WO2008017604A2 - Sandel-duftstoffrezeptoren - Google Patents

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WO2008017604A2
WO2008017604A2 PCT/EP2007/057825 EP2007057825W WO2008017604A2 WO 2008017604 A2 WO2008017604 A2 WO 2008017604A2 EP 2007057825 W EP2007057825 W EP 2007057825W WO 2008017604 A2 WO2008017604 A2 WO 2008017604A2
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acid sequence
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Hanns Hatt
Johannes Panten
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Symrise Gmbh & Co. Kg
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Definitions

  • the invention relates to the field of olfactory receptors, the medication affecting the condition and the biosensors.
  • fragrance receptor gene For example, seven years elapsed between the first functional description of a fragrance receptor gene and its corresponding fragrance ligand (Zhao et al., Functional expression of a mammalian odorant receptor, Science 279 (1998), 237-242). Until now, only two human fragrance receptor genes have been able to associate corresponding fragrances with fragrance receptors:
  • fragrance receptor genes in heterologous systems has not been reliably achieved despite constant efforts of the experts (Mombaerts, loc. Cit.). Furthermore, it is still not possible to make predictions about which substances can act as agonists or antagonists on the basis of the DNA sequence or the receptor amino acid sequence. For example, findings are based on Can hardly be transferred to other species because sperm cells are susceptible to random gene expression and fragrance receptor genes found in sperm can be difficult to associate with the remaining fragrance receptor gene families (Vanderhaeghen et al, Specific repertoire of olfactory receptor genes in the male germ cells of several mammalian species; Genomics 39 (1997), 239-246).
  • an expression system comprising a cell expressing an OR10J1 fragrance receptor or fragrance receptor having an amino acid sequence homology of at least 70% to the amino acid sequence of the transmembrane domains III to VI of the OR10J1 fragrance receptor
  • the fragrance receptor is heterologous with respect to the cell or
  • the starting point here was the nucleic acid sequence published under the name OR10J1 (Genbank accession number BC1 12290, Malnic, B., Godfrey, PA and Buck, LB, the human olfactory receptor gene family, Proc. Natl. Acad., See, USA 101 (8 ), 2584-2589 (2004)) of the receptor-encoding gene (gene sequence) of a human perfume receptor.
  • OR10J1 Genebank accession number BC1 12290, Malnic, B., Godfrey, PA and Buck, LB, the human olfactory receptor gene family, Proc. Natl. Acad., See, USA 101 (8 ), 2584-2589 (2004)
  • OR1-26 for nomenclature see Ben-Arie et al., Human Molecular Genetics (1994), 229-235).
  • the receptor belongs to the class of proteins described above that belong to the superclass of G protein-coupled proteins with seven putative transmembrane domains.
  • a fusion protein according to the invention is also a fragrance receptor having an amino acid sequence homology of at least 70% to the amino acid sequence of transmembrane domains III to VI of the OR1 OJ1 fragrance receptor.
  • Transmembrane domain III begins at amino acid 109 and transmembrane domain VI ends at amino acid 269 of the OR10J1 protein.
  • Particular preference is given to those proteins which have a protein segment with an amino acid sequence homology of more than 70%, preferably 90% and particularly preferably 5, 4, 3, 2 or 1 amino acid difference to a protein segment consisting of the transmembrane domains III to VI of the OR1 OJ 1 fragrance receptor.
  • the amino acid sequence homology may conveniently be calculated using the EMBOSS: water program (Algorithm of Smith and Waterman (1981), Identification of common molecular subsequences, J. Mol. Biol. 147: 195-197) (gap open penalty: 10.0 Gap extension penalty: 0.5, Blosum62 matrix).
  • the program calculates a similarity percentage, which is the measure of homology.
  • a "similarity" percentage of 80% therefore means a sequence homology of 80% for the purposes of this invention.
  • the invention also provides a fusion protein a) comprising the transmembrane domains III to VI of the OR1 OJ 1 fragrance receptor or a protein segment having an amino acid sequence homology of more than 70%, preferably 90% and more preferably 5, 4, 3, 2 or 1 amino acid difference to the protein portion consisting of the transmembrane domains III to VI of the OR1 OJ 1 fragrance receptor, where b) the portion according to a) between the transmembrane domains I and VI hOR17-40 (Wetzel et al., Supra) and between the transmembrane domain I from hOR17-40 and the transmembrane domain III according to a) another functional transmembrane domain is arranged.
  • fusion protein according to the invention facilitates the production of an expression system according to the invention.
  • this description refers to a receptor or receptor according to the invention, this is the OR1 OJ 1 receptor, a fragrance receptor having an amino acid sequence homology of at least 70% to the amino acid sequence of the transmembrane domains III to VI of the OR10J1 fragrance receptor or a fusion protein according to the invention meant, unless otherwise clearly stated in the respective textual context.
  • the receptor is expressed as a heterologous protein in a host cell - also below more - it is possible that the transcription and / or translation of certain nucleic acid codons or codon sequences proceeds more efficiently than the transcription and / or translation of other codons or codon sequences. This may result in a preference for certain amino acids and / or amino acid sequences. It is now preferred that some or all of the amino acids of the receptor, for which there is no preference of the host cell, are replaced by those amino acids for which there is a preference of the host cell. Further, it may be advantageous to remove a protease cleavage site by an amino acid substitution, deletion or insertion.
  • the receptor is a fusion protein further comprising one or more further protein sections.
  • these may be, in particular, signal peptides such as the "5HT 3 sequence” (cf. CH Wetzel et al., Journal of Neuroscience 19, 7426-7433 (1999)), which facilitates transport and functional incorporation into the cell membrane.
  • signal peptides such as the "5HT 3 sequence” (cf. CH Wetzel et al., Journal of Neuroscience 19, 7426-7433 (1999)), which facilitates transport and functional incorporation into the cell membrane.
  • other signal peptides may also be used in particular those which control or facilitate an intra- and / or intercellular transport of the fusion protein.
  • X is -OH, -COR 2 or C (OH) R 3 R 4 ,
  • R 1 , R 2 , R 3 , R 4 and R 5 independently of one another denote H or CH 3 ,
  • the dashed line drawn in the formula (I) means a double bond at one of the two positions.
  • a fusion protein according to the invention is a receptor which is suitable for binding specifically to a compound of formula (I).
  • the receptor binds a substance or specifically binds a substance to the receptor when the substance is applied to several molecules of the receptor at low concentrations, preferably at concentrations less than 10 mM, more preferably at concentrations less than or equal to 1 mM, in particular preferred at Concentrations less than or equal to 100 ⁇ M, most likely binds again and again in the same area of the receptor.
  • the result of such a specific binding may be a - preferably reversible - conformational change of the receptor which is not substantially limited only to the site of binding.
  • an agonist in the context of the invention is understood as meaning a substance which, by virtue of its specific binding to the receptor, triggers a chemical reaction which exceeds this mere bond.
  • receptors are not chemically abrupt next to other cell constituents, but are in operative association with other parts of at least one signal transduction cascade, such as that mediated by G proteins.
  • Specific binding of an agonist converts such receptors from an inactive to an active state, usually accompanied by a conformational change of the receptor that is not substantially limited to the site of agonist binding, and is manifested in turn on of the signal transduction cascade, recognizable, for example an increase in the cytosolic concentration of Ca 2+ , cAMP, cGMP and / or inositol triphosphate or the change in the ATP / ADP ratio.
  • the conformational change of the receptor, and also the turning on of the signal transduction cascade is a chemical reaction beyond the mere binding of the agonist.
  • agonists based on the receptor are, in particular, the compounds of the formula (I).
  • an antagonist is a substance which, although specifically bound by a receptor, makes the specific binding of an agonist to the receptor more difficult.
  • the specific binding of the antagonist unlike an agonist, does not lead to the activation of one
  • Signal transduction cascade when the receptor is part of such by the specific binding of an agonist switched signal transduction cascade.
  • one may be by the specific binding of an agonist caused conformational change of the receptor in the specific binding of an antagonist.
  • X is a group -OH, -COR 2
  • R, R and R independently of one another denote H or CH 3 ,
  • R 3 and R 4 independently of one another are H or CH 3 .
  • the substances and their use as fragrances are largely described, mainly in US 5,189,013 and DE 10 2005 026 801. There, the preparation of the substances mentioned here is also described.
  • R 1 can be H or CH 3 ,
  • each R 1 can be H or CH 3 ,
  • R 2 is H or CH 3 .
  • R 4 is in each case H or CH 3 ,
  • R 4 is in each case H or CH 3 .
  • R 1 is H or CH 3
  • R 2 is H or CH 3 .
  • the compounds of the formula C to be used according to the invention can be prepared, for example, by a process comprising the following steps:
  • Lithium aluminum hydride the compound or the mixture of the formulas B3a and / or B3b, so that a compound or mixture of the formulas
  • R 4 has the same meaning as R 2 in the formulas B3a and / or B3b and / or; respectively.
  • Methyl magnesium halides such as methyl magnesium chloride or
  • the compounds prepared by this process are mixtures comprising a compound of formula (Ia) and a compound of formula (Ib).
  • R * has the same meaning as R 2 in the formulas B3a and / or B3b, and optionally
  • the first reaction step for example, in the first stage, methods well known to the person skilled in the art react ⁇ -methylencampholenaldehyde, ie compound (X) in a Wittig reaction with methyltriphenylphosphonium bromide and in the presence of potassium tert-butoxide as base (Synth 1985, 15, 855-864).
  • the person skilled in the art is aware of alternative olefination reactions for converting the compound of the formula (X) into the compound of the formula (XI).
  • the diene of formula (XI) obtained as a result of the first reaction step is then reacted in a Diels-Alder reaction, typically in the presence of catalytic amounts of aluminum trichloride, with the ⁇ , ⁇ -unsaturated carbonyl compound of formula (XII) in which R * has the meaning above.
  • a compound or mixture of the formula B3a or B3b can be prepared in two steps, and a compound or mixture of the formula C can be prepared in a total of three steps.
  • Scheme 1 illustrates the reaction steps to be carried out; the indication of methyltriphenylphosphonium bromide in Scheme 1 is to be understood merely as an example.
  • the diene (XI) obtained is subjected to a Diels-Alder reaction with an ⁇ , ⁇ -unsaturated carbonyl compound of the formula (XII), wherein R 1 has the abovementioned meaning, in the presence of catalytic amounts of aluminum trichloride.
  • the resulting mixture of the two compounds (IXa) and (IXb) is finally reduced in the presence of a reducing agent such as sodium borohydride or lithium aluminum hydride under standard conditions or reacted in a Grignard reaction with methyl magnesium halide, in particular methyl magnesium chloride, also under standard conditions.
  • a reducing agent such as sodium borohydride or lithium aluminum hydride under standard conditions
  • methyl magnesium halide in particular methyl magnesium chloride
  • the compounds of the formula (I), in particular the compounds of the formulas B and C, are specified according to the invention as perfumes. They are suitable for specific binding to a receptor as described above, in particular to a fusion protein according to the invention and for triggering a Signal transduction cascade as described above. It has also been found, as explained in more detail below, that compounds of the formula (I) can increase the Ca 2+ concentration in a cell expressing the receptor described and can increase the flagellum frequency of a sperm.
  • a vector comprising a nucleic acid portion encoding a receptor according to any one of the previous aspects of the invention, that is, a vector comprising a nucleic acid portion encoding a) an OR10J1 fragrance receptor or b) a Perfume receptor having an amino acid sequence homology of at least 70% to the amino acid sequence of the transmembrane domains III to VI of the OR1 OJ 1 fragrance receptor or c) a fusion protein according to the invention.
  • the vector may also be a so-called suicide vector, particularly one which allows for the integration of the receptor-encoding nucleic acid portion into the genome of the host cell.
  • the vector is an expression vector.
  • Suitable host cells are in particular those from Drosophila melanogaster, Caenorhabditis elegans, Xenopus / aew 's oocytes and human HEK293 cells as well as CHO (Chinese Hamster Ovary), COS (African Green Monkey Kidney), BHK (Syrian Baby Hamster Kidney) and PC12 (rat adrenal phenochromocytoma) cells, with HEK293 cells being particularly preferred.
  • the expression system according to the invention comprises, as indicated above, a cell which overexpresses a receptor according to the invention.
  • "overexpressing” means any process in which the receptor is present beyond the maximum achievable gene expression level for the respective host cell under natural conditions.
  • the receptor may in particular also be a heterologous receptor for the host cell. Does the host cell in question normally not according to the invention Receptor forth, so overexpression in the context of the invention takes place already when it (for the first time ever) produces such a receptor. Particular preference is given here to those host cells which, in addition to the functional expression of the receptor, also provide the elements necessary for a signal transduction cascade influenced by the receptor through the binding of an agonist.
  • the host cell is a mammalian cell, wherein the host cell may in particular also be a degenerate mammalian cell.
  • a mammalian cell wherein the host cell may in particular also be a degenerate mammalian cell.
  • An example of this is the human embryonic kidney cell-derived cell line HEK293 (see Graham et al., J. Gen. Virol. (1977): 59-72).
  • a complex is specified, wherein the complex comprises a fusion protein according to the invention, and also specifically bound thereto, a compound of the formula (I), in particular of the formula B or C.
  • Such a complex is particularly advantageous for studying the interactions between the receptor and an agonist and / or a possible antagonist.
  • the antagonist may be reversible or irreversible.
  • the receptor is operably linked to a signal transduction cascade, the production of such a complex of receptor and agonist allows the activation or activation of the corresponding complex
  • a receptor-antagonist complex makes it possible to prevent the activation of the signal transduction cascade even in the presence of the agonist.
  • a complex of receptor and agonist or antagonist are described below.
  • a biosensor is disclosed, comprising
  • Formula B or C in particular of the formula B3a and especially preferred PI-23472.
  • the biosensor comprises a cell expressing a receptor according to the invention, ie a) an OR1 OJ 1 fragrance receptor or b) a fragrance receptor having an amino acid sequence homology of at least 70% to the amino acid sequence of transmembrane domains III to VI of OR1 OJ 1 Perfume receptor or c) expressing a fusion protein of the invention, and in which the receptor is in operative association with a signal transduction cascade.
  • a receptor-agonist complex is prepared as just described. This may result in a not limited essentially only to the site of binding of the agonist limited conformational change of the receptor.
  • the receptor triggers the signal transduction cascade after binding of the agonist. This in turn generates a measurable signal, for example in the form of an increase in the cytosolic Ca 2+ concentration.
  • a second messenger such as cAMP, cGMP, IP 3 and the like.
  • the person skilled in the art can easily select a suitable substance for detecting this binding, its concentration, or by means of the signal transduction cascade influenced by the receptor by the specific binding of an agonist Conformation changes according to the specific binding of the agonist to the receptor.
  • Such a biosensor is particularly advantageous for finding additional receptors.
  • the skilled person will first provide an expression system in which the putative receptor is functionally expressed. Suspected agonists are applied to the expression system and an optionally triggered thereby signal of the biosensor is measured. If a substance triggers a biosensor signal and this signal does not also occur in the natural cells of the expression system (ie, cells that have not been altered to an expression system), the expression system will actually express a receptor for that substance.
  • a probe for detecting a nucleic acid encoding a portion of a receptor of the invention is suitably a nucleic acid, in particular an RNA or a, preferably single-stranded, DNA, wherein the nucleic acid can hybridize with a nucleic acid which codes for a portion of a receptor according to the invention.
  • Preferred probes have the sequence SEQ ID NO. 1, SEQ ID NO 2, SEQ ID NO 3 or SEQ ID NO 4 or a 12-30, preferably 15-20 amino acids long section of the sequences SEQ ID NO 3 or SEQ ID NO 4 ..
  • the nucleic acid is linked to a detectable label
  • a detectable label For example, with a fluorescent, luminescent, color coding, a radioactive label or an enzyme that catalyzes the formation of a detectable reaction product.
  • the probe can also be coupled to a solid, for example to metal particles such as magnetic beads (optionally via a linker).
  • the invention teaches to use a nucleic acid, preferably a probe as previously described, to detect a nucleic acid encoding a fragment of a receptor.
  • a nucleic acid preferably a probe as previously described
  • further receptors with the same or similar amino acid sequence as the receptor according to the invention can be found.
  • the probe is contacted under preferably stringent hybridization conditions with nucleic acids of a cell to be assayed to allow hybridization of the probe to a corresponding host nucleic acid, if such a corresponding nucleic acid is present.
  • the less stringent the hybridization conditions the less similar can be the nucleic acids that hybridize to the probe.
  • the nucleic acids hybridized with the probe are purified and sequenced.
  • nucleic acids coding for a fragment of a receptor it is sufficient to bring these nucleic acids into contact with the probe, preferably under stringent hybridization conditions, in order to hybridize the probe to the corresponding probe
  • the nucleic acid to be detected by the probe is immobilized on a solid support, for example in a gel or on a nylon filter.
  • hybridizing the probe to the nucleic acid to be detected is readily detectable by also binding the probe - mediated by the nucleic acid to be detected - to the solid support and substantially not washing off the solid support when performing a wash step.
  • Those skilled in such detection methods are known as Southern or Northern Blot.
  • Primers suitable for amplifying an OR10J1-encoding nucleic acid according to the invention have the sequence SEQ ID NO. 1 or SEQ ID NO 2. These PCR primers can also be used for
  • Expression detection using RT-PCR they can also be used to generate PCR fragments, which are needed for the construction of expression vectors.
  • a receptor according to the invention for detecting and / or specifically binding a compound of the formula (I), in particular of the formula B or C. This produces the above-described complexes which have the abovementioned advantages.
  • a particularly preferred use of a compound of formula (I), in particular of formula B or C, is to influence the flagellum frequency of a sperm. It has also been found that sperm express receptors according to the first aspect of the invention and show chemokinetic reactions that can be triggered by the binding of a compound of formula (I), in particular.
  • the agonists, ie compounds of the formula (I), in particular of the formula B or C and in particular of the formula B3a, can therefore also be used to increase the swimming speed of sperm.
  • the addition of an antagonist to sperm leads to the effects described - with constant agonist concentration - either not or not to the usual extent.
  • the invention also provides a medicament, in particular a contraceptive or contraceptive medicament comprising as agonist one or more compounds of the formula (I), in particular of the formula B or C and especially of the formula B3a, in a pharmaceutically effective amount, especially in one contraceptive or contraceptive amount.
  • a drug is understood to be any agent used for the prevention, diagnosis or treatment of a physical condition of a human and / or animal.
  • Medicaments in the sense according to the invention can therefore be, in particular, medicaments according to ⁇ 1 of the Medicinal Products Act, but also medical products according to ⁇ 3 of the Medical Devices Act, in their version valid on August 1, 2002.
  • a drug utilizes the achievable with the above-described use of agonists and antagonists Advantages.
  • the medicament suitably comprises a pharmaceutically acceptable carrier.
  • the medicament may also comprise a precursor of the agonist or antagonist, which is converted into an agonist or antagonist in the human and / or animal body.
  • an antagonist - preferably an antagonist irreversibly inhibiting the receptor - in or on the human body, preferably in the vagina, uterus and / or fallopian tube, there to sperm optionally present there orientation to complicate an ovum that may be present.
  • This can be done by an intravaginal preparation from which the antagonist is released.
  • a condom with an antagonist - again preferably an irreversible -, for example, to impregnate or coat, so that the antagonist is released when used properly the condom.
  • a contraceptive drug it may be particularly advantageous to release one or more agonists - optionally in combination with other substances - in the fallopian tube and / or uterus to accelerate spermatozoa with a low flagellum frequency.
  • an antagonist against the specific binding of an agonist of the formula (I), in particular of the formula B or C is used for influencing the odor perception ability of a human and / or an animal.
  • the use of an antagonist makes it possible in a simple manner to raise the odor perception threshold for one or more agonists in humans and / or animals, so that the agonist concerned is less easily smelled. This may be particularly useful in cases where an agonist develops a disturbing odor, but can only be removed with disproportionate effort from the air or other carrier medium.
  • the invention teaches compounds of the formula (I), in particular of the formula B3a and in particular the compound PI-23472, as an antagonist against the binding of an agonist to the receptor OR1 D2 and in particular for the abrogation of the chemotactic effect on sperm of agonists of this receptor, especially from Bourgeonal.
  • a method for producing a fusion protein or expression system according to the invention, a method is disclosed which comprises the steps:
  • a method for detecting a compound of the formula (I), in particular of the formula B or C, in a sample comprising the steps:
  • a receptor according to the invention in particular an OR1 OJ 1 receptor, a fragrance receptor having an amino acid sequence homology of at least 70% to the amino acid sequence of the transmembrane domains III to VI of the OR1 OJ 1 fragrance receptor or of a fusion protein according to the invention,
  • the receptor may be provided in the form of an expression system in which the receptor is operatively linked to a signal transduction cascade.
  • a specific binding of the compound of formula (I) to the receptor can be checked by switching on the relevant signal transduction cascade, while checking the specific binding of the antagonist by the absence of such switching on of the signal transduction cascade in the presence of a compound of formula (I) can.
  • an expression system can also be simulated artificially by assembling the receptor and the other components of the signal transduction cascade in vitro.
  • the receptor may also be present as a purified protein bound to the surface of a solid support, particularly a metal surface.
  • a physical surface property may change. This may, for example, be the change in surface plasmon resonance, as may be determined in a Biacore process.
  • the receptor and / or a compound of the formula (I) and / or an antagonist with a fluorescent dye and the change brought about by the specific binding of the compound of the formula (I) and / or of the antagonist to the receptor to determine the fluorescence.
  • the receptor can be present as a fusion protein with a green fluorescent p / Ote / n (GFP) content, so that the fluorescence of the
  • Fusion protein or the GFP portion of the fusion protein upon specific binding of a compound of formula (I) and / or an antagonist changes accordingly.
  • the person skilled in the art is familiar with such examination methods under the name "FRET assays" (fluorescence resonance energy transfer assays).
  • the receptor may also be present as a fusion protein with a luciferase moiety, such that the luminescence of the fusion protein or luciferase moiety of the fusion protein changes upon specific binding of an agonist and / or an antagonist ("BRET assay").
  • a method for detecting the antagonist in a sample comprising the following steps:
  • a receptor according to the invention in particular an OR1 OJ 1 receptor, a fragrance receptor having an amino acid sequence homology of at least 70% to the amino acid sequence of the transmembrane domains III to VI of the OR1 OJ 1 fragrance receptor or of a fusion protein according to the invention,
  • steps b) and c) can be carried out simultaneously or in any desired sequence, provided that step c) is performed before or simultaneously with step d).
  • step d the following method embodiments may be appropriate:
  • the receptor according to the invention is first provided.
  • the person skilled in the art can make use of the possibilities described above for a method according to the invention for detecting an agonist, in particular a compound of the formula (I), and / or antagonists.
  • the receptor is brought into contact with the optionally antagonist-containing sample.
  • conditions are set under which an antagonist could specifically bind to the receptor, if it is present in the sample.
  • the receptor is contacted with an agonist.
  • the conditions are adjusted so that the agonist can specifically bind to the receptor if no antagonist has specifically bound to the receptor.
  • the receptor is first contacted with the agonist and then with the sample optionally containing the antagonist.
  • the sample optionally containing the antagonist.
  • Fig. 1 shows the specific activation of HEK293 cells by PI-23472.
  • HEK293 cells were transiently transfected with a vector encoding OR10J1.
  • the gene for OR10J1 with the primers SEQ ID NO. 1 and SEQ ID NO. 2, digested with the restriction enzyme EcoRV and the resulting fragment cloned into the corresponding cleavage site of the vector pCDNA3 (Invitrogen, USA).
  • transfection protocol used in this and the following examples corresponds to that of WO 2004/033496 A1, whose contents, in particular its examples 3 to 13, in so far referenced.
  • HEK293 cells were maintained under standard conditions in DMEM (Sambrook et al., Molecular cloning: A laboratory manual, CoId Spring Harbor 1982) with 10% fetal calf serum, 100 U / ml penicillin and streptomycin, and 2 mM L-glutamine. Transfection was by calcium phosphate precipitation. About 1 h before the start of transfection, the medium was replaced with 2 ml of fresh DMEM. For transfection, 100 to 200 ⁇ l of the transfection reagent were added.
  • FIG. 1 shows a representative illustration of a Ca 2+ distribution in the transfected HEK293 cells.
  • HEK293 cells were transfected with a vector encoding OR10J1. About 5% of the transfected cells showed a significant increase in intracellular calcium content after addition of Pl-23472.
  • HEK293 cells were transfected as described in Example 1 with vectors encoding OR10J1 or OR1 D2. The transfected cells were examined for their response to various substances.
  • FIG. 2 shows, in three subfigures, the development of the intracellular Ca 2+ content of the transfected HEK293 cells after administration of the substance indicated in each case.
  • Panel a shows that OR10J1-transfected HEK293 cells respond to the administration of PI-23472 with an increase in intracellular Ca 2+ content. n-undecanal does not act as an inhibitor. Similarly strong increases in the intracellular Ca 2+ content could also be achieved with the other compounds of the formula (I) in the case of OR1 OJ 1 -transfected HEK293 cells (not shown).
  • Subpart b shows that OR1 D2-transfected HEK293 cells respond to the administration of Bourgeonal only in the absence of the antagonist n-undecanal with an increase in intracellular Ca 2+ content.
  • Subpart c shows that OR1 D2-transfected HEK293 cells do not respond to the administration of PI-23472 with an increase in the intracellular Ca 2+ content.
  • Chambers with four separate compartments were used to study sperm chemotaxis, using the capillary method of Adler (Adler, Science 153, 708-716 (1966); Adler, Journal of General Microbiology 74, 77-91 (1984); 1973)). Each compartment consisted of two wells connected by a channel. The sperm samples (10 6 cells / ml) were each presented in the wells. A flat 6 ⁇ L microcapillary tube (Drummond Scientific Co.) containing either test or control solution was introduced into the channel with its two ends contacting the fresh sperm suspensions within the two wells.
  • FIG. 3 shows these results graphically, the values being mean values and standard deviation with regression lines calculated from the raw data. From a concentration of 10 " 6 M, PI-23472 increased the swimming velocity of sperm (part b).
  • Example 4 Preparation of 1- [4- (2,2,3-trimethyl-cyclopent-3-enyl) -cyclohex-3-enyl] -ethanol / 1- [3- (2,2,3-trimethyl-cyclopent 3-enyl) -cyclohex-3-enyl] -ethanol
  • the resulting precipitation becomes filtered off with suction, then the phases are separated, and the aqueous phase extracted three more times with diethyl ether (750 ml each).
  • the combined organic phases are dried, filtered off and concentrated by rotary evaporation.
  • the crude product obtained is taken up again in pentane (500 ml) and the precipitate formed is filtered off with suction.
  • the solvent is then removed on a rotary evaporator, giving 281.6 g of crude product (XI), with a product content of 79%.
  • the resulting crude product is used without further purification in the next stage.
  • a small sample of the crude product is purified by flash chromatography.
  • Odor Weak sandalwood note, woody-sweet, mossy, nutty.
  • Odor very intense sandalwood note, naturally pronounced of ß-Santalol, slightly milky-greasy with a weak musk character, enormous room effect (diffusivity) and adhesion (substantivity).
  • Odor Weak sandalwood note, slightly greasy.
  • Odor Beautiful sandalwood note with musk aspects.

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Abstract

Die Erfindung betrifft das Gebiet der olfaktorischen Rezeptoren, der empfängnisbeeinflussenden Medikamente und der Biosensoren. Die Erfindung betrifft ferner Verbindungen der allgemeinen Formel (I) wobei X bedeutet: -OH, -COR2 oder C(OH)R3R4, R1, R2, R3, R4 und R5 unabhängig voneinander H oder CH3 bedeuten, und alternativ X und R5 zusammen eine Ketogruppe (=O) bedeuten können, und wobei ferner die in der Formel (I) eingezeichnete gestrichelte Linie eine Doppelbindung an einer der beiden Positionen bedeutet, und Verwendungen dieser Verbindungen.

Description

Sandel-Duftstoffrezeptoren
Die Erfindung betrifft das Gebiet der olfaktorischen Rezeptoren, der empfängnisbeeinflussenden Medikamente und der Biosensoren.
Seit der Entdeckung der für olfaktorische Rezeptoren (Duftstoffrezeptoren) codierenden DNA-Sequenzen (Gene) sind zahlreiche Aspekte im Zusammenhang mit diesen Rezeptoren noch immer ungeklärt. Zwar kann der Fachmann mit einiger Sicherheit anhand charakteristischer Merkmale - beispielsweise Zugehörigkeit zur Familie der G-Protein gekoppelten Rezeptoren, Hypervariabilität in den Transmembran-Domänen III, IV, V und VI - zwischen DNA-Sequenzen von Duftstoffrezeptoren und solchen Sequenzen, die nicht für einen Duftstoffrezeptor codieren, unterscheiden. Damit ist jedoch noch nichts substantiell über die Regulation der Duftstoffrezeptor-Expression bekannt; insbesondere ist unbekannt, in welchem Gewebe und in welcher Stärke ein vermutetes Duftstoffrezeptor-Gen exprimiert wird; ferner ist nicht vorhersagbar, welche Substanzen an den von diesem Gen codierten Duftstoffrezeptor spezifisch binden können, sei es als Agonist (Aktivator) oder als Antagonist (Inhibitor). Duftstoffrezeptor-Gene von Vertebraten lassen sich zwar durch degenerierte PCR (Polymerase-Kettenreaktion) verhältnismäßig leicht subklonieren (Mombaerts, Genes and ligands for odorant, vomeronasal and taste receptors, Nat. Rev. Neurosci. 5(2004), 263-278). Es hat sich jedoch bisher als sehr schwierig herausgestellt, einem isolierten Duftstoffrezeptor einen zugehörigen, von dem Rezeptor nachweisbaren Duftstoff (Liganden) zuzuordnen. Beispielsweise vergingen sieben Jahre zwischen der ersten funktionalen Beschreibung eines Duftstoffrezeptor-Gens und der Angabe seines zugehörigen Duftstoff-Liganden (Zhao et al., Functional expression of a mammalian odorant receptor; Science 279(1998), 237-242). Bisher ist erst bei zwei menschlichen Duftstoffrezeptor-Genen eine Zuordnung entsprechender Duftstoffe zu Duftstoffrezeptoren gelungen:
Wetzel et al (The Journal of Neuroscience, 1999: 7426-7433) beschreiben die funktionelle Expression des menschlichen hOR17-40 Rezeptor-Proteins. Es konnten nur zwei als Agonisten wirkende Substanzen bestimmt werden, nämlich Helional und Heliotropylaceton. Diese Substanzen lösen eine Aktivierung des Rezeptors aus, die sich in einer vorübergehenden Erhöhung des cytosolischen Ca2+-Spiegels niederschlägt, wenn der Rezeptor funktionell in HEK293-Zellen exprimiert wird. Antagonisten, also Substanzen, die eine Rezeptor-Aktivierung durch einen oder mehrere Agonisten spezifisch und reversibel verhindern können, wurden nicht gefunden. Spehr et al (Identification of a testicular odorant receptor mediating human sperm Chemotaxis; Science 299(2003), 2054-2058) wiederum konnten die Bindung von Bourgeonal an einen weiteren menschlichen Duftstoffrezeptor (hOR17-4) und die antagonistische Wirkung von n-Undecanal auf diese Ligandenbindung nachweisen.
Die funktionelle Expression von Duftstoffrezeptor-Genen in heterologen Systemen ist jedoch trotz ständigen Bemühens der Fachwelt bisher nicht zuverlässig gelungen (Mombaerts, a.a.O.). Ferner ist es nach wie vor nicht möglich, anhand der DNA-Sequenz bzw. der Rezeptor-Aminosäuresequenz Vorhersagen darüber zu treffen, welche Substanzen als Agonisten oder Antagonisten wirken können. Beispielsweise sind Befunde, die anhand von Testikulargeweben von Mäusen gewonnen wurden, kaum auf andere Spezies übertragbar, da Spermazellen anfällig für zufällige Genexpression sind und in Spermien gefundene Duftstoffrezeptor-Gene schwer den übrigen Duftstoffrezeptor-Genfamilien zugeordnet werden können (Vanderhaeghen et al, Specific repertoire of olfactory receptor genes in the male germ cells of several mammalian species; Genomics 39 (1997), 239-246).
Es besteht daher ein großer Bedarf, weitere Duftstoffrezeptoren zu finden, funktionell zu exprimieren und die jeweils wirksamen Agonisten und Antagonisten zu bestimmen.
Erfindungsgemäß wird deshalb ein Expressionssystem angegeben umfassend eine Zelle, die einen OR10J1- Duftstoffrezeptor oder einen Duftstoffrezeptor mit einer Aminosäure-Sequenzhomologie von zumindest 70 % zur Aminosäuresequenz der Transmembrandomänen III bis VI des OR10J1- Duftstoffrezeptors exprimiert, wobei
a) der Duftstoffrezeptor heterolog in bezug auf die Zelle ist oder
b) der Duftstoffrezeptor in der Zelle überexprimiert wird.
Ausgangspunkt hierbei war die unter der Bezeichnung OR10J1 veröffentlichte Nucleinsäuresequenz (Genbank Accession-Nummer BC1 12290; Malnic,B., Godfrey,P.A. and Buck,L.B.; the human olfactory receptor gene family; Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 101 (8), 2584-2589 (2004)) des für den Rezeptor codierenden Gens (Gensequenz) eines menschlichen Duftstoffrezeptors. Eine synonyme Bezeichnung ist OR1-26 (wegen der Nomenklatur siehe Ben-Arie et al., Human Molecular Genetics (1994), 229-235). Der Rezeptor gehört zu der eingangs beschriebenen Klasse von Proteinen, die zur Superklasse der G- Protein-gekoppelten Proteine mit sieben vermuteten Transmembrandomänen gehören. Da nunmehr die funktionelle Expression dieses Rezeptors erstmals gelungen ist, wurde es auch möglich, Substanzen zu finden, die als Agonist oder Antagonist spezifisch an den Rezeptor binden können; hierzu unten mehr. Der Fachmann erkennt, dass auch ein Protein, das einen Proteinabschnitt mit einer von der Sequenz von OR10J1 abweichenden Aminosäuresequenz besitzt, ein Duftstoffrezeptor mit der im weiteren Verlauf beschriebenen Duftstoff- Ligandenspezifität sein kann. Die Erfolgsaussichten, einen funktionalen Rezeptor zu erhalten, insbesondere einen Duftstoffrezeptor, ist in der Gruppe der Proteine mit einem Abschnitt mit homologer Aminosäuresequenz zu OR10J1 höher als in der Gruppe der Proteine ohne oder mit nur geringer Homologie zur Sequenz dieses Duftstoffrezeptors. Ein erfindungsgemäßes Fusionsprotein ist dementsprechend auch ein Duftstoffrezeptor mit einer Aminosäure- Sequenzhomologie von zumindest 70 % zur Aminosäuresequenz der Transmembrandomänen III bis VI des OR1 OJ 1 -Duftstoffrezeptors Die Transmembrandomäne III beginnt bei Aminosäure 109 und die Transmembrandomäne VI endet bei Aminosäure 269 des OR10J1-Proteins. Besonders bevorzugt sind dabei solche Proteine, die einen Proteinabschnitt mit einer Aminosäure-Sequenzhomologie von mehr als 70 %, vorzugsweise von 90% und besonders bevorzugt von 5, 4, 3, 2 oder 1 Aminosäure Unterschied zu einem Proteinabschnitt bestehend aus den Transmembrandomänen III bis VI des OR1 OJ 1 -Duftstoffrezeptors besitzen. Die Aminosäure-Sequenzhomologie kann zweckmäßigerweise mit Hilfe des EMBOSS:water-Programms (Algorithmus von Smith und Waterman (1981 ), Identification of common molecular subsequences, J. Mol. Biol. 147:195-197) berechnet werden (Gap open penalty: 10.0; Gap extension penalty: 0.5; Blosum62-Matrix). Das Programm berechnet einen "Similarity"-Prozentwert, dieser ist das Maß der Homologie. Ein "Similarity"- Prozentwert von 80% bedeutet also im Sinne dieser Erfindung eine Sequenzhomologie von 80%.
Erfindungsgemäß wird zudem ein Fusionsprotein angegeben a) umfassend die Transmembrandomänen III bis VI des OR1 OJ 1 -Duftstoffrezeptors oder einen Proteinabschnitt mit einer Aminosäure-Sequenzhomologie von mehr als 70 %, vorzugsweise von 90% und besonders bevorzugt von 5, 4, 3, 2 oder 1 Aminosäure Unterschied zu dem Proteinabschnitt bestehend aus den Transmembrandomänen III bis VI des OR1 OJ 1 -Duftstoffrezeptors, wobei b) der Abschnitt gemäß a) zwischen den Transmembrandomänen I und VI hOR17-40 (Wetzel et al., s.o.) angeordnet ist und zwischen der Transmembrandomäne I aus hOR17-40 und der Transmembrandomäne III gemäß a) eine weitere funktionale Transmembrandomäne angeordnet ist. Zum Herstellen und zur Verwendung solcher Fusionsproteine wird sich der Fachmann insbesondere an der Beschreibung der WO 2004-033496A1 orientieren, deren Inhalt in soweit in Bezug genommen wird. Ein erfindungsgemäßes Fusionsprotein erleichtert insbesondere das Herstellen eines erfindungsgemäßen Expressionssystems.
Soweit in dieser Beschreibung von einem Rezeptor oder erfindungsgemäßen Rezeptor gesprochen wird, ist damit der OR1 OJ 1 -Rezeptor, ein Duftstoffrezeptor mit einer Aminosäure-Sequenzhomologie von zumindest 70 % zur Aminosäuresequenz der Transmembrandomänen III bis VI des OR10J1- Duftstoffrezeptors oder ein erfindungsgemäßes Fusionsprotein der oben beschriebenen Art gemeint, soweit nicht im jeweiligen Textzusammenhang klar ein anderes angegeben ist.
Wird der Rezeptor als heterologes Protein in einer Wirtszelle exprimiert - auch hierzu unten mehr -, so ist es möglich, dass die Transkription und/oder Translation bestimmter Nucleinsäure-Codons bzw. Codon-Abfolgen effizienter vonstatten geht als die Transkription und/oder Translation anderer Codons bzw. Codon-Abfolgen. Hieraus kann sich eine Präferenz für bestimmte Aminosäuren und/oder Aminosäureabfolgen ergeben. Es ist nunmehr bevorzugt, wenn einige oder alle Aminosäuren des Rezeptors, für die keine Präferenz der Wirtszelle besteht, durch solche Aminosäuren ersetzt sind, für die eine Präferenz der Wirtszelle besteht. Ferner kann es vorteilhaft sein, eine Protease-Schnittstelle durch einen Aminosäureaustausch, -deletion oder -insertion zu entfernen.
Vorzugsweise ist der Rezeptor ein Fusionsprotein, das ferner einen oder mehrere weitere Proteinabschnitte umfasst. Hierbei kann es sich insbesondere um Signalpeptide wie die "5HT3-Sequenz" (vergleiche C. H. Wetzel et al., Journal of Neuroscience 19, 7426-7433 (1999)) handeln, die den Transport und den funktionellen Einbau in die Zellmembran erleichtert. Anstelle oder neben der "5HT3-Sequenz" können jedoch auch andere Signalpeptide verwendet werden, insbesondere solche, die einen intra- und/oder interzellulären Transport des Fusionsproteins steuern oder erleichtern.
Es hat sich nunmehr herausgestellt, dass der Rezeptor spezifisch an Verbindungen der nachfolgenden Formel (I) bindet:
Figure imgf000008_0001
(I)
wobei
X bedeutet: -OH, -COR2 oder C(OH)R3R4,
R1, R2, R3, R4 und R5 unabhängig voneinander H oder CH3 bedeuten,
und alternativ X und R5 zusammen eine Ketogruppe (=0) bedeuten können, und wobei ferner
die in der Formel (I) eingezeichnete gestrichelte Linie eine Doppelbindung an einer der beiden Positionen bedeutet.
Ein erfindungsgemäßes Fusionsprotein ist dementsprechend ein Rezeptor, der geeignet ist zum spezifischen Binden an eine Verbindung der Formel (I).
Unter einer spezifischen Bindung im Sinne dieser Erfindung wird eine Bindung verstanden, die - vereinfacht gesagt - nach einer Art Schlüssel-Schloss-Prinzip funktioniert. Insbesondere bindet der Rezeptor eine Substanz bzw. bindet eine Substanz an den Rezeptor dann spezifisch, wenn die Substanz bei Applikation auf mehrere Moleküle des Rezeptors bei niedrigen Konzentrationen, vorzugsweise bei Konzentrationen kleiner als 1O mM, besonders bevorzugt bei Konzentrationen kleiner oder gleich 1 mM, insbesondere bevorzugt bei Konzentrationen kleiner oder gleich 100 μM, mit großer Wahrscheinlichkeit immer wieder im gleichen Bereich des Rezeptors bindet. Das Ergebnis einer solchen spezifischen Bindung kann insbesondere eine - vorzugsweise reversible - nicht im wesentlichen lediglich auf den Ort der Bindung begrenzte Konformationsänderung des Rezeptors sein.
Ferner wird unter einem Agonisten im Sinne der Erfindung eine Substanz verstanden, die durch ihre spezifische Bindung an den Rezeptor eine über diese bloße Bindung hinausgehende chemische Reaktion auslöst. In ihrem natürlichen Umfeld stehen Rezeptoren nicht chemisch unvermittelt neben anderen Zellbestandteilen, sondern stehen in Wirkverbindung mit weiteren Teilen zumindest einer Signaltransduktionskaskade, wie sie beispielsweise durch G- Proteine vermittelt wird. Durch das spezifische Binden eines Agonisten werden solche Rezeptoren von einem inaktiven in einen aktiven Zustand überführt, dies geht gewöhnlich einher mit einer nicht im wesentlichen auf den Ort der Agonisten-Bindung begrenzten Konformationsänderung des Rezeptors und schlägt sich in einem Einschalten der Signaltransduktionskaskade nieder, erkennbar beispielsweise an einem Anstieg der cytosolischen Konzentration von Ca2+, cAMP, cGMP und/oder Inositol-Triphosphat oder der Änderung des ATP/ADP-Quotienten. Die Konformationsänderung des Rezeptors, und auch das Einschalten der Signaltransduktionskaskade, ist eine über die bloße Bindung des Agonisten hinausgehende chemische Reaktion. Agonisten im Sinne dieser Erfindung bezogen auf den Rezeptor sind insbesondere die Verbindungen der Formel (I).
Im Sinne der Erfindung ist ein Antagonist eine Substanz, die zwar spezifisch von einem Rezeptor gebunden wird, jedoch das spezifische Binden eines Agonisten an den Rezeptor erschwert. Das spezifische Binden des Antagonisten führt, anders als bei einem Agonisten, nicht zum Einschalten einer
Signaltransduktionskaskade, wenn der Rezeptor Teil einer solchen, durch das spezifische Binden eines Agonisten eingeschalteten Signaltransduktionskaskade ist. Insbesondere kann eine durch das spezifische Binden eines Agonisten hervorgerufene Konformationsänderung des Rezeptors beim spezifischen Binden eines Antagonisten ausbleiben.
Insbesondere wurde eine Bindung des Rezeptors an die Verbindungen der nachfolgenden Formeln gefunden:
Figure imgf000010_0001
B
wobei
X eine Gruppe -OH, -COR2
und R , R und R unabhängig voneinander H oder CH3 bedeuten,
und alternativ X und R5 zusammen eine Ketogruppe (=0) bedeuten können,
ferner:
Figure imgf000010_0002
wobei
R3 und R4 unabhängig voneinander H oder CH3 bedeuten. Die Substanzen sowie ihre Verwendung als Riechstoffe sind größtenteils beschrieben, hauptsächlich in US 5,189,013 und DE 10 2005 026 801. Dort ist auch die Herstellung der hier genannten Substanzen beschrieben.
Eine besonders gute Bindung an den Rezeptor wurde erhalten mit folgenden Verbindungen der Formel B:
Figure imgf000011_0001
B1 a B1 b
wobei R1 H oder CH3 sein kann,
ferner
Figure imgf000011_0002
B2a1 B2b1
Figure imgf000011_0003
B2a2 B2b2 wobei jeweils R1 H oder CH3 ein kann,
ferner
Figure imgf000012_0001
B3a B3b
wobei R2 gleich H oder CH3 bedeutet.
Eine ebenfalls gute Bindung an den Rezeptor konnte erhalten werden mit folgenden Verbindungen der Formel C:
Figure imgf000012_0002
C1a C1 b
wobei R4 jeweils H oder CH3 bedeutet,
ferner
Figure imgf000013_0001
C2a C2b
wobei R4 jeweils H oder CH3 bedeutet.
Verbindungen der genannten Strukturen sind demgemäß für die Zwecke der Erfindung besonders bevorzugt.
Neu sind folgende Substanzen:
Figure imgf000013_0002
wobei R1 H oder CH3 bedeutet, und
Figure imgf000013_0003
Für die Zwecke der Erfindung sind die Verbindungen der nachfolgenden Formeln B3a und B3b besonders bevorzugt:
Figure imgf000014_0001
B3a B3b
wobei R2 gleich H oder CH3 bedeutet.
Am meisten bevorzugt sind die Verbindungen der Formeln B3a und B3b mit R2 = CH3, insbesondere die Verbindung B3a mit R2 = CH3. Die Verbindung der Formel B3a mit X=CH3 wird nachfolgend auch PI-23472 genannt.
Die erfindungsgemäß einzusetzenden Verbindungen der Formel C können beispielsweise durch ein Verfahren mit folgenden Schritten hergestellt werden:
Bereitstellen oder Herstellen einer oder mehrerer Verbindungen der Formeln B3a oder B3b oder deren Mischung
Figure imgf000014_0002
B3a B3b wobei R2 H oder CH3 bedeutet,
Reduzieren, vorzugsweise mit Natriumborhydrid oder
Lithiumaluminiumhydrid, der Verbindung oder der Mischung der Formeln B3a und/oder B3b, so dass eine Verbindung bzw. Mischung der Formeln
C1a und/oder C1 b gebildet wird, wobei R4 die gleiche Bedeutung wie R2 in den Formeln B3a und/oder B3b besitzt; bzw.
nukleophile Addition einer metallorganischen Verbindung mit Methylanionencharakter, vorzugsweise unter Verwendung eines
Methylmagnesiumhalogenids wie Methylmagnesiumchlorid oder
Methyllithium, an die Verbindung oder die in der Mischung enthaltenen
Verbindungen der Formeln B3a und/oder B3b, so dass eine eine
Verbindung bzw. Mischung der Formeln C2a und/oder C2b gebildet wird, wobei R4 die gleiche Bedeutung wie R2 in den Formeln B3a und/oder B3b besitzt.
Die nach diesem Verfahren hergestellten Verbindungen sind Mischungen, die eine Verbindung der Formel (Ia), und eine Verbindung der Formel (Ib) umfassen.
Zur Herstellung der Verbindungen der Formeln B3a und/oder B3b oder (bevorzugt) einer Mischung einer Verbindung der Formel B3a mit einer Verbindung der Formel B3b, wobei R2 H oder CH3 bedeutet, werden vorzugsweise die folgenden Schritte durchgeführt:
Überführen einer Verbindung der Formel (X)
Figure imgf000015_0001
(X) mittels Olefinierungs-Reaktion in eine Verbindung der Formel (Xl),
Figure imgf000016_0001
(Xl)
Umsetzen der Verbindung der Formel (Xl) mit einer Verbindung der Formel (XII)
Figure imgf000016_0002
(XII)
mittels Diels-Alder-Reaktion zu einer Mischung von Verbindungen der Formeln B3a und B3b, wobei in Formel (XII) R* die gleiche Bedeutung wie R2 in den Formeln B3a und/oder B3b, sowie gegebenenfalls
Trennen der Verbindungen der Formeln B3a und B3b voneinander.
Im ersten Reaktionsschritt wird beispielsweise In der 1. Stufe wird nach dem Fachmann wohlvertrauten Methoden α-Methylencampholenaldehyd, das heisst die Verbindung (X) in einer Wittig Reaktion mit Methyltriphenylphosphoniumbromid und in Gegenwart von Kalium-tert-butanolat als Base umgesetzt umgesetzt (Synth. Commun. 1985, 15, 855-864). Dem Fachmann sind alternative Olefinierungs-Reaktionen zur Überführung der Verbindung der Formel (X) in die Verbindung der Formel (Xl) bekannt. Das als Ergebnis des ersten Reaktionsschrittes erhaltene Dien der Formel (Xl) wird dann in einer Diels-Alder-Reaktion, typischerweise in Gegenwart von katalytischen Mengen Aluminiumtrichlorid, mit der α-,ß-ungesättigten Carbonylverbindung der Formel (XII) umgesetzt, in der R* die oben genannte Bedeutung hat.
Ausgehend von der Verbindung der Formel (X) lässt sich in zwei Schritten eine Verbindung bzw. Mischung der Formel B3a oder B3b und in insgesamt drei Schritten eine Verbindung bzw. Mischung der Formel C herstellen. Das nachfolgende Schema 1 verdeutlicht die durchzuführenden Reaktionsschritte; die Angabe von Methyltriphenylphosphoniumbromid in Schema 1 ist dabei lediglich beispielhaft zu verstehen.
Das erhaltene Dien (Xl) wird einer Diels-Alder Reaktion mit einer α,ß- ungesättigten Carbonylverbindiung der Formel (XII), wobei R1 die oben genannte Bedeutung hat, in Gegenwart von katalytischen Mengen Aluminiumtrichlorid unterworfen. Die resultierende Mischung der beiden Verbindungen (IXa) und (IXb) wird abschließend in Gegenwart eines Reduktionsmittels, wie z.B. Natriumborhydrid oder Lithiumaluminiumhydrid unter Standardbedingungen reduziert oder in einer Grignard Reaktion mit Methylmagnesiumhalogenid, insbesondere Methylmagnesiumchlorid, ebenfalls unter Standardbedingungen umgesetzt. Somit erhält man als Produkt eine Mischung der Alkohole (Ia) und (Ib) (Schema 1 ).
Figure imgf000018_0001
(X) (Xl)
Figure imgf000018_0002
Figure imgf000018_0003
B3a B3b
Figure imgf000018_0004
Schema 1
Die Verbindungen der Formel (I), insbesondere die Verbindungen der Formeln B und C, werden erfindungsgemäß angegeben als Duftstoffe. Sie sind geeignet zum spezifischen Binden an einen Rezeptor wie oben beschrieben, insbesondere an ein erfindungsgemäßes Fusionsprotein und zum Auslösen einer Signaltransduktionskaskade wie oben beschrieben. Ferner hat sich gezeigt, wie unten näher ausgeführt wird, dass Verbindungen der Formel (I) die Ca2+- Konzentration in einer den beschriebenen Rezeptor exprimierenden Zelle steigern und die Geißelschlagfrequenz eines Spermiums erhöhen können. Zudem konnte nachgewiesen werden, dass Verbindungen der Formel B, insbesondere der Formel B3a, bei Verabreichung an Spermien den Rezeptor OR1 D2 inhibieren, als Antagonist gegen Bourgeonal wirken und insbesondere die Bindung von Bourgeonal an den Rezeptor OR1 D2 verhindern, die Bourgeonal-abhängige Aufnahme von Ca2+ in Spermien verringern oder ganz unterdrücken und die Bourgeonal-vermittelte Spermien-Chemotaxis unterdrücken können.
Erfindungsgemäß wird deshalb auch die Verwendung einer Verbindung der Formel (I), insbesondere der Verbindungen der Formeln B und C, gelehrt
a) zum Binden an und/oder zum Aktivieren eines OR10J1 -Duftstoffrezeptors oder eines Duftstoffrezeptors mit einer Aminosäure-Sequenzhomologie von zumindest 70 % zur Aminosäuresequenz der Transmembrandomänen III bis VI des OR1 OJ 1 -Duftstoffrezeptors oder eines erfindungsgemäßen Fusionsproteins,
b) zum Auslösen oder Erhöhen der Bildung von Cycloadenosinmonophosphat und/oder zum Auslösen eines Einstroms oder Erhöhen der Konzentration an Ca2+ in einer Zelle, die einen OR1 OJ 1 -Duftstoffrezeptor oder einen Duftstoffrezeptor mit einer Aminosäure-Sequenzhomologie von zumindest 70 % zur Aminosäuresequenz der Transmembrandomänen III bis VI des OR1 OJ 1 -Duftstoffrezeptors oder ein erfindungsgemäßes Fusionsprotein exprimiert,
c) zum Steigern der Geißelschlagfrequenz eines Spermiums,
d) zum Herstellen eines Arzneimittels zum Behandeln einer niedrigen Spermiengeißelschlagfrequenz, und
e) als Inhibitor des OR1 D2-Rezeptors. Zum Herstellen eines erfindungsgemäßen Expressionssystems ist es zweckmäßig, ein Gen für den Rezeptor durch einen Vektor in eine Wirtszelle einzuführen. Gemäß einem weiteren Aspekt der Erfindung wird deshalb ein Vektor angegeben, der einen Nucleinsäure-Abschnitt umfasst, der für einen Rezeptor nach einem der vorherigen Aspekte der Erfindung codiert, also ein Vektor umfassend einen Nucleinsäureabschnitt codierend für a) einen OR10J1- Duftstoffrezeptor oder b) einen Duftstoffrezeptor mit einer Aminosäure- Sequenzhomologie von zumindest 70 % zur Aminosäuresequenz der Transmembrandomänen III bis VI des OR1 OJ 1 -Duftstoffrezeptors oder c) ein erfindungsgemäßes Fusionsprotein. Ein solcher Vektor erleichtert es, eine für den erfindungsgemäßen Rezeptor codierende Nucleinsäure zu klonieren. Der Vektor kann auch ein sogenannter suicide-Vektor sein, insbesondere ein solcher, der die Integration des für den Rezeptor codierenden Nucleinsäure-Abschnitts in das Genom der Wirtszelle ermöglicht.
In besonders bevorzugten Ausführungsformen ist der Vektor ein Expressionsvektor. Solche Vektoren ermöglichen die Transkription und Translation des im Vektor enthaltenen, für den erfindungsgemäßen Rezeptor codierenden Nucleinsäureabschnitts, wenn der Vektor in eine geeignete Wirtszelle eingebracht wird. Geeignete Wirtszellen sind insbesondere solche aus Drosophila melanogaster, Caenorhabditis elegans, Xenopus /aew's-Oocyten und menschliche HEK293-Zellen sowie CHO- (Chinese Hamster Ovary), COS- (Afrikan Green Monkey Kidney), BHK- (Syrian Baby Hamster Kidney) und PC12- (Rat Adrenal Phenochromocytoma) - Zellen, wobei HEK293-Zellen besonders bevorzugt sind.
Das erfindungsgemäße Expressionssystem umfasst wie eingangs angegeben eine Zelle, die einen erfindungsgemäßen Rezeptor überexprimiert. Unter "überexprimieren" wird dabei jeder Vorgang verstanden, in dessen Folge der Rezeptor über das für die jeweilige Wirtszelle unter natürlichen Bedingungen maximal erreichbare Genexpressionsniveau hinausgehend vorliegt. Dabei kann der Rezeptor insbesondere auch ein für die Wirtszelle heterologer Rezeptor sein. Stellt die betreffende Wirtszelle normalerweise keinen erfindungsgemäßen Rezeptor her, so findet eine Überexpression im Sinne der Erfindung bereits dann statt, wenn sie (erstmals) überhaupt einen solchen Rezeptor herstellt. Besonders bevorzugt sind dabei solche Wirtszellen, die neben der funktionellen Expression des Rezeptors auch die für eine vom Rezeptor durch die Bindung eines Agonisten beeinflusste Signaltransduktionskaskade notwendigen Elemente bereitstellen.
Zweckmäßigerweise handelt es sich bei der Wirtszelle um eine Säugerzelle, wobei die Wirtszelle insbesondere auch eine entartete Säugerzelle sein kann. Ein Beispiel hierfür ist die auf humane embryonale Nierenzellen zurückgehende Zellinie HEK293 (s. Graham et al., J. Gen. Virol. (1977): 59-72).
Gemäß einem weiteren Aspekt der Erfindung wird ein Komplex angegeben, wobei der Komplex ein erfindungsgemäßes Fusionsprotein, sowie daran spezifisch gebunden, eine Verbindung der Formel (I) umfasst, insbesondere der Formel B oder C.
Ein solcher Komplex ist besonders vorteilhaft dazu geeignet, die Wechselwirkungen zwischen dem Rezeptor und einem Agonisten und/oder einem möglichen Antagonisten zu untersuchen. Dabei kann es sich bei dem Antagonisten um einen reversiblen oder irreversiblen handeln. Wenn der Rezeptor mit einer Signaltransduktionskaskade in Wirkverbindung steht, so ermöglicht das Herstellen eines solchen Komplexes aus Rezeptor und Agonist das Einschalten oder Aktivieren der entsprechenden
Signaltransduktionskaskade. Das Herstellen eines Rezeptor-Antagonisten- Komplexes ermöglicht es in diesem Fall, das Einschalten der Signaltransduktionskaskade auch bei Vorliegen des Agonisten zu verhindern. Weitere vorteilhafte Anwendungsmöglichkeiten eines Komplexes aus Rezeptor und Agonist oder Antagonist sind unten beschrieben. Besonders bevorzugt sind dabei die Komplexe aus einem erfindungsgemäßen Rezeptor und einer Verbindung der Formel B3a, insbesondere mit X=CH3 (PI-23472).. Diese bilden sich schon bei geringen Konzentrationen an PI-23472 Insbesondere wird gemäß einem weiteren Aspekt der Erfindung ein Biosensor angegeben, umfassend
a) einen erfindungsgemäßen Rezeptor und
b) Mittel zum Nachweisen einer Bindung einer Verbindung der Formel (I) an den Rezeptor, vorzugsweise einer Verbindung der
Formel B oder C, insbesondere der Formel B3a und insbesondere bevorzugt PI-23472.
Der Fachmann kann die zum Nachweisen der Bindung des Agonisten, insbesondere einer Verbindung der Formel (I) und insbesondere der Formel B oder C und insbesondere von PI-23472, an den Rezeptor geeigneten Mittel je nach der Art des gewählten Rezeptors leicht auswählen. In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst der Biosensor eine Zelle, die einen erfindungsgemäßen Rezeptor exprimiert, also a) einen OR1 OJ 1 -Duftstoffrezeptor oder b) einen Duftstoffrezeptor mit einer Aminosäure-Sequenzhomologie von zumindest 70 % zur Aminosäuresequenz der Transmembrandomänen III bis VI des OR1 OJ 1 -Duftstoffrezeptors oder c) ein erfindungsgemäßes Fusionsprotein exprimiert, und in der der Rezeptor in Wirkverbindung mit einer Signaltransduktionskaskade steht. Durch das spezifische Binden des Agonisten an den Rezeptor wird ein Rezeptor-Agonist-Komplex wie soeben beschrieben hergestellt. Dabei kann es zu einer nicht im wesentlichen lediglich auf den Ort der Bindung des Agonisten begrenzten Konformationsänderung des Rezeptors kommen. Durch diese Konformationsänderung oder auf andere Weise löst der Rezeptor nach der Bindung des Agonisten die Signaltransduktionskaskade aus. Diese wiederum erzeugt ein messbares Signal, beispielsweise in Form einer Erhöhung der cytosolischen Ca2+-Konzentration. Anstelle der cytosolischen Ca2+- Konzentration kann auch der Konzentrationsanstieg oder der Konzentrationsabfall einer anderen Substanz, insbesondere eines second messegers wie cAMP, cGMP, IP3 und dergleichen gemessen werden. Der Fachmann kann anhand der vom Rezeptor durch die spezifische Bindung eines Agonisten beeinflusste Signaltransduktionskaskade leicht eine geeignete Substanz zum Nachweisen dieser Bindung auswählen, deren Konzentration oder Konformation sich entsprechend der spezifischen Bindung des Agonisten an den Rezeptor ändert.
Ein solcher Biosensor ist insbesondere vorteilhaft dazu geeignet, weitere Rezeptoren zu suchen. Dazu wird der Fachmann zunächst ein Expressionssystem bereitstellen, in dem der vermutete Rezeptor funktionell exprimiert wird. Auf das Expressionssystem werden vermutete Agonisten appliziert und eine gegebenenfalls hierdurch ausgelöstes Signal des Biosensors gemessen. Wenn eine Substanz ein Biosensor-Signal auslöst und dieses Signal nicht auch in den natürlichen Zellen des Expressionssystems (also Zellen, die nicht zu einem Expressionssystem verändert wurden) auftritt, so wird vom Expressionssystem tatsächlich ein Rezeptor für diese Substanz exprimiert.
Ebenfalls wird erfindungsgemäß eine Sonde zum Nachweisen einer Nucleinsäure angegeben, die für einen Abschnitt eines erfindungsgemäßen Rezeptors codiert. Eine solche Sonde ist zweckmäßigerweise eine Nucleinsäure, insbesondere eine RNA oder eine, vorzugsweise einzelsträngige, DNA, wobei die Nucleinsäure mit einer Nucleinsäure hybridisieren kann, die für einen Abschnitt eines erfindungsgemäßen Rezeptors codiert. Bevorzugte Sonden besitzen die Sequenz SEQ ID NO. 1 , SEQ ID NO 2, SEQ ID NO 3 oder SEQ ID NO 4 oder eines 12 - 30 , vorzugsweise 15 - 20 Aminosäuren langen Ausschnitt der Sequenzen SEQ ID NO 3 oder SEQ ID NO 4.. Die Nucleinsäure ist verbunden mit einer nachweisbaren Markierung, beispielsweise mit einer Fluoreszenz-, Lumineszenz-, Farbmarkierung, einer radioaktiven Markierung oder einem Enzym, das die Bildung eines nachweisbaren Reaktionsprodukts katalysiert. Anstelle einer solchen nachweisbaren Markierung kann die Sonde auch an einen Feststoff, beispielsweise an Metallpartikel wie magnetische Beads, gekoppelt sein (gegebenenfalls über einen Linker).
In diesem Zusammenhang wird erfindungsgemäß gelehrt, eine Nucleinsäure, vorzugsweise eine Sonde wie zuvor beschrieben, zum Nachweisen einer Nucleinsäure, die für ein Fragment eines Rezeptors codiert, zu verwenden. So können zum einen weitere Rezeptoren mit gleicher oder ähnlicher Aminosäuresequenz wie der erfindungsgemäße Rezeptor gefunden werden. Dabei wird die Sonde unter vorzugsweise stringenten Hybridisierungsbedingungen mit Nucleinsäuren einer zu untersuchenden Zelle in Kontakt gebracht, um ein Hybridisieren der Sonde an eine dieser entsprechenden Wirts-Nucleinsäure zu ermöglichen, falls eine solche entsprechende Nucleinsäure vorliegt. Je weniger stringent die Hybridisierungsbedingnungen sind, desto weniger ähnlich können die Nucleinsäuren sein, die mit der Sonde hybridisieren. Nach dem Hybridisieren werden die mit der Sonde hybridisierten Nucleinsäuren aufgereinigt und sequenziert.
Soll mit der Sonde nur die Anwesenheit von Nucleinsäuren, die für ein Fragment eines Rezeptors codieren, nachgewiesen werden, so reicht es aus, diese Nucleinsäuren - vorzugsweise unter stringenten Hybridisierungsbedingungen - mit der Sonde in Kontakt zu bringen, um ein Hybridisieren der Sonde an die entsprechende Nucleinsäure zu ermöglichen, wenn eine solche entsprechende Nucleinsäure vorliegt. Dabei ist es zweckmäßig, wenn die Nucleinsäure, die mit der Sonde nachgewiesen werden soll, an einem festen Träger immobilisiert ist, beispielsweise in einem Gel oder auf einem Nylonfilter. In diesem Fall ist das Hybridisieren der Sonde an die nachzuweisende Nucleinsäure leicht dadurch nachweisbar, dass die Sonde - vermittelt durch die nachzuweisende Nucleinsäure - ebenfalls an den festen Träger gebunden ist und bei Durchführen eines Waschschrittes im wesentlichen nicht vom festen Träger abgewaschen wird. Dem Fachmann sind derartige Nachweisverfahren als Southern- oder Northern-Blot bekannt.
Erfindungsgemäß geeignete Primer zum Amplifizieren einer für OR10J1 codierenden Nucleinsäure besitzen die Sequenz SEQ ID NO. 1 oder SEQ ID NO 2. Diese PCR-Primer können auch verwendet werden zum
Expressionsnachweis mit Hilfe einer RT-PCR, sie können weiterhin eingesetzt werden, um PCR-Fragmente zu erzeugen, die für die Konstruktion von Expressionsvektoren benötigt werden. Zudem wird erfindungsgemäß angegeben, einen erfindungsgemäßen Rezeptor zu verwenden zum Nachweisen und/oder spezifischen Binden einer Verbindung der Formel (I), insbesondere der Formel B oder C. Dadurch werden die oben beschriebenen Komplexe erzeugt, die die oben genannten Vorteile besitzen.
Eine besonders bevorzugte Verwendung einer Verbindung der Formel (I), insbesondere der Formel B oder C besteht darin, die Geißelschlagfrequenz eines Spermiums zu beeinflussen. Es hat sich herausgestellt, dass auch Spermien Rezeptoren gemäß dem ersten Aspekt der Erfindung exprimieren und chemokinetische Reaktionen zeigen, die durch die Bindung einer Verbindung der Formel (I), insbesondere, ausgelöst werden können. Die Agonisten, also Verbindungen der Formel (I), insbesondere der Formel B oder C und insbesondere der Formel B3a, können daher auch dazu verwendet werden, die Schwimmgeschwindigkeit von Spermien zu erhöhen. Die Zugabe eines Antagonisten zu Spermien führt dazu, dass die beschriebenen Effekte - bei gleichbleibender Agonistenkonzentration - entweder nicht oder nicht in dem sonst üblichen Maße eintreten.
Dementsprechend wird erfindungsgemäß auch ein Arzneimittel angegeben, insbesondere ein Kontrazeptivum oder empfängnisförderndes Arzneimittel, umfassend als Agonist eine oder mehrere Verbindungen der Formel (I), insbesondere der Formel B oder C und insbesondere der Formel B3a, , in einer pharmazeutisch wirksamen Menge, insbesondere in einer kontrazeptiven oder empfängnisfördernden Menge. Die eine oder mehrere Verbindung(en) der Formel (I) können dabei insbesondere als pharmazeutisch verträgliches Salz der jeweiligen Verbindung der Formel (I) vorliegen. Unter einem Arzneimittel wird dabei jedes Mittel verstanden, das zur Vorbeugung, Diagnose oder zur Behandlung eines körperlichen Zustandes eines Menschen und/oder Tieres eingesetzt wird. Arzneimittel im erfindungsgemäßen Sinne können daher insbesondere Arzneimittel gemäß § 1 des Arzneimittelgesetzes sein, aber auch Medizinprodukte gemäß § 3 des Medizinproduktegesetzes, jeweils in ihrer am 01. August 2002 geltenden Fassung. Ein solches Arzneimittel nutzt die mit der oben beschriebenen Verwendung von Agonisten und Antagonisten erzielbaren Vorteile. Neben den Agonisten und/oder dem Antagonisten umfasst das Arzneimittel zweckmäßigerweise einen pharmazeutisch akzeptablen Träger. Anstelle des Agonisten oder Antagonisten selbst kann das Arzneimittel auch eine Vorstufe des Agonisten bzw. Antagonisten umfassen, die im menschlichen und/oder tierischen Körper zu einem Agonist bzw. Antagonist umgesetzt wird.
Bei einem kontrazeptiv wirkenden Arzneimitteln kann es besonders zweckmäßig sein, einen Antagonisten - bevorzugt einen den Rezeptor irreversibel hemmenden Antagonisten - im oder auf dem menschlichen Körper, vorzugsweise in der Scheide, dem Uterus und/oder dem Eileiter freizusetzen, um dort gegebenenfalls vorhandenen Spermien die Orientierung hin zu einer gegebenenfalls vorhandenen Eizelle zu erschweren. Dies kann durch ein Intravaginalpräparat erfolgen, aus dem der Antagonist freigesetzt wird. Ebenfalls möglich ist es, ein Präservativ mit einem Antagonisten - wiederum bevorzugt einem irreversiblen - zu versehen, beispielsweise zu imprägnieren oder zu beschichten, so dass der Antagonist bei bestimmungsgemäßer Verwendung des Präservativs freigesetzt wird.
Bei einem empfängnisfördernden Arzneimittel kann es insbesondere vorteilhaft sein, einen oder mehrere Agonisten - gegebenenfalls in Kombination mit weiteren Substanzen - im Eileiter und/oder Uterus freizusetzen, um Spermien mit einer niedrigen Geißelschlagfrequenz zu beschleunigen.
Ferner wird erfindungsgemäß ein Antagonist gegen das spezifische Binden eines Agonisten der Formel (I), insbesondere der Formel B oder C zum Beeinflussen der Geruchswahrnehmungsfähigkeit eines Menschen und/oder eines Tieres verwendet. Die Verwendung eines Antagonisten ermöglicht es auf einfache Weise, die Geruchswahrnehmungsschwelle für einen oder mehrere Agonisten bei Mensch und/oder Tier anzuheben, so dass der betreffende Agonist weniger leicht gerochen wird. Dies kann insbesondere in den Fällen sinnvoll sein, in denen ein Agonist einen störenden Geruch entwickelt, jedoch nur mit unverhältnismäßig hohem Aufwand aus der Luft oder einem anderen Trägermedium entfernt werden kann. Zudem wird erfindungsgemäß gelehrt, Verbindungen der Formel (I), insbesondere der Formel B3a und insbesondere die Verbindung PI-23472, als Antagonist gegen die Bindung eines Agonisten an den Rezeptor OR1 D2 und insbesondere zum Aufheben der chemotaktischen Wirkung auf Spermien von Agonisten dieses Rezeptors, insbesondere von Bourgeonal, zu verwenden.
Zum Herstellen eines erfindungsgemäßen Fusionsproteins oder Expressionssystems wird ein Verfahren angegeben, das die Schritte umfasst:
a) Einbringen eines erfindungsgemäßen Vektors in eine Zelle, und
b) Einstellen von Bedingungen, so dass der Nucleinsäureabschnitt des Vektors, der für den Rezeptor codiert, in der Zelle exprimiert wird.
Mit Hilfe dieses Verfahrens ist es möglich, ein erfindungsgemäßes Expressionssystem und damit den erfindungsgemäßen Rezeptor und gegebenenfalls auch einen erfindungsgemäßen Biosensor herzustellen. Der erfindungsgemäße Rezeptor kann aus den Zellen des Expressionssystems weiter aufgereinigt werden.
Gemäß einem weiteren Aspekt der Erfindung wird ein Verfahren angegeben zum Nachweisen einer Verbindung der Formel (I), insbesondere der Formel B oder C, , in einer Probe, wobei das Verfahren die Schritte umfasst:
a) Bereitstellen eines erfindungsgemäßen Rezeptors, insbesondere eines OR1 OJ 1 -Rezeptors, eines Duftstoffrezeptor smit einer Aminosäure-Sequenzhomologie von zumindest 70 % zur Aminosäuresequenz der Transmembrandomänen III bis VI des OR1 OJ 1 -Duftstoffrezeptors oder eines erfindungsgemäßen Fusionsproteins,
b) Inkontaktbringen des Rezeptors mit der zu untersuchenden Probe und Einstellen von Bedingungen, bei denen eine gegebenenfalls in der Probe enthaltene Verbindung der Formel (I) spezifisch an den Rezeptor bindet, und
c) Überprüfen, ob eine Verbindung der Formel (I) eine spezifische Bindung mit dem Rezeptor eingegangen ist.
Der Rezeptor kann insbesondere in Form eines Expressionssystems bereitgestellt werden, in dem der Rezeptor in Wirkverbindung mit einer Signaltransduktionskaskade steht. In diesem Fall kann eine spezifische Bindung der Verbindung der Formel (I) an den Rezeptor durch das Einschalten der betreffenden Signaltransduktionskaskade überprüft werden, während das spezifische Binden des Antagonisten durch das Ausbleiben eines solchen Einschaltens der Signaltransduktionskaskade bei Anwesenheit einerVerbindung der Formel (I) überprüft werden kann. Ein solches Expressionssystem kann jedoch auch künstlich nachgebildet werden, indem der Rezeptor und die übrigen Bestandteile der Signaltransduktionskaskade in vitro zusammengestellt werden.
Der Rezeptor kann jedoch auch als aufgereinigtes Protein vorliegen, das an die Oberfläche eines festen Trägers, insbesondere einer Metalloberfläche, gebunden ist. In diesem Fall kann sich durch das spezifische Binden einer Verbindung der Formel (I) und/oder eines Antagonisten an den Rezeptor eine physikalische Oberflächeneigenschaft ändern. Dies kann beispielsweise die Änderung der Oberflächen-Plasmon-Resonanz sein, wie sie in einem Biacore-Verfahren bestimmt werden kann.
Ebenfalls möglich ist es, den Rezeptor und/oder eine Verbindung der Formel (I) und/oder einen Antagonisten mit einem Fluoreszenzfarbstoff zu versehen und die durch die spezifische Bindung der Verbindung der Formel (I) und/oder des Antagonisten an den Rezeptor hervorgerufene Änderung der Fluoreszenz zu bestimmen.
Insbesondere kann der Rezeptor als Fusionsprotein mit einem green fluorescent p/Ote/n-(GFP-)-Anteil vorliegen, so dass sich die Fluoreszenz des
Fusionsproteins bzw. des GFP-Anteils des Fusionsproteins bei spezifischer Bindung einer Verbindung der Formel (I) und/oder eines Antagonisten entsprechend ändert. Dem Fachmann sind solche Untersuchungsverfahren unter der Bezeichnung "FRET-Assays" {Fluorescence resonance energy transfer assays) bekannt. Auf vergleichbare Weisekann der Rezeptor auch als Fusionsprotein mit einem Luciferase-Anteil vorliegen, so dass sich die Lumineszenz des Fusionsproteins bzw. des Luciferase-Anteils des Fusionsproteins bei spezifischer Bindung eines Agonisten und/oder eines Antagonisten ändert ("BRET-Assay").
Dabei ist insbesondere ein Verfahren zum Nachweisen des Antagonisten in einer Probe bevorzugt, das folgende Schritte umfasst:
a) Bereitstellen eines erfindungsgemäßen Rezeptors, insbesondere eines OR1 OJ 1 -Rezeptors, eines Duftstoffrezeptor smit einer Aminosäure-Sequenzhomologie von zumindest 70 % zur Aminosäuresequenz der Transmembrandomänen III bis VI des OR1 OJ 1 -Duftstoffrezeptors oder eines erfindungsgemäßen Fusionsproteins,
b) Inkontaktbringen des Rezeptors mit der zu untersuchenden Probe und Einstellen von Bedingungen, bei denen ein gegebenenfalls in der Probe enthaltener Antagonist spezifisch an den Rezeptor bindet,
c) Inkontaktbringen des Rezeptors mit einer Verbindung der Formel
(I), insbesondere der Formel B oder C, um der Verbindung ein spezifisches Binden an den Rezeptor zu ermöglichen, falls kein Antagonist spezifisch an den Rezeptor gebunden ist, und
d) Überprüfen, ob die Verbindung der Formel (I) und/oder ein Antagonist eine spezifische Bindung mit dem Rezeptor eingegangen ist.
Der Fachmann erkennt, dass die Schritte b) und c) gleichzeitig oder in einer beliebigen Reihenfolge nacheinander durchgeführt werden können, vorausgesetzt, dass Schritt c) vor oder gleichzeitig mit Schritt d) durchgeführt wird. Insbesondere können folgende Verfahrensausführungen zweckmäßig sein:
In einer bevorzugten Ausführungsform wird zunächst der erfindungsgemäße Rezeptor bereitgestellt. Hierzu kann sich der Fachmann der Möglichkeiten bedienen, die oben für ein erfindungsgemäßes Verfahren zum Nachweisen eines Agonisten, insbesondere einer Verbindung der Formel (I), und/oder Antagonisten beschrieben wurden. Anschließend wird der Rezeptor mit der gegebenenfalls antagonistenhaltigen Probe in Kontakt gebracht. Dabei werden solche Bedingungen eingestellt, unter denen ein Antagonist spezifisch an den Rezeptor binden könnte, so er denn in der Probe vorhanden ist. Nach dem Inkontaktbringen mit dem Antagonisten wird der Rezeptor mit einem Agonisten in Kontakt gebracht. Hierbei werden die Bedingungen so eingestellt, dass der Agonist an den Rezeptor spezifisch binden kann, wenn kein Antagonist an den Rezeptor spezifisch gebunden hat. Abschließend wird überprüft, ob der Agonist an den Rezeptor spezifisch gebunden hat. Dies kann beispielsweise dadurch geschehen, dass das Einschalten einer Signaltransduktionskaskade überprüft wird, mit der der Rezeptor in Wirkverbindung steht. Wenn der Agonist an den Rezeptor gebunden hat, dann liegt der Antagonist wahrscheinlich nicht in einer Konzentration in der zu untersuchenden Probe vor, bei der er das spezifische Binden des Agonisten verhindern könnte. Insbesondere kann es möglich sein, das Maß der Agonistenbindung an den Rezeptor zu bestimmen und hieraus - gegebenenfalls nach einer entsprechenden Kalibrierung - auf die Konzentration des Antagonisten in der zu untersuchenden Probe zu schließen.
In einer bevorzugten Abwandlung des Verfahrens wird der Rezeptor zuerst mit dem Agonisten und anschließend mit der den Antagonisten gegebenenfalls enthaltenden Probe in Kontakt gebracht. In diesem Fall kann aus der Abnahme des Maßes, in dem der Agonist spezifisch an den Rezeptor gebunden ist, auf die Anwesenheit des Antagonisten und gegebenenfalls auch auf dessen Konzentration in der zu untersuchenden Probe geschlossen werden. Die Erfindung wird nachfolgend anhand der Figuren und der Beispiele näher erläutert, ohne dass diese den Schutzbereich der Patentansprüche einschränken sollen.
Fig. 1 zeigt die spezifische Aktivierung von HEK293-Zellen durch PI-23472.
Beispiel 1 : Spezifische Aktivierung von HEK293-Zellen durch PI-23472
HEK293-Zellen wurden transient mit einem Vektor transfiziert, der für OR10J1 codierte. Zum Herstellen des Vektors wurde das Gen für OR10J1 mit den Primern SEQ ID NO. 1 und SEQ ID NO. 2 amplifiziert, mit der Restriktionsnuklease EcoRV verdaut und das erhaltene Fragment in die entsprechende Schnittstelle des Vektors pCDNA3 (Invitrogen, USA) kloniert.
Das verwendete Transfektionsprotokoll in diesem und den folgenden Beispielen entspricht dem der WO 2004/033496 A1 , auf deren Inhalt, insbesondere auf deren Beispiele 3 bis 13, in soweit verwiesen wird.
HEK293-Zellen unter Standardbedinungen in DMEM (Sambrook et al.,Molecular cloning: A laboratory manual; CoId Spring Harbour 1982) mit 10% fötalem Kälberserum, 100 U/ml Penicillin und Streptomycin und 2 mM L-Glutamin gehalten. Die Transfektion erfolgte durch Calciumphosphat-Präzipitation. Etwa 1 h vor Beginn der Transfektion wurde das Medium durch 2 ml frisches DMEM ersetzt. Zur Transfektion wurden 100 bis 200 μl des Transfektionsreagens zugegeben. Nach 24 h wurden die Zellen mit frischem PBS++ (2.7 mM KCl, 1 ,5 mM KH2PO4, 137 mM NaCI, 8,1 mM Na2HPO4, 0,9 mM CaCI2, 0,48 mM MgCI2, pH 7,3-7,5) gewaschen und erneut mit frischem DMEM kultiviert. Zur Calcium-Darstellung wurde das DMEM drei Tage nach der Transfektion durch übliche Ringer-Lösung ausgetauscht. Als Indikator der Calcium-Konzentration wurde Fura2 (Molecular Probes) nach Anleitung des Herstellers verwendet. Figur 1 zeigt eine repräsentative Abbildung einer Ca2+-Verteilung in den transfizierten HEK293-Zellen. HEK293-Zellen wuren mit einem Vektor transfiziert, der für OR10J1 codiert. Etwa 5% der transfizierten Zellen zeigten eine signifikante Zunahme des intrazellulären Calciumgehalts nach Zugabe von Pl- 23472.
Beispiel 2: Spezifität von Spermien-Duftstoffrezeptoren
HEK293-Zellen wurden wie in Beispiel 1 beschrieben mit Vektoren transfiziert, die für OR10J1 oder OR1 D2 codierten. Die transfizierten Zellen wurden auf ihre Reaktion auf verschiedene Substanzen hin untersucht.
Figur 2 zeigt in drei Teilfiguren die Entwicklung des intracellulären Ca2+-Gehalts der transfizierten HEK293-Zellen nach Verabreichen der jeweils angegebenen Substanz. Teilfigur a zeigt, dass OR10J1-transfizierte HEK293-Zellen auf die Verabreichung von PI-23472 mit einer Erhöhung des intracellulären Ca2+-Gehalts reagieren. n-Undecanal wirkt dabei nicht als Inhibitor. Ähnlich starke Erhöhungen des intracellulären Ca2+-Gehalts konnten bei OR1 OJ 1 -transfizierten HEK293- Zellen auch mit den übrigen Verbindungen der Formel (I) erreicht werden (nicht dargestellt). Teilfigur b zeigt, dass OR1 D2-transfizierte HEK293-Zellen auf die Verabreichung von Bourgeonal nur in Abwesenheit des Antagonisten n- Undecanal mit einer Erhöhung des intracellulären Ca2+-Gehalts reagieren. Teilfigur c zeigt, dass OR1 D2-transfizierte HEK293-Zellen nicht auf die Verabreichung von PI-23472 mit einer Erhöhung des intracellulären Ca2+-Gehalts reagieren. Beispiel 3: Beeinflussung des Verhaltens von Spermien
Die Reaktion von Spermien auf Bourgeonal und PI-23742 wurde untersucht wie in Beispiel 17 der WO 2004/033496A1 beschrieben, wobei jedoch frische Spermaproben statt gefrorener Spermaproben verwendet wurden..
Die Reaktionen von Sperma auf Bourgeonal und PI-23742 wurde (a) durch computer-assisted video motion analysis (CAVMA) gemessen, um Veränderungen in der Schwimmgeschwindigkeit (Spermaaktivierung) zu detektieren, und (b) in einem flat capillary-Assay für die Chemotaxis in der Nähe einer Diffusionsmaterialquelle untersucht. Für jede Test- oder Kontroll- Behandlung wurden fünf wiederholte Experimente unter Verwendung von Sperma der fünf Spender durchgeführt. Die Daten der Bioassays wurden statistisch durch Ein-Weg-Varianzanalyse (ANOVA) unter Verwendung eines post-hoc Scheffe-Tests (R. W. Day and G. P. Quinn, Ecol. Monogr. 59, 433-463 (1989)) analysiert. Eine Bonferroni-Korrektur wurde zum Angleichen der α-Levels für multiple Vergleiche verwendet.
Zur Untersuchung der Spermien-Aktivierung wurden Bioassays für die Schwimmgeschwindigkeit bei 37 0C durchgeführt. Spermien wurden sanft einer Kontroll- oder Testlösung einheitlicher Konzentration zugefügt. Die Bilder von Spermien (3,0 x 103 Zellen/ml) wurden dann unter Verwendung einer Videokamera (NEC Modell Tl 23A), die auf einem Olympus IX70-Lichtmikroskop montiert war, bei 90-facher Vergrößerung aufgenommen. Um mögliche Artefakte durch Reibungskräfte zu minimieren, besaß die Kamera eine 100 μm Feldtiefe und fokussierte auf eine Region, die annäherend 2 mm von der nächsten Oberfläche entfernt war. Videobilder von Spermien wurden mit 30 Bildern/Sekunde digitalisiert und über 10-Sekundenintervalle unter Verwendung eines CAVMA-Systemes (Motion Analysis Corporation, Modell VP 320, Expert Vision und Benutzter-Software), verbunden mit einer Sun SPARC 2 Computer- Arbeitsstation bearbeitet (J. A. Riffell, P. J. Krug, R. K. Zimmer, Journal of Experimental Biology 205, 1439-1450 (2002)). Die Schwimmgeschwindigkeit wurde auf einer Bild-zu-Bild-Basis bestimmt und danach über jeden einzelnen zurückgelegten Weg gemittelt. Um zu vermeiden, sich horizontal anstatt vertikal bewegende Zellen zu messen, wurden kurze Wege mit weniger als 1 1 Bildern verworfen, bei denen sich die Spermien um mehr als 20 % in ihrer scheinbaren Größe veränderten.
Zur Untersuchung der Spermien-Chemotaxis wurden Kammern mit vier getrennten Kompartimenten verwendet, wobei die Kapillar-Methode von Adler (J. Adler, Science 153, 708-716 (1966); J. Adler, Journal of General Microbiology 74, 77-91 (1973)) modifiziert wurde. Jedes Kompartiment bestand aus zwei durch einen Kanal verbundenen Vertiefungen. Die Spermienproben (106 Zellen/ml) wurden jeweils in den Vertiefungen vorgelegt. Ein flaches 6 μl- Mikrokapillarröhrchen (Drummond Scientific Co.), das entweder Test- oder Kontrolllösung enthielt, wurde in den Kanal eingeführt, wobei seine beiden Enden die frischen Spermien-Suspensionen innerhalb der zwei Vertiefungen berührten. Nach vier Stunden Inkubation bei 37 0C wurden die Inhalte jeder Kapillare in die Vertiefung eines Toxoplasmose-Objektträgers transferiert, hitzefixiert und mit 0,1 Acridin-Orange 1 Minute lang gefärbt. Zellzählungen wurden dann unter Verwendung eines Olympus-BH2-Mikroskopes, das für Phasenkontrast- und Epifluoreszenz-Applikationen ausgerüstet war (J. A. Riffeil, P. J. Krug, R. K. Zimmer, Journal of Experimental Biology 205, 1439-1450 (2002); C. C. Gee and R. K. Zimmer-Faust, Journal of Experimental Biology 200, 3185-3192 (1997)), bei 67-facher Vergrößerung durchgeführt.
Zur Bestimmung der Chemoattraktion von Spermien und des Effekts eines Antagonisten wurde PI-23742 und Bourgeonal allein bzw. Bourgeonal bei 10"7 M in Kombination mit 10"6, 10"7, 10"8 oder 10"9 M PI-23742 getestet. Während der Durchführung der Chemotaxis-Bioassays wurde das Spermienverhalten innerhalb eines Bereiches von 300 μm vor jeder Kapillarspitze 30 Sekunden lang auf Video aufgenommen. Die Videoaufnahme begann 10 bis 15 Minuten nach dem Experimentbeginn, um die Bildung eines chemischen Gradienten zu ermöglichen. Die Spermien-Orientierung zum Gradienten hin wurde unter Verwendung von CAVMA quantifiziert. Durch Anwendung zirkulärer Statistiken wurde die mittlere Vektorlänge (r) und die Schwimmrichtung berechnet, um das Bewegungsmuster der untersuchten Spermien zu beschreiben. Der Winkel der Spermienorientierung wurde in Bezug auf einen Ursprung angegeben, der als die kürzeste Verbindung zwischen jeder individuellen Zelle und der Kapillarenspitze (0°) definiert wurde. Um zu bestimmen, ob die Zellbewegung innerhalb des chemischen Gradienten nicht-zufällig war, wurde jede mittlere Ausrichtung mit einer uniformen zirkulären Verteilung unter Verwendung eines unimodalen Rayleigh-Tests (J. H. Zar, Biostatistical Analysis (1984)) verglichen.
Die Spermien reagierten (vgl. Figur 3) auf PI-12372 und Bourgeonal in einer Dosis-abhängigen Weise, indem sie erhöhte Schwimmgeschwindigkeiten und Chemotaxis in Kapillar-Assays zeigten. Die Figur 3 stellt diese Ergebnisse graphisch dar, wobei die Werte Mittelwerte und Standartabweichung mit aus den Rohdaten berechneten Regressionsgeraden sind. Ab einer Konzentration von 10" 6 M erhöhte PI-23472 die Schwimmgeschwindigkeit von Spermien (Teilfigur b).
PI-23742 konnte die chemotaktische Wirkung von Bourgeonal auf Spermien hemmen (Figur 3, Teilfigur a). Dieser Befund ist konsistent mit der obigen Feststellung, dass Verbindungen der Formel (I), insbesondere der Formel B3a und insbesondere PI-23472 Antagonisten der Bourgeonalwirkung sind.
Beispiel 4: Herstellung von 1-[4-(2,2,3-Trimethyl-cyclopent-3-enyl)- cyclohex-3-enyl]-ethanol / 1 -[3-(2,2,3-Trimethyl-cyclopent-3-enyl)-cyclohex- 3-enyl]-ethanol
1.1. 1 ,5,5-Trimethyl-4-(1-methylen-allyl)-cyclopenten (Xl):
Zu einer Lösung aus Methyltriphenylphosphoniumbromid (708.1 g, 1.98 mol) in Diethylether (1900 ml) gibt man Kalium-tert-butanolat (222.5 g, 1.98 mol) hinzu. Die sich bildende gelbe Lösung wird nach beendeter Zugabe auf Rückflusstemperatur erhitzt und nach 60 Minuten tropft man α- Methylencampholenaldehyd ((X), 247.4 g, 1.51 mol) hinzu. Nach beendeter Reaktion lässt man auf Raumtemperatur abkühlen und gibt unter starkem rühren Pentan (600 ml) und Wasser (600 ml) hinzu. Der entstandene Niederschlag wird abgesaugt, anschließend trennt man die Phasen, und extrahiert die wässrige Phase noch dreimal mit Diethylether (je 750 ml). Die vereinigten organischen Phasen werden getrocknet, abfiltriert und einrotiert. Das erhaltene Rohprodukt wird nochmals in Pentan (500 ml) aufgenommen und der sich bildende Niederschlag wird abgesaugt. Anschließend entfernt man das Lösungsmittel am Rotationsverdampfer und erhält 281.6 g Rohprodukt (Xl), mit einem Produktgehalt von 79%. Das erhaltene Rohprodukt wird ohne weitere Reinigung in die nächste Stufe eingesetzt. Zur spektroskopischen Strukturbestimmung wird eine kleine Probe des Rohproduktes flashchromatographisch gereinigt.
1H-NMR (400 MHz, CDCI3): δ (ppm) = 0.75 (s, 3H), 1.07 (s, 3H), 1.61 (td, J = 2.1 , 1.6 Hz, 3H), 2.33 (dquin, J = 8.2, 2.1 Hz, 2H), 2.90 (t, J = 8.2 Hz, 1 H), 4.98-5.06 (m, 2H), 5.20-5.23 (m, 1 H), 5.27-5.33 (m, 1 H), 5.33 (dd, J = 17.4, 1.3 Hz, 1 H), 6.38 (ddd, J = 17.4, 10.8, 0.9 Hz, 1 H).
13C-NMR (100 MHz, CDCI3): δ (ppm) = 12.8, 21.4, 27.0, 34.9, 47.8, 51.0, 1 13.0, 114.9, 121.5, 140.4, 147.2, 147.3.
1.2 1-[4-(2,2,3-Trimethyl-cyclopent-3-enyl)-cyclohex-3-enyl]-ethanon / 1-[3- (2,2,3-Trimethyl-cyclopent-3-enyl)-cyclohex-3-enyl]-ethanon
Zu einer heterogenen Lösung von Aluminiumchlorid (23.79 g, 0.18 mol) in Toluol (350 ml) tropft man Methylvinylketon (124.8 g, 1.78 mol), gelöst in Toluol (75 ml), so zu, dass die Temperatur 25°C nicht übersteigt. Man lässt 30 Minuten rühren, bevor man das Dien ((XI), 264.0 g, 1.28 mol, 79% Reinheit), gelöst in Toluol (75 ml), zugibt. Jetzt erhitzt man für 24 Stunden auf 900C. Nach beendeter Reaktion gießt man den Reaktionsansatz auf gesättigte NaHCO3-Lösung (500 ml), trennt die Phasen und wäscht die organische Phase mit gesättigter NaHCO3-Lösung bis zur Neutralität. Anschließend wird die organische Phase über Na2SO4 getrocknet, abfiltriert und einrotiert. Man erhält 404.1 g Rohprodukt, wobei die beiden Isomeren (B3a) und (B3b) mit R2 = -CH3 im Verhältnis 3:1 und in einer Gesamtreinheit von 73.2% entstehen. Das erhaltene Rohprodukt wird ohne weitere Reinigung in die nächste Stufe eingesetzt. Zur spektroskopischen Strukturbestimmung wird eine kleine Probe des Rohproduktes flashchromatographisch (Cyclohexan/EtOAc = 10:1 , Rf = 0.24) gereinigt.
Die spektroskopischen Daten beziehen sich auf (IXa mit R1 = -CH3).
1H-NMR (400 MHz, CDCI3): δ (ppm) = 0.73 (s, 3H), 1.04 (s, 3H), 1.56-1.60 (m, 3H), 1.89-2.27 (m, 7H), 2.17 (s, 3H), 2.23-2.37 (m, 1 H), 2.39-2.46 (m, 1 H), 2.51- 2.60 (m, 1 H), 5.22-5.27 (m, 1 H), 5.45-5.52 (m, 1 H).
13C-NMR (100 MHz, CDCI3): δ (ppm) = 12.7, 20.6, 25.1 , 26.7, 27.2, 27.9, 28.7, 32.4, 47.5, 48.1 , 57.3, 120.5, 121.2, 137.5, 146.9, 211.2.
Geruch: Schwache Sandelholznote, holzig-süß, moosig, nussig.
1.3 1-[4-(2,2,3-Trimethyl-cyclopent-3-enyl)-cyclohex-3-enyl]-ethanol / 1-[3- (2,2,3-Trimethyl-cyclopent-3-enyl)-cyclohex-3-enyl]-ethanol
Zu einer auf 00C abgekühlten Lösung des Reaktionsgemisches nach Vorschrift 1.2 (253.6 g, 0.80 mol, Reinheit 73.2%) in Ethanol (600 ml) gibt man portionsweise Natriumborhydrid (15.1 g, 0.4 mol). Nach beendeter Zugabe lässt man auf Raumtemperatur kommen und rührt eine weitere Stunde. Nach beendeter Reaktion gibt man 2M HCl zu, bis der Reaktionsansatz pH = 7 erreicht. Anschließend rotiert man das Ethanol ab und nimmt den Rückstand in gesättigter NaCI-Lösung (300 ml) auf. Jetzt wird dreimal mit Diethylether (je 500 ml) extrahiert, bevor man die vereinigten organischen Phasen über Na2SO4 trocknet, abfiltriert und einrotiert. Man erhält 247.1 g Rohprodukt, wobei die beiden Isomere im Verhältnis 3:1 und in einer Gesamtreinheit von 76.5% entstehen. Anschließende Vakuumdestillation an einer 30 cm Füllkörperkolonne (Sdp.: 100-1030C, 0.11 mbar) liefert die gewünschten Verbindungen (im Verhältnis 3:1 ) in 97%-iger Reinheit.
Die beiden Regioisomere konnten durch präparative HPLC (Säule: GROM Saphir 110 Si, 5μm, 125x20 mm; Eluent: Methanol/Wasser = 3:1 ; Flussrate: 25 ml/min; Druck: 120 bar) getrennt, analysiert, spektroskopisch vermessen und geruchlich evaluiert werden.
1-[4-(2,2,3-Trimethyl-cyclopent-3-enyl)-cyclohex-3-enyl]-ethanol
1H-NMR (400 MHz, CDCI3): δ (ppm) = 0.73 (s, 3H), 1.04 (s, 3H), 1.19 (d, J = 6.3 Hz, 3H), 1.25-1.38 (m, 1 H), 1.54 (s, 1 H, OH), 1.43-1.60 (m, 1 H), 1.59 (td, J = 2.4, 1.6 Hz, 3H), 1.68-2.12 (m, 5H), 2.12-2.22 (m, 1 H), 2.25-2.36 (m, 1 H), 2.43 (t, J = 8.4 Hz, 1 H), 3.57 (quint, J = 6.4 Hz, 1 H), 5.24-5.27 (m, 1 H), 5.45-5.52 (m, 1 H).
13C-NMR (100 MHz, CDCI3): δ (ppm) = 12.8, 20.7, 20.8, 25.1 , 26.8, 28.1 , 29.5, 32.5, 41.5, 48.2, 57.6, 71.9, 121.5, 121.6, 137.8, 147.4.
Geruch: sehr intensive Sandelholznote, natürlich an ß-Santalol erinnernd, etwas milchig-fettig mit schwachem Moschuscharakter, enorme Raumwirkung (Diffusivität) und Haftung (Substantivität).
1-[3-(2,2,3-Trimethyl-cyclopent-3-enyl)-cyclohex-3-enyl]-ethanol
1H-NMR (400 MHz, CDCI3): δ (ppm) = 0.74 (s, 3H), 1.05 (s, 3H), 1.20 (d, J = 6.3 Hz, 3H), 1.25-1.38 (m, 1 H), 1.46-1.58 (m, 1 H), 1.58-1.61 (m, 3H), 1.64-1.76 (m, 1 H), 1.78-.96 (m, 2H), 2.02-2.22 (m, 4H), 2.26-2.38 (m, 4H), 2.40-2.48 (m, 1 H), 3.61 (quint, J = 6.4 Hz, 1 H), 5.24-5.28 (m, 1 H), 5.46-5.53 (m, 1 H).
13C-NMR (100 MHz, CDCI3): δ (ppm) = 12.8, 20.7, 20.8, 24.4, 25.6, 26.9, 32.1 , 32.5, 41.8, 48.2, 57.8, 71.7, 121.6, 122.5, 137.0, 147.4.
Geruch: Weiche Sandelholznote, trocken, etwas staubig. Beispiel 5: Herstellung von 2-[4-(2,2,3-Trimethyl-cyclopent-3-enyl)- cyclohex-3-enyl]-propan-2-ol / 2-[3-(2,2,3-Trimethyl-cyclopent-3-enyl)- cyclohex-3-enyl]-propan-2-ol
Zu einer 3M Methylmagnesiumchlorid-Lösung in THF (15 ml, 45 mmol) tropft man (B3a)/(B3b) = 3:1 mit R2 = -CH3 (8.21 g, 35 mmol), gelöst in Diethylether (10 ml), so zu, dass die Temperatur 35°C nicht übersteigt. Nach beendetem zutropfen rührt man noch 1 Stunde bei Raumtemperatur. Nach beendeter
Reaktion gießt man die Reaktionslösung auf kalte NH4CI-Lösung (15 ml), trennt die Phasen und extrahiert die wässrige Phase noch zweimal mit Diethylether (je 50 ml). Die vereinigten organischen Phasen werden noch je einmal mit gesättigter NaHCO3-Lösung und gesättigter NaCI-Lösung gewaschen, bevor sie über Na2SO4 getrocknet, abfiltriert und einrotiert werden. Man erhält 9.52 g
Rohprodukt, welches durch Flashchromatographie (Cyclohexan/EtOAc = 10:1 , Rf
= 0.21 ) gereinigt wird. Die spektroskopischen Daten beziehen sich auf Verbindung (C2a) mit R4 = -CH3.
1H-NMR (400 MHz, CDCI3): δ (ppm) = 0.75 (s, 3H), 1.06 (s, 3H), 1.18 (s, 3H), 1.20 (s, 3H), 1.18-1.30 (m, 1 H), 1.47-1.60 (m, 1 H), 1.60 (td, J = 2.3, 1.7 Hz, 3H), 1.80-2.05 (m, 3H), 2.05-2.23 (m, 4H), 2.23-2.38 (m, 1 H), 2.43 (t, J = 8.2 Hz, 1 H), 5.23-5.28 (m, 1 H), 5.46-5.53 (m, 1 H).
13C-NMR (100 MHz, CDCI3): δ (ppm) = 12.7, 20.6, 24.1 , 26.1 , 26.8, 27.0, 27.1 , 27.3, 30.4, 32.4, 45.2, 57.4, 72.5, 121.3, 121.6, 137.5, 147.1.
Geruch: Schwache Sandelholznote, etwas fettig.
Beispiel 6: Herstellung von [4-(2,2,3-Trimethyl-cyclopent-3-enyl)-cyclohex- 3-enyl]-methanol / [3-(2,2,3-Trimethyl-cyclopent-3-enyl)-cyclohex-3-enyl]- methanol
3.1 4-(2,2,3-Trimethyl-cyclopent-3-enyl)-cyclohex-3-encarbaldehyd / 3-(2,2,3- Trimethyl-cyclopent-3-enyl)-cyclohex-3-encarbaldehyd
Zu einer heterogenen Lösung von Aluminiumchlorid (12.11 g, 91.00 mmol) in Toluol (700 ml) tropft man Acrolein (47.85 g, 0.85 mol), gelöst in Toluol (275 ml), so zu, dass die Temperatur 25°C nicht übersteigt. Man lässt 30 Minuten rühren, bevor man das Dien ((XI), 143.8 g, 0.70 mol, 79% Reinheit), gelöst in Toluol (45 ml), zugibt. Jetzt erhitzt man für 24 Stunden auf 900C. Nach beendeter Reaktion gießt man den Reaktionsansatz auf gesättigte NaHCθ3-Lösung (300 ml), trennt die Phasen und wäscht die organische Phase mit gesättigter NaHCO3-Lösung bis zur Neutralität. Anschließend wird die organische Phase über Na2SÜ4 getrocknet, abfiltriert und einrotiert. Man erhält 195.4 g Rohprodukt, wobei die beiden Isomeren (B3a) und (B3b) mit R2 = H im Verhältnis 3:1 und in einer Gesamtreinheit von 66.5% entstehen. Das erhaltene Rohprodukt wird ohne weitere Reinigung in die nächste Stufe eingesetzt. Zur spektroskopischen Strukturbestimmung wird eine kleine Probe des Rohproduktes flashchromatographisch (Cyclohexan/EtOAc = 10:1 , Rf = 0.22) gereinigt.
Die Massenspektroskopischen Daten beziehen sich auf (B3a mit R2 = H).
MS: m/z (%) = 41 (C3H5 +, 82), 55 (C4H7 +, 43), 67 (C5H7 +, 43), 79 (C6H7 +, 75), 91 (C7H7 +, 100), 105 (C8H9 +, 67), 119 (C9H11 +, 60), 148 (M+ - C4H6O, 56), 175 (M+ - C3H7 +, 73), 203 (M+ - CH3), 218 (M+, 35).
Geruch: Intensive Sandelholznote, schöne Natürlichkeit.
3.2 [4-(2,2,3-Trimethyl-cyclopent-3-enyl)-cyclohex-3-enyl]-methanol / [3- (2,2,3-Trimethyl-cyclopent-3-enyl)-cyclohex-3-enyl]-methanol Zu einer Suspension aus Lithiumaluminiumhydrid (10.16 g, 0.27 mol) in Diethylether (400 ml) tropft man die Mischung der Aldehyde (B3a/B3b = 3:1 , mit R2 = H, 178.0 g, 0.54 mol, 66.5% Reinheit, aus Beispiel 3.1 ), gelöst in Diethylether (150 ml), so zu, dass der Diethylether leicht siedet. Nach beendeter Zugabe lässt man noch 30 Minuten rühren, bevor man nacheinander n-Hexan (150 ml), Wasser (150 ml) und 15%ige NaOH (100 ml) zugibt. Der enstandene Niederschlag wird abgesaugt, die Phasen werden getrennt und die wässrige Phase wird noch dreimal mit Diethylether (je 250 ml) extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen werden über Na2SO4 getrocknet, abfiltriert und einrotiert. Man erhält 151.8 g Rohprodukt in 68%-iger Reinheit. Anschließende Vakuumdestillation an einer 30 cm Füllkörperkolonne (Sdp.: 92-94°C, 0.07 mbar) liefert die gewünschte Verbindung (C1a/C1 b = 3:1 , mit R4 = H) in 98%-iger Reinheit.
Die spektroskopischen Daten beziehen sich auf (C1a mit R4 = H).
1H-NMR (400 MHz, CDCI3): δ (ppm) = 0.74 (s, 3H), 1.05 (s, 3H), 1.18-1.38 (m, 2H), 1.59 (td, J = 2.2, 1.6 Hz, 3H), 1.72-1.86 (m, 3H), 1.91-2.05 (m, 1 H), 2.06- 2.22 (m, 3H), 2.25-2.37 (m, 1 H), 2.43 (t, J = 8.3 Hz, 1 H), 3.49-3.59 (m, 2H), 5.24- 5.28 (m, 1 H), 5.46-5.50 (m, 1 H).
13C-NMR (100 MHz, CDCI3): δ (ppm) = 12.7, 20.7, 25.9,26.9, 27.7, 28.9, 32.5, 36.6, 48.2, 57.6, 67.8, 121.5, 121.6, 138.1 , 147.3.
Geruch: Schöne Sandelholznote mit Moschusaspekten.

Claims

Patentansprüche
1. Verwendung einer Substanz der Formel (I)
Figure imgf000042_0001
(I)
wobei
X bedeutet: -OH, -COR' oder C(OH)R 30 DR44,
R1, R2, R3, R4 und R5 unabhängig voneinander H oder CH3 bedeuten,
und alternativ X und R5 zusammen eine Ketongruppe (=0) bedeuten können, und wobei ferner
die in der Formel (I) eingezeichnete gestrichelte Linie eine Doppelbindung an einer der beiden Positionen bedeutet,
a) zum Binden an und/oder zum Aktivieren eines OR10J1- Duftstoffrezeptors oder eines Duftstoffrezeptors mit einer Aminosäure- Sequenzhomologie von zumindest 70 % zur Aminosäuresequenz der Transmembrandomänen III bis VI des OR1 OJ 1 -Duftstoffrezeptors,
b) zum Auslösen oder Erhöhen der Bildung von Cycloadenosinmonophosphat und/oder zum Auslösen eines Einstroms oder Erhöhen der Konzentration an Ca2+ in einer Zelle, die einen OR10J1- Duftstoffrezeptor oder einen Duftstoffrezeptor mit einer Aminosäure- Sequenzhomologie von zumindest 70 % zur Aminosäuresequenz der Transmembrandomänen III bis VI des OR1 OJ 1 -Duftstoffrezeptors exprimiert,
c) zum Steigern der Geißelschlagfrequenz eines Spermiums, und/oder d) zum Herstellen eines Arzneimittels zum Behandeln einer niedrigen Spermiengeißelschlagfrequenz.
2. Verbindung ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus
Figure imgf000043_0001
wobei R1 H oder CH3 bedeutet, und
Figure imgf000043_0002
3. Expressionssystem umfassend eine Zelle, die einen OR10J1- Duftstoffrezeptor oder einen Duftstoffrezeptor mit einer Aminosäure- Sequenzhomologie von zumindest 70 % zur Aminosäuresequenz der Transmembrandomänen III bis VI des OR1 OJ 1 -Duftstoffrezeptors exprimiert, wobei
a) der Duftstoffrezeptor heterolog in bezug auf die Zelle ist oder
b) der Duftstoffrezeptor in der Zelle überexprimiert wird.
4. Expressionssystem nach Anspruch 3, wobei die Zelle eine gegebenenfalls entartete Säugerzelle ist.
5. Vektor umfassend einen Nucleinsäureabschnitt codierend für einen OR1 OJ 1 -Duftstoffrezeptor oder einen Duftstoffrezeptor mit einer Aminosäure- Sequenzhomologie von zumindest 70 % zur Aminosäuresequenz der Transmembrandomänen III bis VI des OR1 OJ 1 -Duftstoffrezeptors.
6. Nucleinsäure der Sequenz SEQ ID NO 1 SEQ ID NO 2, oder SEQ ID NO. 4.
7. Verwendung einer Nucleinsäure gemäß Anspruch 6 oder SEQ ID NO 3 zum Nachweisen eines Nucleinsäureabschnitts codierend für einen OR10J1-
Duftstoffrezeptor oder einen Duftstoffrezeptor mit einer Aminosäure- Sequenzhomologie von zumindest 70 % zur Aminosäuresequenz der Transmembrandomänen III bis VI des OR1 OJ 1 -Duftstoffrezeptors.
8. Biosensor zum Nachweisen einer Verbindung der Formel (I) gemäß Anspruch 1 , umfassend
a) ein Expressionssystem nach einem der Ansprüche 3 oder 4, und
b) Mittel zum Nachweisen einer Bindung der Verbindung der Formel (I) an den besagten Duftstoffrezeptor des Expressionssystems.
9. Arzneimittel umfassend eine oder mehrere Verbindungen der Formel (I) gemäß Anspruch 1 oder eines Salzes der jeweiligen Verbindung, in einer pharmazeutisch wirksamen Menge.
10. Verwendung eines OR1 OJ 1 -Duftstoffrezeptors oder eines Duftstoffrezeptors mit einer Aminosäure-Sequenzhomologie von zumindest 70 % zur Aminosäuresequenz der Transmembrandomänen III bis VI des OR10J1- Duftstoffrezeptors zum Nachweisen und/oder zum Binden an eine Verbindung der Formel (I) gemäß Anspruch 1.
11. Verfahren zum Nachweisen einer Verbindung der Formel (I) gemäß Anspruch 1 , umfassend die Schritte:
a) Bereitstellen eines Expressionssystems nach einem der Ansprüche 3 bis 4,
b) Inkontaktbringen des Expressionssystems mit einer Probe, die gegebenenfalls eine besagte Verbindung der Formel (I) enthält, und
c) Überprüfen, ob die Verbindung der Formel (I) an den besagten Duftstoffrezeptor des Expressionssystems gebunden hat.
12. Verfahren zum Nachweisen eines Antagonisten eines OR10J1- Duftstoffrezeptors oder eines Duftstoffrezeptors mit einer Aminosäure- Sequenzhomologie von zumindest 70 % zur Aminosäuresequenz der Transmembrandomänen III bis VI des OR1 OJ 1 -Duftstoffrezeptors, umfassend die Schritte:
a) Bereitstellen des erfindungsgemäßen Rezeptors,
b) Inkontaktbringen des Rezeptors mit der zu untersuchenden Probe und Einstellen von Bedingungen, bei denen ein gegebenenfalls in der Probe enthaltener Antagonist spezifisch an den Rezeptor bindet,
c) Inkontaktbringen des Rezeptors mit einer Verbindung der Formel (I) ,um der Verbindung ein spezifisches Binden an den Rezeptor zu ermöglichen, falls kein Antagonist spezifisch an den Rezeptor gebunden ist, und
d) Überprüfen, ob die Verbindung der Formel (I) und/oder ein Antagonist eine spezifische Bindung mit dem Rezeptor eingegangen ist.
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