KR20070001935A - 세포의 세포벽 성분의 시그날 검출을 증진시키는 방법 - Google Patents

세포의 세포벽 성분의 시그날 검출을 증진시키는 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 세포를 분해하여 세포벽 단편을 형성하고 세포벽 단편을 분석하는 것을 포함하는, 세포벽 성분의 시그날 검출을 증진시키는 방법에 관한 것이다.
세포, 세포벽, 시그날, 단백질, 스타필로코쿠스 아우레우스

Description

세포의 세포벽 성분의 시그날 검출을 증진시키는 방법{METHOD OF ENHANCING SIGNAL DETECTION OF CELL-WALL COMPONENTS OF CELLS}
통상 사용되는 항생제에 대하여 내성을 갖는 세균의 출현이 감염된 개체의 치료와 중대한 관련성을 갖는 문제로서 증가되고 있다. 따라서, 초기 단계에서 상기 세균의 존재를 결정하고 상대적으로는 신속한 방식으로 상기 세균을 보다 잘 제어하는 것에 대한 중요성은 증가되고 있다. 이는 또한, 다양한 다른 미생물에 대하여도 적용된다.
두드러지게 관심의 대상의 되는 미생물 중 하나는 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus) ("S. 아우레우스(S. aureus)")이다. 이는 광범위한 감염: 표재성 병변 예로서, 작은 피부 농양 및 상처 감염; 전신성 및 생명 위협성 이상 예로서, 심장내막염, 폐렴 및 패혈증; 및 중독증 예로서, 식중독 및 독소 충격 증후군을 유발하는 병원체이다. 몇몇 균주 (예: 메티실린-내성 S. 아우레우스)는 단지 몇몇 정선된 항생제를 제외한 모든 항생제에 대하여 내성을 나타낸다.
항생제에 대하여 내성을 갖는 미생물, 특히, 세균을 검출하는 현 기술은 일반적으로 시간이 많이 소비되고 전형적으로 순수한 형태의 세균을 배양하는 것을 포함한다. 급성 감염과 관련된 병원성 스타필로코카시, 즉, 인간 및 동물에서 S. 아우레우스 및 동물에서 S. 인터메디우스(S. intermedius) 및 S. 하이쿠스(S. hyicus)를 확인하기 위한 하나의 기술은 혈장을 응고시키는 미생물에 능력에 기초한다. 적어도 2개의 혈장응고효소 시험이 기술되어 있다: 유리형 혈장응고효소에 대한 튜브 시험 및 결합형 혈장응고효소 또는 응고 인자에 대한 슬라이드 시험. 튜브 혈장응고효소 시험은 전형적으로 뇌 심장즙 배지중 배양액을 재구성된 혈장과 밤새도록 혼합하고, 혼합물을 4시간동안 인큐베이션시키고 응고물 형성을 위해 서서히 튜브에 포장을 씌우고 응고물 형성에 대하여 튜브를 관찰하는 것을 포함한다. 응고물 형성을 위해 소수의 균주는 4시간 초과의 시간을 요할 수 있기 때문에 S. 아우레우스를 위해서는 밤새도록 시험물을 인큐베이션시키도록 권고되었다. 슬라이드 혈장응고효소 시험은 전형적으로 더욱 신속하고 더욱 경제적이다; 그러나, 10% 내지 15%의 S. 아우레우스 균주는 음성 결과를 나타낼 수 있고, 이는 분리물을 시험 튜브 시험으로 재검할 것을 요한다.
S. 아우레우스, 및 다른 미생물을 검출하는 방법이 본 분야에 기술되어 있지만, 개선된 검출 방법이 잇점을 제공할 것이다.
요약
본 발명은 세포를 분해하여 세포벽 단편을 형성하고 관심의 대상이 되는 성분에 대하여 세포벽 단편을 분석하는 것을 포함하는, 세포벽 성분의 시그날 검출을 증진시키는 방법을 제공한다. 특히, 본 발명은 미생물, 특히, 스타필로코쿠스 아우레우스의 특징적인 하나 이상의 세포 성분을 검출하는데 유용하다.
한 실시태양에서, 본 발명은 세포의 세포벽 성분의 시그날 검출을 증진시키는 방법을 제공한다. 본 발명은 세포를 포함하는 시험 샘플을 제공하고; 세포를 분해하여 세포벽 단편을 포함하는 분해물을 형성하고; 세포벽 성분에 대하여 세포벽 단편을 분석하되, 세포벽 성분은 분해되지 않은 세포내의 동일한 성분과 비교하여 증진된 시그날을 나타내는 것을 포함한다.
또 다른 실시태양에서, 스타필로코쿠스 아우레우스의 특징적인 세포의 세포벽 성분의 시그날 검출을 증진시키는 방법을 제공한다. 본 발명은 미배양된 세포를 포함하는 시험 샘플을 제공하고; 미배양된 세포를 분해하여 세포벽 단편을 포함하는 분해물을 형성하고; 스타필로코쿠스 아우레우스의 특징적인 세포벽 성분에 대하여 세포벽 단편을 분석하되, 스타필로코쿠스 아우레우스의 특징적인 세포벽 성분은 분해되지 않은 세포내의 동일한 성분과 비교하여 증진된 시그날을 나타내는 것을 포함한다.
또 다른 실시태양에서, 스타필로코쿠스 아우레우스의 특징적인 세포의 세포벽 성분의 시그날 검출을 증진시키는 방법을 제공한다. 본 발명은 미배양된 세포를 포함하는 시험 샘플을 제공하고; 미배양된 세포를 리소스타핀과 접촉시켜 세포벽 단편을 포함하는 분해물을 형성하고; 단백질 A에 대하여 세포벽 단편을 분석하되, 세포벽 단편중 단백질 A는 분해되지 않은 세포내의 단백질 A와 비교하여 증진된 시그날을 나타내는 것을 포함한다.
용어 "포함하다" 및 그의 파생어는 명세서 및 청구 범위에서 상기 용어들이 나타내는 제한적인 의미를 갖지는 않는다.
본원에서 사용되는 바, "하나(a)," "하나(an)," "그(the)," "적어도 하나," 및 "하나 이상"은 상호교환적으로 사용된다.
상기의 본 발명의 요약이 본 발명의 각 기술되는 실시태양 또는 본 발명의 모든 실행을 기술하고자 하는 것은 아니다. 하기의 기술이 예시되는 실시태양을 더욱 특히 예시한다. 명세서를 통해 수개의 부분에서, 일례 목록을 통해 가이던스가 제공되고, 일례는 다양한 조합에 의해 사용될 수 있다. 각각의 경우, 인용된 목록은 대표적인 군으로서만 사용되고 배타적인 목록으로서 해석되어서는 안된다.
본 발명은 예를 들면, 원핵 및 진핵 유기체로부터의 세포의 세포벽 성분의 시그날 검출을 증진시키는 방법을 제공한다. 본 발명은 시험 샘플중 세포 (배양될 수 있거나 배양되지 않을 수 있다)를 분해하여 세포벽 단편을 형성하고 관심의 대상이 되는 성분에 대하여 세포벽 단편을 분석하는 것을 포함한다.
특히, 본 발명의 방법은 관심의 대상이 되는 종 (예: 관심의 대상이 되는 미생물)의 특징적인 하나 이상의 세포 성분, 임의로 관심의 대상이 되는 종(예: 관심의 대상이 되는 항생제 내성 미생물)의 추가로 특징적인 하나 이상의 내부 세포 성분을 검출하는데 유용하다. 본원에서, 분석되는 세포벽 단편은 세포벽의 고체 조각들인 것으로 판단된다. 즉, 분해시 가용화되지 않으며, 오히려, 세포벽은 단지 조각들로 분해되는 것으로 판단된다. 추가로, 분석되는 세포벽 단편 성분은 여전히 세포벽 단편의 일부이다 (즉, 세포벽 중 또는 그 위에 있다). 즉, 분해시 가용화되지 않는다. 현저하게는, 이는 분해되지 않은 세포내의 동일한 성분과 비교하여 세포벽 성분의 시그날을 증진시킨다.
특히 관심의 대상이 되는 미생물(microbes) (즉, 미생물(microorganisms))은 그람 양성 세균, 그람 음성 세균, 진균, 원생동물, 미코플라스마, 효모, 바이러스, 및 지질로 피막된 바이러스(lipid-enveloped viruses)도 포함한다. 특히, 관련 유기체로서 엔테로박테리아세아에(Enterobacteriaceae) 과의 구성원, 또는 스타필로코쿠스 spp. 속, 스트렙토코쿠스 spp.(Streptococcus spp .) 속, 슈도모나스 spp.(Pseudomonas spp .) 속, 엔테로코쿠스 spp.(Enterococcus spp .) 속, 에쉬르키아 spp.(Esherichia spp .) 속, 바실러스 spp.(Bacillus spp .) 속, 리스테리아 spp.(Listeria spp .) 속, 비브리오 spp.(Vibrio spp .) 속, 및 허피스 바이러스, 아스퍼질러스 spp.(Aspergillus spp .) 속, 푸사리움 spp.(Fusarium spp .) 속, 및 칸디다 spp.(Candida spp .) 속을 포함한다. 특히, 병독성 유기체는 스타필로코쿠스 아우레우스 (내성 균주 예로서, 메티실린 내성 스타필로코쿠스 아우레우스 (MRSA) 포함), S. 에피더미디스(S. epiderminas), 스트렙토코쿠스 뉴모니아에(Streptococcus pneumoniae), S. 아가락티아에(S. agalactiae), S. 피오게네스(S. pyogenes), 엔테로코쿠스 패칼리스(Enterococcus faecalis), 반코마이신 내성 엔테로코쿠스 (VRE), 반코마이신 내성 스타필로코쿠스 아우레우스 (VRSA), 반코마이신 중간-내성 스타필로코쿠스 아우레우스 (VISA), 바실러스 안트라시스(Bacillus anthracis), 슈도모나스 애루지노사(Pseudomonas aeruginosa), 에쉬르키아 콜라이(Escherichia coli), 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger), A. 푸미카투스(A. fumigatus), A. 클라바투스(A. clavatus), 푸사리움 솔라니(Fusarium solani), F. 옥시프로럼(F. oxysporum), F. 클라미도스포럼(F. chlamydosporum), 리스테리아 모노사이토게네스(Listeria monocytogenes), 비브리오 콜레라(Vibrio cholera), V. 파라헤몰리티쿠스(V. parahemolyticus), 살모넬라 콜레라수이스(Salmonella cholerasuis), S. 티피(S. typhi), S. 티피뮤리움(S. typhimurium), 칸디다 알비칸스(Candida albicans), C. 글라브라타(C. glabrata), C. 크루세이(C. krusei), 및 다중 약물 내성 그람 음성 로드 (MDR)를 포함한다.
그람 양성 및 그람 음성 세균이 관심의 대상이 된다. 특히 관심의 대상이 되는 것은 그람 양성 세균, 예로서, 스타필로코쿠스 아우레우스이다. 전형적으로, 이들은 세균의 특징적인 세포벽 성분, 예로서, 세포벽 단백질의 존재를 검출함으로써 검출될 수 있다. 또한, 특히 관심의 대상이 되는 것은 MRSA, VRSA, VISA, VRE, 및 MDR을 포함하는 항생제 내성 미생물이다. 전형적으로, 이들은 내부 세포 성분, 예로서, 막 단백질의 존재를 추가적으로 검출하여 검출할 수 있다.
미생물의 특징적인 세포벽 성분에 대한 시그날이 증진되기 때문에 본 발명은 상기 미생물에 대한 샘플을 분석하는 통상의 기술보다 유리하다. 상기 세포벽 성분은 예를 들면, 세포벽 단백질, 예로서, 단백질 A 및 미생물 표면 성분 인식 부착 매트릭스 분자 (MSCRAMMs), 예로서, 섬유소원-결합 단백질 (예: 응괴 인자), 섬유결합소-결합 단백질, 콜라겐-결합 단백질, 헤파린/헤파린-관련 다당류 결합 단백질 등을 포함한다. 단백질 A 및 응괴 인자, 예로서, 섬유소원-결합 단백질 및 응괴 인자 A, B, 및 Efb 또한 스타필로코쿠스 아우레우스의 존재를 검출하는 방법에서 특히 유용하다. 관심의 대상이 되는 다른 세포벽 성분은 캡슐 다당류 및 세포벽 탄수화물 (예: 테이코산 및 지질타이코산)을 포함한다.
상기 미생물 또는 관심의 대상이 되는 다른 종은 예로서, 생리학적 체액, 예를 들면, 혈액, 침, 수정체액, 윤활액, 뇌척수액, 농, 땀, 삼출물, 뇨, 점액, 수유 젖 등과 같은 임의의 소스로부터 유래될 수 있는 시험 샘플중에서 분석될 수 있다. 추가로, 시험 샘플은 신체 부위, 예로서, 상처, 피부, 콧구멍, 두피, 손톱 등으로부터 유래될 수 있다.
본 분야에는 S. 아우레우스와 같은 미생물의 검출을 위한 다양한 환자 샘플링 기술이 기술되어 있다. 상기 샘플링 기술이 본 발명의 방법에도 적절하다. 환자의 콧구멍을 문지르는 것으로부터 샘플을 수득하는 것이 보편적이다. 특히 바람직한 샘플링 기술은 대상자 (예: 환자)의 앞콧구멍을 멸균 면봉 또는 샘플링 장치로 문지르는 것을 포함한다. 예를 들면, 하나의 면봉, 즉, 양쪽 콧구멍을 위해 하나의 면봉을 사용하여 각 대상자를 샘플링한다. 샘플링은 예를 들면, 건식 또는 적절한 용액으로 미리-습윤화시킨 면봉 (영국 이스트 그린스테드에 소재하는 퓨리탄(Puritan)으로부터 상표명 "Pure-Wraps"하에 입수가능)을 대상자의 콧구멍 앞쪽 팁으로 삽입시키고 대상자의 콧구멍 점막 표면을 따라 2회 완전히 회전시켜 실시될 수 있다. 전형적으로, 이어서 면봉을 직접 배양하거나 전형적으로 완충액 및 적어도 하나의 계면활성제와 임의로 배합된 물을 포함하는 적절한 용액으로 추출한다.
생리학적 체액외에도, 다른 시험 샘플은 다른 액체뿐만 아니라 액상 매질에 용해된 고체(들)를 포함할 수 있다. 관심의 대상이 되는 샘플은 프로세스 스트림, 물, 토양, 식물 또는 다른 식생, 대기, (예: 오염된) 표면 등을 포함할 수 있다.
점성 체액 희석액과 같은 시험 샘플 (예: 액체)을 사전 처리할 수 있다. 샘플 포트로 주입하기 전에 시험 샘플 (예: 액체)을 농축, 여과, 원심분리, 증류, 투석 등; 천연 성분의 희석, 여과, 불활성화, 시약 첨가, 화학 처리 등과 같은 다른 방법으로 처리할 수 있다.
세포벽 성분의 이러한 시그날 증진은 시험 샘플중 세포를 분해한 결과로서 발생한다. 본 발명의 방법에서, 분해는 세포를 분해제와 접촉시키거나 세포를 물리적으로 분해하는 것을 포함할 수 있다. 통상의 조건, 예를 들면, 약 5℃ 내지 약 37℃, 바람직하게, 약 15℃ 내지 약 25℃의 온도에서 분해를 수행할 수 있다. 현저하게는, 배양된 세포 또한 사용할 수 있지만, 미배양된 세포, 즉, 직접 시험 샘플을 사용할 경우에도 분해는 발생할 수 있다.
세포를 분해하여 세포벽 단편을 형성하여 생성된 세포벽 성분의 시그날 증진의 결과로서, 관심의 대상이 되는 종을 상대적으로 저농도로 갖는 샘플을 평가할 수 있다. 따라서, 이롭게, 본 발명의 방법은 개선된 감수성을 갖는다. 예를 들면, 특정 실시태양의 경우, 시험 샘플은 미생물, 특히, 스타필로코쿠스 아우레우스를 상대적으로 저농도로 가질 수 있다. 상기의 상대적으로 저농도는 예를 들면, 미생물 1 밀리리터당 약 5 X 104 집락 형성 단위("cfu")(cfu/ml) 미만, 약 5 X 103cfu/ml 미만, 1000cfu/ml 미만, 및 500cfu/ml 만큼 낮은 것을 포함한다. S. 아우레우스와 같은 미생물을 예를 들면, 5 X 107cfu/ml 이하까지의 범위의 고수준으로도 검출할 수 있다.
적절한 분해제는 예를 들면, 리소스타핀, 리소자임, 엔도펩티다아제, N-아세틸무라밀-L-알라닌 아미다아제, 엔도-베타-N- 아세틸글루코사미니다아제, 및 ALE-1와 같은 효소를 포함한다. 원하는 경우, 다양한 효소 배합물을 사용할 수 있다. 리소스타핀은 스타필로코쿠스 아우레우스의 존재를 검출함에 있어 특히 유용하다.
다른 분해제는 염 (예: 카이오트로픽 염), 가용화제 (예: 세제), 환원제 (예: DTT, DTE, 시스틴, N-아세틸 시스테인), 산 (예: HCl), 염기 (예: NaOH)를 포함한다. 원하는 경우, 다양한 분해제 배합물을 사용할 수 있다.
분해는 세포를 물리적으로 분해할 때에도 발생할 수 있다. 시험 샘플을 유리 비드와 함께 와동시킬 때, 초음파 처리할 때, 끓일 때, 또는 시험 샘플을 고압으로 할 때, 예로서, 프렌치 프레스를 사용할 때 물리적 분해는 발생할 수 있다.
원하는 경우, 본 발명의 방법은 세포막과 관련되거나 관련되지 않을 수 있는 내부 세포 성분에 대하여 분해물을 분석하는 것을 포함할 수 있다. 내부 세포 성분은 MRSA, VRSA, VISA, VRE, 및 MDR과 같은 항생제 내성 미생물 분석함에 있어 특히 유용하다. 상기 미생물의 특징이 될 수 있는 내부 세포 성분은 막 단백질을 포함한다. 상기 막 단백질의 예로서 세포질 막 단백질, 외막 단백질, 및 세포막 단백질을 포함한다. 세포질 막 단백질, 예로서, 페니실린 결합 단백질 (PBP) (예: PBP2' 또는 PBP2a)은 특히, 항생제 내성 미생물의 특징이 될 수 있다. 예를 들면, 세포질 막 단백질 PBP2'는 MRSA의 특징이 된다.
본 발명의 방법은 세포벽 성분의 존재를 검출할 수 있을 뿐만 아니라, 바람직하게는, 상기 세포벽 성분을 확인할 수 있는 바, 그에 대한 세포벽 성분이 특징이 되는 미생물을 확인할 수 있는 것을 포함한다. 특정 실시태양에서, 세포벽 성분에 대하여 세포벽 단벽을 분석하는 것은 세포벽 성분을 측량하는 것을 포함한다.
본 발명의 방법에서 사용되는 분석 기술에 따라, 상대적으로 소량의 샘플을 사용할 수 있다. 1-2 밀리리터(ml)만큼 다량의 시험 샘플을 사용할 수 있지만, 유리하게는, 50 마이크로리터(㎕)의 시험 샘플이 특정 방법의 경우에는 충분하다.
본 발명의 방법에서 사용되는 분석 기술에 따라, 검출 시간은 상대적으로 짧을 수 있다. 예를 들면, 검출 시간은 약 300분 미만, 약 250분 미만, 약 200분 미만, 약 150분 미만, 약 100분 미만, 약 60분, 및 약 30분 만큼 짧을 수 있다.
분석 기술은 본 분야의 기술자에게 공지되어 있는 광범위하게 다양한 통상의 기술중 어느 것일 수 있다. 예를 들면, 상기 방법으로 형광 면역크로마토그래피 (예: 미국 특허 번호 제 5,753,517호에 기술된 것과 같은 신속한 분석물 측정 방법), 음향파 센서, ELISA (예: 비색 ELISA), 및 미국 특허 출원 공개 번호 제 2004/0132217호; 2002년 12월 19일 출원된 미국 특허 출원 시리얼 번호 제 10/325,276호; 및 동일자로 출원된 출원인의 양수인의 공계류중인 출원 일련 번호 제 _______의 발명의 명칭 "디아세틸렌 물질로 제작된 비색 센서" (대리인 문서 번호 60422 US002)에 기술되어 있는 것과 같은 다른 비색 기술 (예: 폴리디아세틸렌 (PDA) 물질을 포함하는 비색 센서), 및 표면 플라즈몬 공명 (SPR, 스웨덴 웁살라에 소재하는 바이아코어(Biacore)로부터 입수할 수 있는 바이오센서 타입 사용)을 포함할 수 있다.
효소 면역 측정법 (ELISA)은 중요한 2가지 생물학적 현상에 기초한다: 1) 실제로 무한 갯수의 특이적인 외부 화합물들을 식별하는 항체의 식별 능력 및 2) 검출가능한 화학 반응을 특이적으로 촉진시키는 효소의 능력. 가용성 항체에 결합된 효소에 의해 촉매화되는 차후 반응을 통한 이들 반응의 검출과 함께 외부 화합물에 대한 결합된 항체 및 가용성 항체의 반응의 이러한 조합이 외부 화합물의 매우 감수성이고 특이성인 측정법을 제공한다. 상기 기술은 본 분야의 기술자에게 잘 공지되어 있다.
표면 플라즈몬 공명 (SPR)이 센서 표면의 굴절률 변화를 측정하는 표면 플라즈몬 공명에 기초하는 광학 기술이다. 빛이 광학적으로 밀도가 더 높은 매질 (즉,굴절률이 더욱 높은 것)으로부터 밀도가 더욱 낮은 매질 (즉, 굴절률이 더욱 낮은 것)로 이동할 때, 빛이 경계면과 만나는 각이 임계각을 초과하는 경우 2개의 매질 사이에 경계면에서 내부 전반사 (TIR)가 발생한다. TIR이 발생할 때, 전자기 "소멸파"는 경계면으로부터 굴절률이 더욱 낮은 매질로 전파된다. 경계면이 박층 특정 도전재 (예: 금 또는 은)로 피복되어 있는 경우, 소멸파는 전도체 표면에서 소위 표면 플라즈몬으로 명명된 유리 전자 콘스텔레이션(constellations)과 커플링될 수 있다. 입사광의 특정 각도에서 공명 커플링이 발생되고, 동시에 빛 에너지를 흡수하고 상기 각에서 반사광의 강도를 특징적으로 저하시킨다. 표면 전자기파는 증진된 전기장을 포함하는 제 2 소멸파를 생성시키고, 밀도가 더욱 낮은 매질로 투과된다. 공명각은 입사광의 파장 및 전도성 필름의 성질 및 두께를 포함하는 다수의 인자에 감수성이다. 그러나, 가장 중요하게 각도는 표면 플라즈몬파의 소멸파가 전파되는 매질의 굴절률에 의존한다. 따라서, 다른 요소가 일정하게 유지될 때, 공명각은 매질에서 굴절률 변화에 매우 감수성인 바, 밀도가 더 작은 매질의 굴절률의 직접적인 측정치이다. SPR 소멸파는 경계면으로부터 거리로 지수적으로 붕괴되고, 대략 1 파장의 깊이까지 굴절률이 더욱 낮은 매질을 효과적으로 투과한다. 따라서, 경계면에 매우 근접한 굴절률 변화만이 검출될 수 있다. 이러한 기술은 스웨덴 웁살라에 소재하는 바이아코어로부터 이용할 수 있는 바이오센서 타입을 사용하여 수행될 수 있다.
본 발명의 특정 실시태양에서, 세포벽 성분을 분석하는 방법은 적어도 하나의 물리적 성질의 변화를 검출하는 것을 포함할 수 있다. 이는 파상(wave phase) 및/또는 파 속도를 변화시키는 속도 변화 및/또는 질량 변화를 포함할 수 있다. 특정 실시태양에서, 상기 변화는 바이오센서에 의해 검출될 수 있다.
본원에서 사용되는 바, "바이오센서"는 적어도 하나의 물리절 성질의 변화를 검출하고 검출가능한 변화에 대한 반응으로 시그날을 생성하는 장치를 언급한다. 바이오센서가 변화를 검출하는 수단은 전기화학적 수단, 광학 수단, 전기-광학적 수단, 음향 기계적 수단 등을 포함할 수 있다. 예를 들면, 전기화학적 바이오센서는 전위차 및 전류측정식 측정법을 사용하는 반면, 광학 바이오센서는 흡광도, 형광, 시각적 검출, 또는 발광 및 소멸파를 사용한다. 특정 실시태양을 위해, 검출용 음파 기계적 수단을 사용하는 바이오센서, 예로서, 표면 음파 (SAW) 바이오센서를 사용할 수 있다. 음파 기계적 수단을 사용하는 바이오센서 및 상기 바이오센서의 요소는 예를 들면, 미국 특허 번호 제 5,076,094호; 제 5,117,146호; 제 5,235,235호; 제 5,151,110호; 제 5,763,283호; 제 5,814,525호; 제 5,836,203호; 및 제 6,232,139호에 기술되어 있다.
압전-기초 SAW 바이오센서는 전형적으로 질량 또는 속도의 미세한 변화를 검출할 수 있는 그의 능력에 기초하여 작동한다. 예로서, 미국 특허 번호 제 5,814,525 (렌츨레르(Renschler) 등)에 기술되어 있는 바와 같이, 압전-기초 음파 기계적 장치 부류는 추가로 그의 검출 모드에 의존하여 표면 음파 (SAW), 음파 플레이트 모드 (APM), 또는 수정압전 미세저울 (QCM) 장치로서 다시 구분될 수 있다. 사용되는 음파는 액체와 접촉할 때 장치와 함께 작동할 수 있는 것을 제외하면, APM 장치는 SAW 장치와 유사한 원리로 작동한다. 유사하게, QCM (전형적으로 AT-커트 석영) 장치상의 두개의 반대 전극에 적용되는 다른 전압은 그의 공명 주파수가 피복재의 질량 변화에 비례하여 변화되는 두께 전단파 모드를 유도한다. 음파 전파 방향 (예: 도파관에 평행한 면으로 또는 도파관 면에 수직으로)은 바이오센서가 구성되는 압전재의 결정-커트에 의해 결정될 수 있다. 대다수의 음파 (예: 레일리파, 대부분 Lamb 파)가 면의 안팎으로 전파되는 SAW 바이오센서는 표면과 접촉시 액체로부터 감폭되는 음파 때문에 액체 센싱 적용시에는 사용되지 않는다.
액상 샘플 매질을 위해, 전단 수평형 표면 음파 바이오센서 (SH-SAW)를 바람직하게 사용될 수 있다. SH-SAW 센서는 바람직하게 파동 전파가 전단 수평형 모드로, 즉 도파관에 의해 한정되어진 면에 평행하게 회전할 수 있도록 하는 결정-커트 및 오리엔테이션을 갖는 압전재로부터 구성되고, 이로써, 검출 표면과의 접촉시 액체에 대하여 음파 감폭 손실은 감소된다. 전단 수평형 음파는 예로서, 두께 전단 모드 (TSM), 음향 플레이트 모드 (APM), 표면 스키밍 벌크파 (SSBW), 러브파, 누설파 (LSAW), 및 블류스테인-굴리야브(Bleustein-Gulyaev)(BG)파를 포함할 수 있다.
특히, 러브파 센서는 SH파 모드, 예로서, ST 석영의 SSBW 또는 36°YX LiTa03의 누설파를 지지하는 기판을 포함할 수 있다. 이러한 모드는 바람직하게 박층의 음향 가이드 층 또는 도파관의 적용에 의해 러브파로 전환될 수 있다. 이러한 파장은 주파수에 의존성이고 도파관 층의 전단 파장 속도가 압전 기판의 것보다 낮을 경우 생성될 수 있다.
도파관 물질은 바람직하게 하기 성질 중 하나 이상을 나타내는 물질일 수 있다: 낮은 음향 손실, 낮은 전기 전도성, 물 및 수용액중 강인성 및 안정성, 상대적으로 낮은 음향 속도, 소수성, 고분자량, 고도의 가교결합성 등. 하나의 일례에서, SiO2를 석영 기판상의 음향 도파관 층으로서 사용하였다. 다른 열가소성 및 가교결합된 중합체 도파관 물질의 예로서, 에폭시, 폴리메틸메타크릴레이트, 페놀 수지 (예: NOVALAC), 폴리이미드, 폴리스티렌 등을 포함한다. 본 발명의 검출 카티리지에서 사용되는 음향-기계적 센서와 함께 사용하기 위한 다른 잠재적으로 적절한 도파관 물질 및 구조체는 동일자 출원된 출원인의 양수인의 PCT 출원 번호 제 ______, 발명의 명칭 "음향 센선 및 방법" (대리인 문서 번호 60209WO003)에 기술되어 있다.
다르게는, QCM 장치는 또한 액상 샘플 매질과 함께 사용될 수 있다. 음향-기계적 장치 및 성분를 사용하는 바이오센서는 예로서, 미국 특허 번호 제 5,076,094호(프라이 등); 제 5,117,146호(마틴 등); 제 5,235,235호 (마틴 등); 제 5,151,110호(베인 등); 제 5,763,283호(세르노세크 등); 제 5,814,525호(렌츨레르 등); 제 5,836,203호(마틴 등); 및 제6,232,139호(카살누오보 등)에 기술되어 있다. 전단 수평형 SAW 장치는 예로서, 뉴멕시코 앨버커키에 소재하는 산디아 코포레이션(Sandia Corporation)과 같은 다양한 제조사로부터 입수할 수 있다. 본 발명과 관련하여 사용할 수 있는 몇몇 SH-SAW 바이오센서는 또한 브랜치 등의 ["Low-Level detection of a Bacillus anthracis simulant using Love-wave biosensor on 36°YX LiTa03, "Biosensor and Bioelectronics, 19, 849-859 (2004)]에도 기술되어 있다.
본원에서 논의된 바와 같이, 본 발명의 방법은 다양한 검출 시스템 및 요소 (예: 바이오센서를 포함하는 검출 카티리지)에서 사용될 수 있고, 이는 예로서, 2003년 12월 30일에 출원된 미국 특허 출원 시리얼 번호 제 60/533,169호; 동일자로 출원된 발명의 명칭 "음향-기계적 검출 시스템 및 사용 방법"의 PCT 출원 번호 제 _______ (대리인 문서 번호 59468W0003); 및 동일자로 출원된 발명의 명칭 "검출 카티리지, 모듈, 시스템 및 방법"의 PCT 출원 번호 제 _______ (대리인 문서 번호 60342W0003)에서 찾아볼 수 있다.
몇몇 실시태양에서, 바이오센서는 관심의 대상이 되는 S. 아우레우스 생체분자를 압전 바이오센서의 표면에 부착시키는 반응물 (예: 항체)을 포함한다. S. 아우레우스가 존재하는 경우, 시험 샘플중 분해된 세포를 S. 아우레우스에 대하여 특징적이고 바이오센서 표면상에 고정화되어 있는 단백질 A 특이 항체로 검출될 수 있는 단백질 A에 대하여 분석한다.
추가로, 분해된 세포, 예로서, S. 아우레우스 세균은 세포의 내부 부위 (세포의 세포벽 부위에 반대됨)로부터 단백질 마커를 유리시킨다. 상기 단백질 마커는 S. 아우레우스 반응성 분자에 의해 검출될 수 있다. 이 기술은 메티실린 내성 S. 아우레우스 (MRSA)를 검출하는데 특히 적절하다. 몇몇 실시태양에서, S. 아우레우스 항체는 S. 아우레우스 반응물로서 사용된다. "S. 아우레우스 항체"는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 제공된 항원에 특이적으로 결합하는 능력을 갖는 이뮤노글로블린을 언급한다. 용어 "항체"는 척추 동물, 예로서, 포유 동물 종으로부터 유래되고, 외부 화합물, 예로서, 단백질과도 특이적으로 반응성인 임의의 이소타입 전체 항체 (IgG, IgA, IgM, IgE 등) 및 그의 단편을 포함하고자 한다.
항체는 통상의 기술을 사용하여 단편화될 수 있고 단편은 전체 항체로서 동일한 방식으로 유용성에 대하여 선별될 수 있다. 따라서, 본 용어는 특정 단백질과 선택적으로 반응할 수 있는 항체 분자의 단백질 분해적으로 절단되거나 재조합적으로 제조된 절편을 포함한다. 상기의 단백질 분해적 및/또는 재조합 단편의 비제한적인 예로서, Fab, F(ab')2, Fab, Fv, 및 펩티드 링커에 의해 연결된 VL 및/또는 VH 영역을 포함하는 단일 쇄 항체 (scFv)를 포함한다. scFv's는 공유 결합 또는 비공유 결합으로 연결되어 2개 이상의 결합 부위를 형성할 수 있다. 항체는 본 분야의 기술자에게 공지되어 있는 임의의 검출가능한 부위로 표지화될 수 있다. 몇몇 측면에서, 측정하고자 하는 분석물에 결합하는 항체 (1차 항체)는 표지화되지 않고, 그 대신 표지된 2차 항체 또는 1차 항체에 특이적으로 결합하는 다른 시약의 결합에 의해 간적접으로 검출된다.
다양한 S. 아우레우스 항체가 본 분야에 공지되어 있다. 예를 들면, S. 아우레우스 항체는 시그마-알드리치 및 어큐레이트 케니칼로부터 상업적으로 이용가능하다. 추가로, S. 아우레우스 항체는 미국 특허 번호 제 4,902,616호에 기술되어 있다. 전형적으로, 사용된 항체의 농도는 적어도 2ng/ml이다. 바람직하게, 항체의 농도는 적어도 100ng/ml이다. 예를 들면, 50㎍/ml의 농도로 사용될 수 있다. 전형적으로, 약 500㎍/ml 이하로 사용된다. 앞서 기술된 바와 같이, 바이오센서의 표면상에 S. 아우레우스 항체를 고정화시키는 것이 바람직하다.
본원에 기재된 하나의 분석 기술을 전기 및/또는 전기화학적 방법과 커플링시킬 수 있다. 미생물 대사는 일반적으로 교류저항의 감소를 유발시키는 전도성 및 전기 용량 둘 모두를 증가시킨다. 따라서, 이러한 개념을 포함하는 측정법이 세균을 검출하는 조사 문헌에서 사용되었다. 예를 들면, 재생 벌크 음파 교류저항 센서가 미생물 검출을 위해 개발되었다. 이들 유기체는 그의 대사 산화 환원 반응을 측량가능한 전기 시그날로 변환시킬 수 있다. 따라서, 전기화학적 방법 또한 세균 미생물 검출에 사용될 수 있다. 상기 방법으로 직접적인 전위차 검출, 광-보조형 전압측정 센싱 (LAPS), 및 전류 측정 검출을 포함한다. 호스래디시 퍼옥시다제 태그된 항체를 사용한 산화 환원 반응과 커플링된 ELISA 기술을 전기화학적으로 모니터하였다. 다른 변형으로서 전류 측정 센싱과 조합된 면역여과 기술을 포함한다. 상기 기술은 D. 이비니츠키(D. Ivinitski) 등의 [Biosensor & Bioelectronics, 14, 599-624 (1999)]에 기재되어 있다.
본 발명은 이용가능한 설명을 허용하는, 본 발명자 의해 사전에 확인된 수개의 특정 실시태양을 참고로 하여 기술된다. 그럼에도 불구하고, 현재 사전에 확인된 바 없는 변형을 포함하는 본 발명의 실질적인 변형은 그에 대한 등가물을 포함할 수 있다. 따라서, 본 발명의 범주는 본원에 기술된 상세한 것 및 구조로만 제한하고자 하는 것은 아니며 하기 청구범위, 및 그의 등가물로만 제한하고자 한다.
실시예 1. ELISA 검출
항체를 포함하는 플레이트 제조
폴리스티렌 마이크로웰 플레이트 (코스타 96 웰 세포 배양 클러스터, 덮개가 있는 편평한 바닥, 처리된 조직 배양액, 비발열성, 폴리스티렌 플레이트, 카달로그 번호 3596, 뉴욕주 커밍에 소재하는 커밍 인코포레이티드(Coming Incorporated))를 10㎍/ml의 ChromPure 래빗 IgG (전체 분자, 카탈로그 번호 011-000-003, 펜실베이니아주 웨스트 그로브에 소재하는 잭슨 이뮤노리서치 라보라토리즈(Jackson ImmunoRcsearch Laboratories)) 항체로 피복시켰다. 0.1M의 중탄산나트륨 (pH 9.6) (미주리주 세인트 루이스에 소재하는 시그마-알드리치)중 항체를 희석시켜 항체 용액을 제조하였다. 피복된 플레이트를 37℃에서 1시간동안 인큐베이션시켰다.
플레이트 세척
이어서, 흡인시켜 플레이트를 세척하고 0.02M 인산나트륨 (시그마-알드리치) 및 0.15M 염화나트륨 (시그마-알드리치)으로 구성된 0.25ml의 "PBS 완충액"을 각 웰에 분배하고, 그에 0.05% 용량/용량(v/v) 폴리에틸렌 (20) 소르비탄 모노라우레이트 (상표명 TWEEN 20, 미주리주 세인트 루이스에 소재하는 시그마-알드리치로부터 입수가능)를 가하고, 용액의 pH는 7.5였고, 세척을 5회에 걸쳐 반복하였다.
플레이트 차단
카네이션 탈지 분유 (오하이오주 솔론에 소재하는 네슬레 USA 인코포레이션(Nestle USA, Inc.))를 2% 중량/용량(w/v) 초과의 로딩으로 세척액과 혼합하여 블라터우 용액을 제조하였다. 블라터우 용액 일부 (0.2ml)를 각 웰에 가하고 플레이트를 37℃에서 1시간동안 인큐베이션시켰다. 이어서, 플레이트를 상기와 같이 세척하였다.
세균 현탁액 시료
S. 아우레우스 세균을 메릴랜드주 록빌에 소재하는 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션으로부터 상표명 "ATCC 25923"하에 입수하였다. 세균을 5-10ml의 제조된 멸균 트립틱 소이 배지(Tryptic Soy Broth) (캘리포니아주 산타마리아에 소재하는 하디 다이아그노스틱스(Hardy Diagnostics))에 접종하여 세균을 밤새도록 (17-22시간, 37℃) 배양하였다. 배양액을 원심분리 (Eppendorf 모델 번호 5804R 원심분리기 (뉴욕주 웨스트베리에 소재하는 브릭만 인스트루먼트(Brinkman Instruments))에서 15분동안 8,000-10,000rpm)에 의해 세척하고 0.2% (w/v) PLURONIC L64 계면활성제 (뉴저지 마운트 올리브에 소재하는 BASF 코포레이션)를 함유하는 PBS 완충액에 재현탁시키고 상기 용액을 사용하여 추가로 3회 싸이클 동안 원심분리하여 세척하였다.
세균 희석액
이어서, 세척된 세균 현탁액을 하기 용액으로 희석시켰다.
용액 1은 0.2% (w/v) PLURONIC L64 계면활성제 (BASF 코포레이션)를 포함하 는 PBS 완충액이었다.
용액 2는 0.01M Tris-HCL, 1mM EGTA, 1% Triton X-100, 2.5mM 피로인산나트륨, 1mM 인산나트륨 및 1㎍/ml 류펩틴 (미주리주 세인트 루이스에 소재하는 시그마-알드리치)을 배합하여 제조된 완충액이었다.
용액 3은 3㎍/ml로 리소스타핀와 함께 용액 2를 배합하여 제조된 분해 완충액이었다 (카탈로그 번호 L-4402, 시그마-알드리치).
S. 아우레우스 세균을 108, 2x107, 4x106, 8x105 및 1.6x104/ml의 일련의 5배 희석액으로 각각 3개의 용액으로 희석시켰다.
S. 에피더미디스(S. epidermidis) ATCC 12228 (메릴랜드주 록빌에 소재하는 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션)을 동일한 방식으로 제조하고 S. 에피더미디스 세균을 비교 대상으로서 108/ml로 용액 3으로만 재현탁시켰다.
항원 용액의 ELISA 시험
앞서 피복시키고, 차단시키고 세척시킨 플레이트에 세균을 함유하지 않는 각 용액의 샘플뿐만 아니라 각 항원 시료 및 희석액 샘플을 가하였다. 0.1ml의 샘플 용액을 플레이트상의 각개 마이크로웰에 가하여 각 샘플을 이중으로 플레이팅하였다. 플레이트를 37℃에서 1시간동안 인큐베이션시켰다. 이어서, 플레이트를 상기와 같이 세척하고 0.1ml의 제 1 항체 용액을 적절한 웰에 가하였다.
제 1 항체는 바이오티닐화된 래빗-항-S. 아우레우스 IgG (바이오틴 래빗 항-스타필로코쿠스 아우레우스, 카탈로그 번호 YVS6887, 뉴욕주 웨스트베리에 소재하 는 어큐러트 케미컬 앤드 사이언티픽 컴퍼니(Accurate Chemical and Scientific Company)) 및 바이오티닐화된 마우스 항-단백질 A IgG (모노클로날 항-단백질 어 클론 SPA-27, 바이오틴 컨쥬게이트, 카탈로그 번호 B-3150, 미주리주 세인트 루이스에 소재하는 시그마-알드리치)였다. 상기 항체를 블라터우에서 5㎍/ml로 희석하고, 0.1ml의 제 1 항체 용액을 적절한 웰에 가하였다. 플레이트를 37℃에서 1시간동안 인큐베이션시켰다.
인큐베이션시킨 후, 플레이트를 상기와 같이 세척하고 0.1ml의 스트렙트아비딘-알칼린 포스파타제 컨쥬게이트 (SA-AP, 잭슨 이뮤노리서치 라보라토리즈) 시료를 적절한 웰에 가하였다. 스트렙트아비딘-알칼린 포스파타제 컨쥬게이트 (카탈로그 번호 016-050-084, 잭슨 이뮤노리서치 라보라토리)를 블라터우에서 5㎍/ml로 희석하여 스트렙트아비딘-알칼린 포스파타제 컨쥬게이트 (SA-AP) 시료를 제조하였다. 플레이트를 37℃에서 1시간동안 인큐베이션시킨 후, 상기와 같이 세척하였다.
세척한 후, 0.1ml 부의 알칼린 포스파타제 기질 시료를 적절한 웰에 가하였다. 알칼린 포스파타제 기질 시료는 제조사의 지침에 따라 제조된 파라-니트로페닐 포스페이트 기질(pNPP, 제품 코드 50-80-00, 메릴랜드주 게이터스버그에 소재하는 커테가드 앤드 페리 라보라토리즈(Kirkegaard and Perry Laboratories))이었다. 이어서, 플레이트를 실온에서 15분동안 인큐베이션시켰다. 15분간의 인큐베이션 기간 후, 0.1ml의 5% (w/v) 디소듐 EDTA (시그마-알드리치)를 가하여 효소 촉매화된 기질 현상을 종결시켰다.
405nm에서 바이오-테크 모델(Bio-Tek model) EL808 마이크로웰 플레이트 판 독기 (버몬트주 위누스키에 소재하는 바이오-테크 인스트루먼트 인코포레이션(Bio-Tek Instruments, Inc.))를 사용하여 플레이트를 판독하고 결과는 하기 표 1에 기재한다 (N/A = 적용불가능 (즉, 미측정)).
ELISA 결과 (405nm에서의 흡광도)
세균 농도(cfu/ml)
1차 항체 용액 108 2x107 4x106 8x105 1.6x104 완충액
래빗-바이오틴 PBS-L64 완충액 2.730 1.107 0.376 0.192 0.192 0.267
래빗-바이오틴 분해되지 않은 S. 아우레우스 2.126 0.679 0.235 0.163 0.534 0.144
래빗-바이오틴 분해된 S. 아우레우스 4.000 4.000 4.000 4.000 1.321 0.162
래빗-바이오틴 분해된 S. 에피더미디스 0.300 N/A N/A N/A N/A 0.134
마우스-바이오틴 PBS-L64 완충액 3.895 1.322 0.409 0.243 0.157 0.166
마우스-바이오틴 분해되지 않은 S. 아우레우스 4.000 1.246 0.371 0.265 N/A 0.136
마우스-바이오틴 분해된 S. 아우레우스 4.000 4.000 4.000 4.000 4.000 0.194
마우스-바이오틴 분해된 S. 에피더미디스 0.715 N/A N/A N/A N/A 0.267
실시예 2. 형광 에세이 검출
세균 현탁액 시료 및 희석액
S. 아우레우스 세균을 메릴랜드주 록빌에 소재하는 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션으로부터 상표명 "ATCC 25923"하에 입수하였다. 세균을 5-10ml의 제조된 멸균 트립틱 소이 배지 (캘리포니아주 산타마리아에 소재하는 하디 다이아그노스틱스)에 접종하여 세균을 밤새도록 (17-22시간, 37℃) 배양하였다. 배양액을 원심분리 (Eppendorf 모델 번호 5804R 원심분리기 (뉴욕주 웨스트베리에 소재하는 브릭만 인스트루먼트)에서 15분동안 8,000-10,000rpm)에 의해 세척하고 0.2% (w/v) PLURONIC L64 계면활성제 (뉴저지주 마운트 올리브주에 소재하는 BASF 코포레이션)을 함유하는 PBS 완충액에 재현탁시키고 상기 용액을 사용하여 추가로 3회 싸이클동안 원심분리하여 세척하였다.
이어서, 세척된 S. 아우레우스 25923 현탁액을 2개의 상이한 희석제로 105 내지 103/ml의 10배의 일련의 희석액으로 희석시켰다. 첫번째는 RAMP 에세이 샘플 완충액 1번 (캐나다 BC 버나비에 소재하는 레스판스 바이오메디컬 코포레이션(Response Biomedical Corporation)이고 두번째는 첫번째 완충액과 동일하되, 단, 리소스타핀 (시그마-알드리치)만을 가하여 3㎍/ml 용액으로 수득된 것이었다. 완충액만의 샘플에도 수행되었다(EO).
제조사의 지시에 따라 RAMP 형광 에세이 판독기 (캐나다 BC 버나비에 소재하는 레스판스 바이오메디컬 코포레이션)상에서 에세이를 실시하였다. 결과를 하기 표 2에 제시한다.
전체 및 분해된 S. 아우레우스 25923을 사용한 RAMP 시험
샘플 농도 (cfu/ml) 전체 세포-S. 아우레우스 25923 (dUnits) 분해된 S. 아우레우스 25923 (dUnits)
E5 51.4 999
E4 55.7 108.3
E3 55.8 83.8
E0 44.8 56.5
실시예 3. 비색 검출
폴리카보네이트 막상의 폴리디아세틸렌 리포좀 피복
(60/40) 디아세틸렌 HO(O)C(CH2)2C(O)O(CH2)4-C-C-C=C (CH2)40(0)C(CH2)12CH3 (미국 특허 출원 공개 번호 제 2004/0132217호의 실시예 6에서와 같이 제조) 및 1,2-디메리스토일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (DMPC, 화학식량 (F.W.) 678, 시그마-알드리치로부터 입수 가능, 카탈로그 번호 P2663)의 제제를 다공막 지름이 200nm인, 25mm의 지름을 갖는 다공성 폴리카보네이트 막 (캐나타 오타와에 소재하는 아베스틴 인코포레이션(Avestin, Inc.))상에 피복시켜 비색 검출 샘플을 제조하였다. 휴대용 압출 프로세스를 사용하여 막을 피복시켰다.
60/40 디아세틸렌/DMPC 혼합물을 유리 비알에서 측량하고 HEPES 완충액 (5 mM, pH 7.2)에서 현탁시켜 1mM의 용액을 제조하였다. 이어서, 상기 용액을 미소닉스(Misonix) XL202 탐침 초음파 분쇄기를 사용하여 2분동안 탐침 초음파 처리하고, 4℃의 냉장고에 약 20분동안 놓았다. 상기 프로세스를 통해 폴리디아세틸렌 (PDA) 리포좀이 형성되었다.
피복시키고자 하는 폴리카보네이트 막을 아베스틴 인코포레이션 (캐나타 오타와에 소재)으로부터 입수할 수 있는, 상표명 LIPOFAST의 휴대용 압출 시스템의 스테인리스 스틸 챔버내 놓았다. 막을 TEFLON 베이스 바닥의 O-환을 커버하였다. 막이 구부러지고/거나 구겨지지 않도록 주의하였다. 상부 TEFLON O-환 블럭은 막의 상부상의 스테인리스 스틸 하우징안에 놓았다. 이어서, 스테인리스 스틸 캡을 손으로 단단히 조임으로써 챔버를 밀봉시켰다. 가스 타이트 주입기(Gas Tight syringe (Hamilton 500-마이크로리터(㎕))를 디아세틸렌 리포좀 현탁액으로 충진시키고 바닥에 부착시키고 두번째 주입기는 다른 캡에 부착시켰다. 첫번째 주입기의 리포좀을 일정하게 고른 압력을 사용하여 챔버를 통해 서서히 배출시켰다.
막 표면상의 리포좀을 포획하여 투명한 완충액이 서서히 두번째 주입기내로 흐르도록 하였다. 이러한 작용은 1차 패스 피복으로 간주되었다. 막 샘플을 본 실시예에서 사용되는 2차 피복의 검출기로서 사용하였다. 이미 피복막에 적용된 2차 0.5 밀리리터 (ml)부의 리포좀에 의해 첫번째와 유사하게 2차 패스를 적용시켰다. 충진된 완충액을 함유하는 2차 주입기를 제거하고 내용물은 버렸다. 말단의 스테인리스 스틸 캡의 나사를 풀고 TEFLON O-환 블럭을 제거하였다. 습식 막을 제거하고 유리 슬라이드 상에 피복된 부분이 위쪽에 오도록 놓고 냉장고에서 5℃하에 적어도 3시간동안 방치하였다. 이어서, 샘플을 CaS04을 함유하는 건조기에서 30분동안 건조시키고 30-90초동안 254 나노미터(nm) UV광에 노출시켰다.
PDA-피복된 기판 (25 밀리미터 (mm) 써클)을 4등분으로 절단시켰다. 각 등분의 샘플을 실험용 샘플로서 사용하였다. 기판을 24-웰 마이크로티터 플레이트의 분리형 웰에 놓았다. 1Ox PBS 액상 농축액 (캘리포니아주 샌디에고에 소재하는 EMD 바이오사이언스(EMD Biosciences)로부터 상업적으로 입수가능)을 10배로 희석시켜 인산 완충처리된 염수액을 제조하였다. 이로써, 하기 염 조성물: 10mM 인산나트륨, 137mM 염화나트륨, 2.7mM 염화칼륨을 포함하는 PBS 완충액을 수득하였다. 추가로, 상기 PBS 완충액에 0.2% (w/v) PLURONIC L64 계면활성제 (뉴저지주 마운트 올리브에 소재하는 BASF 코포레이션으로부터 상업적으로 입수가능)을 가하여 PBS L64 완충액을 수득하였다. 전체 S. 아우레우스 세균 ATCC 25923를 함유하는 250㎕ PBS L64 완충액을 250㎕의 항체 용액과 혼합하여 전체 세균 샘플 용액을 제조하였다. 항체 용액은 PBS L64 완충액중 100㎍/ml의 농도로 래빗 항-스타필로코쿠스 아우레우스 (카탈로그 번호 YVS6881, 어큐레이트 케미컬 앤드 사이언티픽 코포레이션(Accurate Chemical and Scientific Corp.))를 함유하였다. PBS L64 완충액중 분해된 S. 아우레우스 세균 ATCC 25923을 함유하는 샘플은 PBS L64 완충액중 3㎍/ml의 농도로 리소스타핀으로 구성된 분해된 완충액 (카탈로그 번호 L-4402, 시그마-알드리치)을 사용하여 제조하였다. 분해된 세균 샘플 용액은 상기와 같이 제조된 250㎕의 항체 용액과 함께 혼합된 PBS-L64중의, 250㎕의 분해된 S. 아우레우스 세균 ATCC 25923으로 구성되었다. 시험 샘플중 사용된 세균의 농도는 하기 표 3에 기록되어 있는 바와 같이 0 내지 105cfu/ml로 다양하였다. 세균 및 항체 용액의 혼합물을 5분동안 방치시킨 후, PDA-피복된 기판을 포함하는 24-웰 플레이트상에 가하였다. 대조군 샘플 또한 비교를 위해 제조하였다. 대조군 샘플은 어떤 세균도 함유하지 않고 상기와 같이 제조된 250㎕의 항체 용액과 함께 혼합된 250㎕의 PBS-L64 완충액만으로 간단히 구성되었다.
디지털 카메라를 사용하여 매 5분마다 사진 촬영하였다. 어도비 시스템 인코포레이티드(Adobe Systems Incorporated) (캘리포니아주 산요세 소재)로부터 입수된, 상표명 ADOBE PHOTOSHOP 버젼 5.0의 소프트웨어를 사용하여 사진을 스캐닝하여 각 센서에 대한 RGB (레드, 그린, 블루) 채널 값을 수득하였다. 비색 반응 (CR)은 식 CR= ((PR초기-PR샘플)/PR초기) (여기에서, PR = 샘플중 레드 값의 퍼센트이고, 이는 식 PR =R값/(R값+B값)*8100 (여기에서, R값 및 B값은 각각 폴리디아세틸렌 센서의 레드 및 블루 채널 값과 일치한다)에 의해 주어진다)에 의해 주어지는 레드 및 블루 채널 값을 사용하여 결정되었다. 하기 표 3의 데이타는 15분간 측정된 대조군 샘플 및 세균 함유 샘플 (전체 또는 분해된 것) 사이의 비색 반응의 차이를 제시한다.
비색 반응의 차이
세균 농도(cfu/ml) 전체 세균에 있어서 대조군과의 비색 반응의 차이 (Δ프렉션 레드) 분해된 세균에 있어서 대조군과의 비색 반응의 차이 (Δ프렉션 레드)
0 0 0
100 0.05 0.17
1,000 0.05 0.58
10,000 0.05 0.52
100,000 0.04 0.64
본 발명의 범주 및 정신을 벗어나지 않는 본 발명에 대한 다양한 수정 및 변형이 본 분야의 기술자에게는 자명할 것이다. 본 발명을 예시적인 실시태양 및 본원에 기술된 실시예로 과도하게 제한하고자 하는 것은 아니며, 상기 실시예 및 실시태양은 본원 하기에 기술되는 청구범위에 의해서만 제한하고자 하는 본 발명의 범주를 포함하는 일례로서만 제시된다.

Claims (38)

  1. 세포를 포함하는 시험 샘플을 제공하는 단계;
    세포를 분해하여 세포벽 단편을 포함하는 분해물을 형성하는 단계; 및
    세포벽 성분에 대하여 세포벽 단편을 분석하는 단계를 포함하며,
    상기 세포벽 성분이 분해되지 않은 세포내의 동일한 성분과 비교하여 증진된 시그날을 나타내는, 세포의 세포벽 성분의 시그날 검출을 증진시키는 방법.
  2. 제 1항에 있어서, 세포벽 성분이 세포벽 단백질을 포함하는 방법.
  3. 제 2항에 있어서, 세포벽 단백질이 단백질 A인 방법.
  4. 제 2항에 있어서, 세포벽 단백질이 응괴 인자인 방법.
  5. 제 1항에 있어서, 세포벽 성분이 캡슐 다당류 또는 세포벽 탄수화물을 포함하는 방법.
  6. 제 1항에 있어서, 세포를 분해하는 것이 세포와 분해제를 접촉시키는 것을 포함하는 방법.
  7. 제 6항에 있어서, 분해제가 리소스타핀, 리소자임, 엔도펩티다아제, N-아세틸무라밀-L-알라닌 아미다아제, 엔도-베타-N-아세틸글루코사미니다아제, ALE-1, 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 효소를 포함하는 방법.
  8. 제 6항에 있어서, 분해제가 염, 가용화제, 환원제, 산, 염기, 또는 이들의 조합을 포함하는 방법.
  9. 제 1항에 있어서, 세포를 분해하는 것이 세포를 물리적으로 분해하는 것을 포함하는 방법.
  10. 제 1항에 있어서, 세포가 하나 이상의 미생물을 포함하는 방법.
  11. 제 10항에 있어서, 미생물이 그람 양성 세균을 포함하는 방법.
  12. 제 11항에 있어서, 그람 양성 세균이 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus)를 포함하는 방법.
  13. 제 10항에 있어서, 미생물이 그람 음성 세균을 포함하는 방법.
  14. 제 1항에 있어서, 세포가 미배양된 방법.
  15. 제 1항에 있어서, 내부 세포 성분에 대하여 분해물을 분석하는 것을 더 포함하는 방법.
  16. 제 15항에 있어서, 세포가 항생제 내성 미생물을 포함하는 방법.
  17. 제 15항에 있어서, 내부 세포 성분이 세포막을 포함하는 방법.
  18. 제 17항에 있어서, 세포막이 막 단백질을 포함하는 방법.
  19. 제 18항에 있어서, 막 단백질이 세포질 막 단백질인 방법.
  20. 제 19항에 있어서, 세포질 막 단백질이 PBP2'인 방법.
  21. 제 1항에 있어서, 세포벽 성분에 대하여 세포벽 단편을 분석하는 것이 세포벽 성분을 확인하는 것을 포함하는 방법.
  22. 제 1항에 있어서, 세포벽 성분에 대하여 세포벽 단편을 분석하는 것이 세포벽 성분을 측량하는 것을 포함하는 방법.
  23. 제 1항에 있어서, 세포벽 성분에 대하여 세포벽 단편을 분석하는 것이 형광 면역크로마토그래피로 분석하는 것을 포함하는 방법.
  24. 제 1항에 있어서, 세포벽 성분에 대하여 세포벽 단편을 분석하는 것이 ELISA로 분석하는 것을 포함하는 방법.
  25. 제 1항에 있어서, 세포벽 성분에 대하여 세포벽 단편을 분석하는 것이 음향파 센서로 분석하는 것을 포함하는 방법.
  26. 제 1항에 있어서, 세포벽 성분에 대하여 세포벽 단편을 분석하는 것이 비색측정으로 분석하는 것을 포함하는 방법.
  27. 미배양된 세포를 포함하는 시험 샘플을 제공하는 단계;
    미배양된 세포를 분해하여 세포벽 단편을 포함하는 분해물을 형성하는 단계; 및
    스타필로코쿠스 아우레우스에 특징적인 세포벽 성분에 대하여 세포벽 단편을 분석하는 단계를 포함하며,
    스타필로코쿠스 아우레우스에 특징적인 세포벽 성분이 분해되지 않은 세포내의 동일한 성분과 비교하여 증진된 시그날을 나타내는, 스타필로코쿠스 아우레우스에 특징적인 세포의 세포벽 성분의 시그날 검출을 증진시키는 방법.
  28. 제 27항에 있어서, 세포벽 성분이 세포벽 단백질을 포함하는 방법.
  29. 제 28항에 있어서, 세포벽 단백질이 단백질 A인 방법.
  30. 제 27항에 있어서, 미배양된 세포를 분해하는 것이 미배양된 세포와 리소스타핀을 접촉시키는 것을 포함하는 방법.
  31. 제 27항에 있어서, 내부 세포 성분에 대하여 분해물을 분석하는 것을 더 포함하는 방법.
  32. 제 31항에 있어서, 내부 세포 성분이 세포막을 포함하는 방법.
  33. 제 32항에 있어서, 세포막이 막 단백질을 포함하는 방법.
  34. 제 33항에 있어서, 막 단백질이 MRSA의 특징적인 세포질 막 단백질인 방법.
  35. 제 34항에 있어서, 세포질 막 단백질이 PBP2'인 방법.
  36. 제 27항에 있어서, 세포벽 성분에 대하여 세포벽 단편을 분석하는 것이 세포 벽 성분을 측량하는 것을 포함하는 방법.
  37. 제 27항에 있어서, 시험 샘플이 5 X 104cfu/ml 미만의 농도로 스타필로코쿠스 아우레우스를 포함하는 방법.
  38. 미배양된 세포를 포함하는 시험 샘플을 제공하는 단계;
    미배양된 세포를 리소스타핀과 접촉시켜 세포벽 단편을 포함하는 분해물을 형성하는 단계; 및
    단백질 A에 대하여 세포벽 단편을 분석하는 단계를 포함하며,
    상기 세포벽 단편 중의 단백질 A가 분해되지 않은 세포내의 단백질 A와 비교하여 증진된 시그날을 나타내는, 스타필로코쿠스 아우레우스에 특징적인 세포의 세포벽 성분의 시그날 검출을 증진시키는 방법.
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