JPH05252961A

JPH05252961A - ヒトカテプシンｅの製造法

Info

Publication number: JPH05252961A
Application number: JP4229374A
Authority: JP
Inventors: Hitoshi Hori; 比斗志堀; Tamami Takahashi; 玉美高橋; Takeshi Azuma; 健東; Takao Matsuba; 隆雄松葉; Masayuki Yamada; 正幸山田
Original assignee: Tosoh Corp
Current assignee: Tosoh Corp
Priority date: 1991-08-06
Filing date: 1992-08-06
Publication date: 1993-10-05

Abstract

(57)【要約】【目的】ヒトカテプシンＥの二量体又は単量体を遺伝子
工学的手法を使用して大量に製造する。【構成】ヒトカテプシンＥを暗号化するｃＤＮＡ及びプ
ロモ−タ−を含むベクタ−を構築し、適当な宿主を形質
転換し、この形質転換宿主を培養することにより、上記
目的を達成する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、ヒトカテプシンＥ（以
下ｈＣＴＳＥという）の製造法に関するものであり、詳
しくは遺伝子工学的手法を用いたｈＣＴＳＥの製造法に
関するものである。また本発明は、遺伝子工学的なｈＣ
ＴＳＥの製造に使用する、発現ベクタ−又は形質転換宿
主に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】カテプシンＥ（ＣＴＳＥ）は、胃粘膜上
皮、骨髄、肺等の臓器を構成する細胞内部に局在する、
酸性プロテア−ゼ類に分類される蛋白質分解酵素であ
り、生理作用は解明されていないものの、臓器特異的な
局在様式や癌化した細胞での局在の変化等（T.Sakuら、
Gut 、31巻、p1250 、1990年）から、胃癌や膵臓癌を含
む癌や膵炎等の炎症のマ−カ−等として注目されてい
る。

【０００３】ＣＴＳＥのような、生体内含有量となんら
かの疾患が関連付けられ、これを測定することが疾患の
早期発見を可能にすると考えられる生理活性物質では、
高感度の生体内含有量測定系をまず開発して、その相関
等を詳細に研究する必要がある。生体内に存在する生理
活性物質を高感度に測定する方法として、抗体等の免疫
因子を利用した免疫測定法がある。

【０００４】サンドイッチ免疫測定法に代表される酵素
免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）では、例えば測定対象である
生理活性物質を認識する抗体を使用して当該対象を試料
から分離し、更に対象を認識する抗体であって、測定可
能な標識物質と結合した抗体を接触させて（抗体）−
（対象）−（抗体）（標識物質）からなる免疫複合体を
形成し、この標識物質を定量する。そして得られた結果
を、既知濃度の対象について同様の操作を行った場合の
結果から導かれる検量線等と比較することで、試料中の
対象の濃度を知るのである。

【０００５】以上のような免疫測定法をＣＴＳＥの測定
系として構築するには、ＣＴＳＥを認識する抗体及び検
量線を作成する必要がある。

【０００６】ところで、ｈＣＴＳＥは生体から分子量約
８万の二量体として単離・精製される（Takeda Mら、J.
Biochem.100,p1269,1986年）が、人工的に単量体にされ
ても酵素活性を発現し得る酵素である。この事実は、生
体内で生理作用を担うｈＣＴＳＥが二量体として存在す
るばかりでなく、単量体として存在する可能性を示して
いる。このためｈＣＴＳＥ測定系の構築にあたっては、
二量体はもちろん、単量体をも測定し得る測定系を構築
することが望まれる。

【０００７】ＣＴＳＥを認識する抗体は、ＣＴＳＥを適
当な動物に免疫する等すれば調製できるが、特にモノク
ロ−ナル抗体等を効率良く取得しようとする場合には、
高純度に精製されたＣＴＳＥを使用する必要がある。ま
た検量線を作成するには高純度に精製されたＣＴＳＥを
使用することが必要である。

【０００８】前記したように、二量体又は単量体のＣＴ
ＳＥに対する測定系を構築するに当たっては、二量体、
単量体又は前駆体を同様に認識し又は区別して認識でき
る抗体や、二量体、単量体又は前駆体ｈＣＴＳＥに関す
る検量線が必要になる。

【０００９】

【従来技術の課題】二量体又は単量体ｈＣＴＳＥを認識
する抗体を調製し、それらの測定に必要な検量線を作成
するには、高純度の二量体又は単量体ｈＣＴＳＥを使用
する必要がある。

【００１０】従来、ｈＣＴＳＥは生体から単離・精製さ
れているがその量は微量であり、抗体を調製し、又は検
量線を作成するには不足している。しかも、単離・精製
されたｈＣＴＳＥは全て二量体であり、単量体のｈＣＴ
ＳＥを認識する抗体を調製したり、それらに関する検量
線を作成することはできないという課題がある。単離・
精製された二量体ｈＣＴＳＥから人工的に単量体ｈＣＴ
ＳＥを製造することは可能であるが、この操作ではｈＣ
ＴＳＥを変性させることが必要であり、生体内で自然に
製造された単量体ｈＣＴＳＥとの同一性に疑問が残る。

【００１１】従来、ｈＣＴＳＥを暗号化するｃＤＮＡ及
びそれから推測されるｈＣＴＳＥの一次構造が知られて
いる（東ら、J.Biol.Chem.264,p16748,1989 年）。しか
しながら、このｃＤＮＡを用いてｈＣＴＳＥを大量に製
造したとの報告はなく、またこのｃＤＮＡを用いること
で単量体ｈＣＴＳＥが製造できるか否かについても不明
である。

【００１２】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、免疫測定
法によりｈＣＴＳＥを測定する測定系を構築する過程に
おいて、それを暗号化するｃＤＮＡを用いることで二量
体又は単量体ｈＣＴＳＥを製造できることを見出し、こ
れらを使用して二量体又は単量体ｈＣＴＳＥを区別して
認識するモノクロ−ナル抗体や、二量体及び単量体ｈＣ
ＴＳＥを認識できる抗体を製造できることを見出した。

【００１３】本発明は、ｈＣＴＳＥ又はその誘導体を暗
号化するＤＮＡ及びそれを発現するためのプロモ−タ−
を含む発現ベクタ−であり、この発現ベクタ−で形質転
換された宿主である。また本発明は、前記宿主を培養す
ることを特徴とする、ｈＣＴＳＥの製造法であり、更に
前記宿主を培養することを特徴とする、ヒトカテプシン
Ｅ単量体の製造法である。以下本発明を詳細に説明す
る。

【００１４】ｈＣＴＳＥを暗号化するｃＤＮＡは、例え
ば推測されるｈＣＴＳＥの一次構造（J.Biol.Chem.264,
p16748,1989 年）を参照してＤＮＡプロ−ブを作製し、
例えばgastoric adenocarcinoma 等のヒト胃に由来する
細胞で製造されたｍＲＮＡからｈＣＴＳＥ暗号化するｍ
ＲＮＡを抽出し、これを鋳型として調製することができ
る。また例えば、ｃＤＮＡの塩基配列（J.Biol.Chem.26
4,p16748,1989 年）を参照し、これをいくつかの部分に
分割して化学合成し、後に結合させる等して調製すれば
良い。なおｈＣＴＳＥを暗号化するｃＤＮＡは、例えば
J.Biol.Chem.264,p16748,1989 年の記載と同一の塩基配
列である必要はなく、例えば暗号化するアミノ酸残基に
変化を与えない範囲でコドンが異なっていたり、又は塩
基の一部が削除されたり、本来存在しない塩基が挿入さ
れたものであっても、ｈＣＴＳＥ活性を有するか、ある
いは免疫原として使用した場合にｈＣＴＳＥを特異的に
認識する抗体を誘導でき、またはｈＣＴＳＥに対する抗
体と免疫反応を生じる蛋白質を発現するものであれば制
限はない。

【００１５】また特に、より認識部位が明確な抗体を製
造するうえでは、例えば部分的なｈＣＴＳＥを使用する
ことが望ましい。

【００１６】本発明のベクタ−は、前記のｈＣＴＳＥを
暗号化するｃＤＮＡの他に、少なくともこのｃＤＮＡを
発現させるためのプロモ−タ−を有するベクタ−であ
る。プロモ−タ−は、選択する宿主との関係において適
宜決定すれば良いが、一例を述べれば、大腸菌を宿主と
する場合には乳糖（ｌａｃ）プロモ−タ−、トリプトフ
ァン（ｔｒｐ）プロモ−タ−、タック（ｔａｃ）プロモ
−タ−が好ましいプロモ−タ−として例示でき、ＣＨＯ
又はＣＯＳ細胞等の動物細胞を宿主として使用する場合
には、ＳＶ４０プロモ−タ−、アデノウイルスプロモ−
タ−、メタチオネインプロモ−タ−が好ましいプロモ−
タ−として例示できる。

【００１７】本発明のベクタ−は、更に自己増殖のため
の複製開始点、形質転換細胞の選択を簡単にするための
薬剤耐性遺伝子、宿主細胞のＨｉｓ合成遺伝子の変異を
相補するＨｉｓ４遺伝子、遺伝子数増幅のためのｄｈｆ
ｒ遺伝子、ｈＣＴＳＥのｍＲＮＡへのポリアデニレ−シ
ョンシグナル配列、ｈＣＴＳＥｃＤＮＡの転写をタ−ミ
ネ−トするためのタ−ミネ−タ−等の塩基配列を有して
いることが好ましい。ここで好適な宿主であるＣＨＯ又
はＣＯＳ細胞等の動物細胞を使用する場合のベクタ−に
ついて述べれば、プロモ−タ−としてＳＶ４０プロモ−
タ−を有し、宿主染色体に組み込まれたｈＣＴＳＥ遺伝
子のコピ−数を増幅するためのｄｈｆｒ遺伝子を有し、
複製開始点としてＳＶ４０複製開始点を有するものを例
示することができる。また、特にｈＣＴＳＥの分泌発現
について好適な宿主であるピキア酵母を使用する場合の
ベクタ−については、プロモ−タ−としてアルコ−ルオ
キシダ−ゼプロモ−タ−を有し、薬剤耐性遺伝子、宿主
細胞のＨｉｓ合成遺伝子の変異を相補するＨｉｓ４遺伝
子、複製開始点を有するものを例示できる。なお本発明
のベクタ−はプラスミドであることが、その大腸菌内で
の増殖等の面において好ましい。

【００１８】宿主として使用する細胞に特別の制限はな
いが、立体構造を有し、体内で自然に製造されたｈＣＴ
ＳＥと同様の糖鎖が付加されたｈＣＴＳＥを製造するた
めには、ＣＨＯ細胞やＣＯＳ細胞等の動物細胞を使用す
ると良い。またｈＣＴＳＥの分泌発現を目的とする場合
には、ピキア酵母等の酵母を宿主として使用することが
好ましい。なお、製造したｈＣＴＳＥを細胞内部に蓄積
したり、活性を発現し得ない立体構造に折り畳まれた形
で発現するような宿主を使用した場合には、例えば特開
昭５９−１６１３２１号に記載されたようなリフォ−ル
ディング操作を行えば良い。

【００１９】ｈＣＴＳＥを暗号化するｃＤＮＡを含むベ
クタ−で宿主を形質転換する操作及び形質転換された宿
主を培養する操作は、通常の方法に従って行えば良い。
宿主としては前述の通り、例えばＫ−１２等の大腸菌、
枯草菌、酵母等を使用すれば良いが、製造されたｈＣＴ
ＳＥの回収等を簡単にする目的では、特にピキア酵母等
の酵母を使用することが好ましい。特にピキア酵母を使
用した場合には、通常は細胞質内に留まって細胞外に分
泌されない（Samloff I.M.ら、Gastroenterology、93
巻、p77 、1987年）ｈＣＴＳＥを細胞外に分泌発現させ
ることができる。従ってピキア酵母でｈＣＴＳＥを製造
した場合には、その培養上清から簡単にｈＣＴＳＥを精
製できる。そして、ｈＣＤＮＡを暗号化するｃＤＮＡを
発現させる操作は、ベクタ−に含まれるプロモ−タ−を
活性化することにより、適宜行えば良い。即ち、タック
プロモ−タ−等の、誘導物質が存在した場合に構造遺伝
子を発現させる性質を有するプロモ−タ−を使用した場
合には当該誘導物質を培養液に添加してやれば良く、ま
た例えばＳＶ４０プロモ−タ−等の、動物細胞に導入し
た場合に構造遺伝子を発現させる性質を有するプロモ−
タ−を使用した場合には、前記したような宿主動物細胞
に導入するだけで良い。

【００２０】上記のように、ｈＣＴＳＥを暗号化するｃ
ＤＮＡを含むベクタ−で形質転換した宿主細胞を培養
し、ベクタ−中のプロモ−タ−を発現させることによ
り、二量体又は単量体ｈＣＴＳＥを製造することができ
る。主として二量体ｈＣＴＳＥを製造する場合には、プ
ロモ−タ−を発現させた後、適当期間してからｈＣＴＳ
Ｅを回収すれば良く、主として単量体ｈＣＴＳＥを製造
する場合にはプロモ−タ−を発現させた後、短期間のう
ちにｈＣＴＳＥを回収すれば良い。

【００２１】培養液等からｈＣＴＳＥを回収する操作
は、例えば製造されたｈＣＴＳＥが細胞内部に蓄積され
た場合には、細胞を破砕した後に通常の精製操作等を行
えば良く、またこのとき発現されたｈＣＴＳＥが活性を
発現し得ない立体構造に折り畳まれていた場合には、前
記したようなリフォ−ルディング操作を行って活性を発
現し得る立体構造のｈＣＴＳＥを取得すれば良い。ＣＯ
Ｓ細胞やＣＨＯ細胞では、活性を発現し得るｈＣＴＳＥ
が製造されるから、単にこれを回収するだけで良い。特
にピキア酵母のように、細胞内又は培養液中に製造され
たｈＣＴＳＥを放出するものであれば、通常の、例えば
高速液体クロマトグラフィ−等の手法を用いて培養上清
から回収、精製するだけで良い。

【００２２】

【実施例】以下に本発明を更に詳細に説明するために実
施例を記載するが、本発明はこれら実施例に限定される
ものではない。

【００２３】実施例１ＣＨＯ細胞でのｈＣＴＳＥ製造
用プラスミドの調製ＣＨＯ細胞を宿主としてｈＣＴＳＥを製造する目的で、
ＣＨＯ細胞用発現プラスミド（ｐｈＣＴＳＥ−ｄｈｆ
ｒ）を調製した。まず全長ｈＣＴＳＥを暗号化するｃＤ
ＮＡを含むファ−ジベクタ−を、東ら（J.Biol.Chem.26
4,p16748,1989 年）に従って調製した。

【００２４】このファ−ジベクタ−をＥｃｏＲＩにて切
り出し、市販のプラスミド（ＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩ
ＩＳＫ⁺、ストラタジ−ン社製）のＥｃｏＲＩ部位に
挿入した。続いてこのプラスミドをＳｍａＩ及びＥｃｏ
ＲＶにて切断し、ｈＣＴＳＥを暗号化するｃＤＮＡ部分
及びＰｏｌｙ（Ａ）付加シグナルを含む、１．８ｋｂの
フラグメントを得た。

【００２５】以上のようにして得た１．８ｋｂのフラグ
メントを、動物細胞用発現ベクタ−であり、ｄｈｆｒ遺
伝子発現ユニットを含むプラスミド（ｐＥＣＥｄｈｆ
ｒ、特願平１−２７１８６５号）のＳｍａＩ部位にｈＣ
ＴＳＥが発現されるように組み込み方向を揃えて挿入
し、ｐｈＣＴＳＥ−ｄｈｆｒを得た。

【００２６】以上の工程を図１に示す。

【００２７】実施例２ｈＣＴＳＥを産生するＣＨＯ細
胞株の樹立実施例１のようにして調製したｐｈＣＴＳＥ−ｄｈｆｒ
を、Ｃｈｅｎらの方法（Mol.Cell.Biol.7,p2745,1987
年）に従って、ｄｈｆｒ遺伝子欠損ＣＨＯ細胞ＤＸＢ−
１１（G.Urlandら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA.,77,p421
6,1980 年）に導入し、メソトレキセ−トを含有するＤ
ＭＥ培地（ギブコ社製）で培養して形質転換細胞株を選
択した。

【００２８】生体より精製されたｈＣＴＳＥをウサギに
免疫して調製した抗ｈＣＴＳＥウサギ血清を使用して、
前記のようにして選択された細胞株から、ｈＣＴＳＥを
産生する細胞株を取得し、これをｈＣＥｄ４とした。

【００２９】実施例３ｈＣＴＳＥの製造実施例２のようにして調製されたｈＣＥｄ４を、１０％
の透析済ウシ胎児血清を含むＤＭＥ選択培地（Ｌ−グル
タミン、非必須アミノ酸混液、ペニシリン、ストレプト
マイシンを含む）にて２５ｃｍ²の培養フラスコに限界
密度まで増殖させた後、細胞をトリプシン処理して遊離
させ、回収した。この細胞に０．５％の界面活剤ノニデ
ットＰ−４０を含む生理食塩含有リン酸緩衝液（ｐＨ
７．４、以下、ＰＢＳという）を１００μｌ加えてボル
テックスミキサ−で攪拌し、細胞を可溶化させて遠心分
離に供し、その上清を採集してｈＣＴＳＥ溶液とした。

【００３０】実施例４製造されたｈＣＴＳＥの解析実施例３で得たｈＣＴＳＥ溶液を、１０％のＳＤＳ−ポ
リアクリルアミドゲルを用いた電気泳動にて展開した
後、ウエスタンブロット法により蛋白質をゲルからニト
ロセルロ−スフィルタ−に移行、吸着させた。

【００３１】実施例２で使用した抗ｈＣＴＳＥウサギ血
清と上記ニトロセルロ−スフィルタ−を接触させ、更に
ペルオキシダ−ゼと結合した抗ウサギＩｇＧ抗体（Ｂｉ
ｏ−Ｒａｄ社製）を添加した。フィルタ−を洗浄後、ペ
ルオキシダ−ゼの基質である４−クロロ−１ナフト−ル
を添加した。

【００３２】１０分後、前記基質のペルオキシダ−ゼに
よる分解物を測定した。その結果、前記したようにして
得られた蛋白質（ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて、二本のバ
ンドを示す）は、ｈＣＴＳＥウサギ血清と特異的反応す
る、ｈＣＴＳＥ二量体又はｈＣＴＳＥ単量体であること
が示された。

【００３３】本実施例における、ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結
果を図２に示す。これらの結果からは、実施例３で製造
されたｈＣＴＳＥ溶液中には、抗ｈＣＴＳＥウサギ血清
と特異的に反応する蛋白質、即ち純度の高いｈＣＴＳＥ
が大量に含まれていたことが分かる。

【００３４】実施例５単量体ｈＣＴＳＥの製造実施例３で得たｈＣＴＳＥ溶液を、酸性プロテア−ゼ阻
害剤であるペプスタチンをリガンドとするアフィニティ
クロマトグラフィ−で処理し、その吸着画分のうち、ｈ
ＣＴＳＥ酵素活性を有する低分子の画分を回収した。こ
の画分をコンナカバリンＡカラムクロマトグラフィ−で
処理したところ、吸着画分にｈＣＴＳＥ活性が確認され
た。以上の結果は、実施例３で製造されたｈＣＴＳＥが
糖鎖を有する糖蛋白質であることを示している。

【００３５】以上のようにして得た低分子ｈＣＴＳＥ画
分を、１０％のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルを用い
た電気泳動にて展開した。この結果、分子量約４万の蛋
白質のみが示された。

【００３６】実施例６ピキア酵母でのｈＣＴＳＥ製造
用プラスミドの調製ピキア酵母を宿主としてｈＣＴＳＥを製造するための発
現プラスミド（ｐＨＩＬ−Ｄ１ＣＴＳＥ）を調製し
た。まず全長ｈＣＴＳＥを暗号化するｃＤＮＡを含むフ
ァ−ジベクタ−を、東ら（J.Biol.Chem.264,p16748,198
9 年）に従って調製した．このファージベクターをＥｃ
ｏＲＩにて切り出し、市販のプラスミド（Bluescript I
I SK+ 、ストラタージン社製）のＥｃｏＲＩ部位に挿入
した。続いてこのプラスミドをＳｍａＩ及びＥｃｏＲＶ
にて切断し、ｈＣＴＳＥを暗号化するｃＤＮＡ部分及び
Ｐｏｌｙ（Ａ）付加シグナルを含む、１．８ｋｂのフラ
グメントを得た。

【００３７】以上のようにして得た１．８ｋｂのフラグ
メントを、ピキア酵母用発現ベクタ−であるｐＨＩＬ−
Ｄ１に導入した。まずｐＨＩＬ−Ｄ１のＥｃｏＲＩ部位
を切断後平滑末端にし、その部位に１．８ｋｂのフラグ
メントを挿入し、ｐＨＩＬ−Ｄ１ＣＴＳＥを得た。以
上の操作を図３に示す。

【００３８】実施例７形質転換体の作成 Pichia pastoris GTS115株から、Cregg J.M.らの方法
（Molc.Cell.Biol. 、5巻、p3376 、1985年）及び特開
平2-104290号に記載の方法に従ってスフェロプラストを
調製し、ＢｇｌＩＩによって線状化したｐＨＩＬ−Ｄ１
ＣＴＳＥで形質転換した。この形質転換菌を最小栄養
培地で培養し、ヒスチジン要求性を失った形質転換菌を
選別した。それらの中で、メタノール培地上での成育が
殆ど見られないクローンを選択した。この菌において
は、ｈＣＴＳＥを暗号化するｃＤＮＡ部分及びＰｏｌｙ
（Ａ）付加シグナルが、宿主のＡＯＸ遺伝子に置き換わ
っている。以下、ｐＨＩＬ−Ｄ１ＣＴＳＥによる形質
転換株をｍｕｔ- 株とする。

【００３９】なお、比較のためＢｇｌＩＩによって線状
化したｐＨＩＬ−Ｄ１にて形質転換したGTS115株も培養
し、以下実施例９及び１０で使用した。

【００４０】実施例８ｈＣＴＳＥの製造実施例７で得られたｍｕｔ- 株を１００ｍｌの１％グリ
セロール含有培地でＯＤ600 ＝１１〜２０となるまで３
０℃で振盪培養した後、菌体を０．８％メタノール含有
培地に移し、メタノールの濃度を０．２〜０．８％に保
ちながら１４４時間（６日間）培養した。培養物を遠心
操作により培養上清と菌体に分画し、上清をセントリコ
ン３０（アミコン社）で４０倍〜６０倍に濃縮した。菌
体についてはガラスビーズで破砕した後遠心分離してそ
の上清を集めた。

【００４１】実施例９製造されたｈＣＴＳＥの解析実施例８で得られた菌の培養上清濃縮液及び菌体破砕上
清を７．５％のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳
動で展開した後、ウエスタンブロッティング法により蛋
白質を膜（zeta−probe 膜、BioRad社製）に移行し吸着
させた。

【００４２】抗ｈＣＴＳＥウサギ血清と前記膜を接触さ
せ、更にビオチンと結合した抗ウサギＩｇＧ抗体を添加
した。膜を洗浄後、アルカリフォスファターゼが結合し
たアビジンを添加し、膜を洗浄後アルカリフォスファタ
ーゼの基質であるニトロブルーテトラゾリウムを添加し
て発色させ、数分後基質の分解物を測定した。その結
果、培養上清には抗ｈＣＴＳＥウサギ血清と特異的に反
応する蛋白、即ちｈＣＴＳＥ二量体とｈＣＴＳＥ単量体
に由来する二本のバンドが確認されたが、ｐＨＩＬ−Ｄ
１にて形質転換したGTS115株については、このようなバ
ンドは観察されなかった。

【００４３】実施例１０製造されたｈＣＴＳＥの解析実施例８で得られた培養上清濃縮液及び菌体破砕上清を
８％のポリアクリルアミドゲル電気泳動で展開した後、
泳動後のゲルを0.1 N 塩酸酸性条件下で0.67%ヘモグロ
ビン溶液に浸し20分間インキュベートした。ヘモグロビ
ン溶液を除去した後、0.1 N 塩酸溶液中で更に30分間イ
ンキュベートし、ＣＢＢ溶液でゲルを染色し、その後脱
色した。その結果、実施例８で得られた培養上清に分泌
している蛋白質はｈＣＴＳＥの酸性プロテアーゼ活性を
有することが示されたが、菌体破砕上清、ｐＨＩＬ−Ｄ
１にて形質転換したGTS115株の培養上清濃縮液及び菌体
破砕上清については、このようなｈＣＴＳＥのプロテア
−ゼ活性は観察されなかった。本実施例における結果を
図４に示す。

【００４４】

【発明の効果】本発明により、二量体又は単量体ｈＣＴ
ＳＥの遺伝子工学的製造法が提供される。これにより、
生体からは微量にしか分離・精製し得なかったｈＣＴＳ
Ｅを、二量体の形態は勿論、単量体の形態においても大
量に取得できる。

【００４５】このように本発明によれば、その局在様式
から重要な生理活性、生理作用を有すると推測されるも
のの、いまだに詳細は知られていないｈＣＴＳＥの研究
に有効な免疫測定法を実施するための材料を提供するも
のである。

【００４６】本発明で製造される二量体又は単量体ｈＣ
ＴＳＥは、アミノ酸一次構造に代表される免疫化学的性
質が生体内に存在するｈＣＴＳＥと同一である。従っ
て、生体より分離・精製され、更には人工的に単量体に
変性されたｈＣＴＳＥを使用して抗体等を調製すること
に比較して、より正確で高感度の免疫測定法を実施する
ための材料となり得る。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は本発明の実施例１で製造した、ｈＣＴＳ
ＥをＣＨＯ細胞で製造するための発現ベクタ−ｐｈＣＴ
ＳＥ４１２の構築の工程を示す図である。図中、ｐＡＧ
４１２、ｐＥＣＥ−ｄｈｆｒ又はｐｈＣＴＳＥ−ｄｈｆ
ｒは製造したベクタ−を示す。ｐｏｌｙＡはアデニレ−
ションシグナル配列を、ｏｒｉは複製開始点を、Ａｍｐ
Ｒはアンピシリン耐性遺伝子を、ＰＬはＳＶ４０後期プ
ロモ−タ−を、ＰＥはＳＶ４０初期プロモ−タ−を、ｄ
ｈｆｒはジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子をそれぞれ示す。
また、その他の記号は通常の遺伝子工学で使用されるの
と同様の意味で使用されている。

【図２】図２は本発明の実施例４における、ＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥの結果を示すものである。図中、左側の数字は分
子量マ−カ−を同様の条件下で展開して得られた結果を
示し、その数字はｋＤａを示している。図中、１の矢印
は低分子体ｈＣＴＳＥのバンド、即ち単量体ｈＣＴＳＥ
を、２の矢印は高分子体ｈＣＴＳＥのバンド、即ち二量
体ｈＣＴＳＥのバンドを示す。

【図３】図３は本実施例６の作業を示し、ピキア酵母発
現用プラスミドｐＨＩＬ−Ｄ１ＣＴＳＥの構築過程を示
す図である。図中ｐＡＧ−４１２、ｐＨＩＬ−Ｄ１ＣＴ
ＳＥは製造されたベクタ−を示している。ｐｏｌｙＡは
アデニレ−ションシグナル配列を、Ｏｒｉは複製開始点
を、Ａｐはアンピシリン耐性遺伝子を、５´ＡＯＸはＡ
ＯＸプロモ−タ−領域を、３´ＡＯＸはＡＯＸタ−ミネ
−タ−領域をＨＩＳ４はＧＴＳ１１５株に欠損している
ヒスチジン合成遺伝子を示す。またその他の記号は通常
の遺伝子工学で使用されるのと同様の意味を示す。

【図４】図４は本発明の実施例９におけるポリアクリル
アミドゲル電気泳動後のプロテア−ゼ活性測定結果を示
す。レーン１と２はそれぞれｐＨＩＬ−Ｄ１で形質転換
された菌の破砕上清と培養上清を、レ−ン３と４はそれ
ぞれｐＨＩＬ−Ｄ１ＣＴＳＥで形質転換された菌の菌
体破砕上清と培養上清の結果を示す。１の矢印は低分子
体ｈＣＴＳＥすなわち単量体ｈＣＴＳＥの活性の存在
を、２の矢印は高分子体ｈＣＴＳＥすなわち二量体ｈＣ
ＴＳＥの活性の存在を示す。なおそれぞれの非染色領域
は、ｈＣＴＳＥの酸性プロテア−ゼ活性によってヘモグ
ロビンが分解された結果、ＣＢＢで染色されなかったこ
とを示している。

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所Ｃ１２Ｎ 9/64 Ｚ 7823−4Ｂ //(Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｒ 1:84） (Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｎ 9/64 Ｃ１２Ｒ 1:84） (Ｃ１２Ｎ 9/64 Ｃ１２Ｒ 1:91）

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】ヒトカテプシンＥを暗号化するＤＮＡ及び
それを発現するためのプロモ−タ−を含む発現ベクタ
−。
【請求項２】請求項１項に記載の発現ベクタ−で形質転
換された宿主。
【請求項３】請求項２に記載の宿主を培養することを特
徴とする、ヒトカテプシンＥの製造法。
【請求項４】請求項２に記載の宿主を培養することを特
徴とする、ヒトカテプシンＥ単量体の製造法。
【請求項５】宿主が動物細胞である請求項３又は４に記
載のヒトカテプシンＥの製造法。
【請求項６】宿主がピキア酵母である請求項３又は４に
記載のヒトカテプシンＥの製造法。