WO2007119279A1 - コイヘルペスウイルス（ｋｈｖ）病用ｄｎａワクチン - Google Patents

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WO2007119279A1
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Takashi Aoki
Ikuo Hirono
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    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/16011—Herpesviridae
    • C12N2710/16022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
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    • C12N2710/16011—Herpesviridae
    • C12N2710/16034—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein

Definitions

  • KHV Koi herpesvirus
  • the present invention relates to a DNA vaccine for inducing protective immunity against Koi herpesvirus (KHV) infection in fish.
  • KHV Koi herpesvirus
  • Koi herpesvirus disease is a disease that occurs in maggots and shikigoi due to infection with koi herpesvirus (KHV), and when it develops, its ability to slow down and stop eating External symptoms include faint discoloration and erosion (sagging), which occurs from juveniles to adults, and is a disease with a high mortality rate.
  • KHV koi herpesvirus
  • Vaccines are generally used for the prevention or treatment of viral infections.
  • inactive vaccines Japanese encephalitis, Weil disease, etc.
  • toxoids toxoids
  • attenuated vaccines BCG, polio, etc.
  • genetically modified vaccines hepatitis B virus, etc.
  • Inactive vaccines and toxoids detoxified with exotoxins are relatively safe vaccines that induce antibodies against them.
  • Genetically modified vaccines are considered safer because they do not contain impurities when compared to inactivated vaccines.
  • Vibrio disease inactive vaccine In addition, currently approved as a marine vaccine in Japan, Vibrio disease inactive vaccine, ⁇ -hemolytic streptococcal disease inactive vaccine, iridovirus infection inactive vaccine, j8 hemolysis Sexual streptococcal inactive vaccine only.
  • DNA vaccine a new vaccine species that induces immunity
  • the disadvantages of type vaccines have been improved.
  • DNA vaccines can induce not only humoral immune responses but also cellular immunity, so that they can provide protection against infections and can be highly purified.
  • it is stable at room temperature or high temperature, refrigerated storage is not essential, it can be stored for a long time, it is easy to improve DNA vaccines quickly by genetic engineering techniques, and it is spent on vaccine development There are advantages such as time reduction.
  • Patent Document 1 Japanese Patent Laid-Open No. 9 176043
  • Patent Document 2 JP-A-2005-112726
  • Patent Document 3 Japanese Patent Laid-Open No. 2002-125674
  • Patent Document 4 Japanese Patent Laid-Open No. 9-285291
  • Non-Patent Document 1 P. Boudinot et.al, Virology, (USA), 1998, Vol.249, p.297-306
  • Non-patent Document 2 McLauchlan et.al, Fish and Shellfish Immunology, England, 2003, Vol.
  • An object of the present invention is to provide a carp DNA vaccine for inducing protective immunity against koi herpesvirus (KHV) disease.
  • the present inventors have intensively studied to develop an effective vaccine against koi herpesvirus (KHV) disease, and have developed all of koi herpesvirus (KHV) gene DNA in Japan, the United States, Israel, and Indonesia.
  • the base sequence was determined, and from among the approximately 180 genes, five genes encoding glycoherpesvirus (KHV) glycoproteins and five genes encoding membrane proteins were selected.
  • KHV glycoherpesvirus glycoproteins
  • membrane proteins encoding membrane proteins
  • the present invention provides (1) (a) glycoprotein of koi herpesvirus (KHV) comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8 or 10, (b) SEQ ID NO: 2, In the amino acid sequence shown in 4, 6, 8, or 10, one or several amino acids are deleted, substituted or appended, and the immunogenicity against koi herpesvirus (KHV).
  • KHV glycoprotein of koi herpesvirus
  • KHV koi herpesvirus
  • Koi herpesvirus (KHV) membrane protein (e) from the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 12, 14, 16, 18 or 20, wherein one or several amino acids are deleted, substituted or added A protein having immunogenicity against koi herpesvirus (KHV), or (f) an amino acid sequence having at least 80% homology with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 12, 14, 16, 18 or 20 And a DNA encoding a protein having immunogenicity against koi herpesvirus (KHV).
  • the present invention also relates to (6) DNA having the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 11, 13, 15, 17 or 19 or a complementary sequence thereof, and (7) SEQ ID NO: 11, 13, 15, 17 or 19 DNA encoding a protein having a nucleotide sequence in which one or several bases are deleted, substituted or added, and having immunogenicity against koi herpesvirus (KHV), (8) It hybridizes with DNA with stringency complementary to the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 11, 13, 15, 17 or 19 under stringent conditions and has immunogenicity against koi herpesvirus (KHV) DNA encoding the protein, (9) glycoprotein of koi herpesvirus (KHV) consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8 or 10, and (10) SEQ ID NO: 2, 4, 6 , 8 or 10, in the amino acid sequence 1 Or a protein having an amino acid sequence in which several amino acids are deleted, substituted or added, and having immunogenicity against k
  • the present invention provides (13) a recombinant vector comprising one or more DNAs selected from among the DNAs described in any one of (1) to (8) above, (14) the above ( The key force of the DNA described in any one of 1) to (8) is also selected.
  • the DNA vaccine for caries containing 1 or 2 or more DNAs (15) The DNA vaccine for caries containing the recombinant vector of (13) above, (16) A method for preventing or treating koi herpesvirus (KHV) disease, comprising administering to the carp the DNA vaccine for carp described in (14) or (15) above, (17) Use of the carp DNA vaccine described in 14) or (15) to induce an immune response against carp herpesvirus (KHV) disease, or (18) any of (9) to (12) above An antibody characterized by specifically recognizing the protein of (19) and a gene expression vector of the protein according to any one of (9) to (12) above. It can be obtained by introducing about trans di We nick Koi compound having a resistance to Le Bae scan virus (KHV) to Koi, wherein.
  • KHV koi herpesvirus
  • FIG. 1 is a diagram showing the results of a DNA vaccine test for KHV infection.
  • A Test results when each of the 5 types of glycoprotein genes is administered
  • B Test results when each of the 3 types of membrane protein genes is administered
  • FIG. 2 is a diagram showing the results of a test using a DNA combination vaccine for KHV infection.
  • the vertical axis represents cumulative mortality and the horizontal axis the number of days after KHV infection.
  • Groupl is a negative control test group.
  • Group2 is a membrane protein test group.
  • Group3 is a glycoprotein test group.
  • the DNA of the present invention includes (a) DNA encoding a koi herpesvirus (KHV) glycoprotein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8 or 10, and (b ) In the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8 or 10, consisting of an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added, and immunity against koi herpesvirus (KHV) DNA encoding a protein having an originality, (c) SEQ ID NO: 2, 4, DNA encoding a protein comprising an amino acid sequence having at least 80% homology with the amino acid sequence shown in 6, 8 or 10 and having immunogenicity against koi herpesvirus (KHV), or SEQ ID NO: 1 1 or several bases in the base sequence shown in SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7 or 9 or in the base sequence shown in SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7 or 9 DNA that encodes a protein having an immunogenicity against the parenthesus herpes
  • KHV koi herpesvirus
  • DNA consisting of a base sequence and encoding a protein having immunogenicity against koi herpesvirus (KHV), or DNA having a complementary sequence to the base sequence shown in SEQ ID NO: 11, 13, 15, 17 or 19 DNA that encodes a protein that hybridizes under stringent conditions and has immunogenicity against koi herpesvirus (KHV) is not particularly limited, and the protein of the present invention includes SEQ ID NO: In the amino acid sequence shown in 2, 4, 6, 8 or 10, the powerful koi herpesvirus (KHV) glycoprotein or the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8 or 10 A protein having an amino acid sequence deleted, substituted or added, and having immunogenicity against koi herpesvirus (KHV), SEQ ID NO: 12, Amino acid sequence shown in 14, 16, 18 or 20 In the koi herpesvirus (KHV) membrane protein consisting of a row or the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 12, 14, 16, 1 8 or 20, one or several amino
  • the protein is not particularly limited as long as the protein has an amino acid sequence and has immunogenicity against koi herpesvirus (KHV).
  • a protein having immunogenicity against koi herpesvirus (KHV) refers to a protein capable of stimulating and inducing an immune response (including humoral immunity and cellular immunity) against koi herpesvirus (KHV) when in vivo.
  • amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added is, for example, 1 to 20, preferably 1 to 15, more preferably 1 to: LO, and further preferably Means an amino acid sequence in which any number of 1 to 5 amino acids have been deleted, substituted or added.
  • base sequence in which one or several bases are deleted, substituted or added is, for example, 1 to 20, preferably 1 to 15, more preferably 1 to: LO, and still more preferably. It means a base sequence in which any number of 1 to 5 bases is deleted, substituted or added.
  • DNA consisting of a base sequence in which one or several bases are deleted, substituted or added is known to those skilled in the art such as chemical synthesis, genetic engineering techniques, mutagenesis, etc. It can also be produced by any method. Specifically, mutations are made to DNA consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, or 9 or DNA containing the base sequence shown in SEQ ID NO: 11, 13, 15, 17 or 19 Mutant DNA can be obtained by introducing a mutation into these DNAs using a method of contacting with the original drug, a method of irradiating with ultraviolet rays, a genetic engineering technique, or the like.
  • Site-directed mutagenesis which is one of genetic engineering techniques, is a technique that can introduce a specific mutation at a specific position.
  • Molecular Cloning A Laboratory Mannual, 3rd Ed., Cold bpnng Ha rbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY., 2001. (hereinafter abbreviated as "Molecular Cloning 3rd Edition"), Current Protocols in Molecular Biology, Supplement 1-38, John Wile y & Sons (1987-1997)
  • Molecular Cloning 3rd Edition Current Protocols in Molecular Biology, Supplement 1-38, John Wile y & Sons (1987-1997)
  • base sequence that hybridizes under stringent conditions refers to DNA or RN A base sequence obtained by using a nucleic acid such as A as a probe and using the colony hybridization method, plaque hybridization method, Southern blot hybridization method, etc. Specifically, using a filter in which DNA derived from colonies or plaques or a fragment of the DNA is immobilized, in the presence of 0.7 to 1.0 M Na C1, the hybridization is performed at 65 ° C. After washing, the filter is washed at 65 ° C using 0.1 to 2 times the SSC solution (1x concentration of SSC solution is 150 mM sodium chloride and 15 mM sodium citrate). Can identify the DNA that can be identified. Hybridization can be performed according to the method described in Molecular Cloning 3rd edition and the like.
  • the stringent condition refers to a condition in which a so-called specific hybrid is formed and non-specific hybrids and hybrids are not formed. Specifically, a homology of 50 to 70% or more is required.
  • the condition is that the DNAs that have DNA hybridize and the DNAs with lower homology do not hybridize with each other are the conditions for normal Southern hybridization washing at 65 ° C, IX SSC, 0.1 0/0 SDS, also ⁇ or 0. IX SSC, 0. 1 0/ 0 SDS into the threaded eyes those to Roh in salt concentration, can be mentioned Iburidizu conditions.
  • DNA that can be hybridized under stringent conditions includes DNA having a certain degree of homology with the base sequence of the DNA used as a probe, for example, 60% or more, preferably 70%.
  • a DNA having a homology of at least%, more preferably at least 80%, further preferably at least 90%, particularly preferably at least 95%, most preferably at least 98% can be suitably exemplified.
  • the method for obtaining and preparing the DNA of the present invention is not particularly limited.
  • ⁇ MA, 11, 13, 15, 17 or ⁇ MA19 [Indicated base sequence information, SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8 or 10, or SEQ ID NO: 12, 14, 16, 18 or 20
  • appropriate probes and primers are prepared and used to screen the koi herpesvirus (KHV) DN ⁇ library to identify the gene of interest.
  • KHV koi herpesvirus
  • the method for obtaining and preparing the protein of the present invention is not particularly limited. However, it may be a chemically synthesized protein or a recombinant protein produced by gene recombination technology.
  • the protein of the present invention can be obtained by appropriately combining the methods for isolating and purifying the protein, such as cells or tissue that express the strong protein.
  • a protein is prepared by chemical synthesis, for example, according to a chemical synthesis method such as Fmoc method (fluorenylmethyloxycarbonyl method), tBoc method (t-ptyloxycarbonyl method), etc. Proteins can be synthesized.
  • the protein of the present invention can be synthesized using various commercially available peptide synthesizers.
  • the protein of the present invention can be prepared by introducing DNA consisting of a base sequence encoding the protein into a suitable expression system.
  • preparation by gene recombination technology that can be prepared in a large amount by a relatively easy operation is preferable.
  • the protein of the present invention is prepared by gene recombination technology
  • ammonium sulfate or ethanol precipitation in order to recover and purify the protein from the cell culture, ammonium sulfate or ethanol precipitation, acid extraction, key-on
  • a known method including cation exchange chromatography, phosphocellulose chromatography, hydrophobic interaction chromatography, affinity chromatography, hydroxyapatite chromatography and lectin chromatography, preferably high performance liquid chromatography is used.
  • the column used for the affinity chromatography is, for example, a column in which an antibody such as a monoclonal antibody against the protein of the present invention is bound, or a normal peptide tag added to the protein of the present invention.
  • purified products of these proteins can be obtained.
  • a purified sample can be obtained by performing the above-described purification treatment after allowing the cell membrane degrading enzyme to act.
  • amino acids are deleted, substituted, or added in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, or 10, or SEQ ID NO: 12, 14, 16, 18, or 20.
  • a protein having an amino acid sequence ability or a protein consisting of an amino acid sequence having 80% or more homology with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 is SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, or Is SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7 or 9, or SEQ ID NO: 11, which shows an example of the base sequence encoding the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 12, 14, 16, 18 or 20, respectively.
  • Those skilled in the art can appropriately prepare or obtain the information based on the nucleotide sequence information shown in 13, 15, 17 or 19.
  • the recombinant vector of the present invention is a set capable of expressing a protein having the gene DNA of the present invention and having immunogenicity against a coil herpesvirus (KHV) in a carp in vivo.
  • the recombinant vector is not particularly limited as long as it is a replacement vector, and the recombinant vector of the present invention can be constructed by appropriately integrating the gene DNA of the present invention into an expression vector.
  • the expression vector is preferably one that can replicate autonomously in the host cell, or one that can be integrated into the host cell's chromosome. Those containing the first order control sequences can be preferably used.
  • an expression vector for animal cells particularly a recombinant vector using an expression vector for fish cells is preferable.
  • the procedure and method for constructing an expression vector that can be used in the present invention are in the field of genetic engineering. It can be used conventionally.
  • Examples of the control sequence that can be used in the present invention include a constitutive promoter, an inducible or regulatory promoter, a tissue-specific promoter, or a promoter derived from the gene of the expressed antigen. It is not particularly limited as long as it can be expressed in the cells.
  • Constitutive promoters include, for example, cytomegalovirus (CMV) derived promoter sequences, or Rous sarcoma virus (RSV), simian virus-40 (SV-40), muscle 13 actin promoter, or simple herpes. Examples include strong promoters such as viruses (HSV).
  • Examples of the tissue-specific promoter include a thymidine kinase promoter.
  • inducible or regulatable promoters include growth hormone regulatable promoters, promoters under the control of the lac operon sequence, and dumbbell inducible metamouthoneone promoter.
  • the transcriptional regulatory sequence can be operably linked to a nucleotide sequence encoding an immunogenic polypeptide (ie, so that expression of the nucleotide sequence can be regulated).
  • the control sequence may include an expression control sequence including a promoter (eg, the inducible or constitutive promoter) DNA sequence, and if desired, further enhancer element, transcription or polyadenylation signal.
  • a promoter eg, the inducible or constitutive promoter
  • the expression vector may be a bacterial replication origin sequence, or an antibiotic resistance (eg, kanamycin) gene or a non-antibiotic resistance gene (eg, a j8-galatatosidase gene), if desired. ) And other selectable markers.
  • an antibiotic resistance eg, kanamycin
  • a non-antibiotic resistance gene eg, a j8-galatatosidase gene
  • the carp DNA vaccine of the present invention includes a composition containing one or more selected DNAs of the DNA of the present invention and a composition containing the above-described recombinant vector of the present invention.
  • a composition containing one or more selected DNAs of the DNA of the present invention and a composition containing the above-described recombinant vector of the present invention.
  • it is not particularly limited, it consists of a cocktail of 5 kinds of DNA consisting of the base sequences shown in SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7 and 9 and a base sequence shown in SEQ ID NOs: 11, 13, 15, 17 and 19.
  • a cocktail of 5 types of DNA, a cocktail of these 10 types of DNA, and a recombinant vector capable of expressing these DNA cocktails are preferred.
  • an adjuvant can be added to the DNA vaccine for core of the present invention.
  • Adjuvants stimulate the immune system and enhance the immune response to antigens, and are mainly added to vaccines as adjuvants.
  • a typical adjuvant for example, an aluminum compound, a polynucleotide, or a force known to have a bacterial cell component, such as Coi IL 1 j8 zebra IFN-a, etc. can be suitably exemplified.
  • a plasmid into which IL-1 ⁇ gene or IFN- ⁇ gene is inserted so that it can be expressed in the body can be prepared and inoculated into fish together with the vaccine of the present invention.
  • KHV koi herpesvirus
  • the fish to which the carp DNA vaccine of the present invention can be applied is not particularly limited as long as it is a fish that can be infected by koi herpesvirus (KHV). Name Nishikigoi It can be done.
  • antibodies that specifically bind to the protein of the present invention include monoclonal antibodies, polyclonal antibodies, chimeric antibodies, single chain antibodies, humanized antibodies and the like. These are the powers that can be prepared by conventional methods using the above-mentioned glycoproteins and membrane proteins as antigens. Among them, monoclonal antibodies are more preferable in terms of their specificity.
  • An antibody that specifically binds to the protein of the present invention, such as a strong monoclonal antibody, is useful for, for example, separation and quantification of the protein of the present invention and to elucidate the molecular mechanism of the protein of the present invention.
  • the antibody against the protein of the present invention can be obtained by administering a fragment containing the protein or epitope or a cell expressing the protein on the membrane surface to an animal (preferably a non-human) using a conventional protocol.
  • an animal preferably a non-human
  • the preparation of monoclonal antibodies may result in antibodies produced by continuous cell line cultures, such as the hypridoma method (Nature 256, 495-497, 1975), the trioma method, the human B cell hyperpridoma. Any method can be used such as the method (Immunology Today 4, 72, 1983) and the EBV-hybridoma method (Monoclonal Antibodies and Cancer The rapy, pp. 77-96, Alan R. Liss, Inc., 1985).
  • the antibodies such as the monoclonal antibody of the present invention include, for example, fluorescent substances such as FITC (fluorescein isocyanate) or tetramethylrhodamine isocyanate, 125 i, 32 P, 14 C, 35 S or 3 H
  • fluorescent substances such as FITC (fluorescein isocyanate) or tetramethylrhodamine isocyanate, 125 i, 32 P, 14 C, 35 S or 3 H
  • FITC fluorescein isocyanate
  • tetramethylrhodamine isocyanate tetramethylrhodamine isocyanate
  • a protein labeled with an enzyme such as alkaline phosphatase, peroxidase, / 3-galatatosidase or phycoerythrin
  • a fusion protein fused with a fluorescent protein such as green fluorescent protein (GFP)
  • GFP green fluorescent protein
  • transgenes that are resistant to the koi herpesvirus of the present invention include transgenes obtained by gene transfer of one or more gene expression vectors of the protein of the present invention. If it is a carp, it is not particularly limited.
  • a promoter that efficiently expresses the protein gene of the present invention in carp cells Connected downstream of It is preferable to produce an expression vector.
  • Such promoters include: 13-actin Promo ⁇ ⁇ "Ta ' ⁇ ", aaipocyteP2 aP2) Flomo ⁇ Ta' ⁇ , Mylz2 (Danio reno myosin light polypeptide 2 skeletalmuscle mylz2) promoter, UCP promoter, SV40 promoter, site Mega viral promoter, EF1 alpha promoter, meta port Chio Ne Inn promoter primary, and power among them medaka ⁇ - Akuchinpu port motor can be exemplified heat shock promoter, my l z 2 promoter is preferable in terms of expression efficiency.
  • a polyaformati silkworm sequence such as a ushi growth hormone polyadulylated sequence downstream of the protein gene of the present invention.
  • an intron sequence an enzyme sequence having a function of enhancing gene expression, or a terminator sequence for instructing transcription termination may be used.
  • the constructed expression vector can be introduced into the carp by a microinjection method into an oocyte or a fertilized egg, a viral vector infection method, a particle gun method, or an elect mouth position method.
  • the transgenic caries of the present invention include, for convenience, carp fertilized egg cells, carp embryo cells, and the like, in addition to carp adults and progeny into which the protein gene of the present invention has been introduced.
  • HV-g4-R SEQ ID NO: 28 5 '-TCAGAGTTCGTCTCTGATG G-3'
  • KHV-ml F SEQ ID NO: 31 5'-ATGACGGAGCGGGCAGCGCT-3 '
  • the PCR amplified DNA was cloned into the gene expression vector pcDNA3.1 and introduced into E. coli.
  • the transformed Escherichia coli was cultured in large quantities, and plasmid DNA was extracted and purified. Purification of the plasmid was performed by ultracentrifugation using molecular salt cesium (Molecular Cloning 3rd edition) o
  • a vaccine test was conducted in the same manner as described above. At this time, 5 types of glycoprotein genes (group2) and 5 types of membrane protein genes (group3) were mixed and inoculated. As a negative control, vector plasmid DNA alone (groupl) was inoculated. For 30 days after vaccination, breeding was carried out in a circulating filtration tank at 23 ° C, and infection experiments were conducted as described above.o
  • the carp DNA vaccine of the present invention can confer immunity against carp herpes virus disease caused by koi herpes virus (KHV). More specifically, according to the DNA vaccine for koi of the present invention, an immune response (including a humoral immune response and a cellular immune response) against koi herpesvirus disease can be induced. It is effective in preventing the infection of Luz (KHV) or treating Koi herpesvirus disease.
  • KHV koi herpes virus

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Abstract

　コイのコイヘルペスウイルス（ＫＨＶ）病に対する防御免疫を誘導するための魚類用ＤＮＡワクチンを提供するものである。前記ＤＮＡワクチンは、コイのコイヘルペスウイルス（ＫＨＶ）に対する免疫原性ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むＤＮＡ、又は前記ＤＮＡを含む発現ベクターを有効成分として含む。

Description

明 細 書
コィヘルぺスウィルス (KHV)病用 DNAワクチン 技術分野
[0001] 本発明は、コィヘルぺスウィルス (Koi herpesvirus ; KHV)の魚類への感染症に対 する防御免疫を誘導するための DNAワクチンに関する。
背景技術
[0002] コィヘルぺスウィルス病は、コィヘルぺスウィルス (KHV)に感染することによりマゴ ィや-シキゴィに発生する病気で、発病すると行動が緩慢になったり餌を食べなくな る力 目立った外部症状は少なぐ鰓の退色やびらん (ただれ)などが見られ、幼魚か ら成魚までに発生し、死亡率が高い病気である。
[0003] 前記コィヘルぺスウィルス病は、 1998年 5月にイスラエルにて、最初の発症の報告 がなされた。その後、同じイスラエルにおいて、その年の秋と翌年の春との 2度発症し 、輸出用のコィを含めて約 600トンのコィが死滅した。被害総額は 400万ドルを超え るものであった。その後も世界各国 (イスラエル、英国、ドイツ、オランダ、ベルギー、 米国、インドネシア、台湾)で次々と発症の報告がなされた。
[0004] わが国においても 2003年（平成 15年） 11月に農林水産省が茨城県の霞ケ浦にお いてコィヘルぺスウィルス病を疑うコィを確認したと発表して以来、青森、山梨、三重
、岡山、宫崎と各地でコィヘルぺスウィルス病の発生が報告されている。農林水産省 でも感染経路の特定をはじめとして、この病気の拡散防止につ 、て努めて!/、るところ である。
[0005] 細菌感染に関しては、いくつかの魚介類用ワクチンが開発されているものの、ウイ ルス性疾患又は寄生性疾患に効果のあるワクチンは、サケ科魚類の一部及びスズキ 目のイリドウィルスに対するワクチン (例えば、特許文献 1参照。）が開発されているの みでほとんど開発されて!ヽな ヽ。
[0006] ウィルス感染症の予防又は治療には、一般的にワクチンが使用されている。ヮクチ ンには不活ィ匕ワクチン（日本脳炎、ワイル病など）、トキソイド (破傷風、ジフテリアなど )、弱毒ワクチン (BCG、ポリオなど）、遺伝子組換えワクチン (B型肝炎ウィルスなど） などがある。不活ィ匕ワクチン及び外毒素を無毒化したトキソイドは、これらに対する抗 体を誘導する比較的安全なワクチンである。遺伝子組換えワクチンは、不活化ヮクチ ンと比較すると、不純物を含まないので、より安全なワクチンと考えられている。また、 現在わが国で水産用ワクチンとして認可されているのは、ビブリオ病不活性ィ匕ヮクチ ン、 α溶血性レンサ球菌症不活性ィ匕ワクチン、イリドウィルス感染症不活性ィ匕ヮクチ ン、 j8溶血性レンサ球菌不活性ィ匕ワクチンのみである。
[0007] し力しながら、これらのワクチンにおいて抗体産生は誘導することができる力 細胞 性免疫は誘導されにくいのが欠点である。また、不活ィ匕ワクチン及び弱毒ワクチンは 、抗原となるウィルスを産業的には大量に得ることが必要であり、適当な細胞の確保 が必須である。更に、弱毒ワクチンで獲得した免疫効果は、長期間維持される場合が 多いが、一方で副作用、危険性が指摘されている。不活化ワクチン及び遺伝子組換 えワクチンは、抗原の持続性が宿主内において短いと考えられており、アジュバント などを必要とする。これら従来型のワクチンは製造から被検体に接種するまでの間、 冷蔵保存する必要があるため、コストの増加と効力の低下が生じる問題点があった。
[0008] 最近、ワクチンの研究開発が進み、免疫原性タンパク質をコードするプラスミド DN Aの投与をすることにより、免疫誘発をもたらす新しいワクチン種 (DNAワクチン）が 開発され、次に述べるような従来型ワクチンの不利益が改善されてきている。すなわ ち、 DNAワクチンは、体液性免疫応答のみならず、細胞性免疫を強力に誘導できる ので、感染症に対する防御能を賦与することが可能となること、また、高度に純ィ匕でき ること、室温又は高温下でも安定であり、冷蔵保存は必須でなく長期間の貯蔵が可 能であること、遺伝子工学的手法により DNAワクチンの迅速な改良がし易いこと、及 びワクチン開発に費やす時間の短縮などの利点がある。
[0009] 例えば、ラブドウィルス (Rhabdovirus)の構成タンパク質のグリコプロテインをコード して 、る遺伝子を筋肉に注射することによって、 -ジマスの免疫応答を刺激すること（ 例えば、非特許文献 1参照。）や、 DNAワクチンについて報告がなされている（例え ば、非特許文献 2参照。 ) 0また、ヒラメのウィルス性出血性敗血症に対する DNAワク チン (例えば、特許文献 2参照。）や、伝染性造血器壊死症 (IHN)ウィルスのアポト 一シス誘導タンパク質をコードするウィルスに対する DNAワクチン (例えば、特許文 献 3参照。）や、免疫原性ポリペプチドの発現を誘導しうる遺伝子発現系を用いた養 殖種用 DNAワクチン (例えば、特許文献 4参照。）などが提案されている。しかし、コ ィのコィヘルぺスウィルス病に対する防御免疫を刺激するための DNAワクチンの報 告はない。
[0010] 特許文献 1 :特開平 9 176043号公報
特許文献 2：特開 2005 - 112726号公報
特許文献 3：特開 2002— 125674号公報
特許文献 4：特開平 9 - 285291号公報
非特許文献 1 : P. Boudinot et.al , Virology, (USA) , 1998, Vol.249, p.297- 306 非特許文献 2 :McLauchlan et.al, Fish and Shellfish Immunology , England, 2003, Vol
.15, p.39-50
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0011] 本発明の課題は、コィヘルぺスウィルス (KHV)病に対する防御免疫を誘導するた めのコィ用 DNAワクチンを提供することにある。
課題を解決するための手段
[0012] 本発明者らは、コィヘルぺスウィルス (KHV)病に対する有効なワクチンを開発する ために鋭意研究し、 日本、アメリカ、イスラエル、インドネシアの各コィヘルぺスウィル ス (KHV)遺伝子 DNAの全塩基配列を決定し、約 180ある遺伝子の中から、コィへ ルぺスウィルス (KHV)のグリコプロテインをコードする 5種類の遺伝子や膜タンパク 質をコードする 5種類の遺伝子を選択し、これらの遺伝子を組み込んだプラスミド DN Aをコィに接種 (筋肉注射）したところ、コィのコィヘルぺスウィルス (KHV)に対する 免疫効果を有することを見い出し、本発明を完成するに至った。
[0013] すなわち本発明は、（1) (a)配列番号 2, 4, 6, 8又は 10に示されるアミノ酸配列から なるコィヘルぺスウィルス（KHV)のグリコプロテイン、（b)配列番号 2, 4, 6, 8又は 10 に示されるアミノ酸配列において、 1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付 カロされたアミノ酸配列カゝらなり、かつコィヘルぺスウィルス (KHV)に対する免疫原性 を有するタンパク質、又は (c)配列番号 2, 4, 6, 8又は 10に示されるアミノ酸配列と 少なくとも 80%以上の相同性を有するアミノ酸配列力 なり、かつコィヘルぺスウィル ス (KHV)に対する免疫原性を有するタンパク質をコードする DNAや、（2)配列番号 1, 3, 5, 7又は 9に示される塩基配列若しくはその相補的配列力 なる DNAや、 (3) 配列番号 1, 3, 5, 7又は 9に示される塩基配列において、 1若しくは数個の塩基が欠 失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、かつコィヘルぺスウィルス (KHV)に 対する免疫原性を有するタンパク質をコードする DNAや、（4)配列番号 1, 3, 5, 7 又は 9に示される塩基配列に相補的な配列力 なる DNAとストリンジヱントな条件下 でハイブリダィズし、かつコィヘルぺスウィルス (KHV)に対する免疫原性を有するタ ンパク質をコードする DNAや、（5) (d)配列番号 12, 14, 16, 18又は 20に示される アミノ酸配列からなるコィヘルぺスウィルス (KHV)の膜タンパク質、（e)配列番号 12, 14, 16, 18又は 20に示されるアミノ酸配列において、 1若しくは数個のアミノ酸が欠 失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつコィヘルぺスウィルス (KHV) に対する免疫原性を有するタンパク質、又は (f)配列番号 12, 14, 16, 18又は 20に 示されるアミノ酸配列と少なくとも 80%以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、 かつコィヘルぺスウィルス (KHV)に対する免疫原性を有するタンパク質をコードす る DNAに関する。
また本発明は、（6)配列番号 11, 13, 15, 17又は 19に示される塩基配列若しくは その相補的配列力もなる DNAや、（7)配列番号 11, 13, 15, 17又は 19に示される 塩基配列において、 1若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配 列からなり、かつコィヘルぺスウィルス (KHV)に対する免疫原性を有するタンパク質 をコードする DNAや、（8)配列番号 11, 13, 15, 17又は 19に示される塩基配列に 相補的な配列力もなる DNAとストリンジェントな条件下でノヽイブリダィズし、かつコィ ヘルぺスウィルス (KHV)に対する免疫原性を有するタンパク質をコードする DNA や、（9)配列番号 2, 4, 6, 8又は 10に示されるアミノ酸配列からなるコィヘルぺスゥ ィルス（KHV)のグリコプロテインや、（10)配列番号 2, 4, 6, 8又は 10に示されるァ ミノ酸配列において、 1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたァミノ 酸配列からなり、かつコィヘルぺスウィルス (KHV)に対する免疫原性を有するタン パク質や、（11)配列番号 12, 14, 16, 18又は 20に示されるアミノ酸配列からなるコ ィヘルぺスウィルス（KHV)の膜タンパク質や、（12)配列番号 12, 14, 16, 18又は 20に示されるアミノ酸配列において、 1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは 付加されたアミノ酸配列カゝらなり、かつコィヘルぺスウィルス (KHV)に対する免疫原 性を有するタンパク質に関する。
[0015] さらに本発明は、（13)上記（1)〜（8)のぃずれか記載のDNAの中カも選ばれる1 又は 2以上の DNAを含む組換えベクターや、（14)上記（1)〜（8)のいずれか記載 の DNAの中力も選ばれる 1又は 2以上の DNAを含むコィ用 DNAワクチンや、（15) 上記（ 13)記載の組換えベクターを含むコィ用 DNAワクチンや、（ 16)上記（ 14)又 は（15)記載のコィ用 DNAワクチンをコィに投与することを特徴とする、コィヘルぺス ウィルス (KHV)病の予防又は治療方法や、 (17)上記（14)又は（15)記載のコィ用 DNAワクチンの、コィのコィヘルぺスウィルス（KHV)病に対する免疫応答の誘発へ の使用方法や、（18)上記（9)〜（12)のいずれか記載のタンパク質を特異的に認識 することを特徴とする抗体や、（19)上記（9)〜（12)のいずれか記載のタンパク質の 遺伝子発現ベクターを遺伝子導入することによって得られることを特徴とするコィへ ルぺスウィルス (KHV)に抵抗性を有するトランスジヱニックコィ類に関する。
図面の簡単な説明
[0016] [図 1]KHV感染症に対する DNAワクチン試験結果を示す図である。（A) 5種類のグ リコプロテイン遺伝子それぞれを投与した場合の試験結果 (B) 3種類の膜タンパク質 遺伝子それぞれを投与した場合の試験結果
[図 2]KHV感染症に対する DNA混合ワクチンを用いた試験結果を示す図である。 縦軸は累積死亡率を、横軸は KHV感染後の日数を示した。 Grouplは陰性コント口 ール試験区 Group2は膜プロテイン試験区 Group3はグリコプロテイン試験区 発明を実施するための最良の形態
[0017] 本発明の DNAとしては、（a)配列番号 2, 4, 6, 8又は 10に示されるアミノ酸配列か らなるコィヘルぺスウィルス (KHV)のグリコプロテインをコードする DNAや、（b)配列 番号 2, 4, 6, 8又は 10に示されるアミノ酸配列において、 1若しくは数個のアミノ酸が 欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつコィヘルぺスウィルス (KH V)に対する免疫原性を有するタンパク質をコードする DNAや、（c)配列番号 2, 4, 6, 8又は 10に示されるアミノ酸配列と少なくとも 80%以上の相同性を有するアミノ酸 配列からなり、かつコィヘルぺスウィルス (KHV)に対する免疫原性を有するタンパク 質をコードする DNAや、配列番号 1, 3, 5, 7又は 9に示される塩基配列若しくはそ の相補的配列力 なる DNAや、配列番号 1, 3, 5, 7又は 9に示される塩基配列にお いて、 1若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、か っコィヘルぺスウィルス (KHV)に対する免疫原性を有するタンパク質をコードする D NAや、配列番号 1, 3, 5, 7又は 9に示される塩基配列に相補的な配列力 なる DN Aとストリンジェントな条件下でハイブリダィズし、かつコィヘルぺスウィルス（KHV)に 対する免疫原性を有するタンパク質をコードする DNAや、（d)配列番号 12, 14, 16 , 18又は 20に示されるアミノ酸配列からなるコィヘルぺスウィルス (KHV)の膜タンパ ク質をコードする DNAや、（e)配列番号 12, 14, 16, 18又は 20に示されるアミノ酸 配列において、 1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配 列からなり、かつコィヘルぺスウィルス (KHV)に対する免疫原性を有するタンパク質 をコードする DNAや、（f)配列番号 12, 14, 16, 18又は 20に示されるアミノ酸配列 と少なくとも 80%以上の相同性を有するアミノ酸配列力 なり、かつコィヘルぺスウイ ルス (KHV)に対する免疫原性を有するタンパク質をコードする DNAや、配列番号 1 1, 13, 15, 17又は 19に示される塩基配列若しくはその相補的配列力もなる DNA や、配列番号 11, 13, 15, 17又は 19に示される塩基配列において、 1若しくは数個 の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、かつコィヘルぺスウィル ス (KHV)に対する免疫原性を有するタンパク質をコードする DNAや、配列番号 11 , 13, 15, 17又は 19に示される塩基配列に相補的な配列力もなる DNAとストリンジ ェントな条件下でハイブリダィズし、かつコィヘルぺスウィルス（KHV)に対する免疫 原性を有するタンパク質をコードする DNAであれば特に制限されるものでなぐまた 、本発明のタンパク質としては、配列番号 2, 4, 6, 8又は 10に示されるアミノ酸配列 力 なるコィヘルぺスウィルス（KHV)のグリコプロテインや、配列番号 2, 4, 6, 8又 は 10に示されるアミノ酸配列において、 1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しく は付加されたアミノ酸配列カゝらなり、かつコィヘルぺスウィルス (KHV)に対する免疫 原性を有するタンパク質や、配列番号 12, 14, 16, 18又は 20に示されるアミノ酸配 列からなるコィヘルぺスウィルス（KHV)の膜タンパク質や、配列番号 12, 14, 16, 1 8又は 20に示されるアミノ酸配列において、 1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若 しくは付加されたアミノ酸配列カゝらなり、かつコィヘルぺスウィルス (KHV)に対する 免疫原性を有するタンパク質であれば特に制限されず、本発明において、コィヘル ぺスウィルス (KHV)に対する免疫原性を有するタンパク質とは、コィ生体内に入つ た場合にコィヘルぺスウィルス (KHV)に対する免疫（体液性免疫及び細胞性免疫 を含む)応答を生体内で刺激'誘導することができるタンパク質をいう。
[0018] 上記「1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列」とは 、例えば 1〜20個、好ましくは 1〜15個、より好ましくは 1〜： LO個、さらに好ましくは 1 〜5個の任意の数のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を意味す る。また、上記「1若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列」と は、例えば 1〜20個、好ましくは 1〜15個、より好ましくは 1〜： LO個、さらに好ましくは 1〜5個の任意の数の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列を意味する。
[0019] 例えば、これら 1若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列か らなる DNA (変異 DNA)は、化学合成、遺伝子工学的手法、突然変異誘発などの 当業者に既知の任意の方法により作製することもできる。具体的には、配列番号 1, 3 , 5, 7又は 9に示される塩基配列からなる DNAや、配列番号 11, 13, 15, 17又は 1 9に示される塩基配列を含む DNAに対し、変異原となる薬剤と接触作用させる方法 、紫外線を照射する方法、遺伝子工学的な手法等を用いて、これら DNAに変異を 導入することにより、変異 DNAを取得することができる。遺伝子工学的手法の一つで ある部位特異的変異誘発法は特定の位置に特定の変異を導入できる手法であること 力ら 用であり、 Molecular Cloning: A Laboratory Mannual, 3rd Ed., Cold bpnng Ha rbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY.,2001. (以後"モレキュラークロー-ング第 3版 と略す)、 CurrentProtocols in Molecular Biology, Supplement l〜38,John Wile y & Sons (1987-1997)等に記載の方法に準じて行うことができる。この変異 DNAを適 切な発現系を用いて発現させることにより、 1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若 しくは付加されたアミノ酸配列力もなるタンパク質を得ることができる。
[0020] 上記「ストリンジェントな条件下でハイブリダィズする塩基配列」とは、 DNA又は RN Aなどの核酸をプローブとして使用し、コロニ一'ハイブリダィゼーシヨン法、プラーク ハイブリダィゼーシヨン法、あるいはサザンブロットハイブリダィゼーシヨン法等を用い ることにより得られる塩基配列を意味し、具体的には、コロニーあるいはプラーク由来 の DNAまたは該 DNAの断片を固定化したフィルターを用いて、 0. 7〜1. 0Mの Na C1存在下、 65°Cでノ、イブリダィゼーシヨンを行った後、 0. 1〜2倍程度の SSC溶液（ 1倍濃度の SSC溶液の組成は、 150mM塩ィ匕ナトリウム、 15mMクェン酸ナトリウム） を用い、 65°C条件下でフィルターを洗浄することにより同定できる DNAをあげること ができる。ハイブリダィゼーシヨンは、モレキュラークローユング第 3版等に記載されて V、る方法に準じて行うことができる。
[0021] すなわち、ストリジェントな条件下とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、 非特異的なノ、イブリツドが形成されない条件をいい、具体的には、 50〜70%以上の 相同性を有する DNA同士がハイブリダィズし、それより相同性が低い DNA同士が ハイブリダィズしな 、条件ある 、は通常のサザンハイブリダィゼーシヨンの洗 ヽの条 件である 65°C、 I X SSC, 0. 10/0SDS、又 ίま 0. I X SSC, 0. 10/0SDSにネ目当する 塩濃度でノ、イブリダィズする条件を挙げることができる。例えば、ストリンジェントな条 件下でハイブリダィズすることができる DNAとしては、プローブとして使用する DNA の塩基配列と一定以上の相同性を有する DNAが挙げることができ、例えば 60%以 上、好ましくは 70%以上、より好ましくは 80%以上、さらに好ましくは 90%以上、特に 好ましくは 95%以上、最も好ましくは 98%以上の相同性を有する DNAを好適に例 示することができる。
[0022] 本発明の DNAの取得方法や調製方法は特に限定されるものでなぐ本明細書中 【こ開示した酉己歹 U番号 1, 3, 5, 7又 ίま 9、ある!/ヽ ίま、 11, 13, 15, 17又 ίま 19【こ示され る塩基配列情報や、配列番号 2, 4, 6, 8又は 10、あるいは、配列番号 12, 14, 16, 18又は 20に示されるアミノ酸配列に示されるアミノ酸配列情報に基づいて適当なプ ローブやプライマーを調製し、それらを用いて、コィヘルぺスウィルス（KHV)の DN Αライブラリーをスクリーニングすることにより目的の遺伝子を単離したり、常法に従つ て化学合成により調製することができる。
[0023] 本発明のタンパク質の取得'調製方法は特に限定されず、天然由来のタンパク質 でも、化学合成したタンパク質でも、遺伝子組換え技術により作製した組換えタンパ ク質の何れでもよい。天然由来のタンパク質を取得する場合には、力かるタンパク質 を発現している細胞又は組織力ゝらタンパク質の単離 '精製方法を適宜組み合わせる ことにより、本発明のタンパク質を取得することができる。化学合成によりタンパク質を 調製する場合には、例えば、 Fmoc法 (フルォレニルメチルォキシカルボ-ル法)、 tB oc法 (t—プチルォキシカルボニル法)等の化学合成法に従って本発明のタンパク質 を合成することができる。また、各種の市販のペプチド合成機を利用して本発明のタ ンパク質を合成することもできる。遺伝子組換え技術によりタンパク質を調製する場合 には、該タンパク質をコードする塩基配列からなる DNAを好適な発現系に導入する ことにより本発明のタンパク質を調製することができる。これらの中でも、比較的容易 な操作でかつ大量に調製することが可能な遺伝子組換え技術による調製が好ましい
[0024] 例えば、遺伝子組換え技術によって、本発明のタンパク質を調製する場合、かかる タンパク質を細胞培養物から回収し精製するには、硫酸アンモ-ゥムまたはエタノー ル沈殿、酸抽出、ァ-オンまたはカチオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロース クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ァフィユティークロマトグラフィ 一、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィーおよびレクチンクロマトグラフィーを含め た公知の方法、好ましくは、高速液体クロマトグラフィーが用いられる。特に、了フィニ ティークロマトグラフィーに用いるカラムとしては、例えば、本発明のタンパク質に対す るモノクローナル抗体等の抗体を結合させたカラムや、上記本発明のタンパク質に通 常のペプチドタグを付加した場合は、このペプチドタグに親和性のある物質を結合し たカラムを用いることにより、これらのタンパク質の精製物を得ることができる。また、本 発明のタンパク質が細胞膜に発現している場合は、細胞膜分解酵素を作用させた後 、上記の精製処理を行うことにより精製標品を得ることができる。
[0025] さらに、配列番号 2, 4, 6, 8又は 10、あるいは、配列番号 12, 14, 16, 18又は 20 に示されるアミノ酸配列において 1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加 されたアミノ酸配列力 なるタンパク質、又は配列番号 2に示されるアミノ酸配列と 80 %以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質は、配列番号 2, 4, 6, 8又 は 10、あるいは、配列番号 12, 14, 16, 18又は 20に示されるアミノ酸配列をコード する塩基配列の一例をそれぞれ示す配列番号 1, 3, 5, 7又は 9、あるいは、配列番 号 11, 13, 15, 17又は 19に示される塩基配列の情報に基づいて当業者であれば 適宜調製又は取得することができる。
[0026] 本発明の組換えベクターとしては、前記本発明の遺伝子 DNAを含み、かつコィへ ルぺスウィルス (KHV)に対する免疫原性を有するタンパク質をコィの生体内で発現 することができる組換えベクターであれば特に制限されず、本発明の組換えベクター は、本発明の遺伝子 DNAを発現ベクターに適切にインテグレイトすることにより構築 することができる。発現ベクターとしては、宿主細胞において自立複製可能であるも のや、あるいは宿主細胞の染色体中へ組込み可能であるものが好ましぐまた、本発 明の遺伝子を発現できる位置にプロモーター、ェンハンサー、ターミネータ一等の制 御配列を含有しているものを好適に使用することができる。発現ベクターとしては、動 物細胞用発現ベクター、特に魚類細胞用発現ベクターを用いた組換えベクターが好 ましぐ本発明に用いることのできる発現ベクターの構築の手順及び方法は、遺伝子 工学の分野で慣用されて 、るものを用いることができる。
[0027] 本発明で用いることのできる制御配列としては、例えば、構成プロモーター、誘導 性又は調節性プロモーター、組織特異的プロモーター、又は発現されている抗原の 遺伝子由来のプロモーター等が挙げられるが、魚類の細胞内で発現可能である限り 、特にそれらに限定されない。構成プロモーターとしては、例えば、サイトメガロウィル ス（CMV)由来のプロモーター配列、又はラウス肉腫ウィルス（RSV)、シミアンウィル ス—40 (SV-40)、筋 13ァクチンプロモーター、又は単純へルぺスウィルス (HSV)な どの強力プロモーター等が挙げられる。組織特異的プロモーターとしては、例えば、 チミヂンキナーゼプロモーター等が挙げられる。誘導性又は調節性プロモーターとし ては、例えば、成長ホルモン調節性プロモーター、 lacオペロン配列の制御下にある プロモーター、又は亜鈴誘導性メタ口チォネインプロモーターを挙げることができる。 前記転写調節配列は、免疫原性ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に、操作 可能に (すなわち、前記ヌクレオチド配列の発現を調節することができるように)結合 させることがでさる。 [0028] 前記制御配列は、プロモーター（例えば、前記誘導性又は構成性プロモーター） D NA配列を含む発現制御配列を含むことができ、所望により、更に、ェンハンサー要 素、転写又はポリアデ-ルイ匕シグナル [例えば、シミアンウィルス 40 (SV— 40)又 はゥシ成長ホルモン由来]のスプライシングのためのイントロン配列、又は CpGモチ ーフとして知られて 、る免疫刺激 DN A配列のうち、 1つ若しくはそれ以上のコピーを 含むことができる。
[0029] また、発現ベクターは、所望により、例えば、細菌複製起点配列、あるいは、選別さ せるための抗生物質耐性 (例えば、カナマイシンなど)遺伝子又は非抗生物質耐性 遺伝子 (例えば、 j8—ガラタトシダーゼ遺伝子など)等の選択性マーカーを含むこと ができる。
[0030] 本発明のコィ用 DNAワクチンとしては、前記本発明の DNAの中力 選ばれる 1又 は 2以上の DNAを含む組成物や、上記本発明の組換えベクターを含む組成物であ れば特に制限されないが、配列番号 1 , 3, 5, 7及び 9に示される塩基配列からなる 5 種類の DNAのカクテルや、配列番号 11, 13, 15, 17及び 19に示される塩基配列 からなる 5種類の DNAのカクテルや、これら 10種類の DNAのカクテルや、これらの DNAカクテルを発現することができる組換えベクターが好ましい。また、本発明のコ ィ用 DNAワクチンにアジュバントを添加'配合することができる。アジュバントは、免疫 系を刺激して抗原に対する免疫反応を高めるものであり、主にワクチンに補助剤とし て添加される。代表的なアジュバントとしては、例えば、アルミニウム化合物、ポリヌク レオチド又は細菌の菌体成分などが知られている力 コィ IL 1 j8ゃゼブラ IFN— a 等を好適に例示することができ、これらはコィの体内で発現可能なように IL-1 β遺伝 子や IFN— α遺伝子を挿入したプラスミドを作製し、本発明のワクチンとともに魚類に 接種することちできる。
[0031] 本発明のコィ用 DNAワクチンをコィに投与することで、コィのコィヘルぺスウィルス
(KHV)病に対する免疫応答を誘発することができ、コィヘルぺスウィルス (KHV)病 の予防又は治療をすることができる。本発明のコィ用 DNAワクチンを適応することが できる魚類としては、コィヘルぺスウィルス (KHV)が感染する可能性のある魚類であ る限り、特に限定されるものではないが、例えば、マゴィゃニシキゴィを具体的に挙げ ることがでさる。
[0032] 本発明のタンパク質に特異的に結合する抗体としては、モノクローナル抗体、ポリク ローナル抗体、キメラ抗体、一本鎖抗体、ヒト化抗体等の免疫特異的な抗体を具体 的に挙げることができ、これらは上記グリコプロテインや膜タンパク質を抗原として用 いて常法により作製することができる力 その中でもモノクローナル抗体がその特異 性の点でより好ましい。力かるモノクローナル抗体等の本発明のタンパク質に特異的 に結合する抗体は、例えば、本発明のタンパク質の分離，定量や、本発明のタンパク 質の分子機構を明らかにする上で有用である。
[0033] 本発明のタンパク質に対する抗体は、慣用のプロトコールを用いて、動物 (好ましく はヒト以外）に該タンパク質若しくはェピトープを含む断片、又は該タンパク質を膜表 面に発現した細胞を投与することにより産生され、例えばモノクローナル抗体の調製 には、連続細胞系の培養物により産生される抗体をもたらす、ハイプリドーマ法 (Natu re 256, 495-497, 1975)、トリオ一マ法、ヒト B細胞ハイプリドーマ法（Immunology Toda y 4, 72, 1983)及び EBV—ハイブリドーマ法（Monoclonal Antibodies and Cancer The rapy, pp.77-96, Alan R.Liss, Inc., 1985)など任意の方法を用いることができる。
[0034] また上記本発明のモノクローナル抗体等の抗体に、例えば、 FITC (フルォレセイン イソシァネート)又はテトラメチルローダミンイソシァネート等の蛍光物質や、 125i、 32P 、 14C、 35S又は3 H等のラジオアイソトープや、アルカリホスファターゼ、ペルォキシダ ーゼ、 /3—ガラタトシダーゼ又はフィコエリトリン等の酵素で標識したものや、グリーン 蛍光タンパク質 (GFP)等の蛍光発光タンパク質などを融合させた融合タンパク質を 用いることによって、上記タンパク質の機能解析を行うことができる。また免疫学的測 定方法としては、 RIA法、 ELISA法、蛍光抗体法、プラーク法、スポット法、血球凝 集反応法、ォクタ口-一法等の方法を挙げることができる。
[0035] 本発明のコィヘルぺスウィルスに抵抗性を有するトランスジヱニックコィ類としては、 1又は 2以上の本発明のタンパク質の遺伝子発現ベクターを遺伝子導入することによ つて得られるトランスジエニックコィ類であれば特に制限されず、コィ類に、 1又は 2以 上の本発明のタンパク質遺伝子を導入する発現ベクターを構築する場合、本発明の タンパク質遺伝子をコィ類細胞で効率よく発現するプロモーターの下流に連結した 発現ベクターを作製することが好ましい。かかるプロモーターとしては、 13ーァクチン プロモ^ ~"タ' ~"、 aaipocyteP2 aP2)フ—ロモ ~~タ' ~~、 Mylz2 (Danio reno myosin light polyp eptide 2 skeletalmuscle mylz2)プロモーター、 UCPプロモーター、 SV40プロモーター 、サイトメガウィルスプロモーター、 EF1 αプロモーター、メタ口チォネインプロモータ 一、熱ショックプロモーター等を例示することができる力 中でもメダカ β—ァクチンプ 口モーターや、 mylz2プロモーターが発現効率の点で好ましい。また、 mRNAを安定 化させるために、本発明のタンパク質遺伝子の下流にゥシ成長ホルモンポリアデュル 化配列等のポリアデ-ルイ匕配列を連結することが好ましい。その他必要に応じて、遺 伝子の発現を増強させる機能を持つイントロン配列やェンノヽンサ一配列、転写終結 を指令するターミネータ一配列を用いることもできる。構築した発現ベクターのコィ類 への導入は、卵母細胞又は受精卵へのマイクロインジェクション法、ウィルスベクター 感染法、パーティクルガン法、エレクト口ポレーシヨン法によって行うことができる。な お、本発明のトランスジエニックコィ類には、本発明のタンパク質遺伝子が導入された コィ成体、その子孫の他、コィ受精卵細胞、コィ胚細胞なども便宜上含まれる。
[0036] 以下、実施例によって本発明を具体的に詳述するが、本発明はこれら実施例に限 定されるものではない。
実施例 1
[0037] 我々がゲノム解析を行った日本、アメリカおよびイスラエルで分離された KHVのゲ ノムにコードされている 5種類のグリコプロテイン遺伝子と 5種類の膜タンパク質遺伝 子の翻訳開始コドン力 翻訳終止コドンまでをポリメラーゼ連鎖反応（Polymerase cha in reaction : PCR)により増幅した。使用したプライマーセットを表 1に示した。 PCRの 際の铸型 DNAは日本で分離された KHV— Jを用いた。 PCRの条件は、 95°Cで 30 秒、 55°Cで 30秒、 72°Cで 30秒を 1サイクルとし、 30サイクル行った。
[0038] [表 1] KHV-gl -F E列番号 21 5' -ATGCGTGCCAGCTTTGGCAG-3'
KHV-gl-R 配列番号 22 5' -TCACCCCGCAGAGGTACCAT-3'
KHV-g2-F 配列番号 23 5' -ATGTACCAGCAGCAATAGCA-3'
KHV-g2-R E列番号 24 5' -TCAGTTGTGAAGAGTAGATT-3 '
KHV-g3-F 配列番号 25 5' -ATQAQCCACAGACAGCCAGC-3'
KHV-g3-R 配列番号 26 5' -TCAGTAATAGTAATAGTTGT-3'
KHV-g4-F 配列番号 27 5' -ATGCCGTCGAGCATGACTGG-3*
HV-g4-R 配列番号 28 5' -TCAGAGTTCGTCTCTGATG G-3 '
KHV-g5-F 配列番号 29 5' -ATGTCTATGCGCCCGCACAA-3'
KHV-g5-R 配列番号 30 5' -CTACCGAGTGAGCCGTCTCT-3'
KHV- ml F 配列番号 31 5' -ATGACGGAGCGGGCAGCGCT-3'
KHV-m1-R 配列番号 32 5' -TTAGAAGACGAGCAAGCGCT-3'
KHV-m2-F 配列番号 33 5' - ATGTCTCCTTTGTGC GGTCT-3 '
KHV-mZ-R 配列番号 34 S' -CTATACGCGCTCATAACCCC-3'
KHV-m3-F 配列番号 35 5' -ATGAGCGCGTATAGGTACAA-3'
KHV-m3-R 配列番号 36 5' -TCAGACGAGCTCGTTGAGGA-3'
KHV-m4-F 配列番号 37 5' ~ATGGCAGTCACCAAAGCTCA-3'
KHV-m4-R 配列番号 38 5' -TC ACC ACATCTTGCC G GTGT-3 '
KHV-m5-F 配列番号 39 5' -ATGGATGCAGCGGTCTTCTC-3'
KHV-m5-R 配列番号 40 5' -TCAGGCGGCTGTCTTCCTCT-3'
[0039] PCR増幅 DNAを遺伝子発現ベクター pcDNA3. 1にクローン化し、大腸菌へ導入 した。この形質転換大腸菌を大量培養し、プラスミド DNAを抽出精製した。プラスミド の精製は塩ィ匕セシウムを用いた超遠心法 (モレキュラークローユング第 3版）により行 つた o
実施例 2
[0040] ワクチン試験はコィ 1尾あたり 50 μ gの DNAを 100 μ Lのリン酸緩衝液（phosphate buffered saline : PBS)ととも〖こ、注射器を用いコィの背部筋肉へと接種した。この際、 各種グリコプロテイン遺伝子及び膜タンパク質遺伝子をそれぞれ接種した。陰性コン トロールとしてベクタープラスミド DNAのみを接種した。ワクチン接種後 30日間は循 環濾過式水槽で 23°Cにて飼育した。
[0041] 感染実験は、 KHV感染コィの鰓を PBS中でホモジナイズし、 0. 22 μ mフィルター で濾過した液をコィ 1尾あたり 100 /z L接種した。ウィルス液接種後、コィは循環濾過 式水槽で 23°Cにて飼育した。
[0042] KHV感染後、コィを 12日間観察し続け、コィの累積死亡率を算出し、その結果を 図 1に示した。試験の結果、コントロール区のコィは約 50%の累積死亡率であつたの に対し、ワクチン試験区での累積死亡率は約 13— 40 (グリコプロテイン）、 14— 40 ( 膜タンパク質）％であったことから、 KHV感染に対する DNAワクチンの感染防御の 有効性、すなわちワクチン効果が明らかとなった。
実施例 3
[0043] 前記の方法と同様にワクチン試験を行った。この際、 5種類のグリコプロテイン遺伝 子 (group2)と 5種類の膜タンパク質遺伝子 (group3)をそれぞれ混合して接種した。陰 性コントロールとしてベクタープラスミド DNAのみ (groupl)を接種した。ワクチン接種 後 30日間は循環濾過式水槽で 23°Cにて飼育し、前記記載と同様に感染実験を行 つた o
[0044] KHV感染後、コィを 3週間観察し続け、コィの累積死亡率を算出し、その結果を図 2に示した。試験の結果、コントロール区のコィは約 60%の累積死亡率であつたのに 対し、ワクチン試験区での累積死亡率は約 10— 20%であったことから、 KHV感染に 対する DNAワクチンの感染防御の有効性、すなわちワクチン効果が明ら力となった 産業上の利用可能性
[0045] 本発明のコィ用 DNAワクチンによれば、コィヘルぺスウィルス (KHV)によるコィへ ルぺスウィルス病に対する免疫能を付与することができる。より詳細には、本発明のコ ィ用 DNAワクチンによれば、コィヘルぺスウィルス病に対する免疫応答（体液性免 疫応答及び細胞性免疫応答を含む）を誘導することができるので、コィヘルぺスウイ ルス (KHV)の感染の予防又はコィヘルぺスウィルス病の治療に有効である。

Claims

請求の範囲
[1] 以下の (a) , (b)又は（c)のタンパク質をコードする DNA。
(a)配列番号 2, 4, 6, 8又は 10に示されるアミノ酸配列からなるコィヘルぺスウィルス (KHV)のグリコプロテイン
(b)配列番号 2, 4, 6, 8又は 10に示されるアミノ酸配列において、 1若しくは数個の アミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列力もなり、かつコィヘルぺスウイ ルス (KHV)に対する免疫原性を有するタンパク質
(c)配列番号 2, 4, 6, 8又は 10に示されるアミノ酸配列と少なくとも 80%以上の相同 性を有するアミノ酸配列カゝらなり、かつコィヘルぺスウィルス (KHV)に対する免疫原 性を有するタンパク質
[2] 配列番号 1, 3, 5, 7又は 9に示される塩基配列若しくはその相補的配列力 なる DN A。
[3] 配列番号 1, 3, 5, 7又は 9に示される塩基配列において、 1若しくは数個の塩基が欠 失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、かつコィヘルぺスウィルス (KHV)に 対する免疫原性を有するタンパク質をコードする DNA。
[4] 配列番号 1, 3, 5, 7又は 9に示される塩基配列に相補的な配列からなる DNAとスト リンジェントな条件下でハイブリダィズし、かつコィヘルぺスウィルス（KHV)に対する 免疫原性を有するタンパク質をコードする DNA。
[5] 以下の )，（e)又は（f)のタンパク質をコードする DNA。
(d)配列番号 12, 14, 16, 18又は 20に示されるアミノ酸配列からなるコィヘルぺスゥ ィルス (KHV)の膜タンパク質
(e)配列番号 12, 14, 16, 18又は 20に示されるアミノ酸配列において、 1若しくは数 個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつコィヘルべ スウィルス (KHV)に対する免疫原性を有するタンパク質
(f)配列番号 12, 14, 16, 18又は 20に示されるアミノ酸配列と少なくとも 80%以上 の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつコィヘルぺスウィルス (KHV)に対する 免疫原性を有するタンパク質
[6] 配列番号 11, 13, 15, 17又は 19に示される塩基配列若しくはその相補的配列から なる DNA。
[7] 配列番号 11, 13, 15, 17又は 19に示される塩基配列において、 1若しくは数個の 塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、かつコィヘルぺスウィルス（
KHV)に対する免疫原性を有するタンパク質をコードする DNA。
[8] 配列番号 11, 13, 15, 17又は 19に示される塩基配列に相補的な配列力もなる DN
Aとストリンジェントな条件下でハイブリダィズし、かつコィヘルぺスウィルス（KHV)に 対する免疫原性を有するタンパク質をコードする DNA。
[9] 配列番号 2, 4, 6, 8又は 10に示されるアミノ酸配列からなるコィヘルぺスウィルス（K
HV)のグリコプロテイン。
[10] 配列番号 2, 4, 6, 8又は 10に示されるアミノ酸配列において、 1若しくは数個のアミ ノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列力もなり、かつコィヘルぺスウィル ス (KHV)に対する免疫原性を有するタンパク質。
[11] 配列番号 12, 14, 16, 18又は 20に示されるアミノ酸配列からなるコィヘルぺスウイ ルス (KHV)の膜タンパク質。
[12] 配列番号 12, 14, 16, 18又は 20に示されるアミノ酸配列において、 1若しくは数個 のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつコィヘルぺス ウィルス (KHV)に対する免疫原性を有するタンパク質。
[13] 請求項 1〜8のいずれか記載の DNAの中力 選ばれる 1又は 2以上の DNAを含む 組換えベクター。
[14] 請求項 1〜8のいずれか記載の DNAの中力 選ばれる 1又は 2以上の DNAを含む コィ用 DNAワクチン。
[15] 請求項 13記載の組換えベクターを含むコィ用 DNAワクチン。
[16] 請求項 14又は 15記載のコィ用 DNAワクチンをコィに投与することを特徴とする、コ ィヘルぺスウィルス (KHV)病の予防又は治療方法。
[17] 請求項 14又は 15記載のコィ用 DNAワクチンの、コィのコィヘルぺスウィルス（KHV
)病に対する免疫応答の誘発への使用方法。
[18] 請求項 9〜 12のいずれか記載のタンパク質を特異的に認識することを特徴とする抗 体。 請求項 9〜 12の 、ずれか記載のタンパク質の遺伝子発現ベクターを遺伝子導入す ることによって得られることを特徴とするコィヘルぺスウィルス (KHV)に抵抗性を有 するトランスジエニックコィ類。
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