DE3875835T2

DE3875835T2 - Antivirale, antitumoraktive und fungizide zusammensetzungen.

Info

Publication number: DE3875835T2
Application number: DE8888306347T
Authority: DE
Inventors: Sue Shipley Cross; Tatsuo Higa; Shinichi Sakemi
Original assignee: Harbor Branch Oceanographic Institution Inc
Current assignee: Harbor Branch Oceanographic Institute Foundation Inc
Priority date: 1987-07-17
Filing date: 1988-07-12
Publication date: 1993-06-03
Anticipated expiration: 2008-07-13
Also published as: JPH01117886A; US4801606A; ES2052724T3; EP0299713A3; DE3875835D1; EP0299713A2; CA1327357C; EP0299713B1

Description

Die Erfindung betrifft neue organische Zusammensetzungen, die nützliche antitumoraktive, antivirale und fungicide Wirkungen aufweisen und die sich von einem Meeresorganismus ableiten, dem Schwamm Theonella sp., sowie Verfahren zu ihrer Verwendung.
Verschiedene Krankheiten, die in Beziehung zu Tumoren stehen, befallen den Menschen. Beträchtliche Forschungsarbeit ist der Oncologie und Maßnahmen gegen Tumoren gewidmet worden. Tumoren sind bei einer Reihe von Säugetieren üblich, und die Verhinderung, Bekämpfung des Wachstums und Rückbildung von Tumoren in Säugetieren ist für den Menschen von großer Bedeutung. Der Ausdruck "Tumor" bezieht sich auf abnormes, massenhaftes Wachstum von neuem Gewebe, das nicht in Einklang mit der Organisation des Ursprungsgewebes oder des Wirtsorganismus als eines Ganzen steht.
Tumoren befallen Säugetiere und den Menschen mit einer Anzahl von Störungen und Bedingungen, die verschiedene Formen von Krebs und daraus resultierender canceröser Kachexie einschließen. Die Krebskachexie bezieht sich auf die symptomatischen Beschwerden, die den Befall eines Säugetieres mit einem Tumor begleiten. Diese Symptome schließen eine geschwächte Kondition des befallenen Säugetieres ein, wie sie sich beispielsweise durch Gewichtsabnahme zeigt. Die Ernstlichkeit von Krebserkrankungen ist wohlbekannt; so steht Krebs beispielsweise lediglich Herz- und Gefäßkrankheiten als Todesursache beim Menschen nach.
Virale Krankheiten befallen Menschen, Pflanzen, Insekten und andere Tiere. Die Verhütung und Bekämpfung von viralen Krankheiten besitzt eine große Bedeutung für Gesundheit und Wirtschaft.
Virale Krankheiten tragen zum Krankheitsbefall beim Menschen bei, wie beispielsweise bei normalen Erkältungen, Herpes und Krebs, und die Bedeutung ihrer Bekämpfung ist klar. Ebenfalls wichtig ist die Bekämpfung von viralen Krankheiten bei Tieren aus wirtschaftlichen Gründen sowie deswegen, weil Tiere Virusreservoire oder Virusträger werden können, die das Ausbreiten von viralen Krankheiten auf den Menschen erleichtern. Virale Pflanzenkrankheiten haben bekanntlich eine verheerende Wirkung auf den Anbau von Obstbäumen, Tabak und verschiedenen Gemüsen. Virale Krankheiten bei Insekten sind ebenfalls von Interesse, weil die Insekten in der Lage sind, virale Krankheiten auf Menschen zu übertragen.
Die Verhütung des Wachstums von Pilzen und der dadurch verursachten Infektionen und Krankheiten von Säugetieren und Pflanzen ist ebenfalls für den Menschen von Bedeutung. Das Vorhandensein von Pilzen kann verschiedene Krankheiten und Infektionen beim Menschen hervorrufen, einschließlich Pilzkrankheiten, wie beispielsweise pulmonaler Candidiasis und pulmonaler Blastomycose. Gewisse hefeartige Organismen, beispielsweise Cryptococcus Neoformans, kann ernste Infektionen des zentralen Nervensystems hervorrufen. Besser bekannte Pilzinfektionen beim Menschen und bei Säugetieren sind beispielsweise der Ringwurm, das sind Pilzinfektionen im Haar- und Nagelbereich, sowie resistente Infektionen der Haut. Viele andere Pilzinfektionen befallen Menschen und Säugetiere im Bereich der Haut, der Schleimhautmembranen und des Darmtraktes sowie im Vaginalbereich und in den Lungen.
Pflanzen werden von verschiedenen Pilzen ebenfalls angegriffen. Der Schaden der von Pilzinfektionen der Landwirtschaft zugefügt wird, beläuft sich jährlich auf Milliarden Dollar. Verschiedene anorganische und organische Fungistatica und Fungicide wurden bereits ausprobiert, jedoch mit begrenztem Erfolg. Für ein Fungistaticum oder Fungicid ist es natürlich wichtig, daß es zwar die Pilze, jedoch nicht die Pflanze tötet und daß es keine toxischen Reste auf den zur Ernährung verwendeten Teilen der Pflanze hinterläßt. Verschiedene Verfahren sind angewandt worden, um Pilzinfektionen in der Landwirtschaft zu bekämpfen, wie beispielsweise die Methode mit Blattfungiciden, bei der Pflanzen mit einem preventiv wirkenden, wetterfesten Fungicid beschichtet werden. Die Behandlung von Saatgut und Boden sind Methoden, die Fungicide erfordern, für die Samen sicher sind und die einem Abbau durch den Boden und durch Boden-Mikroorganismen widerstehen. Chemotherapeutica sind Fungicide, die in die Pflanze eindringen, um neues Wachstum zu schützen oder Infektionen zu beseitigen, die bereits innerhalb der Pflanze aufgetreten sind. Landwirtschaftliche Fungistatica und Fungicide sowie ihre Anwendung müssen außerdem nach sehr strengen Erfordernissen und Regeln eingesetzt werden, die beispielsweise in den Vereinigten Staaten von Amerika erlassen worden sind.
Beträchtlicher Forschungsaufwand und Forschungsmittel sind für die Oncologie und Maßnahmen zur Tumorbekämpfung einschließlich Chemotherapie, antivirale Maßnahmen und Bekämpfung von Pilzinfektionen, bei sowohl Säugetieren als auch Pflanzen bereits eingesetzt worden. Während verschiedene antitumoraktive, antivirale oder fungicide Mittel und entsprechende Verfahren entwickelt worden sind, die bei der Inhibierung von Tumoren, Viren bzw. der Ausbreitung von Pilzen hilfreich sind, besteht dennoch ein Bedarf an weiteren Verfahren und chemischen Mitteln.
Eine mögliche Quelle für antitumoraktive, antivirale und fungicide Verbindungen ist das Meerespflanzen- und -tierleben, und von besonderem Interesse sind Meeresschwämme. Es wurde nun gefunden, daß organische Verbindungen, die sich von Extrakten des Schwamms Theonella sp. ableiten, nützliche antitumoraktive, antivirale und fungicide Wirkungen aufweisen.
Einige Verbindungen von Interesse sind schon früher aus dem Meeresschwamm Theonella sp. isoliert worden. Insbesondere wird über sesquiterpenoide Verbindungen von H. Nakamura, J. Kobayashi, Y. Ohizumi und Y.Hirata in Tetrahedron Letters, Band 25, Nr. 47, Seiten 5401-5404 (1984) berichtet. Diese Literaturstelle offenbart die Isolierung von "Theonellin"-Verbindungen der Formel:
aus dem Seeschwamm Theonella cf. Swinhuei aus Okinawa. Für die Theonellin-Verbindungen wurde von Nakamura et al. über keine biologische Aktivität berichtet. Von Interesse sind außerdem Misakinolid-Verbindungen mit antitumoraktiven und antiviralen Eigenschaften, wie sie in der gleichzeitig eingereichten Patentanmeldung Serial No. 051,127 vom 18. Mai 1987 von T. Higa, R. Sakai und M. Lui beschrieben sind.
Eine weitere interessante Verbindung natürlicher Herkunft ist Pederin. Pederin wird aus Insekten der Gattung Paederus isoliert. Pederin besitzt die folgende Struktur:
Pederin weist eine antimitotische Wirkung auf, wie sie in den britischen Patentschriften 1,078,049(1967) und 932,875 (1963) beschrieben ist.
Es besteht ein Bedarf an neuen Verbindungen, die sich als antitumoraktive, antivirale und fungicide Mittel eignen, sowie an einem Verfahren zur Herstellung derartiger neuer Verbindungen.
Es besteht außerdem ein Bedarf an der Schaffung eines Verfahrens zur Inhibierung von Tumoren, Viren und Pilzwachstum sowie der daraus sich ergebenden Infektionen und Krankheiten unter Verwendung neuer antitumoraktiver, antiviraler und fungicider Verbindungen.
Gegenstand der Erfindung ist eine Verbindung gemäß der Formel I, II oder III Formel I Formeln II, III
worin
Z=Z¹ Formel II
oder Formel III
und worin X¹ bis X&sup4; gleich oder verschieden sind und Wasserstoff, eine Hydroxylgruppe, eine niedrig molekulare Acylgruppe oder eine niedrig molekulare Alkylgruppe bedeuten; X&sup5; und X&sup6; gleich oder verschieden sind und Wasserstoff oder eine niedrigmolekulare Alkylgruppe bedeuten; R¹ Wasserstoff, eine Hydroxylgruppe, eine niedrigmolekulare Alkylgruppe oder eine niedrigmolekulare Alkoxygruppe bedeutet; R² bis R&sup5; gleich oder verschieden sind und Wasserstoff, eine Hydroxylgruppe, eine niedrigmolekulare Alkoxygruppe oder eine niedrigmolekulare Acyloxygruppe bedeuten; Q¹ bis Q³ gleich oder verschieden sind und Wasserstoff, eine Nitro-, Amino-, niedrigmolekulare Acylamino- oder niedrigmolekulare Alkylgruppe bedeuten; und Z¹ Wasserstoff, eine Alkyl-, Hydroxyl-, Alkoxy-, Amino- oder eine Mono- oder Dialkylaminogruppe oder einen α-Aminosäurerest bedeutet, oder Verbindungen gemäß der Formel I, II oder III, in denen die Doppelbindungen teilweise oder vollständig reduziert sind.
Erfindungsgemäße Verbindungen der Formel III können an den Stickstoffatomen im Pyrimidinring eine niedrigmolekulare Alkylgruppe enthalten, wobei dann ein quaternäres Salz gebildet wird.
Bevorzugte niedrigmolekulare Acyl-, niedrigmolekulare Alkyl-, niedrigmolekulare Alkoxy-, niedrigmolekulare Acyloxy- und niedrigmolekulare Acylaminogruppen enthalten 1 bis 5 Kohlenstoffatome.
Bei bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung sind die Verbindungen im wesentlichen rein.
Bei weiteren bevorzugten Ausführungsformen besitzen die Verbindungen die folgenden Strukturen IV bis VI:
Gegenstand der Erfindung ist außerdem eine antitumoraktive, antivirale oder fungicide Zusammensetzung, die als aktiven Bestandteil eine antitumoraktiv, antiviral bzw. fungicid wirksame Menge der Verbindung der Erfindung und ein ungiftiges, pharmazeutisch annehmbares Träger- oder Verdünnungsmittel enthält.
Während wirksame Mengen je nach den Bedingungen, unter denen eine antitumoraktive, antivirale oder fungicide Verbindung angewandt wird, variieren können, liegt die Mindestdosis für eine Antitumoraktivität im allgemeinen zwischen 0,001 und 10 Mikrogramm gegenüber 10&sup5; Tumorzellen. Die wirksame Mindestdosis für eine antivirale Wirkung liegt im allgemeinen zwischen 0,0002 und 20 Mikrogramn gegenüber 25 bis 80 plaquebildende Viruseinheiten. Die Verbindungen gemäß der Erfindung sind zur Inhibierung oder Abtötung eines weiten Bereichs von Viren geeignet, darunter RNA-Viren, Vesicular-Stomatitis-Viren (im folgenden "VSV" genannt), Adeno-, Corona-, Reo- und Influenzaviren sowie das DNA-Virus, und die Viren Herpes Simplex I und II (im folgenden "HSV-I" und "HSV-II" genannt) sowie die Adeno- und Papovaviren. Die wirksame Mindestdosis für die fungicide Aktivität liegt im allgemeinen zwischen 5 und 50 Mikrogramm/ml gegenüber 10³ Fungi/ml, wie beispielsweise Candida albicans. Beispiele für nicht toxische, pharmazeutisch annehmbare Träger oder Verdünnungsmittel sind die folgenden: Ethanol, Dimethylsulfoxid und Glycerin.
Gegenstand der Erfindung ist weiterhin ein Verfahren zur Herstellung der Verbindungen gemäß der Erfindung. Das Verfahren umfaßt die Stufen des Sammelns des Meeresschwammes Theonella sp., des Inkontaktbringens des Meeresschwammes mit einem geeigneten organischen Lösungsmittelsystem, um einen Extrakt zu gewinnen, des Fraktionierens des Extrakts und der Isolierung der Verbindungen gemäß der Erfindung aus dem fraktionierten Extrakt.
Bei bevorzugten Durchführungsformen der Erfindung wird das geeignete organische Lösungsmittelsystem aus der Gruppe von Lösungsmitteln ausgewählt, die aus Ethylacetat, Methanol, Heptan, Hexanen, Isooctan, Aceton, Benzol, Toluol, Diethylether, t-Butylmethylether, Methylenchlorid, Chloroform, Ethanol, Isopropanol, 1,2- Dichlorethan, Dichlormethan und Gemischen daraus besteht. Besonders bevorzugte Lösungsmittel zum Extrahieren sind Ethylacetat und Methanol.
Während die aufgeführten Lösungsmittel die gegenwärtig bevorzugten sind, die sich für die Zwecke der Erfindung eignen, können auch andere geeignete Lösungsmittel verwendet werden. Ein geeignetes Lösungsmittelsystem muß in der Lage sein, die Verbindungen gemäß der Erfindung unter Ausschluß anderer Bestandteile des Schwammes zu extrahieren. Unterschiedliche Verhältnisse von Lösungsmitteln zueinander sowie beliebige Kombinationen können bei dem Lösungsmittelsystem gemäß der Erfindung verwendet werden, wie dem Fachmann bekannt ist.
Verbindungen gemäß der Erfindung werden durch verschiedene Fraktionierungs- und Chromatographietechniken aus den erhaltenen Extrakten isoliert und bzw. oder aus ihnen synthetisiert. Gemäß dem Verfahren der Erfindung kann jede geeignete Fraktionierungs- und Isolierungstechnik, die dem Fachmann bekannt ist, angewandt werden. Bevorzugte Isolierungstechniken sind die verschiedenen Chromatographieverfahren, wie beispielsweise die Säulenchromatographie mit geeigneten stationären Phasen, die dem Fachmann bekannt sind (beispielsweise Polystyrol-NS- Gel), die mit einem geeigneten Lösungsmittel, wie beispielsweise Heptan, Methanol, Dichlormethan, Ethylacetat, einem Hexan, Isooctan, Chloroform, Dichlormethan, 1,2- Dichlorethan, Benezol, Toluol, Isopropanol, n-Butanol, Wasser, Ethanol, Diethylether sowie Gemischen daraus eluiert werden. Besonders bevorzugte Eluiermittel sind Chloroform, Methanol, Wasser und Gemische daraus.
Ein Verfahren zur Inhibierung von Tumoren in einem Wirt besteht daraus, daß man einen Tumor mit einer Antitumorwirkung aufweisenden Menge der Verbindung gemäß der Erfindung in Kontakt bringt. Die Verbindungen gemäß der Erfindung eignen sich zur Inhibierung eines weiten Bereichs von Tumoren, wie P-388-Mäuseleukämie-Zellen, sowie den menschlichen Lungen-, Dickdarm- und Brusttumoren, wie dem Lungenkarzinom A-549, dem Ileocöcal-Adenokarzinom HCT-8 und den menschlichen Brustadenokarzinom-Zellen MDA-MB-231. Die Wirksamkeit der Verbindungen gemäß der Erfindung zur Inhibierung von Tumorzellen und Tumoren zeigt ihre Nützlichkeit zur Bekämpfung von Tumoren in Wirten einschließlich Säugetieren und zur Behandlung von Krebskachexie.
Ein Verfahren zur Inhibierung von Viren in einem Wirt besteht darin, daß man Viren mit einer antiviral wirkenden Menge der Verbindungen gemäß der Erfindung in Kontakt bringt. Die Wirksamkeit der Verbindungen gemäß der Erfindung zum Inhibieren von Viren zeigt ihre Nützlichkeit zur Bekämpfung von Viren und mit Viren verknüpften Krankheiten in Wirten einschließlich Säugetieren und Pflanzen.
Ein Verfahren zur Inhibierung von Pilzen in einem Wirt besteht darin, daß man den Pilz mit einer fungiciden Menge der Verbindungen gemäß der Erfindung in Berührung bringt. Die Wirksamkeit der Verbindungen gemäß der Erfindung zum Inhibieren von Pilzen zeigt ihre Nützlichkeit zur Bekämpfung von Pilzen und mit Pilzen verknüpften Krankheiten in Wirten einschließlich Säugetieren. Außerdem können diese Verbindungen als landwirtschaftliche Fungicide nützlich sein.
Im folgenden wird im einzelnen auf bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung eingegangen, von denen im folgenden Beispiele angegeben sind.

Beispiele

Die Erfindung wird im folgenden an Hand von Beispielen erläutert. Die folgenden Beispiele stellen bevorzugte Ausführungsformen von Verbindungen, Zusammensetzungen, Verfahren und Anwendungsmethoden gemäß der Erfindung dar. Die Ausgangsmaterialien und Reagenzien bei den Beispielen, bei denen Herstellungsverfahren nicht angegeben sind, sind im Handel aus bekannten Quellen, wie beispielsweise Chemikalienhandlungen, erhältlich. Beispiele 1 bis 3 Herstellung von
Eine 7,5 kg (Naßgewicht) schwere Probe eines Schwamms Theonella sp., die auf der Höhe von Onna, Okinawa in 15,2 m (50 Fuß) tiefem Wasser gesammelt worden war, wurde durch zweitätiges Auslaugen in Methanol (8 Liter) extrahiert. Nach Dekantieren des Extraktes wurde das Material in frischem Methanol (8 Liter) in der gleichen Weise ausgelaugt und extrahiert. Der vereinigte Extrakt wurde auf etwa 300 ml wäßrige Suspension konzentriert und danach mit Essigester extrahiert (3 x 300 ml). Die wäßrige Phase wurde zur Trockne eingedampft und mit Methanol (500 ml ) extrahiert, und man erhielt 114 g eines braunen Feststoffs. Ein Teil (100 g) dieses Feststoffes wurde auf eine mit Polystyrolgel (NS-Gel) beschickte Säule gegeben und zunächst mit Wasser und anschließend mit Methanol eluiert. Das methanolische Eluat (19,77 g) wurde an Silicagel aufgetrennt, indem man zu Anfang mit Chloroform/Methanol (3:1) und anschließend mit steigenden Anteilen an Methanol eluierte. Die Fraktionen, die mit 2:1 bis 1:1 des Chloroform/Methanol-Gemisches eluiert worden waren, wurden gesammelt (insgesamt 4,32 g) und zwischen der Ober- und Unterphase eines Systems aus Chloroform/Methanol/Wasser von 13:7:8 aufgeteilt. Die Unterphase (1,79 g) wurde wiederholt durch Gegenstromchromatographie aufgetrennt, wobei man als mobile Phase (Oberphase) ein System aus 1,2-Dichlorethan/Chloroform/Methanol/Wasser im Verhältnis 2:3:10:6 anwandte, und man erhielt 470 mg Onnamid (1) in Form eines hellgelben Glases α 20D = +99,1º (c 5.5, Methanol).
Onnamid A(1) wies die folgenden Spektraldaten auf:
Hochauflösendes Massenspektrum (FABMS): m/z 794.4557 (berechnet für C&sub3;&sub9;H&sub6;&sub4;N&sub5;O&sub1;&sub2; (M + H):794.4551);
UV-Spektrum (Methanol) λ max202 (&epsi; 7500) und 299 nm (38800);
IR-Spektrum (KBr) 3360 br, 2965, 2935, 1650 br, 1950 br, 1512 br,1450 br, 1391, 1320 br, 1305 scharf, 1265,1226,1194, 1170, 1130 scharf, 1092, 1071, 1030, 1008, 910, 880 und 788 cm&supmin;¹; ¹H NMR (CD&sub3;OD) δ7.13 (1H, dd, J=15.0, 11.2 Hz), 6.50 (1H, dd, J=14.8, 10.7 Hz), 6.23 (1H, dd, J=14.7, 11.3 Hz), 6.19 (1H, dd, J=14.7, 10.8 Hz), 6.07 (1H, d, J=15.1 Hz), 5.93 (1H, dt, J=15.2, 6.9 Hz), 5.79 (1H, d, J=9.2 Hz), 5.48 (1H, d, J=6.9 Hz), 4.80 (1H, d, J=6.9 Hz), 4.79 (1H, br s), 4.63 (1H, br s), 4.36 (1H, dd, J=7.9, 5.3 Hz), 4.23 (1H, s), 4.16 (1H, dd, J=9.7, 6.5 Hz), 3.98 (1H, dd, J=9.0, 6.6 Hz), 3.87 (1H, dq, J=2.4, 6.5 Hz), 3.64 (1H, m), 3.62 (1H, d, J=9.6 Hz), 3.55 (3H, s), 3.47 (1H, dd, J=8.1, 3.6 Hz), 3.22 (3H, s), 3.19 (2H, m), 2.40 (1H, br d, J=14.3 Hz), 2.32 (1H, br d, J=14.4 Hz), 2.25-2.05 (3H, m), 1.89 (1H, m), 1.75 (1H, m), 1.63 (2H, m), 1.62-1.37 (5H, m), 1.28 (1H, m), 1.17 (3H, d, J=6.5 Hz), 1.00 (3H, s), 0.96 (3H, d, J=6.9 Hz), and 0.85 (3H, s); ¹³C NMR (CD&sub3;OD) δ179.01 (s), 174.27 (s), 168.28 (s), 158.67 (s), 148.14 (s), 141.93 (d), 141.15 (d), 140.42 (d), 131.46 (d), 129.48 (d), 124.37 (d), 110.12 (t), 101.27 (s), 87.58 (t), 80.59 (d), 78.74 (d), 75.48 (d), 74.88 (d), 73.99 (d), 71.03 (d), 70.78 (d x 2), 61.93 (q), 55.62 (d), 48.78 (q), 42.96 (d), 42.17 (s), 42.04 (t), 37.27 (t), 36.84 (t), 34.75 (t), 33.92 (t), 31.18 (t), 26.32 (t), 26.05 (t), 23.67 (q), 18.18 (q), 14.46 (q) und 12.39 (q).

Methylester von Onnamid A(2)

Ein Gemisch aus Onnamid A(1) (18 mg), Jodmethan (1 ml) und Kaliumcarbonat (10 mg) in Aceton (1 ml) wurde unter Rückfluß 2 h lang erhitzt. Nach Filtrieren und Eindampfen wurde das Reaktionsgemisch durch Dünnschichtchromatographie (Silicagel, 3:1 Chloroform/Methanol) aufgetrennt, und man erhielt 6,8 mg(37%) des Methylesters (2) in Form eines hellgelben Glases: ¹H-NMR (CD&sub3;OD) δ7.19 (1H, dd, J=15.0, 11.3 Hz), 6.57 (1H, dd, J=14.8, 11.0 Hz), 6.28 (1H, dd, J=14.9, 11.4 Hz), 6.23 (1H, dd, J=15.3, 10.8 Hz), 6.05 (1H, d, J=15.0 Hz), 5.98 (1H, dt, J=15.1, 8.5 Hz), 5.79 (1H, d, J=9.3 Hz), 5.19 (1H, d, J=6.9 Hz), 4.79 (1H, d, 6.4 Hz), 4.79 (1H, d, J=1.7 Hz), 4.63 (1H, d, J=1.7 Hz), 4.54 (1H, dd, J=8.9, 5.3 Hz), 4.23 (1H, s), 4.16 (1H, dd, J= 9.8, 6.5 Hz), 3.97 (1H, dd, J=9.2, 6.5 Hz), 3.87 (1H, dq, J=2.5, 6.6 Hz), 3.73 (3H, s), 3.64 (1H, m), 3.63 (1H, d, J=9.9 Hz), 3.55 (3H, s), 3.46 (1H, dd, J=8.7, 3.8 Hz), 3.25-3.15 (2H, m), 3.23 (3H, s), 2.40 (1H, br d, J=14.4 Hz), 2.31 (1H, dd, J=14.4, 2.3 Hz), 2.25-2.07 (3H, m), 1.92 (1H, m), 1.75 (1H, m), 1.64 (2H, m), 1.62-1.37 (5H, m), 1.30 (1H, m), 1.17 (3H, d, J=6.5 Hz), 1.00 (3H, s), 0.96 (3H, d, J=6.9 Hz) und 0.85 (3H, s); ¹³C NMR (CD&sub3;OD) δ174.33 (s), 173.71 (s), 168.99 (s), 158.65 (s), 148.23 (s), 143.15 (d), 142.01 (d), 141.09 (d), 131.40 (d), 129.15 (d), 122.96 (d), 110.04 (t), 101.30 (s), 87.63 (t), 80.62 (d), 78.75 (d), 75.56 (d), 74.90 (d), 74.06 (d), 71.04 (d), 70.85 (d x 2), 61.91 (q), 53.16 (d), 52.83 (q), 48.75 (q), 43.03 (d), 42.21 (s), 41.85 (t), 37.27 (t), 36.77 (t), 34.79 (t), 33.92 (t), 29.92 (t), 26.29 (t), 26.00 (t), 23.62 (q), 18.15 (q), 14.41 (q), and 12.36 (q).

Pyrimidinderivat von Onnamid A(3)

Ein Gemisch aus Onnamid A(1) (10 mg), 2,4-Pentandion (0,5 ml) und Pyridin (0,5 ml) wurde in einem zugeschmolzenen Rohr 5 h lang auf 95 ºC erhitzt. Verdampfen eines Überschusses des Reagenzes im Vakuum ergab 11 mg (100%) des Pyrimidinderivats (3) in Form eines hellgelben Glases: UV-Spektrum:(MeOH) λmax 202 (&epsi;22800), 239 (19100) und 299 nm (41200): ¹H-NMR (CD&sub3;OD); δ 7.17 (1H, dd, J=14.9, 11.2 Hz), 6.55 (1H, dd, J=14.7, 10.7 Hz), 6.39 (1H, s), 6.26 (1H, dd, J=15.1, 11.5 Hz), 6.22 (1H, dd, J=15.1, 10.6 Hz), 6.04 (1H, d, J=15.1 Hz), 5.96 (1H, dt, J=14.2, 6.9 Hz), 5.80 (1H, d, J=9.3 Hz), 5.20 (1H, d, J=6.8 Hz), 4.79 (1H, br s), 4.78 (1H, d, J=6.6 Hz), 4.63 (1H, br s), 4.49 (1H, dd, J=8.3, 4.3 Hz), 4.22 (1H, s), 4.16 (1H, dd, J=9.9, 6.6 Hz), 3.98 (1H, dd, J=9.3, 6.6 Hz), 3.87 (1H, dq, J=2.6, 6.4 Hz), 3.65 (1H, m), 3.64 (1H, d, J=9.7 Hz), 3.55 (3H, s), 3.46 (1H, dd, J=8.5, 4.5 Hz), 3.41 (2H, t, J=6.6 Hz), 3.23 (3H, s), 2.40 (1H, br d, J=14.3 Hz), 2.32 (1H, br d, J=14.4 Hz), 2.26 (6H, s), 2.25-2.05 (3H, m), 1.94 (1H, m), 1.76 (1H, m), 1.69 (2H, m), 1.60-1.40 (5H, m), 1.28 (1H, m), 1.17 (3H, d, J=6.6 Hz), 1.00 (3H, s), 0.95 (3H, d, J=7.0 Hz) und 0.85 (3H, s); ¹³C NMR (CD&sub3;OD) δ176.67 (s), 174.18 (s), 168,99 (s x 2), 168.59 (s), 162.21 (s), 148.12 (s), 142.41 (d), 141.43 (d), 140.63 (d), 131.39 (d), 129.33 (d), 123.69 (d), 110.20 (d), 110.09 (t), 101.23 (s), 87.57 (t), 80.50 (d), 78.72 (d), 75.50 (d), 74.81 (d); 74.03 (d), 71.02 (d x 2), 70.75 (d), 61.93 (q), 54.25 (d), 48.76 (q), 42.92 (d), 42.19 (s), 41.62 (t), 37.22 (t), 36.78 (t), 34.77 (t), 33.87 (t), 30.41 (t), 26.98 (t), 25.99 (t), 23.59 (q), 23.43 (q x 2), 18.15 (q), 14.34 (q) und 12.36 (q).

Antitumorwirkungen der Verbindungen gemäß der Erfindung

Die folgenden Bestimmungsmethoden wurden angewandt, um die Antitumorwirksamkeit der Verbindung gemäß der Erfindung zu erläutern.

P388-Mäuseleukämie-Zellen-Test

Aufrechterhaltung der Zell-Linie

P388-Mäuseleukämie-Zellen werden in Dulbecco-MEM- Medium mit 10% Pferdeserum, 4 mM Glutamin und 20 ug/ml Gentamycin (Biologos, Inc.) gezüchtet. Die Zellen werden in 10% CO&sub2; bebrütet und zweimal je Woche subkultiviert.

Verfahren

1. Einbringen der Verbindungen in jede Vertiefung einer Platte mit 24 Vertiefungen oder in jedes Röhrchen und Verdampfenlassen des Lösungsmittels zur Trockene.
2. Hinzufügen von 2 ml (1,2 x 10&sup5;) Zellen in jede Vertiefung oder in jedes Röhrchen und Vermischen.
3. Bebrüten in 10% CO&sub2; 48 h lang bei 37 ºC.
4. Auswerten der Platten mit einem umgekehrten Mikroskop, wobei Aktivitäten von 1+ bis 4+ wie folgt bewertet werden: ND (nicht erfaßbar) > 90%; 1+ 75 bis 90%; 2+ 50 bis 74%; 3+ 25 bis 49%; 4+ < 25% des Vergleichswachstums.
Für jedes Röhrchen werden Zellauszählungen durchgeführt und die Ergebnisse in Prozent der Vergleichsprobe angegeben. IC&sub5;&sub0; ist die Konzentration der Verbindung, die erforderlich ist, um das Zellwachstum zu 50% zu inhibieren.
Die Ergebnisse des obigen Tests sind in der Tabelle 1 zusammengefaßt.

Antivirale Wirkungen der Zusammensetzungen gemäß der Erfindung

Die folgende Testmethode wurde angewandt, um die antivirale In-vitro-Wirksamkeit der Verbindungen gemäß der Erfindung zu demonstrieren, wie in Tabelle 2 angegeben.

Antiviraler Test für den Mäuse-Coronavirus A-59

A. ZELLKULTUR: NCTC-Klone 1469, ein Derivat der Mäuseleber

B. AUFRECHTERHALTUNG DER ZELLKULTUR

1. Trypsinisierung

a. Aseptisches Entfernen des Mediums.
b. Spülen der Zellschicht mit 10 ml Ca&spplus;&spplus;- und Mg&spplus;&spplus;- freier, phosphatgepufferter Kochsalzlösung.
c. Einbringen von 4 ml eines Gemisches aus Trypsin und EDTA in einen 150-cm²-Kolben.
d. Einminütiges oder kürzeres Stehenlassen und anschließendes Schütteln des Kolbens.
e. Zusatz von 10 ml Wachstumsmedium und Aufbrechen der Zellklumpen unter Pipettieren.
f. Auszählung der Zellen.

2. Subkulturen zur Aufrechterhaltung der Zellen für die Tests

a. Beimpfen von 150-cm²-Gewebekulturkolben mit 10 x 10&sup6; Zellen in 40 ml Kulturmedium.
b. Zweimal je Woche Anlegen von Subkulturen.

C. VIRUS

Mäusehepatitisvirus, Stamm MHV-A59, als Coronavirus klassifiziert.

D. HERSTELLUNG VON PLATTEN FÜR VIRALE TESTS

1. Zellkonzentration

a. Verdünnen der Zellen mit Wachstumsmedium zwischen 5 x 10&sup5; und 7,5 x 10&sup5; Zellen je ml.
b. Beimpfen von 24 Vertiefungsblechen mit 1,0 ml je Vertiefung.

E. VIRALER TEST

1. Verdünnen des Wirkstoffs oder des Extraktes für den Test in dem geeigneten Lösungsmittel.
2. Anbringen von 20 Lambda in ein 12 x 75 mm großes Glasröhrchen zur Herstellung einer 16-mm-Testvertiefung.
3. Verdampfenlassen des Lösungsmittels unter einer Haube mit laminarer Strömung.
4. Verdünnung des MHV-A59 in Dulbecco'scher phosphatgepufferter Kochsalzlösung mit Ca&spplus;&spplus; und Mg&spplus;&spplus; bis zur geeigneten, für die gerade in Behandlung befindliche Probennummer vorherbestimmten Verdünnung. Die Verdünnung des Virus in einer Titrierung, die innerhalb von 24 h einen Wert von 3+ bis 4+ CPE ergibt, wird bei diesem Test angewandt.
5. Entfernung des Mediums aus den Vertiefungen der Platten, die NCTC-1469-Zellen enthalten, die 24 h zuvor aufgeimpft worden waren.
6. Zusatz von 200 Lambda des verdünnten Virus zu jeder Testvertiefung. Zusatz von PBS zu Vergleichsvertiefungen.
7. Bebrütung der Zellen und des Virus bei 37 ºC während 1 h.
8. Am Ende der Bebrütungsperiode Abgießen der überstehenden Flüssigkeit.
9. Zusatz von 10 Lambda Dimethylsulfoxid (DMSO) zu jedem Glasröhrchen.
10. Zusatz von 1 ml des Erhaltungsmediums zu jedem Glasröhrchen.
11. Eingießen des Inhalts des Glasröhrchens in die entsprechende Vertiefung der Gewebskulturplatte.
12. Bebrütung der infizierten Zellen bei 37 ºC und Auswertung am folgenden Tag.
13. Nach 12 h sind die Bereiche der Zellverschmelzung gut erkennbar und können sowohl visuell als auch mikroskopisch erfaßt werden.
14. Nach 24 h ist CPE extensiv und auf den angefärbten Platten der Unterschied zwischen vorhandener und nicht vorhandener Aktivität durch visuelle Prüfung erkennbar.
15. Zum Anfärben der Platten Entfernen des Mediums und Zugabe von 200 Lambda Methylenblau in jede 16-mm-Vertiefung.
16. Belassen des Farbstoffs auf der Zellschicht während 30 min oder länger.
17. Abgießen des Farbstoffes und Waschen der Platten in Leitungswasser, bis das Wasser klar ist.
18. Trocknenlassen der Platten.
19. Auswertung der Wirkstoffaktivität.
a. Auswertung der Cytotoxizität
100% = vollständige Zerstörung der Zellen
75% = partielle Zellzerstörung
50% = partielle Zellzerstörung
25% = partielle Zellzerstörung
0% = keine Cytotoxizität
b. Die antivirale Aktivität wird von 0 bis +++ bewertet.
+++ = vollständige Inhibierung von cytopathischen Effekten und Zellfusion
++ = partielle Inhibierung
+ = partielle Inhibierung
+/- = partielle Inhibierung
0 = kein Schutz

F. MEDIEN

1. Wachstumsmedium für die NCTC-1469-Zell-Linie

Medium NCTC 135 (GIBCO-Katalog 320-1350)
10% Pferdeserum
2% 200 mM 1-Glutamin
1% nichtessentielle Aminosäuren (NEAA) (100X)
1% Natriumpyrovat (110 mg/Liter) (100X)
Gentamicin 10 mg/ml (Verwendung 50 ug/ml) oder 0,5 ml/100
50 mg/ml (Verwendung 50 ug/ml) oder 0,1 ml/100

2. Aufrechterhaltungsmedium für den viralen Test

Modifiziertes Dulbeccos'sches Adlermedium jeweils 4500 mg/Liter Glucose
GIBCO-Katalog 320-1965
5% fötales Rinderserum (FBS)
2% 200 mM 1-Glutamin
1% nichtessentielle Aminosäuren (NEAA) (100X)
1%iges Natriumpyruvat (110 mg/Liter) (100X)
Gentamicin (Verwendung 50 ug/ml)

3. Trypsin

GIBCO-Katalog 610-5405 Trypsin-EDTA (10X)
5,0 g Trypsin (1:250) und 2,0 g EDTA/Liter
Herstellung von 1X-Lösung in phosphatgepufferter Dulbecco'scher Salzlösung, die frei von Ca&spplus;&spplus; und Mg&spplus;&spplus; ist. Zusatz von 1,1 g Glucose je Liter.

4. Anfärbung

Methylenblau (mit Zertifikat)
Sigma Nr. M 9140
50% Ethanol:Wasser
5 g Methylenblau/Liter

Antiviraler Scheibentest auf VSV and HSV-1

A. Aufrechterhaltung der Zellkulturen

1. Virus

a. Replikation von sowohl Herpes-Simplex-Virus Typ 1 (HSV-1) als auch Vesicular-Stomatitis-Virus (VSV) in der Zell-Linie CV-1. CV-1 ist eine fibroblastenartige Zellkultur, die von primären Zellen des afrikanischen grünen Affen abgeleitet ist.

2. Wachsenlassen der CV-1-Zellen

a. Beimpfen von 150-cm²-Gewebekulturkolben jeweils mit 10 x 10&sup6; CV-1-Zellen in 40 ml EMEM mit 10% FBS (Wachstumsmedium).
b. Sieben Tage nach dem Beimpfen der Kolben muß die Anzahl der Zellen etwa 40 bis 50 x 10&sup6; betragen. CV-1-Zellen besitzen eine Verdopplungszeit von 72 h, bezogen auf diese Zahlen.

3. Trypsinisierung

a. Aseptische Entfernung des Mediums.
b. Spülen der Zellschicht mit 10 ml Ca&spplus;&spplus;- und Mg&spplus;&spplus;freier, phosphatgepufferter Dulbecco'scher Kochsalzlösung oder Pucks-G-Kochsalzlösung mindestens zweimal.
c. Zusatz von 4,0 ml Trypsin/EDTA-Gemisch.
d. Inkubierung des Kolbens bei Raumtemperatur unter gelegentlichem Stoßen, bis sich die Zellen von dem Kolben ablösen (etwa 5 min).
e. Schütteln des Kolbens.
f. Zusatz von 10 ml EMEM-Wachstumsmedium und Aufbrechen der Zellklumpen unter Pipettieren.
g. Auszählung der Zellen.

B. Herstellung von Platten für virale Tests

1. Zellkonzentration

a. Verdünnung der Zellen mit EMEM auf 4 x 10&sup5; Zellen/ml.
b. Beimpfen von Tabletts mit 24 Vertiefungen mit 0,5 ml/Vertiefung. Zellkonzentration je Vertiefung: 2 x 10&sup5; Zellen.
c. Bebrüten mit 5% CO&sub2; bei 37 ºC.
d. Die Füllungen der Vertiefungen können während der nächsten Tage, beginnend mit dem Tag nach dem Beimpfen, (vorzugsweise am Tag 2, 3 oder 4) verwendet werden.

C. Bestimmung von HSV-1 und VSV in CV-1-Zellen

1. Infektion von CV-1-Zellen in Platten mit dem Virus.

a. Entfernung des Mediums von den Vertiefungen.
b. Infizieren der Vertiefungen mit mindestens 25 und nicht mehr als 80 plaquebildenden Einheiten (PVU) des Virus.
c. Bebrüten der infizierten Zellen 1,0 h bei 37 ºC.
d. Am Ende der Inkubationszeit Abgießen der überstehenden Flüssigkeit.
e. Zusatz von 0,5 ml Auflagemedium aus Methylcellulose (MCO, Aufrechterhaltungsmedium ohne Phenolrot, hergestellt mit 1%iger Methylcellulose von 4000 cps. FBS wird in 5%iger Konzentration verwendet).

2. Bewertung des Wirkstoffs

a. Zur Bewertung des Wirkstoffs werden Filterpapierscheiben (6 mm Durchmesser) mit etwa 0,02 ml Meerwasserextrakt der Testverbindung durchfeuchtet.
1) 20 bis 30 min Verdampfenlassen des Lösungsmittels bei Raumtemperatur.
2) Einbringen der Scheiben in die Vertiefung, die CV-1-Zellen, Virus und MCO enthält.
b. Bebrüten der Gewebskulturplatten über 48 h bei 37 ºC.
c. Nach 48 h Aufbringen von 0,5 ml NRMCO auf jede Vertiefung. NRMCO ist ein Aufrechterhaltungs- Auflagemedium ohne Phenolrot, das 0,1 mg Neutralrotfarbstoff je ml und 2% Methylcellulose von 15 cps enthält.
d. Bebrüten der Platten bei 37 ºC und Bewerten am nächsten Tag. Die antivirale Aktivität muß aufgrund zweier Parameter beobachtet werden. Der eine ist die tatsächliche Verringerung der Zahl der Plaques und der zweite die Verringerung des Plaque-Durchmessers.

3. Bewertung der Aktivität des Wirkstoffs

a. Die antivirale Aktivität wird von 0 bis +++ bewertet.
+++ = vollständige Inhibierung der Plaque-Bildung
++ = partielle Inhibierung
+ = partielle Inhibierung
+/- = partielle Inhibierung
0 = kein Schutz.

b. Cytotoxizität

Die Vertiefungen von Gewebskulturplatten mit 24 Vertiefungen besitzen einen Durchmesser von 16 mm. Die Scheiben haben einen Durchmesser von 6 mm. Zonen der Cytotoxizität von über 6 mm werden von 8 bis 16 bewertet, wobei man lediglich gerade Zahlen verwendet.
0 = keine visuell oder mikroskopisch beobachtbare Cytotoxizität.
16 = vollständige Zerstörung der Zellen
8, 10, 12, 14 = partielle Cytotoxizität

FUNGICIDE AKTIVITÄT DER VERBINDUNGEN GEMÄSS DER ERFINDUNG

Die folgende Testmethode wurde angewandt, um die fungicide In-vitro-Wirksamkeit der Verbindungen gemäß der Erfindung zu zeigen, wie in Tabelle 3 dargestellt.

Herstellung des Inoculums

Candida albicans:

C. albicans (Ca) wird auf Sabouraud- Dextroseagar gezüchtet, und man erhält Einzelkolonien, von denen eine zur Beimpfung von Sabouraud-Dextrosebrühe verwendet wird. Die Nährlösung wird 18 h lang bei 37 ºC unter Schütteln mit 200 Upm bebrütet, und die erhaltene Kultur wird mit 10% (Volumen/Volumen) Glycerin bei -80 ºC eingefroren und als Inokulum für den Anti-Candida- Test verwendet.

Testprotokolle

1. Scheiben-Diffusionstest

C. Albicans wird auf geschmolzenen Sabouraud-Dextroseagar bei 45 ºC aufgeimpft, so daß sich eine Zelldichte von etwa 1000 Zellen/ml ergibt. Es werden Platten mit 10 ml des beimpften Agars in einer 10 x 10 cm großen Petrischale hergestellt. Diese Platten werden bei 4 ºC aufbewahrt, bis sie für den Test benötigt werden.
Papierscheiben (6,35 mm) werden mit der Testsubstanz imprägniert und trocknen gelassen. Danach werden sie auf die Oberfläche einer Testplatte gelegt, die, wie oben beschrieben, hergestellt worden ist. Die Platten werden über Nacht bei 37 ºC bebrütet, wonach die Zonen der Wachstumsinhibierung erkannt werden können. Diese werden in Form des Durchmessers der Zone in Millimeter ausgedrückt.

2. Inhibierende Mindestkonzentration (MIC)

Zweifache Verdünnungen für den Wirkstoff werden in 50-ul- Volumina von Sabouraud-Dextrosenährlösung unter Verwendung von Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen hergestellt. Ein Inokulum von Candida Albicans wird in einem kleinen Volumen zugesetzt, so daß sich eine Zelldichte von etwa 1000 Zellen/ml ergibt. Die Platten werden bei 37 ºC über Nacht bebrütet. Danach werden 10 ul Triphenyltetrazoliumchlorid (1% Gewicht/Volumen) in jede Vertiefung hinzugegeben; weitere 2 h Bebrüten ergibt eine tiefe Färbung des Mikroorganismus. Die MIC ist die niedrigste Konzentration des Wirkstoffs, die ein vollständig inhibiertes Wachstum bewirkt. Tabelle 1 Antitumor-Aktivität gegenüber Mäuse-P388: Zusammensetzung Onnamid A(1) Methylester (2) Pyrimidinderivat (3) Tabelle 2 Antivirale Aktivität Verbindung Dosis (ug) Probe(Vertiefg.) Onnamid A (1) Methylester (2) Pyrimidderivat (3) CYT = Cytotoxizität AV = Antivirale Wirksamkeit Tabelle 3 Fungicide Aktivität gegenüber Candida albicans: Verbindung Onnamid A(1) Methylester (2) Pyrimidinderivat (3)
Die obigen Daten geben die In-vitro-Aktivität wieder, wie sie für die Verbindungen gemäß der Erfindung für die Inhibierung verschiedener Tumorzellen, Viren und Pilze bestimmt worden ist. Die obigen Ergebnisse zeigen, daß, wie der Fachmann daraus erkennt, die Verbindungen gemäß der Erfindung zur Inhibierung von Tumoren, Viren und Pilzen in Wirtsorganismen sowie zur Inhibierung von dadurch verursachten Krankheiten geeignet sind.
Der Umfang der vorliegenden Erfindung ist nicht durch die Beschreibung, die Beispiele und die darin angegebenen Verwendungszwecke beschränkt, sondern es können Modifikationen vorgenommen werden, ohne daß vom Erfindungsgedanken abgewichen wird. Die beschriebenen Zusammensetzungen können auch andere wertvolle Verwendungen besitzen, wie beispielsweise als Analgetica. Die therapeutische Anwendung der Zusammensetzungen gemäß der Erfindung kann durch jede geeignete therapeutische Methode und Technik erfolgen, wie sie zur Zeit oder vermutlich in Zukunft der Fachwelt bekannt ist bzw. sein wird. Außerdem können die Zusammensetzungen gemäß der Erfindung als Ausgangsmaterialien oder Zwischenprodukte für die Herstellung weiterer wertvoller Verbindungen verwendet werden.

Claims

1. Verbindung gemäß Formel I, II oder III, Formel I Formeln II, III

worin:

Z=Z¹ Formel II

oder Formel III

und worin X¹ bis X&sup4; gleich oder verschieden sind und Wasserstoff, eine Hydroxylgruppe, eine niedrigmolekulare Acylgruppe oder eine niedrigmolekulare Alkylgruppe bedeuten, X&sup5; und X&sup6; gleich oder verschieden sind und Wasserstoff oder eine niedrigmolekulare Alkylgruppe bedeuten, R¹ Wasserstoff oder eine Hydroxyl-, niedrigmolekulare Alkyl- oder niedrigmolekulare Alkoxygruppe bedeutet; R² bis R&sup5; gleich oder verschieden sind und Wasserstoff, oder eine Hydroxyl-, niedrigmolekulare Alkoxy- oder niedrigmolekulare Acyloxygruppe bedeuten; Q¹ bis Q³ gleich oder verschieden sind und Wasserstoff, eine Nitro-, Amino-, niedrigmolekulare Acylamino- oder niedrigmolekulare Alkylgruppe bedeuten; und Z¹ Wasserstoff, eine Alkyl-, Hydroxyl-, Alkoxy-, Anino- oder Mono- oder Dialkylaminogruppe oder einen α-Aminosäurerest bedeutet, oder Verbindungen gemäß der Formel I, II oder III, in denen die Doppelbindungen teilweise oder völlig reduziert sind.

2. Verbindung gemäß Anspruch 1 der Formel:

3. Verbindung gemäß Anspruch 1 oder 2, worin mindestens eine Doppelbindung reduziert ist.

4. Antitumoraktive Zusammensetzung, die als aktiven Bestandteil eine wirksame antitumoraktive Menge einer Verbindung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3 sowie eine nicht toxische, pharmazeutisch annehmbare Träger- oder Verdünnungssubstanz enthält.

5. Antivirale Zusammensetzung, die als aktiven Bestandteil eine wirksame antivirale Menge einer Verbindung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3 sowie eine nicht toxische, pharmazeutisch annehmbare Träger- oder Verdünnungssubstanz enthält.

6. Fungizide Zusammensetzung, die als aktiven Bestandteil eine wirksame fungizide Menge einer Verbindung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3 sowie eine nicht toxische, pharmazeutisch annehmbare Träger- oder Verdünnungssubstanz enthält.

7. Verfahren zur Herstellung einer Verbindung gemäß Anspruch 1, wobei man

die Meeresschwammgattung Theonella sp. sammelt,

den Schwamm mit einem geeigneten organischen Lösungsmittelsystem in Berührung bringt,

einen Lösungsmittelextrakt des Schwamms erhält, den Extrakt fraktioniert, und

eine Verbindung gemäß Anspruch 1 aus dem fraktionierten Extrakt isoliert.

8. Verfahren gemäß Anspruch 7, bei dem das Lösungsmittelsystem aus Methanol, Ethylacetat, Heptan, Hexanen, Isooctan, Aceton, Ethanol, Isopropanol, n-butanol, Toluol, Benzol, Diethylether, t-butylmethylether, Chloroform, 1,2-Dichlorethan, Dichlormethan, Wasser oder einer Kombination der genannten Stoffe besteht.

9. Verfahren gemäß Anspruch 7 oder 8, wobei der Lösungsmittelextrakt durch Gegenstromchromatographie fraktioniert und isoliert wird, wobei man als Elutionsmittel Heptan, Hexane, Isooctan,Chloroform, Dichlormethan, 1,2-Dichlorethan, Benzol, Toluol, Isopropanol, Diethylether, Methanol, Ethanol, Acetonitril, Wasser, Butanol oder Kombinationen aus diesen Stoffen verwendet.