JPH05322901A - ペプチドの検出又は測定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】目的ペプチドの受容体の構造中の部分配列をも
つペプチド、例えば、Ａ型利尿ホルモンの受容体の部分
配列ペプチドPro-Ala-Ile-Glu-Tyr-Alaやエンドセリン
−１の受容体の部分配列ペプチドSer-Asp-Tyr-Lys-Gly-
Lysをプローブとして目的ペプチドを捕捉し、目的ペプ
チドを検出又は測定する。 【効果】Ａ型利尿ホルモンやエンドセリン−１等の生理
活性ペプチドを容易に検出又は測定できる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明はペプチドの検出又は測定
方法に関し、更に詳しくは臨床検査、生化学、薬学等の
分野において重要なペプチドを検出する方法又は測定す
る方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】生体内には、神経分泌ホルモン、下垂体
前葉から分泌される種々の刺激ホルモン、あるいは消化
管ホルモンのようなペプチドホルモンが存在し、血圧、
血糖レベル等の恒常性の維持に、重要な役割を果たして
いる。これらの生理活性ペプチドは標的細胞に存在する
受容体に結合し、続いて標的細胞がこれに応答すること
が知られている。

【０００３】これらの生理活性物質を検出又は測定する
方法としては、生理活性物質がペプチド性物質である場
合には、従来、これらの生理活性物質を抗原として調製
した抗体を利用する方法がよく用いられる。すなわち、
目的ペプチド（抗原）を含む試料に、別途準備・調製し
た（目的のペプチドに特異的に結合する）抗体を反応さ
せ、抗原−抗体複合物を分離し、抗体の目印（予め、
¹²⁵Ｉ等で標識しておく。）を検出・測定したり、その
抗体に結合する抗体（二次抗体）を反応させて、反応し
た二次抗体（予め、¹²⁵Ｉ等で標識しておく。）を検出
・測定したりして、目的ペプチドの量を求めるのであ
る。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】抗体は通常、ウサギ、
マウス、ヤギ等の動物を抗原で免疫し、その血清から取
得したり（抗血清、ポリクローナル抗体）、細胞融合法
により作製した抗体産生性ハイブリドーマを動物の腹く
う又はフラスコ内で培養して、腹水又は培養液から回収
し（モノクローナル抗体）、得られる。しかし、抗体を
用いる方法は、ポリクローナル抗体の場合、産生量が不
安定であったり、製造ロット間で親和性や力価等の性能
にバラツキがあったり等の問題があり、モノクローナル
抗体の場合には、目的の性能の抗体を産生するハイブリ
ドーマの作製に手間や時間がかかる等の問題がある。更
に、抗体は高分子量のタンパク質であるので、温度やプ
ロテアーゼに対して比較的不安定である。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、抗体と同
様な親和性を保持しながら、これとは異って、分子量が
比較的小さく、化学合成が容易なペプチドを種々検討し
た結果、受容体の構造中の、目的ペプチドに結合する部
位のアミノ酸配列をもったペプチドが、これらの性質を
有していることを見出し、本発明を完成した。

【０００６】すなわち、本発明は下記の（１）〜（４）
に関するものである。 （１）目的ペプチドの受容体の構造中の部分配列をもつ
ペプチド又はその誘導体をプローブとして、目的ペプチ
ドを捕捉することを特徴とする目的ペプチドの検出又は
測定方法。 （２）受容体の構造中の部分配列が、目的ペプチドとの
結合に関与する部分配列である上記（１）又は（２）の
検出又は測定方法。 （３）受容体の構造中の部分配列をもつペプチドがPro-
Ala-Ile-Glu-Tyr-Alaであり、目的ペプチドがＡ型利尿
ホルモン（以下、ＡＮＰと略す）である上記(１)又は
（２）の検出又は測定方法。 （４）受容体の構造中の部分配列をもつペプチドがSer-
Asp-Tyr-Lys-Gly-Lysであり、目的ペプチドがエンドセ
リン−１（以下、ＥＴ−１と略す）である上記(１)又は
（２）の検出又は測定方法。

【０００７】本発明における目的ペプチドとしては、オ
キシトシン、バソプレッシン、黄体形成ホルモン放出ホ
ルモン等の神経分泌ホルモン、甲状腺刺激ホルモン、副
腎皮質刺激ホルモン、性腺刺激ホルモン等の刺激ホルモ
ン、ガストリン、セクレチン等の消化管ホルモン、その
他、インシュリン、グルカゴン、ＥＧＦ、ＮＧＦ等があ
り、これらはいずれも生体内で重要な役割を担っている
生理活性ペプチドで、その構造（アミノ酸配列）も知ら
れているものが多い。

【０００８】いっぽう、それぞれの生理活性ペプチドに
対する標的細胞の受容体のアミノ酸配列も解明されてい
るものが少なくない。そこで、受容体の構造中、目的ペ
プチドに対して親和性のある部分配列を見出すために
は、既知の受容体のアミノ酸配列を参考にして、異種間
で受容体のアミノ酸配列を比較し相同性の高い部分を捜
し出したり、類似した性質をもつ受容体間でアミノ酸を
比較し相同性の高い部分を捜し出したりして行う。

【０００９】更には、精製した受容体にフォトアフィニ
ティーラベル等の方法で目的の生理活性ペプチドを共有
結合させ、限定加水分解し、その分解物（オリゴペプチ
ド）のアミノ酸配列を調べ、結合部位のアミノ酸配列を
いくつか推定し、これらを合成し、合成ペプチドについ
て目的の生理活性ペプチドとの結合能を試験することに
よっても、行うことができる。

【００１０】このようにして見出し、あるいは結合能を
確認したペプチドは、通常、アミノ酸の数はおよそ２０
以下である。そのペプチドは遊離の形であってもよい
し、塩の形であってもよい。また、そのペプチドから化
学的に誘導される誘導体であってもよい。これらのペプ
チドは、ペプチドのアミノ酸配列をコードする遺伝子を
大腸菌等の細胞に導入してその細胞によっても得られる
が、アミノ酸の数が２０以下と小さく、誘導体の合成も
可能なことから、化学合成が有利である。化学合成は公
知の方法、例えば、慣用されている固相合成法や液相合
成法等を用いて行えばよい。

【００１１】ペプチドの誘導体としては、ペプチドのア
ミノ酸残基の側鎖に水酸基、アミノ基、カルボキシル基
を導入したもの等が挙げられ、また、α−アラニンに対
するβ−アラニン等のように、構造異性体で置き換えた
ものであってもよい。

【００１２】プローブである上記ペプチド又はその誘導
体を用い、目的のペプチドを捕捉するためには、通常、
上記ペプチド又はその誘導体をタイタープレートあるい
はビーズのような固体に固定化して用いる。固定化の方
法としては、物理吸着法又は化学的結合法があるが、そ
れらの中では、種々のスペーサを介することにより一定
の配向性をもたせ、しかも強固に結合させることが可能
な化学的共有結合による方法が、好ましい。

【００１３】プローブであるペプチド又はその誘導体を
固体に固定すれば、その結合能を利用して目的ペプチド
を捕捉することができるが、これを検出又は測定できる
ようにするためには、通常、標識物で標識された第２の
特異的反応物質を反応させる。標識物で標識された第２
の特異的反応物質としては、従来のサンドイッチ型酵素
免疫分析法で用いられる場合と同様に、目的ペプチドに
対する抗体を用いることができる。目的ペプチドが受容
体の２ヵ所以上で結合するものであるときは、プローブ
に用いたペプチドとは異なる他の結合部位に関する部分
配列をもつペプチドであってもよい。

【００１４】第２の特異的反応物質である抗体又はペプ
チドに標識を付ける方法も、従来のサンドイッチ型酵素
免疫分析法で用いられている方法を同様に利用できる。

【００１５】標識物としては、¹²⁵Ｉ、酵素（ペルオキ
シダーゼ、アルカリフォスファターゼ、β−ガラクトシ
ダーゼ、グルコース６リン酸デヒドロゲナーゼ、あるい
はグルコースオキシダーゼなど）、蛍光物質又は磁性体
等がある。

【００１６】第２の特異的反応物質が抗体である場合、
抗体を¹²⁵Ｉで標識するには抗体中のチロシン残基に¹²⁵
Ｉを導入する。また、抗体を酵素で標識するには、カル
ボジイミドあるいはスクシンイミド等を用い、抗体と酵
素を化学的に結合すればよい。

【００１７】第２の特異的反応物質が、プローブに用い
たペプチドとは異なる他の結合部位に関する部分配列を
もつペプチドである場合には、これを¹²⁵Ｉで標識する
には、ペプチドの末端にチロシンを付加し、¹²⁵Ｉを導
入すればよい。また、そのペプチドに酵素を導入する場
合には、その第２のペプチドにシステイン、グルタミン
酸、あるいはリジン等を付加したのち、これに標識酵素
を化学的に結合させればよい。このときプローブのペプ
チドと標識酵素の間に炭素鎖などのスペーサを挟んで結
合させることもできる。

【００１８】

【実施例】以下、実施例により本発明を更に詳細に説明
する。 実施例１ ＡＮＰの測定 （ａ）ペプチド(Pro-Ala-Ile-Glu-Tyr-Ala)の合成 ミモトープ デザイン キット[ケンブリッジ リサーチ
バイオケミカルズ社(Cambridge Research Biochemicals
Inc.)製]を用いて、そのピンブロック上にＡＮＰに対
して親和性を持つペプチドのPro-Ala-Ile-Glu-Tyr-Ala
を合成した。

【００１９】ペプチドの合成方法はキットに付属するマ
ニュアルに従い、キットに含まれるピンブロック及び９
-fluorenylmethyloxycarbonyl(以下、Fmocと略す)-L-ア
ミノ酸を用いて行った。用いたアミノ酸は全てアミノ基
をFmoc基で保護したpentafluorophenyl エステル(以
下、-Opfpと略す)であり、チロシンの側鎖保護基はt-bu
tyl ether(以下、-tBuと略す)、グルタミン酸の側鎖保
護基はt-butyl エステル(以下、-OtBuと略す)である。
また、合成に用いたポリエチレン製のピンの先端表面は
グラフト重合したアクリル酸ポリマーで、それにはFmoc
-β-アラニンがヘキサメチレンジアミンのスペーサを介
して、共有結合している。

【００２０】Fmoc-β-アラニンが共有結合したピンブロ
ックをピペリジン／Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（以
下、ＤＭＦと略す）混合液（２０：８０ 容量比）に３
０分間浸漬して保護基（Fmoc-）を外し、ピンブロック
をＤＭＦで５分間（２回）、メタノールで２分間（１
回）及びメタノールで５分間（２回）洗浄した後、メタ
ノールを完全に蒸散させた。ピンブロックをＤＭＦ中に
５分間浸し、次にFmoc-L-α-アラニン溶液に３０℃で１
８時間浸漬してL-α-アラニン(以下、単にアラニンとい
う。)を付加させた。このときのFmoc-アラニン溶液は２
２．５ｍＭの１-hydroxy-benzotriazole（以下、ＨＯＢ
Ｔと略す）を含むＤＭＦ溶液に最終濃度２０ｍＭになる
ように調製した。アラニンを付加した後、ＤＭＦで２分
間、メタノールで２分間（３回）洗浄した。

【００２１】チロシン、グルタミン酸、イソロイシン、
アラニン及びプロリンについて上記と同様の操作を繰り
返した。上記アミノ酸を全て結合させた後、最後のアミ
ノ酸であるプロリンのアミノ基の保護基を外し、次い
で、このペプチドを結合させたピンブロックをＤＭＦ、
無水酢酸及びトリエチルアミンの５：２：１（容量比）
混合液に３０℃で９０分間浸漬し、プロリンのアミノ基
をアセチル基によって保護した。反応後ＤＭＦで２分
間、更にメタノールで２分間（３回）洗浄した。

【００２２】風乾後、側鎖の保護基を外すために、トリ
フルオロ酢酸、アニソール及びエタンジチオールの９
５：２.５：２.５（容量比）混合液に室温で４時間浸漬
した。これを風乾後、０．１％(w/v)塩酸及び５０％(v/
v)メタノールを含む水溶液に浸漬し、超音波処理し、風
乾して、以後の実験に用いた。このピンブロックのピン
の先端には、Ｎ末端のプロリンのアミノ基がアセチル化
されたPro-Ala-Ile-Glu-Tyr-Ala-のヘキサペプチドが共
有結合で付いている。

【００２３】（ｂ）ＡＮＰの検量曲線の作成 得られたペプチドのＡＮＰに対する結合能の試験及びＡ
ＮＰの検量曲線の作成は以下のようにして行った。ピン
ブロック及びタイタープレート(ヌンク社製、イムノプ
レート Ｉ)に対するＡＮＰの非特異的な吸着を防ぐため
に、９６穴タイタープレートに１ウェル当り、０．２％
(w/v)脱脂粉乳（Kirkegaard and Perry Laboratories.
Inc. ）４００μｌを入れ、それぞれのピンが各ウェル
に入るようにピンブロックのピンをタイタープレートの
ウェルに浸漬し、３７℃で２時間インキュベートした。

【００２４】ピンブロック及びタイタープレートを洗浄
液（０．１％(w/v)のツイーン２０含有のダルベッコの
リン酸緩衝液）で充分に洗った後、０．１％(w/v)脱脂
粉乳及び０．１％(w/v)ツイーン２０含有のダルベッコ
のリン酸緩衝液（以下、緩衝液１と略す）に溶かしたヒ
ト由来のＡＮＰ（ペプチド研究所（株））を１ウェル当
り１７５μｌずつ各ウェルに加え、ピンを浸漬させて３
７℃で１時間インキュベートした。このとき、各ウェル
中のＡＮＰの濃度は０．０５μｇ／ｍｌから１００μｇ
／ｍｌの範囲の所定濃度とし、ＡＮＰを含まない緩衝液
のみのものも用意した。

【００２５】ピンブロック及びタイタープレートを洗浄
液で洗い、緩衝液１で２０００倍に希釈した抗ヒトＡＮ
Ｐウサギ血清(ペプチド研究所(株)製)を１ウエル当り１
７５μｌ加え、ウェル中にピンを浸漬させ、３７℃で１
時間インキュベートした。

【００２６】ピンブロック及びタイタープレートを洗浄
液で充分に洗った後、緩衝液１で２０００倍に希釈した
アルカリフォスファターゼ標識抗ウサギヤギ抗体(Kirke
gaard and Perry Laboratories. Inc. 製；二次抗体)を
１ウエル当り１７５μｌを加え、ウェル中にピンブロッ
クを浸漬させ、３７℃で１時間インキュベートした。

【００２７】ピンブロック及びプレートを洗浄液で充分
洗ったあと、アルカリフォスファターゼ用基質であるｐ
−ニトロフェニルリン酸溶液（Kirkegaard and Perry L
aboratories. Inc. 製）を１ウエル当り１７５μｌ加
え、ウェル中にピンブロックを浸漬し、３７℃で２時間
反応させた。このとき、ピンを入れずにウェルに基質の
みを加えたものを用意し、これを対照とした。

【００２８】ピンブロックを取り除いて反応を停止し、
各ウェルから１００μｌずつを別のプレートの各ウェル
に採り、マイクロプレートリーダー（コロナ電気（株）
ＭＴＰ−２２形マイクロプレート光度計）を用い、各ウ
ェルの溶液の吸光度（Ａ₄₀₅−Ａ₄₉₂）を求めた。このと
き対照を用いて吸光度差ゼロの状態を調整した。

【００２９】図１にその結果を示した。この方法によ
り、およそ１．０μｇ／ｍｌから１００μｇ／ｍｌの範
囲でＡＮＰ濃度を測定できることがわかる。

【００３０】実施例２ エンドセリン−１の測定 （ａ）ペプチド（Ser-Asp-Tyr-Lys-Gly-Lys）の合成 ミモトープ デザイン キットを用いて、実施例１（ａ）
と同様の方法でピンブロック上に、ＥＴ−１に親和性を
持つペプチドを合成した。

【００３１】ペプチドの合成方法はキットに付属するマ
ニュアルに従い、キットに含まれるピンブロック及びFm
oc-L-アミノ酸を用いて行った。用いたアミノ酸の活性
エステルは、セリンのほかは全てアミノ基がFmoc基で保
護されたpentafluorophenylエステルであり、セリンの
みはアミノ基がFmoc基で保護されたdihydroxy-benzotri
azineエステル(以下、-ODhbtと略す)である。またセリ
ンおよびチロシンの側鎖保護基はt-butyl ether、アス
パラギン酸の側鎖保護基はt-butyl ester、リジンの側
鎖保護基t-butyloxycarbonyl(以下、Boc-と略す)であ
る。また、合成に用いたポリエチレン製のピンの先端表
面はグラフト重合したアクリル酸ポリマーで、それには
Fmoc-β-アラニンがヘキサメチレンジアミンのスペーサ
を介して、共有結合している。

【００３２】Fmoc-β-アラニンが共有結合したピンブロ
ックをピペリジン／ＤＭＦ混合液（２０：８０ 容量
比）に３０分間浸漬して保護基（Fmoc-）を外し、ピン
ブロックをＤＭＦで５分間（２回）、メタノールで２分
間（１回）及びメタノールで５分間（２回）洗浄した
後、メタノールを完全に蒸散させた。ピンブロックをＤ
ＭＦ中に５分間浸し、次にFmoc-リジン溶液に３０℃で
１８時間浸漬してリジンを付加させた。このときのFmoc
-リジン溶液は２２．５ｍＭのＨＯＢＴを含むＤＭＦ溶
液に最終濃度２０ｍＭになるように調製した。リジンを
付加した後、ＤＭＦで２分間、メタノールで２分間（３
回）洗浄した。

【００３３】グリシン、リジン、チロシン、アスパラギ
ン酸及びセリンについて上記と同様の操作を繰り返し
た。上記アミノ酸を全て結合させた後、最後のアミノ酸
であるセリンのアミノ基の保護基を外し、次いで、この
ペプチドを結合させたピンブロックをＤＭＦ、無水酢酸
及びトリエチルアミンの５：２：１（容量比）混合液に
３０℃で９０分間浸漬し、セリンのアミノ基をアセチル
基によって保護した。反応後ＤＭＦで２分間、更にメタ
ノールで２分間（３回）洗浄した。

【００３４】風乾後、側鎖の保護基を外すために、トリ
フルオロ酢酸、アニソール及びエタンジチオールの９
５：２.５：２.５（容量比）混合液に室温で４時間浸漬
した。これを風乾後、０．１％(w/v)塩酸及び５０％(v/
v)メタノールを含む水溶液にペプチドを結合させたピン
ブロックを浸漬し、超音波処理し、風乾して、以後の実
験に用いることにした。このピンブロックのピンの先端
にはＮ末端のセリンのアミノ基がアセチル化されたSer-
Asp-Tyr-Lys-Gly-Lys-のヘキサペプチドが共有結合で付
いている。

【００３５】（ｂ）ＥＴ−１の検量曲線の作成 ＡＮＰの代わりにＥＴ−１（ペプチド研究所（株）製）
を用い、更にPro-Ala-Ile-Glu-Tyr-Ala-が共有結合で付
いていピンブロックの代わりにSer-Asp-Tyr-Lys-Gly-Ly
s-が共有結合で付いているピンブロックを用いたほか
は、実施例１（ｂ）と同様に操作し、ＥＴ−１に対する
の結合能の試験及びＥＴ−１の検量曲線を作成した。

【００３６】図２にその結果を示した。０．１μｇ／ｍ
ｌから１．０μｇ／ｍｌの濃度範囲のＥＴ−１によく応
答して発色するので、この方法では、およそ０．１μｇ
／ｍｌから１．０μｇ／ｍｌの濃度範囲でＥＴ−１を測
定できることが分かる。

【００３７】

【発明の効果】本発明により、抗体と同様な親和性を保
持しながら、これとは異なり分子量が比較的小さいため
化学合成が容易なペプチドを用いて、目的の生理活性ペ
プチドを容易に測定できる方法を提供できた。

【図面の簡単な説明】

【図１】ＡＮＰの検量曲線のグラフを示す。

【図２】ＥＴ−１の検量曲線のグラフを示す。

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】目的ペプチドの受容体の構造中の部分配列
   をもつペプチド又はその誘導体をプローブとして、目的
   ペプチドを捕捉することを特徴とする目的ペプチドの検
   出又は測定方法。
2. 【請求項２】受容体の構造中の部分配列が、目的ペプチ
   ドとの結合に関与する部分配列である請求項１に記載の
   検出又は測定方法。
3. 【請求項３】受容体の構造中の部分配列をもつペプチド
   がPro-Ala-Ile-Glu-Tyr-Alaであり、目的ペプチドがＡ
   型利尿ホルモンである請求項１又は請求項２のいずれか
   に記載の検出又は測定方法。
4. 【請求項４】受容体の構造中の部分配列をもつペプチド
   がSer-Asp-Tyr-Lys-Gly-Lysであり、目的ペプチドがエ
   ンドセリン−１である請求項１又は請求項２のいずれか
   に記載の検出又は測定方法。