WO2007094495A2 - 新規な抗がんカテプシン製剤およびそれを用いたがん併用療法抗がん剤 - Google Patents

Abstract

　この発明の抗がんカテプシン製剤は、カテプシンＥおよび／またはその活性部位からなるもしくはその活性部位を含む活性フラグメントを有効成分として含有する。 　この発明の抗がんカテプシン製剤は、正常細胞に対しては悪影響を及ぼすことなく、がん細胞のみの成長を阻止ならびに転移を防止すると共に、がん細胞のアポトーシスを誘導することができる。また、他の抗がん剤と併用することにより、従来の抗がん剤が感受性を示さなかったがんに対しても、その感受性を増強することができ、その感受性増強作用によりがんに対する治療効果を著しく高めることができる。さらに、抗がん剤の感受性が増強されることにより、その抗がん剤自体の用量を減少することができることになり、その抗がん剤による副作用などを著しく低減することができる。

Description

明 細 書

新規な抗がんカテブシン製剤およびそれを用いたがん併用療法杭がん 剤

技術分野

[0001] この発明は、新規な抗がんカテブシン製剤およびそれを用いたがん併用療法に関 し、更に詳細には、カテブシン Eおよび Zまたはその活性フラグメントを有効成分とし て含む杭がんカテブシン製剤およびそれと抗がん剤とをさらに有効成分として含有 する新規杭がんカテブシン製剤、それと抗がん剤とを併用することによって抗がん剤 の感受性を増強することができる新規な抗がん剤、つまり抗がんカテブシン製剤、抗 がん剤の感受性増強方法および該抗がん剤を用いたがんの治療方法に関するもの である。

背景技術

[0002] これまで、がんを治療するために数多くの抗がん剤が開発されてきた。しかしながら 、これらの薬剤は、がん細胞ば力りではなぐ正常細胞に対しても攻撃をして損傷'殺 傷してしまうという大きな欠点を有している。これまで、正常細胞に対しては作用せず 、がん細胞だけを攻撃する抗がん作用物質が研究されている力 これらの物質はい ずれも研究室レベルで作用が見られたとしても、実際には効果がなぐ実用化されて いるものはない。

[0003] また、これらの薬剤の多くは、単独では十分な効果を得られない場合が多ぐいくつ 力の抗がん剤を併用する併用療法が試みられてきた。しかしながら、十分な抗がん 作用効果が得られて 、な 、場合も多 、のが現状である。

作用機序の異なる複数の抗がん剤を組み合わせて併用する併用療法の他に、そ れ自体は杭がん作用を有しない薬剤との併用療法も提案されているが、かかる併用 療法も十分な抗がん作用効果を奏して 、な 、。

さらに、抗がん剤と種々の化合物との併用療法も提案されている (例えば、特許文 献 1、 2, 3参照)。し力しながら、力かる併用療法も十分な抗がん効果を得られていな V、場合が多 、と言わざるをえな 、。 [0004] 、ずれの併用療法にお 、ても、抗がん剤の感受性を増強できれば、がん治療の効 果を改善することができることから、種々の併用療法が要望されて 、る。

[0005] なお、本明細書において、「がん」または「腫瘍」などの関連する用語は、特に厳密 に区別して使用しているのではなぐ互換可能な意味で使用されていて、例えば、「 がん」という用語を用いたときには、特に定めない限りもしくは文脈力も明白である場 合を除いて、「腫瘍」などの関連する用語をも意味して使用されているものと理解すベ きである。したがって、反対に、「腫瘍」という用語を使用している場合には、特に定め ない限りもしくは文脈力も明白である場合を除いて、「がん」などの関連する用語をも 意味して使用されているものと理解すべきである。

[0006] カテブシンは、ァスパラギン酸プロテアーゼであって、高等動物から微生物に至る まで幅広く分布し、細胞内外のタンパク質代謝やプロセッシングなどの重要な生体機 能を担っている。かかる高等動物のァスパラギン酸プロテアーゼの 1つとして、細胞内 エンドソーム /リソソーム系にカテブシン Dやカテブシン Eが存在して!/、る。ァスパラギ ン酸プロテアーゼは、細胞内外のタンパク質代謝やプロセッシングに関与することか ら、その活性レベルの変化は血圧異常や胃力、いよう、発がんなどのさまざまな病態に つながると考えられてきた。

[0007] これらカテブシンのうち、カテブシン Eは、胃、腸管などの消化管上皮、リンパ系組 織、泌尿器系組織、血液系細胞および皮膚に限定的に分布している細胞内ァスパラ ギン酸プロテアーゼである。特に胃はすべての組織の中でカテブシン E含量が最も 高ぐカテブシン D含量よりも多くなつている。カテブシン Eの細胞内局在もカテブシン Dのそれとは明らかに異なり、組織 ·細胞特異性がある。赤血球や破骨細胞、近位尿 細胞などでは、細胞膜に、ミクログリアやマクロファージでは、エンドソーム Zリソソ一 ムシステムに、その他の多くの末梢組織では、小胞体やゴルジ体に存在する。これま での研究から、カテブシン Eは、赤血球を除くほとんどの細胞で、エンドソーム Zリソソ ームシステムに局在するときにのみ成熟型構造としてプロテアーゼ活性を発現するこ とが明らかにされている。また、ミクログリアやマクロファージなどの免疫系細胞では、 インターフェロン γやリポ多糖など、何らかの刺激が細胞に加わって活性ィ匕されたと き、カテブシン Εは mRNAレベルでもタンパク質レベルでも著しい増大を示し、その 多くを活性型酵素として細胞外へ分泌することから、これらの細胞機能との密接な関 係や細胞外での機能に注目が集まって 、る。

[0008] また、カテブシン Eは、若齢ラットの脳神経細胞にはほとんど検出されないが、老齢 ラットではリポフスチンや APP (アミロイド前駆体タンパク質)の C末端フラグメントを蓄 積した神経細胞中に明らかにその存在を確認することができる。また、前脳虚血ゃ力 ィニン酸を投与したラットの脳では、これらの刺激に対して脆弱な部位に存在する変 性を受けた神経細胞とこれらの刺激に呼応して、集積した活性化ミクログリアにカテ プシン Eの著しい発現増大が認められる。これらの結果は、カテブシン Eが-ユーロン 死の実行過程にぉ 、て重要な役割を果たして 、ることを示唆して 、る。

[0009] さらに、カテブシン Eは、免疫系細胞中に優先的に発現し、また活性ィ匕食細胞によ つて分泌されるプロテアーゼであることが知られている力 このタンパク質の生体内に おける生理学的機能については未だ不明な点が多い。本発明者の研究により、カテ プシン Eは、がん細胞表面力も腫瘍壊死因子 (TNF)関連アポトーシス誘導リガンド (T RAIL)を可溶性分子として切断遊離し、それによつて、種々のがん細胞を特異的にァ ポトーシスに誘導し、がんの成長阻止ならびに転移抑制を誘導すること、かかる現象 は正常細胞には一切起こさないという、他のカテブシン群には全く見られない新規の 抗がん作用を有していることが判明した。

[0010] アポトーシスは、免疫応答において形質転換細胞やウィルス感染細胞の生体外排 除に重要な役割を果たしており、腫瘍の退縮の主要な決定因子である。腫瘍細胞の アポトーシスの機構につ 、ては余り解明されて!、な!/、けれども、腫瘍細胞の増殖抑 制ならびにアポトーシス誘導は、がん患者の良好な予後を予測する上できわめて重 要である。これまで蓄積された証拠によると、腫瘍細胞のアポトーシスは、例えば、 TN F- a、 FasL(CD95Lまたは ApolLとも呼ばれる）、 TRAIL (または Apo2Lとも呼ばれる）な どの TNFファミリー分子によって制御されて 、ることが示唆されて 、る（参考文献 1)。 これらのサイト力インは、すべて II型膜貫通タンパク質であり、細胞表面上の固有のレ セプターと結合することによって、標的細胞にアポトーシスのシグナル伝達を誘導す ることができる。これらのファミリーメンバーは、アポトーシスを誘導するためにホモ三 量体を形成し、これが標的細胞表面に形成された固有のレセプターの三量体に結合 することによってアポトーシスが誘導される。し力しながら、これらのファミリーメンバー のうちで、 TRAILだけが、正常細胞には影響を及ぼすことなぐ種々のがん細胞のみ をアポトーシスに誘導することから、この TRAILの抗がん剤としての有用性に強い関 心が持たれている (参考文献 2, 3)。また、最近の研究で、腫瘍部位に浸潤する様々 なエフェクター細胞、例えば、顆粒球、マクロファージ、ナチュラルキラー細胞、 Bリン パ球、 Tリンパ球などは、腫瘍細胞に対する抗腫瘍免疫応答として必須の役割を担 つていることが示されている。これらの細胞のうち、マクロファージは、いくつかの機構 によって、例えば、食細胞による腫瘍細胞の殺滅、抗原のプロセシングや T4リンパ球 への提示、 TNF-a、 IL-1、 IL-6、 IL-8等の非特異的宿主防御において重要な役割を もつ種々のサイト力インの分泌増加などによって、がんに対する宿主防御機構におい て最も重要な役割を果たしていると考えられている（参考文献 4, 5, 6)。したがって、 腫瘍に対する抗がん効果は、 TRAILを介するがん細胞特異的アポトーシス誘導機構 と腫瘍浸潤マクロファージによるがん細胞傷害機構の少なくとも 2つの機構によって 誘導されるものと考えられる。

[0011] これまでの多くの研究から、がんに関与するプロテアーゼの多く（例えば、リソソーム 性カテブシン B、 Lおよび D、 MMP-1や MMP-9などのマトリックスメタ口プロテアーゼな ど）は、腫瘍の増殖成長、侵入、あるいは転移に対して促進効果を有していること (参 考文献 7, 8)、これらのプロテアーゼ活性を阻害すると腫瘍の増殖が抑制されること（ 参考文献 7)、等々が明らかにされ、がんにおけるプロテアーゼは、生体にとっては悪 玉として働いていると考えられてきた。したがって、がんの増殖成長や転移を抑制す る機能をもつ善玉プロテアーゼにつ 、てはほとんど知られて 、な 、。

[0012] カテブシン Eは、前述したように、抗原提示細胞やリンパ球などの免疫系の細胞に 限定的に発現し (参考文献 9, 10, 11)、食細胞では FN-gや LPSなどによる活性ィ匕刺 激によって発現量が増大し、活性型分子として細胞外に多量に分泌される (参考文 献 12)。カテブシン Eは、他のカテブシン酵素と違って、細胞特異的な局在様式ゃプ ロセシング機構を有するなど、ユニークな性質を有している（参考文献 13)。しかしな がら、これらの所見とこのタンパク質の生理学的機能との関連性はあまり理解されて いない。最近、カテブシン Eは、 MHCクラス II分子による外因性抗原提示機構にお V、て、外因性抗原のプロセシングにお 、て重要な役割を果たして 、ることが示された (参考文献 10, 14, 15, 16)。さらに、カテブシン Eノックアウト（CatE— ^Λ )マウスは、無 菌条件下で飼育しても何の変化を起こさないが、通常の条件下で飼育したときにアト ピー性皮膚炎様皮膚症状を呈すること (参考文献 17)、また細菌感染に対する感受 性を増大すること (参考文献 18)が明らかにされている。さらに最近では、本発明者ら は、カテブシン Ε欠乏が主要なリソソ一ム膜糖タンパク質（例えば LAMP-1や LAMP-2 など）のリソソーム内蓄積を誘導し、その結果、マクロファージ内のリソソーム性 ρΗを 上昇させ、細胞の構造ならびに機能に障害を引き起こすことを明らかにした (参考文 献 18)。これらの知見に基づいて、本発明者らは、カテブシン Εが免疫応答に深く関 与し、生体恒常性の維持に強く貢献していることを明らかにしている。最近、様々なガ ンにおける遺伝子またはタンパク質の発現プロフアイリングの解析結果から、発ガン 機構におけるカテブシン Εの役割については文献上では不明である力 本酵素のが んにおけるノィォマーカーとしての有用性が示唆されている（参考文献 20, 21, 22)

[0013] し力しながら、これらのカテブシン力 扁平上皮がんなどの腫瘍マーカーとして使用 できることは報告されて 、るが（特許文献 4)。カテブシン Εそれ自体が杭がん作用を 有して 、ることも、また杭がん剤の感受性を増強すると 、う知見もこれまで一切報告 はなく知られて!/ヽなかった。

特許文献 1： WO01Z008698号公報

特許文献 2：特表 2003 - 530297号公報

特許文献 3：特開 2004 - 26811号公報

特許文献 4：特開 2005 - 117993号公報

発明の開示

発明が解決しょうとする課題

[0014] したがって、本発明者らは、カテブシン Εの特異的な作用を鋭意研究した結果、力 テプシン Ε自体が抗がん効果を示すと共に、抗がん剤と併用することによって、抗が ん剤の感受性を増強することができることを見出して、この発明を完成するに至った。

[0015] したがって、この発明は、その主な態様として、カテブシン Εおよび Ζまたはその活 性部位力 なるもしくはその活性部位を含む活性フラグメントを有効成分として含有 する杭がんカテブシン製剤を提供することを目的として!/ヽる。

[0016] また、この発明は、その別の態様として、上記有効成分に加えて、抗がん剤をさらに 含有していることにより、該抗がん剤の作用効果を増強することができる抗がんカテブ シン製剤を提供することを目的とする。

[0017] また、この発明は、カテブシン Eならびに Zもしくはその活性部位力もなるもしくはそ の活性部位を含む活性フラグメントと抗がん剤とを含有する抗がんカテブシン E製剤 を使用して、該抗がん剤の感受性を増強する抗がん剤の感受性増強方法を提供す ることを目的とする。

[0018] さらに、この発明は、上記杭がんカテブシン製剤を使用してがんの治療を実施する ことからなるがん治療方法を提供することを目的とする。

[0019] その上、この発明は、腫瘍壊死因子 (TNF)ファミリーメンバーにより形成されている ことからなる TNFホモ三量体を提供することを目的としている。

課題を解決するための手段

[0020] 上記目的を達成するために、この発明は、カテブシン Eおよび Zまたはその活性部 位力 なるもしくはその活性部位を含む活性フラグメントを有効成分として含有する抗 がんカテブシン製剤を提供する。

[0021] また、この発明は、上記有効成分に加えて、抗がん剤をさらに含有することにより、 該抗がん剤の作用効果を増強することができる抗がんカテブシン製剤を提供する。さ らに、この発明は、抗がん剤を含有する抗がんカテブシン製剤を使用して、抗がん剤 の感受性を増強する抗がん剤の感受性増強方法を提供する。

[0022] さらに、この発明は、上記杭がんカテブシン製剤を使用してがんの治療を実施する ことからなるがん治療方法を提供する。

さらにまた、この発明は、 TNF- a、 FasL(CD95Lまたは ApolL)、 TRAIL (または Apo

2L)などの腫瘍壊死因子 (TNF)ファミリーメンバーにより形成されて 、る TNFホモ三量 体を提供する。

[0023] なお、本明細書において、単に「抗がんカテブシン製剤」という用語を使用する場合 は、通常、説明を簡単にするために、カテブシン Eおよび Zまたはその活性部位から なるもしくはその活性部位を含む活性フラグメントを有効成分として含有する抗がん カテブシン製剤と、この有効成分の他に、抗がん剤を併用した抗がんカテブシン製剤 の両者を含む意味で使用するものとする。他方、どちらか一方の用語を使用して説 明をしている場合でも、文脈上矛盾がなければ、その用語はその一方についての説 明に限定されるものではなぐ他方にも同様に適用して説明していると理解すべきで ある。さら〖こ、抗がん剤を併用した抗がんカテブシン製剤の場合には、該抗がん剤が 同一製剤中に配合されて 、る抗がんカテブシン製剤と、該抗がん剤が同一製剤中に 配合されてなぐカテブシン Eおよび Zまたはその活性部位力もなるもしくはその活性 部位を含む活性フラグメントを有効成分として含有する抗がんカテブシン製剤と別々 に併用して使用される場合も包含して ヽる意味として使用されて ヽると理解すべきで ある。

図面の簡単な説明

[図 1]各種カテブシンのヒト前立腺がん ALVA-41細胞の生存に対する効果を示す 図。

[図 2]腫瘍細胞におけるカテブシン E誘導アポトーシスの特徴を示す図。

[図 3]ALVA- 41細胞におけるカテブシン E誘導アポトーシスの媒介としての TRAILの 同定についての説明図。

[図 4]各種ヒト前立腺がん細胞株に対するカテブシン E誘導アポトーシスへの感受性 についての説明図。

[図 5]カテブシン E注射のヌードマウスにおける ALVA-41細胞によって形成された腫 瘍成長に対する効果についての説明図。

[図 6-1]内在カテブシン Eレベルと、腫瘍中のマウス B 16メラノーマ細胞の成長低下な らびに転移との直接的関連性についての説明図。

[図 6-2]図 6— 1の続き

[図 7]マウスカテブシン Eトランスジーンのプラスミド構築のための模式図。

[図 8]マウスカテブシン Eを過剰発現させた HEK293細胞の細胞抽出液のィムノブロッ ト解析データを示す図。

[図 9]カテブシン Eを過剰発現させたトランスジエニックマウス (CatE + /+マウス）と対照 としての野生型 (Wt)マウスの各種臓器におけるカテブシン EmRNAの発現量を示す 図。

[図 10]カテブシン Eならびにエトポシドのヒト白血病細胞の生存に及ぼす影響を調べ た結果を示す説明図。

[図 11]カテブシン Eとエトポシドの同時投与の場合とエトポシド前処理の場合とのヒト 白血病細胞の生存に及ぼす影響を調べた結果を示す説明図。

[図 12]カテブシン Eとエトポシドとの併用投与とエトポシド単独投与によるヒト白血病細 胞 U937細胞の生存に対する効果を示す説明図。

発明を実施するための最良の形態

[0025] 以下の明細書においても、特定のがんやがん細胞などの特定の対象について説 明をするが、力かる説明は、この発明をかかる特定の対象に限定する意図でなされる ものでは一切なぐこの発明の内容を具体的に説明するために例示的に記載してい るものと理解されるべきである。つまり、下記の説明では、例えば、前立腺がんや前立 腺がん細胞について記載するが、前立腺がんや前立腺がん細胞以外についても同 様に適用できるものと理解されるべきである。

[0026] まず、各種カテブシン酵素のヒト前立腺がん ALVA-41細胞の細胞生存ならびにァ ポトーシスに対する効果について記載する。

ヒト前立腺がん細胞 ALVA- 41をカテブシン B、 D、 E、 Lとそれぞれ 20時間中性 pH でインビトロ培養して、各プロテアーゼのがん細胞に対する細胞毒性にっ 、て調べた 。カテブシン Bと Dとは濃度依存的に生存細胞の数を増加したが（図 1A)、このことは 、これらのカテブシンが腫瘍細胞の増進、侵入ならびに転移を促進するという以前の 結果と一致している（参考文献 7)。カテブシン Lはこれらの細胞に対して、低濃度（10 μ g/ml)では生存細胞数を増加するのに対して、高濃度 (50-100 g/ml)では生存 細胞数を減少させた。以前の知見で、プロカテブシン Lの過剰発現と分泌はヒトメラノ 一マ細胞の腫瘍発生を増加することが報告されているが（参考文献 24, 25)、アンチ センス cDNAによる内在性カテブシン Lの欠損はダリオ一マ細胞、メラノーマ細胞、ォ ステオザルコーマ細胞の悪性形質を抑制している（参考文献 25, 26)。このことはこ のタンパク質が腫瘍成長と転移に関与して 、ることを示唆して 、る。これらに対して、 カテブシン Eは生存細胞数を用量依存的に減少させた。形態学的には、カテブシン Bまたは Dで処理した細胞は成長相にある細胞形態を示しているのに対し、カテブシ ン Eで処理した細胞は、細胞膜の嚢胞化、細胞質の縮小、アポトーシス小体の形成 など、アポトーシスの形態学的特徴を示した（図 1B)。カテブシン UlOO /z g/ml)で処 理した細胞は、細胞や核の膨化ゃ崩壊など、ネクローシス様の形態学的変化が認め られた。さらに、カテブシン Eとカテブシン Lによって誘導される細胞死パターンの違 いを確認するために、ァネキシン V染色（アポトーシスの初期過程を検出）と TUNEL アツセィ（アポトーシスの後期過程を検出）によってかかるプロテアーゼで処理した細 胞を分析した。その結果、カテブシン E (50 g/ml)で処理した細胞はァネキシン Vと TUNEL試薬による染色に対して陽性であつたのに対して、カテブシン UlOO /z g/ml) で処理した細胞は両者による染色には陰性であった（図 1C)。これらの結果から、力 テプシン Eは ALVA-41細胞に対してアポトーシスを誘導するのに対して、カテブシン Lはネクローシスによる細胞死を誘導していることが判明した。カテブシン Eによるが ん細胞の細胞死がアポトーシスであるということは、カスパース 3、 6、 7のインヒビター である DEVD-foilkや、カスパース 1、 3、 4、 7のインヒビターである z-VAD-foilkによつ て阻害されることからも確認された。

カテブシン Eのがん細胞に対する細胞毒性は、ァスパラギン酸プロテアーゼインヒビ ターであるぺプスタチン Aを ALVA-41細胞の培地に添加することによって阻止された (図 1C)。さらに、活性部位の 2個のァスパラギン酸残基をァラニンで置換した不活性 カテブシン E変異体（D98A/D283A)は、ヒト胚性腎 (HEK)293T細胞の生存に対して 効果を示さなカゝつたのに対して、対応する野生型組換えタンパク質は、天然のカテブ シン Eと同様に、 HEK293T細胞（図 2B)や ALVA-41細胞に対して濃度依存的にアポ トーシスを誘導した。これらの結果は、カテブシン Eによるアポトーシス誘導能がその 触媒活性に完全に依存していることを示している。次に、カテブシン Eによるアポト— シス誘導ががん細胞に対する直接的または間接的作用によるものかどうかを調べた めに、カテブシン Eで処理した ALVA-41細胞の培養上清を、新たに調製した ALVA- 41細胞の培地にぺプスタチン Aの存在もしくは非存在下で添カ卩した。その結果、がん 細胞は、ぺプスタチン Aの存在または非存在にかかわらず、添加したカテブシン E処 理培養上清によって用量依存的にアポトーシスに誘導された（図 2C)。このことは、力 テプシン E誘導性アポトーシスがカテブシン Eのプロテアーゼ作用によって腫瘍細胞 表面力 放出された何らかの分子によって誘導されて 、ることを示して 、る。このこと をさらに検証するために、カテブシン E処理細胞培養上清を DEAE— Sephacelクロマト グラフィ一で分画した。その結果、カテブシン E活性の 80%以上が 0.3M NaClで溶出 した分画中に検出された (参考文献 27. 28)が、ほとんどのアポトーシス誘導活性は 、カテブシン E活性がほとんど検出できな力つた 0.1M NaClで溶出した分画に検出さ れた。

次に、カテブシン E媒介腫瘍細胞のアポトーシスに関与する媒体としての TRAILの 同定について記載する。

前述したように、腫瘍細胞のアポトーシスにっ 、ての機構はあまり理解されて ヽな ヽ けれども、最近の研究で、腫瘍細胞のアポトーシスは TNFファミリーメンバー、例えば TNF— a、 FasL、 TRAILなどのリガンドタイプのサイト力イン分子によって制御されて いることが示唆されている（参考文献 1)。そこで、カテブシン E処理により ALVA-41細 胞カも遊離した TNFファミリーメンバーを、各リガンドに対する特異的な抗体を用いた ELISAアツセィによって検定した。カテブシン E処理した細胞培養上清中には、 TNF- aと FasLはほとんど検出されないのに対して、 TRAILは明らかに遊離していることが 判明した（図 3C)。 TRAILは、他の TNFファミリーメンバー同様に、その細胞外カルボ キシル末端領域が三量ィ匕することによって、標的細胞表面上にあるレセプターに結 合し、アポト一シスシグナルを伝えることができることが知られている（参考文献 29— 3 2)。そこで、抗 TRAIL抗体を用いたィムノブロット解析によって、カテブシン E処理 AL VA-41細胞培養上清中に含まれる可溶性 TRAIL分子の分子型を解析した。その結 果、 63kDaと 65kDaの 2本の強い免疫反応性バンドと、 48kDaに相当するマイナーなバ ンドがカテブシン E処理細胞の培養上清中に検出された（図 3B)。カテブシン E処理 前の細胞抽出液中には、分子量 17、 24、 30ならびに 48kDaの免疫反応性バンドが検 出され、カテブシン E処理後の細胞抽出液中には、 17kDaと 24kDaの免疫反応性バン ドが消失して 、た。 TRAILのアミノ酸配列に基づ 、て計算された TRAILの細胞外部分 の分子量は 21kDaであることから（参考文献 33)、カテブシン E処理細胞の培地中に 検出された 63 kDaと 65kDaのタンパク質ならびに 48kDaのタンパク質は、それぞれ可 溶性 TRAILの三量体ならびに-量体に相当すると考えられる。また、 ELISAによるデ ータと一致して、カテブシン Eで処理した ALVA-41細胞の培養上清中には、 TNF- α も FasLの可溶性三量体は産生されて 、な 、ことが確認された。

[0029] さらに、この可溶性 TRAIL力 カテブシン E処理 ALVA-41細胞培養上清のもつアポ トーシス誘導活性をどの程度担って 、るかを調べるために、 DEAE— Sephacelクロマト グラフィ一によつて得られた同培養上清の O.lMNaCl分画のアポトーシス誘導能が抗 TRAIL抗体によってどの程度消失するかを調べた。その結果、この分画のアポトーシ ス誘導効果は抗 TRAIL抗体処理によってほとんど失われることがわ力つた（図 3C)。 このことから、カテブシン Eによって仲介される腫瘍細胞アポトーシス活性はその細胞 表面力も放出された TRAIL三量体に依存していることが明ら力となった。

[0030] つぎに、種々のヒト前立腺がん細胞株のカテブシン E媒介 TRAIL依存アポトーシス に対する感受性にっ 、て説明する。

カテブシン Eによる TRAIL依存性アポトーシスに対する感受性について、種々のヒト 前立腺がん細胞株を用いて調べた結果、カテブシン Eは正常なヒト前立腺上皮（PrE )細胞の生存ならびに形態に対してほとんど影響しな力つた力 がん細胞に対しては 、程度の差はあるものの、すべてに対してアポトーシスを誘導した（図 4A)。カテブシ ン E誘導性アポトーシスに対する感受性は次のような順序で増加した： PPC-1 < DU1 45< =ALVA-101 <ALVA-41 < PC- 3。このうち、 PC-3細胞の生存に対するカテブ シン Eの効果は PPC-1細胞の生存に対する効果の約 20倍であった。

[0031] TRAILは、作用する種々の明確なレセプターによってアポトーシスを促進または阻 害することが示されている（参考文献 29)。ヒトでは、 TRAILに対する少なくとも 5種類 のレセプターが同定されている。そのうち、 TRAIL— R1(DR4)と TRAIL— R2(DR5)はァ ポトーシスシグナルを伝達できるデス (死）レセプターである（参考文献 29)。残りの 3 種類のレセプターである TRAIL— R3(DcRl)と TRAIL— R4(DcR2)ならびに可溶性レセ プターであるォステオプロテグリン（OPG)は、過剰発現したときに TRAIL誘導アポトー シスを阻害するデコイ（decoy)レセプターとして同定されて!、る（参考文献 29)。 TRAI L誘導アポトーシスに対する細胞の感受性がデスレセプターとデコイレセプターの相 対的発現レベルに依存している可能性があることから、種々のヒト前立腺がん細胞株 ならびに PrE細胞における TRAILとこれらのレセプターの細胞表面発現量を細胞表 面ピオチンィ匕法、ならびにそれぞれに対応する特異抗体を用いたィムノブロット解析 によって解析した。全ての前立腺がん細胞株と PrE細胞は、 TRAILば力りでなぐ膜レ セプター（2種類のデスレセプター DR4と DR5、ならびに 2種類のデコイレセプター Dc R1と DcR2)も同様な発現量を示した。したがって、 TRAILならびに膜レセプターの発 現は、カテブシン Eによる TRAIL依存性アポトーシスに対するがん細胞間の感受性の 差異には直接関係がないことが明らかとなった（図 4B)。他方、デスドメインを持たず 、破骨細胞形成阻害を示す可溶性デコイレセプター OPG (参考文献 34、 35)の量は 、 PrE細胞ならびに PPC-1細胞の培養上清中で、被験した他の細胞株のそれに比べ て著しく増加した。がん細胞由来 OPGがホルモン耐性前立腺がん細胞に対する重要 な生存因子であり、内在性 OPGレベルと TRAILによる前立腺がん細胞のアポトーシス 誘導能と間に負の相関があることを考慮すると、 PrE細胞ならびに PPC-1細胞では、 OPG発現量の増加がこれらの細胞にカテブシン Eによる TRAIL依存性アポトーシスに 対して抵抗性を付与して ヽるものと考えられる。カテブシン E処理によって放出される 可溶性 TRAIL三量体の量もまた、がん細胞株によって異なっており（図 4C)、 PrE< P C-3< PPC-1 <ALVA-101 < =DU145<ALVA- 41細胞の順で増大する。種々の前 立腺がん細胞株での TRAILの発現量に有意な差異が認められないことから、可溶性 TRAILの産生量の違!、は、カテブシン Eによるがん細胞表面での TRAIL切断効率の 相違〖こよるものと考えることができる。したがって、 OPGの発現量増大もしくは細胞表 面でのカテブシン Eによる TRAIL切断効率の低下、またはその両方で、前立腺がん 細胞株におけるカテブシン E誘導性アポトーシスに対する感受性の低さを部分的に 説明することできる。しかしながら、カテブシン E誘導性アポトーシスに対する PC-3細 胞のより高い感受性は、これら 2つの機構のいずれでも説明することはできず、このプ ロセスに対する感受性の別の決定因子の存在、例えば FLIP、 IAP類、 Be卜 xL、 Be卜 2 などの抗アポトーシスタンパク質の発現量の相違などといった機構の存在を示唆して いる。

次に、カテブシン E投与によるヒト前立腺がん細胞を持つヌードマウスにおける腫瘍 成長および転移の抑制について説明する。

がん細胞の培養系で観察されたカテブシン Eの抗がん活性が、ヒト前立腺がん細胞 を皮下移植したヌードマウスを用いたインビボ研究によっても検証できるかどうかを調 ベた。ヌードマウスの皮下に ALVA-41細胞を移植し、腫瘍の容積が約 100mm³になつ たときに、形成した腫瘍の中心部に精製カテブシン E (200 g/kg)を毎日 1回の割合 で 16日間注射した。対照として、カテブシン Eの代わりに生理食塩水を注射した。生 理食塩水を投与した腫瘍は、最初は比較的ゆっくりと成長した後、指数関数的に増 大した（図 5A)。一方、カテブシン Eで処理した腫瘍の成長は、対照群に比べて著し く抑制された。カテブシン Eの腫瘍退縮効果は、投与量に依存しており、 1日当たりの 用量が 200 g/kgで著明であり、 50 g/kgではその効果は減少し、 30 g/kgもしくは それ以下では腫瘍抑制効果はほとんど見られな力つた。腫瘍容積がほぼ 400 mm³ に達した時点でカテブシン Eを 400 g/kgの濃度で 1日 1回投与した。 10日間投与し た後、腫瘍を摘出しその重量を測定したところ、カテブシン E投与群では、対照群に 比べて、腫瘍重量は有意に低かった（図 5B)。それぞれの群の腫瘍を TUNEL染色し てアポトーシスを起こしたがん細胞の数を比べたところ、カテブシン E処理群では、多 数のアポトーシス細胞が観察されるのに対し、対照群ではアポトーシス細胞はほとん ど検出されな力つた（図 5C)。このことは、外部力も投与したカテブシン Eがインビボの 個体レベルにおいても、がん細胞をアポトーシスに誘導できることを示している。カテ プシン Eによるがん細胞の TRAIL依存性アポトーシスは、投与回数を増やしたり、投 与量を増やすことによって増強することができることから、カテブシン E投与方法を改 良することで腫瘍の退縮により大きな効果を期待することができる。また、カテブシン E投与による正常組織や細胞に対する毒性効果は何ら認められな力つた。

以下に内在性カテブシン E発現レベルと腫瘍成長抑制効果との関係について説明 する。

リンパ球、ナチュラルキラー細胞、単球、榭状細胞などの腫瘍浸潤エフェクター細 胞は、腫瘍進行または転移の TRAIL依存性抑制に重要な役割を果たして ヽることが 知られている（参考文献 36、 39)。カテブシン Eがリンパ球、マクロファージ、榭状細 胞、ミクログリアなどの免疫系細胞に優先的に発現することから（参考文献 9. 10、 40 )、これらの細胞中のカテブシン Eは腫瘍細胞に対する生体防御機構に寄与している と考えられる。したがって、この発明において、異なるカテブシン E発現レベルを示す 3タイプの同系マウス（CatE— ^Λマウス、カテブシン Εを過剰発現して!/、るトランスジェ- ックマウス (CatE^Tg)ならびにそれらの野生型同腹子マウス (Wt)を用いて、カテブシン Eの腫瘍成長、転移ならびに個体死へのカテブシン E発現量の影響を評価した。各 遺伝子型のマウスに同系由来のマウスメラノーマ B16細胞を皮下に注射し、得られた 腫瘍の大きさを 21日目まで観察した。各動物群における腫瘍の成長は 8日目までは 比較的緩やかであった力 その後徐々に増加した。接種後 10日から 15日間は、 Cat E_^/_マウスにおける腫瘍成長は、 CatE^Tgマウスと Wtマウスにおける腫瘍成長に比べて 有意に高力つたけれども、接種後 19日を経過すると、 CatE— ^/_マウスと Wtマウスとの間 の有意差は見られなくなった（図 6A)。しかし、 CatE^Tgマウスにおける腫瘍成長は全実 験期間にわたって、他の 2つの同系マウス群よりも有意に強く抑制された。 21日間の 接種最終日での CatE^Tgマウスにおける腫瘍重量は、 CatE— ^Λマウスと Wtマウスに比べ て、それぞれ 3分の 1と 5分の 1であった。また、 B16メラノーマ細胞を接種したマウスの 死亡率を 56日間で比較すると、 CatE— ^/_マウスの死亡率は最も高ぐついで Wtマウス 、 CatE^Tgはもつとも死亡率が低かった（CatE— ^/_マウスの生存率が 20%であるのに対し て、野生種の生存率は 60%、また CatE^Tgマウスの生存率は 80%) (図 6B)。これらの 結果は、腫瘍増殖とカテブシン E発現量の間には逆の相関があることを示している。

CatE^Tgマウスの死亡率低下が腫瘍細胞のアポトーシスの亢進と排除によるものであ るかどうかを調べるために、各遺伝子型のマウスにおける腫瘍のアポトーシス細胞の 発現度合いを比較した。接種後 23日目に各動物群カゝら採取した腫瘍を TUNELアツ セィしたところ、 CatE^Tgマウスにおいてアポトーシス細胞が著しく増加していることが分 かった。これに対して、 CatE— ^Λマウスと Wtマウスでは、同時点でのアポトーシス細胞は わずかであった（図 6C)。ここで注目すべきことは、用いたメラノーマ B16細胞は TRAI L依存性アポトーシスに抵抗性であることである（参考文献 39. 42)。したがって、 Ca tE^Tgマウスで観察されたがん細胞のアポトーシスは、 TRAILを介する機構とは別の機 構によって誘導されていると考えられた。形態学的観察から、メラノーマ B16細胞を接 種したすべてのマウス群の腫瘍部位には、多数のリンパ球やマクロファージなどのェ フエクタ一細胞が浸潤していた。しかしながら、 F4/80抗原ならびに MHCクラス II分子 に対する抗体を用いた免疫染色の結果、マクロファージの数と活性ィヒ度合いは、 Cat E^Tgマウスの腫瘍においてもっとも高ぐついで Wtマウスで高ぐ CatE— ^/_マウスの腫瘍 ではいずれもきわめて低いことが分力つた（図 6D)。これらのデータは、がん患者から の胸膜滲出液中のマクロファージ数と悪性度の間に逆比例の関連性があるとする以 前の結果と一致している（参考文献 43、 44)。マクロファージゃリンパ球は、 TRAIL依 存性アポトーシス誘導効果のほかに、活性酸素種や反応性窒素中間体、ならびに IF N— a、 IFN— y、 IL-1、 IL- 12などのエフェクター分子の産生を介して細胞障害性を 発揮することが知られている (参考文献 45)。さらに、活性ィ匕マクロファージは、抗体 依存性および非依存性機構を介して腫瘍細胞を効果的に障害することも分かってき ている（参考文献 46. 47)。したがって、 CatE^Tgマウスにおける TRAIL抵抗性 B16細胞 のアポトーシスと同時に発生する腫瘍成長抑制ならびにこれらの動物の死亡率低下 は、腫瘍浸潤エフェクター細胞、なかでも活性ィ匕マクロファージによる細胞毒性によ つて発現していると思われる。

[0035] さらに、死亡細胞数とそれらを含む腫瘍部周囲の壊死領域は、 CatE^Tgマウス < Wt マウスく CatE— ^/_マウスの順で著明に増大している（図 6E)。これは、壊死領域におけ る血管分布と反比例しており、循環系による死細胞の排除と炎症性細胞の腫瘍部位 への浸潤が、 CatE^Tgマウスでもっとも高ぐついで Wtマウス、 CatE— 'マウスではもつと も低いことを示している。さらに、腫瘍中心部ならびにその近辺に見られる血管内皮 細胞の構造は、 CatE^Tgマウスと Wtマウスに比べて、 CatE— マウスにおいて著しく損な われていた（図 6Eの下段パネル）。このような CatE— ^/_マウスの血管系の不全は、赤血 球などの血管内容物の血管外漏出を促進すると考えられる。また、腫瘍浸潤マクロフ ァージが無血管領域内に新たな血管を誘導したり、一旦形成された血管系のリモデリ ングに重要な役割を果たしていることを考えると、この発明によるデータは、カテブシ ン Eが腫瘍浸潤マクロファージの活性ィ匕を通じて、腫瘍部位における血管系をコント ロールして 、ることを示唆して 、る。

[0036] さらに、内在性カテブシン E発現レベルはがん細胞の転移度に影響を及ぼしている ことが判明した。メラノーマ B16細胞を各遺伝子型のマウス群に静脈注射をして、肺へ の転移したがん細胞のコロニーの数を 22日後に測定した結果、 CatE— ^/_マウスにおけ る力かるコロニーの数は、 Wtマウスと CatE^Tgマウスに比べてそれぞれ約 2倍と 8倍であ つた（図 6F)。このことはカテブシン E欠損ががん細胞の肺転移を促進したことを示し ている。したがって、これらのデータは、内在性カテブシン Eががん細胞の転移を抑 制して!/、ることを示唆して 、る。

[0037] ここで TRAILについて簡単に説明すると、 TRAILの細胞外 COOH末端部分は、他 の TNFファミリーと同様に、細胞表面から切断遊離される。このようにして遊離された 可溶性 TRAILは、ホモ三量体を形成して、種々のがん細胞をアポトーシスに誘導す る（参考文献 2, 3)。しかし、可溶性 TRAILによるアポトーシスは正常細胞ではほとん ど起こらない。 TRAILのこの注目すべき性質は、ヒトのがん治療における新たな治療 剤としての有用性を示唆している。事実、組換え型可溶性 TRAILや TRAIL受容体に 対するァゴニスト (作用型抗体を含む）は、新たな抗癌剤として米国では第 1相臨床 試験が行われている。したがって、種々の細胞株の細胞表面から可溶性 TRAILの発 生に関与するプロテアーゼを特定することは極めて重要である。今日では、 TNF- a と FasLが、可溶形の TNF— α変換酵素（TACE) (参考文献 47, 48) ^ΜΜΡ~ 7 ( 考文献 49, 50, 51)によってそれぞれ放出されることは示されている。しかしながら、 TRAIL切断に関与するタンパク質分解酵素を特定するには至って 、な 、。これまで の知見では、全長組換 TRAILを発現して!/、る S19細胞の TRAILの細胞表面での発現 は、ロイぺプチンや E— 64などのシスティンプロテアーゼインヒビターによって増強さ れるが、メタ口プロテアーゼによっては増強されないこと、また、その細胞抽出液から の 20kDaの可溶性 TRAILの遊離は力かるシスティンプロテアーゼインヒビターによつ て阻止されることから、細胞システィンプロテアーゼカ STRAIL放出に関与している可 能性が示唆されている (参考文献 52)。しかしながら、インビト口での実験条件で得ら れたこれらの知見が、実際に生体内で可溶性 TRAILの産生を行う生理学的なタンパ ク質分解事象を表しているかどうか不明である。

[0038] この発明において、本発明者らは、カテブシン E力 ヒト前立腺がん細胞の表面で T RAILを切断した後、可溶性三量体分子の生成し、正常な PrE細胞に対しては一切影 響を及ぼすことなぐがん細胞にのみアポトーシスを誘導する責任酵素であることを 初めて明らかにした。カテブシン Eは全てのヒト前立腺がん細胞から可溶性 TRAILを 遊離するけれども、アポトーシスの誘導効率にはがん細胞株間で差異が認められた 。 PPC-1や DU145などのいくつかの細胞株は、正常な PrE細胞と同様に、カテブシン E誘導性アポトーシスに比較的抵抗性があるのに対して、 PC-3や ALVA-41などのそ の他の細胞株は高い感受性を示した。細胞表面での TRAIL、 DR4、 DR5、 DcRlまた は DcR2の発現レベルはこれらの細胞株の間では実質的には差がないことから、これ らの分子の発現量の相違はカテブシン E誘導性アポトーシスにおけるがん細胞間の 感受性の差違には関係していないことを示唆している。むしろ、可溶性デコイレセプ ター OPG産生の増加は、 PrE細胞や PPC-1細胞に対してカテブシン E誘導性アポト 一シスに対する抵抗性を付与している一因といえる。さら〖こ、 ALVA-41細胞のカテブ シン Eに対する高い感受性は、これらの細胞表面力 放出される可溶性 TRAILの量 が比較的多いこと力も説明できる。しかしながら、 PC-3細胞のカテブシン Eに対する 高感受性は、 OPGや可溶性 TRAILの量のみでは説明できず、抗アポトーシスタンパ ク質、例えば FLIP、 IAP類、 Be卜 X、 Be卜 2などの発現が PC-3細胞では他の細胞株に し

比べて少ないことからなど、他の要因があると思われる。

また、インビトロで観察されたカテブシン Eによる腫瘍細胞における成長阻止とアポ トーシスの誘導実験の結果は、ヒトがん細胞を移植したマウスを用いた個体レベルの 研究結果とよく一致していることが判明した。ヒト前立腺がん細胞を移植したヌードマ ウスにカテブシン Eを毎日投与すると、正常組織や細胞には組織学的な影響をまつ たく及ぼすことなぐ腫瘍細胞の成長阻止とアポトーシスが誘導された。これらの結果 は、腫瘍細胞を接種したマウスの生存を著しく延命した知見と一致している。大部分 の腫瘍細胞のアポトーシスはカテブシン E投与の最終日に観察されていることから、 カテブシン Eをより頻繁に投与する力、またはカテブシン Eの投与量を多くすることで 、腫瘍の退縮をより短期間に効果的に誘導することができるものと考えられる。また、 活性化 T細胞 (参考文献 39、 53)、 B細胞 (参考文献 54)、ナチュラルキラー細胞 (参 考文献 55)、榭状細胞 (参考文献 39)、単球 (参考文献 37)などの腫瘍エフェクター 細胞が TRAILを産生することを考えると、活性ィ匕食細胞力 分泌されたカテブシン E が、腫瘍細胞ばかりではなぐこれらの免疫系細胞力 も可溶性 TRAILを産生するこ とで腫瘍細胞のアポトーシスや腫瘍の退縮を誘導することができるものと推定される。

[0040] また、カテブシン Eは TRAILとは独立した機構を介して腫瘍殺傷活性を発揮するこ とも判明した。非常に多くの腫瘍細胞は TRAIL依存性アポトーシスに感受性があるけ れども、ある種の腫瘍細胞株は TRAIL依存性アポトーシスに対してむしろ抵抗性を有 して 、る。マウス B16メラノーマ細胞は TRAIL依存性アポトーシスに対して抵抗性を有 している（参考文献 38, 41)。本発明で得られた知見では、 B16メラノーマ細胞を皮下 移植した CatE^Tgマウスでは、腫瘍浸潤エフェクター細胞、特に活性ィ匕マクロファージ が数においても活性化度においても、同系の CatE— ^/_マウスや Wtマウスのそれらと比 ベて顕著であった。腫瘍部位に浸潤する活性ィ匕マクロファージは、がん細胞と直接 接触したり、サイト力インなどの液性因子を介して間接的に相互作用して、がん細胞 を攻撃排除する能力を有して 、ることを考慮すると (参考文献 36)、腫瘍浸潤性活性 化マクロファージ力 他の免疫系細胞とともに、 TRAIL依存性アポトーシス機構とは別 の機構で腫瘍細胞をアポトーシスに誘導することができるものと考えられる。この点に 関して、腫瘍浸潤性活性ィ匕マクロファージの存在の程度とがん患者の良好な予後と が密接に関連していると報告されている（参考文献 36)。マクロファージの IFN— γや LPSによる活性化は、カテブシン Εの mRNAとタンパク質レベルでの発現増大ならび にカテブシン E分泌の増加をもたらすことが示されている（参考文献 12)。他方、カテ プシン E欠乏はマクロファージの機能不全をもたらすことが示されている（参考文献 1 9)。これらの知見は、カテブシン Eが活性ィ匕マクロファージの機能に密接に関係して いることを示している。したがって、 B16メラノーマ細胞を移植した CatE— ^/_マウスの皮下 腫瘍では、浸潤性マクロファージの数においても、また、これらの細胞の活性状態 (M HCクラス II分子の発現によって反映されるような）においても、 CatE^Tgマウスや Wtマウ スに比べて、明らかに低下しているというこの所見は、マクロファージにおけるカテブ シン Eの発現レベルが腫瘍成長の抑制と個体死の抑制に強く関係していることを示し ている。したがって、カテブシン Eは、腫瘍浸潤性活性ィ匕マクロファージのもつ細胞障 害活性を介して B16メラノーマ細胞の増殖成長を抑制していると考えられる。

[0041] ここで注目すべきことは、腫瘍中の腫瘍浸潤性マクロファージには、 2つの相対する 競合する作用、つまり、腫瘍退縮と腫瘍促進の結果があることである。例えば、低濃 度の腫瘍性浸潤マクロファージは細胞融解効果を有するのに対して、高濃度の腫瘍 性浸潤マクロファージは腫瘍成長促進効果を有する（参考文献 56, 57)。マクロファ ージの多岐に亘る機能 (例えば、亢進した貪食能、 Tリンパ球や好中球の誘引と活性 ィ匕、 自然免疫や獲得免疫の活性ィ匕など)を通じての有用な抗がん効果 (参考文献 58 )に対して、マクロファージはいくつかの機構 (例えば、腫瘍細胞の移動や侵入の促 進、細胞外マトリックスの分解や改変の亢進、血管新生の促進など）を通じて腫瘍の 成長と転移を促進すると考えられる (参考文献 59)。これらの競合する機能は、マクロ ファージが産生する多種のサイト力インと活性酸素種の質的量的な多様性力 生じ ていると考えられる。この発明において、本発明者らは、 CatE^Tgマウス力 同系の Cat E ^/_マウスや Wtマウスに比べて、マウス B16メラノーマ細胞の皮下成長と肺転移を著 明に抑制し、死亡率を減少していること、 CatE^Tgマウスの腫瘍ではアポトーシス性壊 死の明白な領域があることを初めて明らかにした。このように、内因性カテブシン Eの 発現レベルが B16メラノーマ細胞のがんの成長阻止や転移抑制、ならびに腫瘍浸潤 性マクロファージの増加や活性化と正の相関をしていることは、カテブシン Eがマクロ ファージの細胞毒性、アポトーシス誘導能、ならびに腫瘍微小血管系の変性を介し て腫瘍細胞を排除できることを示唆している。したがって、カテブシン Eは少なくとも 2 つの異なる機構、つまり TRAIL依存性アポトーシス機構ならびに腫瘍浸潤性マクロフ ァージ誘導性細胞毒性機構によってがん細胞を破壊すると考えられる。カテブシン B 、 L、 Dや MMP類などの多くのプロテアーゼのタンパク質分解活性は、腫瘍成長の促 進に良好な微小環境をつくるが、腫瘍成長阻止や転移阻害を誘導するようなプロテ ァーゼについてはほとんど知られていない。この点で、カテブシン Eは抗がん作用を もつ有用なプロテアーゼの 1例を示すものである。

ほとんど全ての抗がん剤が克服できて ヽな 、共通の課題はそれらの激 、副作用 である。したがって、抗がん剤探索の有効な戦略は、正常細胞に対しては一切細胞 毒性を発揮することなぐ標的の腫瘍細胞だけをアポトーシスに誘導することを目標と することである。これまでの知見では、カテブシン Eまたは内在性カテブシン Eの発現 を増加できる薬剤の投与が抗がん療法にとって有望な治療戦略となりうることを示唆 している。したがって、カテブシン Eを基本とした杭がん療法は、カテブシン Eを単独 で投与または他の療法と併用して、ヒトがんの処置を現場で行うことができることであ る。

[0043] したがって、この発明は、その主な態様として、抗がんカテブシン製剤を提供するこ とである。この杭がんカテブシン製剤は、カテブシン Eおよび Zまたはその活性部位 力 なるもしくはその活性部位を含む活性フラグメントを有効成分として含有するカテ プシン製剤と、上記有効成分に加えて、抗がん剤を有効成分としてさらに包含する力 テプシン製剤とからなつている。また、後者のカテブシン製剤は、上記したように、上 記成分と抗がん剤が同一製剤中に配合されている形態の製剤と、上記成分と抗がん 剤がそれぞれ別個に配合されていて併用して投与する形態の製剤とを含むものとか らなっている。

[0044] この発明に係る杭がんカテブシン製剤は、カテブシン Eおよび Zまたはその活性部 位力 なるもしくはその活性部位を含む活性フラグメントを有効成分として含有するこ とを特徴としている。

この発明のカテブシン Eは、配列表の配列番号 1に示す塩基配列およびアミノ酸配 列を有している。またこの発明に係るカテブシン Eのその活性部位は、 98番目と 283 番目のァスパラギン酸を含む領域である。この発明において、カテブシン Eの活性部 位力もなる活性フラグメントとは、 98番目と 283番目のァスパラギン酸を含む領域から なる活性フラグメントを意味している。また、カテブシン Eの活性部位を含む活性フラ グメントとは、 98番目と 283番目のァスパラギン酸を含む領域を部分として含む領域 力 なる活性フラグメントを意味して 、る。

[0045] なお、本明細書にぉ 、て「カテブシン E」と単に記載した場合でも、用語「カテブシン EJは、文脈力 明らかに別の意味に解釈される場合や特段の定めがある場合を除 V、て、上記活性フラグメントをも包含した意味で使用して 、ると理解すべきである。

[0046] この発明において、カテブシン Eは、特にその表面に TRAILを有する非常に多くの 種類の腫瘍細胞に対して、その TRAILを活性ィ匕させて、腫瘍細胞の成長ならびに転 移を阻止すると共に、アポトーシスを誘導する作用を有している。しかも、驚いたこと には、カテブシン Eは、腫瘍細胞以外の正常細胞に対してはまったく影響を及ぼすこ となぐ腫瘍細胞だけを攻撃することが分力つた。したがって、カテブシン Eを有効成 分とするこの発明のカテブシン製剤は、極めて有効な抗がん剤として期待することが できる。

[0047] 上記に説明したように、非常に多くの種類の腫瘍細胞力TRAIL誘導アポトーシスに 感受性があるけれども、さらに、カテブシン Eはまた TRAILを介するアポトーシス機構 とは独立した機構を介して腫瘍阻止活性を発揮することも可能である。つまり、この発 明のカテブシン Eは、 TRAIL依存性アポトーシスに対してむしろ抵抗性を有して 、る 腫瘍細胞株、例えば B16メラノーマ細胞などの細胞に対しても、腫瘍阻止活性を発揮 することができる。

[0048] この発明に係る杭がんカテブシン製剤は、他の杭がん剤と併用する、 V、わゆる併用 療法に使用することができる。力かる併用療法に使用できる杭がん剤としては、カテ プシン Eと併用した場合にその効果が増強または補完されるものまたはカテブシン E の作用を増強または補完するものであれば、いずれも使用することができ、抗がん剤 の適用範囲も特に限定されるものではない。また、この発明の抗がんカテブシン製剤 を他の杭がん剤と併用投与する場合、杭がん剤を単独で投与する場合よりも少な!ヽ 用量で治療効果を達成することが期待できる。したがって、併用投与する抗がん剤の 毒性による副作用を回避または最小限に押さえることができると期待される。

[0049] なお、本明細書において、単に「抗がんカテブシン製剤」という用語を使用する場合 でも、文脈力 別の意味に解釈すべき場合または特段の定めがない場合を除いて、 カテブシン Eを単独で使用する抗がんカテブシン製剤ばカゝりではなぐ他の杭がん剤 と併用して投与する抗がんカテブシン製剤をも意味して使用されていると理解すべき である。

[0050] また、この発明における併用療法には、同一製剤中にカテブシン Eと抗がん剤とが 同時に有効成分として含まれている場合の他に、抗がん剤とカテブシン Eとを別々に 投与し、相互にその作用を補完または増強する場合もまたこの発明の範囲に包含さ れるちのと理解さるべさである。

[0051] 本発明の抗がんカテブシン製剤と併用できる杭がん剤としては、例えば、アルキル ィ匕剤、代謝拮抗剤、抗生物質、微小管阻害剤などの細胞障害性杭がん剤または分 子標的治療薬などが挙げられる。 抗がん剤のうち、アルキル化剤としては、例えば、シクロフォスフアミド、ィフォスフアミ ド、メルファラン、メクロルエタミン、クロラムブシル等の-トロジェンマスタード類、ブス ルファン、ィムプロスルファントシレート等のスルホン酸アルキル類、チォテパ等のェ チレンイミン類、へキサメチルメラミン等のメチルメラミン類、力ノレムスチン、セムスチン 、二ムスチン、ラ-ムスチン、口ムスチン、ストレプトゾシン等の-トロウレァ類、ダカル バシン等のトリァゼン類などが挙げられる。

[0052] 代謝拮抗剤としては、例えば、メトトレキサート等の葉酸類似化合物、 5—フルォロウ ラシル（5— FU)、テガフール、 UFT、ドキシフルリジン（5'— DFUR)、カルモフール 、力ぺシタビン、シタラビン、フロクスゥリジン、シタラビンオタフォスフェート、エノシタビ ン等のピリミジン類似化合物、メルカプトプリン、 6—メルカプトプリンリボシド、チォグ ァニン、ペントスタチン等のプリン類似化合物などが挙げられる。

[0053] 抗がん性抗生物質としては、例えば、ァクチノマイシン D、ブレオマイシン、ぺプロマ イシン、マイトマイシン C、アクラルビシン、ストレプトゾシン、ダウノルビシン、ドキソル ビシン、ピラルビシン、ェピルビシン、ネオカルジノスタチン、ジノスタチンスチマレマ 一、イダルビシン等が挙げられる。植物アルカロイド系の杭がん剤としては、例えば、 ビンクリスチン、ビンブラスチン等のビンカァノレカロイド類、エトポシド、テニポシド類の ェピポドフイロトキシン類、パクリタキセル、ドセタキセル等のタキソール類、ビノレルビ ン、ビンデシン、イリノテカン、ソブゾキサン、ェポチロン、デスォキシェポチロンなどが 挙げられる。

[0054] 白金配位ィ匕合物としては、例えば、シスブラチン、カルボブラチン、ネダプラチン等 が挙げられる。その他、上記の分類に含まれない抗がん剤として、例えば、ミトキサン トロン等のアントラセネジオン類、プロカルバジン等のメチルヒドラジン類、トレチノン等 のビタミン A代謝物質、デカルバジン、ヒドロキシカルバミド、ペントスタチン、 Lーァス ノ ラギナーゼなどが挙げられる。

[0055] 力かる杭がん剤のうち、例えば、上記アルキル化剤、代謝拮抗剤ならびに白金錯体 は、いずれも DNA合成過程である細胞周期の S期を抑制する薬剤である。これに対 して、抗生物質や植物アルカロイド類のパクリタキセル、ドセタキセルなどは、微小管 形成阻害作用を有しており、主に細胞分裂過程の M期を抑制する薬剤である。した がって、これらの抗がん剤は、単独でもまたは組み合わせて併用しても使用すること ができる。また、これらの抗がん剤を組み合わせる場合には、例えば、代謝拮抗剤と 白金配位化合物、特にシスプラチン (CDDP)と 5—フルォロウラシル (5-FU)とを併用 するのがよい。

[0056] この発明に係る杭がんカテブシン製剤は種々のがんの治療に有効に適用すること ができ、力かるがんの種類としては、特定の種類に限定されないが、以下のものを例 示することができる:食道、頸部、甲状腺、胃、肝臓、肺 (小細胞がんを含む)、乳房、 すい臓、胆のう、腎臓、大腸、直腸、結腸、膀胱、前立腺、卵巣、皮膚 (扁平上皮がん を含む)などのがん；リンパ性白血病、リンパ芽球性白血病、細胞リンパ腫、ホジキンリ ンパ腫、非ホジキンリンパ腫などのリンパ系列の造血性腫瘍;骨髄性白血病、骨髄異 形性症候群、前骨髄性白血病等などの骨髄性系列の造血性腫瘍;星細胞腫、神経 芽細胞腫、神経膠腫、シュワン腫などの中枢および末梢神経系の腫瘍;腺維肉腫、 横紋筋肉腫、骨肉腫などの間葉系の腫瘍;黒色腫、色素性乾皮症、角質棘細胞腫、 精上皮腫、甲状腺濾胞がん、奇形がん腫などのその他の腫瘍等。

[0057] この発明の抗がんカテブシン製剤は、薬学的に許容される担体や添加物、例えば 、希釈剤、賦形剤、安定化剤、緩衝剤、着色剤などを含有していてもよぐ例えば、酢 酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩ィ匕ナトリウム、塩ィ匕カリウム、塩ィ匕カルシウム、ソルビタ ンモノラウレート、トリエタノールアミンォレエートなどが挙げられる。

[0058] この発明の抗がんカテブシン製剤は、経口的にまたは静脈注、筋肉注、腹腔内、経 皮、直腸もしくは局所投与等の非経口的に投与することができる。経口投与する場合 には、例えば、錠剤、カプセル剤、水溶液または懸濁液などの形態で投与することが できる。経口投与のための固形製剤において通常使用される担体としては、例えば、 ラタトース、コーンスターチ、ステアリン酸マグネシウムなどを挙げることができる。また

、経口投与のための液性製剤の場合には、通常、乳化剤または懸濁化剤などを使用 することができる。

[0059] この発明にお 、て、抗がん剤と組み合わせて使用するカテブシン Eの投与量は、該 抗がん剤の杭がん活性 (細胞死誘導活性を含む)を増強する量であれば、特に制限 されるものではなぐ該抗がん剤の所定の投与量に従って広範囲に変動して投与す ることができる。実際には、カテブシン Eの併用投与により、抗がん剤の感受性が増強 されることにより、該抗がん剤の所定の投与量よりも少ない用量で投与することができ る。通常、カテブシン Eの投与 1回当たりの投与量 (単位投与量）は、併用する抗がん 剤の種類、投与形態、がんの種類、患者の体重や状態、病態などによって変動する 1S 例えば、 0.01 mg〜10 g/kg体重であるのがよい。一方、抗がん剤の投与量も、そ の種類、がんの種類、患者の体重や状態、病態などによって異なるが、例えば、 1 ng /kg体重〜 200 mg/kg体重（静脈内投与)もしくは 0.005 mg/kg体重〜 600 mg/m²体表 面積 (静脈内投与）、または 2.5mg/kg体重〜 2g/kg体重 (経口投与）の範囲で使用す ることがでさる。

[0060] 以下、実施例により本発明を具体的に説明する。ただし、本発明はこれらの実施例 により一切限定されるものではない。

実施例 1

[0061] (細胞生存の測定）

細胞生存は Cell Counting Kit_8を使用して製造者マニュアルに従って測定した。そ の方法を簡単に記載すると、細胞 (1 X 10⁴)を容量 100 1の 96ゥエルプレートに接種 し、 24時間培養した。次いで、細胞をラット胃（参考文献 27, 60— 62)力も精製した 所定濃度の各種カテブシンと共に無血清 Opti-MEM培地で培養した。その後、キッ ト試薬 10 1を各ゥエルに添加し、細胞を更に 1時間培養した。各ゥエルの吸光度を 4 50 nmでマイクロプレートリーダーで測定した。

[0062] (アポトーシスの測定）

アポトーシスの形態変化にっ ヽて細胞を位相差顕微鏡で調べた。前期と後期アポ トーシスの細胞をそれぞれァネキシン V染色と TUNELアツセィによって検出した。ァ ネキシン V染色のためには、 ALVA-41細胞をカテブシン Eまたはカテブシン Lと 4時 間接触させ、遠心分離して単離し、 PBSで 2度洗浄し、フルォレツセンイソチオシァネ ート結合ァネキシン Vと共に室温で暗所に 10分間培養した。ァネキシン V染色で陽 性の細胞は蛍光顕微鏡で検出した。 TUNELアツセィは、培養腫瘍細胞については Apop Tag Peroxidase Apoptosis Detection Kit、異植; につい一しは Tumor TAし S In Situ Apoptosis Detection Kitを用 ヽて行った。 [0063] (組換えカテブシンタンパク質の調製）

その活性部位の 2個のァスパラギン酸残基をァラニンで置換した組換え野生種なら びにその変異タンパク質 (D98A/D283A)を HEK293T細胞で発現し、前記記載の方法 で精製した (参考文献 63)。

[0064] (DEAE-Sephacelクロマトグラフィーとィムノデプリーシヨン）

ALVA- 41細胞 (9 X 10⁹個)を無血清培地 Opti-MEMを用いてカテブシン Ε(100 μ g/ ml)と一緒に 37° Cで 20時間培養し、 20,000 x g、 4° Cで 30分間遠心分離した。培 養上清を濃縮し、遠心分離して、得られた上清を 0.05% Brij 35を含む 10mMリン酸ナト リウムバッファー (pH 7.0)を用いて透析した後、同一溶液で平衡にした DAEA-Sephac elカラムに添カロした。その後、カラムを 0.01Mおよび 0.3M NaClで段階的に溶出した。 カラム分画の細胞毒性活性とカテブシン E活性は、新規調製した ALVA-41細胞と下 記カテブシン E特異的基質 MOCAc- Gly- Ser- Pro- Ala- Phe- Leu- Ala- Lys(Dnp)- D- A rg-NH (参考文献 64)を用いて調べた。 0.1M NaCl分画からの TRAILのィムノデプリ

2

ーシヨンのために、その分画を、最初に、 TRAILのマウスモノクローナル抗体またはコ ントロールマウスィムノグロブリン G (それぞれ 1 μ g/mlの濃度）を用いて、次にタンパク 質 G-Sepharose 4 Fast Flowと共に 4° Cで 1晚培養した。その後、榭脂を遠心分離で 除去し、得られた上清にっ ヽて ALVA-41細胞の生存に対する効果を評価した。

[0065] (SDS- PAGEおよびィムノブロット分析）

SDS-PAGEおよびィムノブロット分析を前記文献 (参考文献 63)に従って行った。 S DS-PAGEによって分画されたタンパク質の-トロセルロース膜での移動と 5%無脂肪 乾燥ミルクでのブロッキング後に、その膜を、抗 TRAIL抗体 (1/300倍希釈）、抗 TNF- a抗体（1/200倍希釈）、抗 FasL抗体（1/500倍希釈）、抗 DR4抗体（1/500倍希釈）、 抗 DR5抗体（1/100倍希釈）、抗 DcRl抗体（1/500倍希釈）、抗 DcR2抗体（1/500倍希 釈）、抗ォステオプロテゲリン抗体（1/150倍希釈)または抗 β -ァクチン抗体（1/500 倍希釈)などの一次抗体と共に 4° Cで一夜培養した。洗浄後、その膜をホースラデ イツシュパーォキシダーゼ結合ゥサギ、マウスもしくはャギィムノグロブリン G (1/4000 倍希釈)抗体 (二次抗体)と共に一夜 4° Cで培養した。このように処理した膜を数回 洗浄し、次いで免疫コンプレックスをィ匕学発光試薬で検出した。密度測定は LAS1000 アナライザーで行った。

[0066] (細胞表面のピオチン化）

細胞表面のピオチン化は次のようにして行った。〜80%コンフルェント状態で前立 腺細胞をディッシュに入れて、氷冷 PBSで 2度洗浄し、細胞非浸透性分解可能試薬 スルホ - NHS-SS -ピオチンと 4° Cで 30分間培養することによってピオチン標識をした 。非結合ピオチンは細胞を lOOmMグリシン PBS溶液で 6回洗浄することによってクェン チングした後、細胞を 1% Triton X-100と、フエ-ルメチルスルホ -ルフルオリド、ロイ ペン、ぺプスタチンおよびァプロチュンをそれぞれ lmg/mlずつ含んだ lOOmMリン酸 バッファー (pH 8.0)200 μ 1で溶菌した。細胞ライセートは、 20000 x gで 20分間 4° じで 遠心分離し、得られた上清をストレプトアビジンーァガロースビーズ 50 μ 1と一緒に 4° Cで 2時間ゆっくり攪拌した。このように処理したビーズは、 10 mM Tris-HCl (pH 7.5) 、 0.1% SDSゝ 0.1% Triton X- 100、 2mM EDTAおよび ImM

NaNを含む溶液で 2回、さらにこの溶液に 1M NaClと 0.1%ナトリウムラウロイルサルコ

3

シネートをカ卩えた溶液で 2回、さらにまた 5mM Tris-HCl(pH 7.0)で 2回洗浄した。続い て、ビーズを SDSサンプルバッファ一中で 100° Cで 5分間培養し、溶出したタンパク 質について SDS- PAGEおよびィムノブロット分析を行なった。

[0067] (TRAIL, FasLおよび TNF— aに対する ELISA)

無血清 Opti-MEM培地を用いてカテブシン Ε(100 μ g/ml)と一緒に 37° Cで 20時間 培養して得られた ALVA-41細胞（6cmディッシュ当たり lxlO⁶個）培養上清中の TRAIL 、 FasLおよび TNF-ひの量は ELISAキットを用いて測定した。この測定法を簡単に説 明すると、サンプルまたは標準品 100 1を対応する TNFファミリーメンバーに対するモ ノクローナル抗体を固定したマイクロタイタープレートに添加し、室温で 2時間培養し た。次に、プレートのゥエルを洗浄バッファーで 4回洗浄した。次に、各ゥエルにピオ チン結合モノクローナル抗体 100 1を添加し、室温で 1時間培養した後、ゥエルを 完全に洗浄し、ストレプトアビジン一結合ホースラディッシュホースラディッシュバーオ キシダーゼ 100 1とともに、室温で 30分間培養し、洗浄バッファーで 4回洗浄した。 安定化クロモゲン（chromoge OO /z l)を各ゥエルに添カ卩し、室温で 30分間喑所で培 養した。反応停止溶液を添加した後、マイクロリーダーで吸光度 (450應)を測定した [0068] (ィムノヒストケミストリー）

ホルマリン固定およびパラフィン包埋移植片について F4/80および MHCクラス II分 子を CHEMICON IHC Select(R) Immunoperoxidase

Secondary Detection Systemを用いて調べた。スライドのパラフィンをキシレンとアルコ ールで除去し、 3%過酸化水素で 10分間処理した。リンス後、ブロッキング試薬 (正常 ャギ血清）と共に培養しリンスした。続いて、スライドを一次抗体として抗 F4/80抗体（1 ： 500倍希釈)または抗 MHCクラス II抗体（1： 500倍希釈）を用いて室温で 10分間培 養した。 らに、 IHC Select(R) Biotinylated secondary

Antibody Goat anti-Rat IgGを二次抗体として室温で 10分間培養して、ストレプトァ ビジン—結合 HRPで 10分間室温で処理し、クロモゲン試薬（3,3'-ジァミノべンジジン )と室温で 10分間反応させた。このように処理したフラグメントをへマトキシリンで逆染 色し、光学顕微鏡で調べた。

[0069] (実験動物）

全ての実験動物は特定無菌施設において日本薬理学会のガイドラインに従って飼 育した。全ての動物実験は、九州大学大学院歯学研究院動物実験委員会の承認の もとに行った。 C57BL/6遺伝子バックグランドの野生型マウスと CatE— ^/_マウスは前記 文献 (参考文献 17)に記載の通り使用した。カテブシン Eを過剰発現するトランスジェ ニックマウスの作成のために、へマグルチュン（HA)で標識したマウスカテブシン Eトラ ンスジーンを構築した。全 RNAはマウス脾臓力 TRIsol試薬を用いて抽出し、第 1鎖 c DNAを逆転写酵素を用いて合成した。その cDNAをテンプレートとして使用することに よって、マウスカテブシン Eを EXタグポリメラーゼによって増幅した。下記配列を有す るプライマーを使用した：

5し CGGTCTAGAGAGATCGGAGCAGAGTGAGAG- 3'と

5 '-GGACCCGGGTAACAGGYTTAAATGGGTATCA-3 ' (下線配列は制限酵素 の Xbalと Smal部位をそれぞれ表して!/、る）。増幅フラグメントは HA標識をもつ pBluscri pt SKにサブクローユングした。続いて、マウスカテブシン E (mCE)と HAとのギャップを 除去するために部位指向性突然変異を誘導した。 Xbalで消化し、 Klenowフラグメント で充填した後、 pXhoIリンカ一を両端に添カ卩した。得られたプラスミドを Xholで消化し、 ゥシアルカリホスファターゼ処理 pCAGGSに結合した。この得られたプラスミドを用い てトランスジエニックマウスを作成した。ターゲットベクターのリンカ一 DNAフラグメント は C57BL/6Jマウスの受精卵にマイクロインジェクションした。半接合体 Tgマウス^ |IJ 始マウスと野生型マウスとを交配させて作製した。妊娠マウスはテール DNAを用いた PCRとサザンブロット分析法によってスクリーニングした。

[0070] (ヒトおよびマウスの異種移植片を有するマウスの腫瘍成長と転移）

一次腫瘍成長を研究するために、 ALVA- 41細胞（5xl0⁶個）の PBS溶液 lmlを雄ヌ 一ドマウスの右脇腹に皮下注射した。またマウスメラノーマ B16細胞（lxlO⁶個）を同系 野生種 (WT)マウス、 CatE— 'マウスおよび CatE^Tgマウスの右脇腹に同様に皮下注射し た。腫瘍の大きさはキヤリパーで測定し、腫瘍容量は式 ab²Z2 (式中、 aおよび bはそ れぞれ最大および最小中央断面寸法をそれぞれ表す)で算出した。 ALVA-41細胞 異質移植片の大きさが約 100 mm³ (注射後約 12日目ごろ）に達したとき、動物を 5匹 ずつの 2グループに分け、精製カテブシン E (l日当たり 200 g/体重 kg)または生理 食塩水を腫瘍中心部に 16日間投与した。腫瘍重量の測定と免疫組織化学的研究 のために、腫瘍の大きさが約 400mm³に達したときに、カテブシン E (l日当たり 500 g /kg)または溶媒 (ポリエチレングリコール)を腫瘍中心部に 10日間投与した。転移に ついての研究のために、メラノーマ B16細胞（PBS溶液 50 1中 2 x 10⁵個）を Wtマウス 、 CatE— ^Λマウスおよび CatE^Tgマウスの尾静脈から注射した。 22日後にマウスに麻酔を 施し、致死量のジェチルエーテルで屠殺した後、肺を摘出した。その肺表面の転移 黒色コロニー数を数えた。

[0071] (mRNA抽出および RT—PCR)

全 RNAは RNeasy Mini Kitを用いて製造者マニュアルに従って単離した。 RNAの収 率と品質は A260/A280での吸収とゲル電気泳動によって評価した。 cDNA合成は Rea dy-to-Go RT-PCRビーズを用いて行った。各サンプルにっき 500ngを第 1鎖プライマ 一、フォワードならびにリバースプライマー (20pmol)および RNase/DNaseフリー水を含 む 50 1の反応混合物中で培養した。 RTは 45° Cで 10分間および 95° Cで 5分 間からなる加熱プログラムで行った。また、 PCR反応は、下記プライマーを用いて行つ た。 G3PDH (フォワード： 5し TCCACCACCCTGTTGCTGTA;リノくース： 5し ACCACA GTCCATGCCATCAC)、カテブシン E (フォワード： 5し GTGCCCCTCAGAAGACAT CA；リバース： 5し GTATCCCAGACCCAGAATCC)。 PCR生産物はそれぞれ 471bp および 498bpであった。 G3PDHに対する PCRサイクル条件は、 95° Cで 30秒間、 60 ° Cで 30秒間、 72° Cで 1分間を 1サイクルとして 35サイクル、そして最後に 72° C で 5分間であった。全てのサンプルは、ェチジゥムブロマイド（0.5 g/ml)を含む 2.5% ァガロースゲル上に分解し、紫外線照射して可視化した。検出が線状範囲にあること を確保するために、 PCRは異なるサイクルで実施し、少なくとも 2回繰り返した。

[0072] (統計分析）

データは平均値士 SDとして表し、 Student's t testによってグループ間の比較を行 なった。生存データは Mann-Whitney U-testで分析し、 p〈0.O5の値を統計学的に 有意であると判断した。

[0073] 以下に、図面について詳細に説明する。

まず、図 1は、各種カテブシンのヒト前立腺がん ALVA-41細胞の生存に対する効果 を示す。図 1Aは、生理食塩水ならびにカテブシン B、 D、 E、 L (それぞれ濃度 10 g/ ml (左側)、 50 μ g/ml (中央）、 100 g/ml (右側) )で 37° C、 pH 7.4で 20時間処理後 、生存細胞数を比色法で測定した結果を示す。図中のデータは、生理食塩水処理 細胞値に対する相対値であり、 4回の別々の実験の平均値士 SD値で表している。 *p く 0.001は生理食塩水処理細胞に対する対応値である。図 1Bは、各種カテブシン (濃 度 100 g/ml)ならびに生理食塩水で処理した細胞の顕微鏡観察の結果を示す。な お、図中の指示スケールは 50 mである。図 1Cは、細胞を生理食塩水およびカテブ シン E (50 μ g/ml)ならびにカテブシン L (100 μ g/ml)で 37 ° C、 pH 7.4で 20時間処 理後、 TUNEL

アツセィ (上段）と蛍光イソチオシァネート標識ァネキシン A染色（下段）によって検出 したアポトーシス像を示す。なお、図中のバーのスケールは 50 mである。

[0074] 図 2は腫瘍細胞におけるカテブシン E誘導性アポトーシスの特徴を示している。図 2 Aは ALVA-41細胞の生存率の測定結果を示す。この実験では、 ALVA-41細胞をぺ プスタチン A (100 M)の存在下または非存在下で所定濃度のカテブシン Eと共に 37 ° C、 pH

7.4で 20時間培養した後、細胞生存率を測定し、非処理細胞群の値に対するパーセ ントで表している。データは、 4回の別々の実験の平均値士 SD値で表している。 *p〈0. 001はぺプスタチン A非処理細胞に対する対応値である。図 2Bは HEK293細胞の生 存率の測定結果を示す。この実験では、 HEK293細胞を所定濃度の天然カテブシン E、野生型組換え体ならびにその活性部位変異体（D98A/D283A)と共に 37° C、 pH 7.4で 20時間培養した後、細胞生存率を測定し、非処理細胞群の値に対するパー セントで表した。データは、 4回の別々の実験の平均値士 SD値で表している。 *p〈0.0 01は変異体処理細胞に対する対応値である。図 2Cはカテブシン Eのみで処理した 細胞の生存率を示している。この実験では、細胞を所定濃度のカテブシン Eのみで 図 2Aのように処理した後、培養上清を回収し、遠心分離し、沈殿を除去し、その 1部 (100 Μ)を新たに調製した ALVA-41細胞の培地に移した。続いて、これらの細胞 をぺプスタチン A (100 Μ)の非存在下（黒丸印）または存在下（白丸印）で 37° C、 p H 7.4で 20時間培養した後、細胞生存率を測定し、生理食塩水処理 ALVA-41細胞 培養上清で処理した細胞の値に対するパーセントで表した。データは、 4回の別々の 実験の平均値士 SD値で表している。図 2Dに示す実験では、カテブシン E処理 ALVA - 41細胞の培養上清を DEAE-Sephacelカラムクロマトグラフィーで分画し、各画分を上 記の通り処理した。各カラム分画のカテブシン E活性 (上部パネル）と細胞毒性活性（ 下部パネル）は、新たに調製した ALVA-41細胞とカテブシン E特異的基質を用いて それぞれ決定した。所定の最終タンパク質濃度での各分画で処理した細胞生存率 は、生理食塩水処理細胞に対するパーセントとして表され、 4回の別々の実験の平 均値士 SD値で表している。カテブシン E活性は、培養上清中の全活性のパーセント として表され、そのデータは 3回の別々の実験の平均値士 SD値で表している。

図 3は、 ALVA-41細胞におけるカテブシン E誘導性アポトーシスの誘導因子として の TRAILの同定について説明する。図 3Aは培養上清中の TNF- α ,FasLおよび TRA ILの量についての ELISA測定結果を示す。この実験では、 ALVA-41細胞を力テプシ ン E (100 g/ml)または生理食塩水を用いて 37° C、 pH

7.4で 20時間処理後、培養上清中の TNF- a , FasLおよび TRAILの量を ELISAで測定した。データは生理食塩水処理細胞の平均 値の対応値に対する相対値として表し、 4回の別々の実験の平均値士 SD値で表して いる。図 3Bはィムノブロット分析結果を示す。この実験では、細胞を図 Aのようにカテ プシン E (レーン 2, 4)または生理食塩水（レーン 1 , 3)で処理した後、細胞抽出物と 培養上清を TNF- a ,FasLおよび TRAILのそれぞれに対する特異的な抗体を用いて ィムノブロット分析を行った。図 3Cは、 TRAILのィムノデプリーシヨンによるアポトーシ ス誘導活性に対する阻止効果を示す結果である。この実験では、抗 TRAIL抗体を用 いて所定の最終濃度でのカテブシン E処理細胞の培養上清の DEAE-Sephacelカラ ムクロマトグラフィーによって得られた 0.1M NaCl分画からの TRAILを免疫沈降により 除去した。対照として、コントロールマウス IgGに対する抗体を用いて同様の処理を行 つた。免疫沈降後の培養上清を用いての ALVA-41細胞のアポトーシスを調べた。デ ータは生理食塩水処理細胞の生存率に対する対応値のパーセントとして表し、 3回 の別々の実験の平均値士 SD値で表している。 *p〈0.001はコントロール IgG処理細胞 に対する対応値である。

図 4は、各種ヒト前立腺がん細胞株に対するカテブシン E誘導性アポトーシスへの感 受性について説明している。

図 4Aは、各種ヒト前立腺がん細胞株ならびに正常ヒト前立腺上皮 (PrE)細胞をカテ プシン Eまたは生理食塩水で処理したときの細胞生存率を比色アツセィで測定した 結果を示す。このアツセィでは、まず、被験細胞を〜 80%コンフルェント状態まで培 養し、続いてカテブシン E (100 μ g/ml)または生理食塩水と共に 37 ° C、 pH 7.4で 2 0時間培養した後、細胞生存率を比色アツセィで測定した。細胞生存率は生理食塩 水処理細胞に対する対応値のパーセントとして表している。データは 4回の別々の実 験の平均値士 SD値で表している。 *p〈0.001は生理食塩水処理細胞に対する対応値 である。図 4Bはィムノブロット分析の結果を示す。この実験では、先ず細胞を細胞透 過性分解可能試薬 sulfo-NHS-SS-biotinでピオチン化した後、細胞融解し、細胞ライ セートをストレプトアビジン 'ァガロースビーズと 4° Cで 2時間培養した。次に、ビーズ を洗浄し、関連タンパク質を抗 TRAIL抗体または TRAIL膜関連レセプターに対する 抗体を用いてィムノブロット分析を行った。また、細胞ライセート部分を抗 j8—ァクチ ン抗体を用いて直接ィムノブロット分析をした。別の方法として、各細胞株の調整培 地を抗 OPG抗体を用いてィムノブロット分析した。図 4Cはデンシトメ一ターで濃度解 祈したときの結果を示す。この実験では、図 3Aと同様にカテブシン E処理培養上清 を抗 TRAIL抗体を用いてィムノブロット分析した後、ィムノブロットを可溶性三量化 TR AILの定量のために濃度解析した。縦軸の単位は、カテブシン E処理した PrE細胞の ミリメートル単位当たりの TRAIL濃度に対する相対値として定義される。データは 4回 の別々の実験の平均値士 SD値で表している。レーン 1は PrE細胞、レーン 2は ALVA- 41細胞、レーン 3は ALVA-101細胞、レーン 4は PPC-1細胞、レーン 5は PC-3細胞、 レーン 6は DU145細胞。 *p〈0.001はカテブシン E処理 PrE細胞に対する統計的に有 意な値である。

[0077] 図 5は、カテブシン E注射のヌードマウスにおける ALVA-41細胞によって形成され た腫瘍成長に対する効果について説明している。

図 5Aは、 ALVA-41細胞を雄ヌードマウスに皮下注射して生成した腫瘍の容積を示 す。皮下注射後腫瘍容積が〜 100cm³に達したとき、カテブシン E (200 μ g/kg/日）ま たは生理食塩水を腫瘍中心部に 16日間皮下注射した。データは各グループ当たり マウス 5匹からの値の平均値士 SD値であり、 *p〈0.005、 **p〈0.01および ***p〈0.001は カテブシン E処理マウスに対する統計的に有意な対応値である。図 5Bは、腫瘍容積 が〜 400 cm³に達したとき、カテブシン E (400 μ g/kg/日）または生理食塩水を腫瘍 中心部に 10日間注射した後、腫瘍重量を測定した結果を示す。データは各グルー プ当たりマウス 3匹からの値の平均値士 SD値である。図 5Cは、図 5Bと同様にて、力 テプシン Eまたは生理食塩水で処理したマウスの腫瘍を TUNELアツセィで分析した 結果を示す。アツセィは、ジァミノべンジジンと反応させた後、切片を 1%メチルダリー ンでカウンター染色して行った。データは各グループ 5匹のマウスで得られた結果を 表すものであり、下段は、上段のイメージの拡大図である。図中のバーのスケールは 50 μ mで fc 。

[0078] 図 6— 1および図 6— 2は、内在性カテブシン E発現レベルと、腫瘍中のマウス B 16 メラノーマ細胞の成長低下ならびに転移との直接的関連性について説明している。 図 6Aは、 CatE— マウス (n=ll)、 Wtマウス (n=10)および CatE^Tgマウス（n=10)のそれ ぞれに同系のマウス B16メラノーマ細胞 (1 X 10⁶個）を皮下注射して生成した腫瘍容 量を測定した結果を示している。腫瘍容量は注射後所定時間に測定し、データは各 グループ値の平均値士 SD値である。 *p〈0.01および **p〈0.001は Wtマウスに対しての 統計的に有意な対応値である。図 6Bは、マウス B16メラノーマ細胞の皮下注射後の 各グループのマウスの死亡率を示す。 Wtマウスと、 CatE— 'マウスまたは CatE'^gマウス との差は統計学上有意差がある。図 6Cは、各マウスグループ力 の摘出腫瘍に対す る TUNELアツセィ分析結果を示す。アツセィは、ジァミノべンジジンとの反応後、切片 を 1%メチルグリーンでカウンター染色して行った。データは各グループ 5匹のマウスの 移植 23日目の結果を表している。図中のバーのスケールは 50 mである。図 6Dは、 移植 23日目の各グループのマウスへの摘出腫瘍に対する抗 F4/80抗原抗体ならび に抗 MHCクラス II分子抗体で免疫組織ィ匕学的染色の結果を表している。図中、矢印 は血管を示し、またバーのスケールは 100 mである。図 6Eは、がん細胞移植後 23 日目で摘出した腫瘍のパラホルムアミド固定ならびにへマトシリンとェォシン染色の 結果を示す。白色矢じり印と黒色矢じり印とは腫瘍中の血管と壊死領域をそれぞれ 示す。図下段は図上段のイメージ（図中の四角部分)の拡大図を示す。 CatE— ^/_マウス の場合、図下段には腫瘍中心部に新生血管構造が認められる。図 6Fは各グループ のマウスにマウス B 16メラノーマ細胞を静脈注射して肺表面の黒色小結節数を示す グラフである。この実験では、各グループのマウスにマウス B16メラノーマ細胞 (2 X 10 ⁵個)を尾静脈注射し、 22日後に屠殺して肺表面の黒色小結節数を数えた。データは 各グループ値の平均値士 SD値である。 *p〈0.01および **p〈0.001は対応マウスに対 する統計的に有意な値である。

図 7はマウスカテブシン Eトランスジーンのプラスミド構築のための模式図である。 HA 標識したカテブシン Eをターゲットベクター pCAGGSにクローンィ匕した。図中に記した 略号は、 AGプロモーターは amp,アンピシリン抵抗性遺伝子は fl(-) ori、 HAはへムァ グノレチニン、 hCMVはヒトサイトメガロウイノレス即時プロモーター、 lacZは 13 -ガラタトシ ダーゼ αフラグメント 13グロビンプロモーター、 mCEはラットカテブシン Ε遺伝子、 MCS は多彩なクローユング部位、 oriは大腸菌プラスミド pMBl由来、 P lacは lacプロモータ 一、 pUC oriは pUC由来、 SV40 oriは simianウィルス由来を示している。 [0080] 図 8は、マウスカテブシン Eを過剰発現させた HEK293細胞の細胞抽出液のィムノブ口 ット解析データを示す。一次抗体として、カテブシン E (CE)およびヘムァグルチュン（ HA)に対する抗体を用いた。レーン 1はカテブシン Eをトランスフエタトした細胞、レー ン 2は対照細胞を示す。

[0081] 図 9は、カテブシン Eを過剰発現させたトランスジエニックマウス（CatE^+/+マウス）と対 照としての野生型 (Wt)マウスの各種臓器におけるカテブシン EmRNAの発現量を示 している。 Mは 100塩基対マーカー、 G3PDHはグリシルアルデヒド 3リン酸脱水素酵 素を示している。レーン 1から 10までは、順に脳、心臓、肺、胃、脾臓、脾臓、小腸、 大腸、肝臓、腎臓を示している。

実施例 2

[0082] 図 10は、ヒト白血病細胞の生存に及ぼすカテブシン Eならびにエトポシドの影響を 調べた結果を示している。上段のパネルは、白血病細胞 U937細胞および HL-60細 胞に対してカテブシン Eとエトポシドとをそれぞれ投与した場合の影響を投与濃度に ついて検討した結果を示している。下段のパネルは、それぞれの細胞に対して、各 種濃度のカテブシン Eとエトポシド（10 μ g/ml)とを同時に投与したときの効果をカテ プシン Eを単独投与した場合と比べた結果を示している。これらの結果は、力テプシ ン Eとエトポシドとを同時に投与した場合、いずれのがん細胞もその生存率を大きく低 下させて 、ることが示して 、る。

実施例 3

[0083] 図 11は、カテブシン Eとエトポシドのヒト白血病細胞の生存に及ぼす影響を、カテブ シン Eとエトポシドの同時投与の場合とエトポシド前処理の場合で比較して調べた結 果を示す。図示したように、エトポシド（10 g/ml)単独投与の場合、エトポシドはヒト 白血病細胞 U937細胞に対して、 40%程度しかアポトーシスを誘導していないが、各 種濃度のカテブシン Eを同時投与した場合とエトポシド前処理後に投与した場合で は、がん細胞のアポトーシスが著しく亢進していることが判明した。

実施例 4

[0084] 図 12は、カテブシン Eとエトポシドとの併用投与とエトポシド単独投与によるヒト白血 病細胞 U937細胞の生存に対する効果を示して 、る。図上段はエトポシド単独投与の 場合の効果を示して 、る。図下段はエトポシド (50 μ g/ml)と各種濃度のカテブシン E とを併用投与した場合の効果を示している。これらの結果から、カテブシン Eとエトポ シドとを併用することにより、エトポシドの効果が明らかに増強されていることが判明し た。

産業上の利用可能性

[0085] この発明に係る杭がんカテブシン製剤は、がん細胞の成長阻止とがん転移の予防 に有用であると共に、がん細胞のアポトーシスを著しく誘導することができる。また、こ の発明の抗がんカテブシン製剤は、正常細胞に対しては悪影響を及ぼすことなぐが ん細胞だけを殺傷することができることから、従来の抗がん剤の有する副作用を伴わ ないか、または著しく軽減することができる。さらに、この発明の抗がんカテブシン製 剤を、その他の抗がん剤と併用することによって、従来の抗がん剤が感受性を示さな 力つたがんなどに対しても治療効果が期待できることから、特に、がん治療の分野に おいて極めて有用である。

[0086] (参考文献 1)

[表 1]

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Claims

請求の範囲

[1] カテブシン Eおよび Zまたはその活性部位力もなるもしくはその活性部位を含む活 性フラグメントを有効成分として含有することを特徴とする杭がんカテブシン製剤。

[2] 請求項 1に記載の抗がん杭がんカテブシン製剤にぉ 、て、前記活性部位が配列表 の配列番号 1に記載するアミノ酸配列の配列番号 98番目と 283番目のァスパラギン 酸を含む領域であることを特徴とする杭がんカテブシン製剤。

[3] 請求項 1または 2に記載の抗がんカテブシン製剤において、抗がん剤が有効成分と してさらに含有されていることを特徴とする杭がんカテブシン製剤。

[4] 請求項 3に記載の抗がんカテブシン製剤において、前記杭がん剤が抗がん剤また は抗腫瘍剤であることを特徴とする記載の抗がんカテブシン製剤。

[5] 請求項 3または 4に記載の抗がんカテブシン製剤にぉ 、て、前記杭がん剤が白金 配位化合物、トポイソメラーゼインヒビター、抗生物質、抗有糸分裂性アルカロイド、ジ フルォロヌクレオシドであることを特徴とする記載の抗がんカテブシン製剤。

[6] 請求項 3な 、し 5の 、ずれか 1項に記載の抗がんカテブシン製剤にぉ 、て、前記抗 がん剤が、食道、頸部、甲状腺、胃、肝臓、肺 (小細胞がんを含む)、乳房、すい臓、 胆のう、腎臓、大腸、直腸、結腸、膀胱、前立腺、卵巣、皮膚 (扁平上皮がんを含む） などのがん；リンパ性白血病、リンパ芽球性白血病、細胞リンパ腫、ホジキンリンパ腫 、非ホジキンリンパ腫などのリンパ系列の造血性腫瘍;骨髄性白血病、骨髄異形性症 候群、前骨髄性白血病等などの骨髄性系列の造血性腫瘍;星細胞腫、神経芽細胞 腫、神経膠腫、シュワン腫などの中枢および末梢神経系の腫瘍;腺維肉腫、横紋筋 肉腫、骨肉腫などの間葉系の腫瘍;または黒色腫、色素性乾皮症、角質棘細胞腫、 精上皮腫、甲状腺濾胞がん、奇形がん腫などのその他の腫瘍に適用することができ ることを特徴とする記載の抗がんカテブシン製剤。

[7] 請求項 1な!、し 6の 、ずれか 1項に記載のカテブシン Eおよび Zまたはその活性部 位力 なるもしくはその活性部位を含む活性フラグメントを有効成分として含有する抗 がんカテブシン製剤を抗がん剤と併用することによって抗がん剤の感受性を増強す ることを特徴とする杭がん剤の感受性増強方法。

[8] 請求項 7に記載の抗がん剤の感受性増強方法にぉ 、て、前記活性部位が配列表 の配列番号 1に記載するアミノ酸配列の配列番号 98番目と 283番目のァスパラギン 酸を含む領域であることを特徴とする杭がん剤の感受性増強方法。

[9] 請求項 7または 8に記載の抗がん剤の感受性増強方法において、前記杭がん剤が、 代謝拮抗剤、アルキル化剤、杭がん性抗生物質、微小管阻害剤などの細胞障害性 杭がん剤または分子標的治療薬であることを特徴とする記載の杭がん剤の感受性増 強方法。

[10] 請求項 7な 、し 9の 、ずれか 1項に記載の抗がん剤の感受性増強方法にお!、て、 前記杭がん剤が、食道、頸部、甲状腺、胃、肝臓、肺 (小細胞がんを含む)、乳房、す い臓、胆のう、腎臓、大腸、直腸、結腸、膀胱、前立腺、卵巣、皮膚 (扁平上皮がんを 含む)などのがん；リンパ性白血病、リンパ芽球性白血病、細胞リンパ腫、ホジキンリン パ腫、非ホジキンリンパ腫などのリンパ系列の造血性腫瘍;骨髄性白血病、骨髄異形 性症候群、前骨髄性白血病等などの骨髄性系列の造血性腫瘍;星細胞腫、神経芽 細胞腫、神経膠腫、シュワン腫などの中枢および末梢神経系の腫瘍;腺維肉腫、横 紋筋肉腫、骨肉腫などの間葉系の腫瘍;または黒色腫、色素性乾皮症、角質棘細胞 腫、精上皮腫、甲状腺濾胞がん、奇形がん腫などのその他の腫瘍に適用することが できることを特徴とする杭がん剤の感受性増強方法。

[11] カテブシン Eおよび Zまたはその活性部位力もなるもしくはその活性部位を含む活 性フラグメントをがん細胞に接触させることによって、がん細胞表面に TRAILを発現さ せることを特徴とする TRAILの発現方法。

[12] 請求項 11に記載の TRAILの発現方法にぉ 、て、前記活性部位が配列表の配列番 号 1に記載するアミノ酸配列の配列番号 98番目と 283番目のァスパラギン酸を含む 領域であることを特徴とする TRAILの発現方法。

[13] カテブシン Eおよび Zまたはその活性部位力もなるもしくはその活性部位を含む活 性フラグメントをがん細胞に接触させて TRAILを発現させることによって、正常細胞に は影響を及ぼすことなく実質的にはがん細胞だけを殺傷することを特徴とするがん細 胞の殺傷方法。

[14] 請求項 13に記載のがん細胞の殺傷方法において、前記活性部位が配列表の配 列番号 1に記載するアミノ酸配列の配列番号 98番目と 283番目のァスパラギン酸を 含む領域であることを特徴とするがん細胞の殺傷方法。

[15] 請求項 1ないし 6のいずれか 1項に記載の抗がんカテブシン製剤を用いて、がんを 治療することを特徴とするがん治療方法。

[16] 請求項 7な 、し 10の 、ずれか 1項に記載の抗がん剤の感受性増強方法を用いて、 がんを治療することを特徴とするがん治療方法。

[17] 請求項 15または 16に記載のがん治療方法において、前記杭がん剤が、代謝拮抗剤 、アルキル化剤、抗がん性抗生物質、微小管阻害剤などの細胞障害性抗がん剤また は分子標的治療薬であることを特徴とする記載のがん治療方法。

[18] 請求項 15ないし 17のいずれか 1項に記載のがん治療方法において、前記杭がん 剤が、食道、頸部、甲状腺、胃、肝臓、肺 (小細胞がんを含む)、乳房、すい臓、胆の う、腎臓、大腸、直腸、結腸、膀胱、前立腺、卵巣、皮膚 (扁平上皮がんを含む)など のがん；リンパ性白血病、リンパ芽球性白血病、細胞リンパ腫、ホジキンリンパ腫、非 ホジキンリンパ腫などのリンパ系列の造血性腫瘍;骨髄性白血病、骨髄異形性症候 群、前骨髄性白血病等などの骨髄性系列の造血性腫瘍;星細胞腫、神経芽細胞腫 、神経膠腫、シュワン腫などの中枢および末梢神経系の腫瘍;腺維肉腫、横紋筋肉 腫、骨肉腫などの間葉系の腫瘍;または黒色腫、色素性乾皮症、角質棘細胞腫、精 上皮腫、甲状腺濾胞がん、奇形がん腫などのその他の腫瘍に適用することができる ことを特徴とするがん治療方法。

[19] TNF- a、 FasL (CD95Lまたは ApolL)、 TRAIL (または ApolL)などの腫瘍壊死因 子 (TNF)ファミリーメンバーにより形成されていることを特徴とする TNFホモ三量体。