WO2007069673A1 - 多剤耐性ブドウ球菌のイムノクロマトグラフィー検出法および診断キット - Google Patents

多剤耐性ブドウ球菌のイムノクロマトグラフィー検出法および診断キット Download PDF

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Hiromi Ito
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Denka Seiken Co., Ltd.
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    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/44—Multiple drug resistance

Definitions

  • the present invention relates to an immunochromatographic detection method and a kit using the same.
  • Staphylococcus includes more than 40 species, but clinically, Staphy lococcus aureus and S. staphylococci are less than eight CNS. Abbreviated). Staphylococcus aureus is treated as a pathogenic bacterium and CNS is treated as a non-pathogenic bacterium.
  • Antibiotics are used for the treatment of infectious diseases, but staphylococci are classified according to the presence or absence of clinical standpoint resistance, with many drug-resistant strains.
  • Methicillin-resistant Staphylococcus aureus is a j8 ratatum, including methicillin and other vecillin agents.
  • MRSA Methicillin-resistant Staphylococcus aureus
  • drugs such as aminoglycosides and macrolides are resistant to multi-drug. resistant Staphylococcus aureus).
  • Staphylococcus aureus that is sensitive to methicillin is called Methcillin-sensitive Staphylococcus aureus (hereinafter referred to as MSSA).
  • Staphylococcus aureus produces various toxins including enterotoxin, toxic shock syndrome toxin, hemolysin, and epidermal deprivation toxin (Non-patent Document 1), and its infection causes enteritis, pneumonia, dermatitis, It may cause organ failure and, if severe, may lead to death. Therefore, when Staphylococcus aureus is isolated from a patient, we know as soon as possible whether it is MRSA, and in the case of MRSA infection, select an appropriate drug such as vancomycin or arbekacin sulfate that is effective for MRSA. , It is necessary to administer.
  • staphylococci other than Staphylococcus aureus are resident bacteria and are usually non-pathogenic to healthy individuals.
  • an immunosuppressive agent is used as a countermeasure for postoperative infections in organ transplant patients, or when the immune system is weakened due to factors such as a decline in physical strength associated with aging.
  • staphylococci other than Staphylococcus aureus have acquired methicillin resistance and multidrug resistance even though they have acquired methicillin-resistant coagulase-negative staphylococci.
  • staphylococci (hereinafter referred to as fMRCNS), collectively called multi-drug resistant Coagulase—negative staphylococci.
  • fMRCNS multi-drug resistant Coagulase—negative staphylococci.
  • MRCNS is a medical problem because it limits the effective drugs for infection in susceptible individuals.
  • MRSA and MRCNS are collectively called multi-drug resistant staphylococci.
  • PBP1, PBP 2, PBP3, and PBP4 penicillin-binding proteins
  • PBP2 enzymes that crosslink murine, which is a constituent of the staphylococcal cell wall, and synthesize the cell wall.
  • PBP2 'as a new enzyme
  • PBP1-4 commonly possessed by staphylococci are inactivated by penicillin antibiotics, which are substrate analogs, as cell wall synthases, and the bacteria eventually die when cell wall synthesis is disabled.
  • MRSA and MRCNS are able to continue to proliferate by expressing a new cell wall synthase, PBP2 ', which has low affinity for j8 ratata antibiotics, that is, it is not inactivated, and replaces the role of cell wall synthesis. It is considered to be.
  • MRSA and MRCNS have acquired resistance mechanisms against other antibiotics and are mostly multidrug resistant, which makes them resistant to many antibiotics. They are simply treated as multidrug-resistant staphylococci, not as staphylococci that are resistant to ⁇ -ratata antibiotics.
  • a general staphylococcal isolation method ⁇ Judgment method uses a nasal tube, pharyngeal tube, sputum, blood, pus, feces, etc. as clinical specimens and separate culture using an agar medium or liquid agar medium.
  • the cultivated colony When cultured on an agar medium, the cultivated colony is suspected to be a cultivated colony. Identify staphylococci or Staphylococcus aureus by biochemical property tests. If cultured in a liquid medium, inoculate the culture medium into an agar medium for colony isolation and culture, and similarly identify the colonies suspected of staphylococci after pure culture.
  • Bacteria identified as Staphylococcus aureus or staphylococci are subjected to drug susceptibility testing, etc., and whether the test results are MRSA, MSSA, or MRCNS .
  • drug susceptibility tests a culture test method such as a dilution method or a disk sensitivity test is generally used. These drug susceptibility tests require a culture time of 16 to 24 hours (when combined with separation culture and pure culture, it takes more than 3 days to judge the separation of clinical specimens). It is known that there are differences in test results depending on the concentration of inoculum, culture temperature, medium composition or chemicals used, and technical skills are also required.
  • Radioimmunoassay requires the use of radioisotopes, the need for BF separation that separates antigen-antibody complexes from other unbound antigens or antibodies, and It is not practical from the viewpoint of daily examinations, such as the fact that the denaturing agent used for the extraction of antigens from the body is present in the reaction system and the measurement takes several hours.
  • the slide latex agglutination method detects false positives due to contaminating bacteria (for example, false positives due to non-specific reactions) and low sensitivity, so it can be detected from pure cultures. It is indispensable, and it takes 2 to 3 days to collect the sample, the cost of the medium for pure culture increases, and the determination time is as short as 3 minutes.
  • Patent Document 1 Japanese Patent No. 3638731
  • Non-Patent Literature 1 Hideo Igarashi: TSST— 1, Invasion and Immunity, 3, 3-10 (1994)
  • Non-Patent Literature 2 Utsui, Y., and Yokota, T .: Role of an altered penicillin- Dinding protei n in methicillin- and cephem— resistant Staphyloccus aureus., Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 28, 397-403 (1985)
  • the present invention detects the PBP2 specifically produced by the multidrug-resistant Staphylococcus spp.
  • a sensitive and simple method using an immunochromatographic test method to detect the infection of the multidrug-resistant staphylococci It is an object of the present invention to provide an immunochromatography detection apparatus capable of determining, a diagnostic method using the detection apparatus, and a diagnostic kit including the detection apparatus.
  • the present inventors have conducted intensive studies on a method for extracting and measuring PBP2 'simply and quickly without complicated operations of multidrug-resistant staphylococcus.
  • the inventors of the present invention can easily use an immunochromatography detection apparatus using a labeling reagent labeled with an antibody that specifically binds to PBP2 ′ and a capture reagent capable of specifically binding and capturing a complex of PBP2 ′ and the labeling reagent. After successful measurement, the sample was treated with an alkaline solution before being subjected to measurement, then neutralized, and then subjected to an immunochromatography detection device. It was found that can be extracted and measured.
  • the present inventors have provided a surfactant such as an amphoteric surfactant to the capture reagent site where the capture reagent of the immunochromatographic detection device is fixed, so that false positives do not occur.
  • a surfactant such as an amphoteric surfactant
  • a method for detecting a bacterium producing cell wall synthase PBP2 ' characterized in that cell wall synthase PBP2 is detected using an immunochromatographic detection method based on an antigen-antibody reaction.
  • the detection method of the microbe which produces cell wall synthase PBP2 ' is detected using an immunochromatographic detection method based on an antigen-antibody reaction.
  • [0018] Presumed to contain PBP2 'released from cell wall by pretreatment of specimen solution or specimen presumed to contain cell wall synthase PBP2' producing on sheet-like solid support Specimen supply site for supplying the solution, Labeling reagent site where the labeling reagent labeled with an antibody that specifically binds to PBP2 'is held on a solid support, and a complex of PBP2' and the labeling reagent
  • a method for detecting a bacterium that produces cell wall synthase PBP 2 'according to [1] comprising using an immunochromatography detection device comprising a capture reagent site on which a capture reagent capable of binding and capturing is immobilized.
  • [0021] [5] The cell wall synthesizing enzyme according to any one of [2] to [4], wherein the capture reagent site contains a zwitterionic surfactant, an anionic surfactant, and a Z or nonionic surfactant. Detection method for bacteria producing PBP2.
  • [0022] [6] A method for detecting a bacterium that produces a cell wall synthase PBP2 ′ according to any one of [2] to [5], wherein the capture reagent site contains a sulfobetaine-type surfactant.
  • [0023] Cell wall synthase A sample solution presumed to contain PBP2'-producing bacteria or a solution presumed to contain PBP2 'released from the cell wall by pretreatment of the sample is added to the sample supply site. [5] or [6] The method for detecting a bacterium producing cell wall synthase PBP2 'according to [5] or [6], wherein an anion having a large ionization tendency is added before supply. [0024] [8] The anion with a high ionization tendency produces one or more anions selected from the group consisting of chloride ion, bromide ion and iodide ion force [7] cell wall synthase PBP2 ' To detect bacteria.
  • the cation with a high ionization tendency is one or more cations selected from the group consisting of potassium ion, calcium ion, sodium ion and magnesium ion force.
  • [0031] [15] A method for detecting a bacterium that produces the cell wall synthase PBP2 'according to any one of [11] to [14], wherein the aqueous solution after alkali treatment is neutralized with a buffer solution.
  • a sample supply site for supplying a sample solution or a solution presumed to contain PBP2 'released from the cell wall by pretreatment of the sample, and a labeling reagent labeled with an antibody that specifically binds to PBP2' as a solid support Includes a labeling reagent site that is retained in such a way that it can be deployed, a capture reagent site that has immobilized a capture reagent that can specifically bind and capture the complex of PBP2 'and the labeling reagent, and a zwitterionic surfactant at the capture reagent site.
  • the anion with high ionization tendency is one or more anions selected from the group consisting of chloride ion, bromide ion and iodide ion force.
  • Cell wall synthase PBP 2 ' is produced. To detect bacteria.
  • [0042] Alkaline solution strength Alkali metal hydroxide or carbonate, alkaline earth metal A fungus detection kit that produces the cell wall synthase PBP2 'according to [25], which is an aqueous solution of the above-mentioned hydroxide or carbonate.
  • a bacteria detection kit that produces the cell wall synthase PBP2 'according to any one of [22] to [28], wherein the bacterium that produces the cell wall synthase PBP2' is multidrug-resistant staphylococci.
  • the immunochromatography detection apparatus of the present invention By using the immunochromatography detection apparatus of the present invention, it becomes possible to detect PBP2 'with high sensitivity, and thus it is possible to test the amount of bacteria in one colony after separation and culture. As a result, it is possible to determine whether it is MRSA or MRCN S by culturing once a day after separation from clinical specimens, and the time required for testing and the cost of the medium used for pure culture Can be greatly reduced.
  • the positive medium strength can be directly detected in blood (liquid) culture performed in MRSA bacteremia and sepsis tests, so the treatment period can be shortened by the early start of effective treatment.
  • FIG. 1 is a diagram showing an example of the detection apparatus of the present invention including a labeling reagent site.
  • FIG. 2 is a diagram showing an example of the detection apparatus of the present invention that does not include a labeling reagent site.
  • the present invention detects PBP2 'specifically present in bacteria producing cell wall synthase PBP2', such as multidrug-resistant staphylococci, with high sensitivity and ease by an immunochromatographic test method,
  • This is an immunochromatographic detection device and a diagnostic kit that can determine the infection of bacteria producing cell wall synthase PBP2 'such as multidrug resistant staphylococci.
  • the specimen in the present invention refers to a test material such as urine, pus, cerebrospinal fluid, secretion or puncture fluid from a suspect patient, blood agar medium, normal agar medium, heart infusion agar medium, brain heart infusion.
  • bacteria that produce cell wall synthase PBP2 ' contains bacteria that produce cell wall synthase PBP2 ', more specifically, a solution presumed to contain multidrug-resistant staphylococci. It also contains extracts presumed to contain PBP2 'released from the cell wall by pretreatment of these bacterial suspensions.
  • bacteria producing cell wall synthase PBP2 ′ include multidrug-resistant staphylococci
  • multidrug-resistant staphylococci include multidrug-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) and multidrug-resistant Includes coadalase negative staphylococci (MRCNS).
  • Samples are also obtained by directly suspending test materials such as urine, pus, cerebrospinal fluid, secretions, and puncture fluids directly in physiological saline or phosphate buffer.
  • test materials such as urine, pus, cerebrospinal fluid, secretions, and puncture fluids directly in physiological saline or phosphate buffer.
  • the immunochromatography detection device of the present invention is an immunochromatography test piece composed of a test piece, and is arranged and configured, for example, as shown in FIG.
  • Sample supply site 1 for supplying the sample on a sheet-like solid phase support, and labeled reagent site 2 for holding a labeling reagent labeled with an antibody that specifically binds to PBP2 'so that it can be developed on the solid phase support
  • a capture reagent site 3 on which a capture reagent capable of specifically binding and capturing the complex of PB P2 ′ and the labeling reagent is immobilized.
  • a mixture of a sample and a labeling reagent labeled with an antibody that specifically binds to PBP2 ′ may be supplied to the sample supply site 1, and in this case, the labeling reagent site 2 on the solid support is omitted. ( Figure 2).
  • Figure 2 When a mixture of a sample and a labeled reagent labeled with an antibody that specifically binds to PBP2 'is supplied to sample supply site 1, PBP2' and the labeled reagent contained in the sample are contacted in advance at the site separated from the solid support. To do.
  • the analyte and the labeling reagent come in contact with the solid phase support in advance means that the labeling reagent is not contained in the solid phase support in the immunochromatography detection device. Alternatively, it means that the liquid is not contained in a part that is in contact with the solid support and can communicate with the solid support, for example, a specimen addition part. In this case, the analyte and the labeling reagent are contacted in advance except for the solid phase support and the portion in contact with the solid phase support.
  • the immunochromatography detection device of the present invention may further contain a control reagent and may further contain an absorption part.
  • the control reagent is not limited. For example, a substance to which the antibody in the labeling reagent binds can be used.
  • the control reagent is fixed in the downstream of the capture reagent site.
  • the absorption part is a part having liquid absorptivity that controls the flow of the specimen by absorbing the specimen that has passed through the capturing part. In FIG. Is applicable. What is necessary is just to use the thing made from paper, for example as a sorbent pad.
  • one end of the solid support may be used as it is as the specimen supply site, but it may be composed of a member different from the solid support.
  • the sample supply site in the latter can absorb the sample or a mixture of the sample and the labeling reagent, and then the solution can be developed and moved by the solid support and capillary flow so that the absorbed sample or mixture is supplied to the solid support. It is arranged in contact so that
  • the members other than the solid support are, for example, natural, synthetic polymers such as -trocellulose, cellulose acetate, nylon, polyethersulfone, polybutyl alcohol, polyester, glass fiber, polyolefin, cellulose, polystyrene, or the like. However, it is not particularly limited.
  • the labeling reagent is a conjugate obtained by binding an antibody that specifically binds to PBP2 'and an appropriate labeling substance.
  • Non-metallic colloids such as metal colloids, selenium colloids, and insoluble substances such as colored rosin particles.
  • these labeling substances are sometimes referred to as insoluble carriers.
  • the insoluble carrier is preferably an insoluble carrier having a negative charge.
  • the labeling reagent is impregnated in a member different from the solid support and dried, and placed in a position where it is continuously connected to the solid support. Alternatively, the labeling reagent may be directly coated on a solid support and dried.
  • the labeling reagent When the specimen reaches the labeling reagent site containing the labeling reagent, the labeling reagent is dissolved in the specimen and the solid support can be developed. That is, the labeling reagent is held in a labeling reagent site so that it can be developed.
  • the capture reagent is an antibody that specifically binds to PBP2 ', and the capture reagent site specifically binds and captures the complex of PBP2' and the labeling reagent. And the labeling reagent PBP2'-capture reagent complex is formed.
  • the capture reagent is prepared by a method in which it is directly applied to a solid support and dried, but the present invention is not limited to this, and a solid support that is impregnated in a member different from the solid support and dried is used. You can create it on your body.
  • immobilization of the capture reagent on the solid phase support is not limited to a method by adsorption, but may be performed by a known method such as a method of chemically binding using a functional group such as an amino group or a carboxyl group. Good.
  • the antibody used as the capture reagent and the antibody used as the label reagent may be the same, but if there is only one site that binds to the substance in PBP2 ', the label reagent-PBP2'-capture reagent complex Is not formed. Therefore, in this case, the capture reagent and labeling reagent are each P It is necessary to bind to different sites of BP2 '.
  • the solid support may be any material as long as the sample specimen can be absorbed and flowed by capillary action.
  • the support is selected from natural, synthetic polymers such as trocellulose, cellulose acetate, nylon, polyethersulfone, polyvinyl alcohol, polyester, glass fiber, polyolefin, cellulose, polystyrene, or mixtures thereof.
  • the solid support preferably has the shape of a strip-like strip.
  • the cell wall synthase PBP2 'specifically produced by multidrug-resistant Staphylococcus is present on the cell membrane inside the cell wall.
  • Pretreatment to break or dissolve the cell walls of multidrug-resistant staphylococci makes capture and labeling reagents easier to recognize PBP2 '.
  • As an extraction reagent for breaking or thawing the cell walls of multi-drug resistant staphylococci specific interfaces with bactericidal action such as cell wall lytic enzymes, specific cationic surfactants, amphoteric surfactants, etc.
  • active agents are known, these reagents are difficult to use because of their high cost and strong inhibition of the antigen-antibody reaction in the immunochromatographic detection method.
  • a dilute alkaline solution as an extraction reagent for PBP2 ′ by the immunochromatography detection method of the present invention.
  • Specific examples include alkaline metal hydroxides or carbonates having a concentration of 0.01 to 1.0N, alkaline earth metal hydroxides or carbonates.
  • the pH of the diluted alkaline solution is preferably 11 or higher.
  • the neutralizing solution is not particularly limited, but is a phosphate buffer, Tris buffer, or MES, Bis-Tris, ADA that exhibits buffering capacity at pH 6 to pH 8, which is the optimum pH of the reaction system by the immunochromatography detection method. , PIPES, ACES, MOPSO, BES, MOPS, TES, HEPES, DIPSO, TAPSO, POPSO, HEPPSO, EPPS, Tricine, Bicine, TAPS and other good buffers.
  • the pretreatment of the bacterium in the present invention is an antigen by subjecting a bacterium producing cell wall synthase PBP2 ′, more specifically, a bacterial solution that seems to contain multidrug-resistant staphylococci to alkaline conditions.
  • the process of extracting PBP2 'and the process of neutralizing alkaline conditions To tell.
  • the pretreatment may be performed by adding an alkali solution to a sample solution containing bacteria and then adding a neutralizing solution.
  • the bacteria collected with a platinum loop or cotton swab may be suspended directly in an alkaline solution, and then neutralized solution may be added.
  • the amount to be added is not limited, but may be added so that the pH of the sample liquid after neutralization is around pH 6-9. Further, the neutralizing solution may be impregnated in advance in the specimen supply unit and dried.
  • an additive such as a salt, a surfactant, a protein, a high molecular polymer, an acidic compound, or a basic compound is added to a solution obtained by neutralizing a bacterial solution after pretreatment, and then sufficiently. After mixing, the sample can be supplied to the sample supply unit of the immunochromatography detection device.
  • These additives can be expected to increase the sensitivity of antigen-antibody reactions and reduce false positives (eg, false positives due to non-specific reactions). Furthermore, the number of operations can be reduced by one by mixing the above-mentioned additives with the dilute alkaline solution or neutralizing solution.
  • a false positive causative substance is not inactivated by boiling treatment, but a false reagent is contained by adding a surfactant to the capture reagent site in the immunochromatography detection device. It becomes possible to inhibit the binding between the positive causative substance and the capture antibody.
  • the surfactant may contain at least one of the amphoteric surfactants, the anionic surfactants, and the nonionic surfactants. The inhibition of the binding between the false positive causative substance and the capture antibody by the surfactant is thought to be due to the fact that the surfactant masks the false positive causative substance binding site of the antibody.
  • a nonionic surfactant with a molecular weight of 646 and a six-membered ring (trade name: ⁇ 100, manufactured by Nacalai Testa), a molecular weight of 364, a zwitterionic surfactant without a six-membered ring (trade name: SB3-14, Calbiochem, Inc.), molecular weight 615, six-membered ring, three-membered ring, one zwitterion Surfactant (trade name: CHAPS, manufactured by Dojin Chemical Co., Ltd.), molecular weight 878, 6-membered ring, 3-membered ring, 1 non-ionic surfactant (trade name: BIGCHAP, manufactured by Dojin Chemical Co., Ltd.)
  • a nonionic surfactant with a molecular weight of 646 and a six-membered ring (trade name: ⁇ 100, manufactured by Nacalai Testa)
  • a molecular weight of 364 a zwitterionic
  • the molecular weight of the surfactant is preferably 300 or more, and more preferably 600 or more, more preferably containing a large number of cyclic structures such as a six-membered ring.
  • the surfactant is also preferably negatively charged. .
  • Protein A present in the cell membrane of S. aureus. Protein A has a strong binding property to the Fc part of immunoglobulin G.
  • the type of antibody is not particularly limited, such as immunoglobulin G or immune globulin M, but when immunoglobulin G is used, it can be used with the Fc portion removed and in the capture reagent portion combined with the above surfactant. A false positive due to A can be avoided. Removal of the Fc portion can be easily performed by using a known degrading enzyme such as pepsin or papain.
  • Protein G contained in the cell wall of group G streptococci also specifically binds to the Fc portion of immunoglobulin G. Therefore, if the sample solution contains group G streptococci, it is expected to cause a non-specific reaction with the labeling reagent or capture reagent in the same way as with protein A, and the above method is also used to avoid this false positive. Can be used.
  • the properties of the ionic surfactant in particular vary depending on the anion or cation concentration in the solution passing through the capture reagent portion. Therefore, it is necessary to determine the optimum concentration of anion or cation in the solution depending on the type, concentration and nature of the surfactant used.
  • the anion include chloride ion, bromide ion, iodide ion and the like having a large ion tendency.
  • the cation include potassium ion, calcium ion, sodium ion and magnesium ion, which have a high ionization tendency. At this time, a plurality of anions or a plurality of cations may be used.
  • Examples of the surfactant containing a sulfobetaine region include CHAPS, CHAPSO, Myristylsulfobetaine (SB3-14), and Dodecyl dimethyl ammonio butane sulfonate (DDABS).
  • the surfactant that inhibits the binding between the false-positive causative agent and the capture antibody and the surfactant for increasing the sensitivity are used as a capture reagent when the capture reagent is immobilized on the capture reagent site.
  • a surfactant is added in advance. Only one or a combination of a surfactant that inhibits the binding of a false positive causative agent and a capture antibody and a sulfobetaine-type surfactant that has an effect of increasing sensitivity may be used. Further, the surfactant that inhibits the binding between the false positive causative substance and the capture antibody may be a sulfobetaine type. In this case, an effect of increasing the sensitivity can be expected.
  • the method of the present invention preferably has a molecular weight of 300 or more, more preferably 600 or more and a surfactant containing a sulfobetaine region is added to the capture reagent site to capture false positive causative substances and capture. It can have both the effect of inhibiting antibody binding and the effect of increasing sensitivity.
  • a surfactant containing a sulfobetaine region is added to the capture reagent site to capture false positive causative substances and capture. It can have both the effect of inhibiting antibody binding and the effect of increasing sensitivity.
  • CHAPS and SB3-14 are preferred, and CHAPS is particularly preferred. Multiple surfactants may be added to the capture reagent site.
  • the anion or cation is removed from the cell wall by pretreatment of the specimen solution or specimen presumed to contain multidrug-resistant staphylococci. Add it to the sample solution presumed to contain free PBP2 '!
  • the method of the present invention prevents the false positive causative agent from reaching the capture reagent site.
  • the method of preventing the influence of a false positive causative substance by covering is also included.
  • the false positive causative agent can be removed upstream of the capture reagent site of the apparatus of the present invention!
  • the specimen supply site on the immunochromatography detection device is made of glass fiber. Bacteria-derived false positive causative substances are adsorbed on the glass fiber, and the false positive causative substances are prevented from passing over the capture reagent, resulting in suppression of false positives.
  • the method of the present invention is a detection method based on an antigen-antibody reaction using a cell wall synthase PBP2 'as an antigen and an antibody against the same. Therefore, if the cell wall synthase PBP2 ′ is present in the specimen, it can be detected by the method of the present invention.
  • the cell wall synthase PBP2 ′ is specifically produced by multidrug-resistant staphylococci and is thought to exist specifically in the cells.
  • multi-drug resistant staphylococci is used as one specific example instead of “bacteria producing cell wall synthase PBP2 ′”. It is not intended to be limited to “drug-resistant staphylococci”. They can be read as “a bacterium producing a cell wall synthase PBP2 ′” within a range where the method of the present invention can be carried out. That is, bacteria other than multidrug-resistant staphylococci that produce PBP2 ′ can also be detected by the method of the present invention.
  • bacteria containing cell wall synthase PBP2 ′ in the cells can also be detected by the method of the present invention.
  • the cell wall synthase PBP2 ′ is considered to be specifically present on the cell membrane inside the cell wall of multidrug resistant staphylococci.
  • the method of the present invention comprises an extraction reagent for PBP2 ′ for pretreatment to break or thaw the cell wall of the fungus. Therefore, bacteria containing the cell wall synthase PBP2 ′ inside the cell wall can be effectively detected by the method of the present invention.
  • a second anti-PBP2 ′ monoclonal antibody having a different recognition site from the anti-PBP2 ′ monoclonal antibody used for latex sensitization was treated with pepsin by a conventional method to obtain F (a) 2. This was diluted with a citrate buffer (pH 6) containing 0.075% CHAPS, applied to a nitrocellulose membrane (solid support 5), and sufficiently dried (capture reagent site 3). Anti-Mouse IgGs as a control reagent were similarly applied to a trocellulose membrane and thoroughly dried (control part 4).
  • a solid support 5 including a capture reagent site 3 and a control site 4 is arranged on a hydrophobic sheet 7.
  • the immunochromatography detector is placed in a 1.5 mL tube containing the sample-pretreated solution, and after 10 minutes, the color of the capture reagent 3 is evaluated with the naked eye.
  • Example 2 Effect of addition of surfactant to supplemental reagent site
  • Example 1 The one prepared in Example 1 was used.
  • MSSA was cultivated in the same manner as in Example 1, using one strain determined to be MSSA in the drug susceptibility test and one strain determined to be MRSA resistant in the drug susceptibility test. 2 for the ears and 3 for the ears, and for MRSA, 1 for the ears.
  • MSSA1 strain was tested as in Example 1 without dilution. MRSA1 strain is further 0.2N NaOH
  • Example 1 Two dilutions of 0.6MTris hydrochloride containing nonionic surfactant, bovine serum albumin, and rabbit IgG at a ratio of 2: 1, with a dilution ratio of 150 ⁇ L more than 1024 times Tested as in 1.
  • non-ionic surfactants Txl00, BIGCHAP or amphoteric surfactants CHAPS or SB3-14 are added to the capture reagent site to suppress false positives derived from MSSA.
  • Txl00, BIGCHAP or amphoteric surfactants CHAPS or SB3-14 are added to the capture reagent site to suppress false positives derived from MSSA.
  • CHAPS or BIGCHAP which contains many cyclic structures and has a large molecular weight, has a greater false-positive inhibitory effect. This result confirmed the superiority of adding a surfactant to the capture reagent site.
  • CHAPS has both a high effect of suppressing false positives and a high effect of increasing sensitivity, and is particularly useful.
  • Example 1 The one prepared in Example 1 was used.
  • the drug susceptibility test was negative for two strains determined to be sensitive, that is, MSCNS, and the drug sensitivity test was positive for one strain determined to be resistant, that is, MRCNS.

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Abstract

　本発明は、イムノクロマトグラフィー検出法により感度良く簡便・迅速に多剤耐性ブドウ球菌属菌が特異的に産生するPBP2’を検出し、多剤耐性ブドウ球菌への感染を判定することができるイムノクロマトグラフィー検出装置および該検出装置を用いた診断方法ならびに該検出装置を含む診断キットの提供を目的とし、本発明は、シート状の固相支持体上に多剤耐性ブドウ球菌を含むと推定される検体溶液または検体の前処理により細胞壁から遊離したPBP2’を含むと推定される溶液を供給する検体供給部位、PBP2’に特異的に結合する抗体を標識した標識試薬を固相支持体上で展開可能に保持した標識試薬部位、PBP2’と標識試薬の複合体を特異的に結合捕捉し得る捕捉試薬を固定化した捕捉試薬部位が含まれ、捕捉試薬部位または捕捉試薬部位の上流の固相支持体上に両イオン性界面活性剤、陰イオン性界面活性剤およびまたは非イオン性界面活性剤が含まれる多剤耐性ブドウ球菌検出用イムノクロマトグラフィー検出装置である。

Description

明 細 書
多剤耐性ブドウ球菌のィムノクロマトグラフィー検出法および診断キット 技術分野
[0001] 本発明は、ィムノクロマトグラフィー検出法及び、これを応用したキットに関する。
背景技術
[0002] ブドウ球菌属には 40以上の菌種が含まれるが、臨床的には黄色ブドウ球菌（Staphy lococcus aureus)とコ,グフ ~~ゼ陰性フドウ球菌 (し oagulase- negative staphylococci八 以下 CNSと略)に大別される。黄色ブドウ球菌は病原菌として、 CNSは非病原性菌とし て扱われている。
[0003] 感染症の治療には抗生物質が用いられるが、ブドウ球菌は薬剤耐性を持つ株が多 ぐ臨床的見地力 耐性の有無によって分類されている。
[0004] 病原性菌として臨床的に重要である黄色ブドウ球菌のうち、メチシリン耐性黄色ブド ゥ球菌（Methicillin- resistant Staphylococcus aureus) (MRSA)はメチシリンなどのべ- シリン剤を初めとする j8ラタタム剤に耐性を示す黄色ブドウ球菌である力 同時にアミ ノ配糖体剤、マクロライド剤などの多くの薬剤に耐性を示すものが多ぐそのため臨床 上は多剤而ォ性黄色ブドウ球菌（Multi- drug resistant Staphylococcus aureus)として取 り扱われる。一方メチシリンに感受性を示す黄色ブドウ球菌はメチシリン感受性黄色 ブドウ球菌（Methcillin- sensitive Staphylococcus aureus) (以下 MSSA)と呼ばれる。
[0005] 黄色ブドウ球菌は、ェンテロトキシン、毒素性ショック症候群毒素、溶血素、表皮剥 奪毒素を始めとする種々の毒素を産生し (非特許文献 1)、その感染によって腸炎、 肺炎、皮膚炎、臓器不全等を発症せしめ、重篤な場合は死に至らせる場合もある。 従って、患者から黄色ブドウ球菌が分離された場合、 MRSAか否カゝを一刻も早く知り、 MRSA感染症の場合には MRSAに有効とされるバンコマイシン、硫酸アルべカシンな どの適切な薬剤を選択、投与することが必要である。
[0006] 一方、黄色ブドウ球菌以外のブドウ球菌は常在細菌であり、通常は健常人に対し 非病原性である。しかし、臓器移植患者の術後の感染症対策等として免疫抑制剤を 使用している場合や、加齢に伴う体力減衰等の要因により免疫力が低下したいわゆ る易感染性患者には日和見感染を起こすことがある。
[0007] 黄色ブドウ球菌以外のブドウ球菌にお!/ヽてもメチシリン耐性や多剤耐性を獲得して いるものがあり、それらはそれぞれ、メチシリン耐性コアダラーゼ陰性ブドウ球菌 (Met hicillin— resistant Coagulase— negative staphylococci) (以 fMRCNS)ま 7こ ίま多剤耐 '性コ ァグフ ~~ゼ陰'性ブドウ球菌 (Multi-drug resistant Coagulase— negative staphylococci) と、総称される。 MRSAと同様に MRCNSは易感染者に感染した場合は治療に有効な 薬剤が限定されることから、医学上問題になっている。
[0008] これら MRSAと MRCNSは、両方を併せて多剤耐性ブドウ球菌と総称される。
[0009] MRSA, MRCNSの薬剤耐性の本質は、ブドウ球菌の細胞壁の構成成分であるムレ インを架橋し細胞壁を合成する酵素である 4種類のペニシリン結合蛋白（PBP1、 PBP 2、 PBP3、 PBP4)に新たな酵素として PBP2'の発現によるものであることが知られてい る（非特許文献 2)。ブドウ球菌が共通に保有する PBP1〜4は細胞壁合成酵素として 基質アナログであるペニシリン系抗生物質により不活化され、菌は細胞壁合成が不 能となることによりやがて死滅する。しかし MRSA、 MRCNSは j8ラタタム系抗生物質に 対し親和性の低い、即ち不活化されない新たな細胞壁合成酵素 PBP2'を発現し、細 胞壁合成の役割を代替することにより増殖し続けることが可能となると考えられている 。 MRSA,MRCNSは他の抗生物質に対する耐性機構も獲得して多くの抗生物質に耐 性となる多剤耐性がほとんどである。それらは単に βラタタム系抗生物質に耐性をも っブドウ球菌としてではなぐ多剤耐性のブドウ球菌として扱われる。
[0010] 一般的なブドウ球菌の分離法 ·判定法は、鼻腔スヮブ、咽頭スヮブ、喀痰、血液、膿 、糞便などを臨床検体とし、寒天培地や液体寒天培地を用いた分離培養を行う。寒 天培地を用いて培養された場合は、発育したコロニーのうちブドウ球菌が疑われるコ 口-一をさらに純培養し、グラム染色による染色像の検鏡、コアダラーゼ産生能、マン ニット分解能等の生化学的性状試験等によりブドウ球菌または黄色ブドウ球菌の同 定を行う。液体培地で培養された場合は、コロニー単離のために培養液を寒天培地 に接種して培養し、同様にブドウ球菌が疑われるコロニーについて純培養後、同定を 行う。黄色ブドウ球菌またはブドウ球菌であると同定された菌は薬剤感受性試験等に 供され、その試験結果から MRSAか MSSA、或いは MRCNSか否かの判定が行われる 。薬剤感受性試験には、希釈法、ディスク感受性試験等の培養による試験方法が一 般的に用いられて 、る。これらの薬剤感受性試験は培養時間が 16時間〜 24時間必 要であること (分離培養、純培養と合わせると臨床検体の分離カゝら判定までに 3日以 上要する）、この薬剤感受性試験では接種菌濃度、培養温度、培地組成あるいは使 用する薬剤などによって試験成績に差のあることが知られ、手技的にも熟練が必要 である。
[0011] 近年、純培養、分離培養、或いは臨床検体から直接に薬剤耐性機構の本体である PBP2'をコードする ιπ^Δ遺伝子を PCR法によって検出し、被検菌株における m^A遺 伝子の保有状況をもって抗生物質耐性の鑑別を行う方法が開発された。しかし、 mec 遺伝子の保有は必ずしも抗生物質耐性の発現を示して!/ヽるとは限らず、遺伝子を 保有して!/、るにも関わらず耐性を獲得して 、な 、株が存在する。
[0012] 一方、 PBP2'の産生が多剤耐性を発現する上で重要な役割を担っていることは前 述の通りであり、ブドウ球菌力 PBP2'を検出することはその株が耐性を獲得している か否かを知る有用な手段となり得る。
[0013] MRSAをはじめとする多剤耐性ブドウ球菌属菌が特異的に産生する PBP2'を抗原 抗体反応に基づく免疫学的手段によって検出しょうとする方法としては、ウェスタンブ ロット法、放射免疫測定法、スライドラテックス凝集法が知られている（特許文献 1参照 ) oし力し、これらの PBP2'の検出法には以下の問題点がある。ウェスタンブロット法は 、方法そのものが煩雑であり迅速に多数検体を処理することは困難である。放射免疫 測定法は、放射性同位体を使用すること、測定法の操作の中で抗原抗体複合体とそ れ以外の非結合抗原あるいは抗体とを分離する BF分離の操作が必要であること、菌 体からの抗原の抽出に使用された変性剤が反応系に存在することにより測定時間に 数時間を要することなど日常の検査の点から実用的ではない。スライドラテックス凝集 法は、夾雑菌による偽陽性 (例えば、非特異反応による偽陽性)と感度の低さから純 培養菌からの検出となるため、分離培養、純培養の最低 2回の培養操作が不可欠と なり判定までには検体採取から 2日〜 3日を要すること、純培養の培地代としてコスト が高くなること、判定時間は 3分と短いが判定時間を過ぎると凝集が進んでしまうため に偽陽性が起きてしまう可能性があること、菌体から PBP2'を抽出する前処理におい て PBP2 'を含む上清と細胞壁由来の破片とを分離するために遠心操作を要するため 手間が力かり且つ検査室の環境汚染が問題となること、ピペット操作により遠心後の 上清を移し変えるなどの煩雑な操作を伴うこと、煮沸処理を伴うことなどの問題がある 。従ってこれらの検査に代わる、多剤耐性ブドウ球菌属菌が特異的に産生する PBP2 'を特異的に感度良ぐ迅速に検出できる検査方法が望まれている。
特許文献 1：特許第 3638731号公報
非特許文献 1 :五十嵐英夫: TSST— 1,侵襲と免疫， 3, 3-10 (1994)
非特干文献 2 : Utsui,Y., and Yokota, T.： Role of an altered penicillin- Dinding protei n in methicillin- and cephem— resistant Staphyloccus aureus., Antimicrobial Agents a nd Chemotherapy, 28, 397-403 (1985)
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0014] そこで本発明は、ィムノクロマトグラフィー式検査法により感度良く簡便 '迅速に多剤 耐性ブドウ球菌属菌が特異的に産生する PBP2 'を検出し、多剤耐性ブドウ球菌の感 染を判定することができるィムノクロマトグラフィー検出装置および該検出装置を用い た診断方法ならびに該検出装置を含む診断キットを提供することを目的とするもので ある。
課題を解決するための手段
[0015] 本発明者らは、多剤耐性ブドウ球菌属菌力 煩雑な操作を行うことなく簡便かつ迅 速に PBP2 'を抽出し測定する方法について鋭意検討を行った。本発明者らは PBP2 ' に特異的に結合する抗体を標識した標識試薬および PBP2 'と標識試薬の複合体を 特異的に結合捕捉し得る捕捉試薬を用いたィムノクロマトグラフィー検出装置により 簡便に測定することに成功し、さらに、検体を測定に供する前にアルカリ溶液で処理 し次いで中和処理してィムノクロマトグラフィー検出装置に供することにより、煩雑な 遠心操作等の必要無しに、 PBP2 'を抽出し測定し得ることを見出した。さらに、本発 明者らは両イオン性界面活性剤等の界面活性剤をィムノクロマトグラフィー式検出装 置の捕捉試薬を固定ィ匕した捕捉試薬部位に供することにより、偽陽性が生じることな く測定できることを見出し、本発明を完成させるに至った。 [0016] すなわち、本発明は以下のとおりである。
[0017] [1] 細胞壁合成酵素 PBP2'を産生する菌の検出方法であって、細胞壁合成酵素 PB P2，を抗原抗体反応に基づくィムノクロマトグラフィー検出法を用いて検出することを 特徴とする、細胞壁合成酵素 PBP2'を産生する菌の検出方法。
[0018] [2] シート状の固相支持体上に細胞壁合成酵素 PBP2'を産生する菌を含むと推定 される検体溶液または検体の前処理により細胞壁から遊離した PBP2 'を含むと推定 される溶液を供給する検体供給部位、 PBP2'に特異的に結合する抗体を標識した標 識試薬を固相支持体上で展開可能に保持した標識試薬部位、 PBP2'と標識試薬の 複合体を特異的に結合捕捉し得る捕捉試薬を固定化した捕捉試薬部位が含まれる ィムノクロマトグラフィー検出装置を用いることを特徴とする [1]の細胞壁合成酵素 PBP 2'を産生する菌の検出方法。
[0019] [3] PBP2'と標識試薬が固相支持体と分離した部位で予め接触し、検体供給部位 に細胞壁合成酵素 PBP2'を産生する菌を含むと推定される検体溶液または検体の 前処理により細胞壁から遊離した PBP2'を含むと推定される溶液及び PBP2'に特異 的に結合する抗体を標識した標識試薬を含む検体試薬混合溶液を検体供給部位に 供給する、請求項 1または 2に記載の細胞壁合成酵素 PBP2'を産生する菌の検出方 法。
[0020] [4] 標識試薬が、不溶性担体に抗体が結合したものである、 [2]または [3]の細胞壁 合成酵素 PBP2'を産生する菌の検出方法。
[0021] [5] 捕捉試薬部位に両イオン性界面活性剤、陰イオン性界面活性剤および Zまた は非イオン性界面活性剤を含む [2]〜[4]の 、ずれかの細胞壁合成酵素 PBP2，を産 生する菌の検出方法。
[0022] [6] 捕捉試薬部位にスルホベタイン型の界面活性剤を含む [2]〜[5]のいずれかの 細胞壁合成酵素 PBP2'を産生する菌の検出方法。
[0023] [7] 細胞壁合成酵素 PBP2'を産生する菌を含むと推定される検体溶液または検体 の前処理により細胞壁から遊離した PBP2'を含むと推定される溶液に該溶液を検体 供給部位に供給する前にイオン化傾向の大きい陰イオンを添加する、 [5]または [6] の細胞壁合成酵素 PBP2'を産生する菌の検出方法。 [0024] [8] イオン化傾向の大きい陰イオンは塩化物イオン、臭化物イオンおよびヨウ化物ィ オン力もなる群より選ばれた 1種以上の陰イオンである [7]の細胞壁合成酵素 PBP2' を産生する菌の検出方法。
[0025] [9] 細胞壁合成酵素 PBP2'を産生する菌を含むと推定される検体溶液または検体 の前処理により細胞壁から遊離した PBP2'を含むと推定される溶液に該溶液を検体 供給部位に供給する前にイオン化傾向の大きい陽イオンを添加する [5]〜[8]のいず れかの細胞壁合成酵素 PBP2'を産生する菌の検出方法。
[0026] [10] イオン化傾向の大きい陽イオンがカリウムイオン、カルシウムイオン、ナトリウム イオンおよびマグネシウムイオン力もなる群より選ばれた 1種以上の陽イオンである [9
]の細胞壁合成酵素 PBP2'を産生する菌の検出方法。
[0027] [11] 検体をアルカリ処理および中和により前処理する工程を含む [1]〜[10]のいず れかの細胞壁合成酵素 PBP2'を産生する菌の検出方法。
[0028] [12] アルカリ処理力 アルカリ金属の水酸ィ匕物若しくは炭酸塩、アルカリ土類金属 の水酸ィ匕物若しくは炭酸塩の水溶液を用いて行われる [11]の細胞壁合成酵素 PBP2
'を産生する菌の検出方法。
[0029] [13] アルカリ金属の水酸ィ匕物若しくは炭酸塩、アルカリ土類金属の水酸ィ匕物若しく は炭酸塩の水溶液の pHが 11以上である、 [12]の細胞壁合成酵素 PBP2'を産生する 菌の検出方法。
[0030] [14] アルカリ金属の水酸ィ匕物若しくは炭酸塩、アルカリ土類金属の水酸ィ匕物若しく は炭酸塩の濃度が 0.01N〜1.0Nである、 [12]または [13]の細胞壁合成酵素 PBP2'を 産生する菌の検出方法。
[0031] [15] 緩衝液でアルカリ処理後の水溶液を中和する [11]〜[14]のいずれかの細胞 壁合成酵素 PBP2'を産生する菌の検出方法。
[0032] [16] 検体供給部位がガラス系繊維力もなる [1]〜[15]のいずれかの細胞壁合成酵 素 PBP2'を産生する菌の検出方法。
[0033] [17] 細胞壁合成酵素 PBP2'を産生する菌が多剤耐性ブドウ球菌である [1]〜[16] のいずれかの細胞壁合成酵素 PBP2'を産生する菌の検出方法。
[0034] [18] シート状の固相支持体上に細胞壁合成酵素 PBP2'を産生する菌を含むと推定 される検体溶液または検体の前処理により細胞壁から遊離した PBP2 'を含むと推定 される溶液を供給する検体供給部位、 PBP2'に特異的に結合する抗体を標識した標 識試薬を固相支持体上で展開可能に保持した標識試薬部位、 PBP2'と標識試薬の 複合体を特異的に結合捕捉し得る捕捉試薬を固定化した捕捉試薬部位が含まれ、 捕捉試薬部位に両イオン性界面活性剤、陰イオン性界面活性剤および Zまたは非 イオン性界面活性剤が含まれる細胞壁合成酵素 PBP2'を産生する菌検出用ィムノク 口マトグラフィー検出装置。
[0035] [19] 捕捉試薬部位にスルホベタイン型の界面活性剤を含む [18]の細胞壁合成酵 素 PBP2'を産生する菌検出用ィムノクロマトグラフィー検出装置。
[0036] [20] 検体供給部位がガラス系繊維力もなる [18ほたは [19]の細胞壁合成酵素 PBP 2'を産生する菌検出用ィムノクロマトグラフィー検出装置。
[0037] [21] 細胞壁合成酵素 PBP2'を産生する菌が多剤耐性ブドウ球菌である [18]〜[20] のいずれかの細胞壁合成酵素 PBP2'を産生する菌検出用ィムノクロマトグラフィー検 出装置。
[0038] [22] [18]〜[21]のいずれかの細胞壁合成酵素 PBP2'を産生する菌検出用ィムノク 口マトグラフィー検出装置、ならびに細胞壁合成酵素 PBP2'を産生する菌を含むと推 定される検体溶液または検体の前処理により細胞壁から遊離した PBP2 'を含むと推 定される溶液に添加するためのイオン化傾向の大きい陰イオンまたは陽イオン溶液 を含む細胞壁合成酵素 PBP2'を産生する菌検出用キット。
[0039] [23] イオン化傾向の大きい陰イオンは塩化物イオン、臭化物イオンおよびヨウ化物 イオン力もなる群より選ばれた 1種以上の陰イオンである [22]の細胞壁合成酵素 PBP 2'を産生する菌検出用キット。
[0040] [24] イオン化傾向の大きい陽イオンがカリウムイオン、カルシウムイオン、ナトリウム イオンおよびマグネシウムイオン力もなる群より選ばれた 1種以上の陽イオンである [2 2]の細胞壁合成酵素 PBP2'を産生する菌検出用キット。
[0041] [25] さらに、検体アルカリ処理用のアルカリ溶液および中和用の緩衝液を含む [22] 〜[24]のいずれかの細胞壁合成酵素 PBP2'を産生する菌検出用キット。
[0042] [26] アルカリ溶液力 アルカリ金属の水酸ィ匕物若しくは炭酸塩、アルカリ土類金属 の水酸ィ匕物若しくは炭酸塩の水溶液である [25]の細胞壁合成酵素 PBP2 'を産生す る菌検出用キット。
[0043] [27] アルカリ金属の水酸ィ匕物若しくは炭酸塩、アルカリ土類金属の水酸ィ匕物若しく は炭酸塩の水溶液の pHが 11以上である、 [26]の細胞壁合成酵素 PBP2'を産生する 菌検出用キット。
[0044] [28] アルカリ金属の水酸ィ匕物若しくは炭酸塩、アルカリ土類金属の水酸ィ匕物若しく は炭酸塩の濃度が 0.01N〜1.0Nである、 [26]または [27]の細胞壁合成酵素 PBP2'を 産生する菌検出用キット。
[0045] [29] 細胞壁合成酵素 PBP2'を産生する菌が多剤耐性ブドウ球菌である [22]〜[28] のいずれかの細胞壁合成酵素 PBP2'を産生する菌検出用キット。
発明の効果
[0046] 本発明のィムノクロマトグラフィー検出装置を用いることにより、高感度に PBP2'を検 出できるようになる為、分離培養後の 1コロニーの菌量カも試験可能となる。その結果 、臨床検体から分離後わずか 1回、 1日の培養で MRSAか否かの判定、または MRCN Sか否かの判定が可能となり、検査に要する時間と純培養に用いていた培地のコスト が大幅に削減できる。さらに MRSAによる菌血症、敗血症の検査で行われる血液 (液 体)培養で陽性培地力も直接検出ができるようになるため、有効な治療の早期開始 による治療期間の短縮ィ匕が可能となる。
[0047] また抗体固相化支持体上の検体供給部材にろ過効果を持たせることで遠心操作 が不要となり、検査室の衛生面が維持される。
[0048] ィムノクロマトグラフィー検出装置の捕捉部位に界面活性剤を含ませることにより、 抗原以外の菌破砕物の標識試薬および Zまたは捕捉部位への結合、即ち偽陽性を 防ぐこと、および感度向上の効果を持たす事が可能となる。そのため従来の操作で は必須であった菌の前処理工程のうちの煮沸操作が不要となる。
[0049] 本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願 2005-360984号の明細書 および Zまたは図面に記載される内容を包含する。
図面の簡単な説明
[0050] [図 1]標識試薬部位を含む本発明の検出装置の一例を示す図である。 [図 2]標識試薬部位を含まない本発明の検出装置の一例を示す図である。
符号の説明
[0051] 1 検体供給部位
2 標識試薬部位
3 捕捉試薬 (キヤプチヤー抗体)部位
4 対照部位 (コントロール)部位
5 固相支持体 (ニトロセルロース膜）
6 吸収部位 (ァブソーベントパッド）
7 トップラミネートまたはハウジング
発明を実施するための最良の形態
[0052] 以下、本発明について詳細に説明する。
[0053] 本発明は、ィムノクロマトグラフィー式検査法により感度良く簡便 ·迅速に多剤耐性 ブドウ球菌類等の細胞壁合成酵素 PBP2 'を産生する菌に特異的に存在する PBP2 ' を検出し、多剤耐性ブドウ球菌等の細胞壁合成酵素 PBP2'を産生する菌への感染を 判定することができるィムノクロマトグラフィー検出装置および診断キットである。
[0054] 本発明における検体とは、被疑患者からの尿、膿汁、髄液、分泌物や穿刺液など の検査材料を血液寒天培地、普通寒天培地、ハートインフュージョン寒天培地、ブレ インハートインフュージョン寒天培地、ソィビーン'カゼイン 'ダイジェスト寒天培地、チ ョコレート寒天培地、卵黄加マンニット食塩寒天培地、 MRSA選択培地等の増菌培地 に塗抹し、好気的条件下 35°C〜37°C、 18時間以上培養された菌を懸濁した溶液の 他、液体培養培地、血液培養培地等で同様に好気的条件下 35°C〜37°C、 18時間以 上振とう培養された培養液を含む細胞壁合成酵素 PBP2'を産生する菌、より具体的 には多剤耐性ブドウ球菌を含むと推定される溶液を指す。また、これらの菌懸濁液の 前処理により細胞壁から遊離した PBP2'を含むと推定される抽出液も含む。ここで、 「 細胞壁合成酵素 PBP2'を産生する菌」には、多剤耐性ブドウ球菌が含まれ、「多剤耐 性ブドウ球菌」には、多剤耐性黄色ブドウ球菌 (MRSA)および多剤耐性コアダラーゼ 陰性ブドウ球菌 (MRCNS)が含まれる。被疑患者力もの尿、膿汁、髄液、分泌物や穿 刺液などの検査材料を生理食塩水もしくはリン酸緩衝液等に直接懸濁した液も検体 となりうるが、検出感度の面から上記方法で培養した菌を含む液を用いる事が望まし い。
[0055] 本発明のィムノクロマトグラフィー検出装置は、試験片からなるィムノクロマトグラフィ 一試験片であり、例えば図 1に示されるように配置されて構成される。シート状の固相 支持体上に検体を供給する検体供給部位 1、および PBP2'に特異的に結合する抗 体を標識した標識試薬を固相支持体上で展開可能に保持した標識試薬部位 2、 PB P2'と標識試薬の複合体を特異的に結合捕捉し得る捕捉試薬を固定化した捕捉試 薬部位 3を含む。検体供給部位 1に検体を供給すると、検体は標識試薬部位 2、捕 捉試薬部位 3の順に通過するように構成されている。本発明ではさらに、検体と PBP2 'に特異的に結合する抗体を標識した標識試薬との混合物を検体供給部位 1に供給 してもよく、この場合固相支持体上の標識試薬部位 2を省略することができる（図 2)。 検体と PBP2'に特異的に結合する抗体を標識した標識試薬との混合物を検体供給 部位 1に供給する場合、検体に含まれる PBP2'と標識試薬は固相支持体と分離した 部位で予め接触する。ここで、「被分析物質と標識試薬が固相支持体と分離した部 位で予め接触する」とは、ィムノクロマトグラフィー検出装置においては、標識試薬が 固相支持体に含まれておらず、または固相支持体と接触しており液体が固相支持体 と連絡し得る部位、例えば、検体添加部位等にも含まれていないことをいう。この場 合、被分析物質と標識試薬は、固相支持体および固相支持体と接触している部位以 外で予め接触する。
[0056] 本発明のィムノクロマトグラフィー検出装置はさらに対照用試薬を含んでいてもよく 、さらに吸収部を含んでいてもよい。対照用試薬は限定されないが、例えば標識試薬 中の抗体が結合する物質を用いることができる。対照用試薬は、捕捉試薬部位の下 流に固定ィ匕すればよぐ図 1においては対照部位 4が該当する。吸収部は、捕捉部を 通過した検体を吸収することにより、検体の流れを制御する液体吸収性を有する部 位であり、検出装置の最下流に設ければよぐ図 1においては吸収部位 6が該当する 。吸収部は例えば紙製のものをァブソーベントパッドとして用いればよい。
[0057] 本発明のィムノクロマトグラフィー検出装置において、検体供給部位は固相支持体 の一端をそのまま使用しても良いが、固相支持体とは別の部材で構成することもでき る。後者における検体供給部位は一旦検体あるいは検体と標識試薬の混合物を吸 収し、次いで吸収した検体または混合物を固相支持体に供給するように、固相支持 体と毛細流により溶液が展開移動可能となるように接触して配置される。固相支持体 とは別の部材とは、例えば-トロセルロース、酢酸セルロース、ナイロン、ポリエーテル スルホン、ポリビュルアルコール、ポリエステル、ガラス繊維、ポリオレフイン、セルロー ス、ポリスチレン等の天然、合成ポリマー、あるいはこれらの混合物力もなる部材を挙 げることができるが、特に限定されない。
[0058] 本発明のィムノクロマトグラフィー検出装置において、標識試薬とは PBP2 'に特異 的に結合する抗体と適当な標識物質を結合させたコンジュゲートであり、標識物質と して、金コロイド等の金属コロイド、セレニウムコロイド等の非金属コロイド、着色榭脂 粒子等の不溶性の物質が挙げられる。本発明において、これらの標識物質を不溶性 担体とよぶことがある。不溶性担体は、好ましくはマイナスチャージを有する不溶性担 体である。一般的に標識試薬は固相支持体とは別の部材に含浸させて乾燥し、それ を固相支持体と連続的に連結する位置に置く。または、標識試薬は固相支持体上に 直接塗布し、乾燥しても構わない。検体が標識試薬を含む標識試薬部位に到達する と標識試薬は検体中に溶解され、固相支持体を展開し得る。すなわち、標識試薬は 標識試薬部位に展開可能に保持されている。
[0059] 本発明のィムノクロマトグラフィー検出装置において、捕捉試薬とは PBP2 'に特異 的に結合する抗体であり、捕捉試薬部位は PBP2 'と標識試薬の複合体を特異的に 結合捕捉することができ、標識試薬 PBP2 '—捕捉試薬複合体が形成される。一般 的に捕捉試薬は固相支持体に直接塗布し乾燥させる方法で作成されるが、これに限 定されず、固相支持体とは別の部材に含浸させて乾燥したものを固相支持体上にお く方法で作成しても構わない。また、捕捉試薬の固相支持体への固定化は、吸着に よる方法に限らず、アミノ基、カルイボキシル基等の官能基を利用して化学的に結合 させる方法等、公知の方法で行えばよい。
[0060] 捕捉試薬として用いる抗体と標識試薬として用いる抗体は同じでもよいが、 PBP2 ' 中に該物質と結合する部位が一つしか存在しない場合は、標識試薬—PBP2 '—捕 捉試薬複合体が形成されない。従って、この場合捕捉試薬と標識試薬はそれぞれ P BP2'の異なる部位に結合する必要がある。
[0061] 固相支持体は毛管現象により試料検体が吸収され流動し得るものであれば、どの ようなものであってもよい。例えば、支持体は-トロセルロース、酢酸セルロース、ナイ ロン、ポリエーテルスルホン、ポリビニルアルコール、ポリエステル、ガラス繊維、ポリオ レフイン、セルロース、ポリスチレン等の天然、合成ポリマー、あるいはこれらの混合物 力 なる群力 選択される。固相支持体は好ましくは短冊状のストリップの形状を有す る。
[0062] 多剤耐性ブドウ球菌属菌が特異的に産生する細胞壁合成酵素 PBP2'は細胞壁の 内側にある細胞膜上に存在する。多剤耐性ブドウ球菌の細胞壁を壊す、もしくは融 解するための前処理を行うことで、捕捉試薬および標識試薬はより PBP2'を認識しや すくなる。多剤耐性ブドウ球菌の細胞壁を壊す、もしくは融解するための抽出試薬と して、細胞壁溶菌酵素や、特定の陽イオン性界面活性剤，両イオン性界面活性剤等 の殺菌作用を持つ特定の界面活性剤が知られているが、これらの試薬は高価である こと、ィムノクロマトグラフィー検出法における抗原抗体反応を強く阻害してしまうこと、 等の理由により用いる事が困難である。そこで本発明のィムノクロマトグラフィー検出 法による PBP2'の抽出試薬には希アルカリ液を用いることが望ましい。具体的には 0.0 1N〜1.0N濃度のアルカリ金属の水酸ィ匕物若しくは炭酸塩、アルカリ土類金属の水酸 化物若しくは炭酸塩の水溶液が挙げられる。上記希アルカリ液の pHは 11以上が望ま しい。
[0063] 上記のように希アルカリ液で菌液を前処理した場合、前処理後の pHll以上のまま では抗原 抗体反応が阻害されてしまう。そこでアルカリ条件の溶液を中和すること が必要となる。中和液としては特に限定されないが、ィムノクロマトグラフィー検出法 による反応系の至適 pHである pH6〜pH8に緩衝能を示すリン酸緩衝液、トリス緩衝液 、または MES、 Bis - Tris、 ADA, PIPES, ACES, MOPSO、 BES、 MOPS, TES、 HEPES、 DIPSO、 TAPSO、 POPSO、 HEPPSO、 EPPS、 Tricine、 Bicine、 TAPSなどのグッド緩衝 液が挙げられる。本発明における菌の前処理とは、細胞壁合成酵素 PBP2'を産生す る菌、より具体的には多剤耐性ブドウ球菌を含むと思われる菌液をアルカリ条件にさ らすことで抗原である PBP2'を抽出する工程、およびアルカリ条件を中和する工程を 言う。前処理は、菌を含む検体液にアルカリ溶液を添加することでアルカリ処理し、そ の後中和液を添加すればよい。もしくは白金耳や綿棒で採取した菌を直接アルカリ 溶液に懸濁し、その後中和液を添加しても良い。添加量は限定されないが、中和後 の検体液の pHが pH6〜9付近になるように添加すればよい。また、中和液はあらかじ め検体供給部に含浸させ、乾燥させておいてもよい。
[0064] 本発明にお ヽては、菌液を前処理後中和した液に、塩、界面活性剤、蛋白質、高 分子ポリマー、酸性化合物、塩基性化合物等の添加剤を加え、充分に混合した後に ィムノクロマトグラフィー検出装置の検体供給部に検体を供給することが可能である。 これら添加剤により抗原抗体反応の感度上昇や偽陽性 (例えば、非特異反応による 偽陽性)軽減が期待できる。さらに、上記の希アルカリ液や中和液にあら力じめ上記 の添加剤を混合しておくことで、操作数をひとつ減らすことができる。
[0065] 多剤耐性ブドウ球菌を検出しょうとする場合、多剤耐性ではな!/ヽブドウ球菌 (MSSA 、MSCNS)あるいはブドウ球菌以外の菌由来の物質が標識試薬および捕捉試薬であ る抗体と結合することにより偽陽性を示す場合がある。そのためラテックス凝集法によ る PBP2'検出試薬では菌液をアルカリ試薬存在下で煮沸処理することにより IgGと結 合性を示す黄色ブドウ球菌の細胞壁に存在するプロテイン A等の偽陽性の原因物質 を不活ィ匕し、且つ遠心操作により菌破砕後の残骸を取り除き、遠心後の上清を試験 に用いる必要があった。本発明によるィムノクロマトグラフィー検出法では、煮沸処理 により偽陽性の原因物質を不活ィ匕せずとも、ィムノクロマトグラフィー検出装置中の捕 捉試薬部位に界面活性剤を含ませることで偽陽性原因物質と捕捉抗体の結合を阻 害することが可能となる。界面活性剤は両イオン性界面活性剤、陰イオン性界面活 性剤、非イオン性界面活性剤が好ましぐいずれカゝ 1種以上が含まれていればよい。 界面活性剤による偽陽性の原因物質と捕捉抗体の結合を阻害することは抗体の偽 陽性の原因物質結合部位を界面活性剤がマスクすることによると考えられる。従って 界面活性剤の分子量が大きぐおよび Zまたは環状構造を多く持つほど効果が大き いと考えられる。例えば、分子量 646、六員環 1つの非イオン性界面活性剤（商品名： Τχ100、ナカライテスタ社製）、分子量 364、六員環なしの両イオン性界面活性剤（商 品名： SB3-14、カルバイオケム社製）、分子量 615、六員環 3つ五員環 1つの両イオン 性界面活性剤 (商品名： CHAPS、同仁化学社製)、分子量 878、六員環 3つ五員環 1 つの非イオン性界面活性剤 (商品名： BIGCHAP、同仁ィ匕学社製)を用いた場合、界 面活性剤未添加と比較すると、どの条件にぉ 、ても多剤耐性ではな ヽ黄色ブドウ球 菌由来の偽陽性抑制効果は得られた力 TxlOOおよび SB3-14よりも CHAPSおよび BI GCHAPの効果が大きい結果となった。従って、界面活性剤の分子量は 300以上が好 ましぐ 600以上がより好ましぐ六員環等の環状構造を多く含むことが好ましいと考え られる。偽陽性を抑える目的では不溶性担体と同じチャージを保持する界面活性剤 を用いることが望ましぐ不溶性担体がマイナスチャージであるラテックスや金コロイド である場合は界面活性剤もマイナスチャージであることが好ましい。
[0066] 特に偽陽性が懸念されるのは、黄色ブドウ球菌の細胞膜に存在するプロテイン Aで ある。プロテイン Aは免疫グロブリン Gの Fc部分に強い結合性をもつ。標識試薬と捕捉 試薬には PBP2'を特異的に認識する抗体を使用する。抗体は免疫グロブリン G、免 疫グロブリン Mなど特に種類は問わないが、免疫グロブリン Gを使用する場合、 Fc部 分を除去した状態で使用し捕捉試薬部分では上記界面活性剤と組み合わせること で、プロテイン Aによる偽陽性を回避できる。 Fc部分の除去は、ペプシンやパパインな どの既知の分解酵素を使用することで容易に行うことができる。
[0067] グループ Gの連鎖球菌の細胞壁中に含まれるプロテイン Gも免疫グロブリン Gの Fc 部分と特異的に結合する。そのため検体液にグループ Gの連鎖球菌が含まれて 、る 場合、プロテイン Aと同様に標識試薬、あるいは捕獲試薬と非特異反応を起こすこと が予想され、この偽陽性の回避にも上記方法を同様に用いることができる。
[0068] 捕捉試薬部分に添加する界面活性剤のうち、特にイオン性界面活性剤は捕捉試 薬部分を通過する溶液内の陰イオンまたは陽イオン濃度によってその性質が変化す る。そのため使用する界面活性剤の種類や濃度、性質によって溶液内の陰イオンま たは陽イオンの至適濃度を求める必要がある。陰イオンとしては、例えば、イオンィ匕 傾向の大きい塩化物イオン、臭化物イオン、ヨウ化物イオン等が挙げられる。また、陽 イオンとしてはイオン化傾向の大きいカリウムイオン、カルシウムイオン、ナトリウムィォ ン、マグネシウムイオン等があげられる。この際、複数の陰イオンまたは複数の陽ィォ ンを用いてもよい。 [0069] 本発明の方法である、スルホベタイン領域を含んだ界面活性剤を捕捉試薬部位に 添加することで、感度上昇効果が得られる。ラテックス凝集法による PBP2'検出試薬 では感度良く PBP2'を検出できないがために、菌液のアルカリ試薬存在下での煮沸 処理により細胞壁を破壊し、完全に PBP2'を抽出する必要があった。今回の発明に おけるスルホベタイン領域を含んだ界面活性剤の添加により感度上昇することで、煮 沸処理を行わない不完全な PBP2'の溶出状態でも感度良く検出することが可能とな つた。また、アルカリ試薬存在下での煮沸処理を行うことによって PBP2'の分解、また は構造変化による抗体認識部位の変性等による感度低下が起こるが、煮沸処理を行 わないことにより感度が維持される利点もある。
[0070] スルホベタイン領域を含む界面活性剤としては、 CHAPS、 CHAPSO、 Myristylsulfob etaine (SB3- 14)、 Dodecyl dimethyl ammonio butane sulfonate (DDABS)などが挙げら れる。
[0071] 上記の偽陽性の原因物質と捕捉抗体の結合を阻害する界面活性剤および感度を 上昇させる為の界面活性剤は、捕捉試薬部位に捕捉試薬を固相する際に、捕捉試 薬に界面活性剤をあらかじめ添加しておく。偽陽性原因物質と捕捉抗体の結合を阻 害する界面活性剤と、感度を上昇させる効果のあるスルホベタイン型の界面活性剤 は、一方のみを使用しても良いし併用してもよい。また、偽陽性原因物質と捕捉抗体 の結合を阻害する界面活性剤がスルホベタイン型であってもよぐこの場合は感度を 上昇させる効果が期待できる。
[0072] さらに、本発明の方法は、好ましくは分子量 300以上、より好ましくは 600以上で、ス ルホベタイン領域を含んだ界面活性剤を捕捉試薬部位に添加することで、偽陽性の 原因物質と捕捉抗体の結合を阻害する効果とおよび感度を上昇させる効果を両方あ わせ持つことができる。具体例としては、 CHAPS、 SB3-14が好ましぐ特に CHAPSが 好まし ヽ。複数の界面活性剤を捕捉試薬部位に添加してもよ ヽ。
[0073] また、上記のように陰イオンまたは陽イオンを添加する場合には、陰イオンまたは陽 イオンを多剤耐性ブドウ球菌を含むと推定される検体溶液または検体の前処理によ り細胞壁から遊離した PBP2 'を含むと推定される検体溶液に添加すればよ!ヽ。
[0074] さらに、本発明の方法は、捕捉試薬部位に偽陽性の原因物質が到達することを避 けることにより偽陽性原因物質の影響を防止する方法も包含する。例えば、本発明の 装置の捕捉試薬部位の上流部で偽陽性原因物質を除去すればよ!ヽ。偽陽性原因 物質を除去する方法として、ィムノクロマトグラフィー検出装置上の検体供給部位を ガラス系繊維にすることが望ましい。細菌由来の偽陽性原因物質がガラス系繊維に 吸着し、偽陽性原因物質が捕捉試薬上を通過することを阻害し、結果として偽陽性 を抑えることに繋がる。
[0075] 本発明の方法は、細胞壁合成酵素 PBP2'を抗原として、これに対する抗体を用い た抗原抗体反応に基づく検出法である。従って、検体中に細胞壁合成酵素 PBP2'が 存在すれば本発明の方法で検出可能である。一般に、細胞壁合成酵素 PBP2'は多 剤耐性ブドウ球菌によって特異的に産生され、菌体内に特異的に存在すると考えら れている。
[0076] 多剤耐性ブドウ球菌以外の菌で PBP2，を産生する菌の存在は現在知られて!/、な!/ヽ 。本明細書では、「細胞壁合成酵素 PBP2'を産生する菌」と記述する代わりに一つの 具体例として「多剤耐性ブドウ球菌」を用いて説明している箇所があるが、これら記述 は「多剤耐性ブドウ球菌」に限定する意図ではない。それらは本発明の方法が実施 可能な範囲内にお 、て「細胞壁合成酵素 PBP2 'を産生する菌」と読み替え可能であ る。つまり、多剤耐性ブドウ球菌以外であって PBP2'を産生する菌も本発明の方法で 検出可能である。更に、細胞壁合成酵素 PBP2'を菌体内に含む菌も本発明の方法 で検出可能である。また、一般に、細胞壁合成酵素 PBP2'は多剤耐性ブドウ球菌の 細胞壁の内側にある細胞膜上に特異的に存在すると考えられている。本発明の方法 は、菌の細胞壁を壊す、もしくは融解するための前処理のための PBP2'の抽出試薬を 含む。従って、細胞壁合成酵素 PBP2'を細胞壁の内側に含む菌は本発明の方法で 効果的に検出可能である。
実施例
[0077] 以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明する力 本発明はこの実施例に 限定されるものではない。
[0078] 実施例 1 ィムノクロマトグラフィー検出法による MRSAの PBP2'の検出（図 1)
(1)抗体感作ラテックス粒子の調製および乾燥ィ匕 抗 PBP2'モノクローナル抗体を常法によりペプシンで処理し F(a ) 2を得た。これを 0 .4 mのラテックス粒子に感作し、ポリスチレン不織布に噴霧した。次いで減圧装置 内で 1時間減圧乾燥し、乾燥ラテックス抗体パッドとした。使用時には 4mm間隔で裁 断し、標識部位 2として用いた。
[0079] (2)ィムノクロマトグラフィー検出装置の製作
ラテックス感作に用いた抗 PBP2'モノクローナル抗体とは認識部位を異にする第二 の抗 PBP2'モノクローナル抗体を常法によりペプシンで処理し F(a ) 2を得た。これを 0.075%CHAPSを含むクェン酸緩衝液 (pH6)で希釈し、ニトロセルロースメンブレン（ 固相支持体 5)に塗布し、充分に乾燥した (捕捉試薬部位 3)。対照用試薬として Anti -Mouse IgGsを同様に-トロセルロースメンブレンに塗布し、充分に乾燥した（対照部 位 4)。
[0080] 疎水性シート 7上に捕捉試薬部位 3および対照部位 4を含む固相支持体 5を配置し
、標識試薬部位 2、検体供給部位 1としてガラス系繊維、吸収部位 6として濾紙、を用
V、て任意の場所に配置した。
[0081] (3)検体の前処理
黄色ブドウ球菌 14株を血液寒天培地上で 35°C—晚培養し、 0.2N NaOHに 1白金耳 量を直接懸濁した。同様にコロニー 1個を釣菌後 0.2N NaOH 100 /z Lに懸濁した。そ の後、非イオン性界面活性剤および牛血清アルブミン、ゥサギ IgGを含む 0.6M Tris 塩酸塩緩衝液 50 μ Lで中和した。
[0082] (4)アツセィ
検体前処理済みの液が入った 1.5mLチューブにィムノクロマトグラフィー検出装置 を投入し、 10分後に捕捉試薬 3における呈色を肉眼で評価し、呈色のあるものを陽性
、呈色の見られないものを陰性とした。
[0083] (5)薬剤感受性試験
(3)と同方法で培養した菌株を滅菌した 0.9%塩ィ匕ナトリウム溶液に浮遊し、 578nm の吸光度が 0.3となるように調製した液を、 6 /z g/mLォキサシリン、 4%塩ィ匕ナトリウム を含むミューラーヒントン寒天培地に接種し、 35°Cで 24時間培養後、発育したものを
MRSA、発育しないものを MSSAとした。 [0084] (6)結果
結果を表 1に示した。
[表 1] 白金耳量
Figure imgf000019_0001
コ p二一
Figure imgf000019_0002
[0085] 表 1から、両者の陽性一致率： 100% (4/4)、陰性一致率： 100% (10/10)、従って 全体の一致率： 100% (14Z14)であることが判る。この結果力も本発明の優位さが確 認できた。
[0086] 実施例 2 補足試薬部位への界面活性剤添加の効果
(1) 抗体感作ラテックス粒子の調製および乾燥ィ匕
実施例 1で調製したものを使用した。
[0087] (2) ィムノクロマトグラフィー検出装置の製作
実施例 1と同様に作成した。この際、捕捉試薬部位へ 0.05%の CHAPS、 Txl00、 SB3 —14、 BIGCHAP、 DTAC (Dodecyl Trimethyl Ammonium Chloride)を添カ卩したものと 添カ卩しなかったものを作成し、これを用いた。
[0088] (3) 検体の前処理
薬剤感受性試験で感受性、つまり MSSAと判定された菌株 1株及び、薬剤感受性試 験で耐性、つまり MRSAと判定された菌株 1株を用いて、実施例 1と同様の方法で培 養し、 MSSAについては 2白金耳量および 3白金耳量、 MRSAについては 1白金耳量を 釣菌後、前処理した。
[0089] (4) アツセィ
MSSA1株は希釈せずに実施例 1と同様に試験した。 MRSA1株はさらに 0.2N NaOH と非イオン性界面活性剤および牛血清アルブミン、ゥサギ IgGを含む 0.6MTris塩酸塩 を 2： 1で混合した溶液で 2段階希釈し、 1024倍希釈以上の希釈倍率 150 μ Lにつ 、て 実施例 1と同様に試験した。
[0090] (5) 結果
捕捉試薬部位に界面活性剤を添加したものと未添加のものを比較した。 MSSAを用 いた結果を表 2に示した。陰性判定を一、偽陽性の強弱を +の数で表した。 MRSAを 用いた結果を表 3に示した。陰性判定を—、陽性判定を +で表した。
[表 2]
MSSA
Figure imgf000020_0001
[0091] 界面活性剤未添カ卩および陽イオン界面活性剤である DTAC添加では MSSA 2白金 耳量で偽陽性を示した。また比較的分子量の小さ 、Τχ100添加または SB3-14添加で は、未添加または DTAC添加ほどではないが 3白金耳量で偽陽性を示した。一方比 較的分子量の大きい CHAPS添カ卩または BIGCHAP添カ卩においては 2白金耳量、 3白 金耳量で陰性を示した。
[0092] 表 2から非イオン性界面活性剤である Txl00、 BIGCHAPまたは両イオン性界面活 性剤である CHAPSもしくは SB3-14を捕捉試薬部位へ添加することにより、 MSSA由来 の偽陽性を抑制することが判る。なお、環状構造を多く含み分子量の大きい CHAPS または BIGCHAPでは偽陽性の抑制効果がより大きいことが判る。この結果から、捕捉 試薬部位へ界面活性剤を添加することの優位さを確認できた。
[表 3]
MRSA
Figure imgf000020_0002
捕捉試薬部位に CHAPSまたは SB3-14を添加することにより感度が上昇した。 DTA Cを添カ卩したものでは偽陽性と思われた。 [0094] 表 3からスルホベタイン型界面活性剤である SB3-14または CHAPSを捕捉試薬部位 へ添加することにより、界面活性剤未添加および、スルホベタイン型ではない界面活 性剤である TxlOOまたは BIGCHAPを添加したものと比較して、感度を上昇させる効果 があることが判る。この結果カゝらスルホベタイン型界面活性剤を捕捉試薬部位へ添カロ することの優位さを確認できた。
[0095] 実施例 2の結果より、特に CHAPSが偽陽性の抑制する高い効果および感度を上昇 させる高い効果の両方をあわせ持ち、特に有用であることがわかる。
[0096] 実施例 3 ィムノクロマトグラフィー検出法による MRCNSの PBP2'の検出
(1)抗体感作ラテックス粒子の調製および乾燥ィ匕
実施例 1で調製したものを使用した。
[0097] (2)ィムノクロマトグラフィー検出装置の作成
実施例 1と同様に作成したものを使用した。
[0098] (3)検体の前処理
グラム染色でブドウ球菌の性状を示し、カタラーゼ試験で陽性、コアダラーゼ試験 で陰性と判定されたブドウ球菌のうち、薬剤感受性試験でメチシリン感受性、つまり M SCNSと判定された菌株 2株及び、薬剤感受性試験でメチシリン耐性、つまり MRCNSと 判定された菌株 1株を用いて、実施例 1と同様の方法で培養し、 1白金耳量釣菌後、 前処理した。
[0099] (4)アツセィ
実施例 1と同様に実施した。
[0100] (5)薬剤感受性試験
実施例 1と同様の方法で行った。
[0101] (6)結果
結果を表4に示した。薬剤感受性試験で感受性を S、耐性を R、本発明で陽性判定 を +、陰'性判定を—で表した。
[表 4]
Figure imgf000022_0001
[0102] 薬剤感受性試験で感受性、つまり MSCNSと判定された菌 2株に対しては陰性を、薬 剤感受性試験で耐性、つまり MRCNSと判定された菌 1株に対しては陽性を示した。
[0103] 本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本 明細書にとり入れるものとする。

Claims

請求の範囲
[1] 細胞壁合成酵素 PBP2'を産生する菌の検出方法であって、細胞壁合成酵素 PBP2
'を抗原抗体反応に基づくィムノクロマトグラフィー検出法を用いて検出することを特 徴とする、細胞壁合成酵素 PBP2'を産生する菌の検出方法。
[2] シート状の固相支持体上に細胞壁合成酵素 PBP2'を産生する菌を含むと推定され る検体溶液または検体の前処理により細胞壁から遊離した PBP2 'を含むと推定され る溶液を供給する検体供給部位、 PBP2'に特異的に結合する抗体を標識した標識 試薬を固相支持体上で展開可能に保持した標識試薬部位、 PBP2'と標識試薬の複 合体を特異的に結合捕捉し得る捕捉試薬を固定化した捕捉試薬部位が含まれるィ ムノクロマトグラフィー検出装置を用いることを特徴とする請求項 1記載の細胞壁合成 酵素 PBP2'を産生する菌の検出方法。
[3] PBP2 'と標識試薬が固相支持体と分離した部位で予め接触し、検体供給部位に細 胞壁合成酵素 PBP2 'を産生する菌を含むと推定される検体溶液または検体の前処 理により細胞壁から遊離した PBP2'を含むと推定される溶液及び PBP2'に特異的に 結合する抗体を標識した標識試薬を含む検体試薬混合溶液を検体供給部位に供 給する、請求項 1または 2に記載の細胞壁合成酵素 PBP2'を産生する菌の検出方法
[4] 標識試薬が、不溶性担体に抗体が結合したものである、請求項 2または 3に記載の 細胞壁合成酵素 PBP2'を産生する菌の検出方法。
[5] 捕捉試薬部位に両イオン性界面活性剤、陰イオン性界面活性剤および Zまたは非 イオン性界面活性剤を含む請求項 2〜4のいずれか 1項に記載の細胞壁合成酵素 P
BP2'を産生する菌の検出方法。
[6] 捕捉試薬部位にスルホベタイン型の界面活性剤を含む請求項 2〜5の ヽずれか 1 項に記載の細胞壁合成酵素 PBP2'を産生する菌の検出方法。
[7] 細胞壁合成酵素 PBP2 'を産生する菌を含むと推定される検体溶液または検体の前 処理により細胞壁から遊離した PBP2 'を含むと推定される溶液に該溶液を検体供給 部位に供給する前にイオン化傾向の大きい陰イオンを添加する、請求項 5または 6に 記載の細胞壁合成酵素 PBP2'を産生する菌の検出方法。
[8] イオン化傾向の大きい陰イオンは塩化物イオン、臭化物イオンおよびヨウ化物ィォ ンカ なる群より選ばれた 1種以上の陰イオンである請求項 7記載の細胞壁合成酵素
PBP2'を産生する菌の検出方法。
[9] 細胞壁合成酵素 PBP2 'を産生する菌を含むと推定される検体溶液または検体の前 処理により細胞壁から遊離した PBP2 'を含むと推定される溶液に該溶液を検体供給 部位に供給する前にイオン化傾向の大き 、陽イオンを添加する請求項 5〜8の 、ず れカ 1項に記載の細胞壁合成酵素 PBP2'を産生する菌の検出方法。
[10] イオン化傾向の大きい陽イオンがカリウムイオン、カノレシゥムイオン、ナトリウムイオン およびマグネシウムイオン力 なる群より選ばれた 1種以上の陽イオンである請求項 9 記載の細胞壁合成酵素 PBP2'を産生する菌の検出方法。
[11] 検体をアルカリ処理および中和により前処理する工程を含む請求項 1〜： LOのいず れカ 1項に記載の細胞壁合成酵素 PBP2'を産生する菌の検出方法。
[12] アルカリ処理力 アルカリ金属の水酸ィ匕物若しくは炭酸塩、アルカリ土類金属の水 酸化物若しくは炭酸塩の水溶液を用いて行われる請求項 11記載の細胞壁合成酵 素 PBP2'を産生する菌の検出方法。
[13] アルカリ金属の水酸ィ匕物若しくは炭酸塩、アルカリ土類金属の水酸ィ匕物若しくは炭 酸塩の水溶液の pHが 11以上である、請求項 12記載の細胞壁合成酵素 PBP2'を産 生する菌の検出方法。
[14] アルカリ金属の水酸ィ匕物若しくは炭酸塩、アルカリ土類金属の水酸ィ匕物若しくは炭 酸塩の濃度が 0.01N〜 1.ONである、請求項 12または 13に記載の細胞壁合成酵素 PB
P2'を産生する菌の検出方法。
[15] 緩衝液でアルカリ処理後の水溶液を中和する請求項 11〜14のいずれか 1項に記 載の細胞壁合成酵素 PBP2'を産生する菌の検出方法。
[16] 検体供給部位がガラス系繊維力もなる請求項 1〜15の 、ずれか 1項記載の細胞壁 合成酵素 PBP2'を産生する菌の検出方法。
[17] 細胞壁合成酵素 PBP2'を産生する菌が多剤耐性ブドウ球菌である請求項 1〜16の いずれか 1項に記載の細胞壁合成酵素 PBP2'を産生する菌の検出方法。
[18] シート状の固相支持体上に細胞壁合成酵素 PBP2'を産生する菌を含むと推定され る検体溶液または検体の前処理により細胞壁から遊離した PBP2 'を含むと推定され る溶液を供給する検体供給部位、 PBP2'に特異的に結合する抗体を標識した標識 試薬を固相支持体上で展開可能に保持した標識試薬部位、 PBP2'と標識試薬の複 合体を特異的に結合捕捉し得る捕捉試薬を固定化した捕捉試薬部位が含まれ、捕 捉試薬部位に両イオン性界面活性剤、陰イオン性界面活性剤および Zまたは非ィ オン性界面活性剤が含まれる細胞壁合成酵素 PBP2'を産生する菌検出用ィムノクロ マトグラフィー検出装置。
[19] 捕捉試薬部位にスルホベタイン型の界面活性剤を含む請求項 18記載の細胞壁合 成酵素 PBP2'を産生する菌検出用ィムノクロマトグラフィー検出装置。
[20] 検体供給部位がガラス系繊維からなる請求項 18または 19に記載の細胞壁合成酵 素 PBP2'を産生する菌検出用ィムノクロマトグラフィー検出装置。
[21] 細胞壁合成酵素 PBP2'を産生する菌が多剤耐性ブドウ球菌である請求項 18〜20 のいずれか 1項に記載の細胞壁合成酵素 PBP2'を産生する菌検出用ィムノクロマトグ ラフィー検出装置。
[22] 請求項 18〜 21の 、ずれか 1項に記載の細胞壁合成酵素 PBP2 'を産生する菌検出 用ィムノクロマトグラフィー検出装置、ならびに細胞壁合成酵素 PBP2'を産生する菌 を含むと推定される検体溶液または検体の前処理により細胞壁から遊離した PBP2' を含むと推定される溶液に添加するためのイオン化傾向の大きい陰イオンまたは陽 イオン溶液を含む細胞壁合成酵素 PBP2'を産生する菌検出用キット。
[23] イオン化傾向の大きい陰イオンは塩化物イオン、臭化物イオンおよびヨウ化物ィォ ンカ なる群より選ばれた 1種以上の陰イオンである請求項 22記載の細胞壁合成酵 素 PBP2'を産生する菌検出用キット。
[24] イオン化傾向の大きい陽イオンがカリウムイオン、カノレシゥムイオン、ナトリウムイオン およびマグネシウムイオン力 なる群より選ばれた 1種以上の陽イオンである請求項 2 2記載の細胞壁合成酵素 PBP2'を産生する菌検出用キット。
[25] さらに、検体アルカリ処理用のアルカリ溶液および中和用の緩衝液を含む請求項 2 2〜24のいずれか 1項に記載の細胞壁合成酵素 PBP2'を産生する菌検出用キット。
[26] アルカリ溶液力 アルカリ金属の水酸ィ匕物若しくは炭酸塩、アルカリ土類金属の水 酸化物若しくは炭酸塩の水溶液である請求項 25記載の細胞壁合成酵素 PBP2 'を産 生する菌検出用キット。
[27] アルカリ金属の水酸ィ匕物若しくは炭酸塩、アルカリ土類金属の水酸ィ匕物若しくは炭 酸塩の水溶液の pHが 11以上である、請求項 26記載の細胞壁合成酵素 PBP2'を産 生する菌検出用キット。
[28] アルカリ金属の水酸ィ匕物若しくは炭酸塩、アルカリ土類金属の水酸ィ匕物若しくは炭 酸塩の濃度が 0.01N〜1.0Nである、請求項 26または 27に記載の細胞壁合成酵素 PB P2'を産生する菌検出用キット。
[29] 細胞壁合成酵素 PBP2'を産生する菌が多剤耐性ブドウ球菌である請求項 22〜28 のいずれか 1項に記載の細胞壁合成酵素 PBP2'を産生する菌検出用キット。
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