JP2018072297A

JP2018072297A - 分散性安定化された、金コロイドにタンパク質が吸着した複合体

Info

Publication number: JP2018072297A
Application number: JP2016216445A
Authority: JP
Inventors: 悠武藤; Yu Muto
Original assignee: Tosoh Corp
Current assignee: Tosoh Corp
Priority date: 2016-11-04
Filing date: 2016-11-04
Publication date: 2018-05-10
Anticipated expiration: 2036-11-04
Also published as: JP6787053B2

Abstract

【課題】分散性を高めたタンパク修飾金コロイドを提供する。【解決手段】金コロイドにタンパク質が吸着した複合体であって、金コロイドに吸着している部分以外のタンパク質表面の一部又は全部がポリエチレングリコールで修飾されていることを特徴とする複合体。タンパク質が抗体である、複合体。ポリエチレングリコールの鎖長が３０Å以上である、複合体。【選択図】図１

Description

本発明は、分散性安定化された、金コロイドにタンパク質が吸着した複合体に関するものである。

イムノクロマト等の体外診断における染色材料として、金コロイドが多く用いられる。金コロイドは表面プラズモン共鳴に起因した赤色の強い発色を有しており、視覚による簡易的な診断を可能にする。金コロイドへのタンパク質固定化は、一般的に金コロイド表面が負に帯電したことを利用した静電的な物理吸着により行われる。しかし、吸着させるタンパク質の性質によっては、金コロイドの凝集が進行してしまうことがあった。

金コロイド粒子の凝集を防ぐタンパク質固定化方法として、例えば特許文献１には、チオール基を有する非架橋アミノデキストランにより金コロイドを覆う方法が示されている。この方法では、金コロイドをコアに有し、周辺をアミノデキストランで覆うコアーシェル構造を形成することで、金コロイドの分散安定性を向上している。

また、特許文献２にはジスルフィド基又はチオール基を有する化合物を用いて金コロイドを修飾する方法が示されている。

これらの方法はどちらも金コロイドをコアに有するコアーシェル型の粒子を作製した後に、シェルの表面に存在する官能基を利用してタンパク質を導入する必要があり、物理吸着によるタンパク質固定化に比べ、操作が煩雑であった。

特許第３５８３４１５号公報特許第５２０３６００号公報

本発明の目的は、分散性安定化された、金コロイドにタンパク質が吸着した複合体を提供することにある。

上記課題に鑑みてなされた本発明は、以下の態様を包含する。
（１）金コロイドにタンパク質が吸着した複合体であって、金コロイドに吸着している部分以外のタンパク質表面の一部又は全部がポリエチレングリコールで修飾されていることを特徴とする前記複合体。
（２）前記タンパク質が抗体である、請求項１に記載の複合体。
（３）前記ポリエチレングリコールの鎖長が３０Å以上である、請求項１または２に記載の複合体。
（４）金コロイドの表面にタンパク質を吸着させた後、前記タンパク質の表面に対しポリエチレングリコールで修飾を行う請求項１〜３に記載の複合体の製造方法。

以下、本発明について詳細に説明する。

本発明に用いられる金コロイドは、体外診断、バイオセンサー等の分析で用いられるものであればよく、特に限定されない。金コロイドは表面プラズモン効果による赤色が確認可能な大きさであればよく、サイズは特に限定されない。本発明における金コロイドの直径は好ましくは１０〜２００ｎｍ、更に好ましくは２０〜６０ｎｍである。

本発明に用いられるタンパク質は、金コロイド表面に吸着可能なタンパク質であり、例えば、ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）、ＫＬＨ（キーホールリンペットヘモシアニン）、レクチン、ストレプトアビジンなどが挙げられるが、抗体であることが特に好ましい。タンパク質表面にはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）修飾可能な官能基を有している必要があり、ＰＥＧ修飾可能な具体的な官能基には、アミノ基、チオール基などが挙げられる。

金コロイドにタンパク質が吸着した複合体とは、金コロイド表面にタンパク質が物理吸着して一体となった状態を指す。

本発明の複合体は、金コロイドに吸着している部分以外のタンパク質表面の一部又は全部がポリエチレングリコールで修飾されていることを特徴とする。金コロイドに吸着している部分以外のタンパク質表面は修飾可能な官能基の半数以上がポリエチレングリコールで修飾されていることが好ましく、また、その鎖長は、金コロイドの凝集を抑えることが可能な鎖長であればよく、３０Å以上の鎖長を有することが好ましい。

次に、本発明の複合体の製造方法について説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。

本発明の複合体は、金コロイドの表面にタンパク質を吸着させた後、前記タンパク質の表面に対しポリエチレングリコールで修飾を行うことで製造可能である。製造方法について、更に工程ごとに詳細に説明する。

まず、金コロイド溶液にｐＨ調整用の緩衝液を加えてｐＨを６〜９に調整する（最適なｐＨはタンパク質により異なるため、適宜最適なｐＨを検討することが好ましい）。

次に、ｐＨを調整した金コロイド溶液にタンパク質溶液を添加し、室温で１０〜３０分間静置することで、金コロイド表面にタンパク質を物理吸着させる。

次に、金コロイドに物理吸着させたタンパク質表面をＰＥＧ修飾するため、アミノ基又はチオール基に反応性を有するＰＥＧ化試薬（例えばＮＨＳ−ＰＥＧ２４−ＯＭｅ、Ｍａｌｅｉｍｉｄｅ−ＰＥＧ２４−ＯＭｅ、いずれもＴｈｅｒｏｍｏＦｉｓｈｅｒＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ社製）を添加し、室温で３０〜６０分間静置する。

なお、前記タンパク質によって金コロイド表面が完全には覆えていない場合があるので、タンパク質表面のＰＥＧ修飾が終了した後、金コロイド表面の覆えていない箇所をＢＳＡ、スキムミルク、ブロッキングワン（ナカライテスク社製）などのブロッキング試薬で覆い、非特異吸着を抑える操作を行ってもよい。

次に、金コロイドを沈殿させるため、金コロイドの沈殿は形成されるが凝集は進行しない条件（６０ｎｍの金コロイドの場合は、８，０００ｇ、９分）で遠心操作を行い、透明になった上清を廃棄する。この操作は精製度を上げるために、ブロッキング操作と組み合わせて複数回行っても問題ない。

ＰＥＧ修飾の有無と吸光度の関係を示した図である。

以下、本発明を特許５８１０５１４号公報に記載のＢＮＰ（ｂｒａｉｎｎａｔｒｉｕｒｅｔｉｃｐｅｐｔｉｄｅ）認識抗体（ＢＣ２３−１１）を用いた実施例によって具体的に示すが、本発明はこれに限定されない。

実施例１
（１）金コロイド表面への抗体吸着
金コロイドは、ワインレッドケミカル社製の直径６０ｎｍの金コロイド（ＷＲＧＨ１−６０ＮＭ）を用いた２５０μＬの金コロイド溶液にｐＨ９．２の１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ溶液を２５０μＬ添加しｐＨを調整し、０．１ｍｇ／ｍＬのＢＣ２３−１１溶液（ｐＨ９．２、１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ）を５００μＬ添加し、１５分間静置した。
（２）抗体表面のＰＥＧ修飾
次に、（１）で得られた溶液に、２５０ｍＭのＭｅｔｈｙｌ−ＰＥＧ−ＮＨＳ２４−Ｅｓｔｅｒ（ＴｈｅｒｏｍｏＦｉｓｈｅｒＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ社製）のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）溶液１０μＬを添加し、３０分静置した。
（３）ブロッキング
次に、（２）で得られた溶液に、牛血清アルブミンとポリエチレングリコール２０，０００（和光純薬社製）の混合液を１０００μＬ添加し、１５分静置した。
（４）精製
次に、（３）で得られた溶液に対して、８，０００ｇで９分間の遠心操作を行い、金コロイドを沈殿させ、透明になった上清を廃棄した後、残った沈殿に対して（３）で使用したのと同一の混合液を１０００μＬ添加し、同様の遠心操作を繰り返した。

比較例１
（２）の工程（抗体表面のＰＥＧ修飾）を行わなかった以外は実施例１と同様の条件で抗体吸着した金コロイドを作製した。

（ＵＶ−Ｖｉｓスペクトル測定）
実施例１と比較例１で作製した抗体吸着した金コロイドを保存用の緩衝液３００μＬに、ペレットを懸濁して、ＵＶ−Ｖｉｓスペクトル測定用サンプルとした。図１に結果を示す。分散している金コロイドは可視光領域（４００ｎｍ〜５００ｎｍ）に強い吸収帯を有するが、凝集が進行すると、ピーク強度の低下、吸収ピークのブロードニングを起こすことが知られている。実施例１の金コロイドでは可視光領域に強い吸収帯を有するが、比較例１の金コロイドでは可視光領域のピークが低下し、ピークのブロードニングが起こっている。この結果から比較例１の金コロイドは凝集が進行していることが確認された。

以上の結果から、金コロイドに物理吸着したタンパク質表面をＰＥＧ修飾することで、金コロイドの分散安定性を向上できることが確認された。

Claims

金コロイドにタンパク質が吸着した複合体であって、金コロイドに吸着している部分以外のタンパク質表面の一部又は全部がポリエチレングリコールで修飾されていることを特徴とする前記複合体。
前記タンパク質が抗体である、請求項１に記載の複合体
前記ポリエチレングリコールの鎖長が３０Å以上である、請求項１または２に記載の複合体。
金コロイドの表面にタンパク質を吸着させた後、前記タンパク質の表面に対しポリエチレングリコールで修飾を行う請求項１〜３に記載の複合体の製造方法。