JP5137909B2 - 白血球活性化ペプチド - Google Patents
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Description
Robson et al. J. Immunol. 2001. 167: 1028-1038 M'Rabet et al. J. Biol. Chem. 1999. 274: 21847-21852 Gijon et al. J. Leukoc. Biol. 1999. 65: 330-336 Wu et al. J. Cell Sci. 2000. 113: 2935-2940 Liscovitch et al. Biochem. J. 2000. 345: 401-415 Gijon et al. J. Leukoc. Biol. 1999. 65: 330-336 Puri et al. Int. J Biochem. Cell Biol. 1998. 30: 1107-1122 Murthy et al. J. Biol. Chem. 1998. 273: 34519-34526 Robinson et al. Biochem. J. 1998. 336: 611-617 Gijon et al. J. Leukoc. Biol. 1999. 65: 330-336 Farooqui et al. J. Neurochem. 1997. 69: 889-901 Gijon et al. J. Leukoc. Biol. 1999. 65: 330-336 Dana et al. J. Biol. Chem. 1998. 273: 441-445 Boen et al. J. Immunol. 2000. 165: 2040-2047 Wilson et al. J. Immunol. 1999. 163: 6424-6434 Hiemstra et al. J. Immunol. 1998. 161: 4078-4082 Dooley et al. Methods Mol. Biol. 1998. 87: 13-24 Owens et al. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1991. 181: 402-408 Hayashi et al. J. Immunol. 1995. 154: 814-824 Aramburu et al. Science. 1999. 285: 2129-2133 Dooley et al. J. Biol. Chem. 1998. 273: 18848-18856 Baek et al. J. Biol. Chem. 1996. 271: 8170-8175
“約”及び“実質的に(substantially)は、正確な数字より余裕をもたせたことを意味する。例えば、ポリペプチドの長さにおける“約”又は“実質的に”は、ポリペプチドが例示されたアミノ酸の数に限定されないことを示す。結合活性のような機能性活性がそのまま維持される限り、N−末端又はC−末端で追加又は控除されたいくつかのアミノ酸が含まれることができる。
次のようなアミノ酸の単一文字又は3個の文字からなる略字が全て本明細書で使用される:A又はAla=アラニン;R又はArg=アルギニン;N又はAsn=アスパラギン;D又はAsp=アスパラギン酸;C又はCys=システイン;Q又はGln=グルタミン;E又はGlu=グルタミン酸;G又はGly=グリシン;H又はHis=ヒスチジン;I又はIle=イソロイシン;L又はLeu=ロイシン;K又はLys=リジン;M又はMet=メチオニン;F又はPhe=フェニルアラニン;P又はPro=プロリン;S又はSer=セリン;T又はThr=スレオニン;W又はTrp=トリプトファン;Y又はTyr=チロシン;andV又はVal=バリン。
また、前記“リガンド”は、強い親和力によって他の分子に結合される分子を意味することもできる。
“治療”は、治療、予防又は防止措置全てを意味する。治療が必要な対象は、疾病を有していたり疾病にかかり得る対象を全て意味する。“疾病緩和”とは、治療を受けない状態に比べ、好ましくない疾病状態の臨床的な徴候が減少したり、又は疾病進展の時間が遅れたり永くなることを意味する。
本発明者は、組合わせペプチドライブラリー、好ましくは、ヘキサペプチドをスクリーニングした。4700万個を超える互いに異なるペプチド配列を含むライブラリーをスクリーニングしてdHL60細胞にAA放出を活性化させることのできる24個のヘキサペプチドを同定した。これらの生理学的役割の観点より、前記ペプチドは、超酸化物生成及び食細胞の化学走性移動を増加させることが確認された。前記ペプチドの受容体特異性又はシグナル伝達特異性に関する実験を通じて、前記ペプチドが白血球内で共通の受容体であるFPRL1、又は同定されない受容体を通じて、重なったり互いに区別される細胞間信号を誘発することができることが確認された。
本発明の一つの側面によれば、本発明は、白血球及び食細胞のような標的細胞と相互作用したり活性化することができるペプチドに関する。特に、前記ペプチドはアラキドン酸を誘導し、カルシウムの細胞内放出を誘導し、前記標的細胞の移動を誘導する。
本発明のペプチドは、白血球又は食細胞のような標的細胞を多くの生物学的又は酵素学的メカニズムによって活性化することができる。標的細胞を活性化するポリペプチドは、配列番号:1〜配列番号:35に例示されたペプチドを含むが、これに限られるわけではない。
“分離された”ポリヌクレオチド配列には、天然環境から除去された核酸分子、DNA又はRNAが含まれる。これは、本発明のポリペプチドをエンコードするDNA断片を含み、ベクター配列又は他の外来DNAのような異種配列も含むことを意味する。例えば、ベクターに含まれた組換えDNA分子は、部分的又は実質的に精製できるものに分離されたものと見なされることができる。
本発明はまた、標的細胞活性化ポリペプチドの蛋白質、類似体又は誘導体を誘導する核酸分子の変種に関する。このような核酸変種は、核酸置換、削除又は添加によって生成できる。このような置換、削除又は添加は、一つ以上のヌクレオチドを含むことができる。アミノ酸配列の変形は、保存性又は非保存性アミノ酸置換、削除及び添加を生成させることができる。特に、ポリペプチド又はこれらの一部分の特性及び活性を変えない沈黙性置換、添加及び削除が好ましい。これに関連しては、保存性置換が好ましい。
ポリペプチドを活性化する特性を改善したり変化させるために、アミノ酸エンジニアリングを用いることができる。この分野でよく知られている組換えDNA技術は、単一又は多重アミノ酸置換、削除、添加を含む新たな突然変異ポリペプチドや融合蛋白質を生成するのに用いることができる。このような変形されたポリペプチドは、増加/減少した活性及び安定性を示すことができる。また、これらは高収率で精製でき、特定の精製及び保存条件下で対応する天然ポリペプチドに比べてさらに優れた溶解性を示す。
本発明の一実施例は、多様な検出方法を利用して、標的細胞に結合された活性因子ポリペプチドを検出するものである。前記標的細胞に対して活性化したポリペプチドが結合することを検出する一つの方法は、この分野においてよく知られており、活性因子ポリペプチドを直接標識し、標識法(labeling)及び分離技術を利用して分析する方法である。他の方法は、活性因子ポリペプチド又は活性因子ポリペプチド/標的細胞複合体のうちのいずれか一つに特異的に結合する標識されたリガンドを使用する方法である。このようなリガンドとしては抗体を使用することができる。
好適な酵素標識は基質と反応し、過酸化水素を生成させる触媒作用をするオキシダーゼ作用基を含む。グルコースオキシダーゼは特に安定性が優れており、基質を容易に購入できるので好ましい。オキシダーゼ標識の活性は、酵素−標識抗体/基質反応によって形成された過酸化水素の濃度を測定して分析することができる。酵素以外に、他の好適な標識は、ヨード(125I、121I)、炭素(14C)、硫黄(35S)、三重水素(3H)、インジウム(112In)、及びテクネチウム(99mTc)のような放射性標識、蛍光物質及びローダミンのような蛍光標識、及びビオチンを含む。
本発明の具体的な実施例によれば、本発明のペプチドを誘導する配列を含む核酸を投与して、白血球又は食細胞のような標的細胞を活性化し、バクテリア又は他の外部物質に対する免疫反応を増加させるようにする遺伝子治療に使用することができる。遺伝子治療は、発現された又は発現可能な核酸を対象として投与することにより実施できる。本発明の具体的な実施例において、前記核酸は、治療効果を示す誘導された蛋白質を生成させる。
0:926-932 (1993); and Morgan and Anderson, Ann. Rev. Biochem. 62:191-217 (1993); May, TIBTECH 11(5):155-215 (1993).組換えDNA技術分野によく知られている方法は、Ausubel et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley
& Sons, NY (1993); and Kriegler, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY (1990)に記載されている。
本発明の一実施例で、本発明は、充分な標的細胞活性のない多様な疾病を治療することに関する。この方法により、本発明の治療用化合物は、標的細胞を活性化する化合物を提供することにより、疾病中の患者又は疾病もしくは疾患にかかる虞のある患者に投与できる。好ましくは、前記標的細胞は白血球又は食細胞であることができる。特に、前記疾病又は疾患は、ウイルス又はバクテリアのような感染性病源体による感染と関連がある。特に、本発明は、後天性免疫不全症候群又は癌のような正常な免疫反応の希薄化と関連した感染性疾病の治療に関する。
多様な伝達システムが公知されており、本発明の化合物を投与するために使用することができ、例えば、リポソーム内カプセル化、微小粒子、マイクロカプセル、前記化合物の発現性の組換え細胞、受容体−媒介細胞内移入、レトロウイルス又はその他のベクターの一部としての核酸構造体などがある。導入方法は真皮内、筋肉内、腹膜内、静脈内、皮下内、鼻腔内、硬膜外、及び口腔経路を含むが、これらに限定されない。化合物又は組成物は都合のいい経路を通って、例えば、注入液又はボーラス注射、上皮又は粘膜皮膚内層(例、口腔粘膜、直腸及び腸粘膜など)を通じる吸収によって投与することができ、その他の生物学的活性製剤と共に投与することができる。投与は全身又は局所であってもよい。また、本発明の薬学的化合物又は組成物を適切な経路を通じて中枢神経系に導入することが好ましいこともあり、前記適切な経路は脳室内注射及びくも膜内注射を含み、脳室内注射は、例えば、保存所に接触した脳室内挿入管、例えば、Ommaya保存所を利用して容易に行うことができる。肺投与は、例えば、吸入器又は噴霧器を使用して実施することができ、噴霧化剤を利用した処方箋を利用することもできる。
Fmocアミノ酸はMillipore (Bedford, MA)から入手し、Rapidamide樹脂はDupont (Boston, MA)から入手し、末梢血液単核細胞(PBMC)分離培地(Histopaque-1077), cytochrome c、及びfMLFはSigma (St. Louis, MO)から入手し、fura−2ペンタアセトキシメチルエステル(fura-2/AM)は、Molecular Probes (Eugene, OR)から入手し、RPMI 1640はLife Technologies (Grand Island, NY)から入手し、透析された牛胎児の血清及び懸濁された牛の血清は、Hyclone Laboratories Inc.で得られ(Logen, UT)、百日咳毒素(PTX)、GF109203X、及びPD98059はCalBiochem (San Diego, CA)から入手し、LY294002はBIOMOL Research Laboratories, Inc. (Polymouth Meeting, PA)から入手した。
U937 (human histiocytic lymphoma cells), HL60 (human promyelocytic leukemia cells), Raw 264.7 (mouse macrophage), Jurkat (human acute T cell leukemia), PC12 (rat adrenal pheochromocytoma cells), 3Y1 (Rat embryonic fibroblasts), 3T3L1 (preadipocytes),及び NCI-H292 (human mucoepidermoid pulmonary carcinoma cells) を、American Type Culture Collection (Rockville, MD)から入手した。FPR−又はFPRL1発現RBL−2H3細胞を、He et al. J. Immunol. 2000. 165: 4598-4605に記載されたように培養した。細胞は、標準培養条件(humidified atmosphere, 95% air, 5% CO2, at 37℃)で約1×106cells/mlに維持されるようにした。HL60細胞は、ジメチルスルホキシド(DMSO)(最終濃度1.25%、v/v)を培養培地に4日間添加することによって、顆粒球表現型に分化されるように誘導した(Itoh et al. Blood. 1998. 92: 1432-1441)。
末梢血白血球濃縮液を、Ulsan Red Cross Blood Center (Ulsan, Korea)から提供を受けた。PBMCsは、Histopaque-1077濃度勾配で分離された。Ca2+及びMg2+を含有しないHBSSで二回洗浄した後、PBMCsをRPMIを含有する10%FBSに懸濁されるようにし、37℃で60分間培養して、単核球が培養皿に付着するようにした。細胞を5回暖かいRPMI培地で洗浄してリンパ球を除去し、付着した単核球を収集した(Bae et al. J. Leukoc. Biol. 1999. 65: 241-248)。ヒト好中球は次のような標準方法によって分離された;デキストラン沈降法、赤血球の低浸透圧性溶出、及び培地リンパ球分離勾配を利用する方法(Seo et al. J. Immunol. 1997. 158: 1895-1901)。分離されたヒト白血球は直ちに使用された。
ヘキサペプチドライブラリーを、Peptide Library Support Facility of Pohang University of Science and Technologyで製造した(Baek et al., J. Biol. Chem. 1996. 271: 8170-8175、前記文献は本明細書にて参照として引用される)。最後に、114ペプチドプール(Cysはライブラリー製造から除外される)を各々水に溶解して、最終濃度がペプチド当り27nMになるようにした。前記ペプチドを固体相法によって合成した(Baek et al. J. Biol. Chem. 1996. 271: 8170-8175)。簡単に説明すれば、ペプチドをRapidamide支持体樹脂上で合成し、標準Fmoc/t-butyl技術で酸−分解性リンカー上に組立てられるようにした。前記ペプチド組成物は、アミノ酸分析法によって確認した(Baek et al. J. Biol. Chem. 1996. 271: 8170-8175)。
PS−SPCLsを初期にスクリーニングするために、各ペプチドプールのAA放出の活性化特性を測定した。95%の空気と5%のCO2が供給される加湿培養器において、10%のFBSを含むRPMI 1640培地内の0.5μCi/mlの(3H)−AAにより、37℃で90分間培養されたdHL60細胞(107cells/ml)を予め標識化した(Bae et al. J. Immunol. 2000. 164: 4089-4096)。標識された細胞を無血清RPMI 1640で二回洗浄し、脂肪酸を含有しない0.1%のBSAを含有するRPMI 1640培地で37℃で15分間培養した。培地を除去した後、前記細胞を多様な濃度のペプチドで一定の時間の間活性化させた。培地内の、及び収集された細胞の放射性は、液体閃光計数器で測定した。阻害剤の効果の測定時には、活性化の前に細胞を一定の濃度の各々の阻害剤又はビークルと共に15分間予め培養した。
[Ca2+]iの水準を、fura−2/AMを利用するGrynkiewicz方法を利用して測定した(Grynkiewicz et al. J. Biol. Chem. 1985. 260: 3440-3550)。簡単に説明すれば、製造された細胞を無血清RPMI 1640培地で継続して攪拌しながら、37℃で50分間、3μMのfura−2/AMと共に培養した。2×106の細胞を、Ca2+のないLocke溶液(154 mM NaCl, 5.6 mM KCl, 1.2 mM MgCl2, 5 mM HEPES, pH 7.3, 10 mM glucose, and 0.2 mM EGTA)に入れ、この細胞の蛍光変化を340nm及び380nmの二重励起波長で測定し、計算された蛍光比率で[Ca2+]iに換算した。
マイクロタイター(microtiter)96−ウエルプレートELISA判読機(Bio-Tekinstruments, EL312e, Winooski, VT)を利用し、シトクロムc還元を測定することによって超酸化物陰イオン生成を測定した(Bae et al. Blood. 2001. 97: 2854-2862)。ヒト好中球(96−ウエルプレートの各ウエル当り1×106細胞/100μlのRPMI 1640培地)を50μMのシトクロムcと37℃で1分間予め培養し、一定の濃度のペプチドを加えて培養した。超酸化物生成は、1分間隔で5分間、550nmで光吸収の変化から決定した。
化学走性分析は多重ウエルチャンバー(Neuroprobe Inc., Gaithersburg, MD)を利用して実施した(Bae et al. Blood. 2001. 97: 2854-2862)。簡単に説明すれば、製造された単核球を1×106細胞/mlの濃度でRPMIに懸濁した。その後、25μlの懸濁液を5μMのポリヒドロカーボンフィルター(必要に応じて好中球である場合には、ポリビニルピロリドンがコーティングされていない3μMの気孔大きさを有するもの)によって、下部ウエルのペプチド又はN−ホルミル−メチオニル−ロイシル−フェニルアラニン(fMLF)から分離されたチャンバーの上部ウエルに位置させた。2時間(好中球である場合90分)37℃で培養した後、移動しない細胞をスクレーピングして除去し、フィルターを通過して移動した細胞を脱水し、固定した後、ヘマトキシリン(Sigma, St. Louis, MO)で染色した。染色された細胞を、5個の無作為に選択された高出力電界(HPF)(400X)で計数した(Bae et al. Blood. 2001. 97: 2854-2862)。
[実施例9.1−dHL60細胞内でAA放出を活性化するペプチドの同定]
dHL60細胞内でAA放出を活性化するペプチドを同定するために、ヘキサペプチドPS−SPCLsから114ペプチドプール(約4700万個の互いに異なるペプチド)をスクリーニングした。図1は、初期スクリーニングの結果を示す。ヘキサペプチドの互いに異なる位置にあるアミノ酸は互いに異なる水準のAA放出活性を誘導した。大部分の活性ペプチド/位置の組合わせはXKXXXM(配列番号:1)であることが確認された。ここで、第1位置はLys(K)、Met(M)、又はArg(R)であり、第2位置はLys(K)であり、3番目位置はHis(H)、Lys(K)、又はTyr(Y)であり、第4位置はHis(H)、Lys(K)、又はTyr(Y)であり、第5位置はLys(K)、Pro(P)、Arg(R)、Val(V)、又はTyr(Y)であり、第6位置はMetである。
PLA2のイソ形態がペプチド誘導されたAA放出に関与することを調べるために、いくつかのPLA2のイソ形態−特異的阻害剤をいくつかの代表的なペプチドと共に添加した。1μM濃度である場合、dHL60細胞内でAA放出を活性化することが確認された(図3)。cPLA2−特異的阻害剤、AACOCF3及びMAFPでこれら細胞を予め処理すれば、4個のペプチド、P14、P18、P21、及びP24によってAA誘導を遮断することが確認された(図3)。10μMのMAFP又はAACOCF3は、ほぼ4個のペプチドによって誘導された通りにAA放出をほぼ完全に遮断したが、他のPLA2阻害剤、BELは、iPLA2に特異的ものと知られているが、これはペプチド−誘導されたAA放出を阻害しないことが確認された(図3)。これらペプチドによるAA活性化した放出はまた、細胞内のCa2+とBAPTA/AMのキレート形成によって阻害される。これは、cPLA2活性化の特性を維持するものとなることである(データは示していない)。このような結果は、4個のペプチドがdHL60細胞内で、iPLA2でないcPLA2を活性化することによってAA放出を誘導することを示す。
細胞内カルシウムの増加はcPLA2の活性化に必須ということはよく知られている(Gijon et al. J. Leukoc. Biol. 1999. 65: 330-336)。dHL60細胞をcPLA2阻害剤、MAFPと共に予め培養することによってペプチド−活性化されたAA放出が阻害されるという事実より、前記ペプチドが[Ca2+]iの増加に影響を与えるか否かについて調査した。表IIに記載されたように、P1及びP7のようないくつかのペプチドは[Ca2+]iの増加に影響を与えなかったが、多くのペプチドが、dHL60細胞内で1μMで活性化させれば[Ca2+]iの増加を誘発することが確認された(表II)。ペプチド−誘導された[Ca2+]iの増加の濃度依存性を調査した。P3、P4、P5、及びP6は、20μMを超える濃度で最大活性を示した(データは示していない)、P10、P11、P12、P16、P17、P18、P22、P23、及びP24は、約3μMで最大活性を示した(データは示していない)。多くの細胞外リガンドは、ヒト白血球細胞でPTX−感受性G−蛋白質を通じて細胞活性を調節するという多くの報告がある(Sano et al. J. Immunol. 2000. 165: 2156-2164; Badolato et al. J. Immunol. 1995. 155: 4004-4010)。ペプチド−誘導された[Ca2+]iの増加にPTX−感受性G−蛋白質が関与するという可能性を調査するために、各々の24個のペプチドを添加する前に、dHL60細胞をPTX(150ng/ml)で20時間の間処理した。図4に示されているように、各々の活性ペプチド−誘導された[Ca2+]iの増加は、PTXによってほとんど完全に阻害された。PTX−感受性G−蛋白質−結合された受容体に作用しないリガンドであるATPは、dHL60細胞内で[Ca2+]iの増加を活性化し、この[Ca2+]iの増加はPTXによって阻害されなかった(図4)。このような結果は、前記ペプチドがdHL60細胞内でPTX−感受性G−蛋白質を通じて[Ca2+]i放出を活性化することを示している。
合成されたペプチドが好中球−類似dHL60細胞を活性化させるので、白血球の一種である好中球に与える効果を調査した。ペプチドの一種であるP24で好中球を活性化させれば、[Ca2+]iが増加することが確認された(図5)。単核球及びU937細胞をP24によって活性化した(図5)。しかし、Raw264.7及びJurkat細胞はP24によって活性化しなかった(図5)。その後、いくつかの非−白血球細胞株で[Ca2+]iの増加に与えるP24の効果を測定した。しかし、3Y1、PC12、NCI−H292、及びHUVEC細胞株は、[Ca2+]iの増加の側面からはP24に対して反応しなかった(図5、データは示していない)。このような結果は、前記ペプチド効果が好中球及び単核球に対して特異性を有することを示す。他の活性ペプチドは、白血球−特異性面で類似な結果を示した(データは示していない)。
超酸化物生成は、食細胞による宿主の防御メカニズムにおける重要な段階のうちの一つである(Lambeth et al. J. Bioenerg. Biomembr. 1988. 20: 709-733)。4個の代表的なペプチド(P14、P17、P21、及びP24)がヒト好中球での超酸化物生成に与える効果を実験した。これら4個のペプチドは、ヒト好中球で濃度依存的な方法で超酸化物生成を活性化させることが確認された(データは示していない)。さらに、1μMの各々のペプチドでヒト好中球を活性化させると、超酸化物生成の際に激しい変化を誘発することが確認された(表III)。P24は、ヒト好中球で超酸化物の生成が最も強力であった(表III)。
4個のペプチド(P14、P18、P21、及びP24)は超酸化物生成を活性化させ、ヒト食細胞で[Ca2+]iが増加した。これらペプチド−誘導された食細胞活性化現象は、化学走性−誘導される現象と類似している。したがって、前記ペプチドがヒト単核球又は好中球に与える化学走性活性を示すかどうかを調査した。4個の活性ペプチドは、1−10μMの濃度範囲を越える場合に、ヒト好中球の移動を誘導した(図6A)。前記ペプチドによって調節される最大細胞移動−誘導活性は、1μMのfMLFによって誘導される活性に比べて200%以上高かった(図6A)。前記4個のペプチド(P14、P18、P21、及びP24)はまた、ヒト単核球で細胞化学走性を誘導した(図6B)。さらに、前記4個のペプチドは、0.01〜10μMで単核球化学走性を誘導した(図6B)。不活性対照部ペプチドであるLFMYHP(配列番号:36)は、10μMより低い濃度において好中球又は単核球で細胞化学走性を誘導しなかった(図6A及び図6B)。互いに独立的に調製された白血球を利用した4個の実験で、前記4個のペプチドは類似な細胞移動−誘導活性を示した。
ペプチド誘導された食細胞活性化は、化学走性物質によって誘導されるのと非常に類似していることが確認された。ホルミルペプチド受容体、FPR、及びFPRL1は、好中球で化学走性受容体としてよく知られている(Le et al. Immunol. Rev. 2000. 177: 185-194; Le et al. Cytokine Growth Factor Rev. 2001. 12: 91-105)。前記ペプチドがFPR又はFPRL1に結合したかどうかを調査するために、FPR−又はFPRL1−発現RBL−2H3細胞で[Ca2+]iの増加に与えるペプチドの効果を調査した。いかなるペプチドも、FPR−発現RBL−2H3細胞で[Ca2+]iに影響を与えないことが確認された(データは示していない)。しかし、前記4個のペプチド(P14、P18、P21、及びP24)を含むいくつかのペプチドは、FPRL1−発現RBL−2H3細胞でカルシウム増加を誘導した(図7、データは示していない)。不活性対照部ペプチド(LFMYHP(配列番号:36))は、FPRL1細胞でカルシウム増加を誘導できないことが確認された(図7)。活性ペプチドの中で、カルシウム増加活性効果は各々のペプチドに対して互いに異なることが確認された。これらの結果は、前記4個のペプチド(P14、P18、P21、及びP24)を含むいくつかのペプチドが、FPRでないFPRL1に対するリガンドであることを示す。
図5は、前記ペプチドが白血球細胞には作用するが、非−白血球細胞には作用しないことを示す。多くの細胞内リガンドは細胞分化状態特異性を見せることが報告されている(Rabin et al. J. Immunol. 1999. 162: 3840-3850; Berardi et al. Blood. 1995. 86: 2123-2129)。分化されていないHL60細胞及び分化されたHL60細胞内で前記ペプチドが[Ca2+]iの増加に与える効果を調査することにより、前記ペプチドが骨髄球でこのような分化状態特異性を見せるかどうかを調査した。表IIに記載されたように、前記4個のペプチドは、dHL60細胞内で[Ca2+]iの増加を活性化させた。未分化のHL60細胞を前記4個のペプチドで活性化させた場合、[Ca2+]iがP18及びP24によって急激に誘導されることが確認された(図8)。他の2個のペプチド、P14及びP21は、HL60細胞内で[Ca2+]iの増加に影響を与えなかった(図8)。好中球又はdHL60細胞とは異なって、未分化のHL60細胞は、細胞表面でFPR又はFPRL1を発現しなかった(Prossnitz et al. J. Immunol. 1993. 151: 5704-5715)。また、fMLF(FPR−特異なリガンド)又はリポキシン(lipoxinA4)(FPRL1−特異的なリガンド)は、HL60細胞内で[Ca2+]iの増加に影響を与えなかった。これは、HL60細胞はFPR又はFPRL1を発現させないということを示す。このような結果は、FPRL1を除いた受容体は、ペプチドP18及びP24によって活性化されるということを提示する。しかも、P14及びP21は、dHL60細胞及びFPRL1−発現RBL−2H3細胞を活性化させた。これは2個のペプチドが分化状態特異性を示すということを意味する。
細胞内で信号調節された蛋白質キナーゼ(ERK)は、多様な細胞内反応に関与するよく知られた細胞内酵素である(Sugden et al. Cell Signal. 1997. 9: 337-351)。化学走性物質はERK活性を活性化させ、これは白血球細胞の調節でいくつかの重要な段階になることができるという多くの報告がある(Woo et al. J. Biol. Chem. 2002. 277: 8572-8578; Brill et al. J. Immunol. 2001. 166: 7121-7127)。最近の研究で本発明者等は、dHL60細胞を4個のペプチド(P14、P18、P21、及びP24)で活性化させればERKのリン酸化水準が急激に増加するを見出した(図9)。しかも、これらペプチド誘導されたERK活性化は時間依存的であり、活性化後の5分になった時点で最大活性を示した(データは示していない)。これら4個のペプチドに係った細胞内シグナル伝達を比較するために、dHL60細胞をLY294002(50μM)、GF109203X(5μM)、又はPD98059(50μM)で予め処理したり、対照部として未処理のままの状態にした。一定の期間の間(LY294002及びGF109203Xに対して15分、PD98059に対し60分)培養した後、細胞を5分間各々のPEBPEIDE1μMで活性化した。図9に示されているように、P14−誘導されたERKリン酸化は、LY294002、GF109203X、又はPD98059によって遮断され、これは、ペプチド−誘導されたERK活性化は、ホスファチジルイノシトール−3−キナーゼ(PI−3K)、蛋白質キナーゼC(PKC)、又はMEK−依存的ということを示しているものである。P18−誘導されたERKリン酸化はGF109203Xによって完全に遮断されるが、LY294002によっては遮断されない(図9)。PD98059は、P18−誘導されたERKリン酸化を部分的に遮断した(図9)。P21はまた、PI3K及びMEK−依存性を見せるERKリン酸化を誘発させた(図9)。P24−誘導されたERKリン酸化は部分的にLY294002によって遮断されたが、GF109203Xによっては遮断されなかった(図9)。このような結果は、4個のペプチドが重なったり重ならない細胞内信号経路を活性化させて、結果的にdHL60細胞内でERK活性化させるということを暗示する。
Claims (18)
- 配列番号:18、配列番号:19、配列番号:20、配列番号:21、配列番号:22、配列番号:23、配列番号:24、配列番号:25、配列番号:26、配列番号:27、配列番号:28、又は配列番号:29からなるポリペプチドからなる群より選択されるポリペプチド。
- 請求項1に記載のポリペプチドに特異的に結合する抗体。
- 単クローン抗体である、請求項2に記載の抗体。
- 請求項1に記載のポリペプチドをエンコードする、分離された核酸。
- 請求項4に記載の核酸を含む発現ベクター。
- 請求項5に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
- 標的細胞でアラキドン酸の生成を誘導するアラキドン酸生成誘導方法であって、
(a)プロモーターに連結された請求項1に記載のポリペプチドをエンコードするDNAを含む、組換えウイルス又はプラスミドベクターを生成する段階;
(b)前記組換えウイルス又はプラスミドベクターを必要とする哺乳類(ヒトを除く)に投与して、前記標的細胞での前記DNAの発現がアラキドン酸を生成させる段階;
を含むアラキドン酸生成誘導方法。 - 前記標的細胞は白血球又は食細胞である、請求項7に記載のアラキドン酸生成誘導方法。
- 請求項1に記載のポリペプチドと標的細胞を接触させる段階を含む、前記標的細胞でアラキドン酸の生成を誘導するアラキドン酸生成誘導方法(ヒト生体内で処理を行うことを除く)。
- 前記標的細胞は白血球又は食細胞である、請求項9に記載のアラキドン酸生成誘導方法。
- 請求項1に記載のポリペプチドと標的細胞を接触させる段階を含む、前記標的細胞でPLA2を活性化するPLA2活性化方法(ヒト生体内で処理を行うことを除く)。
- 前記PLA2はc PLA2である、請求項11に記載のPLA2活性化方法。
- 前記標的細胞は白血球又は食細胞である、請求項11に記載のPLA2活性化方法。
- 請求項1に記載のポリペプチドと標的細胞を接触させる段階を含む、前記標的細胞で超酸化物を生成させる超酸化物生成方法(ヒト生体内で処理を行うことを除く)。
- 前記標的細胞は白血球又は食細胞である、請求項14に記載の超酸化物生成方法。
- 請求項1に記載のポリペプチドと標的細胞を接触させる段階を含む、前記標的細胞の移動を誘導する標的細胞移動誘導方法(ヒト生体内で処理を行うことを除く)。
- 前記標的細胞はFPRL1を発現するものである、請求項16に記載の標的細胞移動誘導方法。
- 前記標的細胞はFPRを発現しないものである、請求項17に記載の標的細胞移動誘導方法。
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