WO2008016186A1 - Anticorps spécifique dirigé contre l'autotaxine humaine intacte, procédé de criblage dudit anticorps et procédé et réactif destinés à l'examen d'un lymphome malin par une analyse de l'autotaxine - Google Patents

Anticorps spécifique dirigé contre l'autotaxine humaine intacte, procédé de criblage dudit anticorps et procédé et réactif destinés à l'examen d'un lymphome malin par une analyse de l'autotaxine Download PDF

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autotaxin
human
measurement
concentration
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Junken Aoki
Hiroyuki Arai
Yutaka Yatomi
Hitoshi Ikeda
Kazuhiro Nakamura
Koji Igarashi
Kazufumi Ide
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The University Of Tokyo
Tosoh Corporation
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Definitions

  • the present invention relates to an antibody that specifically recognizes and binds natural form of human autotaxin, a screening method thereof, and a method and a test for malignant lymphoma by measuring the concentration of autoxin in a human specimen.
  • a screening method thereof a method and a test for malignant lymphoma by measuring the concentration of autoxin in a human specimen.
  • an enzyme having lysophosphlipase D activity different from autotaxin is expected in human samples, and lysophosphatidic acid and collagen produced by degradation of lysophosphatidylcholine substrate in enzyme activity measurement.
  • enzyme activity measurement There are some interfering factors such as the presence of a human in the human specimen. These endogenous factors in enzyme activity measurement have a considerable impact on the specific quantification of human autotaxin, and are not accurate methods for the determination of human autotaxin.
  • human seminal plasma contains several tens of mM of colline, so there is no pretreatment for colline removal. Therefore, it is difficult to measure seminal plasma activity using the amount of lysine produced using lysophosphatidylcholine as a substrate.
  • a number of monoclonal antibodies have been established by immunization with soluble human toxins in which partial peptides and partial sequences are expressed in E. coli by several groups including us (Journalof Biological) C hemistry 2 6 9, 3 0 4 7 9— 3 0 4 8 4, 1 9 94, FEBS letter 5 7 1, 1 9 7-2 0 4, 2 0 0 4).
  • these antibodies can be used to detect human autotaxin by Western blotting, but these antibodies are not reactive with the natural form of human taxin in human samples. Not shown or very low reactivity. Therefore, it is very difficult to apply to an immunological measurement method such as an ELISA measurement method for human specimens, and it has not been put into practical use.
  • a monoclonal antibody that specifically reacts with a natural form of human autotaxin in a human specimen can be established very efficiently.
  • an antibody is selected based on the reactivity with the natural antigen present in the solution as an index. It is possible to establish a typical human autotaxin quantitative measurement system.
  • the antibody obtained by this method is a high-performance antibody capable of purifying antigen as well as removing antigen from a sample because it can efficiently bind and capture human taxin contained in blood and the like.
  • Autotaxin has various concentrations in human tissues or body fluids. There have been reports suggesting that it varies depending on the disease, but no detailed analysis has been conducted since there is no quantitative method. Qualitative analysis of the presence and ratio of autotaxin under denaturing conditions such as the presence of a reducing agent has been made, but the natural form of human autotaxin that normally exists in the body while maintaining its structure and function. As a result, there was no antibody that can recognize and bind efficiently. In addition, using the lysophospholipase D activity of autotaxin as an index, the causal relationship between changes in lysophoslipase D activity and disease has been analyzed by enzyme activity measurement.
  • measurement values including D activity can be obtained, lysophosphatidylcholine substrate used for activity measurement, and activity measurement Because the resulting collagen is inherently contained in the sample, etc., it is not sufficiently reliable as a true autotaxin specific quantification method.
  • Measurement method capable of accurately quantitating human autotaxin without the need for pretreatment such as reduction treatment, denaturation with protein denaturants such as guanidine hydrochloride, urea, etc. Succeeded in providing quantitative reagents.
  • this application includes the following inventions:
  • a screening method for an antibody that specifically recognizes a natural form of human autotaxin that is present in a living body without being denatured comprising the following steps:
  • a monoclonal antibody capable of specifically recognizing and binding the natural form of human autotaxin can be efficiently obtained, and the autotaxin in a human sample using this antibody is pretreated. It is possible to construct a measurement method that can be quantified without need. Cancer can be diagnosed or chronic liver disease can be diagnosed by measuring human serum using the natural form human autotaxin measuring reagent obtained by the above invention. In addition, according to the above method, human taxin can be quantified in a short time without being affected by endogenous measurement interference factors and competitive enzymes, which were problems in the estimation of the amount of autotaxin due to lysophosphlipase D enzyme activity. Possible methods and reagents can be provided.
  • the present inventor can easily and easily use a general-purpose human autotaxin quantitative measurement system such as an ELISA method using a monoclonal antibody that specifically reacts with a human form of human autotaxin in a human specimen. It was found that it is possible to quantify human taxin contained in blood in a short time. After extensive studies using this measurement system, patients with lymphomas, especially cystic lymphomas, were found. It was revealed that the serum autotaxin concentration was high. There are two main types of malignant lymphoma: Hodgkin lymphoma and non-Hodgkin lymphoma. In Japan, about 90% are classified as non-Hodgkin lymphoma.
  • Non-Hodgkin's lymphomas are classified based on morphological characteristics (pathological classification), cell system qualitative characteristics ("B-cell, T-cell, NK-cell”), chromosomes, and genetic information. There are very various classifications, and one class of follicular lymphoma has been reported in Japan as 10 to 15% of malignant lymphomas, which is increasing year by year. Diagnosis of malignant lymphoma includes lymph node biopsy, chest X-ray examination, computed tomography (CT), nuclear magnetic resonance examination (MRI), gallium (Ga) scintigraphy, positrontron Examination of the degree of disease progression, such as by 'tomography' tomography (PET).
  • CT computed tomography
  • MRI nuclear magnetic resonance examination
  • Ga gallium
  • PET positrontrontron Examination of the degree of disease progression, such as by 'tomography' tomography
  • Blood tests include lactate dehydrogenase (LDH), C-reactive protein (CRP), and soluble interleukin-2 (IL-2) receptor, all of which are specific for a host lymphoma.
  • LDH lactate dehydrogenase
  • CRP C-reactive protein
  • IL-2 soluble interleukin-2
  • the present inventor has performed an immunochemical reaction using an antibody against human toxin.
  • an antibody against human toxin By constructing a measurement method, it was possible to accurately quantify human taxin without being affected by the endogenous substances that cause problems during activity measurement and without requiring pretreatment of the sample.
  • serum autotaxin concentration was high in patients with malignant lymphoma, especially follicular lymphoma, and we examined or assisted follicular lymphoma. It is now possible to provide test reagents that can be used.
  • follicular lymphoma can be examined or assisted by measuring the activity of lysophos lipase D enzyme possessed by autotaxin.
  • the autotaxin of (1 1) is a full-length autotaxin, a partially cleaved autotaxin, or an autotaxin partially mutated ( 1 Inspection method of 1) or (1 2).
  • the specimen of (11) is a human blood component such as whole blood, blood cells, serum, or plasma, or a human cell or tissue extract (11) to (1 3) The inspection method described in any one of the above.
  • the antibody of (15) is a monoclonal antibody.
  • the autotaxin concentration in the specimen is measured by contacting the antibody of (15) with the specimen and detecting the antibody that has not bound or bound to the specimen (11) To (16) The inspection method according to any one of (1) to (6).
  • the autotaxin concentration in the sample is measured by contacting the antibody of (14) with the sample and detecting autotaxin that has not bound or bound to the antibody (1
  • the method described in any one of (15) to (18) is a method using a competitive method using enzyme labeling, isotope labeling, fluorescent labeling, homogeneity using a sandwich method or a fluorescence polarization method.
  • the inspection method according to any one of (11) to (18), wherein the measurement method is binding measurement using surface plasmon resonance analysis.
  • the method described in any one of (1 1) to (14) is a measurement of lysophosphlipase D activity possessed by autotaxin, and this value is compared to a normal value consisting of a healthy subject measurement value.
  • (2 2) A method for examining lymphoma by measuring autotaxin in a test sample for malignant lymphoma characterized by the measurement method of (2 1).
  • malignancy is achieved by quantifying the autotaxin concentration in a human specimen using a quantitative reagent using a human autotaxin-specific monoclonal antibody without the need for pretreatment of the autotaxin in the human specimen.
  • Lymphomas especially follicular lymphomas, can be examined.
  • Book By using an immunoassay reagent, it is possible to provide a test drug that can quantify autoxin in a short time without being affected by endogenous measurement interference factors or competing enzymes contained in the sample. Is possible.
  • it is possible to determine malignant lymphoma although the immunochemical quantification method is complicated and inferior in accuracy even by measuring lysophosphlipase D enzyme activity. is there. Brief Description of Drawings
  • Figure 1 shows the results of Western blotting using SDS-PAGE purified polyhistidine-tag labeled human autotaxin and anti-autotaxin peptide antibody.
  • Figure 2 shows the reactivity of the antibody when human taxin is directly bound to the immunoplate.
  • Figure 3 shows the reactivity with the anti-human autoxin antibody present in the solution of anti-human autotaxin antibody conjugated to the immunoplate via the anti-lat IgG antibody.
  • Figure 4 shows the ability of antibodies to absorb lysophos lipase D activity of serum human autotaxin.
  • Fig. 5 shows the ability of antibodies to absorb lysophosphine lipase D activity of autotaxin in animal serum.
  • Fig. 6 shows the results of Western plotting using SDS-PAGE and the anti-autotaxin peptide antibody of purified full-length human toxin.
  • Figure 7 shows the reactivity with human autotaxin by the two-antibody sandwich method using an anti-human autotaxin monoclonal antibody.
  • Fig. 8 shows the reactivity in the Sandwich ELISA measurement system by combination evaluation using the obtained anti-human autotaxin antibody group.
  • Fig. 9 shows a 6 antibody concentration (0, 0.34, 0.667, 1.55, 2.70, 5.40 g / m2) using a 2-antibody 2-step sandwich ELISA method.
  • L) is a graph showing the relationship between phototaxin concentration and absorbance at 45 O nm when a standard preparation with known concentrations of human taxin is measured.
  • Figure 10 shows 2 antibodies of human serum, 2 antibodies, 2 stepspsins. A correlation between human taxin concentration and lysophosphilipase D activity by Irish ELISA is shown.
  • Fig. 1 1 shows a 2 antibody 1 step sand switch ELISA method with 6 concentrations (0, 0.34, 0.67 5, 1.35, 2.70, 5.40 g Xm L) is a graph showing the relationship between autotaxin concentration and absorbance at 45 O nm when a standard product of known concentration of human taxin is measured.
  • Figure 12 shows the correlation between human autoxin concentration and lysophosphalipase D activity by two-antibody 1-step sandwich ELISA assay in 42 human serum samples.
  • Figure 1 shows the autotaxin for a healthy person using a sample with PSA, CA 1 9-9, CA 15 3 and CA 1 25 measured values exceeding the cut-off using the 2-antibody 1-step sandwich ELISA method. The result of verifying the concentration is shown. In all the sample groups, a significant difference p ⁇ 0.
  • Fig. 14 shows the results of measuring the concentration of human autotaxin in patients with chronic liver disease and healthy individuals using the 2-antibody 1-step sandwich ELISA method.
  • Figure 15 shows the results of measuring lysophospholipase D activity in seminal plasma.
  • Fig. 16 shows the calibration curve when using the 6 concentration standard.
  • Rate indicates the amount of 4-methylumbelliferone produced per unit time (nmo 1 / L ⁇ sec).
  • Figure 17 shows the results of measuring the autotaxin concentration in male serum and categorizing it according to leukemia and malignant lymphoma.
  • the vertical axis shows the autotaxin (ATX) concentration, and the horizontal axis shows the pathological classification.
  • Healthy individuals NH S
  • AL acute leukemia
  • CL chronic leukemia
  • HD Hodgkin lymphoma
  • NH L non-Hodgkinli
  • Other leukemias and others.
  • Figure 18 shows the results of measuring the autotaxin concentration in female sera and categorizing them according to leukemia and malignant lymphoma.
  • the vertical axis shows the autotaxin (ATX) concentration, and the horizontal axis shows the pathological classification.
  • Healthy individuals NH S
  • AL acute leukemia
  • CL chronic leukemia
  • HD Hodgkin lymphoma
  • NH L non-Hodgkinli
  • Other leukemias and others.
  • Figure 19 shows the results of measuring autotaxin concentrations in male serum and categorizing them by non-Hodgkin lympha species.
  • the vertical axis represents autotaxin (AT X) concentration, and the horizontal axis represents each disease state classification.
  • Healthy individuals NH S
  • NH L (C L) (mantle cell lymphoma)
  • NH L (D L B C L) (diffuse large B cell lymphoma)
  • NH L (F L) (follicular lymphoma).
  • Figure 20 shows the results of measuring the autotaxin concentration in female sera and categorizing by non-Hodgkin lympha species.
  • the vertical axis represents autotaxin (AT X) Concentration
  • horizontal axis shows each disease state classification, healthy person (NH S), NHL (DLBCL) (diffuse large B cell lymphoma), NH L (FL) ('follicular lymphoma) Indicates.
  • Figure 21 shows the results of a correlation test between autotaxin (AT X) concentration and lysophosphatidic acid (L P A) concentration.
  • Nucleic acid molecules that code for human taxin genes for the preparation of immunizing antigens are screened from cDNA libraries or genomic libraries using a polynucleotide probe based on the human taxin gene information. Can be obtained.
  • c A DNA library can be easily prepared by isolating RNA from tissue using a known method, or a commercially available one may be used.
  • antigen expression in various expression systems can be performed.
  • the protein expression system may be any of Escherichia coli, yeast, insect cells, animal cells, etc., but it can be expressed in large quantities, and it can express proteins with a structure close to that of natural human toxin such as glycosylation.
  • the possible insect cell-baculovirus system is preferred.
  • an otaxin having a polyhistidine tag it can be easily purified by a metal-free column.
  • the c 1 my c tag and the like can be purified with an anti-c-my c antibody affinity column.
  • Antigen immunity used in the present invention is not limited to any technique as long as the technology is established, For example, antibodies can be produced by immunizing animals with purified antigens.
  • the animal to be used is not particularly limited as long as it has antibody-producing ability, and it may be a commonly used mammal such as a mouse, rat, and rabbit, or 17 trout can be used. is there.
  • immunization is carried out by administering subcutaneously, footpad, or abdominal cavity with purified human autotaxin antigen and phleboine-complete adjuvant.
  • the antibody titer may be increased by repeated booster immunizations with purified antigen and incomplete adjuvant if necessary.
  • the antigen is given to the animal as a final immunization without being emulsified with adjuvant.
  • the amount of antigen to be administered should be about 0. g per animal body weight – as a guideline, but there is no problem as long as the antigen amount does not receive immune tolerance due to insufficient or excessive antigen.
  • any method can be used, and any fusion means using a reagent such as electrical fusion or polyethylene glycol can be used.
  • B cells and myeloma cells of an immunized animal can be obtained by performing cell fusion in the presence of polyethylene glycol and selecting antibody-producing cells using a HAT medium.
  • the selected hybridoma cells can be established as monoclonal antibody-producing hybridoma cells by monocloning by limiting dilution.
  • the hybridoma selection method used in the present invention is characterized in that an immune antigen is bound to a solid phase as in a usual ELISA method, and selection based on reactivity to the antigen bound to the solid surface is not performed.
  • the reason is that although a screening method based on an ELISA method in which an antigen is bound to a solid phase can obtain many reactive antibodies, most of these antibodies are present in serum. ⁇ Auto Yukishi This is because the process cannot be captured efficiently.
  • an anti-rack immunoglobulin antibody is bound to the immunoplate.
  • the surface of the immunoplate to which primary antibody was bound was blocked with russia serum albumin, and then the culture supernatant of the hybridoma cells obtained by cell fusion was used.
  • the immunoplate was washed with a buffer solution such as PBS (phosphate buffer solution), and then recombinant human autotaxin antigen (polyhistidine-tagged histidine containing polyhistidine) Add autotaxin).
  • the polyhistidine-added human autotaxin is confirmed to have lysophosphine lipase D activity.
  • the antibody in the supernatant of the hybridoma is captured for a certain period of time to capture the toxin with polyhistidine.
  • the captured polyhistidine-tagged hitotaxin reflects the state of maintaining the natural form in solution as in the living body.
  • Hypridoma capable of capturing human autotaxin It is expected that antibodies in the culture supernatant can capture autotaxin in human samples.
  • the enzyme-labeled anti-polyhistidine antibody and enzyme-labeled probe H is Probe—HRP (Pierce Biotechnology, I nc) , Cat. No. 1 5 1 6 5), etc., detect the polyhistidine-tagged human autotaxin captured by the antibody. Final detection is enzyme In contrast, it is possible to use color development, fluorescence, chemiluminescence substrate, etc.
  • the method for purifying the antibody used in the present invention is not particularly limited as long as it is an established technique. For example, after selection of the desired antibody-producing hybridoma, a monoclonal antibody-producing hybridoma is established by limiting dilution, and the cell culture supernatant is collected. If necessary, the antibody can be purified by ammonium sulfate precipitation, and the monoclonal antibody can be purified by affinity chromatography using protein A or protein G solid phase support. The purified antibody can be used to verify the construction of a human autotaxin 2 antibody sandwich immunoassay system by labeling with an enzyme such as biotin labeling or alkaline phosphatase. These methods are standard and well established.
  • the method for measuring natural form of human autotaxin disclosed in the present invention is a method that can specifically capture natural form of human autotaxin and, as a result, can detect the purified antibody-natural form of human autotaxin complex. Do not choose.
  • a competitive method using competition between the labeled antigen widely used in Imuno Assy and the antibody of the natural form of human autotaxin in the sample, natural form using two antibodies with different epitopes The Sandwich method that forms a tripartite complex with human taxin is simple and versatile.
  • the carrier is not particularly selected as long as it is used in immunoassay such as immunoplate, latex particles, magnetic fine particles, nitrocellulose membrane, PVDF membrane.
  • the two-antibody sand switch immunoassay method with different epitopes is superior in terms of specificity, sensitivity, and versatility.
  • the combination of anti-human autotaxin monoclonal antibodies that can be constructed with this measurement system is selected by using a purified antibody group and a labeled antibody group, and using a recombinant human autotaxin as a sample, This is done by verifying whether it can be constructed. Specifically, purified unlabeled anti-native form of human autotaxin monoclonal antibody is bound to immunoplate, and the immunoplate surface is blocked with urine serum albumin. Subsequently, recombinant human taxin is added to the imunolate and captured by the solid phase antibody.
  • a dilution series sample of recombinant human taxin and human serum is prepared and depends on the dilution factor. It is verified whether or not there is any reactivity.
  • human serum samples with known lysophosphine lipase D enzyme activity use human taxin quantification for verification.
  • the bonding method may be either physical bonding using a hydrophobic bond or chemical bonding using a linker reagent capable of crosslinking between two substances.
  • the carrier surface should be blocked with bovine serum albumin, skim milk, or a commercially available blocking agent for immunoassay to make the primary reagent.
  • Antibody labels include enzymes such as peroxidase and alkaline phosphatase, fluorescent substances, chemiluminescent substances, detectable substances such as radioisotopes, substances with specific binding partners such as piotin and avidin, etc. A label is preferred.
  • the secondary reagent solution is preferably a buffer solution that can satisfactorily carry out an antigen-antibody reaction, such as a phosphate buffer solution or Tris-HC 1 buffer solution.
  • an antigen-antibody reaction such as a phosphate buffer solution or Tris-HC 1 buffer solution.
  • the reaction is preferably performed at a temperature of 4 to 40 for 5 minutes to 3 hours. Unreacted substances are removed by BZF separation, and then contacted with a secondary reagent for a certain period of time at a certain temperature to form a sandwich complex.
  • a reaction of 5 minutes to 3 hours at a temperature of 4 to 40 is preferable.
  • the labeled substance of the labeled antibody is quantified, and the concentration of human autotaxin in the actual sample is quantified using a calibration curve prepared with a known concentration of human autotaxin as a standard.
  • a 1-step sandwich measurement reagent as in the 2-step sandwich measurement reagent, prepare an antibody-bound antibody and a blocking treatment. A buffer containing the labeled antibody is added to the antibody-immobilized carrier to obtain a reagent. If necessary, the reagent can be lyophilized.
  • 1-step sandwich measurement reagents it is often difficult to construct a measurement system due to excess or deficiency of antigen or antibody due to the balance of antigen-antibody usage.
  • the amount of antibody to be bound to the carrier is 5 to 500 ng, preferably 10 000 ng, preferably 1 to 100 ng, preferably 10 000 per well of 96-well immunoplate. Good results can be obtained by using ng.
  • the human specimen used for measurement includes serum, plasma, urine, seminal plasma, cerebrospinal fluid, etc., but the dilution ratio of the specimen used is preferably undiluted to 100-fold diluted, especially in serum and plasma. 10 for 5-fold diluted sample 0 /! In seminal plasma, good results can be obtained by using undiluted specimens in IOOL.
  • the concentration of human autoxin in the sample determined by the measuring reagent according to the present invention shows a good correlation with the lysophosphatase D activity of autotaxin.
  • Diagnosis of cancer is possible by measuring the autoxin in the serum of cancer patients using the measurement reagent according to the present invention.
  • Prostate cancer marker PSA Gastrointestinal cancer marker CA 1 9 — 9, Breast cancer marker CA 1 5 3, Ovarian cancer marker CA 1 2 5
  • the difference between the healthy subjects in all cancer patient specimens is P ⁇ 0.001 and the results indicate that cancer diagnosis or diagnosis assistance is possible.
  • breast cancer and ovarian cancer showed remarkably high values compared to healthy individuals, and the results were obtained as effective measurement reagents for diagnosis or assistance of cancer using this measurement reagent.
  • malignant lymphomas can be examined by measuring human autotaxin in patient samples using this reagent.
  • a comparison of autotaxin concentrations in specimens of patients determined to be leukemia and malignant lymphoma with autotaxin concentrations in healthy individuals with no clinical symptoms showed a significant difference in non-Hodgkin lymphoma patients. High value was shown.
  • the value is particularly high in follicular lymphoma, and this measurement is effective for testing or assisting malignant lymphoma, especially non-Hodgkin lymphoma, and follicular lymphoma using this measurement reagent.
  • the result was a reagent.
  • Chronic liver disease can be diagnosed by measuring the amount of human toxin in the serum of patients with chronic liver disease using the measurement reagent according to the present invention.
  • concentration of human taxin in patients with chronic liver disease and healthy subjects As a result of the measurement, a significant difference p ⁇ 0. 0 0 0 1 resulted in a high autotaxin concentration in the serum of patients with chronic liver disease, indicating that it was useful for diagnosis of chronic liver disease or for assistance in diagnosis. It was.
  • Example 1 Expression of recombinant human taxin
  • a baculovirus for expressing human autotaxin was prepared according to the protocol. By using this baculovirus and infecting sf 9 or sf 21 according to a conventional method, it contains full-length human toxin and polyhistidine-tagged human autotaxin. Expression culture supernatant can be prepared
  • Example 2 Purification of human taxin with polyhistidine overnight Baculovirus for expression of polyhistidine overnight into insect cells sf 2 1 cells (5 X 10 5 eel ls / ml) 1 L Infected and cultured at 28 for 4 days. After culture, centrifuge (3 0 0
  • the cells were separated by O rpm (10 minutes), and precipitates such as cell debris were removed using a 0.45 im filter.
  • the collected culture supernatant is T B S (T r i s b u f f e r s a l i n e; 10 m
  • the column is packed with 5 mL of resin.
  • the column is packed with 5 mL of resin.
  • the column was equilibrated with an aqueous solution of O mM sodium phosphate, 300 mM NaCl, pH 7.7 (wash buffer). A sample containing 5 mL of polyhistidine-containing hypoxin-containing sample was added. 1
  • Unbound material was washed with 0 O mL of washing buffer, and it was confirmed that the absorbance at 2880 nm of the column passage solution was not more than 0.01.
  • the target product was eluted from the column with about 15 ml of a wash buffer containing 10 mM imidazole, followed by a wash buffer containing 10 OmM imidazole.
  • the eluted sample was collected every 1 mL, and the purity of polyhistidine-tagged human autotaxin in each fraction was verified by SDS-PAGE.
  • the initial fraction is not collected because it contains a lot of impurities, and the fraction containing mainly the target autohistoxin with polyhistidine overnight is recovered and mixed.
  • the purified polyhistidine was used as a human autotaxin antigen.
  • Figure 1 shows the SDS-PAGE image of a purified polyhistidine-tagged human autotaxin product and the results of Western plotting using an anti-autotaxin peptide antibody.
  • Lane M shows the molecular weight marker.
  • Lane 1 shows an image obtained by staining SDS-PAGE with the purified antigen under reducing conditions in Nolane and staining with CBB.
  • Lanes 2 to 5 show Western blotting images. 0.
  • the purified antigen was subjected to SDS-PAGE under reducing conditions in Nolane, transferred to a PVDF membrane, and the PVDF membrane was blocked overnight with TBS containing 3% skim milk.
  • Lane 2 is a 1 g / mL rat anti-toxin peptide monoclonal antibody (recognizing amino acid sequence 4 9 1 5 9 (SEQ ID NO: 2)), Lane 4 is 1 ⁇ gZmL Usagi anti-auto An xanthine peptide polyclonal antibody (recognizing amino acid sequence 6 7 1 — 6 8 6 (SEQ ID NO: 3)) was added and reacted for 2 hours (no antibody was added to the samples in lanes 3 and 5).
  • the samples in lanes 2 and 3 After washing with 0.05% Tween 20 containing TBS (TBST), the samples in lanes 2 and 3 have 0.3 ⁇ g ZmL alkaline phosphatase-labeled anti-latch IgG antibody (American Q ualex; Cat. No. A 1 0 3 AT) and TBST containing 1% Block Ace are added, and lanes 4 and 5 are labeled with 0.3 ⁇ g ZmL of alkaline phosphatase. Anti-rabbit IgG antibody (Zymed) and TBST containing 1% block ace were added.
  • TBS TBS
  • Wistar 'Lewis' Rat 7-week-old female was immunized with ether anesthesia in the hind paw with antigen 2 50 / g together with complete adjuvant of Freon.
  • rodent and iliac lymph nodes were collected from rats and B cells were collected.
  • cell fusion is performed according to a conventional method, and selection is carried out using a HAT medium for about 10 days, and the target antibody is selected by screening the antibody-producing cell hybridoma according to Example 4. Selected.
  • Cells in the positive screening well were monoclonalized by the limiting dilution method and established as a hybridoma.
  • Anti-Rammunoglobulin antibody (Am e r i c a n Q u a 1 e x, C at. N o. A 1 0 3 U T) was injected into a 9-well immunoplate (M a ⁇ i S orp; N a 1 g e NUN C I n t e r n a t i o n a
  • polyhistidine—without human autotaxin with evening light, and other operations simultaneously performed were obtained as a control background and used as a background.
  • a control clone was selected as a positive clone that showed reactivity in the presence of polyhistidine-added autoxin with the presence of polyhistidine, and a monoclonal antibody-producing cell line was established by limiting dilution.
  • Example 5 Antibody purification and piotin labeling
  • the culture supernatant of the monoclonal antibody-producing cells was collected and subjected to Hi Trap Protein GHP (GE Healthcare Bioscience Co., Ltd., Cat. No. 17- 0 4 0 5-0 1).
  • the antibody was purified.
  • the culture supernatant is passed at a flow rate of 20 mL / min through the above column that has been buffer-substituted with PBS (phosphatebuffersa 1 ine; 10 mM phosphoric acid, 150 mM Na CU pH 7.4). I let you.
  • the column was sufficiently washed with PBS of 5 times the column volume to remove unbound protein.
  • TBS solution containing 3% _BSA was added to each well with 2550 L Zwell, and the mixture was allowed to stand at room temperature for 2 hours for blocking.
  • l x g ZmL of purified antibody and TBS containing 1% BSA were added at 50 / well and left at room temperature for 2 hours.
  • TBST add TBST containing 0.3 g ZmL HRP-labeled key anti-lat IgG antibody and 1% BSA in 50 LZ well and let stand at room temperature for 2 hours .
  • TMB substrate was added in 50 1 wells and allowed to stand for 30 minutes at room temperature.
  • Figure 2 shows the results of measuring the absorbance of OD 4500 after stopping the reaction with 1 N-phosphoric acid.
  • the vertical axis shows the type of monoclonal antibody, and the horizontal axis shows the absorbance at 45 O nm.
  • Figs. 2 and 3 show that the conventional ELISA method that binds antigen, which is a screening method for the production of monoclonal antibodies, is efficient for the natural form of human autotaxin that is present in the serum. This indicates that it is very difficult to obtain antibodies that can be captured well.
  • Example 7 Absorption of lysophosphine lipase D activity in serum by a monoclonal antibody
  • FIG. 4 shows the results of verifying the inhibition rate of lysophosphine lipase D activity in human serum treated with immobilized magnetic fine particles of anti-rat IgG antibody without addition of anti-human autotaxin antibody.
  • the vertical axis indicates the type of monoclonal antibody, and the horizontal axis indicates the activity inhibition rate (absorption rate).
  • the activity absorption rate shows the inhibitory activity against the residual activity in a buffer solution containing no anti-human autotaxin antibody.
  • Lysophospholipase D activity was measured by slightly changing FEBS letters 5 7 1, 1 9 7-2 0 4, 2 0 4. Specifically, 20 L of sample and 2 mM of lysophosphatidylcholine (14: 0—lysophosphatidylcholine), l OO mM Tris—HC l, 500 mM
  • R 1 solution consisting of Triton X-100, l OO mM Tris-HC l (pH 8.0), add 1 5 0 ⁇ L, let stand for 5 minutes, then 1 mM 4 monoaminoantipyrine, l O UnitZmL 50 L of R 2 solution consisting of colixidase, 0.0 1% Triton X — 100, lOOmM Tris — HCl (pH 8.0) was added. After 30 minutes, the absorbance at 550 nm was measured for a known concentration of chlorinated chloride. The activity value was used.
  • the antibodies other than the antibodies RIO .30 and R10.3 1 exhibited absorption performance, reflecting the binding performance of the native form of human autotaxin in solution using the His Probe in Example 6. The results are shown and do not reflect the results of binding the antigen directly to the immunoplate. Absorption performance from serum for antibodies R 1 0. 30 and R 1 0. 3 1 and the difference between the measurements using His Probe I HRP are the structures of the recombinant and the human autotaxin present in the serum. Alternatively, there is a difference in the state of existence, and it is speculated that these antibodies cannot recognize human autotaxin in serum.
  • Example 8 Confirmation of reactivity of monoclonal antibodies to other animal species, autotaxin
  • Example 5 The reactivity of the representative antibody purified in Example 5 to autoxin in animal serum was verified by absorption of serum lysophosphine lipase D activity.
  • Piotin-labeled anti-human autotaxin antibody 1 prepared in Example 5 was added to prepare anti-human autotaxin-immobilized magnetic microparticles. After washing the unreacted antibody with TBST, 12.5 L of animal serum diluted 2.5-fold with TBST was added and allowed to react for 2 hours.
  • Fig. 5 and Table 1 show the results of verifying the inhibition rate of lysofophospholipase D activity in animal sera treated with magnetic spheres immobilized with levulavidin immobilized with no anti-human autotaxin antibody.
  • the vertical axis shows the type of animal serum, and the horizontal axis shows the activity inhibition rate (absorption rate).
  • the activity absorption rate is the remaining in a buffer solution that does not contain anti-hypertoxin antibody. Inhibiting activity is shown.
  • An antibody-immobilized carrier was prepared using the antibody purified in Example 5, and a human zero-xin serum prepared by purifying the antigen and removing the antigen from the human serum was prepared. Using these as materials, we prepared standard products (samples with known concentrations of human taxin) to be used for immunoassay. Specifically, the module purified according to Example 5 was used. Noclonal antibody RIO. 2 3 against Hi Trap NH S—activated 5 mL column (GE Healthcare Biosciences, Cat. No. 1 7-0 7 1 7-0 1) mg of antibody was bound according to the manual.
  • FIG. 6 shows the SDS-PAGE image of the full-length human toxin purified product and the results of Western blotting using an anti-autoxin peptide antibody.
  • Lane M in the figure shows a molecular weight marker.
  • Lane 1 shows an image of the purified antigen stained with CBB after SDS-PAGE under reducing conditions with 1 ⁇ g nolane.
  • Lanes 2-5 show Western plotting images.
  • the purified antigen was subjected to SDS-PAGE under reducing conditions with 0.25 / A g nolane, and then transferred to a P VDF membrane.
  • lane 2 recognizes rat anti-autotaxin peptide monoclonal antibody (amino acid sequence 4 9 1 5 9 (SEQ ID NO: 2))
  • lane 4 shows Usagi anti-autotaxin peptide polyclonal antibody ( Amino acid The sequences 6 7 1 -6 6 6 (SEQ ID NO: 2) were recognized), and lanes 3 and 5 were detected as a background loop for nonspecific binding detection without anti-human autotaxin.
  • the purified antigen was confirmed as two bands in the CBB-stained image, and two or more bands were detected in the vicinity of the molecular weight of 105 kDa as in Example 2 in Western plotting using an anti-peptide antibody.
  • the results suggest that there is a difference in sugar chain, or degradation during the culture and purification process.
  • the concentration of this purified full-length ethanol was measured with the BCA protein quantitative kit (Pierce Biotechnology, Inc., Cat. No. 2 3 2 2 5) to obtain the human taxin concentration.
  • This purified human taxin antigen was added to the above human serum-free human serum to prepare a standard product of known concentration.
  • Example 10 Selection of antibody combinations for Sandwich ELISA measurement system
  • Figure 7 shows a typical result.
  • Each of R 1 0. 2 1 and R 1 0. 2 3 is coated on the immunoplate as a primary antibody, reacted with human taxin, and then used with another antibody group to prepare a 2-antibody sandwich.
  • H The results of detection of the reactivity by ELISA are shown in the upper part (results of plate coating of the left figure R 10.2 1 and the right figure 10.2 3).
  • the obtained antibody group was coated on the immunoplate as a primary antibody, and the reactivity was detected using R10.21 and R10.23 as secondary antibodies.
  • 1 0. 2 1 and right figure R 1 0. 2 3 as the secondary antibody for detection).
  • the horizontal axis shows the antibody used (upper: secondary antibody, lower: primary antibody), and the vertical axis shows reactivity by absorbance at 45 O nm. From the comparison of the upper and lower graphs, it was confirmed that the same antibody combination showed reactivity depending on how the primary and secondary antibodies were used, and not.
  • Figure 8 shows a list of reactivity in the Sandwich ELISA using the anti-hyperautotaxin monoclonal antibodies obtained. Those showing no reactivity in this result indicate combinations that cannot construct Sandwich ELISA, suggesting that combinations showing reactivity can be constructed.
  • the name of the primary antibody bound to the immunoplate in the horizontal direction and the name of the secondary antibody in the vertical direction are shown.
  • Example 1 1 2 Step Sandwich Quantification of human taxin by ELISA
  • Example 9 Using the combination of anti-human autotaxin antibodies that showed reactivity in Example 9, a two-step two-antibody sandwich ELISA system for measuring serum human autotaxin was constructed. The measurement system was verified using R 1 0.23 as the solid phase antibody and R 1 0.21 as the secondary antibody. The solid phase antibody R 1 0.23 was converted to F (ab) 2 by pepsin digestion and used. In the same manner as in Example 9, R 1 0.23 was added to 9 6-well Imunolate (manufactured by NUNC) at a concentration of 2 gZmL in 50 LZ wells and allowed to bind to the plate at 4 overnight. After washing 3 times with TBS, TBS containing 3% BSA was added with 2500 LZ well and blocking treatment was performed for 2 hours.
  • R 1 0.23 was added to 9 6-well Imunolate (manufactured by NUNC) at a concentration of 2 gZmL in 50 LZ wells and allowed to bind to the plate at 4 overnight. After washing 3 times with TBS,
  • Example 10 After washing 3 times with TBS, the standard prepared in Example 10 and human serum of unknown concentration were diluted to 15 with ELISA assay buffer and added in 50 x L Nowell. After reacting at room temperature for 2 hours, the plate was washed 4 times with TBST, and an ELISA assembly buffer containing 0.8 g ZmL of piotin-labeled R 1 0.21 was added to 50 ⁇ LZ well. After standing at room temperature for 2 hours, wash 4 times with TBST and dilute 100-fold diluted HRP labeled strobavi ELISA buffer containing 5 mL wells (Zymed) was added. After standing at room temperature for 1 hour, the plate was washed 6 times with TBST, and TMB substrate was added in 50 L wells.
  • Fig. 9 shows the calibration curve for 6 concentrations (0, 0.34, 0.66 75, 1.35, 2.70, 5.40 zg ZmL) of known standards of known concentrations of human toxin. Show. The regression of the calibration curve was performed by cubic regression. An increase in absorbance at 45 nm was confirmed depending on the concentration of human taxin. Using this calibration curve, the concentration of human taxin in the sample was calculated from the absorbance at 4500 nm obtained with human serum at an unknown concentration. In addition, lysophospholipase D activity in human serum used for the measurement was determined according to Example 7, and the correlation with the human taxin concentration was verified.
  • Fig. 10 shows the results of 42 human serum samples.
  • the horizontal axis represents lysophoslipase D activity and the vertical axis represents human autotaxin concentration.
  • Example 12 1 Step Sandwich Quantification of human taxin by ELISA
  • Example 10 Using the combination of anti-human autotaxin antibodies that showed reactivity in Example 10, a system for measuring serum human autotaxin by 2 antibody 1 step sandwich ELISA was constructed. The measurement system was verified using R 1 0.23 as the solid phase antibody and R 1 0.21 as the secondary antibody. The solid phase antibody R 1 0.23 was converted to F (ab) 2 and used. The secondary antibody R 1 0.21 was enzyme-labeled using alkaline phosphatase and Sulfo-SMCC. R 1 as in Example 9. 0.23 was added to 96-well immunoplate (NUN C) at 2 g ZmL and allowed to bind to the plate at 4 overnight. After washing 3 times with TBS, TBS containing 3% BSA was added at 25 / well for blocking treatment for 2 hours.
  • NUN C 96-well immunoplate
  • An ELISA assay buffer containing 0.57 g / mL of alkaline phosphatase labeled R 1 0.21 was added in TBS 50 a 1 Zwell and immediately frozen at ⁇ 40 ° C. Over the course of the day, the product was freeze-dried under reduced pressure to prepare a one-step sound switch ELISA assay reagent.
  • the standard prepared in Example 10 and human serum of unknown concentration were diluted 1 Z 5 times with 0.125% Tween20 aqueous solution and added in 50 L wells. After 2 hours of reaction at room temperature, the plate was washed 4 times with TBST, and TMB substrate was added in 50 wells.
  • Fig. 11 shows calibration curve based on 6 concentrations (0, 0. 3 4, 0. 6 7 5, 1. 3 5, 2. 70, 5.40 g ZmL) of standard samples with known concentrations of human taxin Indicates. The regression of the calibration curve was performed by cubic regression. An increase in absorbance at 45 nm was confirmed depending on the concentration of human taxin. Using this calibration curve, the concentration of human toxin in the sample was calculated from the absorbance at 45 O nm obtained with human serum at an unknown concentration.
  • Example 13 1 Step Sandwich Quantification and diagnosis of human taxin in cancer patient samples by ELISA assay
  • PSA prostate cancer marker
  • Example 14 Quantification and diagnosis of human taxin in patients with chronic liver disease using a one-step sandwich ELISA assay
  • Table 3 also shows measured values and autoxin concentration of hyaluronic acid, serum albumin, total bilirubin concentration, platelet count, and prothrombin time, which are existing liver disease markers using 17 patients with chronic liver disease. I showed the relationship with. There was a correlation between the concentrations of human autotaxin for all existing markers. From these results, it was shown that quantification of serum toxin concentration in serum is effective in diagnosing or assisting diagnosis of chronic liver disease and reflects the degree of the disease.
  • hyaluronic acid concentration For 17 patients with chronic liver disease, hyaluronic acid concentration, serum albumin concentration, total pyrilvin concentration, platelet count, and prothrombin time are measured and compared with the human autotaxin concentration in a list.
  • ELISA assay buffer 5 containing MgCl 2 was dispensed into a measuring cup and freeze-dried overnight. Using this measurement reagent, the measurement was performed by an automated apparatus. Measurement conditions were as follows: 20 L of a sample and 1 30 L of a 0.1% Triton X — 100 solution were dispensed into a measurement cup and reacted at 37: 10 minutes. After the reaction, after washing with succinate buffer, add 4-methylumbelliferyl phosphate and measure the concentration of 4-methylumbelliferone produced per unit time by decomposing and decomposing with alkaline phosphatase. Quantification was performed.
  • lysophosphine lipase after dialyzing the seminal plasma sample thoroughly with TBS for 8 hours to remove low molecular weight substances D activity is shown in the middle of FIG. After dialysis, the amount of lysophospholipase D activity, which was high, decreased to about 1 Z 100.
  • enzyme activity was confirmed in the presence of the substrate in the absence of the substrate, as shown in the right of FIG.
  • an anti-human autotaxin monoclonal antibody (R10.23) to a water-insoluble carrier (ethylene pinyl alcohol with a particle diameter of 1.5 mm, with ferri cocoon inside) so that it becomes an lOOng Z carrier. Then, the antibody was physically adsorbed for a whole day and night, and then blocked with 10 OmM Tris buffer (pH 8.0) containing 1% BSA for 40 hours for 4 hours to obtain an antibody-immobilized carrier.
  • anti-human toxin monoclonal antibody (R10.21) was converted to F (ab) 2 by pepsin treatment, and then SPDP (N-succinimidyl 3- [2-pyridyldithio] probione) was used.
  • An antibody-immobilized carrier was prepared using anti-human autotaxin monoclonal antibody (R10.23), and human autotaxin zero serum prepared by purifying antigen and removing antigen from human serum was prepared. Using these as materials, we prepared standard products (samples with known concentrations of human autotaxin) for use in human autotaxin immunoassay. Specifically, R1 0.23 was manually administered with 25 mg of antibody against Hi Trap NH S—activated 5 mL column (GE Health Science, Cat. No. 1 7-0 7 1 7-0 1).
  • Example 16 Using the autotaxin measurement reagent prepared in Example 16 and using the standard product prepared in Example 17, the reagent performance was evaluated.
  • Fully automatic Enzymno assay device AIA-1800 manufactured by Tosohichi Co., Ltd .: manufacturing and sales notification number 1 3 B 3 X 9 0 0 0 2 0 0 0 0 0 2) is used as the evaluation device. It was. Standard concentrations were 0, 0.31 3, 0.62 5, 1, 2.5, 2.5 and 5.0 g ZmL.
  • the measurement principle of the fully automated enzyme immunoassay device AIA-1800 is the standard or human serum sample 20; prepared in Example 16 with a diluent 1 30 x L containing L and surfactant It is automatically dispensed into a reagent container for autotaxin measurement. After an antigen-antibody reaction at 37 at constant temperature for 10 minutes, after washing 8 times with a buffer containing a surfactant, 4-methylumbelliferyl phosphate was added, and 4— The measured value (nmo 1 / L ⁇ sec) is defined as the methylumbelliferone formation concentration. Table 4 shows the measured values when measuring standard products, and Fig. 16 shows the calibration curve using the measured values. The minimum detection sensitivity calculated from (average value + 2 X standard deviation) of this calibration curve and zero concentration standard product was l l Ong ZmL.
  • NHL Hodgkin lymphoma others Other leukemia, malignant lymphoma
  • Measured values of 7 healthy male subjects are average 0.66 5 6 ⁇ / 111. Quasi-deviation 0.1 2 1 ⁇ gZmL, minimum value 0.4 0 1 xg / mL, maximum value 1. 0 8 8; g / mL. The measured values of 6 healthy female subjects were the average value 0.8 5 2 / gZmL, standard deviation 0.1 8 4 z gZm L, minimum value 0.62 2 1 8 11 and maximum value 1. 5 9 It was 0 / gZmL. Leukemia and malignant lymphoma 2 1 5 patients were measured.
  • Target specimens are healthy individuals, acute leukemia (acute lymphoblastic leukemia, acute myelogenous leukemia), chronic leukemia (chronic lymphocytic leukemia, chronic myelogenous leukemia, precursor lymphocytic leukemia), Hodgkin lymphoma Non-Hodgkin's lymphoma (diffuse large B-cell lymphoma, follicular lymphoma, mantle cell lymphoma, bacitrin lymphoma, lymphoblastic lymphoma), other leukemia, It is a malignant lymphoma (chronic active EBV infection, myelodysplastic syndrome, multiple myeloma). As shown in Figs. 17 and 18, the measurement results were high in non-Hodgkin's lymphoma with a significant difference P of 0.1 for both males and females.
  • Example 2 1 Detailed evaluation of non-Hodgkin lymphoma
  • Example 20 The non-Hodgkin lymphoma measured in Example 20 was further classified and evaluated. The results are shown in Table 8 and FIGS. The follicular lymphoma showed a high value with a significant difference between males and females, p ⁇ 0.05 and p ⁇ 0.001.
  • Burkitt Burkitt lymphoma
  • LBL Lymphoblastic lymphoma
  • MCL mantle cell lymphoma
  • DLBCL Diffuse large B-cell lymphoma
  • G 3 PDH Glycerol 3-phosphate dehydrogenase
  • HSD Hydroxysystemolide dehydrogenase
  • the present invention relates to an antibody against a natural form of human autotaxin contained in a human specimen, and a method and quantitative reagent for measuring human autotaxin using the same. By using these, a method for diagnosing cancer and a method for diagnosing liver disease become possible. Furthermore, the present invention provides By measuring the concentration by means of immunological quantification of human autotaxin contained in human specimens, malignant lymphoma, which has not had a clear serodiagnosis before, especially large Japanese It will be possible to examine or assist in the examination of the majority of non-Hodgkin lymphomas, and even follicular lymphomas.

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Description

明 細 書 天然形態ヒ トオー トタキシン特異的抗体、 そのスク リーニング方法 、 及びオー トタキシン測定による悪性リ ンパ腫の検査方法および検 查薬 技術分野
本発明は、 天然形態ヒ トオー トタキシンを特異的に認識、 結合す る抗体及びそのスク リーニング方法、 並びにヒ ト検体中のオー ト夕 キシン濃度の測定による悪性リ ンパ腫の検査方法および検査薬に関 する。 背景技術
ヒ トオー トタキシンは、 1 9 9 2年 M. L . S t r a c k e らに よって A 2 0 5 8 ヒ ト黒色腫細胞培養培地から細胞運動性を惹起す る物質として単離された分子量約 1 2 5 kDaの糖蛋白質である （ J . B i o l . C h e m. ， 2 5 6 , 2 5 2 4 , 1 9 9 2 ) 。 その後 、 1 9 9 4年に J . M u r a t a らによる c D NAクローニングに より構造解析が進められァミノ末端側で単一膜貫通部分を有するこ と、 細胞ガイ ドメイ ンに 2つのソマ トメジン B領域、 I 型ホスホジ エステラーゼ活性 Vおよび E Fハン ドのループ領域を含み、 ホスホ ジエステラーゼ活性を有することなどが明らかとなった （ J . B 1 o 1 . C h e m. , 2 6 9， 3 0 4 7 9 , 1 9 9 4 ) 。 しかし、 ォ 一ト夕キシンが細胞運動性を惹起する機能に関しての明確な証拠は 得られぬままであった。 2 0 0 2年、 新規リ ゾホスフオ リパーゼ D の同定がヒ ト （A. T o k umu r a e t a 1 - ， J . B i o 1 . C h e m. , 2 7 7 , 3 9 4 3 6 , 2 0 0 2 ) およびゥシ血清 ( M . U m e z u— ^ o t ο e t 1 . , J . C e l l B 1 o 1 . , 1 5 8 2 2 7 , 2 0 0 2 ) からなされ 、 本酵素活性によ り生成されるリ ゾホスファチジン酸が細胞運動性を惹起することが はじめて明らかとなった。
ォー 卜夕キシンの運動性惹起機能から推測し、 S t r a c k e ら はヒ 卜癌の浸潤性能力に対する ―カーと してのォー 卜タキシンの 使用を米国特許第 5 , 4 4 9 , 7 5 3号 （ 1 9 9 5年） に記載して いる。 また、 S t r a c k e らは 、 毒素と結合された抗ォー h夕キ シン抗体の投与による癌治療に関しても米国特許第 5 ， 7 3 1 1
6 7号 （ 1 9 9 8年） に示唆している。 この様にヒ 卜ォ 卜夕キシ ンを特異的に認 する抗体が切望されている力 ォー 卜タキシンは 動物血清中に様々な形態で比較的多量に含まれているため、 血清中 に通常存在する恋久性を受けていないォー 卜夕キシン （天然形 のォ ト夕キシン） に対し特異性かつ強い結合力を有する抗体取得は非 常に困難なことが予想される。 実際、 オー トタキシン自体の定量法 はなく、 オー トタキシンが有するリゾホスフオ リパーゼ D活性の評 価により間接的にその定量が行われているのが現状である。 かかる 活性測定は手法が煩雑であり、 また酵素活性発揮させるために通常 数時間にも及ぶ基質とのイ ンキュベーショ ン時間を要する。 また、 ヒ ト検体中にはオー トタキシンとは異なるリ ゾホスフオ リパーゼ D 活性を有する酵素が存在することが予想されること、 酵素活性測定 におけるリ ゾホスファチジルコ リ ン基質分解により生じるリゾホス ファチジン酸およびコ リ ンがヒ ト検体中に内在する、 などいつた妨 害因子が存在する。 酵素活性測定におけるこれら内在性因子はヒ 卜 オー トタキシンの特異的定量に少なからず影響を及ぼし、 精度の高 ぃヒ トオー トタキシン定量法ではない。 実際、 ヒ ト精漿中には数十 m M程度の濃度のコ リ ンが含まれており、 コ リ ン除去の前処理なし には、 リゾホスファチジルコ リ ンを基質としたコ リ ン生成量による 精漿の活性測定は困難である。
我々を含めいくつかのグループにより ヒ トオー トタキシンの合成 部分ペプチ ドや部分配列を大腸菌により発現させた可溶性ヒ トォー ト夕キシンを免疫することにより多数のモノクローナル抗体が樹立 されている （ J o u r n a l o f B i o l o g i c a l C h e m i s t r y 2 6 9， 3 0 4 7 9— 3 0 4 8 4， 1 9 9 4， F E B S l e t t e r 5 7 1 , 1 9 7 - 2 0 4 , 2 0 0 4 ) 。 し かし、 これら抗体を利用し、 ウエスタンブロッテイ ングにより ヒ ト オー トタキシンを検出することはできるが、 これらの抗体はヒ ト検 体中の天然形態なヒ トォ一 卜タキシンとの反応性は示さない、 ある いはきわめて低い反応性しか示さない。 よって、 ヒ ト検体を対象と した E L I S A測定法などの免疫学的測定方法への適用は非常に困 難であり、 実用には至っていない。
本発明によれば、 ヒ ト検体中の天然形態ヒ トオー トタキシンと特 異的に反応するモノクローナル抗体を非常に効率よく樹立可能であ る。 すなわち、 抗原免疫、 細胞融合によりモノクローナル抗体を作 製する際のスク リーニング方法において、 溶液中に存在する天然形 態の抗原との反応性を指標に抗体を選択することにより、 E L I S A法などの汎用的なヒ トオー トタキシン定量測定系を確立すること ができる。 また、 本手法で取得した抗体は、 血液などに含まれるヒ トォ一 卜タキシンを効率よく結合捕捉できることより、 サンプルか らの抗原の除去はもとより、 抗原精製も可能な高性能な抗体である
発明の開示
オー トタキシンのヒ ト組織あるいは体液中の存在濃度が様々な疾 病により変動することを示唆する報告がなされているが、 これまで その定量方法がないことより、 その詳細な解析が行なわれていない 。 還元剤存在下など変性条件下でのオー トタキシンの有無や存在比 などの定性的な解析はなされてきたが、 構造、 機能を維持した状態 で通常生体内に存在する天然形態のヒ 卜オー トタキシンを効率よく 認識、 結合可能な抗体がなかったことより、 汎用可能なヒ トオー ト タキシンの定量法は確立されていなかった。 また、 オー トタキシン が有するリ ゾホスフォ リパーゼ D活性を指標に、 酵素活性測定によ り リ ゾホスフオ リパーゼ D活性の変動と疾病との因果関係の解析が 行なわれているが、 本酵素活性測定ではヒ ト検体中に含まれるォー ト夕キシン以外の他のリゾホスフオ リパ一ゼ D活性を含んだ測定値 が得られてしまう こと、 活性測定の際に用いるリゾホスファチジル コ リ ン基質や活性測定の際に生じるコ リ ンが検体中に内在的に含ま れること、 などのため、 真のオー トタキシン特異的定量方法として は信頼性が十分でない。
我々は、 天然形態のヒ トオー トタキシンに対する抗体を効率よく 取得する手法を見出し、 その方法により取得した天然形態のヒ トォ 一ト夕キシンに対する抗体を用いることにより、 活性測定時に問題 となる内在性物質の影響を受けることなく、 また、 検体を還元処理 、 グァニジン塩酸塩、 尿素などの蛋白変性剤などにより変性させる などの前処理を必要とすることなく ヒ トオー トタキシンを精度よく 定量可能な測定方法ならびに定量試薬の提供に成功した。
詳しくは、 本願は下記の発明を包含する ：
( 1 ) 変性を受けることなく生体内での存在状態にある天然形態の ヒ トオー トタキシンを特異的に認識する抗体のスク リーニング方法 であって、 以下の段階 ：
当該抗体の候補抗体を補足可能な結合因子を固相に結合させ ； 当該結合因子に当該抗体の候補抗体を結合させ ； 当該候補抗体を作用させた系に天然形態ヒ トオー トタキシンを作 用させ ； 次いで
当該天然形態ヒ トオー トタキシンの前記抗体に対する結合力を指 標に、 当該天然形態ヒ トオー トタキシンを特異的に認識する抗体を 選定する ；
を含んでなる方法。
( 2 ) 前記結合因子が抗体である、 （ 1 ) の方法。
( 3 ) 前記天然形態ヒ トオー トタキシンがポリ ヒスチジンタグを有 する組換ヒ トオー トタキシン抗原である、 （ 1 ) 又は （ 2 ) の方法
( 4 ) 前記ポリ ヒスチジン夕グを有する組換ヒ トォ一 卜タキシン抗 原に対し特異的に結合する標識された抗ポリ ヒスチジン抗体を利用
—、ム
し 、 記天然形態ヒ トオー トタキシンの前記抗体に対する結合力を 測定する、 （ 3 ) の方法。
( 5 ) 前記標識された抗ポリ ヒスチジン抗体が酵素標識化抗ポリ ヒ スチンン抗体である、 （ 4 ) の方法。
( 6 ) 変性を受けることなく生体内での存在状態にある天然形態の ヒ hォ ― ト夕キシンを特異的に認識する抗体であつて、 以下の段階 当該抗体の候補抗体を補足可能な結合因子を固相に結合させ ； 当該結合因子に当該抗体の候補抗体を結合させ ；
当該候補抗体を作用させた系に天然形態ヒ トオー ト夕キシンを作 用させ ； 次いで
当該天然形態ヒ トオー トタキシンの前記抗体に対する結合力を指 標に、 当該天然形態ヒ トオー トタキシンを特異的に認識する抗体を 選定する ； を含んでなる方法により獲得可能な抗体。
( 7 ) 前記結合因子が抗体である、 （ 6 ) の抗体。
( 8 ) 前記天然形態ヒ トオー トタキシンがポリ ヒスチジンタグを有 する組換ヒ トオー トタキシン抗原である、 （ 6 ) 又は （ 7 ) の抗体
( 9 ) 前記ポリ ヒスチジンタグを有する組換ヒ トオー トタキシン抗 原に対し特異的に結合する標識された抗ポリ ヒスチジン抗体を利用 し、 前記天然形態ヒ トオー トタキシンの前記抗体に対する結合力を 測定する、 （ 8 ) の抗体。
( 1 0 ) 前記標識された抗ポリ ヒスチジン抗体が酵素標識化抗ポリ ヒスチジン抗体である、 （ 9 ) の抗体。
上記発明によれば、 天然形態のヒ 卜オー トタキシンを特異的に認 識結合可能なモノクローナル抗体が効率よく取得可能であり、 本抗 体を用いたヒ ト検体中のオー トタキシンを前処理などする必要なく 定量可能な測定方法を構築可能である。 上記発明により得られた天 然形態ヒ トオー トタキシン測定試薬を用い、 ヒ ト血清を測定するこ とにより癌の診断、 あるいは慢性肝疾患の診断が可能である。 また 、 上記方法によればリゾホスフオ リパーゼ D酵素活性によるオー ト タキシン量の推察において問題であった内在性の測定妨害因子や競 合酵素の影響を受けることなく、 かつ短時間でヒ トオー トタキシン を定量可能な方法、 試薬を提供することが可能である。
さ らに、 本発明者は、 ヒ ト検体中の天然形態ヒ トオー トタキシン と特異的に反応するモノクローナル抗体を使用した E L I S A法な どの汎用的なヒ トオー トタキシン定量測定系を用いることにより簡 便かつ短時間で血液などに含まれるヒ トオー トタキシンを定量する ことが可能であることを見出した。 そして、 本測定系を使用し鋭意 検討を行なったところ、 リ ンパ腫、 特に瀘胞性リ ンパ腫患者におい て血清中のオー トタキシン濃度が高値を示すことが明らかとなった 。 悪性リ ンパ腫には、 大きく分けてホジキンリ ンパ腫と非ホジキン リ ンパ腫の 2つがあり、 日本では約 90 %が非ホジキンリ ンパ腫に分 類される。 非ホジキンリ ンパ腫は形態学的特徴 （病理学的分類） 、 細胞系質的特徴 （ " B細胞性、 T細胞性、 N K細胞性" ） 、 染色体 • 遺伝子情報などをもとに分類され、 W H O分類において非常に多 様な分類がなされており、 その一分類である濾胞性リ ンパ腫は日本 において悪性リ ンパ腫の 10〜 1 5 %との報告があり、 年々増加傾向が ある。 悪性リ ンパ腫の診断は、 リ ンパ節生検や胸部 X線検査 、 コ ンピュ一夕断層撮影 （CT) 、 核磁気共鳴検査 （MR I ) 、 ガリウム （G a) シンチグラフィー、 ポジ トロン ' ェミ ッショ ン ' トモグラフィ 一 ( PET) などによる病気の進行度などの検査がなされる。 血液検 查としては乳酸脱水素酵素 （LDH) 、 C反応性蛋白 （CRP) 、 可溶性 イ ンターロイキン - 2 ( I L- 2 ) 受容体 などがあるが、 いずれも悪 性リ ンパ腫特異的な診断マーカーではなく、 悪性リ ンパ腫の診断マ 一力一が切望されている。
オー トタキシンのヒ 卜組織あるいは体液中の存在濃度が様々な疾 病により変動することを示唆する報告がなされているが、 これまで その定量方法がないことより様々な疾病との因果関係の解析がなさ れてこなかった。 本発明によれば、 血清などのヒ ト検体中のオー ト タキシン濃度を簡便、 短時間、 かつ信頼性高く定量可能となった。 本測定方法、 測定試薬を用いることにより これまで明らかにされて いなかった様々な疾患とオー トタキシン濃度の関係を明らかにする ことが可能となった。 さ らに、 本測定系を用い鋭意検討を重ねた結 果、 これまで血清マーカーがなかったことより診断が煩雑、 困難で あった悪性リ ンパ腫、 特に濾胞性リ ンパ腫の検査が可能となった。 本発明者はヒ トオー ト夕キシンに対する抗体を用いた免疫化学的 測定方法を構築したことにより、 活性測定時に問題となる内在性物 質の影響を受けることなく、 また、 検体について前処理を必要とす ることなく ヒ トオー トタキシンを精度よく定量可能となった。 本測 定試薬を用い鋭意検討を重ねた結果、 悪性リ ンパ腫、 特に濾胞性リ ンパ腫患者において血清中のオー トタキシン濃度が高値を示すこと を見出し、 濾胞性リ ンパ腫の検査あるいは検査補助が可能な検査試 薬の提供が可能となった。 また、 煩雑さや精度は劣るもののオー ト タキシンが有するリゾホスフオ リパーゼ D酵素活性測定によっても 濾胞性リ ンパ腫の検査あるいは検査補助が可能である。
従って、 本願は下記の発明をも包含する ：
( 1 1 ) ヒ ト検体中のオー トタキシン濃度を測定し、 その値が健常 人測定値からなる正常値に対し有意差をもって高値を示した場合に 悪性リ ンパ腫と判断することを特徴とする悪性リ ンパ腫の検査方法
( 1 2 ) ( 1 1 ) の悪性リ ンパ腫が濾胞性リ ンパ腫であることを特 徵とする検査方法。
( 1 3 ) ( 1 1 ) のオー トタキシンが完全長のオー トタキシン、 部 分的に切断を受けたオー トタキシン、 一部遺伝子の変異を受けたォ 一ト夕キシンであることを特徴とする （ 1 1 ) 又は （ 1 2 ) の検査 方法。
( 1 4 ) ( 1 1 ) の検体が、 全血、 血球、 血清、 血漿などのヒ ト血 液成分あるいはヒ ト細胞、 組織の抽出液であることを特徴とする （ 1 1 ) 〜 （ 1 3 ) のいずれかに記載の検査方法。
( 1 5 ) ( 1 1 ) のオー トタキシン濃度測定方法が、 抗体を用いた 免疫化学的測定方法である （ 1 1 ) 〜 （ 1 4 ) のいずれかに記載の 検査方法。
( 1 6 ) ( 1 5 ) の抗体がモノクローナル抗体であることを特徴と する （ 1 1 ) 〜 （ 1 5 ) のいずれかに記載の検査方法。
( 1 7 ) ( 1 5 ) の抗体を検体と接触させ、 検体に結合あるいは結 合しなかった抗体を検出することにより検体中のオー トタキシン濃 度の測定を行なう こと特徴とする （ 1 1 ) 〜 （ 1 6 ) のいずれかに 記載の検査方法。
( 1 8 ) ( 1 4 ) の抗体を検体と接触させ、 抗体に結合あるいは結 合しなかったオー トタキシンを検出することにより検体中のオー ト タキシン濃度の測定を行なう ことを特徴とする （ 1 1 ) 〜 （ 1 6 ) のいずれかに記載の検査方法。
( 1 9 ) ( 1 5 ) 〜 （ 1 8 ) のいずれかに記載の方法が酵素標識、 アイソ トープ標識、 蛍光標識などを利用した競合法、 サンドイ ッチ 法あるいは蛍光偏光法等を利用したホモジニァス測定法、 表面ブラ ズモン共鳴分析法を利用した結合測定等であることを特徴とする （ 1 1 ) 〜 （ 1 8 ) のいずれかに記載の検査方法。
( 2 0 ) ( 1 1 ) 〜 （ 1 9 ) のいずれかに記載の測定方法を原理と することを特徴とずる悪性リ ンパ腫検査薬。
( 2 1 ) ( 1 1 ) 〜 （ 1 4 ) のいずれかに記載の方法がオー トタキ シンの有するリゾホスフオリパーゼ D活性の測定であり、 その値が 健常人測定値からなる正常値に対し有意差をもって高値を示した場 合に悪性リ ンパ腫と判断することを特徴とする検査方法。
( 2 2 ) ( 2 1 ) の測定方法を原理とすることを特徴とする悪性リ ンパ腫検査薬検体中のオー トタキシンを測定することによるリ ンパ 腫の検査方法。
上記発明によれば、 ヒ ト検体中のオー トタキシンを前処理などす る必要なく ヒ トオー トタキシン特異的モノクローナル抗体を用いた 定量試薬を使用しヒ ト検体中のオー トタキシン濃度を定量すること により悪性リ ンパ腫、 特に濾胞性リ ンパ腫の検査が可能である。 本 免疫学的定量試薬を用いれば検体中に含まれる内在性の測定妨害因 子や競合酵素の影響を受けることなく、 かつ短時間でヒ トオー ト夕 キシンを定量可能な検査薬を提供することが可能である。 また、 上 記発明によればリゾホスフオ リパーゼ D酵素活性測定によっても前 記免疫化学的定量方法に煩雑さ、 精度は劣るものの悪性リ ンパ腫の 判断が可能であり、 その検査薬の提供も可能である。 図面の簡単な説明
図 1 は、 ポリ ヒスチジンタグ標識ヒ トオー トタキシン精製品の S D S— P A G Eおよび、 抗オー トタキシンペプチド抗体を用いたゥ エスタンプロッティ ングの結果を示す。
図 2 は、 ヒ トオー トタキシンをィムノプレー トに直接結合させた 際の抗体の反応性を示す。
図 3 は、 抗ラッ ト I g G抗体を介してィムノプレー トに結合させ た抗ヒ トオー トタキシン抗体の溶液中に存在するヒ トオー ト夕キシ ンとの反応性を示す。
図 4は、 抗体による血清中ヒ トオー トタキシンのリ ゾホスフオ リ パーゼ D活性の吸収性能を示す。
図 5 は、 抗体による動物血清中オー トタキシンのリ ゾホスフオ リ パーゼ D活性の吸収性能を示す。
図 6 は、 全長ヒ トオー トタキシン精製品の S D S— P A G Eおよ び、 抗オー トタキシンペプチド抗体を用いたウエスタンプロッティ ングの結果を示す。
図 7 は、 抗ヒ トオー トタキシンモノクローナル抗体による 2抗体 サン ドイ ッチ法によるヒ トオー トタキシンとの反応性を示す。
図 8 は、 取得した抗ヒ トオー トタキシン抗体群を用いた組み合わ せ評価によるサン ドイ ッチ E L I S A測定系での反応性を示した。 図 9 は、 2抗体 2ステップサン ドイ ッチ E L I S A法を用い、 6 濃度 （ 0 , 0 . 3 4 , 0 . 6 7 5， 1 . 3 5， 2 . 7 0， 5 . 4 0 g /m L ) のヒ トオー トタキシン既知濃度標準品を測定した際のォ — トタキシン濃度と 4 5 O nmの吸光度の関係を示したグラフである 図 1 0は、 ヒ ト血清 4 2検体の 2抗体 2ステツプサン ドイ ッチ E L I S A法によるヒ トオー トタキシン濃度とリ ゾホスフオリパーゼ D活性の相関性を示す。
図 1 1 は、 2抗体 1 ステップサン ドイ ッチ E L I S A法を用い、 6濃度 （ 0 , 0 . 3 4 , 0 . 6 7 5 , 1 . 3 5， 2 . 7 0 , 5 . 4 0 g Xm L ) のヒ トオー トタキシン既知濃度標準品を測定した際の オー トタキシン濃度と 4 5 O nmの吸光度の関係を示したグラフであ る。
図 1 2は、 ヒ ト血清 4 2検体の 2抗体 1 ステップサン ドイ ッチ E L I S A法によるヒ トオー トタキシン濃度とリ ゾホスフオリパーゼ D活性の相関性を示す。
図 1 3は、 2抗体 1 ステップサン ドイ ッチ E L I S A法を用い P S A、 C A 1 9 — 9、 C A 1 5 3、 C A 1 2 5測定値がカッ トオフ を超える検体を用い、 健常人に対するオー トタキシン濃度を検証し た結果を示す。 いずれの検体群においても健常人に対し有意差 p < 0 . 0 0 1 を示した。
図 1 4は、 2抗体 1 ステップサン ドイ ッチ E L I S A法を用い慢 性肝疾患患者および健常人の血清中のヒ トオー トタキシン濃度を測 定した結果を示す。
図 1 5は、 精漿中のリゾホスフォ リパ一ゼ D活性測定の結果を示 す。
図 1 6 は、 6濃度標準品を用いた際の検量線を示す。 回帰式は L 0 g (R a t e ) = a L o g (C o n e ) 3 + b L o g (C o n e ) 2 + c L o g (C o n e ) + dで示ざれ、 表示している検量線の 各定数は、 a = _ 0. 1 2 2 7 8 7 7 0、 b = - 0. 3 0 0 6 8 2 5 5、 c = 1. 2 6 8 6 1 6 1 8、 d = 1. 5 6 2 0 1 6 0 0であ る。 R a t eは単位時間当たりの 4—メチルゥンベリ フエロンの生 成量 ( n m o 1 / L · s e c ) を示す。
図 1 7は、 男性血清のオー トタキシン濃度を測定し、 白血病、 悪 性リ ンパ腫ごとに分類した結果を示す。 縦軸はオー トタキシン （A T X) 濃度、 横軸は各病態分類を示し、 健常人 （NH S ) 、 A L ( 急性白血病） 、 C L (慢性白血病） 、 HD (ホジキンリ ンパ腫） 、 NH L (非ホジキンリ ンパ腫） 、 その他白血病、 リ ンパ腫 （others ) を示す。
図 1 8は、 女性血清のオー トタキシン濃度を測定し、 白血病、 悪 性リ ンパ腫ごとに分類した結果を示す。 縦軸はオー トタキシン （A T X) 濃度、 横軸は各病態分類を示し、 健常人 （NH S ) 、 A L ( 急性白血病） 、 C L (慢性白血病） 、 HD (ホジキンリ ンパ腫） 、 NH L (非ホジキンリ ンパ腫） 、 その他白血病、 リ ンパ腫 （others ) を示す。
図 1 9は、 男性血清のオー トタキシン濃度を測定し、 非ホジキン リ ンパ種ごとに分類した結果を示す。 縦軸はオー トタキシン （AT X) 濃度、 横軸は各病態分類を示し、 健常人 （NH S ) 、 B u r k
1 t t (バーキッ ト リ ンパ腫） 、 L B L (リ ンパ芽球性リ ンパ腫）
、 NH L ( C L ) (マン トル細胞リ ンパ腫） 、 NH L (D L B C L) (びまん性大細胞型 B細胞リ ンパ腫） 、 NH L ( F L) (濾胞 性リ ンパ腫） を示す。
図 2 0は、 女性血清のオー トタキシン濃度を測定し、 非ホジキン リ ンパ種ごとに分類した結果を示す。 縦軸はオー トタキシン （AT X) 濃度、 横軸は各病態分類を示し、 健常人 （NH S ) 、 N H L ( D L B C L) (びまん性大細胞型 B細胞リ ンパ腫） 、 NH L ( F L ) ('濾胞性リ ンパ腫） を示す。
図 2 1 は、 オー トタキシン （AT X) 濃度とリゾホスファチジン 酸 （L P A) 濃度の相関性試験の結果を示す。 発明を実施するための最良の形態
免疫抗原の調製のためのヒ トオー トタキシン遺伝子をコー ドする 核酸分子は、 ヒ トオー トタキシンの遺伝子情報をもとにしたポリヌ クレオチドプローブを使用して、 c D N Aライブラリーあるいはゲ ノムライブラリーよりスク リーニングすることにより得られる。 c DNAライブラリ一は、 公知の方法を利用して組織から RNAを単 離することにより容易に調製可能であり、 また市販のものを利用し てもかまわない。 得られたヒ トオー トタキシン c D NAを用い、 発 現用べク夕一に組換えることにより、 種々の発現系での抗原発現を 行なう ことができる。 また、 以降の抗原精製操作を簡便にするため にポリ ヒスチジン夕グゃ M y c夕グ等の汎用されているマーカー夕 グをヒ 卜ォ一 卜タキシン遺伝子の末端に導入することも有効である 。 蛋白質発現系は大腸菌、 酵母、 昆虫細胞、 動物細胞などいずれで もかまわないが、 大量発現が可能であり、 かつ糖鎖付加など天然形 態なヒ トォ一 卜タキシンに近い構造を有する蛋白質発現が可能であ る昆虫細胞—バキュロウィルス系が好ましい。 ポリ ヒスチジンタグ を有するォー 卜タキシンを発現させた場合は、 金属キレー 卜カラム などにより容易に精製可能である。 また、 c 一 m y cタグなどは抗 c— my c抗体ァフィ二ティ一カラムによる精製が可能である。 こ れらの方法は標準的であり充分技術確立されている。
本発明に用いる抗原免疫は技術確立されていれば手法を選ばず、 例えば精製抗原を動物に免疫することにより抗体の産生は可能であ る。 使用する動物は抗体産生能を有するものであれば特に制限され るものではなく、 マウス、 ラッ ト、 ゥサギなどの通常用いられる哺 乳動物でもかまわないし、 一 7 ト リ等を用いることも可能である。 たとえば 、 マウスを用いる場 O 、 精製ヒ トオー トタキシン抗原とフ 口イ ン 卜完全アジュバン 卜のェマルジヨ ンを皮下、 足底球 （ f o o t p a d ) 、 あるいは腹腔などに投与することにより免疫を行う。 必要に応じ精製抗原とフ□ィ ン ト不完全アジュバン トによる繰り返 し追加免疫を行なう ことによ 抗体価の上昇が望める場合もある。 細胞融合の数日前に最終免疫として、 アジュバン トとェマルジヨ ン 化することなく抗原のみを動物に投与する。 投与する抗原量は動物 体重あたり約 0 . g ―体重程度を目安に行えば良いが、 抗 原過少、 過多による免疫寛容を受けない抗原量であれば問題ない。 本発明に用いる八ィブリ ——マ細胞作製は技術確立されていれば 手法を選ばず、 電気的融合 、 ポリエチレングリコールなどの試薬を 用いた融合手段を選ばない。 例えば免疫を行なった動物の B細胞と ミエローマ細胞とをポリエチレングリコール存在下細胞融合を行い 、 H A T培地により抗体産生細胞の選択を行う ことにより得ること が可能である。 選択したハイプリ ドーマ細胞は限界希釈法によりモ ノクローン化を行なう ことによりモノクローナル抗体産生ハイプリ ドーマ細胞として樹立可能である。
本発明に用いるハイプリ ドーマ選択方法は、 通常の E L I S A方 法で行なわれるような免疫抗原を固相に結合させ、 固相表面に結合 した抗原に対する反応性による選択を行なわないことを特徴とする 。 その理由は、 抗原を固相に結合させた E L I S A法によるスク リ 一二ング方法では、 反応性を有する多くの抗体を取得可能であるも のの、 これら抗体のほとんどが血清中に存在するヒ 卜オー ト夕キシ ンを効率よく捕捉できないためである。 本発明に用いる抗体スク リ 一二ング方法においては、 ハイプリ ドーマ細胞培養上清中に含まれ る抗体を捕捉可能な 1次抗体、 又はその他の抗体結合性因子、 例え ばプロテイ ン A、 プロテイン Cなどをィムノプレー トに結合させる 。 例えば、 ラッ ト抗体取得を目的とする場合、 抗ラッ 卜ィムノグロ ブリ ン抗体をィムノプレー トに結合させる。 非特異的結合を防ぐた め、 1次抗体などを結合させたィムノプレー ト表面をゥシ血清アル ブミ ンなどでブロッキング処理を行った後、 細胞融合により得られ たハイプリ ドーマ細胞の培養上清をィムノプレー トに添加し、 1次 抗体などに捕捉させる。 未反応物質を除去するため、 P B S (リ ン 酸緩衝液） などの緩衝液によりィムノプレー トを洗浄後、 ポリ ヒス チジン一夕グを有する組換ヒ 卜オー トタキシン抗原 （ポリ ヒスチジ ン—タグ付ヒ トオー トタキシン） を添加する。 ポリ ヒスチジン一夕 グ付ヒ トオー トタキシンは、 リ ゾホスフオ リパーゼ D活性を有する ことを確認したものが好ましい。 一定時間の反応によりハイプリ ド 一マ培養上清中の抗体によりポリ ヒスチジン一夕グ付ヒ トオー ト夕 キシンを捕捉させる。 この際、 捕捉されるポリ ヒスチジン—タグ付 ヒ トオー トタキシンは生体中と同様に溶液中においても天然形態を 維持した状態を反映しているものと推測でき、 本反応によりポリ ヒ スチジン一夕グ付ヒ トオー トタキシンを捕捉可能なハイプリ ドーマ 培養上清中の抗体がヒ ト検体中のオー トタキシンを捕捉可能なこと が期待できる。 続いて捕捉されたポリ ヒスチジン一夕グ付ヒ トォー ト夕キシンのポリ ヒスチジンタグに対し、 酵素標識抗ポリ ヒスチジ ン抗体や酵素標識プローブである H i s P r o b e— H R P ( P i e r c e B i o t e c h n o l o g y , I n c . ， C a t . N o . 1 5 1 6 5 ) 等により、 抗体により捕捉されたポリ ヒスチジン— タグ付ヒ トオー トタキシンの検出を行なう。 最終的な検出は酵素に 対する発色、 蛍光、 化学発光基質等を用い行なう ことが可能であり
、 例えばペルォキシダーゼの基質である T M B (テトラメチルベン ジジン） などにより波長 4 5 0 nmの吸光度の発色検出が可能である 。 本方法で取得した抗体群のほとんどが、 ヒ トオー トタキシンを直 接ィムノプレー 卜に結合させた通常の E L I S A法では反応性を示 さず、 さらに直接結合抗原に反応性を示した抗体を用いての 2抗体 サンドイ ッチ免疫測定系構築は不可能であった。 すなわち、 直接ィ ムノプレー トに結合させた通常の E L I S A法では天然形態のヒ 卜 オー トタキシンを有効に捕捉可能な抗体取得は非常に困難であるこ とが示唆される。
本発明に使用する抗体の精製方法は、 技術確立されている手法で あればその手法は問わない。 例えば目的の抗体産生ハイプリ ドーマ の選択後、 限界希釈によりモノクローナル抗体産生ハイプリ ドーマ を樹立し、 細胞の培養上清を回収する。 必要に応じ硫酸アンモニゥ ム沈殿による抗体濃縮後、 プロテイ ン Aやプロテイ ン G固相化担体 を用いたァフィ二ティ一クロマ トグラフィーによりモノクローナル 抗体の精製を行う ことが可能である。 また、 精製した抗体はビォチ ン標識あるいはアルカリ性ホスファターゼ等の酵素により標識を施 すことにより ヒ トオー トタキシン 2抗体サン ドイ ッチ免疫測定系構 築の検証に使用することが可能である。 これらの方法は標準的であ り充分技術確立されている。
本発明において開示される天然形態ヒ トオー トタキシン測定方法 は、 天然形態ヒ トオー トタキシンを特異的に捕捉し、 その結果精製 した抗体一天然形態ヒ 卜オー トタキシン複合体を検出可能な方法で あれば手法を選ばない。 好ましくはィムノアツセィで汎用されてい る標識抗原と検体中の天然形態ヒ トオー トタキシンの抗体に対する 競合を利用した競合法、 ェピ トープの異なる 2抗体を用い天然形態 ヒ トオー トタキシンとの 3者の複合体を形成させるサン ドイ ッチ法 が簡便かつ汎用しやすい。 抗体を担体に結合させる場合、 担体とし てはィムノプレー ト、 ラテックス粒子、 磁性微粒子、 ニトロセル口 ース膜、 P V D F膜などィムノアツセィで使用されるものであれば 特に担体を選ばない。 担体を用いる場合、 担体に固定化した抗体に より捕捉したヒ トオー トタキシンの酵素活性を検出する方法、 ある いは抗体を固定化したチップに検体を接触させて天然形態ヒ トォ一 ト夕キシン結合依存的なシグナルを検出する表面プラズモン共鳴な どの方法でヒ トオー トタキシンの検出が可能である。 また、 蛍光標 識した抗体が天然形態ヒ トオー トタキシンと結合することによる蛍 光偏光を検出するようなホモジニァス測定方法においてもヒ トォ一 ト夕キシンの定量は可能である。 これら試薬、 装置は十分技術確立 されている。
前記の測定方法において特異性、 感度、 汎用性などの点からェピ トープの異なる 2抗体サン ドイ ッチ免疫測定方法が優れている。 本 測定系が構築可能な抗ヒ トオー トタキシンモノクロ ナル抗体の組 み合わせの選択は、 精製した抗体群と標識抗体群を用い、 組換えヒ 卜オー トタキシンをサンプルとしてサン ドイ ッチ測定系が構築可能 であるかの検証により行なう。 具体的には、 精製した未標識の抗天 然形態ヒ トオー トタキシンモノクローナル抗体をィムノプレー 卜に 結合させ、 ゥシ血清アルブミンなどでィムノプレー ト表面のブロッ キング処理を行う。 続いて、 組換えヒ トオー トタキシンをィムノブ レー トに添加し、 固相抗体に捕捉させる。 未反応物質を除去するた め P B Sなどの緩衝液でィムノプレー トを洗浄後、 標識を施した天 然形態ヒ トオー トタキシンに対する抗体を反応させ 2種類の抗体で の天然形態ヒ トオー トタキシンのサン ドイ ッチ複合体を形成させる 。 未反応物質を除去するため P B Sなどの緩衝液でィムノプレー ト を洗浄後、 抗体標識に酵素標識を行った場合は基質の添加を行い、 ピオチン標識などさ らに反応が必要な場合は酵素により標識ス ト レ ブトアビジンなどを反応させる。 標識酵素に対する発色、 蛍光、 化 学発光基質等を用い 2種の天然形態ヒ トオー トタキシン抗体により 捕捉された組換えヒ トオートタキシンの検出を行なう。 以上の実験 を組換えヒ トォー ト夕キシンを含まない緩衝液で同様に行いバック グラウンド値として用いる。 組換えヒ トオー トタキシンを用いた測 定値がバックグラウン ド低値でありかつ測定値に対し有意に高い組 み合わせをヒ 卜オー トタキシン免疫測定系候補とする。
前記の通りに選択したヒ トオー トタキシン 2抗体サン ドイ ッチ免 疫測定系候補の信頼性を検証するため、 組換ヒ トオー トタキシンお よびヒ 卜血清の希釈系列サンプルを準備し、 希釈倍率依存的に反応 性が認められるか検証を行う。 依存性が認められた抗体の組み合わ せにおいては、 さらにリ ゾホスフオ リパーゼ D酵素活性既知のヒ 卜 血清検体を使用し、 ヒ トオー トタキシン定量を実施し検証を行う。 すなわちリゾホスフオ リパーゼ D酵素活性に対するヒ 卜オー トタキ シン濃度の相関性を検証し、 リゾホスフオ リパ一ゼ D酵素活性とヒ トオー トタキシン濃度に相関性が認められる免疫測定系を選択する ことにより天然形態ヒ トオー トタキシン測定法と して選択する。 選択した 2種の抗体組み合わせを用い、 天然形態ヒ トオー トタキ シン測定試薬の調製を行う。 2ステップサン ドイ ッチ測定試薬の場 合、 2種の抗体の一方をィムノプレー ト、 磁性粒子など B Z F分離 可能な担体に結合させる。 結合方法は、 疎水結合を利用した物理的 結合、 2物質間を架橋可能なリ ンカ一試薬などを用いた化学的結合 、 いずれでもかまわない。 非特異的結合を避けるため担体表面を牛 血清アルブミ ン、 スキムミルクあるいは市販のィムノアッセィ用ブ ロッキング剤などでブロッキング処理を行ない 1次試薬とする。 2 次試薬として標識を施した、 異なるェピ トープを認識するもう一方 の抗体を含む溶液を準備する。 抗体標識はペルォキシダーゼ、 アル カ リ性ホスファタ一ゼなどの酵素、 蛍光物質、 化学発光物質、 ラジ オアイソ トープなどの検出可能な物質、 ピオチン、 アビジンなどの 特異的結合パー トナーが存在する物質などでの標識が好ましい。 ま た、 2次試薬溶液は抗原抗体反応が良好に行える緩衝液、 例えばリ ン酸緩衝液、 T r i s— H C 1 緩衝液などが好ましい。 実検体の測 定は、 1次試薬と実検体を一定時間、 一定温度のもと接触させる。 反応条件は 4〜 4 0での温度で 5分〜 3時間の反応が好ましい。 未 反応物質を B Z F分離により除去し、 続いて 2次試薬と一定時間、 一定温度のもと接触させサンドイ ッチ複合体を形成させる。 反応条 件に関しては 4〜 4 0 の温度で 5分〜 3時間の反応が好ましい。 未反応物質を B Z F分離により除去し、 標識抗体の標識物質を定量 し、 既知濃度ヒ トオー トタキシンを標準とし作成した検量線により 、 実検体中のヒ トオー トタキシン濃度を定量する。 1 ステップサン ドイ ッチ測定試薬の場合、 2ステップサン ドイ ッチ測定試薬と同様 、 担体に抗体を結合させブロッキング処理を行ったものを準備する 。 本抗体固相化担体に標識抗体を含む緩衝液を添加し試薬とする。 必要に応じ、 試薬を凍結乾燥品とすることも可能である。 1 ステツ プ試薬では抗原—抗体の使用量バランスにより抗原あるいは抗体の 過不足が生じ測定系構築が困難であることが多い。 本発明では E L I S A法の場合、 担体に結合させる抗体量を 9 6穴ィムノプレー ト 1 ゥエルあたり 5〜 5 0 0 ng、 好ましくは 1 0 0 ng、 標識抗体 1 〜 1 0 0 ng、 好ましくは 1 0 ngを使用することにより良好な結果が得 られる。 測定に用いるヒ ト検体は、 血清、 血漿、 尿、 精漿、 脳脊髄 液などがあるが、 用いる検体の希釈倍率は無希釈〜 1 0 0倍希釈で の使用が好ましく、 特に血清、 血漿においては 5倍希釈検体を 1 0 0 /! 、 精漿においては無希釈検体を I O O L用いることにより 良好な結果が得られる。
本発明による測定試薬により定量した検体中のヒ トオー ト夕キシ ン濃度はオー トタキシンの有するリ ゾホスフオ リパ一ゼ D活性と良 好な相関性を示す。
本発明による測定試薬を用い、 癌患者血清中のヒ トオー ト夕キシ ンを測定することによる癌の診断が可能である。 前立腺癌マーカー P S A、 消化器癌マ一カー C A 1 9 — 9、 乳癌マーカー C A 1 5 3 、 卵巣癌マーカー C A 1 2 5測定値がカッ トオフを超える検体のォ — 卜タキシン濃度と、 特に臨床症状を有しない健常人のオー トタキ シン濃度とを比較すると、 いずれの癌患者検体においても健常人群 に対し有意差 P < 0 . 0 0 1 を示し、 癌の診断あるいは診断補助が 可能である結果を示した。 特に、 乳癌、 卵巣癌、 においては健常人 に比較し顕著に高値を示し、 本測定試薬を用いた癌の診断あるいは 診断補助に有効な測定試薬である結果が得られた。
特に、 本測定試薬を用い、 患者検体中のヒ トオー トタキシンを測 定することにより悪性リ ンパ腫、 特に濾胞性リ ンパ腫の検査が可能 である。 白血病、 悪性リ ンパ腫と判断された患者検体中のオー ト夕 キシン濃度と、 特に臨床症状を有しない健常人のオー トタキシン濃 度とを比較すると、 非ホジキンリ ンパ腫患者において有意差をもつ て高値を示した。 また、 特に濾胞性リ ンパ腫において顕著に高値を 示し、 本測定試薬を用いた悪性リ ンパ腫、 特に非ホジキンリ ンパ腫 、 さ らには濾胞性リ ンパ腫の検査あるいは検査補助に有効な測定試 薬である結果が得られた。
本発明による測定試薬を用い、 慢性肝疾患患者血清中のヒ トォー ト夕キシンを測定することによる慢性肝疾患の診断が可能である。 慢性肝疾患患者ならびに健常人検体中のヒ トオー トタキシン濃度を 測定した結果、 有意差 p < 0. 0 0 0 1 にて慢性肝疾患患者血清中 のオー トタキシン濃度が高い結果が得られ、 慢性肝疾患診断あるい は診断補助に有用である結果が示された。 さらに、 他の慢性肝疾患 マ一カーとヒ トオー トタキシン濃度の相関性を検証した結果、 ヒア ルロン酸濃度、 血清アルブミン濃度、 総ピリルビン濃度、 血小板数 、 プロ トロンビン時間とヒ トオー トタキシン濃度の間に相関性が認 められ慢性肝疾患の程度を反映しており血清ヒ トオー トタキシン濃 度測定が慢性肝疾患診断に非常に有効であることが示された。 実施例
以下に実施例を示すが、 本発明は実施例に記載された例に限られ るものではない。
実施例 1 ： 組換えヒ トオー トタキシンの発現
A u t o t a x i n— t ( G e n b a n k a c c e s s i o n n u mb e r L 4 6 7 2 0 ) の塩基番号 1 一 2 5 8 9 (配列番 号 1 ) をヒ ト肝臓 c D NAライブラリ一より R T— P C Rを用い常 法に従いクローニングした。 本 c D NAをバキュロウィルス用 トラ ンスファーベクター p F A S T B a c — 1 (イ ンビ トロジェン） に 導入し、 B a c _ t o— B a c システム （イ ンビトロジェン） を用 い、 全長ヒ 卜オー トタキシン発現用バキュロウィルスをプロ トコ一 ルに従い調製した。 クロ一ニングした全長ヒ トオー トタキシン c D NAから停止コ ドン （TAA塩基配列 2 5 9 0 — 2 5 9 2 ) を除去 しヒスチジン 6残基を追加し、 ポリ ヒスチジンを有するポリ ヒスチ ジン一夕グ付ヒ トオー トタキシン発現用バキュロウィルスをプロ 卜 コールに従い調製した。 本バキュロウィルスを用い、 常法に従い、 s f 9あるいは s f 2 1などに感染させることにより全長ヒ トォ一 ト夕キシンおよびポリ ヒスチジン一タグ付ヒ トオー トタキシンを含 む発現培養上清を調製することができる
実施例 2 ： ポリ ヒスチジン一夕グ付ヒ トオー トタキシンの精製 ポリ ヒスチジン一夕グ付ヒ トオー トタキシン発現用バキュロウィ ルスを昆虫細胞 s f 2 1細胞 （ 5 X 1 05 eel ls/m L ) 1 Lに感染 させ、 2 8でにて 4 日間培養した。 培養終了後、 遠心分離 （ 3 0 0
O rpmにて 1 0分間） により細胞を分離し、 さ らに 0. 4 5 i mの フィル夕一により細胞破砕物などの沈殿物を除去した。 回収した培 養上清を T B S (T r i s b u f f e r s a l i n e ; 1 0 m
M T r i s - H C l , 1 5 0 mM N a C l , pH7. 4 ) により 透析後、 B D— TAL O N M e t a l A f f i n i t y R e s i n (B D B i o s c i e n c e s , C a t . NO. 6 3 5 0
1 ) 金属キレー トカラムを用い添付マニュアルに従い精製を行った
。 具体的には 5 mL容量のレジンをカラムに充填する。 本カラムに
5 O mMの C o C 12溶液を 5 O mL添加し、 コバルトを結合させ た。 3 0 O mMの N a C l を含む水溶液によりカラムを洗浄後、 5
O mMリ ン酸ナトリウム、 3 0 0 mMの N a C l 、 p H 7. 7の水 溶液 （洗浄緩衝液） によりカラムを平衡化した。 ポリ ヒスチジン一 夕グ付ヒ トォ一 ト夕キシンを含むサンプル 5 O mLを添加した。 1
0 O mLの洗浄緩衝液により未結合物質を洗浄し、 カラム通過溶液 の 2 8 0 nmの吸光度が 0. 0 1以下になったことを確認した。 1 0 mMのイミダゾールを含む洗浄緩衝液約 1 5 ml、 続いて 1 0 O mM のイミダゾールを含む洗浄緩衝液により 目的物をカラムから溶出し た。 溶出サンプルは 1 mLごとに回収し、 各画分中のポリ ヒスチジ ン—タグ付ヒ トオー トタキシンの純度を S D S— P AG Eにより検 証した。 初期画分は不純物を多く含むため回収せず、 目的ポリ ヒス チジン一夕グ付ヒ トオー トタキシンを主要に含む画分を回収混合し 、 精製ポリ ヒスチジン一夕グ付ヒ 卜オー トタキシン抗原として用い た。 図 1 はポリ ヒスチジン—タグ付ヒ トオー トタキシン精製品の S D S— P A G E像および、 抗オー トタキシンペプチ ド抗体を用いた ウエスタンプロッティ ングの結果を示す。 レーン Mは分子量マーカ 一を示す。 レーン 1 は ノレーンにて精製抗原を還元条件下 S D S— P AG Eを行い、 C B Bにより染色した像を示す。 レーン 2 〜 5はウエスタンブロッテイ ング像を示す。 0. ノレーン にて精製抗原を還元条件下 S D S— P A G Eを行った後、 P VD F 膜に転写し P V D F膜は 3 %スキムミルクを含む T B Sにより一昼 夜ブロッキング処理を行った。 T B Sにより洗浄後、 1 %ブロック エース （大日本製薬社製） および 0. 0 5 % Tw e e n 2 0 を 含む T B Sに浸透させた。 レーン 2は 1 g /mLのラッ ト抗ォ一 ト夕キシンペプチドモノクローナル抗体 （アミ ノ酸配列 4 9 一 5 9 (配列番号 2 ) を認識） 、 レーン 4は 1 ^ gZmLのゥサギ抗ォー ト夕キシンペプチドポリクローナル抗体 （アミ ノ酸配列 6 7 1 — 6 8 6 (配列番号 3 ) を認識） を加え 2時間反応させた （レーン 3 , 5のサンプルには抗体を加えない） 。 0. 0 5 % Tw e e n 2 0を含む T B S (T B S T) による洗浄後、 レーン 2および 3のサ ンプルには 0. 3 u gZmLのアルカ リ性ホスファターゼ標識抗ラ ッ ト I g G抗体 ( A m e r i c a n Q u a l e x社製 ； C a t . N o . A 1 0 3 A T) および 1 %ブロックエースを含む T B S Tを 添加し、 レーン 4および 5のサンプルには 0. 3 ^ g ZmLのアル カ リ性ホスファターゼ標識抗ゥサギ I g G抗体 （Z ym e d社製） および 1 %ブロックエースを含む T B S Tを添加した。 2時間反応 後、 T B S Tにより十分洗浄し、 C D P— S TA R ( P e r k i n E l m e r社製） を用いた化学発光を感光フィルムにより検出し た。 レーン 1 に示すとおり C B B染色像においては単一バン ドと し て確認された。 また、 抗ペプチド抗体を用いたウエスタンブロッテ イ ングの結果では、 アミノ酸配列 4 9— 5 9 (配列番号 2 ) 、 なら びにアミノ酸配列 6 5 2 — 6 6 6 (配列番号 3 ) を認識する 2種の 抗体により検出されることより、 本精製抗原が目的であるポリ ヒス チジン一夕グ付ヒ トオー トタキシンであることを確認した。 ウェス 夕ンブロッテイ ングでは 2本のバン ドが検出されており糖鎖の差、 あるいは培養、 精製過程での分解を示唆する結果が得られた。 実施例 3 ： モノクローナル抗体作製
ウィスター ' ルイス ' ラッ ト 7週令メスに対し、 抗原 2 5 0 / g をフロイ ン 卜の完全アジュバン トと共に後足にエーテル麻酔下によ り免疫を行なった。 1力月後、 ラッ 卜より鼠類リ ンパ節ならびに腸 骨リ ンパ節を採取し、 B細胞を回収した。 マウスミエローマ細胞株 P A I とポリエチレングリ コール存在下、 細胞融合を常法に従い行 い、 約 1 0 日間の HAT培地による選択を行ない、 実施例 4に従い 抗体産生細胞ハイプリ ドーマのスク リーニングにより 目的抗体の選 択を行った。 スク リーニング陽性ゥエル中の細胞を限界希釈法によ りモノクローナル化を行いハイプリ ドーマとして樹立した。 この際 、 HT培地により約 1 0 日間の培養を行った後、 最終的にハイプリ ドーマ用培地により培養を続け、 抗体回収のために培養上清を回収 した。 G I T培地 （大日本住友製薬） 5 0 0 mLに対し、 N C T C 一 1 0 9培地 （イ ンビトロジェン） 2 7. 5 mL、 不必須アミノ酸 (イ ンビトロジェン） 5. 5 mL、 ペニシリ ン/ス ト レプトマイシ ン /グルタミン酸 （イ ンビ トロジェン） 5. 5 mLをろ過滅菌し添 加したものをハイプリ ドーマ細胞培養用培地とした。 本培地に HA T ( S i m a - A l d r i c h C o . ， HY B R YMAX, C a t . N o . H 0 2 6 2 ) を添加したものを H A T培地として、 H T ( s i g m a― A 1 d r i c h C o , H Y B R Y M A X， C a t . N o . H 0 1 3 7 ) を添加したものを H T培地として用いた
実施例 4 ： ハイブリ ド マスク リーニング
抗ラッ 卜ィムノグロブリ ン抗体 （Am e r i c a n Q u a 1 e x , C a t . N o . A 1 0 3 U T ) を 9 6穴ィムノプレー ト （M a χ i S o r p ; N a 1 g e NUN C I n t e r n a t i o n a
1 ， c a t . N o . 4 3 0 3 4 1 ) に 2 o 0 n g /ゥエルにてコー ティ ングした。 旦、体的には、 抗ラッ トイムノグ uプリ ン抗体を T Β sにより希釈し 、 5 n g Z m L溶液を調製した 本溶液を 50 L ウェルにてィムノプレ ― トに添加し、 4でにて一昼夜保存した。 続いて T B Sにより 3回の洗浄後、 3 %—ゥシ血清アルブミ ン （Β S A ； b o v i n e s e r u m a l b u m i n ) を含む T B S 溶液を 2 5 0 LZゥエルにて各ゥエルに添加し、 室温で 2時間放 置した。 T B Sにより 3回洗浄を行い、 ハイプリ ドーマ細胞の培養 上清を 5 0 L ウエルにて添加し、 室温で 2時間放置した。 T B S Tにより 6回洗浄を行なった後、 0. 6 gZmLのポリ ヒスチ ジン一夕グ付ヒ 卜オー トタキシン、 0. 1 % Tw e e n— 2 0、 1 % B S Aを含む T B Sを 5 ゥエルにて添加し、 室温で
2時間放置した。 T B S Tにより 6回洗浄を行ない、 続いて 1 g /mLの H i s P r o b e _HR P ( P i e r c e B i o c t e c h n o 1 o g y , I n c . , C a t . N o . 1 5 1 6 5 ) 、 0. 1 % Tw e e n— 2 0、 1 % B S Aを含む T B Sを 5 0 / Lノ ゥエルにて添加し室温 3 0分放置した。 T B S Tにより 6回洗浄を 行ない、 TM B基質 （K i r k e g a a r d & P e r r y L a b o r a t o r i e s , I n c . ， C a t . N o . 5 0— 7 6 — 0 0 ) を 5 0 1 Zゥエルで添加し室温 3 0分放置した。 1 N—リ ン酸にて反応を停止し〇 D 4 5 0の吸光度を測定した。 この際、 ポ リ ヒスチジン—夕グ付ヒ トオー トタキシンを含まず、 それ以外の操 作を同時に行なったものを対照デ一夕として取得しバックグラウン ドとした。 対照データに対しポリ ヒスチジン一夕グ付ヒ トオー ト夕 キシン存在下で反応性を示したものを陽性クローンとして選択し、 限界希釈によりモノクローナル抗体産生細胞株の樹立を行った。 実施例 5 ： 抗体精製とピオチン標識
モノクローン化した抗体産生細胞の培養上清を回収し、 H i T r a p P r o t e i n G H P (G Eヘルスケア バイオサイエ ンス （株） ， C a t . N o . 1 7 - 0 4 0 5 - 0 1 ) により抗体の 精製を行った。 P B S ( p h o s p h a t e b u f f e r s a 1 i n e ； 1 0 m M リ ン酸、 1 5 0 mM N a C U pH 7. 4 ) で緩衝液置換した上記カラムに対し、 培養上清を流速 2 0 mL/mi nにて通過させた。 カラム容量の 5倍以上の P B Sにより十分カラ ムを洗浄し、 未結合蛋白質の除去を行った。 この際、 カラムを通過 した緩衝液の O D 2 8 0による吸光度が 0. 0 1以下になったこと を確認することにより、 未結合蛋白質が残っていないことの確認が 可能である。 カラム洗浄後、 l O O mM グリ シン、 p H 2. 5溶 出液により結合抗体を溶出させた。 溶出抗体は速やかに 1 Z 1 0容 量の 1 M T r i s 、 p H 8を添加し、 中性にするとともに T B S により速やかに透析を行った。 精製抗体の一部は抗体評価用に E Z - L i n k S u l f o - NH S - L C - L C - b i o t i n ( P i e r c e B i o c t e c h n o l o g y , I n c . , C a t . N o . 2 1 3 3 8 ) により ピオチンによる標識を行った。 実施例 6 ： モノクローナル抗体のヒ トオー トタキシンに対する反応 性評価
実施例 5により精製を行ったモノクローナル抗体のヒ トオー ト夕 キシンに対する反応性を直接ィムノプレー トにヒ トオー トタキシン をコーティ ングした際の反応性と溶液中に存在するヒ 卜オー トタキ シンへの反応性の 2通りの方法で検証した。 はじめにィムノプレー トにヒ トオー トタキシンをコーティ ングした実施例を示す。 精製し た組換え全長ヒ トオー トタキシンを 5 0 n g/ゥエル （ 1 g / L溶液を 5 0 ウエル） にて 9 6穴ィムノプレー ト （m a x i S o r p ; N a l g e UN C I n t e r n a t i o n a l , C a t . N o . 4 3 0 3 4 1 ) に添加し、 4 にて一昼夜保存しコ —ティ ングを行った。 続いて T B Sにより 3回の洗浄後、 3 % _ B S Aを含む T B S溶液を 2 5 0 L Zゥエルにて各ゥエルに添加し 、 室温で 2時間放置しブロッキングを行った。 T B Sにより 3回洗 浄を行い、 l x g ZmLの精製抗体および 1 % B S Aを含む T B S Tを 5 0 /ゥエルにて添加し、 室温で 2時間放置した。 T B S Tにより 6回洗浄を行なった後、 0. 3 g ZmLの H R P標識ャ ギ抗ラッ ト I g G抗体、 1 % B S Aを含む T B S Tを 5 0 L Z ゥエルにて添加し、 室温で 2時間放置した。 T B S Tにより 6回洗 浄を行ない、 TMB基質を 5 0 1 ウエルで添加し室温 3 0分放 置した。 1 N— リ ン酸により反応を停止し OD 4 5 0の吸光度を測 定した結果を図 2に示す。 縦軸にモノクローナル抗体の種類を、 横 軸に 4 5 O nmの吸光度を示す。
続いて、 溶液中のヒ トオー トタキシンに対する反応性を実施例 4 にならい検証した結果を示す。 抗ラッ トイムノグロブリ ン抗体を 9 6穴ィムノプレー ト （M a x i S o r p ) に 2 5 0 ng/ゥエルにて コーティ ングした。 T B Sにより 3回の洗浄後、 3 %— B S Aを含 む T B S溶液を 2 5 0 LZゥエルにて各ゥエルに添加し、 室温で 2時間放置しブロッキングした。 T B Sにより 3回洗浄を行い、 1 Ο /z g ZmL濃度の精製抗体を 5 ウエルにて添加し、 室温 で 2時間放置した。 T B S Tにより 6回洗浄を行なった後、 0. 6 gZmLのポリ ヒスチジン一タグ付ヒ トオー トタキシン、 0. 1 % Tw e e n - 2 0. 1 % B S Aを含む T B Sを 5 0 L ウ エルにて添加し、 室温で 2時間放置した。 T B S Tにより 6回洗浄 を行ない、 続いて l g ZmLの H i s P r o b e — H R P、 0. 1 % Tw e e n— 2 0、 1 % B S Aを含む T B Sを 5 0 L /ゥ エルにて添加し、 室温で 3 0分放置した。 T B S Tにより 6回洗浄 を行ない、 TM B基質を 5 0 a 1 Zゥエルで添加し、 室温で 3 0分 放置した。 1 N—リ ン酸により反応を停止し O D 4 5 0の吸光度を 測定した結果を図 3に示す。 縦軸にモノクローナル抗体の種類を、 横軸に 4 5 0 nmの吸光度を示す。 また、 バックグラン ドは抗ヒ トォ 一ト夕キシン抗体を含まない緩衝液での反応性を示す。
図 2 , 3の結果は通常のモノクローナル抗体作製時のスク リー二 ング方法である抗原を結合させた E L I S A方法においては、 今回 得られた血清中に存在するような天然形態のヒ トオー トタキシンを 効率よく捕捉可能な抗体群の取得が非常に困難であることを示して いる。 実施例 7 ： モノクローナル抗体による血清中のリゾホスフオ リパー ゼ D活性の吸収
抗体による血清中ヒ トオー トタキシンの吸収を血清リゾホスフォ リパーゼ D活性の吸収により検証した。 抗ラッ ト I g G抗体が固定 化された磁性微粒子 B i o M a g G o a A n t i — R a t I g G F c (Q I A G E N, C a t . N o . 3 1 0 1 4 4 ) 5 0 II L ( 5 0 %サスペンジョ ン溶液） に対し精製抗ヒ トオー ト夕キシ ン抗体 1 0 / gを添加し、 抗ヒ トオー トタキシン固定化磁性微粒子 を準備した。 未反応の抗体を T B S Tにより洗浄後、 T B S Tによ り 4倍希釈したヒ ト血清 2 0 0 /z Lを添加し、 2時間反応させた。 反応後、 磁石により磁性微粒子を除去し上清中のリゾホスフオ リパ ーゼ D活性を測定した。 抗ヒ トオー トタキシン抗体未添加の抗ラッ ト I g G抗体が固定化磁性微粒子により処理を行ったヒ ト血清のリ ゾホスフオ リパーゼ D活性に対する活性の阻害率を検証した結果を 図 4に示す。 縦軸にモノクローナル抗体の種類を、 横軸に活性阻害 率 （吸収率） を示す。 活性吸収率は抗ヒ トオー トタキシン抗体を含 まない緩衝液での残存活性に対する阻害活性を示す。 リゾホスフォ リパーゼ D活性測定は F E B S l e t t e r s 5 7 1 , 1 9 7 - 2 0 4 , 2 0 0 4を若干変更し行った。 具体的には、 サンプル 2 0 Lと 2 m Mのリゾホスファチジルコ リ ン （ 1 4 ： 0 —リ ゾホス ファチジルコ リ ン） 、 l O O mM T r i s — H C l 、 5 0 0 m M
N a C l 、 5 mM M g C 1 2 , 0. 0 5 % T r i t o n X 一 1 0 0 ( p H 9. 0 ) を含む基質溶液 2 0 ; Lを混合し、 3 7で にて 6時間から一昼夜反応させた。 続いて本酵素反応により生成し たコ リ ンを定量するため、 0. 5 mM T O O S (N—ェチルー N - ( 2 —ヒ ドロキシ— 3 —スルフォプロピル） 一 3 —メチルァニリ ン） 、 1 0 Unit/mL 西洋ヮサビペルォキシダ一ゼ、 0. 0 1 %
T r i t o n X - 1 0 0 , l O O mM T r i s - H C l (pH 8. 0 ) からなる R 1溶液 1 5 0 ^ Lを加え 5分間放置した後、 1 mM 4 一ァミノアンチピリ ン、 l O UnitZmL コ リ ンォキシダ ーゼ、 0. 0 1 % T r i t o n X _ 1 0 0、 l O O mM T r i s — H C l ( p H 8. 0 ) からなる R 2溶液 5 0 Lを加えた。 3 0分後、 既知濃度塩化コ リ ンを対象に 5 5 0 nmの吸光度を測定し 活性値とした。 抗体 R I O . 3 0および R 1 0. 3 1 を除く抗体で は吸収性能を発揮しており、 実施例 6における H i s P r o b e を 用いた溶液中の天然形態のヒ トオー トタキシンの結合性能を反映し た結果を示しており、 抗原を直接ィムノプレー トに結合させた結果 を反映しない。 抗体 R 1 0. 3 0および R 1 0. 3 1 において血清 から吸収性能と H i s P r o b e 一 H R Pを用いた測定での差は組 換えヒ トオー トタキシンと血清中に存在するヒ トオー トタキシンの 構造あるいは存在状態に差があり これら抗体が血清中のヒ トオー ト タキシンを認識できないことが推測される。 実施例 8 ： モノクローナル抗体の他動物種オー トタキシンへの反応 性確認
実施例 5により精製した代表的な抗体による動物血清中オー ト夕 キシンへの反応性を血清リゾホスフオ リパーゼ D活性の吸収により 検証した。 ス トレプトアビジンが固定化された磁性微粒子 B i o M a gス トレプトアビジン （Q I AG E N, C a t . N o . 3 1 1 7 1 1 ) 2 0 L ( 5 0 %サスペンジョ ン溶液） に対し実施例 5で作 製したピオチン標識抗ヒ トオー トタキシン抗体 1 を添加し、 抗ヒ トオー トタキシン固定化磁性微粒子を準備した。 未反応の抗体 を T B S Tにより洗浄後、 T B S Tにより 2. 5倍希釈した動物血 清 1 2 5 Lを添加し、 2時間反応させた。 反応後、 磁石により磁 性微粒子を除去し、 上清中のリ ゾホスフォ リパーゼ D活性を測定し た。 抗ヒ トオー トタキシン抗体未添加のス 卜レブ卜アビジン固定化 磁性微粒子により処理を行った動物血清のリ ゾホスフオ リパ一ゼ D 活性に対する活性の阻害率を検証した結果を図 5および表 1 に示す 。 縦軸に動物血清の種類を、 横軸に活性阻害率 （吸収率） を示す。 活性吸収率は抗ヒ トォ一 ト夕キシン抗体を含まない緩衝液での残存 活性に対する阻害活性を示す。 R 1 0 . 2 3 に代表されるようにヒ 卜オー トタキシンに特異的な抗体から、 何種かの動物オー ト夕キシ ンと交差反応性を示すものまで多様性に富んだ抗体群が取得できた 。 ェピ トープ位置の詳細な解析を、 オー トタキシン断片を大腸菌発 現させた抗原を用いて試みたが、 ほとんど全ての抗体が可溶性ォー ト夕キシン断片と反応性を示さず、 ェピ トープの特定に至らなかつ た。 しかし、 取得したモノクローナル抗体はヒ トオー ト夕キシン上 の異なるェピ トープを認識する抗体群で構成されていることが予想 され 2抗体を用いたサン ドイ ッチィムノアッセィ構築が可能性を示 唆する結果を得た。
表 1
抗体による動物血清中オー トタキシンのリゾホスフオ リパ一ゼ D活 性の吸収性能を示す。
10 %未満を一、 10〜50 %を十、 50 %以上を + +で示した。
Figure imgf000032_0001
実施例 9 ： ヒ トオー トタキシン標準品の調製
実施例 5で精製した抗体を用い抗体固定化担体を作製し、 抗原の 精製ならびにヒ ト血清から抗原の除去を行なったヒ トオー ト夕キシ ンゼロ血清の調製を行った。 これらを材料として用いヒ トオー ト夕 キシン免疫測定に用いる標準品 （ヒ トォ一 卜タキシン既知濃度サン プル） の調製を行った。 具体的には実施例 5 に従い精製を行ったモ ノクローナル抗体 R I O . 2 3を H i T r a p NH S—活性化 5 mLカラム （G Eヘルスケア バイオサイエンス （株） ， C a t . N o . 1 7 - 0 7 1 7 - 0 1 ) に対し 2 5 m gの抗体をマニュアル に従い結合させた。 本 R 1 0. 2 3結合カラムを用い、 0. 8 ^ m のフィル夕一により不純物を除去したヒ ト血清 2 0 O mLを l mL /m i nの流速で送液しカラム素通り画分を回収した。 本素通り画 分中のヒ トオー トタキシンは実施例 6記載の E L I S A測定法にお いて反応性を示さないことを確認した。 本品を標準品作製用のベー ス血清としさらに、 ゼロ濃度標準品とした。 精製抗原の調製は昆虫 細胞 · バキュロウィルス系で発現させた全長ヒ トォー ト夕キシンを 材料に行った。 培養上清 1 Lを R 1 0. 2 3結合カラムに流速 1 m L/m i nの流速にて送液し、 続いて P B Sにより未結合蛋白質の 洗浄を行った。 カラムを通過した P B Sの 2 8 O nmの吸光度が 0. 0 1以下になったことを確認し、 続いて 1 0 0 m Mグリ シン緩衝液 p H 3. 5を用い結合蛋白質を溶出させた。 溶出液は 1 1 0容量 の l M_ T r i s p H 8. 0を添加することにより中性に戻した 後、 T B Sにより速やかに透析処理を行なった。 図 6は全長ヒ トォ 一 ト夕キシン精製品の S D S— P AG E像および、 抗オー ト夕キシ ンペプチド抗体を用いたウエスタンブロッテイ ングの結果を示す。 図中レーン Mは分子量マーカ一を示す。 レーン 1 は 1 β gノレーン にて精製抗原を還元条件下 S D S— P AG Eを行い、 C B Bにより 染色した像を示す。 レーン 2〜 5はウエスタンプロッティ ング像を 示す。 すなわち 0. 2 5 /A gノレーンにて精製抗原を還元条件下 S D S— P AG Eを行った後、 P VD F膜に転写した。 ブロッキング 処理後、 レーン 2はラッ ト抗オートタキシンペプチドモノクローナ ル抗体 （ァミ ノ酸配列 4 9一 5 9を認識 （配列番号 2 ) 、 レーン 4 はゥサギ抗オー トタキシンペプチドポリクロ一ナル抗体 （アミ ノ酸 配列 6 7 1 _ 6 8 6 (配列番号 2 ) を認識） 、 レーン 3 , 5は抗ヒ トオー トタキシンを含まない非特異的結合検出のためのバックダラ ゥン ドとして検出を行った。 精製抗原は C B B染色像においては 2 本バン ドとして確認され、 抗ペプチ ド抗体を用いたウエスタンプロ ッティ ングにおいては実施例 2同様分子量 1 0 5 k D a付近に 2本 以上のバン ドが検出されており糖鎖の差、 あるいは培養、 精製過程 での分解を示唆する結果が得られた。 本精製全長ヒ トオー ト夕キシ ンを B C A蛋白定量キッ ト （ P i e r c e B i o t e c h n o l o g y , I n c . , C a t . N o . 2 3 2 2 5 ) により濃度測定し 、 ヒ トオー トタキシン濃度とした。 本精製ヒ トオー トタキシン抗原 を上記ヒ トオー トタキシン除去ヒ ト血清に添加し既知濃度標準品を 調製した。 実施例 1 0 ： サン ドイ ッチ E L I S A測定系用抗体組み合わせの選 択
精製抗体ならびにピオチン標識抗体を用い、 サン ドイ ッチ E L I S A測定系が構築可能な抗体の組み合わせ評価を行なった。 9 6穴 ィムノプレー ト （NUN C) に、 精製抗体 2 // g ZmLを含む T B S溶液を 5 0 ノウエルにて添加し、 一昼夜、 4でにて抗体プレ 一卜に結合させる。 T B Sにより 3回洗浄後、 実施例 9により精製 した組換え全長ヒ トオー トタキシンを E L I S Aアツセィ緩衝液 （ 3 % B S A、 1 0 mM M g C l 2、 0. 1 % Tw e e n 2 0 を含む T B S ) にて精製ヒ トオー トタキシン 1 0 O ngZmLにな るよう希釈し、 5 0 L/ゥエルにて添加した。 室温で 2時間放置 後、 T B S Tにより 4回洗浄し、 0. 8 g ZmLのピオチン標識 抗体を含む E L I S Aアツセィ緩衝液を 5 O jLi L /ゥエルにて添加 した。 室温で 2時間放置後、 T B S Tにより 4回洗浄し、 1 0 0 0 倍希釈した H R P標識ス トレプトアビジン （ Z ym e d社製） を含 む E L I S Aアツセィ緩衝液を 5 0 L Zゥエルにて添加した。 1 時間室温で放置後、 T B S Tにより 6回洗浄し、 TM B基質を 5 0 L /ゥエルで添加した。 室温 1 0分後、 1 N _ リ ン酸により反応 を停止し OD 4 5 0の吸光度を測定した。 図 7 に代表的な結果を示 す。 R 1 0. 2 1および R 1 0. 2 3に関してそれぞれをィムノプ レー トに 1次抗体としてコーティ ングし、 ヒ トオー トタキシンと反 応させた後、 他の抗体群を用いて 2抗体サン ドイ ッチ E L I S Aに より反応性を検出した結果を上段 （左図 R 1 0. 2 1、 右図 1 0 . 2 3をプレー トコー トした際の結果） を示す。 また、 同様に取得 抗体群をィムノプレー トに 1次抗体としてコーティ ングし、 R 1 0 . 2 1および R 1 0. 2 3を 2次抗体として用い反応性を検出した 結果を下段 （左図 R 1 0. 2 1、 右図 R 1 0. 2 3を検出用 2次抗 体と した際の結果） に示す。 横軸は使用した抗体 （上段 ： 2次抗体 、 下段 ： 1次抗体） 、 縦軸は 4 5 O nmの吸光度による反応性を示す 。 グラフ上段、 下段の比較より同じ抗体の組み合わせにおいても 1 次抗体、 2次抗体の用い方により反応性を示す場合、 示さない場合 が確認された。 図 8に取得した抗ヒ 卜オー トタキシンモノクローナ ル抗体を用いたサン ドイ ッチ E L I S Aでの反応性の一覧を示した 。 本結果で反応性を示さないものは、 サン ドイ ッチ E L I S A構築 が不可能である組み合わせを示しており、 反応性を示した組み合わ せは構築可能なことを示唆している。 横方向にィムノプレー トに結 合させた 1次抗体を、 縦方向に 2次抗体の名称を示している。 また 、 表中の数値は 4 5 0 nmの吸光度を示しており、 —は吸光度 0. 5 以下を示している。 組み合わせ評価全 5 2 9通りのうち 0. 5以上 の反応性を示した組み合わせは、 1 6通りであり、 全体の約 3 %で あった。 また、 実施例 6 との関連で図 2に示したヒ トオー ト夕キシ ンを直接ィムノプレー トに結合させた E L I S Aに反応性を示した R 1 0. 1 6、 R 1 0. 4 8、 R 1 0. 4 9の 3種のモノクローナ ル抗体を用いた組み合わせではサン ドイ ッチ E L I S Aを構築でき なかった。 すなわち、 ヒ 卜ォ一 卜タキシンを直接ィムノプレー 卜に 結合させた通常のスク リーニング方法により取得した抗体ではサン ドイ ッチ E L I S Aを構築できない、 あるいは構築することが非常 に困難であることを示唆しており、 本発明の手法による抗体スク リ 一二ング方法は非常に効果的な手法であることを示している。 実施例 1 1 ： 2ステツプサン ドイ ッチ E L I S A測定法によるヒ ト オー トタキシンの定量
実施例 9で反応性を示した抗ヒ トオー トタキシン抗体の組み合わ せを用い、 2ステップ 2抗体サンドイ ッチ E L I S Aによる血清中 のヒ トオー トタキシン測定系を構築した。 固相用抗体として R 1 0 . 2 3 を用い、 2次抗体として R 1 0. 2 1 を用い測定系の検証を 行った。 固相用抗体 R 1 0. 2 3はペプシン消化により F ( a b ) 2化し使用した。 実施例 9 と同様に R 1 0. 2 3を 9 6穴ィムノブ レー ト （N U N C社製） に 2 gZmL濃度で 5 0 L Zゥエルに て添加し、 一昼夜、 4 にてプレー トに結合させた。 T B Sにより 3回洗浄後、 3 % B S Aを含む T B Sを 2 5 0 L Zゥエルで添 加し 2時間ブロッキング処理を行った。 T B Sにより 3回洗浄後、 実施例 1 0で作製した標準品ならびに濃度未知のヒ ト血清を E L I S Aアツセィ緩衝液で 1 5に希釈し 5 0 x Lノウエルにて添加し た。 室温で 2時間反応後、 T B S Tにより 4回洗浄し、 0. 8 g ZmLのピオチン標識 R 1 0. 2 1 を含む E L I S Aアツセィ緩衝 液を 5 0 ^ L Zゥエル添加した。 室温で 2時間放置後、 T B S Tに より 4回洗浄し、 1 0 0 0倍希釈した HR P標識ス ト レブトァビジ ン （ Z ym e d社製） を含む E L I S A緩衝液を 5 O L ウエル 添加した。 1時間室温放置後、 T B S Tにより 6回洗浄し、 TMB 基質を 5 0 L ウエルで添加した。 室温 3 0分後、 1 N— リ ン酸 により反応を停止し 4 5 O nmの吸光度を測定した。 図 9にヒ トォー ト夕キシン既知濃度の標準品 6濃度 （ 0 , 0. 3 4, 0. 6 7 5 , 1 . 3 5， 2. 7 0 , 5. 4 0 z g ZmL) による検量線を示す。 検 量線の回帰は 3次回帰により行った。 ヒ トオー トタキシン濃度依存 的に 4 5 0 nmの吸光度上昇が確認された。 本検量線を用い未知濃度 のヒ ト血清で得られた 4 5 0 n mの吸光度より検体中のヒ トォー ト タキシンの濃度を算出した。 また、 測定に用いたヒ ト血清中のリ ゾ ホスフォ リパーゼ D活性を実施例 7 に従い決定し、 ヒ トオー トタキ シン濃度との相関性を検証した。 図 1 0はヒ ト血清 4 2検体の結果 を示しており、 横軸にリゾホスフオ リパーゼ D活性を、 縦軸にヒ ト オートタキシン濃度を示す。 血清中のヒ トオー トタキシン濃度とリ ゾホスフオ リパ一ゼ D酵素活性は相関係数 r = 0. 8 9 3 4と良好 な相関関係を示しており、 本サン ドイ ッチ E L I S A法により血清 中のオー トタキシン濃度定量が可能なことが示された。 実施例 1 2 ： 1ステツプサン ドイ ッチ E L I S A測定法によるヒ ト オー トタキシンの定量
実施例 1 0で反応性を示した抗ヒ トオー トタキシン抗体の組み合 わせを用い、 2抗体 1ステツプサン ドイ ッチ E L I S Aによる血清 中のヒ トオー トタキシン測定系を構築した。 固相用抗体として R 1 0. 2 3を用い、 2次抗体として R 1 0. 2 1 を用い測定系の検証 を行った。 固相用抗体 R 1 0. 2 3は F ( a b ) 2化し使用した。 2次抗体となる R 1 0. 2 1はアルカリ性ホスファターゼと S u 1 f o— S MC Cを用い酵素標識を行なった。 実施例 9 と同様に R 1 0. 2 3 を 9 6穴ィムノプレー ト （NUN C社製） に 2 g ZmL で添加し、 一昼夜、 4でにてプレー トに結合させた。 T B Sにより 3回洗浄後、 3 % B S Aを含む T B Sを 2 5 /ゥエルで添 加し 2時間ブロッキング処理を行った。 0. 5 7 g / m Lのアル カ リ性ホスファターゼ標識 R 1 0. 2 1 を含む E L I S Aアツセィ 緩衝液を T B S 5 0 a 1 Zゥエルで添加し、 速やかに— 4 0でに て凍結した。 一昼夜をかけて減圧下凍結乾燥品とし、 1ステップサ ン ドイ ッチ E L I S A測定試薬を作製した。 測定は、 実施例 1 0で 作製した標準品ならびに濃度未知のヒ ト血清を 0. 1 2 5 % T w e e n 2 0水溶液により 1 Z 5倍希釈し 5 0 L ウエルにて添 加した。 室温で 2時間反応後、 T B S Tにより 4回洗浄し、 TM B 基質を 5 0 ウエルで添加した。 室温 3 0分後、 1 N _リ ン酸 により反応を停止し 4 5 O nmの吸光度を測定した。 図 1 1 にヒ トォ — 卜タキシン既知濃度の標準品 6濃度 （ 0 , 0. 3 4, 0. 6 7 5 , 1. 3 5 , 2. 7 0 , 5. 4 0 g ZmL) による検量線を示す。 検 量線の回帰は 3次回帰により行った。 ヒ トオー トタキシン濃度依存 的に 4 5 0 nmの吸光度上昇が確認された。 本検量線を用い未知濃度 のヒ ト血清で得られた 4 5 O nmの吸光度より検体中のヒ トオー ト夕 キシンの濃度を算出した。 また、 測定に用いたヒ ト血清中のリゾホ スフオ リパーゼ D活性を実施例 7 に従い決定し、 ヒ トオー ト夕キシ ン濃度との相関性を検証した。 図 1 2は横軸にリゾホスフオ リパー ゼ D活性を、 縦軸にヒ トオー トタキシン濃度を示す。 血清中のヒ ト オー トタキシン濃度とリゾホスフオ リパーゼ D酵素活性は相関係数 r = 0. 9 1 8 5 と良好な相関関係を示しており、 本サン ドイ ッチ E L I S A法により血清中のオー トタキシン濃度定量が可能なこと が示された。 実施例 1 3 ： 1ステツプサンドイ ッチ E L I S A測定法による癌患 者検体のヒ トオー トタキシンの定量と診断
健常人検体および癌患者血清検体のヒ トオー トタキシン濃度の定 量を行い、 健常人に対する有意差を検証した。 癌患者血清としては 、 前立腺癌マーカー P S A (P r o s t a r e S p e c i f i c
A n t i g e n ) 、 消化器癌マ一カー C A 1 9 — 9、 乳癌マ一力 一 C A 1 5 3、 卵巣癌マーカ一 C A 1 2 5がカツ トオフを超える検 体を用い、 実施例 1 2に従い 1ステツプサン ドイ ッチ E L I S Aを 実施した。 それぞれの癌マ一力一は全自動ェンザィムィムノアッセ ィ装置 A I A— 6 0 0 II (T o s o h C o r p o r a t i o n ) 、 ならびに体外診断薬として製造承認を得ている各マーカー測定試 薬を用い実施した。 癌患者血清の陽性判断は、 P S A (> 1 0 ng/ m L ) 、 C A 1 9 - 9 (〉 3 8 ng/m L ) 、 C A 1 5 3 (> 2 3 ng /m L ) 、 C A 1 2 5 (> 3 2 ng/ n L ) とした。 図 1 3および表 2に結果を示す。 健常人血清中オー トタキシン濃度に対し、 いずれ の癌検体群も有意 （ P < 0. 0 0 1 ) に高値を示した。 本結果より 、 血清中のオー トタキシン濃度定量は癌の診断に有効であることが 示された。
表 2
2抗体 1ステップサン ドイ ッチ ELISA法を用い PSA、 CA19-9、 CA153 、 CA125測定値がカッ トオフ値を超える検体を用い、 健常人に対す るオートタキシン濃度を検証した結果を示す。 各検体群の測定数、 測定値平均、 標準偏差を表に示した。
Figure imgf000039_0001
実施例 1 4 : 1ステップサン ドイ ッチ E L I S A測定法による慢性 肝疾患患者検体のヒ トオー トタキシンの定量と診断
健常人検体 1 4 6検体および慢性肝疾患 （C L D ： C h r o n i c l i v e r d i s e a s e ) 患者血清検体 2 9検体のヒ トォ 一ト夕キシン濃度の定量を行い、 健常人に対する有意差を検証した 。 実施例 1 2に従い 1ステツプサン ドイ ッチ E L I S Aを実施した 。 図 1 4に結果を示す。 健常人 （ 1 4 9検体） 及び慢性肝疾患群 （ 2 7検体） の測定値平均土標準偏差はそれぞれ、 0. 7 5 6 ± 0. 0 4 5、 0. 1 8 6 6 ± 1. 2 4 4 ng/m Lであり、 有意差 pく 0 . 0 0 0 1 を示した。 また、 表 3 に慢性肝疾患患者検体 1 7例を用 い既存肝疾患マーカ一であるヒアルロン酸、 血清アルブミ ン、 総ビ リルビン濃度、 血小板数、 プロ トロンビン時間を測定値とオー ト夕 キシン濃度との閧係を示した。 いずれの既存マ一カーに対してもヒ 卜オー トタキシン濃度は相関性を示した。 本結果より、 血清中のォ 一ト夕キシン濃度定量は慢性肝疾患の診断あるいは診断補助に有効 であり、 かつその疾患の程度を反映することが示された。
表 3
慢性肝疾患 17例に対し、 ヒアルロン酸濃度、 血清アルブミ ン濃度、 総ピリルビン濃度、 血小板数、 プロ 卜ロンビン時間の測定を行レ 各検体のヒ トオー トタキシン濃度と比較した結果を一覧で示す。
Figure imgf000040_0001
実施例 1 5 ： ヒ ト精漿の測定
健常人精漿中のオー トタキシンの定量とリゾホスフオ リパーゼ D 活性測定を行った。 オー トタキシンの定量は、 全自動ェンザィムィ ムノアッセィ装置 A I A— 6 0 0 II (承認番号 1 3 B 3 X 9 0 0 0 2 0 0 0 0 0 3 ) を用いて行った。 2抗体 1ステップサン ドイ ッチ 測定試薬は、 実施例 1 2同様、 固相用抗体として F ( a b ) 2化尺 1 0. 2 3 を 1. 2 g 2次抗体と してアルカ リ性ホスファタ一 ゼ標識 R 1 0. 2 1 を 0. 用い、 5 %ゼラチン、 1 0 mM
M g C 1 2 を含む E L I S Aアツセィ緩衝液 5 を測定カツ プに分注し、 一昼夜凍結乾燥を行った。 本測定試薬を用い、 自動化 装置により測定を行った。 測定条件は、 2 0 Lの検体と 1 3 0 Lの 0. 1 % T r i t o n X _ 1 0 0溶液を測定カップに分注 し、 3 7 :にて 1 0分間反応を行った。 反応後コハク酸緩衝液によ り洗浄後、 4—メチルゥンベリ フェリルリ ン酸塩を添加し、 アル力 リ性ホスファタ一ゼにより分解、 生成した 4—メチルゥンベリ フエ ロンの単位時間当たりの生成濃度を測定することにより定量を行つ た。 ヒ トオー トタキシン既知濃度の標準品 6濃度 （ 0 , 0. 3 4, 0 . 6 7 5 , 1. 3 5 , 2. 7 0， 5. 4 0 g /m L ) による検量 線を用いた際の、 健常人オー トタキシン濃度は 0. 1 6 4 / gZm Lであった。 一方、 実施例 7に従い、 精漿中のリ ゾホスフオ リパー ゼ D活性を測定した結果、 図 1 5左に示すとおり、 基質であるリゾ ホスファチジルコ リ ン存在、 非存在下においてコ リ ン生成量に大き な差が認められず、 1 0倍希釈した精漿においても非常に高値を示 した。 基質非存在下で高値を示すことより、 内在性のコ リ ンを測定 していることが推測され、 その測定値から健常人精漿中のコ リ ン濃 度は、 約 4 0 mMと非常に高濃度であり、 実施例 7 によるリゾホス フオ リパ一ゼ D活性測定時の基質濃度が 2 mMであることより、 本 コ リ ン濃度を排除した測定を行うためには、 精漿検体を 1 0 0 0倍 程度希釈する必要がある。 本希釈操作によりオー トタキシンも同時 に希釈されるため、 酵素活性測定には長時間が必要であることが予 測される。 精漿中のリゾホスフォ リパ一ゼ D高値活性が内在性コ リ ンによるものであることを確認するため、 精漿検体を 8時間 T B S にて充分透析し低分子物質を除去した後のリ ゾホスフオ リパーゼ D 活性を図 1 5中央に示す。 透析により、 高値を示していたリ ゾホス フォ リパーゼ D活性であるコ リ ン生成量は 1 Z 1 0 0程度まで低下 した。 また、 透析後の精漿のリゾホスフオ リパ一ゼ D活性を測定し た結果、 図 1 5右に示すとおり、 基質非存在下に対し基質存在下で 酵素活性を確認できた。 基質非存在下では、 反応温度 4ででの酵素 反応を停止制御した際の測定値と同等であった。 これら、 結果より 、 精漿中には非常に高濃度のコ リ ンが存在し、 コ リ ン生成度を指標 としたリゾホスフオ リパーゼ D活性測定は困難であり、 本発明によ る免疫測定方法によりはじめて定量可能なことを示す結果である。 実施例 1 6 ： オー トタキシン測定試薬の調製
水不溶性担体 （内部にフェライ 卜を練り込んだ粒子径 1.5mm のエチレンピニルアルコール性） に抗ヒ トオー トタキシンモノクロ ーナル抗体 （R10.23) を l O O n g Z担体になるように 3 7でにて 一昼夜物理的に吸着させ、 その後 1 % B S Aを含む 1 0 O mMト リ ス緩衝液 （ p H 8. 0 ) にて 4 0 、 4時間ブロッキングを行ない 抗体固定化担体とした。 標識抗体は抗ヒ トオー トタキシンモノクロ —ナル抗体 （R10.21) をペプシン処理により F ( a b ) 2化した後 、 S P D P (N-スクシ二ミジル 3- [2-ピリジルジチォ]プロビオネ一 卜） を用いアルカ リ性ホスファターゼと結合させ酵素標識抗体とし た。 磁力透過性の容器 （容量 1. 2 mL) に 1 2個の抗体固定化担 体を入れた後、 l ^ g ZmLの標識抗体を含む緩衝液 （ 3 % B S A を含む トリス緩衝液、 P H 8. 0 ) 5 0 ^ Lを容器に添加し凍結乾 燥を施しオー トタキシン測定試薬とした。 オー トタキシン測定試薬 は窒素充填下密閉封印シールを施し測定まで 4でにて保管した。 実施例 1 7 ： ヒ トオー トタキシン標準品の調製
抗ヒ トオー トタキシンモノクローナル抗体 （R10.23) を用い抗体 固定化担体を作製し、 抗原の精製ならびにヒ ト血清から抗原の除去 を行なったヒ トオー トタキシンゼロ血清の調製を行った。 これらを 材料として用いヒ トオートタキシン免疫測定に用いる標準品 （ヒ ト オー トタキシン既知濃度サンプル） の調製を行った。 具体的には R1 0.23を H i T r a p NH S—活性化 5 mLカラム （G Eヘルスサ ィエンス， C a t . N o . 1 7 - 0 7 1 7 - 0 1 ) に対し 2 5 m g の抗体をマニュアルに従い結合させた。 本 R 1 0. 2 3結合カラム を用い、 0. 8 mのフィル夕一により不純物を除去したヒ ト血清 2 0 O mLを l mLZm i nの流速で送液しカラム素通り画分を回 収した。 本素通り画分中のヒ 卜オー トタキシンは実施例 1 6記載の 測定試薬にて反応性を示さないことを確認した。 本品を標準品作製 用のベース血清としさ らに、 ゼロ濃度標準品とした。 精製抗原の調 製は昆虫細胞 · バキュロウィルス系で発現させた全長ヒ トオー ト夕 キシンを材料に行った。 培養上清 1 Lを R 1 0. 2 3結合カラムに 流速 l mLZm i nの流速にて送液し、 続いて P B Sにより未結合 蛋白質の洗浄を行った。 カラムを通過した P B Sの 2 8 0 nmの吸光 度が 0. 0 1以下になったことを確認し、 続いて 1 0 0 m Mグリ シ ン緩衝液 P H 3. 5を用い結合蛋白質を溶出させた。 溶出液は 1 1 0容量の 1 M— T r i s p H 8. 0を添加することにより中性 に戻した後、 T B Sにより速やかに透析処理を行なった。 精製全長 ヒ トオー トタキシンを B C A蛋白定量キッ ト （ P i e r c e B i o t e c h n o l o g y , I n c . ， C a t . N o . 2 3 2 2 5 ) により濃度測定し、 ヒ トオー トタキシン濃度とした。 本精製ヒ トォ 一 ト夕キシン抗原を上記ヒ トオー トタキシン除去ヒ ト血清に添加し 既知濃度標準品を調製した。 実施例 1 8 ： オー トタキシン測定試薬の評価
実施例 1 6にて作製したオートタキシン測定試薬を用い実施例 1 7で作製した標準品を用い試薬性能評価を実施した。 評価用装置と して全自動ェンザィムィムノアッセィ装置 AIA- 1800 (東ソ一株式 会社製 ： 製造販売届出番号 1 3 B 3 X 9 0 0 0 2 0 0 0 0 0 2 ) を 用いた。 標準品濃度は 0、 0. 3 1 3、 0. 6 2 5、 1. 2 5、 2 . 5及び 5. 0 g ZmLの 6濃度標準品を使用した。 全自動ェン ザィムィムノアッセィ装置 AIA-1800の測定原理は標準品あるいは ヒ ト血清検体 2 0 ； Lと界面活性剤を含む希釈液 1 3 0 x Lを実施 例 1 6で作製したオー トタキシン測定試薬容器に自動で分注される 。 3 7で恒温下 1 0分間の抗原抗体反応を経て、 界面活性剤を含む 緩衝液にて 8回の洗浄が行われた後、 4ーメチルゥンベリ フェリル リ ン酸塩を添加し単位時間当たりの 4—メチルゥンベリ フエロン生 成濃度をもって測定値 （ n m o 1 /L · s e c ) とする。 標準品測 定時の測定値を表 4に、 そしてそれを用いた検量線を図 1 6に示す 。 また、 本検量線およびゼロ濃度標準品の （平均値 + 2 X標準偏差 ) より算出した最小検出感度は l l O n g ZmLであった。
表 4
Figure imgf000044_0001
実施例 1 9 ： オー トタキシン測定試薬の再現性試験
オー トタキシン測定試薬で得られる結果の再現性を検証するため 、 実施例 1 8で作成した検量線を用いてコン トロール検体 3例にて 再現性試験を実施した。 同時再現性として検体を 1 0重測定し変動 係数 （％ C V ： coefficient variation = 標準偏差ノ平均値 x 1 0 0 ) を算出し、 表 5に示す。 また、 数日おきに検体を測定し 0 日 目測定値からの変動ならびに全測定値の変動係数を算出し、 その結 果を表 6に示す。
表 5
同時再現性試験結果 （ / gZniL)
Figure imgf000045_0001
表 6
日差再現性試験結果 （ gZmL、 4重測定の平均値）
Figure imgf000046_0001
いずれの変動係数も 1 0 %以下を示しておりオー トタキシン測定 試薬にて得られる結果は信頼しうることが証明された。
実施例 2 0 ： 白血病、 悪性リ ンパ腫検体の測定
全自動ェンザィムィムノアッセィ装置 A I A - 6 0 O ilを使用し 、 健常人 1 2 0例、 白血病、 悪性リ ンパ腫 2 1 5例の血清検体をォ 一ト夕キシン測定試薬にて測定した。 その結果を表 7 に示す。
表 7
Figure imgf000046_0002
NHS ： 健常人
AL： 急性白血病
CL： 慢性白血病
HD： ホジキンリ ンパ腫
NHL： ホジキンリ ンパ腫 others その他白血病、 悪性リ ンパ腫
男性健常人 7 4例の測定値は平均値 0. 6 5 6 § /111し、 標 準偏差 0. 1 2 1 ^ gZmL、 最小値 0. 4 0 1 x g/mL、 最大 値 1. 0 8 8 ; g/mLであった。 また、 女性健常人 4 6例の測定 値は平均値 0. 8 5 2 / gZmL、 標準偏差 0. 1 8 4 z gZm L、 最小値 0. 6 2 1 8 11 し、 最大値 1. 5 9 0 / gZmLで あった。 白血病および悪性リ ンパ腫 2 1 5例の測定を実施した。 対 象検体は健常人、 急性白血病 （急性リ ンパ性白血病、 急性骨髄性白 血病） 、 慢性白血病 （慢性リ ンパ性白血病、 慢性骨髄性白血病、 前 駆リ ンパ球性白血病） 、 ホジキンリ ンパ腫、 非ホジキンリ ンパ腫 （ びまん性大細胞型 B細胞リ ンパ腫、 濾胞性リ ンパ腫、 マン トル細胞 リ ンパ腫、 バ一キッ トリ ンパ腫、 リ ンパ芽球性リ ンパ腫） 、 その他 白血病、 悪性リ ンパ腫 （慢性活動性 EBV感染症、 骨髄異形成症候群 、 多発性骨髄腫） であり、 それぞれの検体数も表 7に示す。 測定結 果は図 1 7及び 1 8に示すとおり、 非ホジキンリ ンパ腫において男 性、 女性いずれも有意差 Pぐ 0. 0 1をもって高値を示した。 実施例 2 1 ： 非ホジキンリ ンパ腫の詳細な評価
実施例 2 0で測定した非ホジキンリ ンパ腫をさらに詳細に分類し 、 評価を実施した。 その結果を表 8、 並びに図 1 9、 2 0に示す。 濾胞性リ ンパ腫において男性、 女性それぞれにおいて有意差 p < 0 . 0 5、 p < 0. 0 1をもって高値を示した。
表 8
Figure imgf000048_0001
NHS： 健常人
Burkitt： バーキッ ト リ ンパ腫
LBL： リ ンパ芽球性リ ンパ腫
MCL： マン トル細胞リ ンパ腫
DLBCL： びまん性大細胞型 B細胞リ ンパ腫
FL： 濾胞性リ ンパ腫 実施例 2 2 ： オー トタキシン濃度とリゾホスファチジン酸濃度の相 関性試験
オー トタキシンは生理活性脂質であるリゾホスファジン酸 （L P A) 産生を介して、 癌の浸潤及び転移と係わっていることが明らか となっている。 そこで、 血清中のオー トタキシン濃度を測定し、 L P A濃度との相関性を検討した。 L P A測定は C I i n . C h i m . A c t a 3 3 3 , 5 9— 6 7， 2 0 0 3に従い行った。 具体的 には、 測定試薬として以下の組成を含む 1 0 O mM H E P E S緩 衝液 （ p H 7. 6 ) を準備した。
(測定試薬組成）
2 0 k U/L リ ゾホスフオ リパ一ゼ （ E C . 3. 1. 1.
5 )
1. 3 k U/ L ペルォキシダ一ゼ
1 0 0 k U/ L グリセロール 3 リ ン酸ォキシダ一ゼ （G 3 P〇 ； E C 1. 1. 3. 2 1 )
1 0 k U/L グリセロール 3 リ ン酸脱水素酵素 （G 3 P D H ； E C 1. 1. 1. 8 ) 1 0 k U/ L a—ヒ ドロキシステロイ ド脱水素酵素 （H S D ； E C 1. 1 . 1. 5 0 )
1 0 U ニコチンアミ ド . アデニン ' ジヌク レオチド （N
A D H)
I mM コール酸 （ c h o l i c a c i d )
0 . 5 mM T O O S
I mM 4 ーァミ ノアンチピリ ン
0 . 0 1 % T r i t o n X— 1 0 0
測定は 9 Lの血清および L P A濃度既知の標準品を上記測定試薬 2 4 0 Lと混合後、 3 7でにてイ ンキュベー トし 7分後および 9 分後での 5 7 0 n mの吸光度を測定した。 7分から 9分までの測定 値の増加量 （ r a t 6値=吸光度/分） を算出し、 標準品測定値よ り作成した検量線を用い血清検体中の L P A濃度を算出した。 測定 検体中のオー トタキシン抗原濃度と L P A濃度の相関性を検証した 結果、 図 2 1 に示す通り、 相関係数 r = 0. 6 2 1 と良好な相関が 認められた （なお、 一般的に r = 0 . 5以上であればかなり高い相 関性があると判断できる） 。
従来 L P A濃度の測定は L P A自身が不安定であり、 かつ、 採血 後血清中に自然に生成されることから臨床での測定が困難であった が、 本発明によるオー トタキシン測定は容易であり、 かつ、 L P A 濃度と良好な相関性が得られた。 産業上の利用の可能性
本発明は、 ヒ ト検体中に含まれる天然形態のヒ トオー トタキシン に対する抗体、 ならびにそれを用いたヒ トオー トタキシンの定量方 法ならびに定量試薬に関する。 これらを用いることにより癌の診断 方法および肝臓疾患の診断方法が可能となる。 さ らに、 本発明は、 ヒ ト検体中に含まれるヒ トオー トタキシンを免疫学的に定量する方 法によって濃度を測定することにより、 これまで明確な血清診断マ 一力一がなかった悪性リ ンパ腫、 特に日本人の大多数を占める非ホ ジキンリ ンパ腫、 さらには濾胞性リ ンパ腫の検査、 あるいは検査補 助が可能となる。

Claims

1 . 変性を受けることなく生体内での存在状態にある天然形態の ヒ トオー トタキシンを特異的に認識する抗体のスク リーニング方法 であって、 以下の段階 ：
当該抗,体の候補抗体を補足可能な結合因子を固相に結合させ
請
当該結合因子に当該抗体の候補抗体を結合させ
当該候補抗体を作用させた系に天然形態ヒ トォ一ト夕キシンを作 用させ ； 次いで の 当該天然形態ヒ トオー トタキシンの範前記抗体に対する結合力を指 標に、 当該天然形態ヒ トオー トタキシンを囲特異的に認識する抗体を 選定する ；
を含んでなる方法。
2 . 前記結合因子が抗体である、 請求項 1記載の方法。
3 . 前記天然形態ヒ トオー トタキシンがポリ ヒスチジンタグを有 する組換ヒ トオー トタキシン抗原である、 請求項 1 又は 2記載の方 法。
4 . 前記ポリ ヒスチジンタグを有する組換ヒ トオー トタキシン抗 原に対し特異的に結合する標識された抗ポリ ヒスチジン抗体を利用 し、 前記天然形態ヒ トオートタキシンの前記抗体に対する結合力を 測定する、 請求項 3記載の方法。
5 . 前記標識された抗ポリ ヒスチジン抗体が酵素標識化抗ポリ ヒ スチジン抗体である、 請求項 4記載の方法。
6 . 変性を受けることなく生体内での存在状態にある天然形態の ヒ トオー トタキシンを特異的に認識する抗体であつて、 以下の段階
当該抗体の候補抗体を補足可能な結合因子を固相に結合させ 当該結合因子に当該抗体の候補抗体を結合させ ； 当該候補抗体を作用させた系に天然形態ヒ トオー トタキシンを作 用させ ； 次いで
当該天然形態ヒ トオー トタキシンの前記抗体に対する結合力を指 標に、 当該天然形態ヒ トオー トタキシンを特異的に認識する抗体を 選定する ；
を含んでなる方法により獲得可能な抗体。
7 . 前記結合因子が抗体である、 請求項 6記載の抗体。
8 . 前記天然形態ヒ トオー トタキシンがポリ ヒスチジンタグを有 する組換ヒ トオー トタキシン抗原である、 請求項 6又は 7記載の抗 体。
9 . 前記ポリ ヒスチジンタグを有する組換ヒ トオー トタキシン抗 原に対し特異的に結合する標識された抗ポリ ヒスチジン抗体を利用 し、 前記天然形態ヒ トオー トタキシンの前記抗体に対する結合力を 測定する、 請求項 8記載の抗体。
1 0. 前記標識された抗ポリ ヒスチジン抗体が酵素標識化抗ポリ ヒ スチジン抗体である、 請求項 9記載の抗体。
1 1 . ヒ ト検体中のオー トタキシン濃度を測定し、 その値が健常人 測定値からなる正常値に対し有意差をもって高値を示した場合に悪 性リ ンパ腫と判断することを特徴とする悪性リ ンパ腫の検査方法。
1 2 . 請求項 1 1記載の悪性リ ンパ腫が濾胞性リ ンパ腫であることを 特徴とする検査方法。
1 3 . 請求項 1 1記載のオー トタキシンが完全長のオー トタキシン、 部分的に切断を受けたオー トタキシン、 一部遺伝子の変異を受けた オー トタキシンであることを特徴とする請求項 1 1又は 1 2記載の検査 方法。
1 4. 請求項 1 1記載の検体が、 全血、 血球、 血清、 血漿などのヒ ト 血液成分あるいはヒ ト細胞、 組織の抽出液であることを特徴とする 請求項 11〜 13のいずれか 1項記載の検査方法。
15. 請求項 11記載のオー トタキシン濃度測定方法が、 抗体を用い た免疫化学的測定方法である請求項 11〜 14のいずれか 1項記載の検 查方法。
16. 請求項 15記載の抗体がモノクローナル抗体であることを特徴 とする請求項 11〜 15のいずれか 1項記載検査方法。
17. 請求項 15記載の抗体を検体と接触させ、 検体に結合あるいは 結合しなかった抗体を検出することにより検体中のオー トタキシン 濃度の測定を行なう こと特徴とする請求項 11〜 16のいずれか 1 項記 載の検査方法。
18. 請求項 14記載の抗体を検体と接触させ、 抗体に結合あるいは 結合しなかったオー トタキシンを検出することにより検体中のォー 卜タキシン濃度の測定を行なう ことを特徴とする請求項 11〜 16のい ずれか 1項記載の検査方法。
19. 請求項 15〜 18のいずれか 1項記載の方法が酵素標識、 ァイソ トープ標識、 蛍光標識などを利用した競合法、 サン ドイ ッチ法ある いは蛍光偏光法等を利用したホモジニァス測定法、 表面プラズモン 共鳴分析法を利用した結合測定等であることを特徴とする請求項 11 〜 18のいずれか 1項記載の検査方法。
20. 請求項 11〜 19のいずれか 1項記載の測定方法を原理とするこ とを特徴とする悪性リ ンパ腫検査薬。
21. 請求項 11〜 14のいずれか 1項記載の方法がオー トタキシンの 有するリゾホスフオ リパーゼ D活性の測定であり、 その値が健常人 測定値からなる正常値に対し有意差をもって高値を示した場合に悪 性リ ンパ腫と判断することを特徴とする検査方法。
22. 請求項 21記載の測定方法を原理とすることを特徴とする悪性 リ ンパ腫検査薬。
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