KR20090023355A - 구토독 산생 세레우스균의 검출 방법 및 상기 방법을 위한 프라이머 세트 - Google Patents

구토독 산생 세레우스균의 검출 방법 및 상기 방법을 위한 프라이머 세트 Download PDF

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Abstract

본 발명은 구토독 합성 효소 유전자를 갖지만 동물 세포 공포화 시험에 있어서 음성이 되는 이른바 의양성의 구토독 산생 세레우스균을 판별하고, 동물 세포 공포화 시험에 있어서 양성이 되는 구토독 산생 세레우스균만을 확실하게 검출할 수 있는 방법을 제공한다. 구체적으로는, 서열 번호 1로 나타내는 염기 서열 및 서열 번호 2로 나타내는 염기 서열을 갖는 핵산을 프라이머로서 RT-PCR을 행하고, 이에 따라 증폭 생산된 핵산의 생산량 곡선으로부터 구토독 산생 세레우스균과 구토독 비산생 세레우스균을 판별한다.

Description

구토독 산생 세레우스균의 검출 방법 및 상기 방법을 위한 프라이머 세트{METHOD OF DETECTING CEREUS STRAIN PRODUCING EMETIC TOXIN AND PRIMER SET FOR THE METHOD}
본 발명은 구토독 산생 세레우스균의 검출 방법, 보다 구체적으로 말하면, 구토독 산생 세레우스균과 구토독 비산생 세레우스균을 판별하기 위한 판별 방법 및 상기 방법을 위한 프라이머 세트에 관한 것이다.
세레우스균(B.cereus)은 자연계에 널리 분포하는 호기성 유아포균으로, 식품을 오염하고, 증식하여 식품의 부패를 일으키는 경우가 있다. 이 때, 세레우스균은 독소를 산생하지만, 산생되는 독소의 차이에 의해 설사 또는 구토를 주된 증상으로 하는 식중독을 일으키는 것이 있다. 이 중, 일본에서 발생 건수가 많은 것은 구토독(세레우리드)에 의한 식중독이다.
세레우리드는 열, 산, 알칼리, 소화 효소에 대해 내성이 강한 저분자의 환형 펩티드이고, (D-O-Leu-D-Ala-L-O-Val-L-Val)3이라고 하는 구조를 나타내며, 예컨대, 국제 공개 공보 WO 03/097821호(특허 문헌 1)에 그 산생 효소를 코드하는 유전자 서열이 개시되어 있다.
한편, 본원 발명자 등에 의해, 세레우리드 산생주에 있어서 특이적으로 DNA가 증폭되는 프라이머 세트가 발견되어, 세레우리드 합성 효소 유전자를 갖는 세레우스균을 특이적으로 검출할 수 있는 프라이머 세트가 일본 특허 공개 제2006-6256호 공보(특허 문헌 2)에 개시되어 있다. 또한, 이들 이외에도, PCR법에 의해 세레우리드 산생 세레우스균을 검출하는 방법이, 예컨대, 제26회 일본 식품 미생물 학회 학술 총회 강연 요지집(비특허 문헌 1)이나 일본 특허 공개 제2005-57202호 공보(특허 문헌 3)에 개시되어 있다.
그러나, 본원 발명자 등의 연구에 의하면, 특허 문헌 2에 개시된 프라이머 세트를 이용한 PCR법으로 행한 세레우리드 산생균의 검출 결과와, 생화학적 시험인 동물 세포 공포화 시험에 있어서의 검출 결과가 일치하지 않는 것이 확인되었다. 즉, 세레우리드 합성 효소 유전자를 갖지만 동물 세포 공포화 시험에 있어서 구토독 음성이 되는 균주(이하「의양성 구토독 산생주」)가 소수인 채로 존재하고, 구토독 음성임에도 불구하고, 구토독 산생균이라고 판정될 가능성이 있는 것이 발견되었다.
[특허 문헌 1] 국제 공개 공보 WO 03/097821
[특허 문헌 2] 일본 특허 공개 제2006-6256호 공보
[특허 문헌 3] 일본 특허 공개 제2005-57202호 공보
[비특허 문헌 1] 가와이 타카오 등, 「PCR법을 이용한 세레우리드 산생성 세레우스균 검출법의 검토」, 제26회 일본 식품 미생물 학회 학술 총회 강연 요지집, 2005, p40
본 발명은, 상기 문제점에 감안하여 이루어진 것으로, 구토독 합성 효소 유전자를 갖지만 동물 세포 공포화 시험에 있어서 음성이 되는 소위 의양성 구토독 산생 세레우스균을 판별하여, 동물 세포 공포화 시험에 있어서 양성이 되는 구토독 산생 세레우스균만을 확실하게 검출할 수 있는 방법을 제공하는 것을 목적으로 하고 있다.
본 발명은, 서열 번호 1 및/또는 서열 번호 2로 나타내는 염기 서열로 이루어지는 프라이머를 이용하여 RT-PCR을 적용하고, 구토독 산생 세레우스균과 구토독 비산생 세레우스균을 판별하는 세레우스균의 판별 방법을 제공한다. 또한, 여기에 이용되는 세레우스균 검출용의 프라이머 및 구토독 산생 세레우스균의 판별용 키트를 제공한다.
[발명의 효과]
본 발명에 따르면, 구토독 합성 효소를 코드하는 mRNA를 증폭하기에 알맞은 프라이머 세트가 제공된다. 따라서, 본 발명의 프라이머 세트를 이용하여 RT-PCR을 행하면, 구토독의 산생량 혹은 구토독 산생능에 거의 비례한 증폭산물량 곡선을 얻을 수 있다. 이 증폭산물량 곡선으로부터, 구토독 비산생 세레우스균인지의 여부를 판별할 수 있다. 이와 같이, 본 발명에 따르면, 의양성균인지의 여부의 판정을 매우 간단하고 또한 확실하게 행할 수 있다.
도 1은 클론화한 구토독 합성 효소 유전자를 포함한다고 추정되는 세레우스 균 No.55 DNA의 Eco RI 소화산물에 대해 전기 영동을 행한 결과를 도시한 도면이다. 레인 M은 λ Hind III marker, 레인 1은 6 kb DNA 단편을 삽입한 플러스미드, 레인 2는 8 kb DNA 단편을 삽입한 플러스미드에 대해 도시한다.
도 2는 6 kb, 8 kb의 세레우스균 No.55 DNA의 Eco RI 소화산물과, (Try-Ala-1F)-(ER-2) 프라이머 세트에 의해 증폭되는 2205bp PCR 산물과의 관계를 도시한 도면이다.
도 3은 세레우스균 No.55 DNA의 각종 제한 소화 효소산물에 대한 서던 블로팅(Southern blotting) 분석 결과인 전기 영동도이다. 레인 1은 Hinc II에 의한 소화산물, 레인 2는 Pvu II에 의한 소화산물, 레인 3은 Sph I에 의한 소화산물에 대한 결과이다.
도 4는 본원의 프라이머 세트를 이용한 RT-PCR에 의한 증폭산물량 곡선의 일례이다.
도 5는 구토독 산생주와 의양성 구토독 산생주 및 구토독 비산생주에 있어서의 구토독 합성 유전자 전사산물량을 비교한 그래프이다.
본 발명은 서열 번호 1 및 서열 번호 2로 나타낸 염기 서열로 이루어지는 프라이머 세트에 의한 RT-PCR을 행하여, 구토독 산생 세레우스균과 구토독 비산생균을 판별하는 것을 특징으로 한다. RT-PCR는 포리메라아제 연쇄 반응(PCR)에 의해 생긴 증폭산물(핵산)을 증폭과 동시에 검출하는 방법이다. 증폭된 핵산의 검출에는, 각종 형광 프로브를 이용하는 수법과, 인터컬레이터 형광 색소(intercalater dye)를 이용하는 수법이 있고, 본 발명에 있어서는, 어느 쪽의 수법도 이용할 수 있다.
그런데, RT-PCR에 이용되는 프라이머는, 일반적으로는, 타겟이 되는 핵산을 증폭할 수 있는 염기 서열을 갖는 것이면 좋다. 따라서, 구토독 산생 세레우스균을 RT-PCR에서 검출하기 위해서는, 예컨대, 서열 번호 3으로 나타낸 구토독인 세레우리드 합성 효소를 코드하는 유전자로부터 결정된 서열 번호 4로 나타내는 (Tyr-Ala-1F) 프라이머나 서열 번호 5로 나타내는 (ER-2) 프라이머를 이용할 수 있다. 그러나, 이들의 프라이머를 이용한 경우에는, 현실에 구토독을 산생하는 산생주뿐만 아니라, 합성 효소를 보유하지만, 현실에는 구토독을 산생하지 않거나 혹은 구토독을 산생하여도 공포화 활성 시험에서 음성이 될 정도의 구토독밖에 산생하지 않는 균주(의양성주)도 검출되게 된다. 그래서, 의양성주를 구별하기 위해, 본 발명에 있어서는, 세레우리드 합성 효소를 코드하는 유전자로부터 전사된 mRNA를 증폭하는 것에 알맞은 서열 번호 1로 나타내는 핵산 서열로 이루어지는 프라이머 및 서열 번호 2로 나타내는 핵산 서열로 이루어지는 프라이머가 이용된다. 이들의 프라이머는, 각각 Forward용 프라이머(RT-f 및 Reverse용 프라이머(RT-r)로서 이용된다. 통상은 양자를 1조(1세트)로 하여 이용된다. 당연히, 어느 한쪽의 프라이머를 이용하여 RT-PCR을 행하여도 지장이 없다.
RT-PCR에 의해 검출된 핵산량(증폭산물량)은, 예컨대 도 4에 도시한 바와 같이, 증폭 사이클에 따라 대수적으로 증가하고, 점차로 플래토에 달한다. 대수적으로 증가를 개시하는 사이클 수는, 세레우리드의 산생량(혹은 세레우스균의 세레우 리드 산생능)에 비례한다고 생각되어진다. 따라서, 대수적으로 증가를 개시하는 사이클 수를 조사함으로써, 진성의 구토독 산생주, 의양성 산생주, 비산생주의 어느 것인지를 판정할 수 있다. 즉, 구토독을 산생하는 표준주와 구토독을 산생하지 않는 표준주를 이용하여 작성된 핵산량의 산생 곡선(증폭산물량 곡선)과, 피검출주(검체주)를 이용하여 작성된 핵산량의 산생 곡선을 대비시키는 것에 따라 판별된다. 피검출주의 산생 곡선이, 표준주의 산생 곡선과 거의 일치하면, 그 주는 구토독 산생주이고, 비산생 주의 산생 곡선과 거의 일치하면 그 주는 비산생주(혹은 의양성주)라고 판정된다. 그리고, 피검출주의 산생 곡선이, 표준주의 산생 곡선과 비산생 주의 산생 곡선의 사이에 위치하게 되면, 그것은 의양성주, 즉 세레우리드 합성 효소 유전자를 갖지만, 구토독 비산생주(혹은 구토독을 산생한다고 하더라도 동물 세포 공포화 활성에 의해 음성을 나타내는 정도밖에 산생하지 않는 주)라고 판정된다. 또한, mRNA의 발현량과 구토독의 산생량은 비례한다고 생각되어지기 때문에, 대수적으로 증가를 개시하는 사이클 수를 조사하는 것에 따라, 구토독의 산생량을 정량적으로 측정하거나, 양성주, 의양성주의 산생능을 측정하거나 하는 것도 생각되어진다.
PCR의 실시 방법은 일반적으로 행해지는 PCR과 하등 다르지 않다. 증폭의 대상이 되는 핵산의 추출 방법, RT-PCR에 이용되는 각종 시약, PCR의 반응 조건 등 공지의 추출 방법이나 반응 조건으로 행하면 좋고, 적절하게 반응 조건을 바꾸어 행할 수도 있다. 또한, 핵산의 추출은 분리된 세레우스균으로부터 행하는 것이 바람직하지만, 목적이 되는 핵산을 추출할 수 있는 한에 있어서는, 세레우스균을 분 리하지 않고, 예컨대 구토물이나 세레우스균의 존재가 의심되는 식품, 분변 등으로부터 핵산만을 추출하여도 좋다. 즉, 본 발명의 세레우스균의 판별 방법은, 세레우스균 등으로부터 핵산을 추출하고, 추출한 핵산을 본 발명에 의한 프라이머를 이용하여 증폭하며, 그 증폭된 핵산량의 시간적 변화를 측정함으로써, 구토독 산생주와 의양성주(혹은 그들과 비산생주)를 구별하는 방법이다. 당연히, 미리 표준주인 구토독 산생주를 이용하여 증폭된 핵산량의 시간적 변화를 측정하고, 표준적인 구토독 산생주의 산생 곡선을 그려 두고, 곡선이 상승했을 때(혹은 그것보다도 증폭산물량이 많아진 바)의 사이클 수, 예컨대 도 4로 말하면, 24∼26 사이클 부근에서의 표준주의 증폭산물량과 검체주의 증폭산물량을 비교함으로써, 구토독 산생주이거나 의양성주인지의 여부의 판별을 행할 수도 있게 된다. 또한, 미리 구토독 산생주를 이용하여, 증폭산물량이 플래토가 되는 사이클 수(플래토 사이클 수) 및 증폭산물량(플래토 증폭량)을 확인해 두고, 검출주의 플래토 사이클 후(예컨대, 도 4로 말하면, 36∼40 사이클 후)에 있어서의 증폭산물량을 비교함으로써, 양자를 판별하는 것도 생각되어진다.
세레우스균에는, 세레우리드 산생주와 의양성주가 존재함으로써, 세레우스균이 보유하는 세레우리드 합성 효소를 코드하는 유전자는, 그 균주에 의해 상이하다고 생각되어진다. 또, 본원에서 개시되는 서열 번호 3에 나타낸 염기 서열은, 특허 문헌 1에 개시된 것과는 상이하다.
또한, 본 발명에 의한 프라이머에는, 이들의 프라이머와 동일한 기능을 발휘하는 한에 있어서, 결실, 치환, 삽입 혹은 부가에 의해 일부가 개변된 핵산을 포함 한다.
본 발명의 프라이머 세트는, 세레우스균 판별용의 프라이머 세트로서 제공되는 외에,다른 RT-PCR용 키트와 마찬가지로, RT-PCR에 필요한 DNA 증폭용 효소(예컨대, Taq DNA polymerase)나 DNA 합성 시약(dNTP나 반응용 완충액), 증폭된 핵산 검출용의 DNA 검출 시약, 나아가서는 cDNA 합성 효소 등과 세트되어, 세레우스균 판별용 키트로서 제공된다. PCR의 조건은 적절하게 정해져, 실시예 2에 기재된 조건이 예시된다.
실시예 1
본 발명에 따르는 프라이머의 설계에 있어서, 하기에 진술한 바와 같이 우선, 구토독 산생주의 DNA를 제한 효소 Eco RI로 소화하여, (Tyr-Ala-1F: 서열 번호 4)-(ER-2:서열 번호 5) 프라이머 세트를 이용한 PCR 산물을 프로브로 한 서던 분석에 의해 검출한 약 6 kb 및 8 kb의 소화산물의 염기 서열(서열 번호 6)을 결정했다. 다음으로, 이 5' 말단측의 서열((9R-f: 서열 번호 7)-(9R-r: 서열 번호 8))을 프라이머로 한 PCR 산물을 프로브로 하여, 구토독 산생주의 DNA의 제한 효소 Pvu II 소화 단편으로부터 검출한 약 6.5 kb의 DNA 단편의 염기 서열을 일부 결정하여, 이전의 약 6 kb 및 약 8 kb의 염기 서열과 아울러 구토독 세레우리드 합성 효소 유전자의 전체 염기 서열을 결정했다.
[구토독 세레우리드 합성 효소 유전자의 전체 염기 서열의 결정]
(1) 게놈 DNA의 조제
세레우리드 산생 세레우스균의 게놈 DNA는 최적의 조건으로 배양하여 얻은 균체로부터 DNeasy Tissue Kit(QIAGEN사제) 및 Cetyltrimetylammoniumbromide(CTAB)법에 의해 조제되었다. 게놈 DNA의 조제에는, 이와테 대학 농학부에 있어서 구토형 식중독 사건으로 분리되어, 메이지 유업(주)에 보존된 균주(B.cereus No.55)가 이용되었다.
(2) Eco RI에 의한 게놈 DNA 소화 및(Tyr-Ala-1F)-(ER-2) 프라이머 세트를 이용한 서던 분석
다음으로, 조제된 B.cereus 게놈 DNA를 제한 효소 Eco RI(TOYOBO사제)에 의해 완전 소화했다. 이 완전 소화한 DNA 단편에 대해, (Tyr-Ala-1F: 서열 번호 4)-(ER-2: 서열 번호 5) 프라이머 세트를 이용하여 증폭해서 얻어진 PCR 산물을 프로브로서 서던 분석을 행한 바, 약 6 kb와 약 8 kb의 DNA 단편이 검출되었다. 그리고 상기 DNA 단편을 클로닝하여 이들의 염기 서열을 결정했다. 게놈 DNA의 Eco RI 소화 단편을 삽입한 형질 전환체 플러스미드의 Eco RI 소화 후의 전기 영동도를 도 1에 도시한다.
여기서 결정한 약 6 kbp와 약 8 kbp의 염기 서열과 지금까지 결정하고 있는 서열을 포함한 해석의 결과(특허 문헌 2, 서열 번호 5 및 도 5 참조), 이들 2개의 DNA 단편은 연속하지 않고, 사이에 390 bp의 DNA가 존재한다고 생각되어졌다. 얼라이먼트의 결과, 이 390 bp의 서열은, 이미 염기 서열이 결정되어 있는(Tyr-Ala-1F)-(ER-2) PCR 산물의 내부에 존재했다. 이들 새롭게 결정한 6 kb 및 8 kb의 DNA 단편과(Tyr-Ala-1F)-(ER-2) PCR 산물의 관계를 도 2에 도시한다. 또한, 약 6 kb 및 8 kb의 DNA 단편과 중간의 390 bp의 단편을 합친 합계 13,605 bp의 DNP 단편의 염 기 서열을 서열 번호 6으로서 나타낸다.
(3) Hinc II, Pvu II, Sph I에 의한 게놈 DNA 소화 및 9R 프라이머 세트에 의한 서던 분석
다음으로, 상기에서 결정된 약 14 kbp의 염기 서열의 전반 부분으로부터 제작된 서열 번호 7로 나타내는 프라이머(9R-f) 및 서열 번호 8로 나타내는 프라이머(9R-r)를 프로브로 하여, 조제된 B.cereus 게놈 DNA의 각종 제한 효소(Hinc II(NEB사제), Pvu II(MBI사제), Sph I(NEB사제))에 의한 소화산물의 서던 분석을 행한 바, 약 6.5 kbp의 Pvu II 소화산물과 강하게 하이브리다이즈했다. 그리고, 이 소화산물을 클로닝하여, 그 일부 염기 서열을 결정했다. 약 14 kbp의 전반을 9R 프로브세트((9R-f)-(9R-r))로 증폭하여 얻어진 PCR 산물을 프로브로 한 서던 분석의 전기 영동도를 도 3에 도시한다.
이 얼라이먼트 해석을 행한 바, 이것은 이전에 진술한 약 14 kbp의 전반 부분에 결합했다. 또한, 약 14 kbp의 후반 부분은, Ehling-Schulz 등이 보고하고 있는 서열(Accession number: AY691650)과 동일하고, 그들이 보고하고 있는 염기 서열(Accession number: AY691650) 중 종지 코든을 포함하는 서열을 리버스프라이머, 이미 결정한 14 kbp의 최종 부분을 포워드프라이머로서 이용하며, No.55주의 DNA를 주형으로 하는 PCR에 의해, 증폭되는 DNA의 염기 서열을 결정하여, 서열 번호 3에 나타내는 18594 bp의 염기 서열을 결정했다.
서열 번호 3으로 나타내는 염기 서열에 대해, 더욱 해석을 진행한 바, 이 염기 서열에는, 서열 번호 3으로 나타내는 염기 서열 중 360-10535 염기까지의 ORF1 과 10579-18594 염기까지의 ORF2의 2개의 큰 ORF가 포함되는 것을 알 수 있었다. ORF1의 추정 아미노산 서열을 서열 번호 9에, ORF2의 추정 아미노산 서열을 서열 번호 10에 나타낸다. ORF1은 3391아미노산으로 이루어지는 분자량 387624.5의 단백질을 코드하여, ORF2는 2681아미노산으로 이루어지는 분자량 304289.09의 단백질을 코드하고 있다고 추정되었다.
이들의 염기 서열의 결정에 있어서 행해진 처리 조건은 하기와 같다.
(i) 게놈 DNA의 제한 효소에 의한 처리
조제한 게놈 DNA는 제한 효소 Eco RI, Hinc II, Pvu II, Sph I에 의해 소화되었다. 게놈 DNA는 1 ㎍이 사용되었다. 표 1에 나타내는 반응액 조성에 총량이 50 ㎕가 되도록 멸균물을 첨가하여, 37℃에서 밤새(16시간 이상) 인큐베이트했다. 그리고, 제한 효소 소화산물 30 ㎕와 1/10 용량의 로딩 완충액(30％ Glycerol, 50 mM EDTA, 0.25％ Bromo phenol blue, 0.25％ Xylene cyanol FF, pH 7.0)을 혼합한 후, 1.2％ 아가로스겔의 시료 홈에 차지하고, TAE 완충액(40 mM Tris-acetate, 1 mM EDTA, pH 8.0) 중, 100 V의 인가 전압으로 전기 영동을 행했다. 아가로스겔은 TAE 완충액에 의해 조제되었다. 영동 종료 후, 아가로스겔을 1㎍/㎖의 에티디움브로마이드 용액에 침지하여 염색(에티브로 염색)하고, 자외선 조사 장치 TFP-35M(VILBER LOURMAT사제)에 의해 조사하여 밴드를 검출했다.
Figure 112008080100483-PCT00001
(ii) 서던 분석법
(A) PCR 산물의 정제
조제된 DNA의 각 소화산물에 대해, 이하의 반응액 조성, 반응 조건으로 PCR을 행했다. 효소는, Taq DNA polymerase, KOD Dash 중 어느 하나를 사용했다. EcoR I에 의한 게놈 DNA 소화산물에 대해서는, 프라이머 세트(Tyr-Ala-1F)-(ER-2)를 프로브로서, 제한 효소 Hinc II, Pvu II, Sph I에 의한 소화산물에 대해서는, 프라이머 세트(9R-f)-(9R-r)를 프로브로 했다. 또한, 프라이머 세트(9R-f)-(9R-r)에서는, Taq DNA polymerase를 사용하여, 프라이머 세트(Tyr-Ala-1F)-(ER-2)에서는, KOD Dash를 사용했다.
(a) Taq DNA polymerase
<반응액 조성>
10×buffer for Taq DNA polymerase(SIGMA사제) 1.5 ㎕
1mM dNTPS(SIGMA사제) 0.3 ㎕
20 p㏖/㎕ 프라이머(Foward) 0.3 ㎕
20 p㏖/㎕ 프라이머(Reverse) 0.3 ㎕
주형(32 ng/㎕) 1.0 ㎕
5U/㎕ Taq DNA polymerase(SIGMA) 0.09 ㎕
상기 반응액을 0.2 ㎖ 마이크로 튜브 내에서 조제하여, 전량이 15 ㎕가 되도록 멸균물을 첨가하고, TaKaRa PCR Thermal Cycler(TaKaRa사제) 혹은 Thermo Hybaid PCR Express(Thermo BioAnalysis사제)를 이용하여 이하의 조건으로 PCR을 행했다. DNA의 변성, 어닐링, 신장 반응의 사이클을 35사이클 반복했다.
<반응 조건>
전열처리: 95℃, 3.0 min
DNA의 변성: 95℃, 1.0 min
어닐링: 52℃, 1.0 min
신장 반응: 72℃, 1.0 min
(b) KOD Dash
<반응액 조성>
KOD Dash 10×PCR buffer(TOYOBO사제) 1.5 ㎕
2mM dNTPs(TOYOBO사제) 1.5 ㎕
20 p㏖/㎕ 프라이머(foward) 0.3 ㎕
20 p㏖/㎕ 프라이머(reverse) 0.3 ㎕
주형(32 ng/㎕) 1.0 ㎕
2.5U/㎕ KOD Dash(TOYOBO사제) 0.079 ㎕
상기 반응액을 0.2 ㎖ 마이크로 튜브 내에서 조제하고, 전량이 15 ㎕가 되도록 멸균물을 첨가하여, TaKaRa PCR Thermal Cycler을 이용하여 이하의 조건으로 PCR을 행했다. DNA의 변성, 어닐링, 신장 반응의 사이클을 34사이클 반복했다.
<반응 조건>
전열처리: 95℃, 3.0 min
DNA의 변성: 95℃, 1.0 min
어닐링: 42℃, 1.0 min
신장 반응: 72℃, 1.0 min
상기 각 PCR 반응액을 1.2％ 아가로스겔을 이용하여 TAE 완충액 내에서 전기영동 후, 증폭산물을 검출했다. 원하는 밴드를 겔로부터 잘라내어, MinElute Gel Extraction Kit(QIAGEN사제)를 이용하여, 부속의 프로토콜에 따라 PCR 산물을 정제했다. 정제한 DNA에, 1/10 용량의 3M의 CH3COONa 및 2.5 용량의 99％ 에탄올을 첨가하여, -80℃에서 20분간 방치한 후, 원심 분리(20,400×g, 20 min, 4℃)하여 DNA를 침전시켰다. 이 침전을 진공 건조시켜, 멸균물에 용해시켰다.
(B) 디곡시게닌에 의한 DNA의 표지
DIG DNA Labeling and Detection Kit(DIG-ELISA) nonradioactive(Roche사제)를 이용하여 이하의 방법으로 PCR 산물을 표지했다. 상기 방법으로 정제한 DNA 용액 10 ㎕(DNA 2 ㎍)를 0.2 ㎖의 마이크로 튜브에 옮기고, 멸균물을 첨가하여 15 ㎕로 하여, 95℃에서 10분간 열 변성시킨 후, 급냉했다. 2 ㎕의 헥사뉴클레오티드 혼합액(Kit 부속), 2 ㎕의 dNTP 라벨링 혼합액(Kit 부속) 및 1 ㎕의 Klenow enzyme(Kit 부속)을 첨가, 혼합 후, 37℃에서 18시간 인큐베이트했다. 2 ㎕의 0.2 M EDTA(pH 8.0)를 첨가하여, 65℃에서 10분간 가열하여 반응을 정지시켜, 이것을 프로브 용액으로 했다.
제한 효소에 의한 완전소화물을 1.2％ 아가로스겔을 이용하여, TAE 완충액 내에서 전기 영동 후, 에티브로 염색으로 밴드를 확인했다. 다음으로 겔을 순수로 세정하고, 가수 분해액(0.25 M HCl) 내에서 20분간 진탕했다. 또한 변성용액(0.5 M NaOH, 1.5 M NaCl) 내에서 30분간 진탕하고, 0.4 M NaOH에서 10분간 알칼리 변성을 행했다. Hybond-N+ 나일론막(애머셤사제)을 진공 트랜스퍼 장치(Bio CRAFT사제)에 세트 후, 그 위에 알칼리 변성시킨 겔을 실었다. 겔의 위에 0.4 M NaOH를 스며들게 한 해면을 싣고, 그 위에서 0.4 M NaOH를 주입하여, 50∼70 mmHg로 흡인하며, 90분간 알칼리 블로팅했다. 블로팅 종료 후, 나일론막을 2×SSC(3M NaCl, 0.03M C6H5Na3)로 헹궈, 세정했다(2 min, 3회).
하이브리드보틀에 블로팅한 막을 넣고, 15 ㎖의 하이브리다이제이션 용액(5×SSC, 0.5 w/v％ 블로킹 시약(Roche사제), 0.1 w/v％ N-라우로일설코신나트륨염, 0.02 w/v％ SDS)를 첨가하여, 회전식 하이브리드오븐(Lab-Line Instruments사제 또는 UVP Laboratory products사제)을 이용하여, 68℃에서 4시간 인큐베이트했다. 상기 (i)에서 조제한 프로브를 95℃에서 10분간 열변성시킨 후, 급냉하고, 이것을 하이브리드보틀에 부가하여, 68℃에서 밤새 인큐베이트하여 하이브리다이제이션을 행했다.
막을 우선 68℃에서 세정하고, 블로팅한 후, 알칼리포스파타아제 표지 디곡시게닌 항체-Fab 프라그먼트(Roche사제)와 30분간 실온에서 반응시켰다. 세정 후, 발색 반응액[45 ㎕의 NBT 용액(75 mg/㎖ in 70％ dimethylformamide)(나카라이텍스사제), 35 ㎕의 X-인산 용액(50 mg/㎖ in DMF)(나카라이텍스사제)를 10 ㎖의 Buffer 3에 첨가한 것] 내에서 막을 인큐베이트하고, 발색시켜, 밴드를 검출했다.
(iii) 제한 효소 소화 단편의 클로닝
게놈 DNA의 제한 효소(Eco RI 및 Pvu II)의 소화 단편을 하기의 방법으로 정제한 후, 각각 Lamda ZAP II Predigested Eco RI/CIAP Treated Vector Kit(Stratagene사제) 및 Clone Smart Blunt Cloning Kit(Lucigen Corporation사제)를 이용하여 클로닝을 행했다.
A. Eco RI 소화 단편의 정제 방법
Eco RI 소화산물을 1 ㎖의 70％ Ethanol로 세정한 후, 진공 건조시켜, 멸균물에 용해시켰다.
B. Pvu II 소화 단편의 정제 방법
Pvu II 소화 산물에, 동등한 양의 TE 포화 Phenol-Chloroform-Isoamylalcohol(용량비 25:24:1)(pH 7.9) 혼합액을 첨가하여 잘 혼합했다. 원심 분리(20,400×g, 10 min, 4℃)하여, 수층을 새로운 1.5 ㎖의 마이크로 튜브에 분취하며, 동등한 양의 Chloroform-Isoamylalcohol을 첨가하여 혼합한 후, 재차 원심 분리(20,400×g, 10 min, 4℃)했다. 수층을 분취하고, 이것에 1/10 용량의 3M CH3COONa(pH 5.2), 2.5 용량의 99％ 에탄올을 첨가하여 실온으로 10분 정도 방치하며, 원심 분리(20,400×g, 20 min, 4℃)하여, DNA를 침전시켰다. 이 침전을 70％ Ethanol로 세정한 후, 진공 건조시켜 멸균물에 용해시켰다.
(iv) 염기 서열의 결정
Eco RI 소화 단편, 즉 약 6 kb 및 8 kb의 DNA를 삽입한 형질 전환 플러스미드는, Sanger법에 의해, 염기 서열을 결정했다. 또한, 상류 부분을 포함한다고 생각되어지는 약 6.5 kb의 Pvu II 단편에 대해서도 마찬가지로 염기 서열을 결정했다.
상기한 바와 같이 하여 서열이 결정된 약 6 kb 및 8 kb의 아미노산 서열 및 약 6.5 kb의 아미노산 서열에 대해, GenomeNet 및 NCBI의 BLAST program을 이용하여, nucleic acid 데이터베이스, protein 데이터베이스에 있어서의 상동성 검색을 행한 바, Gramicidin S synthetase I이나 Tyrocidine A synthetase II 등의 비리보솜성 펩티드 합성 효소 유전자의 일부와 높은 상동성이 확인되었다.
또한 protein 데이터베이스에 있어서의 모티브 검색도 행했다. 비리보솜성 펩티드 합성 효소에는 하나의 아미노산에 대해, 그 활성화나 아미노산끼리의 결합을 행하는 펩티드 합성 유닛이 있다. 이 펩티드 합성 유닛에는, 아미노산끼리의 축합을 행하는 콘덴세이션 도메인(C domain), 아미노산의 활성화를 행하는 아데니레이션 도메인(A domain), 아미노산을 운반하는 펩티질캐리어프로테인이 함유된다(PCP domain). 세레우리드는 4종의 아미노산으로 구성되기 때문에, 세레우리드 합성 효소에는 4개의 유닛, 또한 마지막으로는 펩티드쇄 절단에 필요한 티오에스테라아제활성 부위가 있다고 추정되지만, 이들의 도메인의 존재도 모티브 검색의 결과, 확인되었다. 확인된 도메인 구조를 표 2에 나타낸다.
Figure 112008080100483-PCT00002
실시예 2
[B.cereus 구토독 세레우리드 합성 효소 발현주의 리얼 타임 PCR에 의한 검출]
계속해서, 개시 코든으로 추정되는 영역을 포함하는 DNA 염기 서열로부터 전사되는 mRNA를 검출하기 위해 유효한 프라이머 세트를 설계, 합성했다. 그리고 합성된 프라이머 세트((RT-f:서열 번호 1)-(RT-r:서열 번호 2))를 이용하여 RT-PCR을 행하고, 구토독 산생주, 의양성주 및 비산생주의 판별을 시도했다.
B.cereus JCM2152(표준주: 이화학 연구소 보존 시설에 보존), KF주(구토독 산생주: 큐슈 대학 농학 연구원에서 분리 보존), No.55주(구토독 산생주), No.11주(구토독 비산생, 구토독 합성 효소 유전자 보유주: 메이지 유업(주)에서 분리 보존), No.17주(구토독 비산생주: 이전과 동일), NO.22주(구토독 비산생주: 이전과 동일) No.4주(구토독 비산생주: 이전과 동일), No.42주(구토독 비산생주: 이전과 동일)에 대해 판별을 시도했다. 이용한 B.cereus균주의 성형을 표 3에 정리했다.
[표 3]
Figure 112008080100483-PCT00003
여러 가지의 B.cereus 균주를 최적 조건으로 배양 후에 집균한 균체로부터, RNeasy Mini Kit(QIAGEN사제)를 이용하여, 부속의 프로토콜에 따라, mRNA를 추출했다. 또, 균체의 용균은 5 mg/㎖ Lysozyme(생화학 공업사제) 및 0.02 mg/㎖의 N-Acetylmuramidase(다이니폰제약사제) 존재 하에, 37℃ 5분간 인큐베이트한 후, 초음파 처리(30 W, 15 sec, 37℃)에 의해 행했다. 또한, RNA에의 게놈 DNA의 혼입을 막기 위해 RNase-free DNase I Set(QIAGEN사제)를 이용하여, 부속의 프로토콜에 따라 DNA 소화를 4회 행했다.
추출한 RNA를 주형으로 하여, 세레우리드 합성 효소 유전자의 cDNA를 합성했다. 또한, 항상 그 전사량이 일정한 16SrRNA의 cDNA도 동시에 합성했다. RNA 1.2 ㎍에 2종의 역전사용 프라이머((RT-R: 서열 번호 2) 또는 (16SrRNA-r: 서열 번호 12))를 각각 20 p㏖씩 혼합하여, RNase-free water를 첨가하여 12 ㎕로 한 용액을 70℃에서 10분간 인큐베이트 후, 5분간 빙냉했다. 이 용액에, dNTP Mixture(2.5 mMeach) 4 ㎕ 및 부속의 5×완충액(250 mM Tris-HCl(pH 8.3), 15 mM MgCl2, 375 mM KCl, 50mM DTT를 이용하여 20 ㎕의 반응액을 조제했다. 25℃에서 5분간 인큐베이트 후, 200 units/㎕ ReverScript I(Wako사제) 1 ㎕를 첨가하여, 25℃에서 10분간, 42℃에서 50분간, 70℃에서 15분간 더 인큐베이트하여 cDNA를 합성했다.
합성한 cDNA 1 ㎕를 각각 주형으로 하고, ((RT-f: 서열 번호 1)-(RT-r: 서열 번호 2) 및 (16SrRNA-f: 서열 번호 11)-(16SrRNA-r: 서열 번호 12))의 양프라이머 세트를 이용하여 리얼 타임 PCR 장치에 의한 정량 PCR에 의해, 표적 유전자인 세레우리드 합성 효소 및 16SrRNA 유전자의 일부의 증폭을 행하여, 전사량을 측정했다.
<<반응액 조성>>
20 p㏖/㎕ 프라이머(forward) 0.5 ㎕
20 p㏖/㎕ 프라이머(reverse) 0.5 ㎕
SYBR Premix Ex TaqTM(TaKaRa사제) 12.5 ㎕
ROX Reference Dye (TaKaRa사제) 0.5 ㎕
상기한 반응액에 전량이 25 ㎕가 되도록 멸균물을 첨가하여, Mx3000P Real-Time PCR System(STRATAGEN사제)를 이용하여 PCR을 행했다. 열변성, 어닐링, 신장 반응을 1사이클로서 40사이클의 반응을 행했다.
<<반응 조건>>
열변성: 95℃, 10 sec
어닐링: 55℃, 20 sec
신장 반응: 72℃, 30 sec
RT-PCR에서의 증폭산물량(핵산량)을 나타내는 곡선을 도 4에 도시한다. 또한, 최종 전사산물량을 비교한 도면을 도 5에 도시한다.
도 4에 도시한 바와 같이, KF주와 No.55주는 거의 동일한 사이클 수로부터 급격하게 증폭산물량이 증가한 것에 비해, No.11주에서 그것보다도 지연되어 증폭산물량이 급격하게 증가하고, No.11주의 수직 상승 사이클 수는, 구토독 산생주와 구토독 비산생주의 사이에 위치했다. 이 결과, No.11주는 의양성주라고 판단되고, 다른 PCR법(표 3 참조)에서는 함께 양성으로서 판단된 KF주와 구별할 수 있었다. 또한, 구토독 합성 효소 전사산물량은, 도 5에 도시한 바와 같이, No.55주(중 정도 공포화 활성주)를 1로 했을 때에, KF주(강 공포화 활성주)는 약 5배 많고, No.11주(무 공포화 활성주)는 1/10 정도였다. 이와 같이, 동물 세포 공포화 활성은 구토독 합성 효소 유전자 전사량과 비례했다. No.11주에서는, 구토독 합성 효소 유전자의 발현량이 적기 때문에 구토독 산생량도 미량이고, 동물 세포 공포화 활성의 측정법에서는 비산생주인지 아닌지의 판정은 곤란했다고 생각되어진다. 구토독 합성 효소 유전자 전사 발현의 기구의 차이에 의해, 구토독 산생이 상이하다고 생각되어졌다. 그 외의 구토독 합성 효소 유전자를 보유하지 않는 JCM2152, No.17, 22, 4, 42주에서는, 구토독 합성 효소 전사산물은 전혀 증폭 검출되지 않았다.
이와 같이, 본 발명의 프라이머 세트를 이용한 리얼 타임(정량) PCR에 의해, 구토독 합성 효소를 발현하는 구토독 산생주만을 특이적으로 검출할 수 있었다. 전사산물량은, 동물 세포공포화 활성량과 비례하여, 독소 산생량이 미량이기 때문에 동물 세포 공포화 시험에서는 구토독 산생 음성이 되는 균주라도, 구토독 합성 효소 유전자를 보유하고 있는 균주에서는, 본 유전자 전사 산물을 정량 검출할 수 있었다. 또한, 본 발명의 프라이머 세트를 이용한 리얼 타임(정량) PCR법에 의해, 구토독 산생량의 정도도 판정할 수 있을 가능성이 나타났다.
본 발명에 따르면, 구토독 비산생균은 물론이고, 구토독 합성 효소 유전자를 갖지만 구토독을 산생하지 않는 세레우스균과 구토독 산생균을 확실하게 판별할 수 있다. 이 결과, 식중독의 발생 원인의 조기 해명, 그 대책 등이 신속하게 행할 수 있게 된다.
SEQUENCE LISTING <110> Kyushu University Meiji Dairies Corporation <120> A method for detecting of B.cereus producing cereulide and a primer-set for the method <130> PCT0706403 <160> 12 <170> PatentIn version 3.1 <210> 1 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> PCR primer for amplifying a DNA fragement unique to m-RNA for a c ereulide synthetase <400> 1 cgaatgcgaa agaagatatg gg 22 <210> 2 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> PCR primer for amplifying a DNA fragement unique to m-RNA for a c ereulide synthetase <400> 2 cgtgaatgtt cttgcatctc tacc 24 <210> 3 <211> 18594 <212> DNA <213> Bacillus cereus <400> 3 tcgatatcga tttatgcgaa atgtacatcc gattagccat ttaccagagc aagaattctt 60 aaaagaatta gagaaatatg gtggtttagc aaaggaaatc attgaaaatg aagagttact 120 gcaaatttta acaccaatta ttcgttctga tttccgttta attgaacaac ttcatgtaac 180 caatatcatt gaaaaattat attgtaatgt tacgattttg aatggtctac aagatataac 240 agatgagaaa agaatgacag attggtatga ctatgttgat ggagattttg agctgataca 300 ttatgaagga ggacatttct tcattgatag tgcaatggat gaggtaattt ataaaatcaa 360 tgaatcagtt gggaaaatca aaaaatttac ataatggggg gatgatggag atgaaacgag 420 tggaagaaca tgatcacatt catgtgttaa atgaaataga aaacgaatgc gaaagaagat 480 atgggagaag taatattgca attatgcttg aaaagcatgg tgttcatgaa cagccgcttc 540 atatagaaga cttatttcat gaggtagaga tgcaagaaca ttcacgagta tcgcgccacg 600 aaacagtttt gatgacagat aaacaatgta tagatgagag tggaaaaccg ttagctcttc 660 gttttggtga gccacttcat cttgatgact gtaccccaaa aacactacaa gaaattttaa 720 agcgtgccgc taagcaagca aaagataaag ggatgacatt tgtatatgaa gatggacatg 780 aagagtacct ctcctaccaa gagatgttgg cagatgcgga gcggttacta aaagggttgc 840 gaaatcttgg tatacaacca ggagaaagta ttttgtttca atttaaggac aataagcatt 900 ttgttactgc gttttgggca tgtatacttg ggggattttt accaacgccg ttaggaacgg 960 cccctatcta tagtgagcaa aatgcacaag tattaaaact ttataacaca tggcagctat 1020 tagaacaacc gattatttta acggaatttg aattgaaaga agagattgct gcaattcgaa 1080 caacattgca acgtcaagag attgttatac atagtattga gaatgttatg gatacagcgc 1140 gcgatacaaa ctggtttcct 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ynthetase <400> 4 catctggatc tacaggaaat cc 22 <210> 5 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> PCR primer for amplifying a DNA fragement unique to a cereulide s ynthetase <400> 5 ctggatattg agatgtaaac catc 24 <210> 6 <211> 13605 <212> DNA <213> Bacillus cereus <400> 6 tttagatggt aatttacaat tcacatatga ggggcaccaa aatgccattg tttttacgga 60 agtagggaga ccgatgcctg gtattggcat tcgtattgtt gatgaggaca atcagtgcct 120 gtcagaagat cgtattggac gattccaaat tcatggtcca acggttatga atggttattt 180 caaaaatgat gaagcaaatg cggaaagttt tactgaagat ggctggttcg atagtggaga 240 tctggggttt atacataacg gtaatcttgt cattacagga agaaaaaagg atatgattgt 300 tgttcatggt gcaaattact acaactatga aattgaagcc ttggtagaac aagtacctgg 360 ggtggaaacc acgtttgtat gtgcaacgag tgtgaagtcg gctgaaggag cagaggaatt 420 agctattttc tttgtcccag taattaatca tgtttctgtg atgtttgcga cgatgcaaca 480 aatcaaacaa attgttgcgc gcaaaatggg tatcacgccg aaagtgatta taccaattca 540 gaaggaagca ttctttaaaa cggatagtgg gaaaataacg agaaatgcat ttcaaaaaca 600 gtttgagaac ggggcatata 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1500 Leu Leu Ile Gly Gln His His Ile Ile Ser Asp Gly Trp Ser Leu 1505 1510 1515 Gly Ile Phe Val Lys Glu Leu Asn Glu Met Tyr Asp Ala Phe Val 1520 1525 1530 Gln His Lys Pro Val Ala Glu Thr Pro Ser Thr Ile Ser Ile Met 1535 1540 1545 Asp Phe Thr Ala Trp His Asn Ser Lys Val Asp Glu Asp Gln Asp 1550 1555 1560 Asp Arg Gln Tyr Trp Leu Gln Arg Phe Glu Gly Glu Leu Pro Thr 1565 1570 1575 Leu Glu Leu Pro Thr Asp Arg Gln Arg Pro Leu Leu Lys Thr Tyr 1580 1585 1590 His Gly Asp Thr Leu Ser Tyr Lys Val Asn Ser Gln Leu His Gln 1595 1600 1605 Lys Leu Lys Asp Phe Ser His Ala Asn Gly Val Thr Met Phe Met 1610 1615 1620 Thr Leu Leu Thr Ala Tyr Asn Ile Met Leu Asn Lys Leu Thr Asn 1625 1630 1635 Glu Thr Asp Ile Val Val Gly Ser Pro Val Ala Gly Arg Asn Glu 1640 1645 1650 Pro Glu Ser Lys Asp Leu Ile Gly Met Phe Val Asn Thr Leu Ala 1655 1660 1665 Leu Arg Ser His Leu Gly Asp Asn Pro Thr Val Asp Val Leu Leu 1670 1675 1680 Lys Gln Ile Lys Gln Asn Thr Leu Glu Ala Tyr Asn His Gln Asp 1685 1690 1695 Tyr Pro Phe Asp Lys Leu Val Asp Asp Leu Asp Pro His Arg Asp 1700 1705 1710 Leu Ser Arg Thr Pro Ile Phe Gln Val Met Met Gly Tyr Met Asn 1715 1720 1725 Met Pro Leu Met Val Ala Phe Arg Glu Ala Glu Val Arg Glu Arg 1730 1735 1740 Phe Val Arg His Lys Val Ala Arg Phe Asp Leu Thr Leu His Val 1745 1750 1755 Phe Glu Asp Glu Asp Gln Met Lys Ile Phe Phe Glu Tyr Asn Thr 1760 1765 1770 Asp Leu Phe Asp Glu Ser Thr Ile Met Arg Trp Gln Asn His Phe 1775 1780 1785 Glu Thr Leu Leu Gln Glu Ile Val Ser Asn Pro Thr Lys Arg Ile 1790 1795 1800 Ser Glu Leu Asn Ile Leu Thr Asn Glu Glu Lys Tyr Glu Ile Leu 1805 1810 1815 Glu Met Asn Asn Asn Ser Thr Glu Tyr Pro Gln His Glu Ser Val 1820 1825 1830 Ala Glu Ile Phe Arg Glu Thr Lys Ile Lys His Gln Ala Lys Leu 1835 1840 1845 Ala Ile Thr Tyr Lys Asp Arg Lys Leu Thr Tyr Ala Glu Leu Ser 1850 1855 1860 Glu Lys Ala Asn Ala Leu Ala His Thr Leu Lys Arg Arg Gly Val 1865 1870 1875 Ala Gln His Asp Val Val Gly Ile Val Ala Glu Arg Ser Pro Glu 1880 1885 1890 Thr Ile Ile Gly Ile Leu Ala Ile Leu Lys Val Gly Ala Ile Tyr 1895 1900 1905 Leu Pro Ile Asp Pro Lys Leu Pro Gln Leu Thr Leu Gln His Ile 1910 1915 1920 Trp Arg Asp Ser Gly Ala Lys Val Leu Leu Gly Lys Asn Glu Thr 1925 1930 1935 Thr Val Glu Val Gly Lys Glu Val Pro Phe Val Asp Ile Glu Gly 1940 1945 1950 Asp Lys Gly Lys Gln Glu Glu Leu Val Cys Pro Ile Ser Pro Glu 1955 1960 1965 Asp Thr Ala Tyr Ile Met Tyr Thr Ser Gly Ser Thr Gly Lys Pro 1970 1975 1980 Lys Gly Val Met Val Thr His Arg Asn Ile Val Arg Leu Val Lys 1985 1990 1995 Asn Thr Asn Phe Val Ser Leu Gln Glu Gln Asp Val Leu Leu Gln 2000 2005 2010 Thr Gly Ser Leu Thr Phe Asp Ala Ala Thr Phe Glu Ile Trp Gly 2015 2020 2025 Ala Leu Leu Asn Gly Leu Thr Leu His Leu Val Glu Asp Tyr Val 2030 2035 2040 Ile Leu Asp Gly Glu Ala Leu Gln Glu Glu Ile Gln Gln Asn Lys 2045 2050 2055 Ala Thr Ile Met Trp Val Ser Ala Pro Leu Phe Asn Gln Leu Ala 2060 2065 2070 Asp Gln Asn Pro Ala Met Phe Thr Gly Ile Lys Gln Leu Leu Ile 2075 2080 2085 Gly Gly Asp Val Leu Ser Pro Lys His Ile Asn Lys Val Met Asp 2090 2095 2100 His Cys Ala Pro Ile Asn Ile Ile Asn Gly Tyr Gly Pro Thr Glu 2105 2110 2115 Asn Thr Thr Phe Ser Thr Ser Phe Val Ile Asp Gln Met Tyr Gln 2120 2125 2130 Asp Ser Ile Pro Ile Gly Thr Pro Ile Ala Asn Ser Ser Ala Tyr 2135 2140 2145 Ile Leu Asp Val His Gln Asn Ile Gln Pro Ile Gly Val Val Gly 2150 2155 2160 Glu Leu Cys Val Gly Gly Asp Gly Val Ala Lys Gly Tyr Val Asn 2165 2170 2175 Leu Glu Gln Leu Thr Glu Glu Arg Phe Ile Ala Asp Pro Phe Leu 2180 2185 2190 Lys Gly Ser Thr Met Tyr Arg Thr Gly Asp Tyr Val Lys Leu Leu 2195 2200 2205 Pro Asn Gly Asn Ile Gln Tyr Ile Gly Arg Val Asp Asn Gln Val 2210 2215 2220 Lys Ile Arg Gly Phe Arg Ile Glu Leu Glu Ala Ile Met Asn Thr 2225 2230 2235 Leu Lys Gln Cys Glu Ser Ile Lys Asp Val Ile Val Val Val Gln 2240 2245 2250 Glu Gln Asn Gly Tyr Lys Thr Leu Val Ala Tyr Val Val Gly Glu 2255 2260 2265 Glu Ser Leu Ser Ile Glu Thr Val Arg Ala Tyr Ala Lys Lys His 2270 2275 2280 Leu Ala Glu Tyr Met Val Pro Ser Gln Phe Ile Phe Ile Glu Glu 2285 2290 2295 Ile Pro Leu Ser Ile Asn Gly Lys Val Gln Tyr Ser Lys Leu Pro 2300 2305 2310 Lys Val Gln Glu Val Leu His Lys Lys Val Glu Thr Leu Leu Pro 2315 2320 2325 Glu Asn Arg Leu Glu Glu Ile Ile Leu Arg Val Tyr Arg Asp Val 2330 2335 2340 Leu Glu Lys Glu Asp Phe Gly Val Thr Asp Ser Phe Phe Ala Tyr 2345 2350 2355 Gly Gly Asp Ser Leu Leu Ser Ile Gln Val Val Ser Met Leu Lys 2360 2365 2370 Lys Glu Glu Ile Ala Val Asp Pro Lys Met Ile Phe Met His Thr 2375 2380 2385 Thr Val Arg Glu Leu Ala Lys Ala Cys Glu Asn Arg Pro Val Met 2390 2395 2400 Glu Glu Thr Lys Arg Thr Glu Lys Asp Tyr Leu Ile Gln Met Arg 2405 2410 2415 Glu Gly Ser Glu Glu Asp Ser Cys Ile Ile Phe Ala Pro Pro Ala 2420 2425 2430 Gly Gly Thr Val Leu Gly Tyr Ile Glu Leu Ala Arg Tyr Phe Glu 2435 2440 2445 Gly Ile Gly Asn Val Tyr Gly Leu Gln Ala Pro Gly Leu Tyr Asp 2450 2455 2460 Asp Glu Glu Pro Thr Phe Leu Asp Tyr Asp Glu Leu Val Gln Val 2465 2470 2475 Phe Leu Arg Ser Ile Glu Gly Thr Tyr Arg Pro Gly Gln Asp Tyr 2480 2485 2490 Leu Gly Gly His Ser Leu Gly Gly His Ile Ala Phe Gly Met Cys 2495 2500 2505 Cys Glu Leu Ile Lys Gln Gly Lys Ala Pro Lys Gly Leu Leu Ile 2510 2515 2520 Leu Asp Thr Thr Pro Ser Leu Gln Val Val Lys Gly Ala Lys Asp 2525 2530 2535 Glu Lys Ile Ala Glu Glu Asp Phe Lys Met Met Val Leu Ala Ala 2540 2545 2550 Gly Ile Gly Asn Met Met Gly Val Asp Pro Glu Glu Leu Lys Gln 2555 2560 2565 Leu Ser Tyr Glu Glu Ala Lys Thr Arg Val Val Ala Val Ala Gln 2570 2575 2580 Lys Asp Glu Lys Leu Lys Thr Phe Ile Asn Glu Thr Tyr Leu Asp 2585 2590 2595 Lys Tyr Leu Lys Leu Gln Ile His Ser Leu Leu Met Ser Arg Thr 2600 2605 2610 Leu Glu Leu Glu Lys Thr Gln Leu Asp Ile Pro Ile Lys Val Phe 2615 2620 2625 Lys Thr Gln Phe His Thr Glu Glu Leu Val Glu Arg Phe Asp Ala 2630 2635 2640 Trp His Asn Tyr Thr Asn Gln Ala Cys Thr Phe Ile Asp Ile Pro 2645 2650 2655 Gly Thr His Thr Thr Met Met Arg Leu Pro His Val Lys Glu Val 2660 2665 2670 Ala Lys Lys Ile Glu Glu Gln Leu 2675 2680 <210> 11 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> PCR primer for amplifying a 16SrRNA <400> 11 gttgcgctcg ttgcgggact taaccc 26 <210> 12 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> PCR primer for amplifying a 16SrRNA <400> 12 gttgcgctcg ttgcgggact taaccc 26

Claims (5)

  1. 구토독 산생 세레우스균과 구토독 비산생 세레우스균을 판별하기 위한 세레우스균 판별 방법으로서,
    서열 번호 1로 나타내는 염기 서열 및/또는 서열 번호 2로 나타내는 염기 서열을 갖는 핵산을 프라이머로서, RT-PCR을 적용하는 것을 특징으로 하는 세레우스균 판별 방법.
  2. RT-PCR에 의해 증폭 생산된 핵산의 생산량으로부터 구토독 산생 세레우스균과 구토독 비산생 세레우스균을 판별하기 위한 세레우스균 판별용 키트로서,
    적어도 서열 번호 1로 나타내는 염기 서열을 갖는 핵산 및/또는 서열 번호 2로 나타내는 염기 서열을 갖는 핵산과,
    DNA 증폭용 효소와,
    DNA 합성용 시약과,
    DNA 검출용 시약을 포함하는 것을 특징으로 하는 세레우스균 판별용 키트.
  3. 제2항에 있어서, mRNA에서 cDNA를 합성하기 위한 DNA 합성 효소를 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 세레우스균 판별용 키트.
  4. RT-PCR에 의해 증폭 생산된 핵산의 생산량으로부터 구토독 산생 세레우스균 과 구토독 비산생 세레우스균을 판별하기 위해 이용되는 서열 번호 1로 나타내는 염기 서열을 갖는 핵산.
  5. RT-PCR에 의해 증폭 생산된 핵산의 생산량으로부터 구토독 산생 세레우스균과 구토독 비산생 세레우스균을 판별하기 위해 이용되는 서열 번호 2로 나타내는 염기 서열을 갖는 핵산.
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