WO2007102481A1 - 目的物質の核内送達用ベクター - Google Patents

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WO2007102481A1
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sugar
lipid membrane
ribosome
lipid
membrane
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PCT/JP2007/054260
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English (en)
French (fr)
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Tomoya Masuda
Hidetaka Akita
Kentaro Kogure
Takashi Nishio
Kenichi Niikura
Kuniharu Ijiro
Hideyoshi Harashima
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Hokkaido University NUC
Original Assignee
Hokkaido University NUC
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    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/0008—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'non-active' part of the composition delivered, e.g. wherein such 'non-active' part is not delivered simultaneously with the 'active' part of the composition
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/10—Dispersions; Emulsions
    • A61K9/127—Synthetic bilayered vehicles, e.g. liposomes or liposomes with cholesterol as the only non-phosphatidyl surfactant
    • A61K9/1271—Non-conventional liposomes, e.g. PEGylated liposomes or liposomes coated or grafted with polymers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00

Definitions

  • the present invention relates to a nuclear delivery vector for a target substance.
  • vectors have been actively developed to reliably deliver target substances such as drugs and nucleic acids to target sites.
  • viral vectors such as retroviruses, adenoviruses, and adeno-associated viruses have been developed as vectors for introducing a target gene into target cells.
  • viral vectors have problems such as difficulty in mass production, antigenicity and toxicity, liposomal vectors with few such problems are attracting attention.
  • Ribosome vectors have the advantage of being able to improve the directivity to the target site by introducing functional molecules such as antibodies, proteins, sugar chains, etc. on the surface! .
  • ribosomes in which a hydrophilic polymer for example, polyalkylene glycol such as polyethylene glycol
  • Patent Document 1 Patent Document 2, Patent Document 3, and Patent Document 4
  • a substance capable of binding to a receptor or an antigen present on the surface of the cell membrane on the outer surface of the ribosome membrane for example, transferrin, insulin, folic acid, hyaluronic acid, antibody or fragment thereof, sugar chain
  • Patent Document 3 and Patent Document 4 a substance capable of binding to a receptor or an antigen present on the surface of the cell membrane on the outer surface of the ribosome membrane
  • transferrin, insulin, folic acid, hyaluronic acid, antibody or fragment thereof, sugar chain for example, transferrin, insulin, folic acid, hyaluronic acid, antibody or fragment thereof, sugar chain
  • Patent Document 1 JP-A-1-249717
  • Patent Document 2 JP-A-2-149512
  • Patent Document 3 Japanese Patent Laid-Open No. 4-346918
  • Patent Document 4 Japanese Patent Laid-Open No. 2004-10481
  • Patent Document 5 International Publication WO2005Z032593 Pamphlet
  • Non-patent literature l Kogure, K. et al., Journal of Controlled Release, 2004, No. 98, p.317
  • An object of the present invention is to provide a nuclear delivery vector of a target substance and a composition containing the same.
  • the present invention provides the following vectors and compositions.
  • a vector for nuclear delivery of a target substance having a ribosomal force comprising a lipid membrane having a sugar on its surface.
  • the amount of the membrane stabilizer contained in the lipid membrane is 0% of the total amount of the lipid membrane components.
  • the target substance to be delivered into the nucleus is encapsulated inside the ribosome.
  • a pharmaceutical composition comprising the vector according to (8) above, which is a target substance capable of exerting a therapeutic effect and a Z or preventive effect on a predetermined disease by being delivered into the nucleus.
  • the pharmaceutical composition encapsulated in the ribosome.
  • (11) The gene expression composition comprising the vector according to (8), wherein the gene to be expressed in the nucleus is enclosed in the ribosome. .
  • a vector for delivery of a target substance into a nucleus and a composition containing the same are provided.
  • lipid membrane having a sugar on its surface may be hereinafter referred to as “sugar-modified lipid membrane”.
  • the ribosome is a closed vesicle having a sugar-modified lipid membrane, it is a multilamellar ribosome (MLV), and SUV (small unilamellar vesicle), LUV (large unilamellar vesicle), GUV ( It may be a single membrane ribosome such as giant unilamellar vesicle).
  • MLV multilamellar ribosome
  • SUV small unilamellar vesicle
  • LUV large unilamellar vesicle
  • GUV It may be a single membrane ribosome such as giant unilamellar vesicle.
  • the ribosome When the ribosome is a multilamellar ribosome, the ribosome comprises one or more lipid membranes inside and / or outside the sugar-modified lipid membrane.
  • the lipid membrane located inside and / or outside the sugar-modified lipid membrane has sugar on the surface as long as the functions expected of the lipid membrane (eg, cell membrane fusion ability, endosome membrane fusion ability, etc.) are retained. It may or may not have sugar on the surface. If the ribosome is a single membrane ribosome, the ribosome comprises only a sugar-modified lipid membrane.
  • the size of the ribosome is not particularly limited, but is usually 30 to 700 nm in diameter, preferably 30 to 500 nm in diameter, and more preferably 30 to 300 nm in diameter.
  • the components constituting the lipid membrane are not particularly limited as long as they do not inhibit the formation of the lipid bilayer. Quality, membrane stabilizer, antioxidant, charged substance and the like.
  • Lipid is an essential component of the lipid membrane, and its content is usually 70% of the total amount of lipid membrane components.
  • ⁇ 100% preferably 80 ⁇ : LOO% (molar ratio), more preferably 90 ⁇ : LOO% (molar ratio).
  • Lipids include, for example, phosphatidylcholine (eg, dioleoyl phosphatidylcholine, dilauroyl phosphatidylcholine, dimyristoyl phosphatidylcholine, dinormi Toylphosphatidylcholine, distearoylphosphatidylcholine, etc.), phosphatidylglycerol (eg, dioleoylphosphatidylglycerol, dilauroylphosphatidylglycerol, dimyristoylphosphatidylglycerol, dipalmitoylphosphatidylglycerol, distearoylphosphatidylglycerol) Phosphatidylethanolamine (eg, dioleoylphosphatidylethanolamine, dilauroyl phosphatidylethanolamine, dimyristoylphosphatidylethanolamine, dipalmitoylphosphatidyl
  • galactosyl celeb oral side, latatosyl celeb oral side, gandarioside sterols derived from animals (e.g. Nore, Desmostero Monore, Dihydrocholesterol), plant-derived sterols (phytosterols) (eg, stigmasterol, sitosterol, campesterol, brassicasterol), microorganism-derived sterols (eg Chimosuteroru, ergosterol) sterols like; palmitic acid, Orein acid, stearic acid, Arakidon acid, saturated or unsaturated fatty acid (number of carbon atoms such as myristic acid and the like for example, 12 to 20) is.
  • animals e.g. Nore, Desmostero Monore, Dihydrocholesterol
  • plant-derived sterols eg, stigmasterol, sitosterol, campesterol, brassicasterol
  • microorganism-derived sterols eg Chimosuteroru,
  • a membrane stabilizer is an optional component of a lipid membrane that can be added to physically or chemically stabilize the lipid membrane or to adjust the fluidity of the lipid membrane, and its content is a component of the lipid membrane. Is generally 0 to 70% (molar ratio), preferably 0 to 30% (molar ratio), and more preferably 0 to 10% (molar ratio). Particularly in the sugar-modified lipid membrane, the content of the membrane stabilizer is preferably 0 to 60% (molar ratio) of the total amount of lipid membrane constituents. It is most preferably 0 to 10% (molar ratio).
  • the disintegration property of the sugar-modified lipid membrane can be improved by drawing the sugar bound to the nuclear pore complex into the nucleus. Improves the efficiency of intranuclear delivery of the target substance enclosed in the ribosome through the nuclear pore It can be done.
  • Examples of the film stabilizer include sterol, glycerin or fatty acid ester thereof.
  • Specific examples of the sterol are the same as those described above, and examples of the glycerin fatty acid ester include triolein and trioctanoin.
  • the antioxidant is an optional component of the lipid membrane that can be added to prevent lipid membrane acidification, and its content is usually 0-30% (molar ratio) of the total amount of the lipid membrane components, Preferably it is 0-20% (molar ratio), More preferably, it is 0-10% (molar ratio).
  • antioxidants examples include tocopherol, propyl gallate, ascorbyl palmitate, butylated hydroxytoluene and the like.
  • the charged substance is an optional component of the lipid membrane that can be added to impart a positive charge or negative charge to the lipid membrane, and its content is usually 0-30% (molar ratio) of the total amount of the lipid membrane constituents. It is preferably 0 to 20% (molar ratio), more preferably 0 to 10% (molar ratio).
  • Examples of the charged substance imparting a positive charge include saturated or unsaturated aliphatic amines such as stearylamine and oleylamine; saturated or unsaturated cationic synthetic lipids such as dioleoyltrimethylammonium propane and the like.
  • Examples of the charged substance that imparts a negative charge include dicetyl phosphate, cholesteryl hemisuccinate, phosphatidylserine, phosphatidylinositol, and phosphatidic acid.
  • Lipids constituting a lipid membrane include lipids having a membrane fusion function, a blood retention function, a temperature change sensitivity function, a pH sensitivity function, etc. May use lipid derivatives. As a result, one or more of the above functions can be imparted to the ribosome. By imparting a membrane fusion function to ribosomes, ribosomes can be fused with cell membranes, endosomal membranes, and the like.
  • the retention of ribosomes in blood can be improved, and the capture rate by reticuloendothelial tissues such as the liver and spleen can be reduced.
  • the ribosome By giving the ribosome a temperature change sensitive function and a Z or PH sensitive function, the release of the target substance encapsulated in the ribosome can be enhanced.
  • Lipids capable of imparting a membrane fusion function include, for example, neutral lipids such as dioleoylphosphatidylethanolamine; cholesterol succinic acid, strength Examples include key lipids (acidic lipids) such as ludiolipin.
  • the ribosome is a multilamellar liposome and the ribosome is provided with a lipid membrane other than the sugar-modified lipid membrane for the purpose of fusing with a cell membrane, endosome membrane, etc., the lipid membrane contains a membrane-fusible lipid. be able to.
  • the membrane-fusible lipid contained in the lipid membrane is not particularly limited as long as it can be fused with the cell membrane and the endosomal membrane.
  • the amount of fusogenic lipid contained in the lipid membrane is not particularly limited, but is usually 40% (molar ratio) or more, preferably 70% (molar ratio) or more of the total lipid content contained in the lipid membrane. More preferably, it is 90% (molar ratio) or more.
  • the upper limit of the amount of fusogenic lipid contained in the lipid membrane is 100% of the total amount of lipid contained in the lipid membrane.
  • Examples of the blood-retaining lipid derivative capable of imparting the blood-retaining function include, for example, glycophorin, gandarioside GM1, phosphatidylinositol, gandarioside GM3, glucuronic acid derivative, glutamic acid derivative, and polyglycerin phospholipid derivative.
  • Examples of the temperature change sensitive lipid derivative capable of imparting a temperature change sensitive function include dipalmitoylphosphatidylcholine and the like.
  • Examples of the pH sensitive lipid derivative capable of imparting a pH sensitive function include, for example, di And oleoylphosphatidylethanolamine.
  • the sugar-modified lipid membrane may have one type of sugar on the surface, or two or more types of sugar on the surface. You may have.
  • the amount of sugar on the surface of the sugar-modified lipid membrane is usually 0.5 to 65% (molar ratio), preferably 1 to 60% (molar ratio), more preferably the total amount of lipid contained in the sugar-modified lipid film. Is 5-50% (molar ratio).
  • the total number of sugar residues constituting the sugar on the surface of the sugar-modified lipid membrane is not particularly limited, but is usually 1 to 20, preferably 1 to 5, and more preferably 1.
  • the sugar type is not particularly limited, and examples thereof include monosaccharides, amino sugars, deoxy sugars, disaccharides, trisaccharides, oligosaccharides, etc. Of these, monosaccharides and amino sugars are preferred.
  • Examples of monosaccharides include mannose, galactose, glucose, fucose, and fructose. Among these, mannose, galactose, glucose, and fucose are preferable.
  • the amount of mannose on the surface of the sugar-modified lipid membrane is preferably 5 to 60% (molar ratio) of the total lipid contained in the sugar-modified lipid membrane. More preferably, it is% (molar ratio).
  • the sugar is galactose, it is preferable that the amount of extra-gallium on the surface of the sugar-modified lipid membrane is 1 to 35% (molar ratio) of the total lipid content in the sugar-modified lipid membrane.
  • the amount of mannose or galactose on the surface of the sugar-modified lipid membrane is ⁇ 15% (molar ratio).
  • amino sugars examples include N-acetylyldarcosamine, N-acetylylgalatatosamine, N-acetylmethylmannosamine, etc. Among them, N-acetylyldarcosamine is preferable.
  • the sugar is N-acetyl darcosamine
  • the amount of N-acetyl darcosamine on the surface of the sugar-modified lipid membrane is 1-30% (molar ratio) of the total lipid content in the sugar-modified lipid membrane. It is more preferable that it is 5 to 15% (molar ratio).
  • the presence of sugar in the sugar-modified lipid membrane is not particularly limited as long as the sugar can also expose the surface force of the lipid membrane, and the sugar is directly bound to the lipid membrane constituents to form the surface of the lipid membrane. It may be present and may be present on the surface of the lipid membrane via a hydrophilic polymer (i.e., by binding of a lipophilic polymer with sugar introduced to the lipid membrane component) It is preferably present on the surface of the lipid membrane via a hydrophilic polymer. Thereby, the monodispersity of the ribosome can be improved.
  • the ratio of the two can be adjusted as appropriate.
  • the ratio is usually 1% (molar ratio) or more, preferably 5% (molar ratio) or more, more preferably 10% (molar ratio) or more of the total amount of sugars on the surface of the sugar-modified lipid membrane.
  • the sugar may be bonded to the end of the main chain of the hydrophilic polymer, or on the side of the hydrophilic polymer. Although it may be bonded to the end of the chain, it is preferably bonded to the end of the main chain of the hydrophilic polymer. Further, the end of the main chain of the hydrophilic polymer may be bonded to the lipid membrane constituent, or the end of the side chain of the hydrophilic polymer may be bonded to the lipid membrane constituent 1, and so on. However, it is preferable that the end of the main chain of the hydrophilic polymer is bonded to the lipid membrane constituent. That is, it is preferable that sugar is introduced into one end of the main chain of the hydrophilic polymer, and the other end of the main chain of the hydrophilic polymer is bonded to the lipid membrane component.
  • the lipid membrane component to which the sugar is bound directly or via a hydrophilic polymer is not particularly limited, but is preferably a phospholipid, sterol or fatty acid which is preferably a lipid or membrane stabilizer. More preferably it is. Saccharides bind directly or through hydrophilic polymers When the lipid membrane constituents are lipids or membrane stabilizers, especially phospholipids, sterols or fatty acids, sugars can be presented on the lipid membrane surface in an extremely stable and simple manner, and are also presented on the lipid membrane surface. Control the density of sugar.
  • hydrophilic polymers into which sugar is introduced include polyalkylene glycols (eg, polyethylene glycol, polypropylene glycol, polytetramethylene glycol, polyhexamethylene glycol, etc.), dextran, pullulan, ficoll, and polybule.
  • polyalkylene glycols eg, polyethylene glycol, polypropylene glycol, polytetramethylene glycol, polyhexamethylene glycol, etc.
  • dextran pullulan
  • ficoll and polybule.
  • Alcohol styrene Maleic anhydride alternating copolymer
  • dibule ether Maleic anhydride alternating copolymer
  • Polyethylene glycol is preferred, with polyalkylene glycol being preferred.
  • hydrophilic polymer is a polyalkylene glycol
  • its molecular weight is usually 500 to 5000, preferably ⁇ 1000 to 3000, and more preferably ⁇ 2000 to 3000.
  • the hydrophilic polymer includes methyl group, ethyl group, n-propyl group, isopropyl group, n-butyl group, isobutyl group, sbutyl group, tbutyl group, n-pentyl group, isopentyl group, tpentyl group.
  • a linear or branched alkyl group having 1 to 5 carbon atoms such as a group or neopentyl group; methoxy group, ethoxy group, n propoxy group, isopropoxy group, n butoxy group, isobutoxy group, s butoxy group, t
  • a linear or branched alkoxy group having 1 to 5 carbon atoms such as a butoxy group; a substituent such as a hydroxyl group, a carbo group, an alkoxy carbo group, or a cyan group; Moyo.
  • the lipid membrane constituent component and the hydrophilic polymer include a functional group possessed by the lipid membrane constituent component (including a functional group artificially introduced into the lipid membrane constituent component) and a functional group possessed by the hydrophilic polymer ( It contains a functional group artificially introduced into the hydrophilic polymer, and can be bonded via a covalent bond formed by reaction with.
  • Examples of combinations of functional groups that can form a covalent bond include amino group Z carboxyl group, amino group Z halogenated acyl group, amino group ZN hydroxysuccinimide ester group, amino group Z benzotriazole carbonate group, amino group Group z aldehyde group, thiol group z maleimide group, thiol group z berylsulfone group, hydroxyl group Z carboxyl group and the like, and the reaction between these functional groups can be carried out according to a known method.
  • the hydrophilic polymer and sugar include a functional group possessed by the hydrophilic polymer (including a functional group artificially introduced into the hydrophilic polymer) and a functional group possessed by the sugar (artificially introduced into the sugar. Can be linked via a covalent bond formed by a reaction with a functional group. Examples of combinations of functional groups that can form a shared bond include amino groups, amino groups and hydroxyl groups, amino groups and thiol groups, and the reaction between these functional groups can be performed according to a known method. .
  • the sugar and the lipid membrane constituent component include a functional group possessed by the sugar (including a functional group artificially introduced into the sugar) and a functional group possessed by the lipid membrane constituent component (artificial to the lipid membrane constituent component).
  • a functional group possessed by the sugar including a functional group artificially introduced into the sugar
  • a functional group possessed by the lipid membrane constituent component artificial to the lipid membrane constituent component.
  • the hydrophilic polymer introduced with a saccharide is, for example, the following formula: P—X—S [wherein P represents a residue of the hydrophilic polymer, X represents a direct bond or a linking group, and S Represents a sugar residue. ].
  • the linking group represented by X for example, a divalent hydrocarbon group which may have a hetero atom; —O—; —S—; —NH—; —COO—; —SS— -NHCO-; -NHCONH-; -SO- and the like.
  • hetero atom examples include a nitrogen atom, an oxygen atom, a halogen atom (fluorine atom, chlorine atom, bromine atom, etc.), a sulfur atom, and the like.
  • divalent hydrocarbon group which may have a heteroatom include, for example, an alkylene group such as an ethylene group, a trimethylene group, and a propylene group; —SCH CH COO—; —OCH
  • the sugar may be bound to the lipid membrane constituent or the hydrophilic polymer via V, a substituent of the offset carbon, or the lipid membrane constituent via the substituent of the carbon at the 1-position. Or it is preferable to bind with a hydrophilic polymer.
  • the target substance to be delivered into the nucleus can be encapsulated inside the ribosome.
  • the type of the target substance is not particularly limited, and examples thereof include drugs, nucleic acids, peptides, proteins, sugars, or complexes thereof, depending on the purpose of diagnosis, treatment, prevention, etc. It can be selected appropriately.
  • the target substance is a substance for the purpose of diagnosis, treatment, prevention or the like of a disease
  • the ribosome holding the target substance can be used as a component of a pharmaceutical composition.
  • Nucleic acid includes DNA or RNA, and analogs or derivatives thereof (for example, peptide nucleic acid (PNA), phosphorothioate DNA, etc.).
  • the nucleic acid may be either single-stranded or double-stranded, and may be either linear or circular.
  • the target substance is preferably encapsulated in the ribosome as an aggregate of the target substance.
  • the target substance can be efficiently delivered into the nucleus.
  • the aggregate of the target substance may be composed only of the target substance, or may contain a substance other than the target substance (for example, a carrier that holds the target substance)!
  • an aggregate of the target substance is prepared by electrostatically binding the target substance and the ionic substance to form a composite.
  • an aggregate of the target substance can be prepared by electrostatically binding the target substance and the cationic substance to form a composite.
  • the target substance and a predetermined carrier are combined in an appropriate manner (for example, physical adsorption, hydrophobic bond, chemical bond, etc.) to form a complex.
  • an aggregate of the target substance can be prepared.
  • complexing an aggregate of the target substance that is positively or negatively charged as a whole can be prepared by adjusting the mixing ratio of the target substance to the cationic substance or the anionic substance.
  • an aggregate of nucleic acids can be prepared by electrostatically binding the nucleic acid and the cationic substance to form a complex.
  • an aggregate of nucleic acids that are positively or negatively charged as a whole can be prepared.
  • the cationic substance that can be used when preparing the aggregate of the target substance is not particularly limited as long as it is a substance having a cationic group in the molecule.
  • the cationic substance include cationic lipids (for example, Lipofectamine (manufactured by Invitrogen)); macromolecules having a cationic group; A polymer or copolymer or a derivative thereof (e.g. Polycationic polymers such as polyethyleneimine, poly (arylamine), poly (diallyldimethylammonium chloride), darcosamine; protamine or its derivatives (for example, protamine sulfate); Of these, stearyl lyin arginine is particularly preferred.
  • the number of arginine residues constituting the polyarginine is usually 4 to 20, preferably 6 to 12, and more preferably 7 to 10.
  • the number of cationic groups possessed by the cationic substance is not particularly limited, but is preferably 2 or more.
  • the cationic group is not particularly limited as long as it can be positively charged.
  • an amino group; a monoalkylamino group such as a methylamino group or an ethylamino group; a dialkylamino group such as a dimethylamino group or a jetylamino group; an imino group; -Dino group etc. are mentioned.
  • the anionic substance that can be used in preparing the aggregate of the target substance is not particularly limited as long as it is a substance having an anionic group in the molecule.
  • the ionic substance include ionic lipids; polymers having ionic groups; homopolymers or copolymers of acidic amino acids such as polyaspartic acid or derivatives thereof; xanthan gum, carboxybi Diar polymers, carboxymethylcellulose polystyrene sulfonates, polysaccharides, polyarion polymers such as carrageenan, and the like can be used.
  • the terionic group is not particularly limited as long as it can be negatively charged, for example, a functional group having a terminal carboxyl group (for example, a succinic acid residue, a malonic acid residue, etc.), a phosphoric acid group, a sulfuric acid group, etc. Is mentioned.
  • a ribosome equipped with a sugar-modified lipid membrane the sugar existing on the surface of the sugar-modified lipid membrane binds to the nuclear pore complex, and the sugar bound to the nuclear pore complex becomes intranuclear.
  • the target substance encapsulated in the ribosome is released into the nucleus through the nuclear pore, and as a result, the target substance is delivered into the nucleus.
  • a ribosome provided with a sugar-modified lipid membrane can be used as a vector for delivering a target substance into the nucleus.
  • the nucleus targeted by the ribosome may be a nucleus separated from cell force or a nucleus existing in a cell.
  • the species from which the nucleus targeted by the ribosome is derived is not particularly limited. For example, animals such as animals, plants, and microorganisms are preferred. Mammals are more preferred. Examples of mammals include humans, monkeys, mice, hidges, sheep, horses, pigs, rabbits, dogs, cats, rats, mice, guinea pigs and the like.
  • the type of cell containing the nucleus targeted by the liposome is not particularly limited, and examples include somatic cells, germ cells, stem cells, or cultured cells thereof.
  • the ribosome is configured such that the sugar-modified lipid membrane is located in the outermost layer of the ribosome transferred into the cell.
  • the ribosome having a configuration in which the sugar-modified lipid membrane is located in the outermost layer of the ribosome transferred into the cell, for example, as shown in Fig. 1 (a), lipid membrane 2a and A single membrane ribosome la comprising the target substance 3 encapsulated inside the lipid membrane 2a, the lipid membrane 2a having a peptide containing a plurality of arginine residues continuous with sugar on the surface Single membrane ribosome la.
  • the “peptide containing a plurality of consecutive arginine residues” will be described in detail below.
  • Single-membrane ribosome la can be transferred from the outside of the cell to the inside of the cell through the peptide existing on the surface of the lipid membrane 2a while maintaining its original form (in an intact state).
  • the sugar present on the surface of the lipid membrane 2a binds to the nuclear pore complex, and the sugar bound to the nuclear pore complex is extracted into the nucleus, thereby disrupting the lipid membrane 2a.
  • the target substance 3 enclosed inside the lipid membrane 2a is released into the nucleus through the nuclear membrane pore.
  • a lipid membrane 21b As another embodiment of the ribosome having a configuration in which the sugar-modified lipid membrane is located in the outermost layer of the ribosome transferred into the cell, as shown in Fig. 1 (b), a lipid membrane 21b, A bilayer ribosome comprising a lipid membrane 22b located outside the lipid membrane 21b and a target substance 3 encapsulated inside the lipid membrane 21b, the lipid membrane 21b having a sugar on its surface, An example is bilayer ribosome lb, where 22b contains a membrane-fusible lipid.
  • Examples of the membrane-fused lipid contained in the lipid membrane 22b include neutral lipids such as dioleoylphosphatidylethanolamine; and cation lipids (acid lipids) such as cholesterol succinic acid and cardiolipin.
  • the amount of membrane-fusible lipid contained in membrane 22b is usually 40% (molar ratio) or more, preferably 70% (molar ratio) or more, more preferably 90% of the total lipid content contained in lipid membrane 22b. (Molar ratio) or more.
  • the upper limit of the content of membrane-fusible lipid is 100%.
  • the bilayer ribosome lb transferred into the cell via endocytosis is taken up into the endsome, but the endosomal force can also escape by membrane fusion between the endosomal membrane and the lipid membrane 22b.
  • the lipid membrane 22b disappears due to membrane fusion with the endosomal membrane, but the lipid membrane 21b is retained.
  • the target substance 3 encapsulated inside the lipid membrane 21b is released into the nucleus in the same manner as in the case of the single membrane ribosome la.
  • the bilayer ribosome lb can be transferred from the outside of the cell into the cell via membrane fusion between the lipid membrane 22b and the cell membrane.
  • the lipid membrane 22b disappears due to membrane fusion with the cell membrane, but the lipid membrane 21b is retained.
  • the target substance 3 encapsulated inside the lipid membrane 21b is released into the nucleus in the same manner as in the case of the single membrane ribosome la.
  • the amount of cation lipid contained in the lipid membrane 22b is 15% (molar ratio) or more, preferably 20% of the amount of membrane-fused lipid contained in the lipid membrane 22c. (Molar ratio) or higher, the endosomal interior changes to acidic (pH 5.5-6.5) or under acidic conditions (pH 5.5-6.5) , The lipid membrane 22b can be efficiently fused with the endosomal membrane or cell membrane.
  • the number of consecutive arginine residues is not particularly limited as long as it is a plurality, but usually 4 to 20, preferably 6 to 12 and more preferably 7 to: LO.
  • the total number of amino acid residues constituting the peptide is not particularly limited, but is usually 4 to 35, preferably 6 to 30, and more preferably 7 to 23.
  • the peptide can include any amino acid sequence at the C-terminus and the Z- or N-terminus of a plurality of consecutive arginine residues, but it is preferable that only the arginine residue can be used.
  • the amino acid sequence added to the C-terminal or N-terminal of a plurality of consecutive arginine residues is preferably an amino acid sequence having rigidity (for example, polyproline). Unlike polyethylene glycol (PEG), which is soft and irregularly shaped, polyproline is linear and retains a certain degree of rigidity. Also included in the amino acid sequence added to the C-terminal or N-terminal of multiple consecutive arginine residues.
  • the amino acid residue is preferably an amino acid residue other than acidic amino acids. This is because an acidic amino acid residue having a negative charge may electrostatically interact with an arginine residue having a positive charge to attenuate the effect of the arginine residue.
  • the lower limit of the amount of peptide present on the surface of the lipid membrane is usually 0.1% (molar ratio), preferably 1% (molar ratio), more preferably 2 with respect to the total lipid constituting the lipid membrane.
  • the upper limit is usually 30% (molar ratio), preferably 25% (molar ratio), more preferably 20% (molar ratio) with respect to the total lipid constituting the lipid membrane. is there.
  • a ribosome having a peptide containing a plurality of continuous arginine residues on its surface can migrate into the cell via the peptide present on the surface (see WO2005Z03 2593).
  • the amount of peptide present on the surface of the ribosome is less than 2% (molar ratio), preferably less than 1.5% (molar ratio), more preferably 1% (molar ratio) relative to the total lipid constituting the lipid membrane. If it is less than that, the ribosome can be transferred into the cell or nucleus mainly via endocytosis (see WO2005Z032593).
  • the lower limit of the amount of peptide at this time is usually 0.1% (molar ratio), preferably 0.5% (molar ratio), more preferably 0.7% (total ratio) with respect to the total lipid constituting the lipid membrane. Molar ratio).
  • the amount of peptide present on the surface of the ribosome is 2% (molar ratio) or more, preferably 3% (molar ratio) or more, more preferably 4% (molar ratio) with respect to the total lipid constituting the lipid membrane.
  • the ribosome can be transferred into the cell or nucleus mainly via macropinocytosis (see WO 2005Z032593).
  • the upper limit of the peptide amount at this time is usually 30% (molar ratio), preferably 25% (molar ratio), more preferably 20% (molar ratio) with respect to the total lipid constituting the lipid membrane.
  • macropinocytosis extracellular substances are taken into the cell as a fraction called macropinosome, and unlike macrosomes, macropinosomes do not fuse with lysosomes, so macropinosome inclusions avoid degradation by lysosomes. can do. Therefore, when the ribosome moves into the cell via macropinocytosis, the target substance encapsulated in the ribosome can be efficiently delivered into the cell.
  • the lipid membrane When the intracellular pathway of the ribosome depends on endocytosis, the lipid membrane must contain a cationic lipid as its main component, but a peptide containing a plurality of consecutive arginine residues on the surface.
  • the ribosome translocation pathway has Since it does not depend only on cis, it is not necessary that the lipid membrane contains a cationic lipid. That is, the lipid membrane of the ribosome may be composed of either a cationic lipid or a non-power thione lipid, or may be composed of both.
  • the ratio of cationic lipid to the total lipid composing the lipid membrane is preferably 0 to 40% (molar ratio). 0 to 20% (molar ratio) More preferably,
  • the presence of the peptide containing a plurality of consecutive arginine residues is not particularly limited as long as the peptide is exposed to the surface force of the liposome, but the peptide is modified with a hydrophobic group or a hydrophobic compound.
  • a hydrophobic group or a hydrophobic compound is inserted into the lipid bilayer, and the peptide is exposed from the lipid bilayer.
  • the lipid bilayer consists of a hydrophilic part and a hydrophobic part, and a hydrophobic group or hydrophobic compound can be inserted into the lipid bilayer by hydrophobic bonding with the hydrophobic part of the lipid bilayer.
  • the hydrophobic group or hydrophobic compound is not particularly limited as long as it can be inserted into the lipid bilayer.
  • the hydrophobic group include a saturated or unsaturated fatty acid group such as a stearyl group, a cholesterol group, or a derivative thereof.
  • a fatty acid group having 10 to 20 carbon atoms for example, a palmitoyl group, an oleyl group).
  • Stearyl group, arachidoyl group, etc. are preferable.
  • hydrophobic compounds include phospholipids, glycolipids or sterols exemplified above, long chain aliphatic alcohols (eg, phosphatidylethanolamine, cholesterol, etc.), polyoxypropylene alkyls, glycerin fatty acids. Examples include esters.
  • Ribosomes can be prepared using known methods such as hydration, sonication, ethanol injection, ether injection, reverse phase evaporation, surfactant method, and freezing and thawing. You can. Moreover, by passing the ribosome through a filter having a predetermined pore size, a ribosome having a certain particle size distribution can be obtained. Further, according to a known method, the multilamellar ribosome force can be converted into a single membrane ribosome, and the single membrane ribosome force can also be converted into a multilamellar liposome. [0073] A composition containing a ribosome provided with a sugar-modified lipid membrane can be used for various applications.
  • the target substance is encapsulated inside the ribosome.
  • a target substance capable of exerting a therapeutic effect or a preventive effect on a predetermined disease by being delivered into the nucleus for example, antisense DNA, siRNA, etc. capable of suppressing the expression of a disease-causing gene
  • a gene to be expressed in the nucleus is encapsulated inside the ribosome.
  • the dosage forms of various compositions are not particularly limited, and examples thereof include ribosome dispersions.
  • a buffer solution such as physiological saline, phosphate buffer solution, quenen buffer solution, and acetate buffer solution can be used.
  • additives such as sugars, polyhydric alcohols, water-soluble polymers, nonionic surfactants, antioxidants, pH adjusters, hydration accelerators may be added to the dispersion.
  • Other dosage forms of the composition include dried products of ribosome dispersions (eg, freeze-dried products, spray-dried products, etc.). The dried product can be used as a ribosome dispersion by adding a buffer solution such as physiological saline, phosphate buffer, queen buffer, or acetate buffer.
  • compositions When the composition is administered to a living body, examples of the route of administration include parenteral administration such as intravenous, intraperitoneal, subcutaneous, nasal administration, etc. It can be appropriately adjusted according to the kind, amount, etc. of the target substance enclosed.
  • FIG. 1 is a diagram schematically showing the structure of a ribosome.
  • FIG. 2 (a) is a graph showing the amount of gene expression 3 hours after transfection of gene-encapsulated sugar-modified ribosome, and (b) is 6 hours after transfection of gene-encapsulated sugar-modified ribosome. It is a figure which shows the gene expression level.
  • FIG. 3 (a) is a graph showing the amount of gene expression after 3 hours of transfection of a gene-encapsulated sugar-modified ribosome, and (b) is 6 hours after transfection of the gene-encapsulated sugar-modified ribosome. It is a figure which shows the gene expression level.
  • FIG. 4 (a) shows gene development 3 hours after gene-encapsulated sugar-modified ribosome transfection. (B) is a diagram showing the gene expression level 6 hours after transfection of the gene-encapsulated sugar-modified ribosome.
  • FIG. 5 (a) is a graph showing the amount of gene expression 3 hours after transfection of gene-encapsulated sugar-modified ribosome, and (b) is 6 hours after transfection of gene-encapsulated sugar-modified ribosome. It is a figure which shows the gene expression level.
  • FIG. 6 is a graph showing the relationship between the amount of gene expression 6 hours after transfection of a gene-encapsulated sugar-modified ribosome and the amount of cholesterol contained in the lipid membrane.
  • FIG. 7 is a graph showing the gene expression level 6 hours after transfection of a gene-encapsulated sugar-modified ribosome in the presence of an excessive amount of sugar.
  • FIG. 8 is a photograph showing that a gene-encapsulated sugar-modified ribosome is transferred into the nucleus. Blue indicates the nucleus, red indicates the gene, and green indicates the vector-derived lipid.
  • the DNA used is a luciferase gene and a 7037 bp full-length plasmid DNA with a CMV promoter upstream (the pcDNA3.1 plasmid with the CMV promoter incorporated with the luciferase gene), and polycation is protamine sulfate.
  • DNA and polycation are each dissolved in 10 mM HEPES buffer (pH 7.4), and DNA solution (0.1 mgZmL) and polycation solution (0.07 mg / mL) are mixed at room temperature under vortexing. Aggregated.
  • lipid membrane consists of dioleoy 1 phosphatidyl ethanolamine (DOPE) and cholesterol (GlcNAc-PEG- Choi) bound to N-acetylethylcolacamine-introduced polyethylene glycol 2: 1 or 9: 1 (M
  • DOPE dioleoy 1 phosphatidyl ethanolamine
  • GlcNAc-PEG- Choi cholesterol bound to N-acetylethylcolacamine-introduced polyethylene glycol 2: 1 or 9: 1
  • M octaarginine
  • STR—R8 solution lipid 5 mol% was added to the mixture and formed by removing the solvent in a glass test tube. The final lipid concentration after hydration was 0.55 mM.
  • GlcNAc PEG Choi was synthesized according to the following scheme.
  • Dissolved and activated molecular sieves (4 A) (about 2 g) are stirred and added to this. 3,4,5 —tri—0—Acety to 1—thiopheny to 2—N—Troc—glucosamine 240 mg Subsequently, 145 mg of N-hydroxy succinimide and 10 ⁇ L of trifluoromethanesulfonic acid (purity 98%, manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) were added to initiate the reaction. The reaction was carried out for about 3 hours under inert and water-free conditions, and the resulting reaction solution was diluted with chloroform and then washed with a saturated aqueous solution of sodium thiosulfate and then with water.
  • GlcNAc-PEG- Choi was used in place of Choi, and ribosomes with octarginine on the surface of the lipid membrane but no N-acetyl darcosamine were prepared (particle size: 220 nm, Zeta potential: +30 mV).
  • the lipid membrane was not modified with stearyloctaarginine, and ribosomes with N-acetyl darcosamine on the surface of the lipid membrane but no octaarginine were prepared (particle size: 190 nm, zeta potential: -20mV).
  • GlcNAc- PEG- Choi is used instead of Choi, and the lipid membrane is not modified with stearyloctaarginine, and N-acetylethyldarcosamine and octarginine are present on the lipid membrane surface.
  • Ribosomes were prepared (particle size: 200 nm, zeta potential: 10 mV).
  • the cells were synchronized to G1 phase by incubation for 18 hours at 37 ° C, 5% CO. afterwards,
  • the cells were supplemented with ribosomes (DNAlOpgZcell) and incubated at 37 ° C for 3 hours to transfect the cells with ribosomes. After 3 and 6 hours of transfection, the cells were washed, lysed with 75 ⁇ L of reporter lys s buffer (Promega), and luciferase atse reagent (Promega) 50 ⁇ L into 20 ⁇ L of cell lysate. The luciferase activity was measured with a luminometer (Luminescencer-PSN). In addition, the amount of protein in the cell lysate was measured using a BCA protein assembly kit (PIERCE).
  • Fig. 2 (a) The gene expression level after 3 hours of transfection is shown in Fig. 2 (a), and the gene expression level after 6 hours of transfection is shown in Fig. 2 (b).
  • Fig. 2 (b) As shown in Fig. 2 (a), after 3 hours of transfection, the surface of the lipid membrane has neither N-acetylyl darcosamine nor octarginine, but the ribosome has octarginine on the surface of the lipid membrane. Ribosomes that do not have N-acetylyldarcosamine, and ribosomes that have N-acetylyldarcosamine on the surface of the lipid membrane but not octaarginine did not show any gene expression regardless of the lipid composition.
  • N-acetyltilcosamine was recognized by cell surface receptor recognition. It does not function as an element that promotes cellular uptake of ribosomes. It is thought that it functions as an element that promotes nuclear translocation of ribosomes after ribosomes have been taken into cells by the function of octaarginine.
  • the ribosome When sugars present on the surface of the membrane are bound to the nuclear pore complex, the ribosome is translocated to the nucleus, and the sugar bound to the nuclear pore complex is extracted into the nucleus, thereby disrupting the lipid membrane.
  • the target substance encapsulated inside the ribosome is considered to be released into the nucleus through the nuclear pore.
  • the nuclear translocation of ribosomes is thought to mainly involve the binding of sugars to the nuclear pore complex, and the intranuclear delivery of ribosome-encapsulated substances is mainly due to the sugar bound to the nuclear pore complex. It is considered that the lipid membrane is disrupted by drawing into the nucleus, and the lipid membrane disintegration is improved by reducing the amount of membrane stabilizer (eg, cholesterol) contained in the lipid membrane.
  • membrane stabilizer eg, cholesterol
  • DOPE, cholesterol (Choi), and cholesterol-conjugated polyethylene glycol (Sugar—PEG—Choi) 5: 5: 0, 5: 4: 1, 5: 3: 2, 5: 2: 3 , 5: 1: 4 or 5: 0: 5 (molar ratio), dissolved in black mouth form and mixed (total lipid content 55 nmol), except that a lipid membrane was formed to form the same as in Example 1.
  • the procedure was performed to prepare a liposome having a sugar (sugar binds to the lipid membrane via polyethylene glycol) and octaarginine on the surface of the lipid membrane (particle size: 220 nm, zeta potential: +10 mV).
  • N-acetylyldarcosamine GlcNAc
  • Man mannose
  • galatatoose Gal
  • Fig. 3 (a), Fig. 4 (a) or Fig. 5 (a) shows the gene expression level after 3 hours of transfection
  • Fig. 3 (b) and Fig. 4 (6) show the gene expression level after 6 hours of transfection. It is shown in b) or Fig. 5 (b).
  • a stearyl Locta arginine (STR-R8) solution (5 mol% of lipid) was added, and the solvent was removed in a glass test tube to form a lipid membrane.
  • Example 1 After the DPC suspension prepared in Example 1 was added to this lipid membrane and incubated for 15 minutes, it was sonicated in an ultrasonic bath (125 W, Branson Ultrasonics) for about 1 minute to obtain the above sugar And ribosomes with octaarginine were prepared. In addition, a control ribosome was prepared using cholesterol instead of cholesterol to which sugar-introduced polyethylene glycol was bound.
  • an ultrasonic bath 125 W, Branson Ultrasonics
  • the cell cycle was synchronized with the G phase. If not, 18 hours before transfer
  • the medium was replaced with a new one, and the cells were cultured at 37 ° C in a 5% CO environment for 18 hours.
  • Rhodamine modified DPC was prepared. Except that this rhodamine-modified DPC was used and NBD—DOPE (AVANTI POLAR LIPIDS) was added to the black mouth form solution so as to be 1% mol of the total lipid amount, all by the method shown in Example 4, Prepared sugar-modified ribosomes with lipids labeled with NB D and encapsulating rhodamine-modified DPC
  • HeLa cells were seeded in a 35 mm glass bottom dish (Iwaki) 48 hours prior to transfection so that 5 x 10 4 cells / 2 mL DMEM (containing 10% serum) Zdish was obtained at 37 ° C. Culturing was performed in a 5% CO environment. 2.5 mM hydrate 18 hours before transfer
  • the cell cycle was synchronized with G phase by interculturing.

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Abstract

　目的物質の核内送達用ベクター及びそれを含有する組成物を提供する。 　脂質膜２ａと、脂質膜２ａの内側に封入された目的物質３とを備えた１枚膜リポソーム１ａであって、脂質膜２ａの表面に、糖と連続した複数個のアルギニン残基を含むペプチドとが導入された１枚膜リポソーム１ａは、脂質膜２ａの表面に存在するペプチドを介して細胞外から細胞内に移行し、細胞内に移行した後、脂質膜２ａの表面に存在する糖が核膜孔複合体へ結合し、核膜孔複合体に結合した糖が核内へ引き抜かれることにより、脂質膜２ａが崩壊し、脂質膜２ａの内側に封入された目的物質３は核膜孔を通じて核内に放出される。

Description

明 細 書
目的物質の核内送達用ベクター
技術分野
[0001] 本発明は、 目的物質の核内送達用ベクター等に関する。
背景技術
[0002] 近年、薬物、核酸等の目的物質を標的部位に確実に送達するためのベクターの開 発が盛んに行われている。例えば、遺伝子治療においては、 目的の遺伝子を標的細 胞へ導入するためのベクターとして、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイ ルス等のウィルスベクターが開発されている。しかしながら、ウィルスベクターは、大 量生産の困難性、抗原性、毒性等の問題があるため、このような問題点が少ないリポ ソームベクターが注目を集めている。リボソームベクターは、その表面に抗体、タンパ ク質、糖鎖等の機能性分子を導入することにより、標的部位に対する指向性を向上さ せることができると!/、う利点も有して 、る。
[0003] 例えば、リボソーム膜の外表面に親水性ポリマー（例えば、ポリエチレングリコール 等のポリアルキレングリコール）が導入されたリボソームが開発されている（特許文献 1 、特許文献 2、特許文献 3及び特許文献 4)。このリボソームによれば、リボソームの血 中滞留性を向上させることにより、腫瘍細胞に対するリボソームの指向性を向上させ ることがでさる。
[0004] また、リボソーム膜の外表面に、細胞膜の表面上に存在する受容体又は抗原と結 合できる物質 (例えば、トラスフェリン、インシュリン、葉酸、ヒアルロン酸、抗体又はそ の断片、糖鎖)が導入されたリボソームが開発されている (特許文献 3及び特許文献 4 ) oこのリボソームによれば、リボソームのエンドサイト一シス効率を向上させることがで きる。 また、リボソーム膜の外表面にステアリルィ匕ォクタアルギニンが導入されたリポ ノームが開発されている（特許文献 5,非特許文献 1)。このリボソームによれば、リポ ノームに封入された目的物質の細胞内送達効率を向上させることができる。
特許文献 1：特開平 1― 249717号公報
特許文献 2 :特開平 2— 149512号公報 特許文献 3：特開平 4 - 346918号公報
特許文献 4：特開 2004— 10481号公報
特許文献 5：国際公開 WO2005Z032593号パンフレット
非特許文献 l : Kogure, K.等.， Journal of Controlled Release, 2004年，第 98卷， p.317
-323
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0005] 本発明は、 目的物質の核内送達用ベクター及びそれを含有する組成物を提供す ることを目的とする。
課題を解決するための手段
[0006] 上記課題を解決するために、本発明は、以下のベクター及び組成物を提供する。
[0007] (1)糖を表面に有する脂質膜を備えたリボソーム力 なる目的物質の核内送達用べ クタ一。
[0008] (2)前記糖が親水性ポリマーを介して前記脂質膜の表面に結合して!/、る前記（1)記 載のベクター。
[0009] (3)前記糖が 1〜20個の糖残基力 なる前記（1)又は（2)記載のベクター。
[0010] (4)前記糖が単糖である前記（1)又は（2)記載のベクター。
[0011] (5)前記糖がアミノ糖である前記（1)又は（2)記載のベクター。
[0012] (6)前記糖の量が、前記脂質膜に含有される総脂質量の 0. 5〜65% (モル比）であ る前記（1)〜（5)の 、ずれかに記載のベクター。
[0013] (7)前記脂質膜に含有される膜安定化剤の量が、前記脂質膜構成成分の総量の 0
〜60% (モル比）である前記（1)〜（6)の!、ずれかに記載のベクター。
[0014] (8)核内へ送達しょうとする目的物質が前記リボソームの内部に封入されている前記
(1)〜（7)の!、ずれかに記載のベクター。
[0015] (9)前記（8)記載のベクターを含有する目的物質の核内送達用組成物。
[0016] (10)前記（8)記載のベクターを含有する医薬組成物であって、核内に送達されるこ とにより所定の疾患に対する治療効果及び Z又は予防効果を発揮し得る目的物質 力 前記リボソームの内部に封入されている前記医薬組成物。 [0017] (11)前記（8)記載のベクターを含有する遺伝子発現用組成物であって、核内で発 現させるべき遺伝子が前記リボソームの内部に封入されている前記遺伝子発現用組 成物。
発明の効果
[0018] 本発明により、目的物質の核内送達用ベクター及びそれを含有する組成物が提供 される。
発明を実施するための最良の形態
[0019] 以下、本発明を詳細に説明する。なお、「糖を表面に有する脂質膜」を以下「糖修 飾脂質膜」という場合がある。
[0020] リボソームは、糖修飾脂質膜を有する閉鎖小胞である限り、多重膜リボソーム (ML V)であって ょ ヽし、 SUV (small unilamellar vesicle)、 LUV (large unilamellar vesicl e)、 GUV (giant unilamellar vesicle)等の一枚膜リボソームであってもよい。
[0021] リボソームが多重膜リボソームである場合、リボソームは糖修飾脂質膜の内側及び /又は外側に 1又は複数の脂質膜を備える。糖修飾脂質膜の内側及び/又は外側 に位置する脂質膜は、当該脂質膜に期待される機能 (例えば、細胞膜融合能、ェン ドソーム膜融合能等）が保持される限り、糖を表面に有していてもよいし、糖を表面に 有していなくてもよい。リボソームが一枚膜リボソームである場合、リボソームは糖修飾 脂質膜のみを備える。
[0022] リボソームのサイズは特に限定されるものではないが、通常は直径 30〜700nm、 好ましくは直径 30〜500nm、さらに好ましくは直径 30〜300nmである。
[0023] リボソームが備える脂質膜 (糖修飾脂質膜であるカゝ否カゝを問わない)を構成する成 分は、脂質二重層の形成を阻害しない限り特に限定されるものではなぐ例えば、脂 質、膜安定化剤、抗酸化剤、荷電物質等が挙げられる。
[0024] 脂質は脂質膜の必須成分であり、その含有量は脂質膜構成成分の総量の通常 70
〜100% (モル比）、好ましくは 80〜： LOO% (モル比）、さらに好ましくは 90〜： LOO% ( モル比）である。
[0025] 脂質としては、例えば、ホスファチジルコリン（例えば、ジォレオイルホスファチジル コリン、ジラウロイルホスファチジルコリン、ジミリストイルホスファチジルコリン、ジノルミ トイルホスファチジルコリン、ジステアロイルホスファチジルコリン等）、ホスファチジル グリセロール（例えば、ジォレオイルホスファチジルグリセロール、ジラウロイルホスファ チジルグリセロール、ジミリストイルホスファチジルグリセロール、ジパルミトイルホスフ ァチジルグリセロール、ジステアロイルホスファチジグリセロール等）、ホスファチジル エタノールァミン（例えば、ジォレオイルホスファチジルエタノールァミン、ジラウロイル ホスファチジルエタノールァミン、ジミリストイルホスファチジルエタノールァミン、ジパ ルミトイルホスファチジルエタノールァミン、ジステアロイルホスファチジエタノールアミ ン等）、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジン酸、カルジ オリピン、スフインゴミエリン、卵黄レシチン、大豆レシチン、これらの水素添加物等の リン脂質；グリセ口糖脂質 (例えば、スルホキシリボシルグリセリド、ジグリコシルジグリセ リド、ジガラタトシルジグリセリド、ガラクトシルジグリセリド、グリコシルジグリセリド）、スフ インゴ糖脂質 (例えば、ガラクトシルセレブ口シド、ラタトシルセレブ口シド、ガンダリオ シド)等の糖脂質;動物由来のステロール (例えば、コレステロール、コレステロールコ ノヽク酸、ラノステロ一ノレ、ジヒドロラノステロ一ノレ、デスモステロ一ノレ、ジヒドロコレステロ ール）、植物由来のステロール（フィトステロール）（例えば、スチグマステロール、シト ステロール、カンペステロール、ブラシカステロール）、微生物由来のステロール（例 えば、チモステロール、エルゴステロール）等のステロール；パルミチン酸、ォレイン酸 、ステアリン酸、ァラキドン酸、ミリスチン酸等の飽和又は不飽和の脂肪酸 (炭素数は 例えば 12〜20)が挙げられる。
膜安定化剤は、脂質膜を物理的又は化学的に安定させたり、脂質膜の流動性を調 節したりするために添加できる脂質膜の任意成分であり、その含有量は脂質膜構成 成分の総量の通常 0〜70% (モル比）、好ましくは 0〜30% (モル比）、さらに好ましく は 0〜10% (モル比)である。特に糖修飾脂質膜においては、膜安定化剤の含有量 が脂質膜構成成分の総量の 0〜60% (モル比）であることが好ましぐ 0〜30% (モル 比）であることがさらに好ましぐ 0〜 10% (モル比）であることが最も好ましい。糖修飾 脂質膜における膜安定化剤の含有量が上記範囲にあると、核膜孔複合体に結合し た糖の核内への引き抜きによる糖修飾脂質膜の崩壊性を向上させることができるの で、リボソームの内部に封入された目的物質の核膜孔を通じた核内送達効率を向上 させることがでさる。
[0027] 膜安定化剤としては、例えば、ステロール、グリセリン又はその脂肪酸エステル等が 挙げられる。ステロールとしては、上記と同様の具体例が挙げられ、グリセリンの脂肪 酸エステルとしては、例えば、トリオレイン、トリオクタノイン等が挙げられる。
[0028] 抗酸化剤は、脂質膜の酸ィ匕を防止するために添加できる脂質膜の任意成分であり 、その含有量は脂質膜構成成分の総量の通常 0〜30% (モル比）、好ましくは 0〜20 % (モル比）、さらに好ましくは 0〜 10% (モル比）である。
[0029] 抗酸化剤としては、例えば、トコフエロール、没食子酸プロピル、パルミチン酸ァスコ ルビル、ブチル化ヒドロキシトルエン等が挙げられる。
[0030] 荷電物質は、脂質膜に正荷電又は負荷電を付与するために添加できる脂質膜の 任意成分であり、その含有量は脂質膜構成成分の総量の通常 0〜30% (モル比）、 好ましくは 0〜20% (モル比）、さらに好ましくは 0〜 10% (モル比）である。
[0031] 正荷電を付与する荷電物質としては、例えば、ステアリルァミン、ォレイルァミン等の 飽和又は不飽和脂肪族ァミン；ジォレオイルトリメチルアンモ -ゥムプロパン等の飽和 又は不飽和カチオン性合成脂質等が挙げられ、負電荷を付与する荷電物質としては 、例えば、ジセチルホスフェート、コレステリルへミスクシネート、ホスファチジルセリン 、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジン酸等が挙げられる。
[0032] 脂質膜 (糖修飾脂質膜であるか否カゝを問わない)を構成する脂質として、膜融合性 機能、血中滞留性機能、温度変化感受性機能、 pH感受性機能等を有する脂質又 は脂質誘導体を使用してもよい。これにより、上記機能のうち 1種又は 2種以上の機 能をリボソームに付与することができる。リボソームに膜融合性機能を付与することに より、リボソームは細胞膜、エンドソーム膜等と膜融合可能となる。リボソームに血中滞 留性機能を付与することにより、リボソームの血液中での滞留性を向上させ、肝臓、 脾臓等の細網内皮系組織による捕捉率を低下させることができる。リボソームに温度 変化感受性機能及び Z又は PH感受性機能を付与することにより、リボソームに封入 された目的物質の放出性を高めることができる。
[0033] 膜融合性機能を付与することができる脂質 (膜融合性脂質)としては、例えば、ジォ レオイルホスファチジルエタノールァミン等の中性脂質；コレステロールコハク酸、力 ルジオリピン等のァ-オン性脂質 (酸性脂質）が挙げられる。リボソームが多重膜リポ ソームであり、当該リボソームが細胞膜、エンドソーム膜等と融合させることを目的とし た脂質膜を糖修飾脂質膜の他に備える場合、当該脂質膜は膜融合性脂質を含有す ることができる。脂質膜に含有される膜融合性脂質は、細胞膜、エンドソーム膜と融 合可能である限り特に限定されるものではない。脂質膜に含有される膜融合性脂質 量は特に限定されるものではないが、脂質膜に含有される総脂質量の通常 40% (モ ル比）以上、好ましくは 70% (モル比）以上、さらに好ましくは 90% (モル比）以上であ る。脂質膜に含有される膜融合性脂質量を上記範囲とすることにより、細胞膜、エンド ソーム膜等に対する十分な融合能を脂質膜に付与することができる。なお、脂質膜 に含有される膜融合性脂質量の上限値は、脂質膜に含有される総脂質量の 100% である。
[0034] 血中滞留性機能を付与することができる血中滞留性脂質誘導体としては、例えば、 グリコフォリン、ガンダリオシド GM1、ホスファチジルイノシトール、ガンダリオシド GM 3、グルクロン酸誘導体、グルタミン酸誘導体、ポリグリセリンリン脂質誘導体、 N—{力 ルポ-ル-メトキシポリエチレングリコール— 2000}— 1,2—ジパルミトイル— sn—グリ セロー 3—ホスフォエタノールァミン、 N—{カルボ-ル-メトキシポリエチレングリコール - 5000}— 1,2-ジパルミトイル sn グリセ口一 3 ホスフォエタノールァミン、 N— { カルボ-ル―メトキシポリエチレングリコール— 750}— 1,2 ジステアロイル— sn—グ リセロー 3—ホスフォエタノールァミン、 N—{カルボ-ルーメトキシポリエチレングリコー ル 2000}— 1,2 ジステアロイル sn—グリセ口一 3 ホスフォエタノールァミン、 N - {カルボ-ル—メトキシポリエチレングリコール― 5000}—1,2—ジステアロイル - sn ーグリセロー 3—ホスフォエタノールァミン等のポリエチレングリコール誘導体等が挙 げられる。
[0035] 温度変化感受性機能を付与することができる温度変化感受性脂質誘導体としては 、例えば、ジパルミトイルホスファチジルコリン等が挙げられ、 pH感受性機能を付与 することができる pH感受性脂質誘導体としては、例えば、ジォレオイルホスファチジ ルエタノールァミン等が挙げられる。
[0036] 糖修飾脂質膜は、 1種類の糖を表面に有していてもよいし、 2種類以上の糖を表面 に有していてもよい。糖修飾脂質膜が表面に有する糖の量は、糖修飾脂質膜に含有 される総脂質量の通常 0. 5〜65% (モル比）、好ましくは 1〜60% (モル比）、さらに 好ましくは 5〜50% (モル比）である。糖修飾脂質膜が表面に有する糖の量を上記範 囲とすることにより、糖修飾脂質膜の表面に存在する糖の核膜孔複合体への結合、 及び核膜孔複合体に結合した糖の核内への引き抜きによる糖修飾脂質膜の崩壊を 効率よく生じさせることができるので、リボソームの内部に封入された目的物質の核膜 孔を通じた核内送達効率を向上させることができる。
[0037] 糖修飾脂質膜が表面に有する糖を構成する糖残基の総数は特に限定されるもの ではないが、通常 1〜20個、好ましくは 1〜5個、さらに好ましくは 1個である。糖の種 類は特に限定されるものではなぐ例えば、単糖、アミノ糖、デォキシ糖、二糖、三糖 、オリゴ糖等が挙げられるが、これらのうち単糖、ァミノ糖が好ましい。
[0038] 単糖としては、例えば、マンノース、ガラクトース、グルコース、フコース、フルクトース 等が挙げられる力 これらのうちマンノース、ガラクトース、グルコース又はフコースが 好ましい。糖がマンノースである場合、糖修飾脂質膜が表面に有するマンノースの量 は、糖修飾脂質膜に含有される総脂質量の 5〜60% (モル比)であることが好ましぐ 25〜50% (モル比）であることがさらに好ましい。糖がガラクトースある場合、糖修飾 脂質膜が表面に有するガラ外一スの量は、糖修飾脂質膜に含有される総脂質量の 1〜35% (モル比）であることが好ましぐ 5〜15% (モル比）であることがさらに好まし い。糖修飾脂質膜が表面に有するマンノース又はガラクトースの量を上記範囲とする ことにより、糖修飾脂質膜の表面に存在する糖の核膜孔複合体への結合、及び核膜 孔複合体に結合した糖の核内への引き抜きによる糖修飾脂質膜の崩壊を効率よく生 じさせることができるので、リボソームの内部に封入された目的物質の核膜孔を通じ た核内送達効率を向上させることができる。
[0039] アミノ糖としては、例えば、 N—ァセチルダルコサミン、 N—ァセチルガラタトサミン、 N—ァセチルマンノサミン等が挙げられるが、これらのうち N—ァセチルダルコサミン が好ましい。糖が N—ァセチルダルコサミンある場合、糖修飾脂質膜が表面に有する N—ァセチルダルコサミンの量は、糖修飾脂質膜に含有される総脂質量の 1〜30% (モル比）であることが好ましぐ 5〜15% (モル比）であることがさらに好ましい。糖修 飾脂質膜が表面に有する N—ァセチルダルコサミンの量を上記範囲とすることにより 、糖修飾脂質膜の表面に存在する糖の核膜孔複合体への結合、及び核膜孔複合体 に結合した糖の核内への引き抜きによる糖修飾脂質膜の崩壊を効率よく生じさせるこ とができるので、リボソームの内部に封入された目的物質の核膜孔を通じた核内送達 効率を向上させることができる。
[0040] 糖修飾脂質膜における糖の存在態様は、糖が脂質膜の表面力も露出し得る限り特 に限定されるものではなぐ糖は脂質膜構成成分に直接結合することにより脂質膜の 表面に存在して ヽてもよ ヽし、親水性ポリマーを介して (すなわち糖が導入された親 水性ポリマーが脂質膜構成成分に結合することにより)脂質膜の表面に存在していて もよいが、親水性ポリマーを介して脂質膜の表面に存在していることが好ましい。これ により、リボソームの単分散性を向上させることができる。
[0041] 脂質膜構成成分に直接結合する糖と、親水性ポリマーに導入された糖とが併存す る場合、両者の比率は適宜調節することができるが、親水性ポリマーに導入された糖 の割合は、糖修飾脂質膜が表面に有する糖の総量の通常 1% (モル比）以上、好ま しくは 5% (モル比）以上、さらに好ましくは 10% (モル比）以上である。親水性ポリマ 一に導入された糖の割合を上記範囲とすることにより、リボソームの単分散性を向上 させることがでさる。
[0042] 糖が親水性ポリマーを介して脂質膜の表面に存在して 、る場合、糖は親水性ポリ マーの主鎖の末端に結合して 、てもよ 、し、親水性ポリマーの側鎖の末端に結合し ていてもよいが、親水性ポリマーの主鎖の末端に結合していることが好ましい。また、 親水性ポリマーの主鎖の末端が脂質膜構成成分に結合して 、てもよ 、し、親水性ポ リマーの側鎖の末端が脂質膜構成成分に結合して 1、てもよ 、が、親水性ポリマーの 主鎖の末端が脂質膜構成成分に結合していることが好ましい。すなわち、糖が親水 性ポリマーの主鎖の一端に導入されており、親水性ポリマーの主鎖の他端が脂質膜 構成成分に結合して 、ることが好ま 、。
[0043] 糖が直接又は親水性ポリマーを介して結合する脂質膜構成成分は特に限定される ものではないが、脂質又は膜安定化剤であることが好ましぐリン脂質、ステロール又 は脂肪酸であることがさらに好ましい。糖が直接又は親水性ポリマーを介して結合す る脂質膜構成成分が脂質又は膜安定化剤、特にリン脂質、ステロール又は脂肪酸で あると、糖を極めて安定かつ簡便に脂質膜表面に提示することができるとともに、脂 質膜表面に提示される糖の密度をコントロールしゃす 、。
[0044] 糖が導入される親水性ポリマーとしては、例えば、ポリアルキレングリコール (例えば 、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリテトラメチレングリコール、ポ リへキサメチレングリコール等）、デキストラン、プルラン、フイコール、ポリビュルアルコ ール、スチレン 無水マレイン酸交互共重合体、ジビュルエーテル 無水マレイン 酸交互共重合体、アミロース、アミロぺクチン、キトサン、マンナン、シクロデキストリン 、ぺクチン、カラギーナン等が挙げられる力 これらのうち、ポリアルキレングリコール が好ましぐポリエチレングリコールがさらに好ましい。
[0045] 親水性ポリマーがポリアルキレングリコールである場合、その分子量は、通常 500〜 5000、好まし <は 1000〜3000、さらに好まし <は 2000〜3000である。
[0046] 親水性ポリマーには、メチル基、ェチル基、 n—プロピル基、イソプロピル基、 n—ブ チル基、イソブチル基、 s ブチル基、 t ブチル基、 n—ペンチル基、イソペンチル 基、 t ペンチル基、ネオペンチル基等の炭素数 1〜5の直鎖状又は分岐鎖状のァ ルキル基；メトキシ基、エトキシ基、 n プロポキシ基、イソプロポキシ基、 n ブトキシ 基、イソブトキシ基、 s ブトキシ基、 t ブトキシ基等の炭素数 1〜5の直鎖状又は分 岐鎖状のアルコキシ基；ヒドロキシル基、カルボ-ル基、アルコキシカルボ-ル基、シ ァノ基等の置換基が導入されて 、てもよ 、。
[0047] 脂質膜構成成分と親水性ポリマーとは、脂質膜構成成分が有する官能基 (脂質膜 構成成分に人為的に導入された官能基を含む。）と、親水性ポリマーが有する官能 基 (親水性ポリマーに人為的に導入された官能基を含む。 )との反応により形成され た共有結合を介して結合することができる。共有結合を形成できる官能基の組み合 わせとしては、例えば、アミノ基 Zカルボキシル基、アミノ基 Zハロゲン化ァシル基、 アミノ基 ZN ヒドロキシスクシンイミドエステル基、アミノ基 Zベンゾトリァゾールカ一 ボネート基、アミノ基 zアルデヒド基、チオール基 zマレイミド基、チオール基 zビ- ルスルホン基、水酸基 Zカルボキシル基等が挙げられ、これらの官能基同士の反応 は公知の方法に従って行うことができる。 [0048] 親水性ポリマーと糖とは、親水性ポリマーが有する官能基 (親水性ポリマーに人為 的に導入された官能基を含む。）と、糖が有する官能基 (糖に人為的に導入された官 能基を含む。）との反応により形成された共有結合を介して結合することができる。共 有結合を形成できる官能基の組み合わせとしては、例えば、アミノ基同士、ァミノ基と 水酸基、ァミノ基とチオール基等が挙げられ、これらの官能基同士の反応は公知の 方法に従って行うことができる。
[0049] 糖と脂質膜構成成分とは、糖が有する官能基 (糖に人為的に導入された官能基を 含む。）と、脂質膜構成成分が有する官能基 (脂質膜構成成分に人為的に導入され た官能基を含む。）との反応により形成された共有結合を介して結合することができる 。共有結合を形成できる官能基の組み合わせとしては、例えば、アミノ基同士、ァミノ 基と水酸基、ァミノ基とチオール基等が挙げられ、これらの官能基同士の反応は公知 の方法に従って行うことができる。
[0050] 糖が導入された親水性ポリマーは、例えば、次式: P— X— S [式中、 Pは親水性ポリ マーの残基を表し、 Xは直接結合又は連結基を表し、 Sは糖残基を表す。 ]で表すこ とができる。なお、 Xで表される連結基としては、例えば、ヘテロ原子を有していてもよ い 2価の炭化水素基；— O—；— S—； -NH-； -COO-； -SS-； -NHCO-； -NHCONH-；—SO—等が挙げられる。ヘテロ原子としては、例えば、窒素原子 、酸素原子、ハロゲン原子 (フッ素原子、塩素原子、臭素原子等)、硫黄原子等が挙 げられる。ヘテロ原子を有していてもよい 2価の炭化水素基としては、例えば、ェチレ ン基、トリメチレン基、プロピレン基等のアルキレン基；— SCH CH COO-； -OCH
2 2
CH COO-； -NHCH CH COO—； -SCH CH COOCH 一； -SOCH CH
2 2 2 2 2 2 2 2 2
COO—等が挙げられる。
[0051] 糖は、 V、ずれの炭素が有する置換基を介して脂質膜構成成分又は親水性ポリマー と結合していてもよいが、 1位の炭素が有する置換基を介して脂質膜構成成分又は 親水性ポリマーと結合することが好ま 、。
[0052] リボソームの内部には、核内に送達しょうとする目的物質を封入することができる。
目的物質の種類は特に限定されるものではなぐ例えば、薬物、核酸、ペプチド、タ ンパク質、糖又はこれらの複合体等が挙げられ、診断、治療、予防等の目的に応じて 適宜選択することができる。目的物質が疾病の診断、治療、予防等を目的とした物質 である場合、目的物質を保持したリボソームは、医薬組成物の構成成分として使用す ることができる。なお、「核酸」には、 DNA又は RNAにカ卩え、これらの類似体又は誘 導体 (例えば、ペプチド核酸 (PNA)、ホスホロチォエート DNA等）が含まれる。また 、核酸は一本鎖又は二本鎖のいずれであってもよいし、線状又は環状のいずれであ つてもよい。
[0053] 目的物質は、目的物質の凝集体としてリボソームの内部に封入されて 、ることが好 ましい。これにより、目的物質を効率よく核内に送達することができる。目的物質の凝 集体は、目的物質のみ力も構成されていてもよいし、目的物質以外の物質 (例えば、 目的物質を保持する担体)を含んで!/、てもよ!、。
[0054] 目的物質が正に帯電している場合、例えば、目的物質とァ-オン性物質とを静電 的に結合させて複合体ィ匕することにより、目的物質の凝集体を調製することができる 。 目的物質が負に帯電している場合、例えば、目的物質とカチオン性物質とを静電 的に結合させて複合体ィ匕することにより、目的物質の凝集体を調製することができる 。 目的物質が負及び正のいずれにも帯電していない場合、目的物質と所定の担体と を適当な様式 (例えば、物理的吸着、疎水結合、化学結合等)で結合させて複合体 ィ匕することにより、目的物質の凝集体を調製することができる。複合体化の際、目的 物質とカチオン性物質又はァニオン性物質との混合比率を調整することにより、全体 として正又は負に帯電する目的物質の凝集体を調製することができる。
[0055] 目的物質が核酸である場合、核酸とカチオン性物質と静電的に結合させて複合体 化することにより、核酸の凝集体を調製することができる。複合体化の際、核酸とカチ オン性物質との混合比率を調整することにより、全体として正又は負に帯電する核酸 の凝集体を調製することができる。
[0056] 目的物質の凝集体を調製する際に使用できるカチオン性物質は、分子中にカチォ ン性基を有する物質である限り特に限定されるものではない。カチオン性物質として は、例えば、カチオン性脂質（例えば、 Lipofectamine (Invitrogen社製））；カチオン性 基を有する高分子；ポリリジン、ポリアルギニン、リジンとアルギニンの共重合体等の 塩基性アミノ酸の単独重合体若しくは共重合体又はこれらの誘導体 (例えばステアリ ル化誘導体）；ポリエチレンィミン、ポリ（ァリルァミン）、ポリ（ジァリルジメチルアンモ- ゥムクロライド）、ダルコサミン等のポリカチオン性ポリマー；プロタミン又はその誘導体 (例えば硫酸プロタミン）；キトサン等が挙げられる力 これらのうち特にステアリルィ匕ポ リアルギニンが好まし 、。ポリアルギニンを構成するアルギニン残基の数は通常 4〜2 0個であり、好ましくは 6〜12個、さらに好ましくは 7〜10個である。カチオン性物質が 有するカチオン性基の数は特に限定されるものではないが、好ましくは 2個以上であ る。カチオン性基は正に荷電し得る限り特に限定されるものではなぐ例えば、ァミノ 基;メチルァミノ基、ェチルァミノ基等のモノアルキルアミノ基;ジメチルァミノ基、ジェ チルァミノ基等のジアルキルアミノ基；イミノ基；グァ-ジノ基等が挙げられる。
[0057] 目的物質の凝集体を調製する際に使用できるァニオン性物質は、分子中にァニォ ン性基を有する物質である限り特に限定されるものではない。ァ-オン性物質として は、例えば、ァ-オン性脂質;ァ-オン性基を有する高分子;ポリアスパラギン酸等の 酸性アミノ酸の単独重合体若しくは共重合体又はこれらの誘導体；キサンタンガム、 カルボキシビ二ルポリマー、カルボキシメチルセルロースポリスチレンスルホン酸塩、 ポリサッカライド、カラギーナン等のポリア-オン性ポリマー等を使用することができる 。ァ-オン性物質が有するァ-オン性基の数は特に限定されるものではないが、好ま しくは 2個以上である。ァ-オン性基は負に荷電し得る限り特に限定されるものでは なぐ例えば、末端カルボキシル基を有する官能基 (例えば、コハク酸残基、マロン酸 残基等)、リン酸基、硫酸基等が挙げられる。
[0058] 糖修飾脂質膜を備えたリボソームにお!/ヽて、糖修飾脂質膜の表面に存在する糖が 核膜孔複合体へ結合し、核膜孔複合体に結合した糖が核内へ引き抜かれることによ り、糖修飾脂質膜が崩壊し、リボソームの内部に封入された目的物質は核膜孔を通 じて核内に放出され、この結果、 目的物質は核内に送達される。したがって、糖修飾 脂質膜を備えたリボソームは、 目的物質の核内送達用ベクターとして使用することが できる。
[0059] リボソームが標的とする核は、細胞力 分離された核であってもよいし、細胞内に存 在する核であってもよい。リボソームが標的とする核が由来する生物種は特に限定さ れるものではなぐ例えば、動物、植物、微生物等が挙げられる力 動物が好ましぐ 哺乳動物がさらに好ましい。哺乳動物としては、例えば、ヒト、サル、ゥシ、ヒッジ、ャ ギ、ゥマ、ブタ、ゥサギ、ィヌ、ネコ、ラット、マウス、モルモット等が挙げられる。リポソ一 ムが標的とする核を含有する細胞の種類は特に限定されるものではなぐ例えば、体 細胞、生殖細胞、幹細胞又はこれらの培養細胞等が挙げられる。
[0060] 標的とする核が細胞内に存在する核である場合、リボソームは、糖修飾脂質膜が細 胞内に移行したリボソームの最外層に位置するように構成される。
[0061] 糖修飾脂質膜が細胞内に移行したリボソームの最外層に位置するような構成を有 するリボソームの一実施形態としては、例えば、図 1 (a)に示すように、脂質膜 2aと、 脂質膜 2aの内側に封入された目的物質 3とを備えた 1枚膜リボソーム laであって、脂 質膜 2aが、糖と連続した複数個のアルギニン残基を含むペプチドとを表面に有する 1枚膜リボソーム laが挙げられる。なお、「連続した複数個のアルギニン残基を含む ペプチド」については以下で詳述する。 1枚膜リボソーム laは、脂質膜 2aの表面に存 在するペプチドを介して、原形を保ったまま (インタクト (intact)な状態で)、細胞外か ら細胞内に移行することができる。細胞内に移行した後、脂質膜 2aの表面に存在す る糖が核膜孔複合体へ結合し、核膜孔複合体に結合した糖が核内へ引き抜かれる ことにより、脂質膜 2aが崩壊し、脂質膜 2aの内側に封入された目的物質 3は核膜孔 を通じて核内に放出される。
[0062] 糖修飾脂質膜が細胞内に移行したリボソームの最外層に位置するような構成を有 するリボソームの別の実施形態としては、図 1 (b)に示すように、脂質膜 21bと、脂質 膜 21bの外側に位置する脂質膜 22bと、脂質膜 21bの内側に封入された目的物質 3 とを備えた 2枚膜リボソーム であって、脂質膜 21bが糖を表面に有し、脂質膜 22b が膜融合性脂質を含有する 2枚膜リボソーム lbが挙げられる。脂質膜 22bに含有さ れる膜融合性脂質としては、例えば、ジォレオイルホスファチジルエタノールアミン等 の中性脂質；コレステロールコハク酸、カルジォリピン等のァ-オン性脂質 (酸性脂質 )が挙げられ、脂質膜 22bに含有される膜融合性脂質量は、脂質膜 22bに含有され る総脂質量の通常 40% (モル比）以上、好ましくは 70% (モル比）以上、さらに好まし くは 90% (モル比）以上である。なお、膜融合性脂質の含有量の上限値は 100%で ある。 [0063] 2枚膜リボソーム lbは、エンドサイト一シスを介して、細胞外から細胞内に移行する ことができる。エンドサイト一シスを介して細胞内に移行した 2枚膜リボソーム lbは、ェ ンドソーム内に取り込まれるが、エンドソーム膜と脂質膜 22bとが膜融合することにより 、エンドソーム力も脱出することができる。エンドソーム力も脱出したリボソームにおい て、脂質膜 22bはエンドソーム膜との膜融合により消失しているが、脂質膜 21bは保 持されている。エンドノームから脱出した後、脂質膜 21bの内側に封入された目的物 質 3は、 1枚膜リボソーム laの場合と同様にして、核内に放出される。
[0064] 2枚膜リボソーム lbは、脂質膜 22bと細胞膜との膜融合を介して、細胞外から細胞 内に移行することができる。細胞内に移行したリボソームにおいて、脂質膜 22bは細 胞膜との膜融合により消失しているが、脂質膜 21bは保持されている。細胞内に移行 した後、脂質膜 21bの内側に封入された目的物質 3は、 1枚膜リボソーム laの場合と 同様にして、核内に放出される。
[0065] 2枚膜リボソーム lbにおいて、脂質膜 22bに含有されるァ-オン性脂質量が、脂質 膜 22cに含有される膜融合性脂質量の 15% (モル比）以上、好ましくは 20% (モル比 )以上である場合、エンドソーム内が酸性 (pH5. 5〜6. 5)に変化することにより、又 は酸性条件下 (pH5. 5〜6. 5)で 2枚膜リボソーム lbと細胞とを接触させることにより 、脂質膜 22bとエンドソーム膜又は細胞膜とは効率よく膜融合することができる。
[0066] 連続した複数個のアルギニン残基を含むペプチドにおいて、連続したアルギニン 残基の個数は複数個である限り特に限定されるものではないが、通常 4〜20個、好 ましくは 6〜12個、さらに好ましくは 7〜： LO個である。ペプチドを構成するアミノ酸残 基の総数は特に限定されるものではないが、通常 4〜35個、好ましくは 6〜30個、さ らに好ましくは 7〜23個である。ペプチドは、連続した複数個のアルギニン残基の C 末端及び Z又は N末端に任意のアミノ酸配列を含むことができるが、アルギニン残基 のみ力もなることが好ま 、。連続した複数個のアルギニン残基の C末端又は N末端 に付加されるアミノ酸配列は、剛直性を有するアミノ酸配列（例えば、ポリプロリン)で あることが好ましい。ポリプロリンは、柔ら力べて不規則な形をとつているポリエチレング リコール (PEG)と異なり、直線的で、ある程度の堅さを保持している。また、連続した 複数個のアルギニン残基の C末端又は N末端に付加されるアミノ酸配列に含まれる アミノ酸残基は、酸性アミノ酸以外のアミノ酸残基であることが好ましい。負電荷を有 する酸性アミノ酸残基が、正電荷を有するアルギニン残基と静電的に相互作用し、ァ ルギニン残基の効果を減弱させる可能性があるためである。
[0067] 脂質膜の表面に存在するペプチド量の下限値は、脂質膜を構成する総脂質に対し て通常 0. 1% (モル比）、好ましくは 1% (モル比）、さらに好ましくは 2% (モル比）であ り、上限値は、脂質膜を構成する総脂質に対して通常 30% (モル比）、好ましくは 25 % (モル比）、さらに好ましくは 20% (モル比）である。
[0068] 連続した複数個のアルギニン残基を含むペプチドを表面に有するリボソームは、そ の表面に存在するペプチドを介して細胞内へ移行することができる（WO2005Z03 2593号参照)。リボソームの表面に存在するペプチドの量が、脂質膜を構成する総 脂質に対して 2% (モル比)未満、好ましくは 1. 5% (モル比)未満、さらに好ましくは 1 % (モル比）未満であると、リボソームは、主にエンドサイト一シスを介して細胞内又は 核内へ移行することができる（WO2005Z032593号参照）。このときのペプチドの 量の下限値は、脂質膜を構成する総脂質に対して通常 0. 1% (モル比）、好ましくは 0. 5% (モル比）、さらに好ましくは 0. 7% (モル比）である。一方、リボソームの表面 に存在するペプチドの量が、脂質膜を構成する総脂質に対して 2% (モル比)以上、 好ましくは 3% (モル比）以上、さらに好ましくは 4% (モル比）以上であると、リボソーム は、主にマクロピノサイト一シスを介して細胞内又は核内へ移行することができる (W O2005Z032593号参照)。このときのペプチド量の上限値は、脂質膜を構成する 総脂質に対して通常 30% (モル比）、好ましくは 25% (モル比）、さらに好ましくは 20 % (モル比）である。マクロピノサイト一シスでは、細胞外物質がマクロピノソームという 画分として細胞内に取り込まれ、マクロピノソームはエンドノームと異なりリソノームと 融合しないため、マクロピノソーム内封物はリソソームによる分解を回避することがで きる。したがって、リボソームがマクロピノサイト一シスを介して細胞内に移行する場合 、リボソームに封入された目的物質を効率よく細胞内に送達することができる。
[0069] リボソームの細胞内移行経路がエンドサイト一シスに依存する場合、脂質膜はその 主要成分としてカチオン性脂質を含む必要があるが、連続した複数個のアルギニン 残基を含むペプチドを表面に有するリボソームの細胞内移行経路は、エンドサイト一 シスにのみ依存するわけではな 、ので、脂質膜にカチオン性脂質が含まれて 、る必 要はない。すなわち、リボソームの脂質膜は、カチオン性脂質及び非力チオン性脂質 のいずれか一方で構成されていてもよいし、両方で構成されていてもよい。但し、力 チオン性脂質による細胞毒性を低減させる点、マクロピノサイト一シスを介してリポソ ームに封入された目的物質を効率よく細胞内に送達する点等力 は、脂質膜に含ま れるカチオン性脂質の量を出来る限り少なくすることが好ましぐ脂質膜を構成する総 脂質に対するカチオン性脂質の割合は 0〜40% (モル比）であることが好ましぐ 0〜 20% (モル比）であることがさらに好ましい。
[0070] 連続した複数個のアルギニン残基を含むペプチドの存在態様は、ペプチドがリポソ ームの表面力 露出する限り特に限定されるものではないが、ペプチドが疎水性基 又は疎水性化合物で修飾されており、疎水性基又は疎水性化合物が脂質二重層に 挿入され、ペプチドが脂質二重層から露出していることが好ましい。脂質二重層は親 水性部分と疎水性部分とからなり、疎水性基又は疎水性化合物は、脂質二重層の疎 水性部分と疎水結合することにより脂質二重層に挿入され得る。
[0071] 疎水性基又は疎水性ィ匕合物は、脂質二重層に挿入され得る限り特に限定されるも のでない。疎水性基としては、例えば、ステアリル基等の飽和又は不飽和の脂肪酸 基、コレステロール基又はその誘導体等が挙げられる力 これらのうち特に炭素数 10 〜20の脂肪酸基 (例えば、パルミトイル基、ォレイル基、ステアリル基、ァラキドイル基 等）が好ましい。また、疎水性ィ匕合物としては、例えば、上記に例示したリン脂質、糖 脂質又はステロール、長鎖脂肪族アルコール (例えば、フォスファチジルエタノール ァミン、コレステロール等）、ポリオキシプロピレンアルキル、グリセリン脂肪酸エステル 等が挙げられる。
[0072] リボソームは、例えば、水和法、超音波処理法、エタノール注入法、エーテル注入 法、逆相蒸発法、界面活性剤法、凍結'融解法等の公知の方法を用いて調製するこ とができる。また、リボソームを所定のポアサイズのフィルターで通過させることにより、 一定の粒度分布を持ったリボソームを得ることができる。また、公知の方法に従って、 多重膜リボソーム力も一枚膜リボソームへの転換、一枚膜リボソーム力も多重膜リポソ ームへの転換を行うことができる。 [0073] 糖修飾脂質膜を備えたリボソームを含有する組成物は種々の用途に使用すること ができる。例えば、目的物質の核内送達用組成物、医薬組成物、遺伝子発現用組 成物等として使用することができる。目的物質の核内送達用組成物として使用する場 合、目的物質がリボソームの内部に封入される。医薬組成物として使用する場合、核 内に送達されることにより所定の疾患に対する治療効果、予防効果等を発揮し得る 目的物質 (例えば、疾患原因遺伝子の発現を抑制できるアンチセンス DNA、 siRNA 等）が、リボソームの内部に封入される。遺伝子発現用組成物として使用する場合、 核内で発現させるべき遺伝子がリボソームの内部に封入される。
[0074] 各種組成物の剤形は特に限定されるものではな 、が、例えば、リボソームの分散液 が挙げられる。分散溶媒としては、例えば、生理食塩水、リン酸緩衝液，クェン緩衝 液，酢酸緩衝液等の緩衝液を使用することができる。分散液には、例えば、糖類、多 価アルコール、水溶性高分子、非イオン界面活性剤、抗酸化剤、 pH調節剤、水和 促進剤等の添加剤を添加してもよい。組成物の別の剤形としては、リボソームの分散 液の乾燥物 (例えば、凍結乾燥物、噴霧乾燥物等）が挙げられる。乾燥物は、生理食 塩水、リン酸緩衝液，クェン緩衝液，酢酸緩衝液等の緩衝液を加え、リボソームの分 散液として使用することができる。
[0075] 組成物を生体に投与する場合、その投与経路としては、例えば、静脈、腹腔内、皮 下、経鼻等の非経口投与が挙げられ、投与量及び投与回数は、リボソームの内部に 封入された目的物質の種類、量等に応じて適宜調節することができる。
図面の簡単な説明
[0076] [図 1]リボソームの構造を模式的に示す図である。
[図 2] (a)は、遺伝子封入糖修飾リボソームのトランスフエクシヨン 3時間後の遺伝子発 現量を示す図であり、（b)は、遺伝子封入糖修飾リボソームのトランスフエクシヨン 6時 間後の遺伝子発現量を示す図である。
[図 3] (a)は、遺伝子封入糖修飾リボソームのトランスフエクシヨン 3時間後の遺伝子発 現量を示す図であり、（b)は、遺伝子封入糖修飾リボソームのトランスフエクシヨン 6時 間後の遺伝子発現量を示す図である。
[図 4] (a)は、遺伝子封入糖修飾リボソームのトランスフエクシヨン 3時間後の遺伝子発 現量を示す図であり、（b)は、遺伝子封入糖修飾リボソームのトランスフエクシヨン 6時 間後の遺伝子発現量を示す図である。
[図 5] (a)は、遺伝子封入糖修飾リボソームのトランスフエクシヨン 3時間後の遺伝子発 現量を示す図であり、（b)は、遺伝子封入糖修飾リボソームのトランスフエクシヨン 6時 間後の遺伝子発現量を示す図である。
[図 6]遺伝子封入糖修飾リボソームのトランスフエクシヨン 6時間後の遺伝子発現量と 、脂質膜に含有されるコレステロール量との関係を示す図である。
[図 7]過剰量の糖の存在下における遺伝子封入糖修飾リボソームのトランスフエクショ ン 6時間後の遺伝子発現量を示す図である。
[図 8]遺伝子封入糖修飾リボソームが核内に移行して ヽることを示す写真である。青 色が核を、赤色が遺伝子、緑色がベクター由来脂質であることをそれぞれ示す。 実施例
[0077] 〔実施例 1〕
1.リボソームの作製
(a)ポリカチオンによる DNAの凝集化
DNAとしては、ルシフェラーゼ遺伝子及びその上流に CMVプロモーターを有する 全長 7037bpのプラスミド DNA (CMVプロモーターを有する pcDNA3. 1プラスミド にルシフェラーゼ遺伝子を組み込んだもの）を使用し、ポリカチオンとしては、硫酸プ ロタミンを使用した。 DNA及びポリカチオンをそれぞれ 10mM HEPES緩衝液 (pH 7. 4)に溶解し、 DNA溶液（0. lmgZmL)及びポリカチオン溶液（0. 07mg/mL) をボルテックス下、室温にて混合し、 DNAを凝集化させた。 NZP (nitrogen/phospha te)比 = 1で調製した DNAZポリカチオン複合体（DPC)懸濁液の DNA量は 0. 05 mgZ mLであつ 7こ。
[0078] (b)脂質膜の水和
DNAの凝集化の後、 DPC懸濁液 0. lmLを脂質膜にカ卩え、 15分間インキュベー シヨンして水和した。脂質膜は、ジォレオイルホスファチジルエタノールァミン（dioleoy 1 phosphatidyl ethanolamine: DOPE)と、 N—ァセチルダルコサミン導入ポリエチレン グリコールに結合したコレステロール（GlcNAc— PEG— Choi)とを 2 : 1又は 9 : 1 (モ ル比)でクロ口ホルムに溶解して混合した後（総脂質量 55nmol)、脂質膜の表面をォ クタアルギニン (R8)で修飾するためにステアリルォクタアルギニン（STR— R8)溶液 (脂質の 5モル％)を混合液に加え、ガラス試験管内で溶媒を除去することにより形成 させた。水和後の脂質の最終濃度は 0. 55mMであった。
[0079] GlcNAc PEG Choiは次のスキームに従って合成した。
[0080] [GlcNAc PEG Choi (化合物 5)の合成スキーム]
[化 1]
Figure imgf000021_0001
5 [0081] まず、コレステロール 10gをピリジン lOOmLに溶解し、 p-TsCl 10gを加え、室温 で 16時間撹拌した。反応後、得られた液体をシリカゲルクロマトグラフィーで精製する ことによりィ匕合物 1 (収量 13g)を得た。続いて、化合物 l (lg)を真空下にてよく脱気し た後、ジォキサン 18mLに懸濁した。これに巿販のテトラエチレングリコール 2gをカロ え、不活性条件下、オイルバスで 4時間還流した。得られた液体を濃縮後、シリカゲ ルクロマトグラフィーで精製することにより薄黄色透明の液体として化合物 2 (収量 0. 144g)を得た。化合物 2 (120mg)を真空下でよく脱気した後、 CH CI lOmLに溶
2 2
解し、活性ィ匕したモレキュラーシーブス (4 A) (2g程度）をカ卩えて撹拌し、これに 3,4,5 —tri—0—Acetyト 1—thiophenyト 2— N—Troc— glucosamine 240mgをカ卩え、続 ヽて N—ヒド 口キシコハク酸イミド 145mg及びトリフルォロメタンスルホン酸（純度 98%,和光純薬 製) 10 μ Lを加えて反応を開始した。不活性及び禁水条件下で 3時間程度反応させ 、得られた反応溶液をクロ口ホルムで希釈後、チォ硫酸ナトリウム飽和水溶液、続い て水で洗浄した。得られた有機層を硫酸ナトリウムで乾燥後、濃縮し、シリカゲルクロ マトグラフィ一にて精製し、化合物 3 (収量 130mg)を得た。化合物 3 (130mg)に無 水酢酸（和光純薬製） 3mL、酢酸（和光純薬製） 3mL、 THF 5mLを加えて室温で 撹拌した。 lOOmMの硫酸銅五水和物水溶液に少量の Znパウダーをくわえ、 Znを 活性化した後、これを濾別したもの (触媒量)を反応溶液に加えて反応を開始し、 5時 間程度反応させた。得られた化合物 4 (収量 180mg)は精製せずに次の反応へ用い た。化合物 4の粗生成物 180mgをメタノール 5mLに溶かし、撹拌した後、 28質量 %ナトリウムメトキシド一メタノール溶液 19 /z Lをカ卩えて反応を開始した。 1時間ほど 室温で撹拌した後、 DOWEX(50WX8- 200 ion-exchange resin) (l〜2g程度）をカロ えて溶液を中和し、続いて綿栓濾過によってこれを取り除いた。得られた溶液を濃縮 後、シリカゲルクロマトグラフィーによって精製し、 目的物である化合物 5 (収量 30mg )を得た。各化合物の同定は NMR及び質量分
祈によって行った。
[0082] (c)超音波処理による凝集化 DNAのパッケージング
DPCを脂質でコーティングするために、ガラス試験管を超音波槽（125 W, Branson Ultrasonics)で約 1分間超音波処理した。こうして、脂質膜の表面に N—ァセチルダ ルコサミン (N ァセチルダルコサミンはポリエチレングリコールを介して脂質膜に結 合する）及びォクタアルギニンを有するリボソームを作製した (粒径： 200nm、ゼータ 電位： + 15mV)。リボソームの流体力学的直径は準弾性光散乱方法によって測定し 、ゼータ電位は、電気泳動的光散乱分光測光器（ELS-8000, Otsuka electronics)に よって測定した。
[0083] GlcNAc— PEG— Choiの代わりにコレステロール（Choi)を使用し、脂質膜の表 面にォクタアルギニンを有するが N ァセチルダルコサミンは有しないリボソームを作 製した（粒径： 220nm、ゼータ電位： + 30mV)。
[0084] ステアリルォクタアルギニンによる脂質膜の修飾を行わず、脂質膜の表面に N ァ セチルダルコサミンを有するがォクタアルギニンは有しな ヽリボソームを作製した (粒 径： 190nm、ゼータ電位： - 20mV)。
[0085] GlcNAc— PEG— Choiの代わりにコレステロール（Choi)を使用するとともに、ステ ァリルォクタアルギニンによる脂質膜の修飾を行わず、脂質膜の表面に N ァセチル ダルコサミンもォクタアルギニンも有しな 、リボソームを作製した (粒径： 200nm、ゼー タ電位： 10mV)。
[0086] 2.遺伝子発現解析
非分裂細胞のモデルとして G1期に細胞周期を同調させた細胞 (ヒト子宮頸ガン由 来 HeLa細胞）を用い、遺伝子発現解析を行った。
[0087] トランスフエクシヨン 18時間前にヒドロキシ尿素（終濃度 2. 5mM)を細胞に添カロし、
37°C、 5%COで 18時間インキュベーションし、細胞を G1期に同調させた。その後、
2
ヒドロキシ尿素存在条件下（2. 5mM)、細胞にリボソーム（DNAlOpgZcell)を添カロ し、 37°Cで 3時間インキュベーションすることにより、細胞にリボソームをトランスフエク シヨンした。トランスフエクシヨンの 3時間後及び 6時間後、細胞を洗浄し、 reporter lysi s buffer (Promega社） 75 μ Lで溶解し、細胞溶解液 20 μ Lにルシフェラーゼアツセィ 試薬（Promega社） 50 μ Lをカ卩えて、ルミノメーター（Luminescencer- PSN)によりルシ フェラーゼ活性を測定した。また、 BCAプロテインアツセィキット（PIERCE社）により細 胞溶解液中のタンパク質量を測定した。トランスフエクシヨン 3時間後の遺伝子発現量 を図 2 (a)に、トランスフエクシヨン 6時間後の遺伝子発現量を図 2 (b)に示す。 [0088] 図 2 (a)に示すように、トランスフエクシヨン 3時間後、脂質膜の表面に N—ァセチル ダルコサミンもォクタアルギニンも有しな 、リボソーム、脂質膜の表面にォクタアルギ ニンを有するが N ァセチルダルコサミンは有しないリボソーム、及び脂質膜の表面 に N ァセチルダルコサミンを有するがォクタアルギニンは有しないリボソームは、脂 質組成に関わらず、遺伝子発現は全く認められな力つた。一方、脂質膜の表面に N —ァセチルダルコサミン及びォクタアルギニンを有するリボソームは、 DOPE： GlcN Ac— PEG— Chol= 2 : 1の場合には遺伝子発現は全く認められなかった力 DOPE ： GlcNAc PEG Chol= 9： 1の場合には有意な遺伝子発現が認められた。
[0089] また、図 2 (b)に示すように、トランスフエクシヨン 6時間後、脂質膜の表面に N ァセ チルダルコサミンもォクタアルギニンも有しな ヽリボソーム、及び脂質膜の表面に N— ァセチルダルコサミンを有するがォクタアルギニンは有しな 、リボソームは、脂質組成 に関わらず、遺伝子発現が極めて低かった。脂質膜の表面にォクタアルギニンを有 するが N—ァセチルダルコサミンは有しないリボソームは、トランスフエクシヨン 3時間 後よりも若干高い遺伝子発現が認められた。一方、脂質膜の表面に N—ァセチルダ ルコサミン及びォクタアルギニンを有するリボソームは、 DOPE : GlcNAc— PEG— C hol= 2 : 1の場合、脂質膜の表面にォクタアルギニンを有するが N ァセチルダルコ サミンは有しな 、リボソーム（DOPE： Chol= 2： 1)の遺伝子発現よりも約 11倍高!ヽ 遺伝子発現が認められ、 DOPE： GlcNAc— PEG— Chol= 9 : 1の場合、脂質膜の 表面に N ァセチルダルコサミン及びォクタアルギニンを有するリボソーム（DOPE : GlcNAc - PEG - Chol= 2 : 1)の遺伝子発現よりも約 13倍高 、（すなわち、脂質膜 の表面にォクタアルギニンを有するが N ァセチルダルコサミンは有しないリボソーム (DOPE： Choi = 2： 1)の遺伝子発現よりも約 141倍高 ヽ)遺伝子発現が認められた
[0090] 脂質膜の表面にォクタアルギニンを有するが N ァセチルダルコサミンは有しな!/ヽ リボソームの遺伝子発現はほとんど認められな力つたことから、 N ァセチルダルコサ ミンは、細胞表面レセプター認識によりリボソームの細胞内取り込みを促進する素子 として機能するわけではなぐォクタアルギニンの機能によりリボソームが細胞内に取 り込まれた後に、リボソームの核移行を促進する素子として機能すると考えられる。脂 質膜の表面に存在する糖が核膜孔複合体へ結合することにより、リボソームが核移 行し、核膜孔複合体に結合した糖が核内へ引き抜かれることにより、脂質膜が崩壊し てリボソームの内部に封入された目的物質は核膜孔を通じて核内に放出されると考 えられる。リボソームの核移行には、主として、糖の核膜孔複合体への結合が関与し ていると考えられ、リボソーム封入物質の核内送達には、主として、核膜孔複合体に 結合した糖の核内への引き抜きによる脂質膜の崩壊、及び脂質膜に含有される膜安 定化剤 (例えばコレステロール等)の量の減少による脂質膜の崩壊性の向上が関与 しているものと考えられる。
[0091] 〔実施例 2〕
DOPEと、コレステロール（Choi)と、糖導入ポリエチレングリコールが結合したコレ ステロール（Sugar— PEG— Choi)とを 5 :5:0、 5:4:1、 5:3:2、 5:2:3、 5:1:4又 は 5： 0： 5 (モル比）でクロ口ホルムに溶解して混合して (総脂質量 55nmol)脂質膜を 形成させた点を除き、実施例 1と同様の操作を行い、脂質膜の表面に糖 (糖はポリエ チレングリコールを介して脂質膜に結合する）及びォクタアルギニンを有するリポソ一 ムを作製した（粒径： 220nm、ゼータ電位： + 10mV)。
[0092] 糖としては、 N ァセチルダルコサミン（GlcNAc)、マンノース（Man)又はガラタト ース (Gal)を使用した。
[0093] Man - PEG - Choi及び Gal - PEG - Choiは以下のスキームに従つて合成した。
[0094] [Man PEG Choi (化合物 7)の合成スキーム]
[化 2]
Figure imgf000026_0001
Figure imgf000026_0002
Figure imgf000026_0003
[0095] 化合物 2 (lg)力 溶媒を十分に除き、それに対して penta-O- Acetyl a - D- Manno pyranose lgをカロえ、 CH CI (anhydrous) lOmLに溶解し、反応溶液に巿販 (東京化
2 2
成工業株式会社製）の Boron Trifluoride Ethyl Ether Complex 1. 2gを加え、反応を 開始した。 16時間室温で撹拌後、水で分液洗浄し、有機層を得た。有機層をシリカ ゲルカラムクロマトグラフィーによって精製し、化合物 6を得た (収量 40mg)。化合物 6 の粗生成物 40mgをメタノール 5mLに溶かし、撹拌した後、 28質量％ナトリウムメト キシド一メタノール溶液 10 Lをカ卩えて反応を開始した。 1時間ほど室温で撹拌した 後、 DOWEX(50WX8- 200 ion-exchange resin) (l〜2g程度）をカ卩え溶液を中和し、 得られた溶液を濃縮後、シリカゲルクロマトグラフィーで精製して目的物である化合物 7 (収量328)を得た。
[0096] [Gal PEG Choi (化合物 9)の合成スキーム] [化 3]
Figure imgf000027_0001
化合物 2 (lg)力 溶媒を十分に除き、それに対して penta-O- Acetyl a - D- Galact opyranose lgをカ卩え、 CH CI (anhydrous) lOmLに溶解し、反応溶液に市販の Boro
2 2
n Trifluoride Ethyl Ether Complex 1. 2gを加え、反応を開始した。 16時間室温で撹 拌の後、 CHC1で希釈した後、飽和 NaHCO水溶液、続いて脱イオン水で分液し、
3 3
有機層を得た。得られた有機層をエバポレーターで濃縮後、カラムクロマトグラフィー によって精製し、化合物 8を得た (収量 32mg)。化合物 8 (32mg)をメタノール 5mL に溶かし、撹拌した後、 28質量0 /0ナトリウムメトキシド—メタノール溶液 10 Lを加え て反応を開始した。 1時間ほど室温で撹拌した後、 DOWEX(50WX8-200 ion-excha nge resin) (l〜2g程度）をカ卩ぇ溶液を中和し、続いて綿栓濾過によってこれを取り除 いた。得られた溶液を濃縮後、シリカゲルクロマトグラフィーによって精製し、目的物 である化合物 9を得た (収量 20. 8mg) 0
[0098] 実施例 1と同様にしてリボソームを細胞にトランスフエクシヨンし、遺伝子発現解析を 行った。トランスフエクシヨン 3時間後の遺伝子発現量を図 3 (a)、図 4 (a)又は図 5 (a) に、トランスフエクシヨン 6時間後の遺伝子発現量を図 3 (b)、図 4 (b)又は図 5 (b)に 示す。
[0099] 図 3に示すように、糖が N—ァセチルダルコサミンであるとき、脂質膜の表面に存在 する糖の量が脂質膜に含有される総脂質量の 10% (モル比)である場合に最も高い 遺伝子発現が認められた。なお、図 3中、「★」は対照であり、「X 127」等は対照に対 する遺伝子発現量を示す。また、図 4に示すように、糖がマンノースであるとき、脂質 膜の表面に存在する糖の量が脂質膜に含有される総脂質量の 40% (モル比)である 場合に最も高い遺伝子発現が認められた。なお、図 4中、「★」は対照であり、「X 12 10」等は対照に対する遺伝子発現量を示す。また、図 5に示すように、糖がガラクトー スであるとき、脂質膜の表面に存在する糖の量が脂質膜に含有される総脂質量の 10 % (モル比）である場合に最も高い遺伝子発現が認められた。なお、図 5中、「★」は 対照であり、「X 116」等は対照に対する遺伝子発現量を示す。
[0100] 〔実施例 3〕
コレステロール（Choi)及び糖導入ポリエチレングリコールが結合したコレステロ一 ル（GlcNAc— PEG— Choi, Man -PEG -Choi, Gal— PEG— Choi)力脂質膜 に含有される (残りの成分は DOPE)リボソームを、 Choi含有量を変化させながら実 施例 1及び 2と同様にして調製し、リボソームを細胞にトランスフエクシヨンした後（6時 間後）の遺伝子発現量を実施例 1及び 2と同様にして測定した。なお、 GlcNAc— P EG— Choiの量は、脂質膜に含有される総脂質量の 10% (モル比）、 Man— PEG— Choiの量は、脂質膜に含有される総脂質量の 30% (モル比）、 Gal— PEG— Choi の量は、脂質膜に含有される総脂質量の 10% (モル比）とした。
[0101] その結果、図 6に示すように、糖の種類に関わらず、 Choi含有量が小さくなると、遺 伝子発現量が増加した。脂質膜の安定性が低減することにより、核膜上における脂 質膜の崩壊性が向上したため、リボソームの内部に封入された遺伝子の核内送達効 率を向上したものと考えられる。
[0102] [実施例 4]
DOPE :糖導入ポリエチレングリコールが結合したコレステロール（GlcNAc— PEG — Chol、 Man— PEG— Chol、 Gal -PEG -Choi) = 9 : 1の脂質組成からなるクロ 口ホルム溶液に、脂質膜の表面をォクタアルギニン (R8)で修飾するためにステアリ ルォクタアルギニン（STR—R8)溶液 (脂質の 5モル％)を加え、ガラス試験管内で溶 媒を除去することにより脂質膜を形成させた。この脂質膜に対して、実施例 1で調製 した DPC懸濁液をカ卩えて 15分間インキュベーションした後、超音波槽（125 W, Bran son Ultrasonics)で約 1分間超音波処理して、上記糖及びォクタアルギニンを有する リボソームを調製した。また、糖導入ポリエチレングリコールが結合したコレステロール に代えてコレステロールを使用したコントロールリボソームを調製した。
[0103] トランスフエクシヨンの 48時間前に 24穴プレートに 2 X 104 cells/500 μ L DMEM ( 10%血清を含む） Zdishとなるように HeLa細胞を播種し、 37°C、 5% CO環境下で
2 培養した。トランスフエクシヨンの 18時間前に培地を 2. 5mMヒドロキシ尿素含有 DM EM(10%血清を含む）交換し、 37°C、 5% CO環境下で 18時間培養することで、細
2
胞周期を G期に同調させた。同調しない場合は、トランスフ クシヨンの 18時間前に
1
培地を新しいものに交換し、 37°C、 5% CO環境下で 18時間、培養した。
2
[0104] HeLa細胞および G期に同調した HeLa細胞に上記のリボソームを含む溶液 0. 2
1
5mL (pDNAとして 0. 4 gに相当、また G期に同調した HeLa細胞の場合は、ヒド ロキシ尿素を 2. 5mM含む）を lmM、 5mM、 20mMの GlcNAc、 Man, Galと共に 添加し、 37°C、 5% COで 3時間インキュベートした。トランスフエクシヨン 3時間後に
2
、培地を 10%血清を含む（G期に同調した HeLa細胞の場合はヒドロキシ尿素を 2. 5
1
mMをさらに含む) DMEM培地に交換した後、 37°C、 5% COでさらに 3時間インキ
2
ュペートした。 PBS 0. 25mLで 3回細胞を洗浄したのち、 Reporter lysis buffer 75 μ Lを添加し、— 80°Cで約 30分凍結した。 30分後凍結したプレートを室温で融解させ 、氷上にてセルスクレーパーを用いて細胞を剥がしとり、細胞溶解液を回収し、上清 20 μ 1当たりのルシフェラーゼ活性 (RLU)を測定した。さらに上清を DDWで 5倍希 釈し、 BCA法によりタンパク定量を行い、得られる RLUをタンパク量で除することによ つて単位細胞当たりのルシフェラーゼ活性（RLU/mg protein)を算出した。
[0105] この結果、 GlcNAc、 Mannose、 Galactose, V、ずれの糖修飾リボソームにお!/、て も、過剰量の糖の存在下での遺伝子発現の変動は認められず、リボソームに含まれ る糖が細胞への取り込み過程にぉ 、て機能をして 、な 、ことが示唆された（図 7)。こ の実験結果は、本発明のリボソームが糖レセプターを介して細胞に取り込まれるので はなぐォクタアルギニンの機能により細胞内に導入され、細胞内に取り込まれた後 に糖が機能することを示すものである。
[0106] [実施例 5]
Label IT CX— Rhodamine Labeling Kit (Penverna Corp.)を用いて、添付のプロトコ一 ルに従い、実施例 1と同じプラスミド DNAをローダミン (Rhodamine)標識し、さらに 実施例 1と同様の操作を行って、ローダミン修飾 DPCを調製した。このローダミン修 飾 DPCを用 、、クロ口ホルム溶液に総脂質量の 1 %モルとなるように NBD— DOPE ( AVANTI POLAR LIPIDS) を添カ卩した他は全て実施例 4に示した方法によって、 NB Dで脂質がラベルされ、ローダミン修飾 DPCを封入した糖修飾リボソームを調製した
[0107] トランスフエクシヨンの 48時間前に 35mmガラスボトム皿（Iwaki社） に 5 X 104 cells /2mL DMEM (10%血清を含む) Zdishとなるように HeLa細胞を播種し、 37°C、 5% CO環境下で培養した。トランスフエクシヨンの 18時間前に培地を 2. 5mMヒド
2
ロキシ尿素含有 DMEM (10%血清含有)に交換し、 37°C、 5% CO環境下で 18時
2
間培養することで、細胞周期を G期に同調させた。
1
[0108] この HeLa細胞に上記のリボソーム溶液 lmL (pDNAとして 2 μ gに相当、またヒドロ キシ尿素を 2. 5mM含有)を添カ卩し、 37°C、 5% COで 3時間インキュベートすること
2
で、曝露させた。細胞を 20UnitsZmLへパリン（PBS溶液） lmLで 3回洗浄した後、 1ェ mgZmL Hoechst 33342(水溶液)を終濃度 5 gZmLとなるように添カ卩し、室温 、遮光条件下で 10分間インキュベートすることで核を染色した。 PBSで細胞を洗浄し たのち、培地を DMEMZF— 12に交換し、共焦点レーザースキャン顕微鏡にて解 祈した。
[0109] その結果、糖修飾を受けていないリボソームでは遺伝子の核への局在は全く認めら れなかったのに対して、糖修飾を受けたリボソームでは、遺伝子の核への局在が認 められた（図 8)。

Claims

請求の範囲
[I] 糖を表面に有する脂質膜を備えたリボソーム力 なる目的物質の核内送達用べクタ
[2] 前記糖が親水性ポリマーを介して前記脂質膜の表面に結合している請求の範囲第 1 項記載のベクター。
[3] 前記糖が 1〜20個の糖残基力もなる請求の範囲第 1項又は第 2項記載のベクター。
[4] 前記糖が単糖である請求の範囲第 1項又は第 2項記載のベクター。
[5] 前記糖がアミノ糖である請求の範囲第 1項又は第 2項記載のベクター。
[6] 前記糖の量が、前記脂質膜に含有される総脂質量の 0. 5〜65% (モル比)である請 求の範囲第 1項〜第 5項のいずれかに記載のベクター。
[7] 前記脂質膜に含有される膜安定化剤の量が、前記脂質膜構成成分の総量の 0〜60
% (モル比）である請求の範囲第 1項〜第 6項のいずれかに記載のベクター。
[8] 核内へ送達しょうとする目的物質が前記リボソームの内部に封入されている請求の 範囲第 1項〜第 7項のいずれかに記載のベクター。
[9] 請求の範囲第 8項記載のベクターを含有する目的物質の核内送達用組成物。
[10] 請求の範囲第 8項記載のベクターを含有する医薬組成物であって、核内に送達され ることにより所定の疾患に対する治療効果及び Z又は予防効果を発揮し得る目的物 質力 前記リボソームの内部に封入されている前記医薬組成物。
[II] 請求の範囲第 8項記載のベクターを含有する遺伝子発現用組成物であって、核内で 発現させるべき遺伝子が前記リボソームの内部に封入されて!、る前記遺伝子発現用 組成物。
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