎水性アミノ酸ユニットが特定分子に対して高い認識力を 有するため、特定分子を捕捉する能力が向上する。
[0104] 上記構成にお!/、て、前記人工合成ペプチドは、天然免疫グロブリンの超可変領域 内の連続する 4つのアミノ酸配列であり、ヒスチジン、グルタミン酸、ァスパラギン酸、 グルタミン、ァスパラギン、リジン、アルギニン、プロリン、スレオニン、セリンからなる群 から選択される親水性アミノ酸が 4つ連続して配列された天然親水性アミノ酸配列ュ ニットを含む構成とすることができる。
[0105] この構成によると、天然親水性アミノ酸ユニットが特定分子に対して高い認識力を 有するため、特定分子を捕捉する能力が向上する。
発明の効果
[0106] 以上説明したように、本発明によると、構造安定性が高く分子認識性に優れたバイ ォセンサを低コストで実現できる。
発明を実施するための最良の形態
[0107] 以下、本発明の実施の形態について説明する。
[0108] 本実施の形態にかかるバイオセンサは、図 1に示すように、分子認識物質であるぺ プチド 1と、ペプチドを担持する担持体 2と、ペプチド 1と担持体 2とを繋ぐリンカ一 3と 、を有する。
[0109] 本実施の形態で用いるペプチドは、複数のアミノ酸がペプチド結合してなるぺプチ ドであり、天然物由来のものであってもよぐ人工合成されたものでもよいが、コストや 再現性の観点から、人工合成ペプチドを用いることが好ましい。人工合成ペプチドの 場合、免疫グロブリンの超可変領域のアミノ酸配列を解析した後に、その超可変領域 に含まれる連続した 3つ以上のアミノ酸配列を含むペプチドを用いることが好ましい。
[0110] ここで、免疫グロブリンの超可変領域のアミノ酸配列は、抗原特異性が最も現れる 部位である。よって、この免疫グロブリンの超可変領域のアミノ酸配列に含まれる連続 した 3つ以上のアミノ酸配列含むペプチドを用いることにより、分子認識力の高いぺ プチドを必要最小限のアミノ酸数で実現することができ、これによりペプチド人工合成 のコストを低減できる。分子認識力をより高めるためには、好ましくは、免疫グロブリン の超可変領域のアミノ酸配列に含まれる連続した 5つ以上のアミノ酸配列含むぺプ チドを用い、さらに好ましくは、免疫グロブリンの超可変領域のアミノ酸配列に含まれ る連続した 8つ以上のアミノ酸配列含むペプチドを用いる。
[0111] 超過変領域に含まれる連続した 3つ以上のアミノ酸配列を含むペプチドは、分子認 識力の向上やリンカ一との固定化を容易にするために、その本来の配列が一部変更 されてもよく、 C末端及び/又は N末端に他のアミノ酸が付加されてもよいし、ぺプチ ドを構成するアミノ酸の有する一部の官能基が修飾されて！/、てもよレ、。
[0112] なお、超可変領域のアミノ酸の配列数は、一般に 10個程度と言われているが、分 子認識を行うペプチドとして機能させるために、人工合成ペプチドのアミノ酸配列数 は、超可変領域のアミノ酸の配列の連続した 3個以上のアミノ酸を含ませることが好ま しぐより好ましくは 5個以上含ませ、さらに好ましくは 8個以上含ませる。
[0113] また、人工合成ペプチドのアミノ酸配列数は、好ましくは 3〜30個程度とし、より好ま しくは 4〜； 16個程度とする。アミノ酸配列数が多くなると、それだけ合成コストが上昇 するので、アミノ酸配列数は、分子補足機能を発揮できる必要最小が好ましい。
[0114] 次に超可変領域のアミノ酸配列の変更例について説明する。例えば、アミノ酸配列 中にイソロイシン（I)—ヒスチジン（H)—トリプトファン (W)—トリプトファン (W)の配列 があった場合、ヒスチジン (H)をトリブトファン (W)に変更すると、疎水性のアミノ酸が 4個連続するため、ペプチドの疎水性が向上するが、疎水性を向上させると、特定分 子の捕捉能力が高まることが期待できる。すなわち、天然免疫グロブリンの超可変領 域のアミノ酸配列と完全同一の人工合成ペプチドよりも、その一部のアミノ酸を疎水 性アミノ酸に置換した合成ペプチドの方が、特定分子に対する捕捉能力が高い場合 が多い。
[0115] また、例えばスレオニン（T) グルタミン酸（E)—チロシン (Y)—スレオニン (T)の 配列があった場合、チロシン (Y)をグルタミン酸 (E)に変更すれば、親水性のァミノ 酸が 4個連続するため、ペプチドの親水性が向上し、特定分子の捕捉能力が良くな ると予想、される。
[0116] また、例えばスレオニン（T)—イソロイシン（I)—グルタミン酸（E)—チロシン (Y)の 配列があった場合、イソロイシン (I)をグルタミン酸 (E)に変更すれば、水素結合を形 成するアミノ酸が 4個連続するため、ペプチドの水素結合性が向上し、特定分子の捕 捉能力が更に良くなると予想される。ここで、水素結合性のアミノ酸とは、セリン、スレ ォニン、チロシン、ァスパラギン酸、グルタミン酸である。
[0117] また、超可変領域のアミノ酸配列の C末端及び/又は N末端にシスティンを付加し て、他の素材への結合性を付与することもできる。また、超可変領域のアミノ酸配列 の N末端のアミノ酸のアミノ基を修飾し、且つ C末端に側鎖に第 1級ァミンを有するァ ミノ酸 (例えば、リジン）を付加することにより、ペプチドのリンカ一との結合部位をこの C末端のアミノ酸と限定できるので、ペプチドとリンカ一との結合により、分子認識を行 うアミノ酸配列部分の構造を変化させることを防止できる。
[0118] ここで、免疫グロブリンとしては、 IgG、 IgA、 IgE、 IgM、 IgY、 IgD等がある。例えば IgG抗体は、 H鎖と L鎖により構成され、 H鎖と L鎖それぞれに超可変領域が存在す る。解析される超可変領域は H鎖のみでも良いし、 L鎖だけでも良ぐまた H，L鎖両 方が解析されてもよい。
[0119] 解析に用いられる免疫グロブリンは、 IgGに限定されるものではなぐ IgA、 IgE、 Ig M、 IgYなどであっても良いし、遺伝子組み換え抗体（単鎖抗体など）やファージディ スプレーであっても良い。
[0120] 免疫グロブリンの超可変領域の決定方法は、前述と同様に行う。
[0121] 抗体製造方法としては、従来より用いられている方法を用いることができる。例えば マウス等の試験動物内にアレルゲンを投与し、生体内において抗体タンパク質を製 造させ、これを単離、精製する方法が用いる。
[0122] 抗体を産生させるアレルゲンは、花粉 (ブタクサ、スギ、カモガヤ、イタリアンライダラ ス、カナムダラ、ョモギ、イネ、コナラ、シラカンバ、テンサイ、ハンノキ、キヨゥチクトウ、 スズメノテツポゥ、ケンタッキー 31フェスタ、ヒメガマ、ハルジオン、イチゴ、バラ、リンゴ 、アカシア、イエローサノレタン、ャナギ、ウメ、ャマモモ、ナシ、コスモス、ピーマン、ブ ドウ、タリ、コゥャマキ、スズメノカタビラ、サクランポ、サクラ、ナデシコ、アフリカキンセ ンカ、ヒメスイノく、キク、除虫菊、クロマツ、了力マツ、カラムシ、ケャキ、タルミ、タンボ ポ、モモ、セィタカアキノキリンソゥ、イチヨウ、才才バヤシャブシ、ツバキ、スターチス、 アブラナ、グロリオサ、ミカン、ネズ、ウイキヨウ、ォリーブ、ィチイ、ォォバコ、マキ 以 上報告順)や、ハウスダスト (ネコ由来物、ゴキブリ由来物、ィヌ由来物、カビ由来物、 ダニ由来物、マウス由来物）、または食物（小麦、そば、卵、乳、落花生、あわび、い 力、、いくら、えび、オレンジ、力、に、キウイフルーツ、牛肉、くるみ、さけ、さば、大豆、鶏 肉、豚肉、まつたけ、もも、やまいも、りんご、ゼラチン 以上厚生労働省特定原材料 等）の全部もしくは一部を構成する物質であることが望ましいが、これに限るものでは ない。
[0123] また、 mRNAを用いて超可変領域を決定する方法も採用できる。この方法の手順 の一例は以下のとおりである。
[0124] (1)抗体産生細胞 (ハイブリドーマ）の培養調製する。
[0125] (2)細胞力、ら mRNAの回収 ·精製。
[0126] (3) cDNA合成。
[0127] (4)ライブラリ作製 (ファージライブラリ）。
[0128] (5)目的遺伝子のスクリーニング。
[0129] (6)目的遺伝子（抗体）の DNAプローブを用いたハイブリダィゼーシヨン等。
[0130] (7)分離した遺伝子のクローニング。
[0131] (8)大腸菌ベクターへの組換え。
[0132] (9)遺伝子配列分析操作。
[0133] (10)クローユングできたベクター調製 (配列分析のための铸型 DNA)。
[0134] (11)遺伝子配列操作のための PCR操作。
[0135] (12) DNAシーケンサー装置での分析。
[0136] (13) DNAシーケンサーでの分析結果の解析。
[0137] (14)確認のための抗体の N末端のアミノ酸配列分析。
[0138] (15)解析した DNA配列に基づくアミノ酸配列と、実際の抗体の N末端が一致する か確認。
[0139] リンカ一は、両末端に特定官能基 (反応性官能基)を有し、この特定官能基により ペプチドとリンカ一、及び当該リンカ一と担持体とが直接結合されている。このリンカ 一として、両末端にエポキシ基とアミノ基との反応生成物からなる特定官能基を有す る炭化水素系化合物を用いることが好ましい。例えば、親水性または疎水性もしくは 両親媒性の炭化水素系化合物の両末端に、エポキシ基を有するジグリシジルエーテ ルを持ったものをァミノ基と反応させてなるものを用いることができる。ジグリシジル構 造中のエポキシ基の一方が分子認識を行うペプチドのァミノ基と共有結合し、もう一 方のジグリシジル構造中のエポキシ基が担持体の官能基と共有結合して、ペプチド とリンカ一、当該リンカ一と担持体とがそれぞれ直接結合される。
[0140] 保水性の観点から、リンカ一分子は、ポリ（モノ）エチレングリコールジグリシジルェ 一テル（PEG— DE)が好ましい。 PEG— DEの構造を以下に表す。
[化 1]
Figure imgf000021_0001
[0141] ここで、 n= lのとき PEG— DEの全鎖長は 8· 3Α、 η = 2のときは 11. θΑ、 η = 4の ときは 16. 6Α、 η = 9のときは 30. 4 Α、 η= 13のときは 41. 4 Α、 η = 22のときは 66 . 2 Αとなる。
[0142] PEG— DEをリンカ一分子として用いれば、 PEGの鎖長に関わり無ぐ担持体ゃぺ プチドを硬化させず、且つ有害な作用も無いため、ペプチドを失活させる可能性をき わめて低くすることができる。
[0143] また、生体膜の厚さ、リボソームの脂質二分子膜の厚さ、 LB膜 (単分子累積膜)な どの厚さが 50A以下であれば、立体配置は直線状となり、 100A程度の長さになる と、折れ曲がり状態になることが知られている。
[0144] この知見を当てはめると、例えば、人工合成ペプチドが 34. OA (アミノ酸配列数が 10個）に 11. 0 A (n = 2)のリンカ一が結合すると、長さの和は 45· OAとなるので、 人工合成ペプチドとリンカ一が直線状に配置すると予想される。また、人工合成ぺプ チドが 7· 4 A (アミノ酸配列数が 2個）に 66· 2 A (n = 22)のリンカ一が結合すると、 長さの和は 73. 6Aとなるので、人工合成ペプチドとリンカ一が少し折れ曲がった状 態に配置すると予想される。さらに、人工合成ペプチドが 34. OA (アミノ酸配列数が 10個）に 66. 2 A (n = 22)のリンカ一が結合すると、長さの和は 100· 2 Aとなるので 、人工合成ペプチドとリンカ一が折れ曲がった状態で配置されると予想される。
[0145] ここで、前記リンカ一の長さが過小であると、十分に担持体とペプチドを離間できず 、過大であるとリンカ一が折れ曲力^すぎて、ペプチドの分子認識機能を損なうおそ れがある。よって、リンカ一の長さは、好ましくは 0· 5〜； 10nm (5〜； !OOA)とし、より 好ましくは 0. 8— 7. 0nm (8〜70A)とする。
[0146] 本発明で述べているペプチドを固定化する担持体は、エポキシ基と反応する官能 基を有するものであればよぐ担持体自体の形状や担持体を支持する支持体の形状 としては、基板、固体粒子、膜、繊維、ゲル等が好ましい。エポキシ基と反応する官能 基を有する担持体としては、エポキシ基との反応性が高い点で、アミノ基を有するも のがよぐ使い勝手がよいことから、キトサンが特に好適である。キトサンは、粒子とし ても、膜としても、ゲルとしても、溶液としても、リンカ一分子と結合させることが可能で ある。またリンカ一を介してペプチドと反応したキトサン溶液を、他の粒子、基板、繊 維などの表面に膜状に付着させて固定化してもよい。
[0147] キトサンを担持体として用い、基板等の表面にキトサン薄膜を形成するには、キトサ ンを酢酸や塩酸に溶解させ、この溶液に基板等を浸漬する方法を採用することがで きる。この際、キトサン溶液の濃度を 2. 5%程度とし、酸濃度を調整してその粘度を、 室温で、 100〜； lOOOmPa ' sとし、好ましくは 200〜500mPa ' sとする。
[0148] また、石英板、ガラス板、シリコン板などの基板や、繊維'パイプなどのような曲面体 をキトサンの酸水溶液に浸漬し、その表面に薄膜を形成する場合、その膜厚は 50〜 400nmとする。ただし、酸は上記に限定されず、キトサン溶液の濃度も 2. 5%に限 定されない。また、キトサン薄膜を形成するための基体も上記に限られず、膜厚も上 記範囲に限定されない。
[0149] リンカ一を介して人工合成ペプチドを担持体に固定化する方法としては、浸漬法が 最も簡便である。ただし、固定化方法は浸漬法に限定されるものではない。
[0150] 浸漬法により固定化を行う場合、浸漬液に含まれる人工合成ペプチドの濃度は、好 ましくは 0. 001— 2. 0モノレ/: Lとし、より好ましくは 0. 005—1. 0モノレ/: Lとする。ま た、浸漬液に含まれるリンカ一分子の濃度としては、好ましくは 0. 00；!〜 4. 0モル/ Lとし、より好ましくは 0. 008— 2. 0モノレ/： Lとする。
[0151] 人工合成ペプチドがリンカ一を介して担持体に固定化された態様は、担持体上に 固定された人工ペプチドが 1種類であってもよぐランダムに混在する 2種類以上であ つてもよい。また、担持体上に 1種類のペプチドが複数固定されてなる分子認識領域 Aと、上記とは異なる 1種類のペプチドが複数固定されてなる分子認識領域 Bと、が 形成されていてもよい。 3以上の分子認識領域が形成されていてもよぐ一つの分子 認識領域に複数のペプチドが固定されて!/、てもよレ、。
[0152] このバイオセンサには、光学的検出法、電気化学的検出法、機械的検出方法等の 公知の検出方法の全てが適用可能である。以下に酵素免疫定量法 (ELISA法）を 適用し光学的検出方法を用いた例について説明する。
[0153] [検出方法 1]
(バイオセンサの作製）
キトサン薄膜が表面に形成された ELISA法用プレートのゥエルに、両末端にェポキ シ基を有するリンカ一分子と人工合成ペプチドの混合溶液を滴下し、 4〜40°Cの任 意の温度で、数時間から数日の間放置して、バイオセンサを作製する。
[0154] (ブロッキング処理）
この後、当該リンカ一分子と当該ペプチドの混合溶液を緩衝液等を用いて洗浄し、 ブロッキング液（例えば、 BSA (ゥシ血清アルブミン）液）を添加し、 4〜40°Cの任意の 温度で、数時間から数日の間放置してブロッキング処理を行う。ブロッキング処理後、 界面活性剤入りリン酸緩衝液を用いて、ゥエルの洗浄を行う。
[0155] (ペプチド アレルゲン複合体形成反応）
次に、アレルゲンタンパク質と BSAとを含有するリン酸緩衝液を、 0、 1、 5、 10ng/ mLの濃度でゥエルに滴下し、 2時間室温で反応を行う。その後、上記と同じ方法でゥ エルの洗浄を行う。
[0156] (ペプチド アレルゲン 酵素標識抗体複合体形成反応）
人工合成ペプチドが固体化された ELISA法用プレートのゥエルに、ペルォキシダ ーゼ結合モノクローナル抗体と BSAとを含有するリン酸緩衝液を添加し、 37°Cで 1時 間放置する。この後、界面活性剤入りリン酸緩衝液を用いて、ゥエルの洗浄を行う。
[0157] (酵素反応）
ついで、ゥエルに酵素と反応して発色する基質を添加し、室温で 10分間、基質とぺ ノレォキシダーゼとの反応を行う。この後、酵素反応停止液を添加する。
[0158] (検出）
450nmの吸光度をプレートリーダーで計測する。
[0159] 他の光学的検知としては、以下の方法が例示できる。なお、バイオセンサの作製〜 ペプチド アレルゲン複合体形成反応までの各工程は、人工合成ペプチドにシステ インが含まれること以外は、上記検出方法 1と同様であるのでその説明を省略する。
[0160] [検出方法 2]
(ペプチド アレルゲン 蛍光標識抗体複合体形成反応）
人工合成ペプチドが固体化された ELISA法用プレートのゥエルに、蛍光色素標識 付きモノクローナル抗体と BSAとを含有するリン酸緩衝液を添加して、 37°Cで 1時間 放置する。この後、界面活性剤入りリン酸緩衝液を用いて、ゥエルの洗浄を行う。
[0161] (一次検出）
先ず 450nmの吸光度をプレートリーダーで計測する。
[0162] (二次検出）
金コロイドを添加し、放置 ·洗浄後に再びプレートリーダ一で 450nm吸光度を計測 する。
[0163] 通常、アレルゲンタンパク質は、非特異的吸着によって、ペプチド以外のプレート部 分に吸着し、これによる発色がノイズとなって検出される。しかし、この方法を用いると 、金コロイドがアレルゲンタンパク質よりも優先的にペプチドのシスティンに結合し、ぺ プチド—アレルゲンタンパク質複合体からアレルゲンタンパク質が脱離する。このた め、二次検出で検出される吸光度は、非特異的吸着由来の吸光度となる。よって、一 次検出と二次検出との差を求めることにより、真に認識反応が行われた量を測定する こと力 Sでさる。
[0164] もう 1つ別の光学的検知としては、以下の方法で執り行われるのが望ましいが、必ず しも以下の方法に限定されるものではない。なお、バイオセンサの作製〜ペプチド アレルゲン複合体形成反応までの各工程は、上記検出方法 1と同様であるのでその 説明を省略する。
[0165] [検出方法 3]
(ペプチド アレルゲン システィン含有ペプチド複合体形成反応）
人工合成ペプチドが固体化された ELISA法用プレートのゥエルに、システィン含有 ペプチドを含有するリン酸緩衝液を添加し、 37°Cで 1時間放置する。この後、界面活 性剤入りリン酸緩衝液を用いて、ゥエルの洗浄を行う。
[0166] (酵素反応）
ついで、ゥエルに金コロイドを添加し、室温で 10分間、金コロイドとシスティンとの反 応を行う。
[0167] (検出）
金コロイドによる赤色発色を計測する。
[0168] 機械的検知としては、以下の方法で執り行われるのが望ましいが、必ずしも以下の 方法に限定されるものではなレ、。
[0169] [検出方法 4]
既成のシリコンウェハーが短冊状に加工する。幅 lmm長さが 3mmの先端部分に 幅 5mm長さ 10mmの基部の二段構造になった短冊を作製する。先端部分と基部と の境界部分にピエゾ素子を接合し、基部の反対側を SUS304の冶具に固定する。
[0170] 先端部分にはキトサン薄膜を形成し、上記検出方法 1と同様にして人工合成ぺプ チドをキトサンに固定化する。
[0171] ピエゾ素子に 420KHzの共振周波数を与える。人工合成ペプチドがアレルゲンタ ンパク質と結合したときには、共振周波数が変化する。この周波数変化を基質特異 反応重量に変換することで、アレルゲンタンパクの量を検知することができる。
[0172] 電気化学的検知としては、以下の方法で執り行われるのが望ましいが、必ずしも以 下の方法に限定されるものではなレ、。
[0173] [検出方法 5]
5mm X 3mmのプラスチック基板の両端に 5mm X lmmの金電極もしくは白金電 極を施す。これら両端の電極からはそれぞれリードを付け、さらにプラスチック基板全 体にキトサン薄膜を形成する。上記検出方法 1と同様にして人工合成ペプチドをキト サンに固定化する。
[0174] プラスチック基板両端の電極には 1Hzから 1MHzの交流が任意にかけられ、人工 合成ペプチドがアレルゲンタンパク質と結合したときには交流インピーダンスが変化 する。この交流インピーダンス変化量より、アレルゲンタンパクの量を検知することが できる。
[0175] (実施例 1)
[花粉アレルゲン Cry— J1の超可変領域の解析]
日本スギ（Cryptomeria japonica)由来の Cry— Jlを認識する抗体は IgG抗体であり 、その H鎖の超可変領域の解析を行った。当該 IgG抗体はマウスモノクローナル抗体 (Anti Cryjl Mouse #013、生化学工業）を用いた。
[0176] (1)まず、上記材料から、アミノ酸シークェンス（エドマン法）を行う抗体サンプルを 決定するために、以下の実験を行った。
[0177] 通常、アミノ酸シークェンスは、 N末端から解析して!/、くものである力 タンパク質の 中には N末端アミノ酸がブロック (修飾）されているものがあり、 N末端アミノ酸がブロッ クされているとアミノ酸シークェンスが行えない場合がある。そのため、複数の抗体サ ンプルの中からブロックされていないものを選択するため、以下の試験を行った。
[0178] (2)当該 IgG抗体の超可変領域のアミノ酸配列を HPLCで分析を行った。数残基（ 本実施例は 6残基）のアミノ酸シークェンスを行うと、 H鎖、 L鎖のアミノ酸に加え不純 物として混入するアミノ酸が同時に検出された。このため、検出されたアミノ酸を、 H 鎖の構成要素、 L鎖の構成要素、不純物の 3種類に分けた。
[0179] (3)ここで、同一種（同一生物）由来の抗体の基本構造は同じであることから、既知 のマウスモノクローム抗体の H鎖アミノ酸配列の全てを遺伝子データベース（GenBa nk； http://www.genome.jp/ doget
-bin/www#bfind?genbank-today)の遺伝子情報から翻訳した配列）からピックアップし 、対象とする抗体種類（サブタイプ）に関するアミノ酸配列について相同比較した。こ こで、 （2)で分析したアミノ酸と合致するアミノ酸配列があれば、その抗体はブロックさ れていない H鎖をもつことになる。 L鎖も同様に行い、ブロックの有無を判断した。こ れにより、ブロックされていないアミノ酸配列を選定し、これをアミノ酸シークェンスを 行う抗体サンプルとした。
[0180] (4)この抗体サンプルを用いて、アミノ酸シークェンスを行った。
[0181] (5)既知の抗体の H鎖アミノ酸配列を全てピックアップし、対象とする抗体種類（サ ブタイプ）に関するアミノ酸配列について相同比較した。既知の抗体の超可変領域に 当たる配列箇所 (一般的には、免疫グロブリン分子の H鎖および L鎖の N端から数え て、およそ 20〜40番目、 50〜70番目、 80〜； 120番目のアミノ酸）で、力、つ（4)で分 析したアミノ酸配列に特異的な配列を # 013の超可変領域と決定した。この分析結 果を図 2に示す。この図において、「〜」は、相同性比較の対象のアミノ酸配列に対し て、相同なアミノ酸の配列位置を合わせる（ァライメント）ために各配列に入れるギヤッ プ (挿入 ·欠失)を示す。
[0182] その結果、 日本スギ（Cryptomeria japonica)由来の Cry— J1マウスモノクローナル 抗体 IgG (AntiCry— Jl Mouse #013生化学工業）の H鎖超可変領域のアミノ酸配列 は、 N末端から C末端に向かって TEYTIHWWと決定した。
[0183] [Cry— J1認識ペプチドの人工合成]
次の 2種類のペプチドを通常のペプチド合成装置にて人工合成した。
( 1 )フルォレセイン結合 TEYTIHWWK (フルォレセインは Tと結合した）
(2)ァセチル化ー TEYTIHWWK (ァセチル化は N末端の Tの α—ァミノ基のみ） なお、上記アミノ酸配列において、ペプチドとリンカ一との結合を、ペプチドの C末 端のアミノ酸とするために、超可変領域のアミノ酸配列の C末端にリジン (Κ)を加え、 Ν末端のアミノ酸のアミノ基を修飾し、反応性を消失させた。
[0184] [キトサン薄膜への合成ペプチドの固定化と構造推定]
フルォレセイン- TEYTIHWWKを用いてキトサン薄膜上への合成ペプチドの固定 化を行った。
片倉チッカリン製 CTFの 2. 5%キトサン酢酸水溶液を 10mL調製した。その 2mLを シリンジで分取し、 25mm X 25mmの石英板上に滴下した。その石英板を 3000rpm で 30秒間回転させた後、 80°Cで 1時間乾燥させた。このようなスピンキャスト法で作 製したキトサン膜は、厚みが 200nmの均質な膜であった。
[0185] 次に、フルォレセイン- TEYTIHWWKが 0. 34mmolとポリエチレンジグリシジルェ 一テル（デナコール EX-850 ナガセケムテックス）が 0· 34mmolと
が溶力、された水溶液 10mLを用意し、そこに上記のキトサン膜が塗膜された石英板を 浸漬した。浸漬時間は 18時間である。キトサン膜が塗膜された石英板の乾燥はタリ ーンベンチ中で 24時間行った。その後、蒸留水にキトサン膜が塗膜された石英板を 24時間浸漬し洗浄した。洗浄後の乾燥はクリーンベンチ中で 24時間行った。
[0186] この石英板に励起波長 495nmの光を照射し、蛍光を検出した。この結果を図 3に 示す。図 3からわかるように、 540nmの発光が確認できた。よって、上記の操作でフ ルォレセイン- TEYTIHWWK力 Sリンカ一を介してキトサン膜に固定化されたことがわ かった。
[0187] ここに、フルォレセイン- TEYTIHWWKとリンカ一分子であるデナコール EX-
850が結合した鎖状の構造体は、鎖の長さから考察してキトサン膜平面から立ち上 力つた状態で固定化されていると予想される。その予想図を図 4に示す。
[0188] [バイオセンサの作製と検出]
抗 Cry— J1抗体 H鎖超可変領域ペプチド（ァセチル化 TEYTIHWWK)と花粉ァレ ルゲンタンパク質（Cry— J1)との反応性を ELISA法にて調べた。実験方法は以下の ようにまとめることができる。
[0189] (1)ペプチドの固定
アミノ基結合プレート（MS— 3608F、住友ベークライト社製）のゥエルに、ァセチル 化- TEYTIHWWKO. 095mg/mL、ポリエチレンジグリシジルエーテル 0· 018mg /mLの液を 200 L添カロし、 4°Cでー晚静置した。
[0190] (2)ブロッキング処理
ペプチド液を取り出し、ブロッキングワン（ナカライテスタ社製）を 200 L添加し 4°C でブロッキング処理を実施した。
[0191] (3)ゥエルの洗浄
ブロッキング処理後、ブロッキング液を取り出し、 0. 05%Tween20含有 P BSを用いてゥエルの洗浄を行った。洗浄は 0· 05%Tween20含有 PBS (20mMリ ン酸ナトリウム pH7. 4 0· 15MNaCl)を 200〃しウエノレに添カロ、取り出しの操作を 3回実施した。
[0192] (4)花粉アレルゲン Cry— J1の添加
花粉アレルゲン Cry— J1 (生化学工業社製)を、 0· 1 %BSA含有 PBSを用いて 0、 1 、 5、 10ng/mLに希釈し、ゥエルに 100 Lずつ添加した。添加後室温で 2時間静 置した。
[0193] (5)ゥエルの洗浄
Cry— J1溶液を取り出し（3)と同様にしてゥエルの洗浄を行った。
[0194] (6)ペルォキシダーゼ結合抗 Cry— J1モノクローナル抗体の添加
ペルォキシダーゼ結合抗 Cry— J1モノクローナル抗体（生化学工業社製）を 0· 1 % BSA含有 PBSで 1000倍に希釈した溶液を 100 Lずつゥエルに添加し、 37°C、 1 時間静置した。
[0195] (7)ゥエルの洗浄
ペルォキシダーゼ結合抗 Cry— J1モノクローナル抗体を取り出し、（3)と同じように ゥエルの洗浄を行った。
[0196] (8)発色
ゥエルに発色液（ナカライテスタ社製）を 100 L添加し、室温で 10分間反応を実施 した。 10分後停止液を 100 L添加し、 450nmの吸光度をプレートリーダー（バイオ ラッド社製）にて測定した。
[0197] この結果を図 5に示す。すなわち、花粉アレルゲンタンパク質（Cry— J1)は濃度に 依存して当該ペプチドに捕捉され、検出できることがわ力、つた。
[0198] (実施例 2)
リンカ一の長さがバイオセンサの検出感度に与える影響を調べるために、以下の実 験を行った。人工合成 CRY—J1認識ペプチドであるァセチルー NH—TEYTIHW WK— COOH (SHl)の 5 g/mL水溶液と、ポリ（モノ）エチレングリコールジグリシ ジルエーテル（PEG— DG)が 45 Mの炭酸水素ナトリウム緩衝溶液（pH = 9)を混 合し固相反応を行った。
[0199] リンカ一分子としての PEG— DG (ポリ（モノ）エチレングリコールジグリシジルエーテ ノレ）は鎖長の異なる 6種類を選んだ。すなわちサンプル 1 :鎖長 8 · 3A、重合度 n = l 、サンプル 2 :鎖長 1 1. 0A、重合度 n = 2、サンプル 3 :鎖長 16. 6 A、重合度 n = 4、 サンプル 4 :鎖長 30. 4A、重合度 n = 9、サンプル 5 :鎖長 41. 4A、重合度 n= 13、 サンプル 6 :鎖長 66. 2A、重合度 n = 22である。 PEG— DGはナガセケムテックス株 式会社製デナコール EXシリーズより選んだ。
[0200] 固相反応は、アミノ化 96穴 ELISA法用プレート（住友ベークライト製、スミロン MS — 3608F)を固相に用い、室温で 24時間にて完了した。
[0201] 次に、 ELISA法用プレートの 96穴の各々に 100 μ Lの蒸留水を充填し、洗浄を 3 回 fiつた。
[0202] ブロッキングはナカライテスタ社製ブロッキングワンを用い、反応は室温で行!/、時間 は 24時間で終了した。
[0203] 界面活性剤 0. l %TWeen25含有リン酸緩衝液（pH = 7)用いて、余剰ブロッキン グ斉 Uの洗净を 3回 fiつた。
[0204] ァセチルー NH— TEYTIHWWK— COOHは蒸留水で希釈し、濃度が 0 g/m レ 0. 2 μ g/ ITLL、 0. 5 μ g/ mL 1. 0 μ g/ mL 2. 0 μ g mL 5. 0 μ g mL のものを用意した。
[0205] 長さの異なるリンカ一分子それぞれに、ァセチルー NH—TEYTIHWWK— COO
H希釈液 0 μ g/mL、 0. 2 μ g/mL、 0. 5 ^ g/mL、 1. 0 ^ g/mL、 2. 0 μ g/m
L、 5. 0 g/mLを 50 μ Lずつ滴下して、リンカ一とペプチドとの結合を行った。
[0206] リンカ一と反応しなかったァセチルー NH—TEYTIHWWK— COOHは、界面活 性剤 0. 1 %Tween25含有リン酸緩衝液（pH = 7)で 3回洗浄を行った。
[0207] 二次抗体である抗スギ花粉抗原 Cry— J1 HRP (HorseRadish Peroxidase) ( 生化学工業）を 0. l%TWeen20含有リン酸緩衝液で 1000倍希釈して調製し、その 調製液を 100 L添加し、室温 1時間反応した。
[0208] 反応しなかった二次抗体 (抗 -スギ花粉抗原 Cry— J1 HRP)は、界面活性剤 0· 1
%Tween25含有リン酸緩衝液（pH = 7)を用いて、 3回洗浄を行った。
[0209] 発色液は ELISA POD基質 TMBキット（ナカライテスタ社）を用いて発色反応を室 温で実施した。基質液を 100 L添加してから 30分後に反応後停止液を 100 L添 加し、 450nmの吸光度を測定した。
[0210] 横軸をポリ（モノ）エチレングリコールジグリシジルエーテル（PEG— DG)リンカ一長 さ（オングストローム単位）とし、縦軸を吸高度の傾きを検出効率と記述してグラフにし たものを図 6に示す。
[0211] ポリ（モノ）エチレングリコールジグリシジルエーテル（PEG— DG)の鎖長が異なる 6 種類；（1 )鎖長 8. 3A、重合度 n = l (2)鎖長 1 1. O A、重合度 n = 2 (3)鎖長 16. 6 A、重合度 n = 4 (4)鎖長 30. 4 A、重合度 n = 9 (5)鎖長 41. 4 A、重合度 n = 13 (6 )鎖長 66 · 2 A、重合度 n = 22のそれぞれについて、抗原 Cryj lの濃度が 0〃 g/m L、 0. 2 μ g/ mL、 0. 5 ^ g/ mL、 1. 0 μ g/ mL、 2. 0 μ g/ mLにお る 450nm の吸光度の傾きは、いずれも直線となった。
[0212] 図 6から明らかなように、リンカ一長さが 15 A以下のもの（重合度 nが 1又は 2のもの )に人工合成ペプチドであるァセチルー NH—TEYTIHWWK— COOHを結合させ たものの Cry— J1に対する検出効率は、リンカ一長さが 16. 6 A以上のもの（重合度 nが 4以上のもの）に人工合成ペプチドを結合させたものよりも高くなることが分力、つた 。この理由は、リンカ一が短ければ、ペプチドのアミノ酸配列が基板に対して比較的 直立した形で存在し、 Cry— J1と会合しやすい状態にあるのに対し、リンカ一が長く なるにつれて、ペプチドが基板に対して寝るように配置し、 Cry— J1と会合しに《な るためと考えられる。
[0213] このこと力、ら、人工合成ペプチドの C末端のアミノ酸にリンカ一を結合した場合には
、リンカ一長さが 1. 5nm (15A)以下であることが好ましいことがわかる。
[0214] (実施例 3)
上記実施例 2とは逆に、ペプチドの N末端にリンカ一を結合させた場合に、リンカ一 の長さが検出感度に与える影響を調べた。このために、ァセチルー NH— KTEYTI HWW— COOH (SH2)を合成した。ァセチル化は、リジン（K)の α —ァミノ基のみ であり、リジンの側鎖のァミノ基とリンカ一とが結合している。
[0215] 固相化反応は、抗 Cry— J1抗体 Η鎖超可変領域ペプチドであるァセチルー ΝΗ— KTEYTIHWW— COOHの 5 g/mL水溶液と、ポリ（モノ）エチレングリコールジ グリシジルエーテル（PEG— DG)が 45 Mの炭酸水素ナトリウム緩衝溶液（pH = 9) を混合して行った。
[0216] ポリ（モノ）エチレングリコールジグリシジルエーテル（PEG— DG)は鎖長の異なる 6 種類を選んだ。すなわち、（1 )鎖長 8. 3A、重合度 n= 1 (2)鎖長 1 1 . θΑ、重合度 n = 2 (3)鎖長 16. 6 A、重合度 n = 4 (4)鎖長 30. 4A、重合度 n = 9 (5)鎖長 41. 4A 、重合度 n= 13 (6)鎖長 66. 2A、重合度 n = 22である。 PEG— DGはナガセケムテ ックス株式会社製デナコール EXシリーズより選んだ。
[0217] 固相反応は、アミノ化 96穴 ELISA法用プレート（住友ベークライト製、スミロン MS — 3608F)を固相に用い、室温で 24時間にて完了した。
[0218] 次に、 ELISA法用プレートの 96穴の各々に 100 μ Lの蒸留水を充填し、洗浄を 3 回 fiつた。
[0219] ブロッキングはナカライテスタ社製ブロッキングワンを用い、反応は室温（25°C)で 行い、時間は 24時間で終了した。
[0220] 余剰ブロッキング剤は、界面活性剤 0. l %TWeen25含有リン酸緩衝液 (pH = 7) を用いて 3回洗浄を行った。
[0221] ァセチルー NH— KTEYTIHWW— COOHは蒸留水で希釈し、濃度が 0 g/m レ 0. 2 μ g/ ITLL、 0. 5 μ g/ mL 1. 0 μ g/ mL 2. 0 μ g mL 5. 0 μ g mL のものを用意した。
[0222] 長さの異なるリンカ一分子それぞれに、ァセチルー NH— KTEYTIHWW— COO
H希釈液 0 μ g/mL、 0. 2 μ g/mL、 0. 5 ^ g/mL、 1. 0 ^ g/mL、 2. 0 μ g/m
L、 5· 0〃 g/mLを 50 μ Lずつ滴下して fiつた。
[0223] 反応しなかったァセチルー NH— KTEYTIHWW— COOHの洗浄は、界面活性 剤 0. 1 %Tween25含有リン酸緩衝液（pH = 7)を用いて 3回行った。
[0224] 二次抗体である抗ースギ花粉抗原 Cry— J1 HRP (生化学工業）を 0 · l%Tween
20含有リン酸緩衝液で 1000倍希釈して調製し、その調製液を 100 し添加し、室 温 1時間反応した。
[0225] 反応しなかった二次抗体 (抗ースギ花粉抗原 Cry— J1 HRP)の洗浄は、界面活 性剤 0. 1 %Tween25含有リン酸緩衝液（pH = 7)で 3回行った。
[0226] 発色液は ELISA POD基質 TMBキット (ナカライテスタ社)を用いて発色反応を室 温で実施した。基質液を 100 L添加してから 30分後に反応後停止液を 100 L添 加し、 450nmの吸光度を測定した。
[0227] 横軸をポリ（モノ）エチレングリコールジグリシジルエーテル（PEG— DG)リンカ一長 さ（オングストローム単位）とし、縦軸を吸高度の傾きを検出効率と記述してグラフにし たものを図 7に示す。
[0228] ポリ（モノ）エチレングリコールジグリシジルエーテル（PEG— DG)の鎖長が異なる 6 種類；（1 )鎖長 8. 3A、重合度 n = l (2)鎖長 1 1. O A、重合度 n = 2 (3)鎖長 16. 6 A、重合度 n = 4 (4)鎖長 30. 4 A、重合度 n = 9 (5)鎖長 41. 4 A、重合度 n = 13 (6 )鎖長 66 · 2 A、重合度 n = 22のそれぞれについて、抗原 Cryj lの濃度が 0〃 g/m L、 0. 2 μ g/ mL、 0. 5 ^ g/ mL、 1. 0 μ g/ mL、 2. 0 μ g/ mLにお る 450nm の吸光度の傾きは、いずれも直線となった。
[0229] また、図 7から明らかなように、リンカ一長さが 20〜6θΑ (2. 0〜6 · 0nm、重合度 n 力 S4〜9)である場合に、人工合成ペプチドであるァセチルー NH— KTEYTIHWW — COOHの Cry— J1に対する検出効率は高くなることが分力、つた。この理由は、定 かではないが、リンカ一の長さが一定の範囲内にある場合に、ペプチドのアミノ酸配 列が基板に対して比較的直立した形で存在し、 Cry— J1を捕捉しやすい状態になる ためと考えられる。
[0230] (実施例 4)
本実施例では、人工合成ペプチドの N末端に一つのリンカ一を、人工合成ぺプチ ドの C末端のアミノ酸に他の一つのリンカ一を結合させた場合に、リンカ一の長さが検 出感度に与える影響を調べた。
[0231] ァセチルー NH— KTEYTIHWWK— COOH (SH3)を合成した。すなわち Cry
J1認識ペプチドのアミノ酸配列両端にリジン残基を配置し、 C末端のリジンの側鎖 のァミノ基が一つのリンカ一と、 N末端のリジンの α—ァミノ基がァセチル化され、側 鎖のアミノ基が他の一つのリンカ一と結合するようにした。この概略図を図 9に示す。
[0232] 固相化反応は、ァセチル化 KTEYTIHWWK— COOHの 5 μ g/mL水溶液と 、ポリ（モノ）エチレングリコールジグリシジルエーテル（PEG— DG)が 45 Mの炭酸 水素ナトリウム緩衝溶液 (pH = 9)を混合して行った。 [0233] ポリ（モノ）エチレングリコールジグリシジルエーテル（PEG— DG)は鎖長の異なる 6 種類を選んだ。すなわち（1 )鎖長 8. 3A、重合度 n= l (2)鎖長 1 1. OA、重合度 n = 2 (3)鎖長 16. 6A、重合度 n = 4 (4)鎖長 30. 4A、重合度 n = 9 (5)鎖長 41. 4A 、重合度 n= 13 (6)鎖長 66. 2A、重合度 n = 22である。 PEG— DGはナガセケムテ ックス株式会社製デナコール EXシリーズより選んだ。
[0234] 固相反応は、アミノ化 96穴 ELISA法用プレート（住友ベークライト製、スミロン MS — 3608F)を固相に用い、室温で 24時間にて完了した。
[0235] 次に、 ELISA法用プレートの 96穴の各々に 100 μ Lの蒸留水を充填し、洗浄を 3 回 fiつた。
[0236] ブロッキングはナカライテスタ社製ブロッキングワンを用い、反応は室温（25°C)で おこな!/ヽ時間は 24時間で終了した。
[0237] 余剰ブロッキング剤は、界面活性剤 0. l %TWeen25含有リン酸緩衝液 （pH = 7) を用いて洗浄を 3回行った。
[0238] ァセチル化ー KTEYTIHWWK— COOHは蒸留水で希釈し、濃度が 0 μ g/mL
、 0. 2 μ gZ ITLL、 0. 5 μ g mL 1. 0 μ g mL 2. 0 μ g mL 5. 0 μ g, mL( ものを用意した。
[0239] 長さの異なるリンカ一分子それぞれに、ァセチル化ー KTEYTIHWWK— COOH 希釈液 0 μ g/mL, 0. 2 μ g/mL, 0. 5 ^ g/mL, 1. 0 ^ g/mL, 2. 0 μ g/mL
、 5. 0〃 g/mLを 50 a Lずつ滴下して fiつた。
[0240] 反応しな力、つた抗原 Cry— Jlの洗浄は、界面活性剤 0. l %Tween25含有リン酸 緩衝液（pH = 7)で 3回行った。
[0241] 二次抗体である抗—スギ花粉抗原 Cry— J1—HRP (生化学工業）を 0· l %Tween
20含有リン酸緩衝液で 1000倍希釈して調製し、その調製液を 100 し添加し、室 温 1時間反応した。
[0242] 反応しなかった二次抗体 (抗ースギ花粉抗原 Cry— J1 HRP)は、界面活性剤 0· 1 %TWeen25含有リン酸緩衝液（pH = 7)を用いて洗浄を 3回行った。
[0243] 発色液は ELISA POD基質 TMBキット (ナカライテスタ社)を用いて発色反応を室 温で実施した。基質液を 100 L添加してから 30分後に反応後停止液を 100 L添 加し、 450nmの吸光度を測定した。
[0244] ポリ（モノ）エチレングリコールジグリシジルエーテル（PEG— DG)の鎖長が異なる 6 種類；（1 )鎖長 8. 3A、重合度 n = l (2)鎖長 1 1. O A、重合度 n = 2 (3)鎖長 16. 6 A、重合度 n = 4 (4)鎖長 30. 4 A、重合度 n = 9 (5)鎖長 41. 4 A、重合度 n = 13 (6 )鎖長 66 · 2 A、重合度 n = 22のそれぞれについて、抗原 Cryj lの濃度が 0〃 g/m L、 0. 2 μ g/ mL、 0. 5 ^ g/ mL、 1. 0 μ g/ mL、 2. 0 μ g/ mLにお る 450nm の吸光度の傾きは、いずれも直線となった。
[0245] 横軸をポリ（モノ）エチレングリコールジグリシジルエーテル（PEG— DG)リンカ一長 さ（オングストローム単位）とし、縦軸を吸高度の傾きを検出効率と記述してグラフにし たものを図 8に示す。
[0246] 図 8から明らかなように、ァセチルー NH— KTEYTIHWWK— COOHの Cryj lに 対する検出効率は、リンカ一長さに関わり無くほぼ同等の検出効率を示すことが分か つた。この理由は、人工合成ペプチドの C末端のアミノ酸に一つのリンカ一を、人工 合成ペプチドの N末端のアミノ酸に他の一つのリンカ一を結合させた場合、リンカ一 長さに影響を受けることなぐ基板に対して人工合成ペプチドが平行に配置するため 、 Cryj— 1が人工合成ペプチド（SH3)にほぼ同等に捕捉されるためと考えられる。
[0247] (実施例 5)
抗 Cryj— 1免疫グロブリンの超可変領域のアミノ酸配列である NH— TEYTIHWW — COOHのアミノ酸配列は、 N末端側からの酉己列 TEYTは、 T, E, Tが親水性であ り、親水性が高い。また IHWWは、 I, Wが疎水性であり、疎水性が高い。また、トリプ トフアン (W)は、ペプチドやタンパクの認識サイトとして機能することが多いと考えられ ている。このため、 N末端に近い配歹 IJTEYTの親水性を上げ、 C末端に近い配歹 IJIH WWの疎水性を上げるために、チロシン (Y)を親水性のグルタミン酸（E)に変更し、 ヒスチジン（H)を疎水性のトリプトファン（W)に変更し、ァセチル一 NH— TEETIW WWK- COOH (AL1 )を人工合成した。
[0248] 固相化反応は、ァセチルー ^^1ー丁££丁1\¥\¥\¥!^—じ00^1 (八し1)の5 8/111し 水溶液と、ポリエチレングリコールジグリシジルエーテル（PEG— DG)が 45 Mの炭 酸水素ナトリウム緩衝溶液 (pH = 9)を混合して行った。 [0249] ポリエチレングリコールジグリシジルエーテル（PEG— DG)は、鎖長 1 1. θΑ、重合 度 n = 2を用いた。
[0250] 固相反応は、アミノ化 96穴 ELISA法用プレート（住友ベークライト製、スミロン MS
— 3608F)を固相に用い、室温で 24時間にて完了した。
[0251] 次に、 ELISA法用プレートの 96穴の各々に 100 μ Lの蒸留水を充填し、洗浄を 3 回 fiつた。
[0252] ブロッキングはナカライテスタ社製ブロッキングワンを用い、反応は室温でおこな!/ヽ 時間は 24時間で終了した。
[0253] 余剰ブロッキング剤の洗浄は、界面活性剤 0. l %TWeen25含有リン酸緩衝液 (p
H = 7)で 3回行った。
[0254] 人工合成ペプチド AL1は蒸留水で希釈し、濃度が 0 μ g/mL、 0. 2 μ g/mL、 0 • 5 μ gZ mL、 1. 0 μ gZ mL、 2. 0 μ gZ mL、 5. gZ mLのものを用意した。
[0255] 人工合成ペプチド AL1の反応は、抗原 Cryj l希釈液 0 μ g/mL、 0. 2 μ g/mL、 0. S ^u g/ mL 1. O ^u g/ mL 2. 0 μ g/ mL, 5. 0 g/ mLを 50 Lずつ滴下し て fiつた。
[0256] 反応しな力、つた人工合成ペプチド AL1は、界面活性剤 0. l %Twe en25含有リン 酸緩衝液（pH = 7)を用いて洗浄を 3回行った。
[0257] 二次抗体である抗ースギ花粉抗原 Cry— J1 HRP (生化学工業）を 0 · l %Twee n20含有リン酸緩衝液で 1000倍希釈して調製し、その調製液を 100 L添加し、室 温 1時間反応した。
[0258] 反応しなかった二次抗体 (抗 -スギ花粉抗原 Cry— J1 HRP)の洗浄は、界面活 性剤 0. 1 %Tween25含有リン酸緩衝液（pH = 7)で 3回行った。
[0259] 発色液は ELISA POD基質 TMBキット (ナカライテスタ社)を用いて発色反応を室 温で実施した。基質液を 100 L添加してから 30分後に反応後停止液を 100 L添 加し、 450nmの吸光度を測定した。
[0260] PEG— DG鎖長 1 1. 0 A、重合度 n = 2によって固相化されたにァセチルー NH— TEETIWWWK— COOHついて、抗原 Cry— J1の濃度が 0 g/mL、 0· 2 gZ mL、 0. 5 μ g/mL, 1. 0 μ g/mL, 2. 0〃 g/mLにおける 450nmの吸光度の頃 きは、直泉となった。
[0261] 人工合成 Cry—Jl認識ペプチドであるァセチルー NH—TEYTIHWWK— COO H (SH1 )については、実施例 2に準じて固相化反応を行った。用いたポリエチレング リコールジグリシジルエーテル（PEG— DG)は、鎖長 11. 0A、重合度 n = 2である。
[0262] 固相化されたにァセチルー NH— TEYTIHWWK— COOHついて、抗原 Cry— J 1の濃度力 s0 μ g/mL, 0. 2 μ g/mL, 0. 5 μ g/mL, 1 · 0 g/mL, 2. O /i g/ mLにおける 450nmの吸光度の傾きは、直線となった。
[0263] 横軸をポリ（モノ）エチレングリコールジグリシジルエーテル（PEG— DG)リンカ一長 さ（オングストローム単位）とし、縦軸を吸高度の傾きを検出効率と記述してグラフにし たものを図 10に示す。
[0264] 図 10から明らかなように、ァセチルー NH— TEYTIHWWK— COOH (SHl )とァ セチル— NH— TEETIWWWK— COOH (ALl )は、 Cry— J1に対してほぼ同等の 反応性を示すことが分かった。この理由は、アミノ酸酉己列 TEYTIHWWK力 親水性 、疎水性共に、 Cry— J1の認識に対して十分な能力を持っていたからと考察できる。 それゆえ、一部の領域の親水性と、一部の領域の疎水性を向上させた人工合成ぺ プチド TEETIWWWKは、超可変領域の C末端にリジンを付加した人工合成ぺプチ ド TEYTIHWWKと同様の認識能力を示すに止まると考えられる。
産業上の利用可能性
[0265] 以上説明したように本発明によると、低コストで且つ失活等のおそれのないバイオ センサを低コストで実現できる。このバイオセンサは、環境計測器、医療検査機器等 に利用可能であり、産業上の意義は大きい。
図面の簡単な説明
[0266] [図 1]実施の形態に力、かるバイオセンサの概略図である。
[図 2]実施例 1で測定したアミノ酸配列（Cry—Jlマウスモノクローナル抗体 IgG (Anti Cry-Jl Mouse #013生化学工業））と、データベースに記載のアミノ酸配列との相同 比較を示す図である。
[図 3]人工合成ペプチドであるフルォレセイン- TEYTIHWWK力 デナコール EX-8 50を介してキトサン膜に固定化された状態の吸光度を示すグラフである。 [図 4]人工合成ペプチドであるフルォレセイン- TEYTIHWWKがリンカ一を介してキ トサンに固定化された構造の予想図である。
[図 5]実施例 1における実験結果を示すグラフである。
[図 6]実施例 2にかかるバイオセンサの検出感度を示すグラフである。
[図 7]実施例 3にかかるバイオセンサの検出感度を示すグラフである。
[図 8]実施例 4にかかるバイオセンサの検出感度を示すグラフである。
[図 9]実施例 4にかかるバイオセンサの概略図である。
[図 10]実施例 5にかかるバイオセンサの検出感度を示すグラフである。
符号の説明
1 ペプチド
2 担持体
3 リンカ一

Claims

請求の範囲
[1] 認識対象物質を捕捉し検知するバイオセンサであって、
分子認識物質であるペプチドと、
2以上の特定官能基を有する炭化水素系化合物からなるリンカ一と、
担持体と、
を有し、
前記ペプチドは前記リンカ一の 1つの特定官能基と直接結合し、前記担持体は前 記ペプチドと結合した当該リンカ一の他の 1つの特定官能基と直接結合している、 ことを特徴とするバイオセンサ。
[2] 前記特定官能基がエポキシ基とアミノ基との反応生成官能基である、
ことを特徴とする請求項 1に記載のバイオセンサ。
[3] 前記特定官能基が 2つであり、且つ各々の特定官能基が前記リンカ一の両末端に それぞれ配置されている、
ことを特徴とする請求項 1に記載のバイオセンサ。
[4] 前記リンカ一の特定官能基部分以外の構造が、親水性、疎水性、又は両親媒性を 持つ炭化水素系の構造であることを特徴とする、
ことを特徴とする請求項 1に記載のバイオセンサ。
[5] 前記リンカ一が、「—〇— CH—CHR—； Rは水素原子又はアルキル基を示す」で 示されるアルキレンオキサイド構造を有する、
ことを特徴とする請求項 1に記載のバイオセンサ。
[6] 前記ペプチドが、人工合成ペプチドである、
ことを特徴とする請求項 1に記載のバイオセンサ。
[7] 前記人工合成ペプチドが、抗体タンパク質の超可変領域のアミノ酸配列と同一、ァ ミノ酸の一部の官能基を修飾したもの、アミノ酸配列の C末端及び/又は N末端に他 のアミノ酸を付加したもの、またはアミノ酸配列の一部を変更したものである、 ことを特徴とする請求項 6に記載のバイオセンサ。
[8] 前記人工合成ペプチドの C末端側及び/又は N末端側のアミノ酸がシスティンで める、 ことを特徴とする請求項 6又は 7に記載のバイオセンサ。
[9] 前記人工合成ペプチドの N末端のアミノ酸のァミノ基が修飾されており、
当該人工合成ペプチドの C末端のアミノ酸が、当該人工合成ペプチドの C末端のァ ミノ酸力 側鎖に第 1級ァミンを有するアミノ酸であり、
当該 C末端のアミノ酸のァミノ基と前記特定官能基とが結合している、
ことを特徴とする請求項 6又は 7に記載のバイオセンサ。
[10] 前記 C末端のアミノ酸力 Sリジンである、
ことを特徴とする請求項 9に記載のバイオセンサ。
[11] 前記リンカ一の長さが、 0. 5〜； !Onmである、
ことを特徴とする請求項 1に記載のバイオセンサ。
[12] 前記リンカ一の長さが、 0. 8〜7. Onmである、
ことを特徴とする請求項 1に記載のバイオセンサ。
[13] 前記担持体上に固定された前記ペプチドが、 1種類である、
ことを特徴とする請求項 1に記載のバイオセンサ。
[14] 前記担持体上に固定された前記ペプチドが、ランダムに混在する 2種類以上のぺ プチドである、
ことを特徴とする請求項 1に記載のバイオセンサ。
[15] 前記担持体上に 1種類のペプチドが複数固定されてなる分子認識領域 Aと、 上記とは異なる 1種類のペプチドが複数固定されてなる分子認識領域 Bと、 が形成されている、
ことを特徴とする請求項 1に記載のバイオセンサ。
[16] 前記担持体が、基板、固体粒子、膜、繊維、ゲルの!/、ずれかである、
ことを特徴とする請求項 1に記載のバイオセンサ。
[17] 前記担持体が、基板、固体粒子、繊維、ゲルの!/、ずれかの表面に形成された薄膜 である、
ことを特徴とする請求項 1に記載のバイオセンサ。
[18] 前記薄膜が、キトサンであり、その膜厚が 50〜400nmである、
ことを特徴とする請求項 17に記載のバイオセンサ。
[19] 分子認識物質であるペプチドと、両末端にエポキシ基を有する炭化水素系化合物 力 なるリンカ一分子と、を混合した液を、表面にエポキシ基と結合する官能基を有 する担持体と接触させて、前記ペプチドと前記リンカ一分子とを直接結合させ、前記 リンカ一分子と前記担持体とを直接結合させるステップを備える、
ことを特徴とするバイオセンサの製造方法。
[20] 前記混合液に含まれるペプチドの濃度が、 0. 001-2. 0モル/ Lである、
ことを特徴とする請求項 19に記載のバイオセンサの製造方法。
[21] 前記混合液に含まれるリンカ一分子の濃度が、 0. 001-4. 0モル/ Lである、 ことを特徴とする請求項 19に記載のバイオセンサの製造方法。
[22] 前記リンカ一分子が、「G—(〇— CH -CHR-) —O G ;Rは水素原子又はァ
2 n
ルキル基を示し、 Gはグリシジル基を示す。 nは 1以上の整数」で示されるポリアルキレ ンオキサイドジグリシジルエーテル又はモノアルキレンオキサイドジグリシジルエーテ ルである、
ことを特徴とする請求項 19に記載のバイオセンサの製造方法。
[23] エポキシ基と結合する前記担持体表面の官能基力 アミノ基である、
ことを特徴とする請求項 19に記載のバイオセンサの製造方法。
[24] 前記担持体は、キトサンを酸溶液に溶力、したキトサン溶液を基板、固体粒子、繊維 、又はゲルの表面に塗布し形成した薄膜である、
ことを特徴とする請求項 23に記載のバイオセンサの製造方法。
[25] 前記キトサン溶液の 25°Cでの粘度力 100〜； lOOOPa ' Sである、
ことを特徴とする請求項 24に記載のバイオセンサの製造方法。
[26] 前記キトサン薄膜の膜厚力 50〜400nmである、
ことを特徴とする請求項 25に記載のバイオセンサの製造方法。
[27] 請求項 7に記載のバイオセンサを用いた認識対象物質の検出方法であって、 前記ペプチドと認識対象物質とを反応させて、ペプチド 認識対象物質複合体を 形成する第 1ステップと、
前記ペプチド 認識対象物質複合体と、蛍光物質付き抗体材料とを反応させて、 ペプチド 認識対象物質複合体 蛍光物質付き抗体材料を形成する第 2ステップと 余剰な蛍光物質付き抗体材料を洗浄する第 3ステップと、
前記蛍光物質の量を検出する第 4ステップと、
金コロイドを添加し、前記システィンと金コロイドとを反応させる第 5ステップと、 余剰な金コロイドと前記蛍光物質付き抗体材料を洗浄する第 6ステップと、 前記第 6ステップの後、再度前記蛍光物質の量を検出する第 7ステップと、 を備え、
前記第 4ステップでの蛍光物質の量と前記第 7ステップでの蛍光物質の量との差よ り前記認識対象物質の量を測定する、 .
ことを特徴とする検出方法。
[28] 請求項 1に記載のバイオセンサを用!、た認識対象物質の検出方法であって、 前記ペプチドと認識対象物質とを反応させて、ペプチド—認識対象物質複合体を 形成する第 1ステップと、
前記ペプチド一認識対象物質複合体と、システィンが末端に付加されたペプチドと を反応させて、ペプチド一認識対象物質複合体—システィン付加ペプチドを形成す る第 2ステップと、
余剰なシスティンが末端に付加されたペプチドを洗浄する第 3ステップと、 金コロイドを添加し、前記システィンと金コロイドとを反応させる第 4ステップと、 余剰な金コロイドを洗浄する第 5ステップと、
前記第 6ステップの後、金コロイドの発色量を検出する第 6ステップと、 - を備える、
ことを特徴とする検出方法。
[29] 特定分子を捕捉する分子捕捉物質としてのペプチドと、
前記ペプチドを担持する担持体と、
前記ペプチドと前記担持体とを繋ぐリンカ一と、
を有し、
前記ペプチドが生体の免疫グロブリンとは構造の異なる人工合成ペプチドであり、 前記リンカ一が少なくとも 2つの反応性官能基を有する炭化水素系化合物であり、 前記リンカ一の 1つの反応性官能基に前記人工合成ペプチドが直接結合し、当該 反応性官能基以外の他の反応性官能基に前記担持体が結合している、
ことを特徴とするバイオセンサ。
[30] 請求項 29に記載のバイオセンサにおいて、
前記人工合成ペプチドは、天然免疫グロブリンのアミノ酸配列のうち、その超可変 領域に該当する部分に存在する連続する 3つ以上のアミノ酸配列を含む、
ことを特徴とするバイオセンサ。
[31] 請求項 30に記載のバイオセンサにおいて、
前記 3つ以上のアミノ酸配列を構成するアミノ酸の官能基の一部が他の官能基で 修飾されている、
ことを特徴とするバイオセンサ。
[32] 請求項 29に記載のバイオセンサにおいて、
天然免疫グロブリンの超可変領域を組成する連続する 4つのアミノ酸からなるアミノ 酸配列で、当該アミノ酸配列を構成するアミノ酸の 3つがイソロイシン、フエ二ルァラ二 ン、バリン、ロイシン、メチ才ニン、トリプトファン、ァラニン、グリシン、システィン、チロ シンからなる群から選択される疎水性アミノ酸であり、他の一つが前記疎水性アミノ酸 以外のアミノ酸である配列を疎水性型アミノ酸配列とするとき、
前記人工合成ペプチドは、前記疎水性型アミノ酸配列中の疎水性アミノ酸以外の アミノ酸が疎水性アミノ酸で置換されてなる合成疎水性アミノ酸配列ユニットを含んで なるものである、
ことを特徴とするバイオセンサ。
[33] 請求項 32に記載のバイオセンサにおいて、
前記合成疎水性アミノ酸ユニットを構成するアミノ酸の官能基の一部が他の官能基 で修飾されている、
ことを特徴とするバイオセンサ。
[34] 請求項 29に記載のバイオセンサにおいて、
天然免疫グロブリンの超可変領域を組成する連続する 4つのアミノ酸からなるアミノ 酸配列で、当該アミノ酸配列を構成するアミノ酸の 3つがヒスチジン、グルタミン酸、ァ スパラギン酸、グルタミン、ァスパラギン、リジン、アルギニン、プロリン、スレオニン、セ リンからなる群より選択される親水性アミノ酸であり、他の一つが前記親水性アミノ酸 以外のアミノ酸である配列を親水性型アミノ酸配列とするとき、
前記人工合成ペプチドは、前記親水性型アミノ酸配列に含まれる親水性アミノ酸以 外のアミノ酸が親水性アミノ酸で置換されてなる合成親水性アミノ酸配列ユニットを含 んでなるものである、
ことを特徴とするバイオセンサ。
[35] 請求項 34に記載のバイオセンサにおいて、
前記合成親水性アミノ酸ユニットを構成するアミノ酸の官能基の一部が他の官能基 で修飾されている、
ことを特徴とするバイオセンサ。
[36] 請求項 29なレ、し 35の!/、ずれかに記載のバイオセンサにおレ、て、
前記人工合成ペプチドの N末端のアミノ酸と前記リンカ一とが結合している、 ことを特徴とするバイオセンサ。
[37] 請求項 29なレ、し 35の!/、ずれかに記載のバイオセンサにおレ、て、
前記人工合成ペプチドの N末端のアミノ酸のァミノ基が修飾されており、 当該人工合成ペプチドの C末端のアミノ酸力 S、側鎖に第 1級ァミンを有するアミノ酸 であり、
前記人工合成ペプチドの C末端のアミノ酸と前記リンカ一とが結合している、 ことを特徴とするバイオセンサ。
[38] 請求項 37に記載のバイオセンサにおいて、
前記 C末端のアミノ酸が、リジンである、
ことを特徴とするバイオセンサ。
[39] 請求項 29なレ、し 35の!/、ずれかに記載のバイオセンサにおレ、て、
前記人工合成ペプチドの N末端のアミノ酸力 S、側鎖に第 1級ァミンを有するアミノ酸 であり、
前記 N末端のアミノ酸の α—ァミノ基が修飾されており、
前記人工合成ペプチドの Ν末端のアミノ酸と前記リンカ一とが結合している、 ことを特徴とするバイオセンサ。
[40] 請求項 39に記載のバイオセンサにおいて、
前記 N末端のアミノ酸が、リジンである、
ことを特徴とするバイオセンサ。
[41] 請求項 29なレ、し 35の!/、ずれかに記載のバイオセンサにおレ、て、
前記人工合成ペプチドの N末端のアミノ酸の α—ァミノ基が修飾されておらず、 当該人工合成ペプチドの C末端のアミノ酸力 S、側鎖に第 1級ァミンを有するアミノ酸 であり、
前記人工合成ペプチドの Ν末端のアミノ酸が一つのリンカ一と結合し、前記人工合 成ペプチドの C末端のアミノ酸と他の一つのリンカ一とが結合している、
ことを特徴とするバイオセンサ。
[42] 請求項 41に記載のバイオセンサにおいて、
前記 Ν末端のアミノ酸が、リジンである、
ことを特徴とするバイオセンサ。
[43] 請求項 29なレ、し 35の!/、ずれかに記載のバイオセンサにおレ、て、
前記人工合成ペプチドの Ν末端のアミノ酸力 S、側鎖に第 1級ァミンを有するアミノ酸 であり、
前記人工合成ペプチドの C末端のアミノ酸力 S、側鎖に第 1級ァミンを有するアミノ酸 であり、
前記 Ν末端のアミノ酸の α—ァミノ基が修飾されており、
前記人工合成ペプチドの Ν末端のアミノ酸が一つのリンカ一と結合し、前記人工合 成ペプチドの C末端のアミノ酸と他の一つのリンカ一とが結合している、
ことを特徴とするバイオセンサ。
[44] 請求項 43に記載のバイオセンサにおいて、
前記 Ν末端のアミノ酸及び C末端のアミノ酸力 リジンである、
ことを特徴とするバイオセンサ
[45] 請求項 37又は 38に記載のバイオセンサにおいて、
前記リンカ一の長さが、 0. 5〜； 1. 5nmである、 ことを特徴とするバイオセンサ。
[46] 請求項 36、 39又は 40に記載のバイオセンサにおいて、
前記リンカ一の長さ力 2. 0〜6. Onmである、
ことを特徴とするバイオセンサ。
[47] 請求項 41な 、し 441/、ずれかに記載のバイオセンサにぉレ、て、
前記リンカ一の長さ力 0. 5〜： LOnmである、
ことを特徴とするバイオセンサ。
[48] 請求項 29な 、し 42の 、ずれかに記載のバイオセンサにおレ、て、
前記リンカ一の反応性官能基と前記人工合成ペプチドとの結合が、エポキシ基とァ ミノ基との反応により生じたものである、
ことを特徴とするバイオセンサ。
[49] 請求項 29なレ、し 48の！/、ずれかに記載のバイオセンサにぉレ、て、
前記リンカ一の反応性官能基と前記担持体との結合力 S、エポキシ基とアミノ基との 反応により生じたものである、
ことを特徴とするバイオセンサ。
[50] 請求項 29なレ、し 49の！/、ずれかに記載のバイオセンサにぉレ、て、
前記リンカ一力 「― O— CH— CHR—； Rは水素原子又はアルキル基を示す」で
2
示されるアルキレンオキサイド構造を有する、
ことを特徴とするバイオセンサ。
[51]' 請求項 29に記載のバイオセンサにおいて、
前記人工合成ペプチドは、天然免疫グロブリンの超可変領域内の連続する 4つの アミノ酸配列であって、イソロイシン、フエ二ルァラ -ン、バリン、ロイシン、メチォニン、 トリプトファスァラニン、グリシン、システィン、チロシン力 なる群力も選択される球水 性アミノ酸力 s4つ連続して配列された天然疎水性アミノ酸配列ュュットを含む、 ことを特徴とするバイオセンサ。
[52] 請求項 29に記載のバイオセンサにおいて、
前記人工合成ペプチドは、天然免疫グロブリンの超可変領域内の連続する 4つの アミノ酸配列であり、ヒスチジン、グルタミン酸、ァスパラギン酸、グルタミン、ァスパラ
訂正された 紙 (^則 91〉 ギン、リジン、アルギニン、プロリン、スレオニン、セリンからなる群から選択される親水 性アミノ酸が 4つ連続して配列された天然親水性アミノ酸配列ユニットを含む、 ことを特徴とするバイオセンサ。
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