JP2008133194A - タンパク質吸着阻害基材およびその用途 - Google Patents

Abstract

【課題】広範な医用材料として有用なタンパク質吸着阻害表面を有する基材およびその用途の提供。
【解決手段】疎水性有機ポリマーからなる支持体の表面上に、該疎水性有機ポリマー特異的に親和性を有するペプチドの一端側にポリアルキレンオキシド鎖が導入されたペプチド誘導体からなる自己組織膜を有する基材。ペプチドは、ファージディスプレイ法で選択することができる。
【選択図】なし

Description

本発明は、タンパク質吸着阻害表面を有する基材およびその用途に関する。

タンパク質溶液と接する医用材料、特に高濃度のタンパク質を含む血液などと接する輸液バッグなどでは、タンパク質の変性吸着や凝固系の活性化などが問題である。
また、生体起源の分子認識機構を利用するバイオセンサーにおいて、セルまたはプレート上における検出（または診断）を再現性よくかつ高い信頼性で行うためには、検液中に含まれる標的物質以外の夾雑物特にタンパク質のセンサーとの相互作用を阻害する必要がある。しかしながら、ブロッキング剤を用いてタンパク質の吸着を阻害しようとすれば、検査対象、プレートの種類などによって、多くのブロッキング剤の中から適切なものを選択しなくてはならないという問題がある。このため、標的物質の検出Ｓ／Ｎ比を向上させるために、タンパク質のセンサー表面への非特異吸着もしくは結合を阻害する方法が望まれる。すなわち、検査、診断、保管・輸送、基礎研究などにおいて、タンパク質のユニバーサルな吸着を阻害しうる材料に対するニーズは高い。

タンパク質のユニバーサルな吸着阻害効果を有するものとして、分子間相互作用の解析に利用される表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）のチップなどの表面をポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＧとも表記する）で修飾することが知られている。たとえば、金属または金属酸化物への結合性部位として、−ＳＨまたは−Ｓｉ（ＯＲ¹）（ＯＲ²）（ＯＲ³）を有するＰＥＧを主体とするポリマー溶液を、バイオセンサー金属または金属酸化物表面に複数回接触結合させることにより得られる、タンパク質（例えば、ＢＳＡ）の吸着が著しく低下した表面が提案されている（特許文献１参照）。このような金属または金属酸化物表面への結合性部位を有するＰＥＧ、たとえばＰＥＧアルカンチオールなどは、自己組織化膜（Self-Assembled Monolayers）（ＳＡＭとも表記する）を形成することが知られている。

ＳＡＭによるＰＥＧ修飾膜をもつ例としては、さらに、ＰＥＧアルカンチオールＳＡＭで被覆した平滑な表面に、リガンドを精密配列させた基板と、タンパク質とを接触させ、リガンドとの分子間相互作用により基板表面に特異的に吸着したタンパク質を質量分析する、タンパク質のスクリーニング方法の提案もある（たとえば特許文献２など参照）。

また、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）センサーチップ上に、ヘテロ２官能ＰＥＧ（α-アセタール-ω−メルカプトＰＥＧ）を用いて形成される反応性ＰＥＧの長鎖（５ｋＤ）層と、非特異的吸着を低減する短鎖（２ｋＤ）ＰＥＧ層との２種の刷毛層を有する、高Ｓ／Ｎ比の特異的表面プラズモン共鳴センサーの提案もある（非特許文献１参照）。
国際公開第２００３／０７６９３３号パンフレット 特開２００３−２４８００１号公報 Analytical Chemistry，2005年2月15日，第77巻，第4号，p.1075−1080

バイオセンサのＳ／Ｎ比の向上が期待される技術として、上記のような研究レベルにおける金などの金属表面のＰＥＧによる表面修飾が公知であるが、バイオセンサの実用性を考慮すれば汎用性有機ポリマーの基材が望まれる。有機ポリマーの表面はタンパク質が極めて吸着しやすく、抗体などの検査用タンパク質を固定化するには有利であるが、非特異的なタンパク質吸着は抑制する必要がある。このため、有機ポリマー、特に疎水性有機ポリマーを支持体とし、その表面にタンパク質のユニバーサルな吸着を阻害する能力の付与された基材の出現が望まれている。またこのような基材は、その製法も簡易であることが望まれる。

本発明者は、上記のような基材を開発すべく検討するうちに、ファージディスプレイ法により特定の有機ポリマー特異的に親和性のある特定のペプチドが存在することを見出した。この知見に基づいて、該ペプチドを、その一端にＰＥＧ鎖を導入したペプチド誘導体とし、有機ポリマーを表面修飾したところ、有機ポリマー直接表面の場合に比して９９％以上の阻害率という著しいタンパク質吸着阻害効果を示すことが確認された。有機ポリマー表面を、ペプチドの親和性を介してＰＥＧ鎖で修飾した構造は知られておらず、また金属表面へのチオール結合などによる原子レベルの高密度ＰＥＧ鎖の導入に対し、ペプチドを介する相対的に低密度のＰＥＧ鎖の導入が、このようなタンパク質吸着に対する高阻害率を達成しうることは予想をはるかに超える効果である。これら知見に基づいて、タンパク質吸着阻害材として信頼性が高く、広範な医用材料に利用可能で有用な以下のような基材およびその用途を提供する。

本発明に係る基材は、疎水性有機ポリマーからなる支持体の表面上に、該疎水性有機ポリマー特異的に親和性を有するペプチドの一端側にポリアルキレンオキシド鎖が導入されたペプチド誘導体からなる自己組織膜を有する。
このような疎水性有機ポリマー上の自己組織膜は、図１に模式的に示すように、親和性ペプチドの下層を介してポリアルキレン鎖が疎水性有機ポリマー表面に柔軟に分布した構造であると解される。

上記ペプチドは、通常、アミノ酸残基４以上のペプチドである。
上記ペプチドは、ファージディスプレイ法により選択することができる。ファージディスプレイ法により、アミノ酸残基を４以上の適宜の数に設定することにより、たとえばアミノ酸残基７のペプチドを選択することができる。

ポリアルキレンオキシド鎖は、ペプチドのＮ末側およびＣ末側のいずれに導入されてもよい。
また、ポリアルキレンオキシド鎖は、リンカーを介してペプチドの一端に導入されていてもよい。
前記ポリアルキレンオキシド鎖は、通常、ＰＥＧである。

支持体となる疎水性有機ポリマーとしては、高立体規則性ポリマーが好ましく挙げられる。特に、上記ペプチドをファージディスプレイ法により選択する場合には、ペプチドの親和性を補助するものとして、有機ポリマーは、疎水性に加え、イソタクチック（it-）、シンジオタクチック（st-）などの立体規則性で示されるか、あるいはＤ体、Ｌ体の相対配置光学異性で表記される立体規則性のある構造のものが好ましい。このようなポリマーとしては、たとえばポリメチルメタクリラート、ポリスチレン、ポリ乳酸およびポリプロピレンなどのポリオレフィンが挙げられる。

本発明に係る基材の一態様例として、疎水性有機ポリマーがイソタクチックポリメチルメタクリラートであり、ペプチドが、ＥＬＷＲＰＴＲ、ＱＬＱＫＹＰＳ、ＡＲＰＨＬＳＦ、ＴＬＨＬＳＰＡ、ＱＴＭＴＹＳＲ、ＡＡＱＴＳＴＰ、ＳＳＰＷＭＲＥおよびＧＩＲＨＴＮＲからなる群より選ばれるアミノ酸配列のペプチドである基材が挙げられる。

本発明に係る基材の他の態様例として、疎水性有機ポリマーがシンジオタクチックポリメチルメタクリラートであり、ペプチドが、ＨＫＰＤＡＮＲ、ＨＰＶＨＰＨＲ、ＬＰＰＷＱＲＱ、ＨＰＲＷＨＴＰ、ＱＬＫＴＧＬＡ、ＨＰＲＬＧＬＡ、ＫＰＲＭＰＰＲ、ＨＰＷＷＲＰＳ、ＨＤＨＲＹＰＫおよびＨＡＩＹＰＲＨからなる群より選ばれるアミノ酸配列のペプチドである基材が挙げられる。

本発明に係る基材の他の態様例として、疎水性有機ポリマーが、ポリ（_Ｌ-乳酸）であり、ペプチドが、ＱＬＭＨＤＹＲ、ＬＳＱＳＬＴＲ、ＨＡＩＹＰＲＨ、ＲＡＣＳＫＤＡ、ＫＨＶＰＫＭＨ、ＡＨＰＡＬＰＬ、ＹＬＴＭＰＴＰおよびＶＹＬＴＧＰＳからなる群より選ばれるアミノ酸配列のペプチドである基材が挙げられる。

本発明では、ＧＥＴＲＡＰＬ、ＦＰＧＲＰＳＰ、ＹＬＴＭＰＴＰ、ＨＬＥＳＴＰＧ、ＨＴＡＱＳＴＡ、ＲＨＥＰＰＬＡ、ＦＳＷＥＡＦＡおよびＧＥＴＱＣＡＡからなる群より選ばれるアミノ酸配列を有するペプチドであるシンジオタクチックポリスチレン（ｓＰＳ）特異的親和性ペプチドを提供することができる。

したがって、疎水性有機ポリマーがｓＰＳであり、ペプチドが上記ｓＰＳ特異的親和性ペプチドである態様の基材も本発明の一態様として挙げられる。

本発明では、上記のような基材をタンパク質吸着阻害表面として含む医用材料も提供することができる。たとえば輸液バッグ、人工血管、カテーテルなどである。
さらに、該医用材料を含むバイオセンサーも提供することができる。たとえば上記基材を表面として含む診断プレートおよび検出プレートなどの形態のバイオセンサーである。

本発明に係る基材は、タンパク質のユニバーサルな阻害効果に優れた表面を有する有機ポリマーであり、タンパク質の吸着を回避する必要のある広範な医用材料として有用である。たとえば、本発明の基材を、検査のためのプローブをもつバイオセンサーのベース表面として利用することにより、タンパク質の非特異的吸着を阻害して標的物質の検出Ｓ／Ｎ比を上げることができ、信頼性の高い高感度バイオセンサーとすることができる。
また、上記のような表面は、有機ポリマー上に容易に形成することができ、本発明に係る基材は製造も容易である。

以下、本発明をより具体的に説明する。
本発明に係る基材を構成する支持体は、疎水性有機ポリマーからなる。ここでの疎水性はいわゆる部分疎水性として扱われるものであってもよい。この有機ポリマーは、透明であれば、光学検出系に好適な基材となる。
透明な疎水性有機ポリマーとしては、たとえば、ポリメチルメタクリラート（ＰＭＭＡ）、ポリスチレン（ＰＳとも表記する）、ポリ乳酸およびポリプロピレンなどのポリオレフィンなどが挙げられる。
後述するように、ペプチドをファージディスプレイ法を用いて選択する場合には、疎水性有機ポリマーのうちでも立体規則性の高いものを好ましく挙げることができる。具体的には、イソタクチックポリメチルメタクリラート（it-ＰＭＭＡとも表記する）、シンジオタクチックポリメチルメタクリラート（st-ＰＭＭＡとも表記する）、ポリ（_Ｌ-乳酸）（ＰＬＬＡとも表記する）、シンジオタクチックポリスチレン（ｓＰＳとも表記する）などが挙げられる。これらは市販材料として入手可能である。分子量は、固体の支持体となりうるものであればよく、基材の用途に適切なものを適宜に選択することができる。

支持体の形状は、特に制限されず、用途に応じて適宜に選択することができる。たとえば検査または診断プレートは、典型的に、フィルム、シートまたはプレートなどである。支持体は、予め所望形状を有する市販品としても入手可能である。
有機ポリマーがたとえばフィルムなどの平面を有する場合、ペプチド誘導体の膜は、少なくとも片面に設けられるが、必要に応じてフィルムの両面に設けられてもよい。また、支持体は、上記有機ポリマーがペプチド誘導体の膜が形成される表面を形成していればよく、単層であっても、下層に他の材料層を有する構成であってもよい。また、支持体の厚みも特に問われず、基材の用途に応じて適宜に選択することができる。

本発明に係る基材は、上記のような支持体の表面に、特定のペプチド誘導体の自己組織膜を有する。ペプチド誘導体の原料となるペプチドは、支持体に親和性のペプチドであればよい。本発明におけるペプチドは、特にこの方法に限定されるものではないが、たとえばファージディスプレイ法（ＰＤ法とも表記する）で選択することができる。ＰＤの手法そのものは公知である。

この手法を用いるit-ＰＭＭＡ特異的親和性を示すペプチドの選択手順の詳細は、たとえばJournal of the American Chemical Society，2005年9月15日，第127巻, 第40号，p.13780−13781に記載されており、この記載を引用することにより、本明細書に記載されているものとする。また、他の有機ポリマー特異的親和性を示すペプチドは、この手法に準じて、it-ＰＭＭＡに代えて目的の有機ポリマーを使用することにより選択することができる。
以下に、ファージディスプレイ法によるペプチド選択の一例を工程順に要約説明する。
（１）ファージディスプレイペプチドライブラリーを含むファージライブラリー（Phage library）溶液と、所定の有機ポリマーとを接触状態で所定時間放置し、ライブラリーのうちの有機ポリマーに親和性ペプチドを有するファージと有機ポリマーとの複合体を沈殿させる。
（２）沈殿した複合体を分離し、洗浄する。
洗浄には、Tween２０を含むトリス緩衝液を用いることができる。
（３）複合体からペプチドを有するファージを溶出させる。
溶出は、グリシン−塩酸緩衝液（ｐＨ２．２）を用いて行うことができる。
（４）溶出させたファージを大腸菌（E.coli ER2738）に感染させ、増幅する。
（５）増幅したファージライブラリーを、オリジナルのファージライブラリーに代えて使用する以外は上記（１）〜（４）の操作（バイオパニング）を所定回数繰り返すことができる。なお、増幅したファージライブラリー溶液は、通常、ＴＢＳで希釈して１．２×１０¹⁰ｐｆｕで使用する。

上記（１）において、ファージは大腸菌に感染する繊維状ファージを利用することができる。ファージディスプレイペプチドライブラリーは、通常、アミノ酸残基数２〜１４のペプチドからなる。このようなペプチドライブラリーを含むファージライブラリーは、たとえば、Ｐｈ.Ｄ.-７^TM Phage Display Peptide Library（NEW ENGLAND Biolabs,Inc.）の商品名でキットとして市販されている。このファージライブラリーは、Ｍ１３系のｆｄファージの非主要外殻タンパク質であるｐIIIのＮ末端に直鎖７残基のランダムなアミノ酸配列のペプチドが提示されたものであり、ペプチド４残基（ＧＧＧＳ）のスペーサーを介して野性型ｐIIIに融合した設計となっている。このライブラリーには、２０⁷個（≒１．２８×１０⁹個）のファージクローンが含まれている。
このキットを用いると、アミノ酸７残基のペプチドが選択される。

所望のペプチドは、最後の溶出操作（３）により取り出す。
上記方法により、所望する有機ポリマー特異的親和性ペプチドを有するファージが存在するか否かは、たとえば、（４）において大腸菌に感染後クローニングし、ファージクローンを取り出し、ＥＬＩＳＡ（Enzyme-linked Immunosorbent Assay）により、有機ポリマーに対する結合定数を測定し、ファージライブラリーの有機ポリマーに対する結合定数との相対比が１を超える、好ましくは１．５以上であるものが存在するか否かで判断することができる。さらに、別の有機ポリマーをリファレンスとすることにより、特定ポリマーに対する特異的親和性を判断することができる。また、ペプチドのアミノ酸配列は、ファージのクローニング、ＤＮＡシークエンシングにより決定することができる。

ＥＬＩＳＡは、特に限定されず、直接吸着法、サンドイッチ法、競合法等を用いることができる。結合定数は、ファージ濃度（［phage］）を変化させて得られた吸収の濃度依存性から以下のLangmuir式を仮定することにより、ファージの見掛けの結合定数（Ｋ_app）を求めることができる。

式中、ＲＡはＥＬＩＳＡにより求めた各濃度での吸収を示し、ＲＡ_maxは最大吸収を示す。

上記（１）において、有機ポリマーは、ファージライブラリー溶液（オリジナル）と接触させる前に、緩衝液たとえばＴＢＳ中に所定時間浸漬しておくこともできる。なお、本明細書において、アミノ酸残基は、特にことわりのない限り、一文字表記である。この一文字表記に対応する三文字表記のアミノ酸およびアミノ酸名を以下に示す。
Ａ：Ａｌａ：アラ二ン
Ｖ：Ｖａｌ：バリン
Ｌ：Ｌｅｕ：ロイシン
Ｉ：Ｉｌｅ：イソロイシン
Ｐ：Ｐｒｏ：プロリン
Ｆ：Ｐｈｅ：フェニルアラニン
Ｗ：Ｔｒｐ：トリプトファン
Ｍ：Ｍｅｔ：メチオニン
Ｇ：Ｇｌｙ：グリシン
Ｓ：Ｓｅｒ：セリン
Ｔ：Ｔｈｒ：トレオニン
Ｃ：Ｃｙｓ：システィン
Ｑ：Ｇｌｎ：グルタミン
Ｎ：Ａｓｎ：アスパラギン
Ｙ：Ｔｙｒ：チロシン
Ｋ：Ｌｙｓ：リシン
Ｒ：Ａｒｇ：アルギニン
Ｈ：Ｈｉｓ：ヒスチジン
Ｄ：Ａｓｐ：アスパラギン酸
Ｅ：Ｇｌｕ：グルタミン酸

上記のようなファージディスプレイ法により、たとえば実施例に後述するようなit-ＰＭＭＡに対するアミノ酸残基７のペプチドとして、表１に示す８種のペプチドが選択されるが、これらペプチド群には、水酸基：Ｓ（Ｓｅｒ）、Ｔ（Ｔｈｒ）、Ｙ（Ｔｙｒ）およびグアニジウム基：Ｒ（Ａｒｇ）を持つアミノ酸が頻出し、ＰＭＭＡの側鎖エステルに対してプロトンドナーとして働き、いかにも水素結合を介して相互作用していることが示唆される。また、ペプチドに硬直な折れ曲がり構造（図１参照）を誘起するＰ（Ｐｒｏ）が多く含まれていることも特徴的である。

一方、it-ＰＭＭＡ親和性として選択されたペプチドは、立体規則性のないアタクチックＰＭＭＡ（at-ＰＭＭＡ）および立体規則性の異なるst-ＰＭＭＡをリファレンスとし、得られたファージクローンによるＥＬＩＳＡ結果を示す。明らかにターゲットに設定したit-ＰＭＭＡにより多くのファージクローンが結合し、特異的なペプチド群が得られていることが分かった。
なお、リファレンス膜に対してライブラリーよりも結合量が多いことが示され、このことから、ペプチドはおそらくＰＭＭＡの疎水性を大雑把に見分け、その後立体規則性といった微細なナノ構造を厳密に認識しているが推測される。

上記知見から、ペプチドのアミノ酸残基は、少なくとも４残基あればポリマー親和性を示す可能性が示唆される。本発明では、合成面からペプチドは短い、すなわちアミノ酸残基数は少ない方が好ましい。
また、上記には、ファージディスプレイによるペプチドの選択方法について説明したが、本発明では、基材ポリマー親和性のペプチドを、ポリマーの構造、疎水性、官能基などに基づいて計算または決定により設計してもよい。

ファージディスプレイ法により選択された各種有機ポリマーに対するアミノ酸７残基のペプチドの例としては、it-ＰＭＭＡに対しては、ＥＬＷＲＰＴＲ、ＱＬＱＫＹＰＳ、ＡＲＰＨＬＳＦ、ＴＬＨＬＳＰＡ、ＱＴＭＴＹＳＲ、ＡＡＱＴＳＴＰ、ＳＳＰＷＭＲＥおよびＧＩＲＨＴＮＲなどのペプチドが挙げられる。
st-ＰＭＭＡに対しては、ＨＫＰＤＡＮＲ、ＨＰＶＨＰＨＲ、ＬＰＰＷＱＲＱ、ＨＰＲＷＨＴＰ、ＱＬＫＴＧＬＡ、ＨＰＲＬＧＬＡ、ＫＰＲＭＰＰＲ、ＨＰＷＷＲＰＳ、ＨＤＨＲＹＰＫおよびＨＡＩＹＰＲＨなどのペプチドが挙げられる。
ＰＬＬＡに対しては、ＱＬＭＨＤＹＲ、ＬＳＱＳＬＴＲ、ＨＡＩＹＰＲＨ、ＲＡＣＳＫＤＡ、ＫＨＶＰＫＭＨ、ＡＨＰＡＬＰＬ、ＹＬＴＭＰＴＰおよびＶＹＬＴＧＰＳなどのペプチドが挙げられる。
ｓＰＳに対しては、ＧＥＴＲＡＰＬ、ＦＰＧＲＰＳＰ、ＹＬＴＭＰＴＰ、ＨＬＥＳＴＰＧ、ＨＴＡＱＳＴＡ、ＲＨＥＰＰＬＡ、ＦＳＷＥＡＦＡおよびＧＥＴＱＣＡＡなどのペプチドが挙げられる。

上記it-ＰＭＭＡについて、より詳細には、配列の違いによって結合の強さやst-ＰＭＭＡとの選択性に違いが観察されることから、ペプチド中のＰ（Ｐｒｏ）にプロトンドナー性のアミノ酸が隣接している場合に結合は強くなり、Ｒ（Ａｒｇ）の数が多くなればなるほど選択性が高くなるという知見を得た。これらの要素を含むペプチドＥＬＷＲＰＴＲの−ＲＰＴＲ−（−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−）がit-ＰＭＭＡに特異結合するモチーフであることが示唆される。このモチーフの長さは最大でＭＭＡ６単位分に相当する。したがって、最大で６残基のＭＭＡ単位に結合していると推察される。なおここでの結合は、共有結合などの強固な化学結合ではなく、親和的結合を意味する。

上記のようなペプチドは、一端側にアルキレンオキシド鎖が導入されたペプチド誘導体に調製される。この際に用いられるペプチドは、支持体となる有機ポリマーに対応するペプチド群のうちから選ばれる単種のペプチドであってもよく、２種以上の組合わせであってもよい。

アルキレンオキシド鎖は、柔軟な鎖であればよく、通常、エチレンオキシド鎖である。エチレンオキシド鎖はＰＥＧの結合により導入することができる。
ＰＥＧにおけるエチレンオキシドの繰り返し単位数は、基材の用途などによっても異なり、特に制限されないが、市販品として入手容易なものとしては、４〜２４が挙げられる。実施例として後述するように、本発明では、市販のＰＥＧのうち、繰り返し単位のもっとも短い４のものでも、有機ポリマー直接表面の場合に比して９９％以上という顕著なタンパク質吸着阻害効果を示すことが確認されている。

ここで、従来公知の金表面にチオール化合物あるいはジスルフィド化合物を吸着させた金チオラート自己組織膜（ＳＡＭ）は、欠陥の少ない高密度・高配向の単分子膜であることが知られている。このような高密度ＳＡＭ構造において、ＰＥＧのタンパク質吸着阻害効果を示す最小限の単位は、繰り返し数４であるとされているが、本発明では繰り返し数４のＰＥＧであっても著しい阻害効果を示し、より短いエチレンオキシド鎖の有効性も示唆される。
なお、親和性ペプチドのみによる自己組織膜は、タンパク質吸着阻害効果を示さない。

ポリアルキレンオキシド鎖は、ペプチドのＮ末側およびＣ末側のいずれに導入されてもよい。
また、ポリアルキレンオキシド鎖は、リンカーを介してペプチドの一端に導入されていてもよい。リンカーは、たとえばアルキル、アミノ酸、他のペプチドなどである。

ポリアルキレンオキシド鎖の自由端は、−ＮＨ₂が好ましく挙げられる。また、−ＯＣＨ₃の有効性は少ないことから、疎水性として機能しうるアルキル末端を有する基よりも、−ＯＨ、−ＣＯＯＨなどの極性基が好ましい。

本発明におけるペプチド誘導体は、支持体の有機ポリマーに特異的親和性ペプチドと、柔軟なアルキレンオキシド鎖を有する構造であれば、その製法は特に限定されないが、たとえば以下のように調製することができる。
ペプチド誘導体は、アミノ基が9−フルオレニルメトキシカルボニル（Fmoc）基、側鎖官能基が種々の保護基で保護されたFmocアミノ酸誘導体を不溶性樹脂担体上でペプチドカップリング反応させることにより合成することができる。つまり、カップリング試薬を用いてあらかじめ活性化させておいたFmocアミノ酸誘導体を樹脂担体上に結合させた後、弱塩基であるピペリジンを用いてFmoc基を除去し、次のFmocアミノ酸をカップリングさせる。この反応を順次行い、目的のアミノ酸ならびにＰＥＧがすべて導入された段階で、強酸であるトリフルオロ酢酸を用いて側鎖官能基の種々の保護基の除去と樹脂担体からの切断を行い、高速液体クロマトグラフィーによる精製、凍結乾燥により目的のペプチドを得た。ＰＥＧ鎖は、通常、Ｎ末に導入する場合は最後に、Ｃ末に導入する場合は最初にカップリングさせる。

本発明に係る基材は、疎水性有機ポリマーからなる支持体表面に、上記のようなペプチド誘導体を、水またはｐＨ３〜１０程度のリン酸またはトリス緩衝液に溶かし、支持体表面を室温下、１分〜１時間浸すことにより、ペプチド誘導体の自己組織化膜を容易に形成することができる。

上記のような本発明に係る基材は、タンパク質のユニバーサルな阻害効果に優れた表面を有する有機ポリマーであり、タンパク質の吸着を回避する必要のある広範な医用材料として有用である。たとえば本発明の基材を表面にもつ輸液バッグなどが提供される。
またたとえば、本発明の基材を、検査のためのプローブなど、生体起源の分子認識機構を利用したバイオセンサーのベース表面として利用すれば、タンパク質の非特異的吸着を阻害して標的物質の検出Ｓ／Ｎ比を上げることができ、信頼性の高い高感度バイオセンサーとすることができる。したがって本発明では、本発明に係る基材を表面に含むバイオセンサーを提供することができる。

次に本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
（実施例１）ペプチドの選択
１）材料
ファージライブラリーは、前述のＰｈ.Ｄ.-７^TMPhage Display Peptide Library（NEW ENGLAND Biolabs,Inc.）を用いた。
it-ＰＭＭＡ（Ｍｎ＝３５５００, Ｍｗ／Ｍｎ＝１．１２, ｍｍ：ｍｒ：ｒｒ＝９８：２：０（ｍｍ、ｍｒ、ｒｒは、それぞれイソ、ヘテロ、シンジオタクチック含量を示す））フィルムは、該ポリマーのクロロホルム溶液からガラスまたは金表面へスピンコート（２０００ｒｐｍ，１分）により調製した。
st-ＰＭＭＡ（Ｍｎ＝２８２００, Ｍｗ／Ｍｎ＝１．２６, ｍｍ：ｍｒ：ｒｒ＝０：１１：８９）のフィルムは、該ポリマーのクロロホルム溶液からガラスまたは金表面へスピンコート（２０００ｒｐｍ，１分）により調製した。
at-ＰＭＭＡ（Ｍｎ＝２８７５０，Ｍｗ／Ｍｎ＝１．０３，ｍｍ：ｍｒ：ｒｒ＝１０：１５：７５）のフィルムは、該ポリマーのクロロホルム溶液からガラスまたは金表面へスピンコート（２０００ｒｐｍ，１分）により調製した。
ＰＬＬＡ（Ｍｎ＝４１１００, Ｍｗ／Ｍｎ＝１．５７）フィルムは、該ポリマーのクロロホルム溶液からガラスまたは金表面へのスピンコートし、２００℃で１０分間熱処理することにより調製した。
ｓＰＳ（Ｍｗ＝１９００００）フィルムは、加熱した該ポリマーのトルエン溶液からガラスまたは金表面へのスピンコートにより調製した。

２）ファージディスプレイによる有機ポリマー特異的親和性ペプチドの選択
各ポリマーフィルムに対する、アミノ酸７残基のランダムペプチドを以下のように選択した。
ポリマーフィルム上に増幅したファージライブラリー溶液を１．２×１０^１０ pfuになるよう１５０ｍＭのＮａＣｌを含むｐＨ７．４のトリス緩衝液（ＴＢＳ）で希釈してマウントし、室温で１時間静置した後ファージ溶液を除去した。０．１ｖｏｌ％のＴｗｅｅｎ ２０を含むＴＢＳ、１００−１５０μＬでポリマーフィルムをそれぞれ５回洗浄した後、溶出用のグリシン−塩酸緩衝液（ｐＨ２．２）２０μＬをマウントし室温で１５分静置しファージを溶出させた。溶出液を回収し、１ Ｍトリス−塩酸（ｐＨ ９．１）を７．５μＬ加えて中和した後、限外濾過膜 (分画分子量１００ｋＤａ) に移し、ＴＢＳで約１ｍＬにメスアップした。１８０１ｇ（４０００ｒｐｍ）、４℃で２分遠心し、約５０μＬまでファージ溶液を濃縮した。再度ＴＢＳで約１ｍＬにメスアップし遠心する操作を２回繰り返すことで (計３回) バッファー交換と同時にファージ溶液を濃縮した後、ＴＢＳで約２００μＬにメスアップし、４℃で保存し増幅させた。得られたファージプールを同様にポリマーフィルムに相互作用させ、同様の操作を３〜５回繰り返した。最終的に得られたファージプールを定法に従いクローニングし、ＤＮＡ配列解析によりアミノ酸配列を決定した。

３）it-ＰＭＭＡ特異的親和性ペプチド
it-ＰＭＭＡ特異的親和性を提示したファージライブラリー（１．２８×１０⁹の多様性）により５回バイオパニングした後、ファージのクローニング、ＤＮＡシークエンシングにより明らかになったペプチド（クローンit-ｃ０１〜it-ｃ０９）およびそのペプチドを提示したクローンの結合定数（Ｋ_app）およびリファレンスとしたポリマーの結合定数（Ｋ_app）との相対比を表１に示す。このうち、it-ｃ０１〜it-ｃ０８をit-ＰＭＭＡ特異的親和性ペプチドとして選択した。

表１中、itは、it-ＰＭＭＡを示し、stは、ここでのリファレンスのst-ＰＭＭＡを示す。Lib.はバイオパニングしていないファージライブラリを示す。

上記ファージクローンと、立体規則性のないat-ＰＭＭＡおよびit-ＰＭＭＡとは別の立体規則性をもつst-ＰＭＭＡをリファレンスとして得られたファージクローンによるＥＬＩＳＡ結果を図２に示す。明らかにターゲットに設定したit-ＰＭＭＡにより多くのファージクローンが結合し、it-ＰＭＭＡ特異的結合（親和性）が示された。

４）st-ＰＭＭＡ特異的親和性ペプチド
st-ＰＭＭＡ特異的親和性を提示したファージライブラリー（１．２８×１０⁹の多様性）により３回（ただし、表３中、st-c02は４回、st-c06は８回）バイオパニングした後、ファージのクローニング、ＤＮＡシークエンシングにより明らかになったペプチド（クローンst-ｃ０１〜st-ｃ１７）およびそのペプチドを提示したクローンの結合定数（Ｋ_app）およびリファレンスとしたポリマーの結合定数（Ｋ_app）との相対比を表２に示す。このうち、st-ｃ０１〜st-ｃ１０をst-ＰＭＭＡ特異的親和性ペプチドとして選択した。なお、st-ＰＭＭＡフィルムは、予め緩衝液（ＴＢＳ）に１５時間浸漬する前処理を施した。

表２中、stは、st-ＰＭＭＡを示し、itはit-ＰＭＭＡ（ここでのリファレンス）を示す。

５）ＰＬＬＡ特異的親和性ペプチド
ＰＬＬＡ特異的親和性を提示したファージライブラリー（１．２８×１０⁹の多様性）により４回（ただし、表３中、L-c05のみ３回）バイオパニングした後、ファージのクローニング、ＤＮＡシークエンシングにより明らかになったペプチド（クローンＬ-ｃ０１〜Ｌ-ｃ０９）およびそのペプチドを提示したクローンの結合定数（Ｋ_app）およびリファレンスとしたポリマーの結合定数（Ｋ_app）との相対比（ＰＬＬＡ／ＰＭＭＡ）を表３に示す。このうち、Ｌ-ｃ０１〜Ｌ-ｃ０８をst-ＰＭＭＡ特異的親和性ペプチドとして選択した。

６）ｓＰＳ特異的親和性ペプチド
ｓＰＳ特異的親和性を提示したファージライブラリー（１．２８×１０⁹の多様性）により８回バイオパニングした後、ファージのクローニング、ＤＮＡシークエンシングにより明らかになったペプチド（クローンsps-ｃ０１〜sps-ｃ０８）およびそのペプチドを提示したクローンの結合定数（Ｋ_app）を表４に示す。sps-ｃ０１〜sps-ｃ０８のペプチドをｓＰＳ特異的親和性ペプチドとして選択した。

（実施例２）基材の作成
（１）ペプチド誘導体の調製
上記で選択したit-ＰＭＭＡ特異的親和性ペプチドのうち、it-ｃ０１の配列をもつペプチドのＮ末側に、ＰＥＧ（エチレンオキシド繰り返し単位数＝４）を導入して、下記構造のペプチド誘導体（以下、ＥＧ_４−it-ｃ０１と表記）を調製した。

（２）表面プラズモン共鳴法によるＥＧ_４−it-ｃ０１の固定化
ＮａＣＬを１５０ｍＭ含む１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）を用いて所定濃度（１０μＭ〜５ｍＭ）のＥＧ_４−it-ｃ０１溶液を調製した。
表面プラズモン共鳴装置（ＳＰＲ）（ビアコア社製、Bioacore Ｘ）に用いる金コートしたセンサーチップ上に、１０ｎｍ厚さのit-ＰＭＭＡフィルムを調製した。
得られたセンサーチップをＳＰＲ装置に装着した後、ＥＧ_４−it-ｃ０１溶液を３７℃下、所定ＲＵ（ＲＵ：ビアコア社製ＳＰＲに用いられる結合量を表す単位で、１ＲＵ＝０．１ｎｇ／ｃｍ^−２）に結合になるまでフローした。

（試験例１）ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）の吸着試験
ＮａＣＬを１５０ｍＭ含む１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ ７．４）を用いて、１μＭのＢＳＡ溶液を調製した。実施例２で調製したit-ＰＭＭＡフィルムでコートしたセンサーチップ、またはこのフィルム上にＥＧ_４−it-ｃ０１をコートしたセンサーチップをＳＰＲ装置に装着した後、ＢＳＡ溶液をフローした（図１参照）。ＲＵ値の変化から、ＢＳＡの吸着挙動を観察した。

図３にＢＳＡの吸着量をリアルタイム計測した結果を示す。it-ＰＭＭＡ表面に対して、ＢＳＡは１３００ＲＵ程度吸着するのに対し、ＥＧ_４−it-ｃ０１をコートすることにより、ＢＳＡの吸着量は減少した。

図４にＥＧ_４−it-ｃ０１のコート量とＢＳＡの吸着量の関係を示す。ＢＳＡの吸着量は、ＥＧ_４−it-ｃ０１のコート量の増加に伴い、ほぼ直線的に減少した。ＥＧ_４−it-ｃ０１を１１００ＲＵ程度コートすることでＢＳＡの吸着量は、コートしていないit-ＰＭＭＡ表面に比べ９９％減少することが分かった。ＥＧ_４−it-ｃ０１は、it-ｃ０１部分でit-ＰＭＭＡに結合するため、水相にエチレングリコール鎖を向けた構造が予想される。ＢＳＡの吸着は、これらの水和したエチレングリコール鎖の排除体積効果により抑制されていると考えられる。これらの結果は、ＥＧ_４−it-ｃ０１がタンパク質吸着抑制剤として機能することを示している。

本発明に係る基材の表面上にＢＳＡの流体を接触させる態様を模式的に示す図である。 ファージクローンによるＥＬＩＳＡを示す。 ＢＳＡ吸着量のリアルタイム計測チャートを示す（カッコ内はコートしたＥＧ_４−it-ｃ０１量を示す。）。 ＥＧ_４−it-ｃ０１のコート量とＢＳＡの吸着量の関係を示すグラフである。

Claims (12)

1. 疎水性有機ポリマーからなる支持体の表面上に、
   該疎水性有機ポリマー特異的に親和性を有するペプチドの一端側にポリアルキレンオキシド鎖が導入されたペプチド誘導体からなる自己組織膜を有する基材。
2. 前記ペプチドが、アミノ酸残基４以上のペプチドである請求項１に記載の基材。
3. 前記ペプチドが、ファージディスプレイ法により選択されたペプチドである請求項１または２に記載の基材。
4. 前記ポリアルキレンオキシド鎖が、ポリエチレンオキシドである請求項１〜３のいずれかに記載の基材。
5. 前記疎水性有機ポリマーが、高立体規則性ポリマーである請求項１〜４のいずれかに記載の基材。
6. 前記疎水性有機ポリマーが、イソタクチックポリメチルメタクリラートであり、前記ペプチドが、ＥＬＷＲＰＴＲ、ＱＬＱＫＹＰＳ、ＡＲＰＨＬＳＦ、ＴＬＨＬＳＰＡ、ＱＴＭＴＹＳＲ、ＡＡＱＴＳＴＰ、ＳＳＰＷＭＲＥおよびＧＩＲＨＴＮＲからなる群より選ばれるアミノ酸配列のペプチドである請求項１〜４のいずれかに記載の基材。
7. 前記疎水性有機ポリマーが、シンジオタクチックポリメチルメタクリラートであり、前記ペプチドが、ＨＫＰＤＡＮＲ、ＨＰＶＨＰＨＲ、ＬＰＰＷＱＲＱ、ＨＰＲＷＨＴＰ、ＱＬＫＴＧＬＡ、ＨＰＲＬＧＬＡ、ＫＰＲＭＰＰＲ、ＨＰＷＷＲＰＳ、ＨＤＨＲＹＰＫおよびＨＡＩＹＰＲＨからなる群より選ばれるアミノ酸配列のペプチドである請求項１〜４のいずれかに記載の基材。
8. 前記疎水性有機ポリマーが、ポリ（_Ｌ-乳酸）であり、前記ペプチドが、ＱＬＭＨＤＹＲ、ＬＳＱＳＬＴＲ、ＨＡＩＹＰＲＨ、ＲＡＣＳＫＤＡ、ＫＨＶＰＫＭＨ、ＡＨＰＡＬＰＬ、ＹＬＴＭＰＴＰおよびＶＹＬＴＧＰＳからなる群より選ばれるアミノ酸配列のペプチドである請求項１〜４のいずれかに記載の基材。
9. ＧＥＴＲＡＰＬ、ＦＰＧＲＰＳＰ、ＹＬＴＭＰＴＰ、ＨＬＥＳＴＰＧ、ＨＴＡＱＳＴＡ、ＲＨＥＰＰＬＡ、ＦＳＷＥＡＦＡおよびＧＥＴＱＣＡＡからなる群より選ばれるアミノ酸配列を有するペプチドであるシンジオタクチックポリスチレン特異的親和性ペプチド。
10. 前記疎水性有機ポリマーが、シンジオタクチックポリスチレンであり、前記ペプチドが請求項９に記載のペプチドである請求項１〜４のいずれかに記載の基材。
11. 請求項１〜８および１０のいずれかに記載の基材をタンパク質吸着阻害表面として含む医用材料。
12. 請求項１１に記載の医用材料を含むバイオセンサー。

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