WO2007136112A1 - 嘔吐毒産生セレウス菌の検出方法及び当該方法のためのプライマーセット - Google Patents

嘔吐毒産生セレウス菌の検出方法及び当該方法のためのプライマーセット Download PDF

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WO2007136112A1
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bacillus cereus
seq
toxin
strain
pcr
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Takahisa Miyamoto
Hideaki Kamikado
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Kyushu University
Meiji Dairies Corporation
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    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers

Definitions

  • the present invention relates to a method for detecting vomiting toxin-producing Bacillus cereus, more specifically, a discrimination method for discriminating vomiting toxin-producing cereus bacteria and vomiting toxin-non-producing cereus bacteria, and a primer for the method Regarding the set.
  • Bacillus cereus (B. cereus) is an aerobic spore bacterium widely distributed in nature that can contaminate food and proliferate, causing food to rot. At this time, Bacillus cereus produces toxins, but there are some that cause food poisoning whose main symptoms are diarrhea or vomiting due to the difference in the toxins produced. Of these, the highest number of cases in Japan is due to vomiting toxins (seleulide).
  • Celeride is a low-molecular-weight cyclic peptide that is highly resistant to heat, acid, alkali, and digestive enzymes, and has the structure (D-0-Leu-D-Ala-LO-Val-L-Val).
  • Patent Document 1 discloses a gene sequence encoding the production enzyme.
  • Patent Document 2 a method for detecting cereulide-producing Bacillus cereus by PCR is described in, for example, the 26th Annual Meeting of the Japanese Society of Food Microbiology (Non-patent Document 1) JP 2005-57202 A (Patent Document 3).
  • Patent Document 1 International Publication WO 03/097821
  • Patent Document 2 Japanese Patent Laid-Open No. 2006-6256
  • Patent Document 3 Japanese Patent Laid-Open No. 2005-57202
  • Non-patent document 1 Takao Kawai et al., “Examination of detection method of cereulide-producing Bacillus cereus using PCR”, 26th Annual Meeting of the Japanese Society of Food Microbiology, 2005, p40 Disclosure of Invention
  • the present invention has been made in view of the above-mentioned problems, and discriminates so-called false-positive vomiting toxin-producing Bacillus cereus that has a vomiting toxin synthase gene but is negative in an animal cell vacuolation test. It is an object of the present invention to provide a method capable of reliably detecting only emetic toxin-producing Bacillus cereus that is positive in a cell vacuolation test.
  • RT-PCR is applied using a primer comprising the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 and Z or SEQ ID NO: 2 to discriminate between vomiting toxin-producing cereus bacteria and vomiting toxin-non-producing cereus bacteria
  • a primer comprising the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 and Z or SEQ ID NO: 2 to discriminate between vomiting toxin-producing cereus bacteria and vomiting toxin-non-producing cereus bacteria
  • a primer for detecting Bacillus cereus and a kit for distinguishing vomiting toxin-producing Bacillus cereus.
  • a primer set suitable for amplifying mRNA encoding an emetic toxin synthase is provided. Therefore, when RT-PCR is performed using the primer set of the present invention, an amplification product amount curve approximately proportional to the amount of emetic toxin production or the ability to produce emetic toxin can be obtained. From this amplification product amount curve, it is possible to determine whether it is a non-emetic Bacillus cereus. Thus, according to the present invention, it is possible to determine whether or not a false positive bacterium is extremely simple and reliable.
  • FIG. 3 is a diagram showing the results of electrophoresis of NA E £ 2RI digestion products.
  • Lane M shows the ⁇ Hind HI marker
  • Lane 1 shows the plasmid with the 6 kb DNA fragment inserted
  • Lane 2 shows the plasmid with the 8 kb DNA fragment inserted.
  • FIG. 2 A diagram showing the relationship between 6kb and 8kb Bacillus cereus No. 55 DNA E ⁇ RI digestion products and the 2205bp PCR product amplified with the (Try-Ala-1F)-(ER-2) primer set .
  • FIG. 3 is an electropherogram showing the results of Southern blotting analysis of various restriction digestion enzyme products of Bacillus cereus No. 55 DNA.
  • Lane 1 is the digestion product from ⁇ II
  • lane 2 is the digestion product from Pvu II
  • lane 3 is the digestion product from I.
  • FIG. 4 is an example of an amplification product amount curve by RT-PCR using the primer set of the present application.
  • FIG. 5 A graph comparing the amount of synthetic gene transcripts in emetic toxin producing strains, false positive emetic toxin producing strains, and non-emetic toxin producing strains.
  • the present invention is characterized by performing RT-PCR using a primer set having the nucleotide sequence shown by SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2, and discriminating between emetic toxin-producing Bacillus cereus and non-emetic toxin producing bacteria.
  • RT-PCR is a method in which an amplification product (nucleic acid) generated by the polymerase chain reaction (PCR) is detected simultaneously with amplification.
  • PCR polymerase chain reaction
  • For detection of the amplified nucleic acid there are a method using various fluorescent probes and a method using an intercalator fluorescent dye, and any method can be used in the present invention.
  • the primer used for RT-PCR generally has only to have a base sequence capable of amplifying a target nucleic acid. Therefore, in order to detect emetic toxin-producing Bacillus cereus by RT PCR, for example, it is represented by SEQ ID NO: 4 determined from the gene encoding cerreido synthase, which is the emetic toxin represented by SEQ ID NO: 3 (Tyr -Ala-1F) primer or the (ER-2) primer represented by SEQ ID NO: 5 can be used.
  • SEQ ID NO: 4 determined from the gene encoding cerreido synthase, which is the emetic toxin represented by SEQ ID NO: 3 (Tyr -Ala-1F) primer or the (ER-2) primer represented by SEQ ID NO: 5 can be used.
  • SEQ ID NO: 4 determined from the gene encoding cerreido synthase, which is the emetic toxin represented by SEQ ID NO:
  • a primer having the nucleic acid sequence shown by SEQ ID NO: 1 and a primer consisting of the nucleic acid sequence shown by SEQ ID NO: 2 that are suitable for amplifying mRNA transcribed from the gene encoding seleleido synthase are used. These primers are used as a forward primer (RT-f) and a reverse primer (RT-r), respectively. Normally, both are used as one set (one set). However, RT-PCR can be performed using either primer.
  • the amount of nucleic acid (amplification product amount) detected by RT-PCR increases logarithmically according to the amplification cycle and gradually reaches a plateau, as shown in FIG. 4, for example.
  • the number of cycles to start logarithmically increasing is considered to be proportional to the amount of cereulide produced (or the ability of Bacillus cereus to produce cereulide). Therefore, by examining the number of cycles at which the logarithmic increase starts, it is possible to determine whether the strain is a genuine vomiting toxin producing strain, a false positive producing strain, or a non-producing strain.
  • nucleic acid amount production curve (amplification product amount curve) created using a standard strain that produces vomiting toxin and a standard strain that does not produce vomiting toxin
  • a nucleic acid created using the detected strain (sample strain) Discrimination is made by contrasting the quantity production curves. If the production curve of the detected strain almost matches the production curve of the standard strain, the strain is an emetic toxin production strain, and if it almost matches the production curve of the non-producing strain, the strain is a non-producing strain (or a false positive strain). ).
  • the production curve of the detected strain is located between the production curve of the standard strain and the production curve of the non-producing strain, it has a false positive strain, that is, a cereulide synthase gene, but a non-emetic toxin producing strain.
  • a false positive strain that is, a cereulide synthase gene
  • a non-emetic toxin producing strain that is, a cereulide synthase gene
  • vomiting strains that produce vomiting toxins only to a degree that is negative in animal cell vacuolation activity since the expression level of mRNA and the production volume of vomiting toxin are considered to be proportional, the production volume of vomiting toxin can be measured quantitatively by examining the number of cycles starting to increase logarithmically, positive strains, false positives It is also possible to measure the productivity of the strain.
  • the method of performing PCR is not different from that of generally performed PCR.
  • the reaction can be carried out by changing the reaction conditions as appropriate, as long as the extraction method and reaction conditions for the nucleic acid to be amplified, various reagents used in RT-PCR, and the reaction conditions for PCR are used.
  • Bacillus cereus Only nucleic acids such as foods, feces and the like that are suspected of the presence of bacteria may be extracted.
  • the method of distinguishing Bacillus cereus of the present invention is to extract a powerful nucleic acid such as Bacillus cereus, amplify the extracted nucleic acid using the primer according to the present invention, and measure the temporal change in the amount of the amplified nucleic acid.
  • This is a method for distinguishing vomiting toxin producing strains from false positive strains (or non-producing strains).
  • the time-dependent change in the amount of nucleic acid amplified using the standard strain emetic toxin producing strain was measured in advance, the production curve of the standard emetic toxin producing strain was drawn, and the curve was established ( Or, if the amount of amplified product is larger than that, for example, in Fig.
  • vomiting can be achieved by comparing the amount of amplified product of the standard strain and the amount of amplified product of the sample strain in the vicinity of 24 to 26 cycles. It is also possible to determine whether the strain is a toxin-producing strain or a false-positive strain. In addition, using a vomiting toxin-producing strain, the number of cycles in which the amount of amplification product reaches a plateau (number of plateau cycles) and the amount of amplification product (plateau amplification amount) are confirmed, and after the plateau cycle of the detected strain (for example, FIG. In terms of 4, it is possible to distinguish between the two by comparing the amount of amplification product after 36 to 40 cycles).
  • the primer according to the present invention includes a nucleic acid partially modified by deletion, substitution, insertion or attachment as long as it exhibits the same function as these primers.
  • the primer set of the present invention is provided as a primer set for distinguishing Bacillus cereus, and in the same manner as other RT-PCR kits, the DNA amplification enzyme required for RT-PCR (for example, Taq DNA polymerase) and DNA synthesis reagents (dNTP and reaction buffer), amplified DNA detection reagents for detection of nucleic acids, and cDNA synthase, etc. are provided as a kit for distinguishing Bacillus cereus.
  • the conditions for PCR are determined as appropriate, and the conditions described in Example 2 are exemplified.
  • the DNA of the emetic toxin producing strain was digested with a restriction enzyme EmR I, and (Tyr-Ala-1F: SEQ ID NO: 4)-(ER-2 : SEQ ID NO: 5 )
  • the base sequences (SEQ ID NO: 6) of the digested products of about 6 kb and 8 kb detected by Southern analysis using the PCR product using the primer set as a probe were determined.
  • the PCR product was used as a probe, and the DNA of the vomiting toxin producing strain was analyzed. Partially determine the base sequence of the approximately 6.5 kb DNA fragment detected from the restriction enzyme II digested fragment, and combine it with the previous approximately 6 kb and approximately 8 kb base sequences, and the entire base sequence of the vomiting venom cereulide synthase gene. It was determined.
  • Genomic DNA of cereulide-producing Bacillus cereus was prepared by the cell strength DN easy Tissue Kit (manufactured by QIAGEN) obtained by culturing under optimal conditions and the Cetyltrimetylammonium bromide (CTAB) method.
  • CTCAB Cetyltrimetylammonium bromide
  • the primer (9R-f) shown in SEQ ID NO: 7 and the primer (9R-r) shown in SEQ ID NO: 8 were also probed, which also produced the first half partial force of the base sequence of about 14 kbp determined above.
  • the first half of about 14 kbp was used as the 9R probe set ((9R-f) -An electrophoretogram of Southern analysis using the PCR product obtained by amplification in (9R-r)) as a probe is shown in Fig. 3.
  • the base sequence shown in SEQ ID NO: 3 contained ORF1 up to 360-10535 bases and ORF2 up to 10579-18594 bases. Two large ORFs were found to be included.
  • the deduced amino acid sequence of ORF1 is shown in SEQ ID NO: 9, and the deduced amino acid sequence of ORF2 is shown in SEQ ID NO: 10. It was estimated that ORF1 encodes a protein with a molecular weight of 387624.5 consisting of 3391 amino acids, and ORF2 encodes a protein with a molecular weight of 304289.09 consisting of 2681 amino acids.
  • genomic DNA is digested restriction enzymes EcoR I, Hinc II, Pvu II , by S e h I It was. 1 ⁇ g of genomic DNA was used. Sterile water was added to the reaction solution composition shown in Table 1 so that the total amount was 50 1 and incubated overnight at 37 ° C (16 hours or longer). After mixing restriction enzyme digested product 301 and 1Z10 volume loading buffer (30% Glycerol, 50 mM EDT A, 0.25% Bromophenol blue 0.25% Xylene cyanol FF pH 7.0), 1.2% agarose gel The sample was charged in a sample groove and electrophoresed at an applied voltage of 100 V in TAE buffer (40 mM Tris-acetate, ImM EDTA, pH 8.0).
  • the agarose gel was prepared with TAE buffer. After the electrophoresis, the agarose gel was immersed in 1 ⁇ gZml of ethidium bromide solution for staining (Echipro staining), and the band was detected by irradiation with an ultraviolet irradiation device TFP-35M (manufactured by VIL BER LOURMAT).
  • PCR was performed on each prepared digested product of DNA under the following reaction solution composition and reaction conditions.
  • the enzyme either Tafl DNA polymerase or KOD Dash was used.
  • primer set (Tyr-Ala-lF)-(ER-2) is used as a probe, and for digestion products with restriction enzymes ns ⁇ , Pvu ⁇ , i ⁇ , a primer set (9R -f)-(9R-r) was used as a probe.
  • Tag DNA polymerase was used in the primer set (9R-f) — (9R-r), and KO D Dash was used in the primer set (Tyr-Ala-IF) — (ER-2).
  • ImM dNTPS manufactured by SIGMA 0.3 1 20 pmol/ ⁇ 1 Primer (Foward) 0.3 / zl
  • reaction solution was prepared in a 0.2 ml microtube, sterilized water was added so that the total amount was 151, and PCR was performed using TaKaRa PCR Thermal Cycler under the following conditions. The cycle of DNA denaturation, annealing, and extension reaction was repeated 34 times.
  • Each PCR reaction solution was electrophoresed in TAE buffer using a 1.2% agarose gel, and the amplification product was detected.
  • the target band was cut out from the gel, and the PCR product was purified using MinElute Gel Extraction Kit (QIAGEN) according to the attached protocol.
  • the purified DNA contains 1Z10 volumes of 3M CH COONa and 2.5 volumes of 99% ethanol.
  • PCR products were labeled by the following method using DIG DNA Labeling and Detection Kit (DIG-ELISA) nonradioactive (Roche).
  • the DNA solution 10 1 purified by the above method (DNA 2 ⁇ g) was transferred to a 0.2 ml microtube, sterilized water was added to make 15 ⁇ 1, heat-denatured at 95 ° C. for 10 minutes, and then rapidly cooled.
  • 2 1 hexanucleotide mixture Kit included
  • 2 ⁇ 1 dNTP labeling mixture Kit included
  • 1 ⁇ 1 Klenow enzyme Klenow enzyme
  • a complete digested product of the restriction enzyme was electrophoresed in a TAE buffer solution using a 1.2% agarose gel, and then the band was confirmed by an effective mouth staining.
  • the gel was washed with pure water and shaken in a hydrolysis solution (0.25 M HC1) for 20 minutes. Further, the mixture was shaken in a denaturing solution (0.5M NaOH, 1.5M NaCl) for 30 minutes, and alkali-denatured with 0.4M NaOH for 10 minutes.
  • a Hybond-N + nylon membrane (Amersham) was set on a vacuum transfer device (Bio CRA FT), and an alkali-denatured gel was placed thereon.
  • a sponge soaked with 0.4 M NaOH was placed on the gel, and 0.4 M NaOH was poured from above the gel, and suctioned at 50 to 70 mMHg, followed by alkali blotting for 90 minutes. After blotting was completed, the nylon membrane was rinsed with 2 ⁇ SSC (3M NaCl, 0.03M C H Na) and washed (2 min, 3 times).
  • the blotted membrane was placed in a hybrid bottle, and 15 ml of hybridization solution (5 X SSC, 0.5 w / v% blocking reagent (Roche), 0.1 lw / v% N Lauroyl sarcosine Sodium salt, 0.02 w / v% SDS) and use a rotary hybrid oven (Lab-Line Instruments or UVP Laboratory products) for 4 hours at 68 ° C. Cuped.
  • the probe prepared in (i) above was heat denatured at 95 ° C. for 10 minutes, then rapidly cooled, added to the hybrid bottle, and incubated at 68 ° C. for hybridization.
  • the membrane was first washed at 68 ° C and blotted, and then reacted with an alkaline phosphatase-labeled digoxigenin antibody-Fab fragment (Roche) for 30 minutes at room temperature. After washing, the color reaction solution (45 1 NBT solution (75 mgZml in 70% dimethylformamide) (Nanarai Lightesta), 35 ⁇ 1 X-phosphate solution (50 mgZml in DMF) (Nacalai Testa) 10 ml Membranes were incubated in Buffer 3) to develop color, and bands were detected.
  • an alkaline phosphatase-labeled digoxigenin antibody-Fab fragment (Roche) for 30 minutes at room temperature. After washing, the color reaction solution (45 1 NBT solution (75 mgZml in 70% dimethylformamide) (Nanarai Lightesta), 35 ⁇ 1 X-phosphate solution (50 mgZml in DMF) (Nacalai Testa) 10 ml Membranes were incuba
  • the EcoR I digested product was washed with lml of 70% Ethanol, then vacuum dried and dissolved in sterile water.
  • Tanol was added and left at room temperature for about 10 minutes, followed by centrifugation (20, 400 X g, 20 min, 4 ° C) to precipitate DNA. This precipitate was washed with 70% Ethanol and then vacuum-dried and dissolved in sterilized water.
  • Transformation plus EcoRI digested fragments ie about 6 kb and 8 kb of DNA
  • the nucleotide sequence of mid was determined by the Sanger method.
  • Non-ribosomal peptide synthase has a peptide synthesis unit that binds amino acids to one amino acid.
  • This peptide synthesis unit includes a condensation domain (C domain) that condenses amino acids, an adenylation domain (A domain) that activates amino acids, and a peptidyl carrier protein that carries amino acids.
  • C domain condensation domain
  • a domain adenylation domain
  • a peptidyl carrier protein that carries amino acids.
  • PCP d omain 0 for Sereurido will be configured also amino force of four, the estimated four units in Sereurido synthase, further and finally the peptide chain Chio esterase active site there Ru required cutting
  • the confirmed domain structure is shown in Table 2.
  • RT-PCR was performed using the synthesized primer set ((RT-f: SEQ ID NO: 1)-(RT-r: SEQ ID NO: 2)) to produce an emetic toxin producing strain, a false positive strain, and a non-producing strain. I tried to determine.
  • JCM2152 standard stock: preserved in RIKEN preservation facility
  • KF strain emetic toxin production strain: separated and stored at Kyushu University Agricultural Research Institute
  • No. 55 strain emetic toxin production strain
  • No. 11 Strains non-emetic toxin production, strains possessing vomiting toxin synthase gene: isolated and stored in Meiji Dairies Co., Ltd.
  • No. 17 strain non-emetic toxin production strain: the same as above
  • NO. 22 strain non-emetic toxin production strain
  • No. 4 strain vomiting
  • mRNA was extracted using the RNeasy Mini Kit (manufactured by QIAGEN) according to the attached protocol.
  • the cells were lysed after incubation at 37 ° C for 5 minutes in the presence of 5 mg Zml Lysozyme (Seikagaku Corporation) and 0.02 mg Zml N-Acetylm uramidase (Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd.). 15 sec, 37 ° C).
  • RNase-free DNase I Set manufactured by QIAGEN was used, and DNA digestion was performed 4 times according to the attached protocol.
  • RNA for reverse transcription (RT-R: SEQ ID NO: 2) or (16SrRNA-r: SEQ ID NO: 1 2)) in 2 ⁇ g, and add RNase-free water.
  • RNase-free water The 12 ⁇ l solution was incubated at 70 ° C. for 10 minutes and then ice-cooled for 5 minutes.
  • dNTP Mixture 2.5mMeach
  • 5X buffer 250mM Tris-HC1 (pH8.3), 15mM MgCl
  • each of the synthesized cDNAs 1 ⁇ m was used as a cage, and ((RT-f: SEQ ID NO: 1)-(RT-r: SEQ ID NO: 2) and (16SrRNA-f: SEQ ID NO: 11)-(16SrRNA-r : Quantitative PCR using a real-time PCR apparatus with both primer sets of SEQ ID NO: 12)) was performed to amplify a portion of the target genes, selelide synthase and 16S rRNA gene, and measure the amount of transcription.
  • Sterilized water was added to the above reaction solution to a total volume of 25 ⁇ 1, and PCR was performed using Mx3000P Real-Time PCR System (manufactured by STRATAGEN). Forty cycles of reaction were performed with heat denaturation, annealing, and elongation as one cycle.
  • Fig. 4 shows a curve indicating the amount of amplified product (nucleic acid amount) in RT-PCR.
  • Figure 5 shows a comparison of the amount of final transcripts.
  • the KF and No. 55 strains showed a sharp increase in the amount of amplified product even at almost the same cycle number, whereas the No. 11 strain had a larger amount of amplified product later than that.
  • the number of rise cycles of No. 11 strain was positioned between the emetic toxin producing strain and the non-emetic toxin producing strain.
  • the No. 11 strain was judged to be a false positive strain and could be distinguished from the KF strain that was judged as positive by other PCR methods (see Table 3).
  • the amount of the vomiting toxin synthetic enzyme transcript is about 5 for the KF strain (strongly vacuolating active strain) when No.
  • mice medium vacuolating active strain
  • No. 11 strain non-vacuum activated strain
  • animal cell vacuolation activity was proportional to the amount of emetic toxin synthase gene transcription.
  • No. 11 strain since the expression level of the emetic toxin synthase gene is low, emetic toxin The production amount was also very small, and it was considered difficult to determine whether it was a non-producing strain by the animal cell vacuolation activity measurement method.
  • the vomiting toxin production was considered to be different due to the difference in the mechanism of transcriptional expression of the emetic toxin synthase gene.
  • JCM2152 No. 17, 22, 4, and 42 strains that do not have other vomiting toxin synthase genes, no vomiting toxin synthase transcripts were detected by amplification.
  • the emetic toxin producing strain expressing the emetic toxin synthase could be specifically detected by real-time (quantitative) PCR using the primer set of the present invention.
  • the amount of transcript is proportional to the amount of animal cell vacuolation activity, and the amount of toxin produced is very small, so even if the strain is negative for vomiting toxin production in animal cell vacuolation tests, it possesses the vomiting toxin synthase gene. Then, the gene transcript was quantitatively detected.
  • the real-time (quantitative) PCR method using the primer set of the present invention can also determine the degree of emetic toxin production ability.

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Abstract

【課題】嘔吐毒合成酵素遺伝子を有するが動物細胞空胞化試験において陰性となるいわゆる擬陽性の嘔吐毒産生セレウス菌を判別し、動物細胞空胞化試験において陽性となる嘔吐毒産生セレウス菌のみを確実に検出できる方法を提供する。具体的には、配列番号１で示す塩基配列及び配列番号２で示す塩基配列を有する核酸をプライマーとしてＲＴ－ＰＣＲを行い、それにより増幅生産された核酸の生産量曲線から嘔吐毒産生セレウス菌と嘔吐毒非産生セレウス菌を判別する。

Description

明 細 書
嘔吐毒産生セレウス菌の検出方法及び当該方法のためのプライマーセッ 卜
技術分野
[0001] 本発明は、嘔吐毒産生セレウス菌の検出方法、より具体的に言うと、嘔吐毒産生セ レウス菌と嘔吐毒非産生セレウス菌を判別するための判別方法及び当該方法のため のプライマーセットに関する。
背景技術
[0002] セレウス菌 (B.cereus)は自然界に広く分布する好気性有芽胞菌で、食品を汚染し、 増殖して食品の腐敗を引き起こすことがある。この際、セレウス菌は毒素を産生する が、産生される毒素の違 、により下痢または嘔吐を主な症状とする食中毒を引き起こ すものがある。このうち、 日本で発生件数が多いのは嘔吐毒（セレゥリド）による食中 母 ¾る。
[0003] セレゥリドは熱、酸、アルカリ、消化酵素に対して耐性の強い低分子の環状ペプチド であり、 (D-0-Leu-D-Ala-L-O-Val-L-Val) という構造を示し、例えば、国際公開公
3
報 WO 03Z097821号 (特許文献 1)にその産生酵素をコードする遺伝子配列が 開示されている。
[0004] 一方、本願発明者らによって、セレゥリド産生株において特異的に DNAが増幅さ れるプライマーセットが見出され、セレゥリド合成酵素遺伝子を持つセレウス菌を特異 的に検出できるプライマーセットが特開 2006— 6256号公報 (特許文献 2)に開示さ れている。また、これら以外にも、 PCR法によってセレゥリド産生セレウス菌を検出す る方法が、例えば、第 26回日本食品微生物学会学術総会 講演要旨集 (非特許文 献 1)ゃ特開 2005— 57202号公報 (特許文献 3)に開示されている。
[0005] し力しながら、本願発明者らの研究によると、特許文献 2に開示されたプライマーセ ットを用いた PCR法で行ったセレゥリド産生菌の検出結果と、生化学的試験である動 物細胞空胞化試験における検出結果が一致しないことが確認された。つまり、セレゥ リド合成酵素遺伝子を有するが動物細胞空胞化試験において嘔吐毒陰性となる菌 株（以下「擬陽性嘔吐毒産生株」）が少数ながら存在し、嘔吐毒陰性であるにもかか わらず、嘔吐毒産生菌と判定される可能性があることが見出された。
[0006] 特許文献 1 :国際公開公報 WO 03/097821
特許文献 2：特開 2006— 6256号公報
特許文献 3：特開 2005 - 57202号公報
非特許文献 1：河合高生ら、「PCR法を用いたセレゥリド産生性セレウス菌検出法の 検討」、第 26回日本食品微生物学会学術総会 講演要旨集、 2005、 p40 発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0007] 本発明は、上記問題点に鑑みてなされたものであって、嘔吐毒合成酵素遺伝子を 有するが動物細胞空胞化試験において陰性となるいわゆる擬陽性嘔吐毒産生セレ ウス菌を判別し、動物細胞空胞化試験において陽性となる嘔吐毒産生セレウス菌の みを確実に検出できる方法を提供することを目的としている。
課題を解決するための手段
[0008] 本発明は、配列番号 1及び Z又は配列番号 2で示される塩基配列からなるプライマ 一を用いて RT— PCRを適用して、嘔吐毒産生セレウス菌と嘔吐毒非産生セレウス 菌を判別するセレウス菌の判別方法を提供する。また、それに用いられるセレウス菌 検出用のプライマー及び嘔吐毒産生セレウス菌の判別用キットを提供する。
発明の効果
[0009] 本発明によれば、嘔吐毒合成酵素をコードする mRNAを増幅するに適したプライ マーセットが提供される。従って、本発明のプライマーセットを用いて RT— PCRを行 えば、嘔吐毒の産生量若しくは嘔吐毒産生能にほぼ比例した増幅産物量曲線が得 られる。この増幅産物量曲線から、嘔吐毒非産生セレウス菌かどうかの判別ができる 。このように、本発明によれば、擬陽性菌カどうかの判定が極めて簡単かつ確実に行 える。
図面の簡単な説明
[0010] [図 1]クローンィ匕した嘔吐毒合成酵素遺伝子を含むと推定されるセレウス菌 No.55D NAの E£2RI消化産物について電気泳動を行った結果を示す図である。レーン Mは、 λ Hind HI marker,レーン 1は、 6kbDNA断片を挿入したプラスミド、レーン 2は、 8kb DNA断片を挿入したプラスミドにつ 、て示す。
[図 2]6kb、 8kbのセレウス菌 No. 55DNAの E^RI消化産物と、（Try- Ala- 1F)—（E R— 2)プライマーセットで増幅される 2205bpPCR産物との関係を示す図である。
[図 3]セレウス菌 No. 55DNAの各種制限消化酵素産物についてのサザンブロッティ ング分析結果である電気泳動図である。レーン 1は Ηί IIによる消化産物、レーン 2 は Pvu IIによる消化産物、レーン 3は Iによる消化産物についての結果である。
[図 4]本願のプライマーセットを用いた RT—PCRによる増幅産物量曲線の一例であ る。
[図 5]嘔吐毒産生株と擬陽性嘔吐毒産生株並びに嘔吐毒非産生株における嘔吐毒 合成遺伝子転写産物量を比較したグラフである。
発明を実施するための最良の形態
[0011] 本発明は、配列番号 1及び配列番号 2で示された塩基配列力 なるプライマーセッ トによる RT— PCRを行い、嘔吐毒産生セレウス菌と嘔吐毒非産生菌を判別すること を特徴とする。 RT— PCRは、ポリメラーゼ連鎖反応 (PCR)により生じた増幅産物 (核 酸)を増幅と同時に検出する方法である。増幅された核酸の検出には、各種蛍光プ ローブを用いる手法と、インターカレーター蛍光色素（intercalater dye)を用いる手法 があり、本発明においては、いずれの手法を用いることができる。
[0012] ところで、 RT—PCRに用いられるプライマーは、一般には、ターゲットとなる核酸を 増幅できる塩基配列を有するものであればよい。従って、嘔吐毒産生セレウス菌を R T PCRで検出するためには、例えば、配列番号 3で示された嘔吐毒であるセレゥリ ド合成酵素をコードする遺伝子から決定された配列番号 4で示される (Tyr-Ala-1F) プライマーや配列番号 5で示される（ER-2)プライマーを用いることができる。しかしな がら、これらのプライマーを用いた場合には、現実に嘔吐毒を産生する産生株のみ ならず、合成酵素を保有するが、現実には嘔吐毒を産生しないかあるいは嘔吐毒を 産生しても空胞化活性試験で陰性となる程度の嘔吐毒しか産生しな 、菌株 (擬陽性 株)をも検出されること〖こなる。そこで、擬陽性株を区別するため、本発明においては 、セレゥリド合成酵素をコードする遺伝子から転写された mRNAを増幅するに適した 配列番号 1で示される核酸配列力 なるプライマー及び配列番号 2で示される核酸 配列からなるプライマーが用いられる。これらのプライマーは、それぞれ Forward用プ ライマー（RT-f)及び Reverse用プライマー（RT-r)として用いられる。通常は両者を 1 組（1セット）として用いられる。もっとも、いずれか一方のプライマーを用いて RT—P CRを行っても差し支えな 、。
[0013] RT— PCRによって検出された核酸量 (増幅産物量）は、例えば図 4に示すように、 増幅サイクルに従って対数的に増加し、次第にプラトーに達する。対数的に増加を 開始するサイクル数は、セレゥリドの産生量 (若しくはセレウス菌のセレゥリド産生能） に比例すると考えられる。従って、対数的に増加を開始するサイクル数を調べること によって、真性の嘔吐毒産生株、擬陽性産生株、非産生株のいずれであるかを判定 することができる。すなわち、嘔吐毒を産生する標準株と嘔吐毒を産生しない標準株 を用いて作成された核酸量の産生曲線 (増幅産物量曲線)と、被検出株 (検体株)を 用いて作成された核酸量の産生曲線を対比させることによって判別される。被検出 株の産生曲線が、標準株の産生曲線とほぼ一致すれば、その株は嘔吐毒産生株で あり、非産生株の産生曲線とほぼ一致すればその株は非産生株 (若しくは擬陽性株 )であると判定される。そして、被検出株の産生曲線が、標準株の産生曲線と非産生 株の産生曲線の間に位置するようであれば、それは擬陽性株、つまりセレゥリド合成 酵素遺伝子を有するが、嘔吐毒非産生株 (若しくは嘔吐毒を産生するとしても動物細 胞空胞化活性で陰性を示す程度しか産生しな ヽ株)であるとして判定される。また、 mRNAの発現量と嘔吐毒の産生量は比例すると考えられるので、対数的に増加を 開始するサイクル数を調べることによって、嘔吐毒の産生量を定量的に測定したり、 陽性株、擬陽性株の産生能を測定したりすることも考えられる。
[0014] PCRの実施方法は一般的に行われる PCRと何ら変わるものではない。増幅の対象 となる核酸の抽出方法、 RT— PCRに用いられる各種試薬、 PCRの反応条件など公 知の抽出方法や反応条件で行えばよぐ適宜反応条件を変えて行うこともできる。ま た、核酸の抽出は分離されたセレウス菌力 行うのが望ましいが、目的となる核酸が 抽出できる限りにおいては、セレウス菌を分離することなぐ例えば嘔吐物ゃセレウス 菌の存在が疑われる食品、糞便等カゝら核酸のみを抽出してもよい。すなわち、本発 明のセレウス菌の判別方法は、セレウス菌など力 核酸を抽出し、抽出した核酸を本 発明によるプライマーを用いて増幅し、その増幅された核酸量の時間的変化を測定 することによって、嘔吐毒産生株と擬陽性株 (もしくはそれらと非産生株)を区別する 方法である。もっとも、予め標準株である嘔吐毒産生株を用いて増幅された核酸量の 時間的変化を測定し、標準的な嘔吐毒産生株の産生曲線を描いておき、曲線が立 ち上がったところ (あるいはそれよりも増幅産物量が多くなつたところ）のサイクル数、 例えば図 4で言うと、 24〜26サイクル付近における標準株の増幅産物量と検体株の 増幅産物量を比較することによって、嘔吐毒産生株であるか擬陽性株であるかどうか の判別を行うこともできる。また、予め嘔吐毒産生株を用いて、増幅産物量がプラトー になるサイクル数 (プラトーサイクル数)及び増幅産物量 (プラトー増幅量)を確認して おき、検出株のプラトーサイクル後（例えば、図 4で言うと、 36〜40サイクル後）にお ける増幅産物量を比較することによって、両者を判別することも考えられる。
[0015] セレウス菌には、セレゥリド産生株と擬陽性株とが存在することより、セレウス菌が保 有するセレゥリド合成酵素をコードする遺伝子は、その菌株によって異なると考えられ る。なお、本願で開示される配列番号 3に示された塩基配列は、特許文献 1に開示さ れたものとは異なる。
[0016] また、本発明によるプライマーには、これらのプライマーと同様の機能を発揮する限 りにおいて、欠失、置換、挿入若しくは付カ卩により一部が改変された核酸を含む。
[0017] 本発明のプライマーセットは、セレウス菌判別用のプライマーセットとして提供される 他、他の RT— PCR用キットと同様に、 RT— PCRに必要な DNA増幅用酵素（例え ば、 Taq DNA polymerase)や DNA合成試薬（dNTPや反応用緩衝液）、増幅された 核酸検出用の DNA検出試薬、さらには cDNA合成酵素などとセットされ、セレウス 菌判別用キットとして提供される。 PCRの条件は適宜定められ、実施例 2に記載され た条件が例示される。
実施例 1
[0018] 本発明に係るプライマーの設計にあたり、下記に述べるようにまず、嘔吐毒産生株 の DNAを制限酵素 EmR Iで消化し、 (Tyr-Ala-1F:配列番号 4) - (ER-2：配列番号 5 )プライマーセットを用いた PCR産物をプローブとしたサザン分析により検出した約 6 kb及び 8kbの消化産物の塩基配列（配列番号 6)を決定した。次に、この 5'末端側の 配列（（9R-f：配列番号 7) - (9R-r：配列番号 8) )をプライマーとした PCR産物をプロ ーブとして、嘔吐毒産生株の DNAの制限酵素 II消化断片から検出した約 6. 5k bの DNA断片の塩基配列を一部決定して、先の約 6kb及び約 8kbの塩基配列と併 せて嘔吐毒セレゥリド合成酵素遺伝子の全塩基配列を決定した。
[0019] 〔嘔吐毒セレゥリド合成酵素遺伝子の全塩基配列の決定〕
(1)ゲノム DNAの調製
セレゥリド産生セレウス菌のゲノム DNAは最適な条件で培養して得た菌体力 DN easy Tissue Kit (QIAGEN社製）及び Cetyltrimetylammoniumbromide (CTAB)法によ り調製された。ゲノム DNAの調製には、岩手大学農学部において嘔吐型食中毒事 件で分離され、明治乳業 (株)で保存された菌株 (E^sgm No. 55)が用いられた。
[0020] (2) EcoR Iによるゲノム DNA消化及び（Tyr-Ala-IF) - (ER-2)プライマーセットを用 いたサザン分析
次に、調製された E^sgm ゲノム DNAを制限酵素 E^R KTOYOBO社製）により 完全消化した。この完全消化した DNA断片について、（Tyr-Ala-1F:配列番号 4) -（ ER-2：配列番号 5)プライマーセットを用いて増幅して得られた PCR産物をプローブと してサザン分析を行ったところ、約 6kbと約 8kbの DNA断片が検出された。そして当 該 DNA断片をクローニングしてこれらの塩基配列を決定した。ゲノム DNAの E^R I 消化断片を組み込んだ形質転換体プラスミドの E^R I消化後の電気泳動図を図 1に 示す。
[0021] ここで決定した約 6kbpと約 8kbpの塩基配列とこれまでに決定して 、る配列を含 めた解析の結果 (特許文献 2、配列番号 5及び図 5参照）、これら 2つの DNA断片は 連続しておらず、間に 390bpの DNAが存在すると考えられた。ァライメントの結果、 この 390bpの配列は、既に塩基配列が決定されて!、る (Tyr-Ala-1F)- (ER-2)PCR産 物の内部に存在した。これら新しく決定した 6kb及び 8kbの DNA断片と (Tyr-Ala-1F )- (ER- 2)PCR産物の関係を図 2に示す。また、約 6kbおよび 8kbの DNA断片と中間 の 390bpの断片をあわせた合計 13, 605bpの DNP断片の塩基配列を配列番号 6と して示す。
[0022] (3) Hinc II、 Pvu II、 Iによるゲノム DNA消化及び 9Rプライマーセットによるサザ ン分析
次に、上記で決定された約 14kbpの塩基配列の前半部分力も作製された配列番 号 7で示されるプライマー（9R-f)及び配列番号 8で示されるプライマー（9R-r)をブロ ーブとして、調製された S^m ゲノム DNAの各種制限酵素 (Hinc II (NEB社製）、 P vu II (MBI社製）、 l I (NEB社製) )による消化産物のサザン分析を行ったところ、約 6. 5kbp( Pvu II消化産物と強くハイブリダィズした。そして、この消化産物をクロー二 ングして、その一部塩基配列を決定した。約 14kbpの前半を 9Rプローブセット（（9R- f) - (9R-r) )で増幅して得られた PCR産物をプローブとしたサザン分析の電気泳動図 を図 3に示す。
[0023] このァライメント解析を行ったところ、これは先に述べた約 14kbpの前半部分に結 合した。また、約 14kbpの後半部分は、 Ehling-Schulzらの報告している配列（Accessi on number :AY691650)と同一であり、彼らの報告している塩基配列（Accession numb er: AY691650)のうち終止コドンを含む配列をリバースプライマー、すでに決定した 14 kbpの最終部分をフォワードプライマーとして用い、 No.55株の DNAを铸型とする P CRにより、増幅される DNAの塩基配列を決定して、配列番号 3に示す 18594bpの 塩基配列を決定した。
[0024] 配列番号 3に示す塩基配列について、さらに解析をすすめたところ、この塩基配 列には、配列番号 3に示す塩基配列中 360— 10535塩基までの ORF1と 10579— 18594塩基までの ORF2の 2つの大きな ORFが含まれることが分かった。 ORF1の 推定アミノ酸配列を配列番号 9に、 ORF2の推定アミノ酸配列を配列番号 10に示す 。 ORF1は 3391アミノ酸力らなる分子量 387624. 5のタンパク質をコードし、 ORF2 は 2681アミノ酸からなる分子量 304289. 09のタンパク質をコードしていると推定さ れた。
[0025] これらの塩基配列の決定に際して行われた処理条件は下記の通りである。
(i)ゲノム DNAの制限酵素による処理
調製したゲノム DNAは制限酵素 EcoR I、 Hinc II、 Pvu II、 Seh Iによって消化され た。ゲノム DNAは 1 μ gが使用された。表 1に示す反応液組成に総量が 50 1となる ように滅菌水を加え、 37°Cで一晩（16時間以上)インキュベートした。そして、制限酵 素消化産物 30 1と 1Z10容量のローデイング緩衝液（30%Glycerol、 50mM EDT A、 0.25% Bromo phenol blueゝ 0.25% Xylene cyanol FFゝ pH7.0)を混合した後 、 1.2%ァガロースゲルの試料溝にチャージし、 TAE緩衝液（40mM Tris- acetate、 ImM EDTA、 pH8.0)中、 100Vの印加電圧で電気泳動を行った。ァガロースゲル は TAE緩衝液により調製された。泳動終了後、ァガロースゲルを 1 μ gZmlのェチジ ゥムブロマイド溶液に浸して染色 (ェチプロ染色）し、紫外線照射装置 TFP-35M(VIL BER LOURMAT社製）により照射してバンドを検出した。
[0026] [表 1] 制限酵素 10 X Buffer 100 μ g/ml BSA
EcoRl 5μ\( 40U) H buffer 5 μ 1 ―
Hinc II 5μ1( 50U) NEB buffer 3 5/zl 0.5 μΐ
Pvull 0.5μ1( 5U) Buffer G 5μΙ 0.5 μ\
Sphl 2 1(10U) NEB buffer 2 5μ\ ―
[0027] (ii)サザン分析法
(A)PCR産物の精製
調製された DNAの各消化産物について、以下の反応液組成、反応条件で PCR を行った。酵素は、 Tafl DNA polymerase, KOD Dashのいずれかを使用した。 EcoR I によるゲノム DNA消化産物については、プライマーセット (Tyr-Ala-lF)-(ER-2)を プローブとして、制限酵素 ns π、 Pvu π、 i ιによる消化産物については、プライマ 一セット（9R-f)- (9R-r)をプローブとした。また、プライマーセット（9R-f)—（9R-r)では 、 Tag DNA polymeraseを使用し、プライマーセット（Tyr- Ala- IF)—（ER- 2)では、 KO D Dashを使用した。
[0028] (a) Taa DNA polymerase
<反応液組成 >
10 X buffer for Tag DNA polymerase (SIGMA社製） 1.5^1
ImM dNTPS (SIGMA社製） 0.3 1 20pmol/ μ 1 プライマー (Foward) 0. 3/zl
20pmol/ μ 1 プライマー (Reverse) 0. 3/zl 铸型（32ngZwl) . 0^1
5UZ μ 1 Taq DNA polymerase (SIGMA) 0. 09^1
[0029] 上記反応液を 0. 2mlマイクロチューブ中で調製し、全量が 15 1になるように滅 菌水をカ卩え、 TaKaRa PCR Thermal Cycler (TaKaRa社製）若しくは Thermo Hybaid P CR Express (Thermo BioAnalysis社製）を用いて以下の条件で PCRを行った。 DNA の変性、アニーリング、伸長反応のサイクルを 35サイクル繰り返した。
<反応条件 >
前熱処理： 95。C、 3. Omin
DNAの変性： 95。C、 1. Omin
アニーリング： 52。C、 1. Omin
伸長反応： 72。C、 1. Omin
[0030] (b) KOD Dash
<反応液組成 >
KOD Dash 10 X PCR buffer (TOYOBO社製;） 1. 5^1
2mM dNTPs (TOYOBO社製） 1. 5^1
20pmol/ μ 1 プライマー（foward) 0. 3^1
20pmol/ μ 1 プライマー (reverse) 0. 3μΙ 铸型（32ngZwl) 1. 0 1
2. 5UZ μ 1 KOD Dash (TOYOBO社製;） 0. 079 μ 1
[0031] 上記反応液を 0. 2mlマイクロチューブ中で調製し、全量が 15 1になるように滅 菌水をカ卩え、 TaKaRa PCR Thermal Cyclerを用いて以下の条件で PCRを行った。 D NAの変性、アニーリング、伸長反応のサイクルを 34サイクル繰り返した。
<反応条件 >
前熱処理： 95°C、 3. Omin
DNAの変'性： 95°C、 1. Omin
アニーリング： 42°C、 1. Omin 伸長反応： 72°C、 1. Omin
[0032] 上記各 PCR反応液を 1. 2%ァガロースゲルを用いて TAE緩衝液中で電気泳動 後、増幅産物を検出した。 目的のバンドをゲルから切り出し、 MinElute Gel Extraction Kit (QIAGEN社製)を用いて、付属のプロトコールに従って PCR産物を精製した。精 製した DNAに、 1Z10容量の 3Mの CH COONa及び 2. 5容量の 99%エタノール
3
を加え、 80°Cで 20分間放置した後、遠心分離（20, 400 X g、 20min、 4°C)して DNAを沈殿させた。この沈殿を真空乾燥させ、滅菌水に溶解させた。
[0033] (B)ジゴキシゲニンによる DNAの標識
DIG DNA Labeling and Detection Kit (DIG— ELISA) nonradioactive (Roche社製） を用いて以下の方法で PCR産物を標識した。上記方法で精製した DNA溶液 10 1 (DNA2 μ g)を 0. 2mlのマイクロチューブに移し、滅菌水を加えて 15 μ 1とし、 95°C で 10分間熱変性させた後、急冷した。 2 1のへキサヌクレオチド混合液 (Kit付属）、 2 μ 1の dNTPラベリング混合液（Kit付属）及び 1 μ 1の Klenow enzyme (Kit付属）を添カロ 、混合後、 37°Cで 18時間インキュベートした。 2 1の 0. 2M EDTA(pH8. 0)をカロ え、 65°Cで 10分間加熱して反応を停止させ、これをプローブ溶液とした。
[0034] 制限酵素による完全消化物を 1. 2%ァガロースゲルを用いて、 TAE緩衝液中 で電気泳動後、ェチブ口染色でバンドを確認した。次にゲルを純水で洗浄し、加水 分解液（0. 25M HC1)中で 20分間振とうした。さらに変性溶液（0. 5M NaOH, 1 . 5M NaCl)中で 30分間振とうし、 0. 4M NaOHで 10分間アルカリ変性を行った 。 Hybond- N+ナイロン膜（アマシャム社製）をバキュームトランスファー装置（Bio CRA FT社製）にセット後、その上にアルカリ変性させたゲルを載せた。ゲルの上に 0. 4M NaOHをしみ込ませた海綿をのせ、その上から 0. 4M NaOHを注ぎ、 50〜70m mHgで吸引し、 90分間アルカリブロッテイングした。ブロッテイング終了後、ナイロン 膜を 2 X SSC (3M NaCl, 0. 03M C H Na )で濯ぎ、洗浄した（2min、 3回）。
6 5 3
[0035] ハイブリボトルにブロッテイングした膜を入れ、 15mlのハイブリダィゼーシヨン溶 液（5 X SSC、 0. 5w/v%ブロッキング試薬（Roche社製）、 0. lw/v%N ラウロイル サルコシンナトリウム塩、 0. 02w/v%SDS)を加え、回転式ハイブリオーブン（Lab- Li ne Instruments社製又は UVP Laboratory products社製）を用い、 68°Cで 4時間イン キュペートした。上記 (i)で調製したプローブを 95°Cで 10分間熱変性させた後、急冷 し、これをハイブリボトルに加え、 68°Cでー晚インキュベートしてハイブリダィゼーショ ンを行った。
[0036] 膜をまず 68°Cで洗浄し、ブロッテイングした後、アルカリフォスファターゼ標識ジ ゴキシゲニン抗体— Fabフラグメント (Roche社製）と 30分間室温で反応させた。洗浄 後、発色反応液（45 1の NBT溶液（75mgZml in 70% dimethylformamide) (ナ 力ライテスタ社製）、 35 μ 1の X—リン酸溶液（50mgZml in DMF) (ナカライテスタ社 製）を 10mlの Buffer 3〖こ添加したもの）中で膜をインキュベートして、発色させ、バンド を検出した。
[0037] (iii)制限酵素消化断片のクローニング
ゲノム DNAの制限酵素 (E^R I及び Ε Μ Π)の消化断片を下記の方法で精製した 後、それぞれ Lamda ZAP II Predigested EcoRl/CIAP Treated Vector Kit (Stratagene 社製）及び Clone Smart Blunt Cloning Kit (Lucigen Corporation社製）を用いてクロー ユングを行った。
A. EcoR I消化断片の精製方法
EcoR I消化産物を lmlの 70%Ethanolで洗浄した後、真空乾燥させ、滅菌水に 溶解させた。
B. Pvu II消化断片の精製方法
Pvu II消ィ匕産物に、等量の TE飽和 Pheno卜 Chloroform- Isoamylalcohol (容量比 2 5 : 24 : 1) (pH7. 9)混合液を加えよく混合した。遠心分離（20、 400 X g、 10min、 4 °C)して、水層を新しい 1. 5mlのマイクロチューブに分取し、等量の Chloroform- Isoa mylalcoholを加え混合した後、再度遠心分離（20、 400 X g、 10min、 4°C)した。水 層を分取し、これに 1/10容量の 3M CH COONa (pH5. 2)、 2. 5容量の 99%ェ
3
タノールを加え室温で 10分程度放置し、遠心分離（20、 400 X g、 20min、 4°C)し、 DNAを沈殿させた。この沈殿を 70%Ethanolで洗浄した後、真空乾燥させ滅菌水に 溶解させた。
[0038] (iv)塩基配列の決定
EcoR I消化断片、すなわち約 6kb及び 8kbの DNAを組み込んだ形質転換プラス ミドは、 Sanger法によって、塩基配列を決定した。また、さらに上流部分を含むと思わ れる約 6. 5kbの Pvu II断片についても同様に塩基配列を決定した。
[0039] 上記のようにして配列が決定された約 6kb及び 8kbのアミノ酸配列及び約 6. 5kbの アミノ酸配列について、 GenomeNet及び NCBIの BLAST programを用い、 nucleic acid データベース、 proteinデータベースにおける相同性検索を行ったところ、 Gramicidin S synthetase Iや Tyrocidine A synthetase IIなどの非リボソーム性ペプチド合成酵素 遺伝子の一部と高い相同性が認められた。
[0040] さらに proteinデータベースにおけるモチーフ検索も行った。非リボソーム性ぺプチ ド合成酵素には 1つのアミノ酸に対し、その活性ィ匕ゃアミノ酸同士の結合を行うぺプ チド合成ユニットがある。このペプチド合成ユニットには、アミノ酸同士の縮合を行うコ ンデンセーシヨンドメイン（C domain)、アミノ酸の活性化を行うアデ-レーシヨンドメィ ン (A domain)、アミノ酸を運搬するぺプチジルキャリアプロテインが含まれる（PCP d omain) 0セレゥリドは 4種のアミノ酸力も構成されるため、セレゥリド合成酵素には 4つ のユニット、さらに最後にはペプチド鎖切断に必要なチォエステラーゼ活性部位があ ると推定されるが、これらのドメインの存在もモチーフ検索の結果、確認された。確認 されたドメイン構造を表 2に示す。
[0041] [表 2]
推定ドメィン アミノ酸配列番号 塩基配列番号 開始コドン 1 1 360—362
A domain 145— 588 792— 2122
snort chain denydrogenase 924— 1096 3129— 3647
PCP domain 1246—1310 4095— 4289
C domain 1330— 1632 4367— 5255
A domain 1818— 2220 5811— 7019
PCP domain 2305— 2368 7272-7463
C domain 2382— 2681 7503—8402
C domain 2842-3142 8883— 9785
終止コドン 1 3391 10533—10535 開始コドン 2 1 10549— 10551
A domain 215— 656 11191—12516 short cnain dehydrogenase 967— 1145 13447— 13983
PCP domain 1286— 1350 14404— 14598
C domain 1373- 1674 14665— 15570
A domain 1858—2250 16120— 17298
PCP domain 2334— 2397 17548— 17739
Thioesterase domain 2425—2681 17821— 18591 終止コドン 2 2682 18592— 18594
実施例 2
[0042] 〔tom ^嘔吐毒セレゥリド合成酵素発現株のリアルタイム PCRによる検出〕
、て、開始コドンと推定される領域を含む DNA塩基配列力 転写される mRNA を検出するために有効なプライマーセットを設計、合成した。そして合成されたプライ マーセット（（RT- f:配列番号 1) - (RT-r：配列番号 2) )を用いて RT— PCRを行 、、嘔 吐毒産生株、擬陽性株及び非産生株の判別を試みた。
[0043] JCM2152 (標準株:理化学研究所保存施設に保存）、 KF株（嘔吐毒産 生株:九州大学農学研究院で分離保存)、 No. 55株 (嘔吐毒産生株)、 No. 11株（ 嘔吐毒非産生、嘔吐毒合成酵素遺伝子保有株：明治乳業 (株)で分離保存)、 No. 17株（嘔吐毒非産生株：同前）、 NO. 22株（嘔吐毒非産生株：同前) No. 4株（嘔吐 毒非産生株：同前）、 No. 42株 (嘔吐毒非産生株：同前）につ 、て判別を試みた。用 いた S^^em 菌株の性状を表 3にまとめた。
[表 3]
Figure imgf000016_0001
(+++：強い、 ++：中程度、 +陽性、 -：陰性)
[0045] 種々の E^^gm 菌株を最適条件で培養後に集菌した菌体から、 RNeasy Mini Kit ( QIAGEN社製）を用いて、付属のプロトコールに従い、 mRNAを抽出した。なお、菌 体の溶菌は 5mgZmlLysozyme (生化学工業社製）及び 0. 02mgZmlの N- Acetylm uramidase (大日本製薬社製)存在下で、 37°C5分間インキュベートした後、超音波処 理（30W、 15sec、 37°C)によって行った。また、 RNAへのゲノム DNAの混入を防ぐ ために RNase- free DNase I Set (QIAGEN社製）を用いて、付属のプロトコールに従い DN A消化を 4回行った。
[0046] 抽出した RNAを铸型として、セレゥリド合成酵素遺伝子の cDNAを合成した。また 、常にその転写量が一定である 16SrRNAの cDNAも同時に合成した。 RNA1. 2 μ gに 2種の逆転写用プライマー（（RT- R:配列番号 2)又は（16SrRNA-r：配列番号 1 2) )をそれぞれ 20pmolずつ混合し、 RNase- free waterをカ卩えて 12 μ 1とした溶液を 7 0°Cで 10分間インキュベート後、 5分間氷冷した。この溶液に、 dNTP Mixture (2. 5m Meach) 4 μ 1及び付属の 5 X緩衝液 (250mM Tris- HC1 (pH8. 3)、 15mMMgCl
2
、 375mM KCl、50mM DTT)を用いて 1の反応液を調製した。 25°Cで 5分 間インキュベート後、 200unitsZ μ 1 ReverScript I (Wako社製） 1 μ 1を加え、 25°Cで 1 0分間、 42°Cで 50分間、さらに 70°Cで 15分間インキュベートして cDNAを合成した [0047] 合成した cDNAl μ 1をそれぞれ铸型として、（（RT-f:配列番号 1) -（RT-r：配列番 号 2)及び（16SrRNA-f:配列番号 11) - (16SrRNA-r：配列番号 12) )の両プライマー セットを用いてリアルタイム PCR装置による定量 PCRにより、標的遺伝子であるセレゥ リド合成酵素及び 16SrRNA遺伝子の一部の増幅を行 ヽ、転写量を測定した。
[0048] 《反応液組成》
20pmolZ 1プライマー（forward) 0. 5 ^ 1
Ζθρπιοΐ/ ΐプライマー (jeversej 0. 5 ^ 1
SYBR Premix Ex Taq™ (TaKaRa社製） 12. 5 ^ 1
ROX Reference Dye (TaKaRa社製） 0. 5 μ ΐ
上記の反応液に全量が 25 μ 1になるように滅菌水をカ卩え、 Mx3000P Real-Time P CR System (STRATAGEN社製）を用いて PCRを行った。熱変性、アニーリング、伸 長反応を 1サイクルとして 40サイクルの反応を行った。
[0049] 《反応条件》
熱変性： 95°C、 lOsec
アニーリング： 55°C、 20sec
伸長反応： 72°C、 30sec
[0050] RT— PCRにおける増幅産物量 (核酸量)を示す曲線を図 4に示す。また、最終転 写産物量を比較した図を図 5に示す。
[0051] 図 4に示したように、 KF株と No. 55株はほぼ同じサイクル数力も急激に増幅産物 量が増加したのに対し、 No. 11株でそれよりも遅れて増幅産物量が急激に増加し、 No. 11株の立ち上がりサイクル数は、嘔吐毒産生株と嘔吐毒非産生株との間に位 置した。この結果、 No. 11株は擬陽性株であると判断され、他の PCR法 (表 3参照） ではともに陽性として判断された KF株と区別することができた。また、嘔吐毒合成酵 素転写産物量は、図 5に示すように、 No. 55株（中程度空胞化活性株)を 1としたとき に、 KF株 (強空胞化活性株）は約 5倍多ぐ No. 11株 (無空胞化活性株）は 1Z10 程度であった。このように、動物細胞空胞化活性は嘔吐毒合成酵素遺伝子転写量と 比例した。 No. 11株では、嘔吐毒合成酵素遺伝子の発現量が少ないために嘔吐毒 産生量も微量で、動物細胞空胞化活性の測定法では非産生株力どうかの判定は困 難だったものと考えられる。嘔吐毒合成酵素遺伝子転写発現の機構の違いにより、 嘔吐毒産生が異なると考えられた。その他の嘔吐毒合成酵素遺伝子を保有して 、な い JCM2152, No. 17、 22、 4、 42株では、嘔吐毒合成酵素転写産物は全く増幅検 出されなかった。
[0052] このように、本発明のプライマーセットを用いたリアルタイム（定量） PCRにより、嘔吐 毒合成酵素を発現する嘔吐毒産生株のみを特異的に検出できた。転写産物量は、 動物細胞空胞化活性量と比例し、毒素産生量が微量なため動物細胞空胞化試験で は嘔吐毒産生陰性となる菌株でも、嘔吐毒合成酵素遺伝子を保有して 、る菌株では 、本遺伝子転写産物を定量検出できた。また、本発明のプライマーセットを用いたリ アルタイム（定量) PCR法により、嘔吐毒産生能の程度も判定できる可能性が示され た。
産業上の利用可能性
[0053] 本発明によれば、嘔吐毒非産生菌はもちろんのこと、嘔吐毒合成酵素遺伝子を有 するが嘔吐毒を産生しないセレウス菌と嘔吐毒産生菌とを確実に判別することができ る。この結果、食中毒の発生原因の早期解明、その対策等が迅速に行えるようになる

Claims

請求の範囲
[1] 嘔吐毒産生セレウス菌と嘔吐毒非産生セレウス菌を判別するためのセレウス菌判別 方法であって、
配列番号 1で示す塩基配列及び Z又は配列番号 2で示す塩基配列を有する核酸を プライマーとして、 RT—PCRを適用することを特徴とするセレウス菌判別方法。
[2] RT— PCRにより増幅生産された核酸の生産量力 嘔吐毒産生セレウス菌と嘔吐毒 非産生セレウス菌とを判別するためのセレウス菌判別用キットであって、
少なくとも配列番号 1で示す塩基配列を有する核酸及び Z又は配列番号 2で示す 塩基配列を有する核酸と、
DNA増幅用酵素と、
DNA合成用試薬と、
DNA検出用試薬とを含むことを特徴とするセレウス菌判別用キット。
[3] さら〖こ、 mRNAから cDNAを合成するための DNA合成酵素を含むことを特徴とする 請求項 2に記載のセレウス菌判別用キット。
[4] RT— PCRにより増幅生産された核酸の生産量力 嘔吐毒産生セレウス菌と嘔吐毒 非産生セレウス菌とを判別するために用いられる配列番号 1で示す塩基配列を有す る核酸。
[5] RT— PCRにより増幅生産された核酸の生産量力 嘔吐毒産生セレウス菌と嘔吐毒 非産生セレウス菌とを判別するために用いられる配列番号 2で示す塩基配列を有す る核酸。
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