WO2007049827A1 - 核酸アレイにおけるプローブ搭載位置の確認方法 - Google Patents

核酸アレイにおけるプローブ搭載位置の確認方法 Download PDF

Info

Publication number
WO2007049827A1
WO2007049827A1 PCT/JP2006/322063 JP2006322063W WO2007049827A1 WO 2007049827 A1 WO2007049827 A1 WO 2007049827A1 JP 2006322063 W JP2006322063 W JP 2006322063W WO 2007049827 A1 WO2007049827 A1 WO 2007049827A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
nucleic acid
probe
complementary
array
arrays
Prior art date
Application number
PCT/JP2006/322063
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Hiroyuki Ooshima
Yuichiro Nagata
Original Assignee
Mitsubishi Rayon Co., Ltd.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Mitsubishi Rayon Co., Ltd. filed Critical Mitsubishi Rayon Co., Ltd.
Priority to CN2006800397611A priority Critical patent/CN101297199B/zh
Priority to EP06832420.1A priority patent/EP1947456B1/en
Priority to JP2006547644A priority patent/JP4009311B2/ja
Priority to US12/091,522 priority patent/US8014958B2/en
Publication of WO2007049827A1 publication Critical patent/WO2007049827A1/ja

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6834—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase
    • C12Q1/6837—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase using probe arrays or probe chips

Definitions

  • the present invention relates to quality control of a nucleic acid array, and more particularly to a method for confirming the type and position of the nucleic acid probe using a hybridization reaction between a nucleic acid probe on a nucleic acid array and a complementary nucleic acid molecule.
  • a nucleic acid array is an array in which a large number of nucleic acid probes (hereinafter sometimes referred to as probes) are mounted on a carrier independently at a high density so as not to mix with each other.
  • the probe mounted on the nucleic acid array serves as a sensor for capturing a nucleic acid molecule constituted by a sequence that is complementary to the base sequence by hybridization.
  • a probe mounted on a surface-supported glass or silicon carrier is used, but in recent years, the carrier can be modified by other methods such as a gel carrier. Has been done.
  • a method for producing a nucleic acid array a method in which a nucleic acid probe prepared in advance is fixed to a substrate such as a glass slide glass, and a method in which a nucleic acid probe is directly synthesized on the substrate are known.
  • Nucleic acid arrays can be prepared by selectively synthesizing (masking) DNA in a predetermined region (reaction site) of a simple matrix (Science 251, 767-773 (1991)).
  • the spotting method is mainly used as a method for mounting a probe prepared in advance (Science 270, 467-470 (1995)).
  • This method uses a probe prepared by PCR or artificial synthesis in advance.
  • a spotter or an arrayer a solution containing It is a technology that is arranged on the surface and mounted in a specific area on the substrate.
  • a method for producing a microarray using a hollow fiber array has been developed. In this method, the through-hole base is manufactured using a hollow fiber array in which a plurality of hollow fibers made of a synthetic polymer are regularly arranged in the fiber axis direction.
  • One feature of this manufacturing method is that a probe is fixed to each hollow fiber hollow portion of the hollow fiber array, and the hollow fiber array is sliced by a method perpendicular to the fiber axis direction, so that the same This is the point that a large number of microarray products with the same specifications can be manufactured from the rod (Patent No. 3 4 8 8 4 5 6).
  • the nucleic acid detection method using a nucleic acid array is a method in which a nucleic acid sample to be tested is hybridized in a sequence-specific manner to a probe mounted on the nucleic acid array, and a sequence-specific hybrid is formed as a fluorescent substance. It is to detect by such as.
  • a nucleic acid molecule containing a nucleobase sequence in a sample corresponding to a plurality of probes can be examined quantitatively or qualitatively.
  • the expression level or a specific nucleobase sequence of a plurality of nucleobase sequences can be determined. It is used to analyze the sequence itself.
  • a hybridization reaction is carried out under appropriate conditions set in advance, and then a nucleic acid sample remaining on the surface of the array or other unnecessary substances is removed by a washing step, which is specific to the probe.
  • a method of detecting a nucleic acid sample forming a hybrid is employed.
  • Probes are often designed to be complementary or identical to a desired nucleobase sequence to be detected, such as sequence analysis and functional analysis.
  • a relatively long-chain nucleic acid such as cDNA or a synthetic oligonucleic acid having a short chain is used.
  • synthetic oligonucleic acid as a probe, for human organisms such as human mice, we have focused on the homology and function of each sequence using the base sequence information.
  • nucleic acid arrays can be used for gene analysis such as gene expression and gene polymorphism, and are used for diagnosis and treatment of diseases, etc. for research purposes such as elucidation of the mechanism of biological phenomena, and also for gene types It is expected to be applied to industrial applications such as product type discrimination by identifying the On the other hand, it is indispensable to maintain the quality of the nucleic acid array in order to apply to these industrial applications. Establishing a quality management method is an urgent issue.
  • the quality control items it is the most important issue to inspect whether the probe mounted on the manufactured nucleic acid array is correctly mounted at a predetermined position.
  • a method is known in which a nucleic acid array is crushed with a nucleic acid staining agent such as ethimub mouthmide and a probe or a predetermined position where the probe is fixed is stained.
  • a nucleic acid staining agent such as ethimub mouthmide
  • the presence or absence of a probe on the (mid) nucleic acid array can be known, but it cannot be examined whether the probe is mounted at a predetermined position.
  • the staining agent becomes noise during detection.
  • an unexpected probe is mounted at an unexpected position on the nucleic acid array, a probe with the wrong mounting position may be provided without knowing the wrong data.
  • a nucleic acid array that narrows down the types of probes. When preparing a cell array, the importance of each individual probe is greater than that of a nucleic acid array that is comprehensively equipped with many types of probes. When statistically processed and interpreted, there is a great possibility that a fundamentally wrong conclusion will be drawn. Disclosure of the invention
  • an object of the present invention is to provide a method for accurately and simply confirming that a probe mounted on a nucleic acid array is correctly arranged at a predetermined position.
  • the present inventors have examined a certain number of arrays for a single type of array that can be created from the same lot, and obtained the entire product obtained from the rod. Focusing on the advantage of being able to confirm, we conducted an extensive study. As a result, given identification information is given to the nucleic acid sample to be hybridized with the array, and the signal obtained by the hybridization and the identification information obtained from each probe are combined efficiently for inspection. Through application, it was found that the probe position can be individually confirmed, and the present invention has been completed. That is, the present invention is as follows.
  • a method for confirming the mounting status of a nucleic acid probe mounted on a nucleic acid array which includes the following steps:
  • N represents the number of identification information
  • M represents the number of compartments to which the nucleic acid probes mounted on the nucleic acid array belong.
  • X is calculated using the formula shown below, and the number of the integer part of X is defined as the number Xa of nucleic acid arrays necessary for confirming the mounting status, and for each nucleic acid probe belonging to the section, N + 1 decimal Assigning numerical values expressed in the modulo and having the same number of digits as x a so that they do not overlap, (c) preparing a complementary nucleic acid molecule comprising a base sequence complementary to all or part of the base sequence of the nucleic acid probe, and for each digit of the assigned numerical value Y, based on the digit of each digit thereby producing a nucleic acid sample group of complementary nucleic acid molecules are mixed nucleic acid array number X a number fraction, X a number of steps of producing a nucleic acid Arei, (d) step (C) Xa number of nucleic acid arrays produced by A step of contacting each of the corresponding nucleic acid sample groups, and detecting a signal derived from the hybrid of the nu
  • the mounting situation of the nucleic acid probe may be related to the type and / or position of the nucleic acid probe.
  • the identification information is, for example, at least one selected from the group consisting of the presence / absence of a signal, the intensity of the signal, and the type of label.
  • the expression pattern of the detected signal may be a value expressed by the ⁇ + 1 base system based on the identification information.
  • a method for inspecting the quality of a nucleic acid array wherein the quality of a nucleic acid array is inspected based on the result obtained by the method described in (1) above.
  • the present invention provides a method for confirming the type and position of individual nucleic acid probes mounted on a nucleic acid array by hybridization between the nucleic acid probe and a nucleic acid containing a complementary sequence thereof.
  • FIG. 1 is a diagram of an array fixing jig for manufacturing a fiber array.
  • Figure 2 shows the design of the nucleic acid array. Numbers indicate sequence numbers, and ⁇ indicates spots without probes.
  • Figure 3 shows the detection image when sample 1 to sample 8 were hybridized.
  • the present invention is a method for confirming the mounting status of a nucleic acid probe mounted on a nucleic acid array, comprising the following steps:
  • N is the number of identification information
  • M is the number of compartments to which the nucleic acid probes mounted on the nucleic acid array belong.
  • X is calculated using the formula shown below, and the number of the integer part of X is defined as the number Xa of nucleic acid arrays necessary for confirming the mounting status, and for each nucleic acid probe belonging to the section, N + 1 decimal Assigning a numerical value expressed by the law and having the same number of digits as X a so that they do not overlap,
  • (C) preparing a complementary nucleic acid molecule comprising a base sequence complementary to all or part of the base sequence of the nucleic acid probe, and for each digit of the assigned number ⁇ , based on the number of each digit thereby producing a nucleic acid array number X a number fraction of nucleic acid sample group were mixed complementary nucleic acid molecule, the step of producing the X a number of nucleic acid arrays, X a number of nucleic acids generated by step (d) (C) A corresponding nucleic acid for each of the arrays A step of contacting a sample group and detecting a signal derived from a hybrid of a nucleic acid probe mounted on a nucleic acid array and the complementary nucleic acid molecule; and
  • nucleic acid probe having a predetermined sequence and a sample sample whose sequence is unknown are hyploidized and soyed. 'If a nucleic acid molecule having a base sequence complementary to the base sequence of the nucleic acid probe is present in the sample, a hybrid is formed between the nucleic acid probe and the nucleic acid molecule.
  • nucleic acid molecules corresponding to the corresponding nucleic acid probe are obtained by quantifying or qualifying the hybridization with a signal derived from a substance labeled on the sample sample such as fluorescence, chemiluminescence, or radioisotope. Can be confirmed.
  • the arrangement of the probes mounted on the nucleic acid array can be inspected using the above method.
  • a nucleic acid molecule complementary to the probe as the specimen sample, it is possible to identify the position of the probe to be present on the nucleic acid array by hybridization.
  • nucleic acid array in order to confirm where the specific nucleic acid probe is mounted on the nucleic acid array, a nucleic acid molecule (complementary nucleic acid molecule) having a base sequence complementary to the nucleic acid probe is included.
  • the sample sample is hybridized to the nucleic acid array, and the hybrid between the nucleic acid probe and the complementary nucleic acid molecule is detected by a signal emitted from a fluorescent substance or a labeling substance such as an enzyme applied to the complementary nucleic acid molecule.
  • nucleic acid array that is independently mounted on a nucleic acid probe substrate composed of five different base sequences
  • Nucleic acid molecules that are complementary to the nucleic acid probe are hybridized to individual nucleic acid arrays one by one, and the signal derived from the hybridization is read to determine the relative mounting position of the nucleic acid probe and its Nucleic acid pro
  • the base sequence of the probe can be clarified.
  • the required number of nucleic acid arrays to be used is five corresponding to the number of nucleic acid probes.
  • the required number of nucleic acid arrays to be used is five corresponding to the number of nucleic acid probes.
  • signals that can independently recognize five types of complementary nucleic acid molecules corresponding to five types of nucleic acid probes for example, five types of fluorescent substances having different wavelengths
  • a single nucleic acid array can be read.
  • the relative loading position of the nucleic acid probe and the base sequence of the nucleic acid probe loaded at that position can be confirmed separately.
  • the complementary nucleic acid sample (group) prepared according to a certain rule is subjected to hybridization on the nucleic acid array, and the obtained signal is used as the nucleic acid sample. Contrast with the presence or absence of complementary nucleic acid molecule and label type.
  • complementary nucleic acid sample refers to a molecule (complementary nucleic acid molecule) containing a base sequence complementary to at least a part of the base sequence of the nucleic acid probe.
  • a sample included according to a certain rule. The plurality of sets is referred to as “complementary nucleic acid sample group” (also simply referred to as “nucleic acid sample group”). It is preferable to prepare nucleic acid samples corresponding to the number of nucleic acid arrays used for confirmation.
  • Prepare according to certain rules means that nucleic acid samples contained in complementary nucleic acid samples are separated from each other when hybridisation is detected, depending on the type of label and the presence or absence of the nucleic acid sample. This refers to preparing a nucleic acid sample so as to exhibit a different pattern.
  • the detailed method is exemplified below. (1) The number of compartments to which the nucleic acid probes mounted on the nucleic acid array belong, and any one or more Definition of identification information
  • nucleic acid probes mounted on the nucleic acid array are contained in a certain compartment. Therefore, the number of compartments where nucleic acid probes are mounted means the number of nucleic acid probes (the number of probe types). Therefore, in the present invention, the number of sections is defined as the number of probes. However, a section without a probe can be included in the number of probes as a negative control, for example. Note that the “number of probes” is not the number of individual probes contained in a compartment, but the number of probes in a compartment.
  • the sequence information, concentration, type of label, etc. of the complementary nucleic acid molecules constituting the sample (group) are recorded in advance. This information is used as “identification information” to evaluate the hybridization status of probes and complementary nucleic acid molecules obtained after hybridization.
  • the number of the complementary nucleic acid molecule, the nucleic acid sample, and the nucleic acid sample group should be clarified (defined). For example, the presence or absence of a certain nucleic acid sample in a nucleic acid sample group becomes identification information “presence / absence of hybridization signal” at the time of detection after hybridization.
  • a “hybridization” It becomes the identification information “type of signal”.
  • changing the concentration of the nucleic acid sample also serves as identification information from the viewpoint of “strength of hybridization signal”. In this way, the identification information is used as a parameter that causes differences in the information obtained as a result of hybridization and the differences.
  • the probe A when the probe A is mounted on the nucleic acid array, when the complementary strand A ′ is put into each complementary nucleic acid sample of the complementary nucleic acid sample group, “A, is inserted or inserted.
  • the known information such as ⁇ Not present '', ⁇ Type of label applied to A ''', ⁇ Amount of A' input '' is obtained as information obtained after hybridization. , “What kind of fluorescence was obtained”, “How strong is the obtained signal intensity”, and so on. From the result of hybridization, it is possible to easily determine the state of the complementary nucleic acid molecule A ′ being put into each complementary nucleic acid sample. wear.
  • the number of arrays required to check the loaded nucleic acid probe is determined by the type of nucleic acid probe and the number of identification information.
  • the more identification information the smaller the number of complementary nucleic acid samples to be prepared, so the number of nucleic acid arrays to be used can be reduced. Confirmation can be done efficiently.
  • the necessary identification information, the number of arrays to be used, and the number of complementary nucleic acid samples must satisfy the following conditions: expressed. '
  • N represents the number of identification information
  • M represents the number of compartments to which the nucleic acid probes mounted on the nucleic acid array belong.
  • the calculated X can be calculated using this equation.
  • the calculated X is represented by the following numerical integer part and decimal, the present invention is defined as a nucleic acid array number X a necessary numbers of the integer part of X to check the mounting status.
  • a nucleic acid array on which 24 types of nucleic acid probes are mounted is examined based on the presence or absence of a fluorescent signal.
  • the number of identification information (N) is one.
  • the required number of arrays for the verification work is five.
  • Complementary nucleic acid samples for hybridization reaction to each of the five arrays are designated as sample A, sample B, sample C, sample D, and sample E, and N is added to each of the nucleic acid probes belonging to the compartment.
  • the numbers assigned to probes 1 to 24 in Table 1 are the numbers “1” and “0” shown in columns ⁇ to ⁇ .
  • a complementary nucleic acid molecule comprising a base sequence complementary to all or a part of the base sequence of the nucleic acid probe is prepared, and for each digit of the assigned numerical value Y, a digit of each digit is prepared. thereby producing a nucleic acid array number X a number fraction of nucleic acid sample group as a mixture of complementary nucleic acid molecules based on, making Xa number of nucleic Arei.
  • nucleic acid can be synthesized by a chemical synthesizer based on the probe sequence information.
  • sample A contains complementary strands for probes 1-16
  • sample B contains phase capture strands for probes 9-24.
  • the “complementary strand” does not need to be complementary to the entire nucleic acid probe. It may be complementary.
  • the label When labeling is performed to give identification information to complementary nucleic acid molecules, confirm with a single label, or perform detection independent of each other with a single label, and detect each difference simultaneously or with a time difference. It must be confirmed by That is, the label may be confirmed by a single detection after performing a single label, or it may be confirmed by a plurality of detections, although they are a single label, but complementary nucleic acid molecules are made independent of each other.
  • the label may be confirmed by a single detection after performing a single label, or it may be confirmed by a plurality of detections, although they are a single label, but complementary nucleic acid molecules are made independent of each other.
  • detection can be carried out by a combination of a Cy 5 direct label and a biotin direct label-streptavidin-Cy5 indirect label.
  • labeling method is not particularly limited as long as hybridization of a nucleic acid can be detected.
  • labeling substances used for labeling for example, fluorescent substances such as Cy3, Cy5, Alexa Fluor, alkaline phosphatase and horseradish peroxidase are used to utilize chemiluminescence associated with substrate degradation. Enzymes or proteins, radioisotopes such as ⁇ - 32 ⁇ and ⁇ - 32 ⁇ ⁇ can be mentioned, but it is preferable to use a fluorescent substance because it is easy to use.
  • the labeling method is stable, and as long as specific hybridization with the probe nucleic acid is not inhibited, direct, indirect or physical Any method can be used regardless of the chemical bond.
  • a method for chemical modification there can be mentioned a method in which an analog base modified with a piotinoaminoallyl group is incorporated during the reaction, and a labeling substance is incorporated through it.
  • the labeling substance can be interacted with complementary nucleic acid molecules using SYBR Green, acrylidine orange, SYBR Gold, etc., and the labeling substance can be bound to complementary nucleic acid molecules via platinum as in ULYSIS. Can also be adopted.
  • a common nucleobase sequence (tag) is extended to the 3 'or 5' end of all complementary nucleic acid molecules separately from the portion complementary to the corresponding nucleic acid probe of each complementary nucleic acid molecule.
  • a labeled nucleic acid molecule that is complementary to the tag sequence can also be used. Even in this case, as long as each signal can be detected independently, any labeling method may be used, and a plurality of tag sequences may be used.
  • each of the above as fabricated X a number of nucleic acid arrays, versus contacting the nucleic acid sample group to respond, from Haipuriddo the nucleic acid probe and the complementary nucleic acid molecule that is mounted on a nucleic acid array Detect the signal to
  • the probes 1 to 16 are fluorescent in nucleic acid array A.
  • a signal is detected, and in Nucleic Acid Array B, a fluorescent signal is detected for probes 9 through 24.
  • a fluorescent signal is detected with respect to the probe marked “1” in the same manner as described above. '(5) Match the expression pattern of the detected signal with the assigned number of patterns
  • the position information of the probe at each position of the nucleic acid array, and the signal actually obtained by the hybridization by the above-mentioned method as the identification information.
  • the identification information it is possible to confirm where the nucleic acid probe corresponding to the complementary nucleic acid sample is spotted on the nucleic acid array.
  • the complementary nucleic acid for probe 1 in Table 1 is contained only in nucleic acid sample A, so the identification information between nucleic acid samples A to E The combination (number ⁇ ) is “1 0 0 0 0”.
  • the nucleic acid complementary to probe 16 is included in all of nucleic acid samples ⁇ to ⁇ . Therefore, the combination of identification information between nucleic acid samples A to E is “1 1 1 1 1”. These combinations of identification information are all different for each complementary nucleic acid.
  • the numerical pattern assigned to each probe is compared with the detection result pattern, and when the detection result is obtained according to the combination, that is, according to the Y value pattern, it is stored in the nucleic acid array. It can be judged that the type and position of the loaded nucleic acid probe are correct. '
  • each nucleic acid array for each complementary nucleic acid for example, for the complementary nucleic acid to probe 1, all of the nucleic acid samples A to C are labeled with green fluorescence.
  • the combination of identification information between C is “0 0 0”, and for the complementary nucleic acid for probe 6, the combination of identification information between nucleic acid samples A to C is “0 1 2”.
  • the combination of these identification information is also completely different for each complementary nucleic acid. Therefore, when the detection results corresponding to the identification information are obtained in combination, it can be determined that the type and position of the nucleic acid probe mounted on the nucleic acid array is correct.
  • one lot of the nucleic acid array can be inspected at the time of shipment of the nucleic acid array and used as one of quality control standards of the nucleic acid array.
  • Nucleic acid array used for quality inspection to confirm the mounting position of the nucleic acid probe It is desirable to prepare the nucleic acid array from a large number of nucleic acid arrays produced in the same lot.
  • This method can be applied to any nucleic acid array. It is preferably a nucleic acid microarray that can be produced by a method in which individual probe spot positions do not physically mix. Such a nucleic acid microarray can be obtained by immobilizing a probe on a hollow fiber or the like, bundling it, and slicing it. Since the probe can be fixed uniformly to the middle thread, when the nucleic acid probe mounting position is determined using the microarray obtained by the above slice, the inspection in the same lot is performed with the quality It can be performed with high accuracy without variation.
  • the nucleic acid array that has been hybridized once can be reused.
  • the hybrid between the nucleic acid probe and the complementary nucleic acid sample is dissociated.
  • the dissociated nucleic acid array can be reused depending on the probe immobilization status or the signal remaining status.
  • nucleic acid arrays that are used under normal humidity conditions are easy to dissociate and immobilize. Since the probe is difficult to peel off compared to the dry substrate, it is not particularly misrecognized as long as it is identification information about the presence or absence of a signal.
  • a hollow fiber bundle was manufactured using the array fixing device shown in FIG.
  • X, y, and z are orthogonal three-dimensional axes, and the X axis coincides with the longitudinal direction of the fiber.
  • a hole (11) with a diameter of 0.32 mm is assumed to have a length of 12
  • the position of the two perforated plates was moved in a state where 0.1N tension was applied to each fiber in the X-axis direction, and fixed at two locations, 20 mm and 100 mm from one end of the hollow fiber. That is, the interval between the two perforated plates was set to 80 mm.
  • the resin raw material was poured into the container from the upper part of the container.
  • the resin used was 2.5 mass% carbon black added to the total weight of the polyurethane resin adhesive (Nippon Polyurethane Industry Co., Ltd. Nipponporan 4276, Coronate 4403).
  • the resin was cured by standing at 25 ° C for 1 week.
  • the porous plate and the plate-like material were removed to obtain a hollow fiber bundle.
  • the container containing the polymerizable solution and the hollow fiber bundle prepared above were placed in a desiccator. After the inside of the desiccator was depressurized, the unsealed end of each yarn of the hollow fiber bundle was immersed in a container containing the predetermined polymerizable solution. De Nitrogen gas was sealed in the sicator, and a gel precursor polymerizable solution containing a capillary probe was introduced into the hollow part of the hollow fiber. Next, the inside of the container was brought to 70 ° C., and a polymerization reaction was carried out over 3 hours.
  • nucleic acid array 300 thin sheet having a thickness of 0.25 mm.
  • the nucleic acid array was prepared at the probe position shown in FIG.
  • the numbers in the figure indicate the probe sequence numbers, and probes having the base sequences shown in the respective sequence numbers are arranged in the nucleic acid array.
  • B indicates a spot without a nucleic acid probe.
  • a nucleic acid sample (oligo DNA) for identifying the probe position of the nucleic acid array prepared above was prepared as follows. These nucleic acid samples contain a portion that is complementary to a part on the 3 ′ side of each corresponding probe, and the 5 ′ side of the nucleic acid sample has a base sequence consisting of a GT repeat sequence, and SEQ ID NO: It contains a base sequence that is complementary to 385. SEQ ID NO: 385 is prepared by preparing oligo DNA labeled with Cy5 on the 5 ′ side at a concentration of lOOpmol / ⁇ .
  • SEQ ID NO: 1 corresponds to SEQ ID NO: 193
  • SEQ ID NO: 2 corresponds to SEQ ID NO: 194, and thereafter
  • SEQ ID NO: 192 corresponds to SEQ ID NO: 384 (Tables 3 and 5).
  • a part of the sequence in the probe table is complementary to a part of the corresponding sequence in Table 5, and each specimen holds a sequence that forms a double strand in the order corresponding to the above-mentioned probe and the sequence number. Yes.
  • sequence expressed in lowercase letters in the base sequence of SEQ ID NO: 193 in Table 5 is complementary to the underlined portion (33th to 65th sequence) of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 in Table 3, and is double-stranded. Can be formed.
  • Samples 1 to 8 have model specimens with each SEQ ID NO. 500 ⁇ 1 / 5 Each was mixed one by one, and pure water was added to prepare a final liquid volume of 500 ⁇ 1. That is, the concentration of each model sample contained in Samples 1 to 8 was adjusted to be lpmol / ⁇ . In addition, the samples were combined so that all the specimens of SEQ ID NOS: 193 to 384 were different in whether or not the specimens 1 to 8 were loaded.
  • the nucleic acid sample prepared as described above was brought into contact with the nucleic acid array prepared as described above, and hybridization was performed at 65 ° C. for 1 hour in a thermostatic bath.
  • detection was performed by washing using a mixed solution of 2xSSC and 0.2% SDS and 2xSSC.
  • the detection operation was performed by immersing the array in 2xSSC using a cooled CCD camera type nucleic acid array automatic detection device, and covering the cover glass, and then measuring the fluorescence signal intensity of the labeled nucleic acid sample molecules.
  • Table 7 shows a table comparing the ON / OFF of the signal at each nucleic acid probe position obtained this time.
  • “Presence / absence of sample input (planned)” is the numerical value assigned to the probe of each SEQ ID NO., “0” indicates that no complementary nucleic acid for that probe is included, and “1” indicates that Indicates that the nucleic acid complementary to the probe is included.
  • For signal ON / OFF signals with an S / N ratio of 5 or higher were set to ON, and signals with lower S / N ratios were set to OFF.
  • “ON” and “OFF” in Table 7 are binary numbers. Can be replaced with “1” and “0”.
  • SEQ ID NOS: 1-38 5 Synthetic DNA Industrial applicability
  • the type and position of each nucleic acid probe mounted on a nucleic acid array is determined, and hybridization between the nucleic acid probe and a nucleic acid containing a complementary sequence thereof is performed.
  • a method is provided for confirmation by the application.

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
  • Automatic Analysis And Handling Materials Therefor (AREA)

Abstract

核酸アレイに搭載されている核酸プローブの搭載状況を確認する方法であって、以下の工程：(a)核酸アレイに搭載された核酸プローブが属する区画数、及び１以上の任意の識別情報を定義する工程、(b) 次式　 Ｘ=｛log (N+1) M｝+1（Ｎは識別情報の数、Ｍは核酸アレイに搭載された核酸プローブが属する区画数を表す。）で示される式を用いてXを算出し、Xの整数部分の数字を搭載状況の確認に必要な核酸アレイ数Xaと定義し、前記区画に属する核酸プローブのそれぞれに、Ｎ＋１進法で表される数値であってXaと同数の桁数を有する数値Yを重複しないように割り当てる工程、(c)前記核酸プローブの塩基配列の全部又は一部と相補的な塩基配列を含む相補核酸分子を調製し、前記割り当てられた数値Yのそれぞれの桁ごとに、それぞれの桁の数字に基づいて相補核酸分子を混合して核酸アレイ数Xa個分の核酸試料群を作製するとともに、Xa個の核酸アレイを作製する工程、(d)工程(c)で作製されたXa個の核酸アレイのそれぞれに、対応する前記核酸試料群を接触させ、核酸アレイに搭載されている核酸プローブと前記相補核酸分子とのハイブリッドに由来するシグナルを検出する工程、並びに(e) 検出されたシグナルの発現パターンと、前記割り当てられた数値Yのパターンとを照合する工程を含む、前記方法を提供する。

Description

明 細 書 核酸ァレイにおけるプロ一ブ搭載位置の確認方法 技術分野
本発明は、 核酸アレイの品質管理に関し、 詳しくは、 核酸アレイ上の核酸プ ローブと相補核酸分子とのハイブリダイゼーション反応を利用した当該核酸プ 口ーブの種類及び位置を確認する方法に関する。 背景技術
核酸アレイとは、 担体上に多数の核酸プローブ （以下、 プローブと称する場 合もある） を高密度に、 互いに混ざり合うことのないようにそれぞれ独立に搭 載したものである。 核酸アレイ上に搭載されるプローブは、 その塩基配列と相 捕である配列によって構成される核酸分子をハイプリダイゼーシヨンによって キヤプチヤーするためのセンサーとして働く。
従来、 核酸アレイとしては、 表面力卩ェを施したガラスやシリコンなどの担体 上に、 プローブを搭載したものが利用されているが、 近年ではゲル担体など、 他の手法による担体の改質も行われている。
核酸アレイの製造方法として、 あらかじめ調製した核酸プローブをスライド ガラスゃシ'リコンなどの基板に固定する方法、 及び核酸プローブを基板上で直 接合成する方法が知られている。
たとえば、 基板上でプローブを直接合成する光リソグラフィ一法によれば、 光照射で選択的に除去される保護基をもつ物質を使用し、 フォトリソグラフィ 一技術と固相合成技術を組み合わせて、 微小なマトリックスの所定の領域 （反 応部位） に選択的に DNAを合成 （マスキング） することによって核酸アレイを 作製することができる （Science 251， 767-773 (1991))。
また、 あらかじめ調製したプローブを搭載する方法としては主にスポッティ ング法が挙げられる (Science 270, 467-470 (1995)) 0 この方法は、 あらかじめ PCRや人工的な合成によって作製したプロ一ブを含む溶液を、 スポッターまた はアレイヤーという特別の装置を用いて数 n 1から数 p 1の微小体積でチップ 表面に並べ、 基板上の特定領域に搭載する技術である。 上記方法の他に、 中空 繊維配列体を用いたマイクロアレイの製造方法が開発されている。 この方法で は、 貫通孔基盤を合成高分子から成る複数本の中空繊維を繊維軸方向に規則正 しく配列させた中空繊維配列体を用いて製造する。 この製法の一つの特徴は、 中空繊維配列体の各中空繊維中空部にプローブを固定ィ匕しておき、 この中空繊 維配列体を繊維軸方向と垂直な方法で薄片化することで、 同一ロッドから同じ 仕様のマイクロアレイ製品を大量に製造することができる点である （特許第 3 4 8 8 4 5 6号公報）。
核酸ァレイを利用した核酸検出方法とは、、 核酸ァレイに搭載されているプロ ーブに対して、 検査対象となる核酸試料を配列特異的にハイブリダィズさせ、 配列特異的に形成したハイプリットを蛍光物質等により検出するというもので ある。 この方法では、 複数のプローブに対応する、 試料中の核酸塩基配列を含 む核酸分子を、 定量的又は定性的に調べることができ、 複数の核酸塩基配列に 関する発現量又は特定の核酸塩基配列の配列自体等を解析するために利用され る。
上記核酸検出の際、 通常は、 予め設定した適切な条件下でハイブリダィゼー シヨン反応を実施し、 次いで洗浄工程により、 アレイ表面に残存した核酸試料 又はその他不要物の除去を行い、 プローブと特異的なハイプリッドを形成して いる核酸試料を検出するという方法が採用される。 プローブは、 配列解析、 機 能解析等、 '検出対象となる所望の核酸塩基配列と相補又は同一となるように設 計されることが多い。 プローブとしては、 cDNA等の比較的長鎖の核酸、 ある いは短鎖の合成オリゴ核酸等が使用される。 合成オリゴ核酸をプローブとして 使用する場合、 ヒ トゃマウスなど、 遺伝子情報の知見が蓄積している生物につ いては、 それらの塩基配列情報を用い、 各配列の相同性や機能などに着目した 上で合成オリゴ核酸の配列を設計し、 プローブを作製することが可能である。 このような核酸アレイは、 遺伝子発現、 遺伝子多型等の遺伝子解析に供する ことができ、 生命現象の機構解明等の研究用途から疾病等の診断 ·治療に利用 され、 さらには遣伝子の型を判別して行う品種判別等、 の産業用途への応用が 期待される。 その一方で、 これらの産業用途への応用を図る上では、 核酸ァレ ィの品質を保^することが必要不可欠であり、 従って品質を保証するための品 質管理方法の確立が急務な課題として挙げられる。
その品質管理項目の中で、 製造した核酸アレイに搭載しているプローブが所 定の位置に正確に搭載されているかを検査することは、 最重要課題である。 上 記検査方法として、 例えば、 核酸アレイをェチジゥムブ口マイ ド等の核酸染色 剤に潰して、 プローブ、 又はプローブが固定されている所定位置を染色する方 法が知られている。 この方法では、 核酸アレイ上 （中） のプローブの有無を知 ることができるが、 該プローブが所定の位置に搭載されているかどうかは検査 することはできない。 さらには染色後の核酸ァレイをそのまま検査等に利用し た場合、 染色剤は検出の際のノイズとなる。 従って、 核酸アレイを製品とする には、 プローブ、 又はプローブが固定されている所定位置の染料を再度洗浄し て、 ェチジゥムブ口マイドを完全に洗い流す操作を 1つの製品毎に行う必要が あり、 製品までの処理工程が非常に煩雑となる。
また、 スポッ ト位置を確認するには、 アレイ上に搭載されたプローブの相補 鎖である標識核酸を全プローブに対して用意し、 ハイプリ.ダイゼーシヨンによ る検出操作を、 1プローブ毎、 全プローブについて行う必要があり、 搭載プロ ープ数が多い場合はさらに操作が煩雑となり現実的ではない。
このように、 「プローブがどのような配列を有し、 核酸アレイ上のどの位置 に搭載されているのか」 を簡便に確認し、 核酸アレイの品質を保証することは 非常に重要である。
しかしながら、 現状ではほとんど確認作業が行われることはない。 その理由 は、 上述の通り、 核酸アレイは多くのプローブを担体上に搭載しているため確 認作業が煩雑になるからである。 また、 プローブ自体の配列を、 簡単に見分け ることが困難であるからである。
つまり、 一度作製された核酸アレイにおいて、 核酸アレイのどの位置に、 ど のようなプローブが存在するのかを確認するためには、 核酸アレイの製造プロ セスからの情報に頼るほか無く、 製造後に個々のプローブの搭載位置を決定す ることは極めて困難である。
仮に、核酸ァレイ上の思わぬ位置に、思わぬプローブが搭載されている場合、 搭載位置を誤ったプローブに関しては、 間違ったデータを気づかないうちに提 供してしまう可能性がある。 また、 特にプローブの種類を絞り込んだ核酸ァレ ィを作製する場合には、 網羅的に多種類のプローブを搭載している核酸アレイ に比較して、 一つ一つのプローブの重要度が大きいため、 核酸アレイ全体から 得られる各プローブのデータを統計的に処理、 解釈する場合に、 根本的に誤つ た結論を導き出してしまう可能性が多大である。 発明の開示
従って、 本発明の課題は、 核酸アレイにおいて、 該アレイに搭載されている プローブが所定の位置に正しく配置されていることを正確且つ簡便に確認する ための方法を提供することにある。 、 本発明者らは、 上記課題を解^するために、 同一ロットから作成され得る単 一種類のアレイであれば、 一定の枚数のアレイを調べることで、 そのロッドか ら得られる製品全体を確認できるという利点に着目し、 鋭意検討を行った。 そ の結果、 アレイとハイブリダィズさせる核酸試料に所定の識別情報を付与し、 ハイブリダィゼーシヨンにより得られるシグナルと、 個々のプローブから得ら れる識別情報とを効率的に組み合わせた上で検査に応用することにより、 プロ 一ブ位置を個別に確認し得ることを見出し、 本発明を完成するに至つた。 すなわち、 本発明は以下の通りである。
( 1 ) 核酸ァレイに搭載されている核酸プローブの搭載状況を確認する方法で あって'、 以下の工程：
(a) 核酸ァレイに搭載された核酸プローブが属する区画数、及び 1以上の任意 の識別情報を定義する工程、
(b) 次式
X= {log (N+I) M } +1
(Nは識別情報の数、 Mは核酸アレイに搭載された核酸プローブが属する 区画数を表す。 ）
で示される式を用いて Xを算出し、 Xの整数部分の数字を搭載状況の確認に 必要な核酸アレイ数 Xaと定義し、 前記区画に属する核酸プローブのそれぞ れに、 N + 1進法で表される数値であって xaと同数の桁数を有する数 ίϋγ を重複しないように割り当てる工程、 (c) 前記核酸プローブの塩基配列の全部又は一部と相補的な塩基配列を含む 相補核酸分子を調製し、 前記割り当てられた数値 Yのそれぞれの桁ごとに、 それぞれの桁の数字に基づいて相補核酸分子を混合して核酸アレイ数 Xa個 分の核酸試料群を作製するとともに、 Xa個の核酸ァレイを作製する工程、 (d) 工程 (C)で作製された Xa個の核酸アレイのそれぞれに、 対応する前記核酸 試料群を接触させ、 核酸ァレイに搭載されている核酸プローブと前記相補 核酸分子とのハイプリッドに由来するシグナルを検出する工程、 並びに
(e) 検出されたシグナルの発現パターンと、 前記割り当てられた数 ίίίΥのバタ 一ンとを照合する工程 、 '
を含む、 前記方法。
本発明において、 核酸プローブの搭載状況は、 核酸プローブの種類及び/又 は位置に関するものが挙げられる。 また、 識別情報としては、 例えばシグナル の有無、 シグナルの強度及び標識の種類からなる群から選ばれる少なくとも 1 つである。 本発明において、 検出されたシグナルの発現パターンは、 上記識別 情報に基づいて Ν + 1進法で数値化されたものを使用することができる。
( 2 ) 上記 （1 ) に記載の方法により得られた結果に基づいて核酸アレイの 品質を検査することを特徴とする核酸ァレイの品質検査方法。 本発明により、 核酸アレイ上に搭載されている個々の核酸プローブの種類と 位置を、 該'核酸プローブと、 その相補配列を含む核酸とのハイブリダィゼーシ ョンによって確認する方法が提供される。
核酸アレイ上の各プローブが所定の位置に配置されているかを確認すること は、 DNAマイクロアレイの品質管理上、 最も重要な検査項目である。 本発明に より、 そのプローブの配置位置を正確且つ簡便に検査することができるため、 従来のような煩雑な検査工程が不要となった。 図面の簡単な説明
図 1は、 繊維配列体を製造する配列固定治具の図である。
図 2は、 核酸アレイのデザインを示す図である。 数字は配列番号、 Βはプロ ーブを搭載しないスポットを示している。 図 3は、 試料 1から試料 8を用いてハイブリダィゼーションを'行った際の検 出画像である。
符号の説明
1 1 · · · ·孔
2 1 · . · ·多孔板
3 1 · · · ·中空繊維
4 1 · · · ·板状物 発明を実施するための最良の形態 、
以下、 本発明を詳細に説明する。 なお、 本明細書において引用した文献、 お よび公開公報、 特許公報その他の特許文献は、 参照として本明細書に組み込む ものとする。 本発明は、 核酸アレイに搭載されている核酸プローブの搭載状況を確認する 方法であって、 以下の工程：
(a)核酸ァレイに搭載された核酸プローブが属する区画数、及び 1以上の任意 の識別情報を定義する工程、
(b) 次式
Figure imgf000008_0001
(Nは'識別情報の数、 Mは核酸アレイに搭載された核酸プローブが属する 区画数を表す。 ）
で示される式を用いて Xを算出し、 Xの整数部分の数字を搭載状況の確認に 必要な核酸アレイ数 Xaと定義し、 前記区画に属する核酸プローブのそれぞ れに、 N + 1進法で表される数値であって Xaと同数の桁数を有する数 ίίΥ を重複しないように割り当てる工程、
(C) 前記核酸プローブの塩基配列の全部又は一部と相補的な塩基配列を含む 相補核酸分子を調製し、 前記割り当てられた数 Ύのそれぞれの桁ごとに、 それぞれの桁の数字に基づいて相補核酸分子を混合して核酸アレイ数 Xa個 分の核酸試料群を作製するとともに、 Xa個の核酸アレイを作製する工程、 (d) 工程 (C)で作製された Xa個の核酸アレイのそれぞれに、 対応する前記核酸 試料群を接触させ、 核酸アレイに搭載されている核酸プローブと前記相補 核酸分子とのハイプリッドに由来するシグナルを検出する工程、 並びに
(e) 検出されたシグナルの発現パターンと、 前記割り当てられた数 ίίίΥのバタ 一ンとを照合する工程
を含むものである。
1 . 核酸プローブの種類及び位置の確認方法
一般的な核酸アレイの使用方法として、 まず、 所定の配列を持つ核酸プロ一 ブと、 配列が未知の検体試料とをハイプリ、ダイズさせる。'検体試料中、 核酸プ 口ーブの塩基配列と相補である塩基配列を有する核酸分子が存在していれば、 核酸プローブとその核酸分子との間でハイプリッドが形成される。
次に、 ハイブリッド形成を蛍光、 化学発光、 ラジオアイソトープなど、 あら かじめ検体試料に標識された物質に由来するシグナルにより定量化又は定性化 することにより、 該当する核酸プローブに対応する相補な核酸分子の存在を確 認することができる。
一方、 上記方法を利用して、 核酸アレイに搭載されているプローブの配置を 検査することもできる。 検体試料としてプローブと相補な核酸分子を使用する ことにより、 ハイブリダィゼーシヨンによって、 核酸アレイ上に存在すべきプ ローブの位置を同定することが可能である。 '
上述のごとく、 核酸アレイにおいて、 特定の核酸プローブが核酸アレイ上の どこに搭載されているのかを確認するためには、 核酸プローブと相補である塩 基配列を有する核酸分子 （相補核酸分子） を含む検体試料を核酸アレイに対し てハイブリダィゼーシヨンさせ、 相補核酸分子に施された蛍光物質、 酵素など の標識物質から発せられるシグナルにより、 核酸プローブと相補核酸分子のハ イブリツドを検出すればよい。 例えば、 5種類の互いに異なった塩基配列で構 成された核酸プローブ基板上に独立して搭載した核酸ァレイの場合、 5種類の 核酸プローブの存在の有無及び存在位置を調べるためには、 それぞれの核酸プ ローブに相補である核酸分子 （相補核酸分子） を一種類づっ個々の核酸アレイ にハイブリダィズし、 ハイブリダィゼーションに由来するシグナルを読み取る ことで、 核酸プローブの相対的な搭載位置と、 その位置に搭載された核酸プロ ーブの塩基配列を明確化することができる。
この場合に使用される核酸ァレイの必要数量は、 核酸プローブの数に対応し た 5枚となる。 また、 5種類の核酸プローブに対応する 5種類の相補核酸分子 をそれぞれ独立に認識できるようなシグナル （たとえば互いに波長の異なる 5 種類の蛍光物質） で読み取ることが出来れば、 一枚の核酸アレイに対して 5種 類の相補核酸分子をハイブリダィズすることで、 核酸プローブの相対的な搭載 位置と、 その位置に搭載された核酸プロ一ブの塩基配列をそれぞれ別個に確認 することができる。
しかしながら、 核酸アレイには多種類のプローブが搭載されており、 少ない ものでも数十から数百種類の核酸プローブが搭載されている。 このような場合、 核酸プ口ーブ数に対応した相補核酸分子を調製し、 それらを搭載プローブ数と 同数の核酸ァレイを使用して、 各核酸プローブの搭載位置を碑認することは極 めて煩雑である。 また、 核酸アレイの使用枚数が過多になることから実質的に 実施することはできない。 数十から数百種類の独立に認識できるようなシグナ ル分子を個々の相補核酸分子に対して施すことも現状では困難である。
そこで本発明においては、 核酸プローブの搭載位置を効率的に同定するため に、 一定の法則に従い調製した相補核酸試料 （群） を、 核酸アレイにハイプリ ダイゼーシヨンさせ、 得られたシグナルを、 該核酸試料中における相補核酸分 子の有無や標識種類と対照させる。
ここで、 ' 「相補核酸試料」 （単に 「核酸試料」 ともいう） とは、 核酸プロ一 ブの少なくとも一部の塩基配列に対して相補的な塩基配列を含む分子 （相補核 酸分子） を一定の法則によって含む試料をいう。 また、 その複数の集合を 「相 補核酸試料群」 という （単に 「核酸試料群」 ともいう） 。 核酸試料は、 確認に 使用される核酸アレイの数の分だけ調製しておくことが好ましい。 「一定の法 則に従い調製する」 とは、 相補核酸試料中に含まれる核酸試料を、 個々のプロ ーブが、 標識の種類や、 核酸試料の有無によって、 ハイブリダィゼーシヨンの 検出時に互いに異なるパターンを示すように核酸試料を調製することをいう。 詳細な方法は、 下記で例示する。 (1) 核酸アレイに搭載された核酸プローブが属する区画数、及び 1以上の任意の 識別情報の定義
核酸アレイに搭載された核酸プローブは、 一定の区画内に収められている。 したがって、 核酸プローブが搭載されている区画の数は、 その核酸プローブ数 (プローブの種類の数） を意味している。 そこで本発明においては、 上記区画 数をプローブ数として定義する。 但し、 プローブが搭載されていない区画も、 例えばネガティブコントロールとしてプローブ数に含めることができる。 なお、 「プローブ数」 とは、 区画内に含まれる個々のプローブの数ではなく、 区画内 のプローブの集団数のことである。
相補核酸試料 （群） を調製するに際し、 、該試料 （群） を構成する相補核酸分 子の配列情報、 濃度、 標識の種類等を予め記録しておく。 この情報は、 ハイブ リダイゼーシヨン後に得られるプローブ及び相補核酸分子のハイプリッ ド形成 の状態を評価するための 「識別情報」 として使用される。 また、相補核酸分子、 核酸試料及び核酸試料群について符番等を行い、 明確化 （定義） しておく。 た とえば、 核酸試料群中のある核酸試料の存在の有無は、 ハイブリダィゼーショ ン後の検出時に 「ハイブリダィゼーシヨンシグナルの有無」 という識別情報と なる。 また、 標識種類の違い、 例えば Cy3標識及び Cy5標識の核酸試料を含む 核酸試料群を使用するのであれば、 標識の違いを判別することが可能であると いう意味で、 「ハイブリダィゼーシヨンシグナルの種類」 という識別情報とな る。 さらに、 核酸試料の濃度を変更することも、 「ハイブリダィゼーシヨンシ グナルの強弱」 という観点から識別情報となる。 このように、 識別情報は、 ハ イブリダィゼーシヨンの結果、 得られる情報の違いや、 その違いの原因となる パラメーターとして使用される。
具体的には、 Aというプローブが核酸アレイ上に搭載されていた場合、その相 補鎖である A'を、 相補核酸試料群のそれぞれの相補核酸試料に入れる際、 「A， を入れるか入れないか」 、 「A 'に対して施された標識の種類」 、 「投入した A' の量」という既知の情報は、ハイブリダィゼーシヨン後に得られる情報として、 「シグナルが得られたか得られていないか」 、 「得られた蛍光はどのような種 類であつたか」 、 「得られたシグナル強度はどの程度の強さであるのか」 、 と いった情報によって識別することができ、 ハイブリダィゼーシヨンの結果から も、 相補核酸分子 A'の各相補核酸試料への投入状態を容易に判断することがで きる。
搭載された核酸プローブの確認に必要なアレイの数は、 核酸プローブの種類 と識別情報の数によって決定される。 核酸アレイにおいて、 核酸プローブの搭 載位置の確認を行う場合、 この識別情報が多ければ多いほど、 準備する相補核 酸試料の数が少なくてすむため、 使用する核酸アレイの枚数も抑えられて、 効 率的に確認を行うことができる。 '
(2) 搭載状況の確認に必要な核酸アレイ数の算出、及び核酸プローブへの数値の 割り当て 、 ' ■
核酸アレイ上に搭載してある核酸プローブの全てについて、 アレイ上の位置 を確認する場合、 必要となる識別情報、 使用すべきアレイ数、 及び相補核酸試 料の数は以下の式を満たす条件で表される。 '
M≤ (N+1) 1
ただし、
M：核酸プローブの種類
N：識別情報の数
X：使用するアレイの枚数
である。
上式の等式部分は、 次式 .
X = Uog (N+i) M} +1
(Nは識別情報の数、 Mは核酸ァレイに搭載された核酸プローブが属する区画 数を表す。 ）
で示すことができるため、 この式を用いて Xを算出することができる。算出され た Xは、 整数部分と小数点以下の数字で表されるが、 本発明では Xの整数部分の 数字を搭載状況の確認に必要な核酸アレイ数 Xaと定義する。
例えば、プローブ数 M=250の核酸アレイであって識別情報がシグナルの有無 という 1つの情報のみで判断するときは、 ハイブリダィゼーシヨンを確認でき る識別情報数は 1 (N=l) であるため、 X=log2 250+1= 8.9657 · · ·となる。 の 整数部分は 「8」 であるため、確認に必要なアレイの枚数 Xa= 8枚ということに なる。 Xa = 8枚のアレイを使用することによって全搭載プローブ アレイ上にお ける相対位置を確認することが可能である。
また、 本発明の別の態様において、 識別情報が、 Cy3、 Cy5の二つの蛍光と、 相補核酸分子の 2段階濃度によつて判断される場合、 ハイブリダイゼーション を確認できる識別情報数 N=4となるため、 Xa =4枚のアレイを使用することによ つて全搭載プローブのアレイ上における相対位置を確認することが可能となる。 ここで、本発明において、 24種類の核酸プローブが搭載された核酸ァレイを、 蛍光シグナルの有無により検査する態様を考えてみる。
蛍光シグナルの有無は、 1種類の蛍光標識で足りるため、 識別情報数 （N) は 1つである。 プローブ数 （M) と識別情報を上記式に代入すると、 確認作業 を行う場合のアレイの必要枚数は、 5枚となる。
5枚の各アレイにハイブリダィゼーシヨン反応させるための相補核酸試料を それぞれ、 試料 A、 試料 B、 試料 C、 試料 D及ぴ試料 Eとし、 前記区画に属する核 酸プローブのそれぞれに、 N + 1進法で表される数値であって Xaと同数の分の 桁数 （試料 A〜E= 5種類の試料、 つまり 5桁） を有する数値 Yを重複しないよう に割り当てる。 上記例の場合は Xa= 5であり、 N+ 1 = 2であるから、 表 1の プローブ 1〜24に割り当てられる数 ίίίΥは、 Α〜Εの欄に示す 「1」 と 「0」 の 数字により二進法で 5桁の数字として表すことができる。 試料 Α〜Εの欄に付さ れた 「1」 は、 蛍光標識された相補核酸が含まれていることを、 「0」 は相補 核酸が含まれていないことを示す。
表 1に示すとおり、 プローブ 1に割り当てられた数値 （Υιとする）は 「1 0 0 0 0」 であり、 プローブ 2に割り当てられた数値 （Y2とする） は 「1 0 0 0 1」 である。 これらの数値はプローブ 1〜2 4の間では重複することなく、 それぞ れ異なっている。 表 1
Figure imgf000014_0001
(3) 相補核酸試料群の作製及びハイブリダイ.ゼーシヨン用アレイの作製
この工程では、 前記核酸プローブの塩基配列の全部又ほ一部と相補的な塩基 配列を含む相補核酸分子を調製し、前記割り当てられた数値 Yのそれぞれの桁ご とに、 それぞれの桁の数字に基づいて相補核酸分子を混合して核酸アレイ数 Xa 個分の核酸試料群を作製するとともに、 Xa個の核酸ァレイを作製する。
上記 Y値を割り当てた後は、 5枚の各アレイにハイブリダィゼーシヨン反応さ せるための相補核酸試料群をそれぞれ調製し、 試料 A、 試料 B、 試料 C、 試料 D 及び試料 Eとする （表 1 ) 。 なお、 核酸は、 プローブの配列情報に基づいて化学 合成装置により合成することができる。
それぞれの試料は、 数字 「1」 を割り当てたプローブの相補鎖を混合して得 られた混合物である。 例えば、試料 Aには、 プローブ 1〜1 6に対する相補鎖が 含まれており、 試料 Bには、 プローブ 9〜 2 4に対する相捕鎖が含まれている。 なお、 「相補鎖」 は、 核酸プローブの全部に相補的である必要はなく、 一部に 相補的であってもよい。
相補核酸分子に識別情報を与えるために標識をおこなう場合は、 単一の標識 で確認するか、 あるいは単一の標識で互いに独立した検出を行い、 検出時にそ れぞれの違いを同時もしくは時間差で確認できることが必要である。すなわち、 標識は、 単一の標識を行って 1回の検出により確認する場合と、 単一の標識で あるが相補核酸分子を互いに独立させて複数回の検出により確認する場合があ る。 具体的には、
(i) 検出時にそれぞれの標識の違いを同時に確認する場合 （例えば C y 3と C y 5の組み合わせなど）、 および、 、 '
(ii) 検出時にそれぞれの違いを時間差で確認する場合 （例えば、 同一標識物 質であるが、 直接標識での検出後に、 間接的な標識で検出する場合）
などが挙げられる。 上記 （2 ) については、 C y 5直接標識とビォチン直接標 識-ストレプトァビジン- Cy5間接標識との組み合わせにより検出を行うことが できる。
上記、 「標識」 方法は、 核酸のハイブリダィゼーシヨンを検出することがで きる限り特に限定されるされるものではない。 標識に使用される標識物質とし ては、 例えば Cy3、 Cy5、 Alexa Fluorなどの蛍光物質、 アルカリフォスファタ ーゼゃホースラディッシュペルォキシターゼを使用した基質分解にともなう化 学発光を利用するための酵素又はたんぱく質、 γ -32Ρや α -32Ρ等のラジオアイソ トープなどが挙げられるが、 蛍光物質を使用すること 簡便である点で好まし レ、。
これらの標識物質を相補核酸分子に取り込ませる際には、 標識方法が安定で あり、 プローブ核酸との特異的なハイブリダィゼーションを阻害しない限りに おいては、 直接的、 間接的または物理的、 化学的結合に関わらずどのような方 法であっても使用可能である。 化学的な修飾を行う方法として、 ピオチンゃァ ミノアリル基によって修飾されたアナログ塩基を反応時に取り込ませ、 それを 介して標識物質を取り込ませる方法が挙げられる。 また、 SYBR Green、 ァク リジンオレンジ、 SYBR Goldなどを用いて標識物質を相補核酸分子にィンター 力レートさせる方法、 ULYSISのように標識物質を相補核酸分子に対して白金 を介して結合させる方法などを採用することもできる。 但し、 標識分子によって標識された相補核酸分子を多数用意することは、 高 コストとなる場合がある。 これを回避するため、 全ての相補核酸分子の 3'又は 5' 末端に、 各相補核酸分子の対応する核酸プローブと相補である部分とは別に、 共通の核酸塩基配列 （タグ） を延長付加しておいた上で、 そのタグ配列に相補 である標識核酸分子を使用することもできる。 この場合においても、 互いのシ グナルを独立に検出できる限り おいて、 その標識方法はどのようなものでも よく、 また、 タグの配列自体を複数種類にすることも可能である。
(4) ハイブリダイゼーション及ぴシグナル検出 '
この工程では、 上記のとおり作製された Xa個の核酸アレイのそれぞれに、 対 応する前記核酸試料群を接触させ、 核酸アレイに搭載されている核酸プローブ と前記相補核酸分子とのハイプリッドに由来するシグナルを検出する。
試料 A〜Eをそれぞれ核酸アレイ A〜Eに添加してプローブと相補核酸との接 触 （ハイブリダィゼーシヨン） を行うと、 核酸アレイ Aでは 1番から 16番まで のプローブに対して蛍光シグナルが検出され、 核酸アレイ Bでは 9番から 24番ま でのプローブに対して蛍光シグナルが検出される。 核酸アレイ C〜Eについても、 上記と同様に 「1」 を付した箇所のプローブに対して蛍光シグナルが検出され る。 ' (5) 検出されたシグナルの発現パターンと、 割り当てられた数 のパターン との照合
上述の方法によって、 相補核酸試料に含まれている相補核酸分子の組み合わ せと、 核酸アレイの各位置におけるプローブの位置情報、 及び、 実際にハイブ リダイゼーシヨンで得られたシグナルを識別情報と照会することにより、 相補 核酸試料に対応する核酸プローブが、 核酸アレイ上のどの位置にスポットされ ているかを確認することが可能である。
各核酸アレイにおける検出結果を各相捕核酸ごとに見ていくと、 例えば表 1 のプローブ 1に対する相補核酸については、核酸試料 Aのみに含まれているため、 核酸試料 A〜E間の識別情報の組み合わせ （数 ίϋΥι)は 「1 0 0 0 0」 となる。 また、プローブ 16に対する相補核酸については核酸試料 Α〜Εの全部に含まれて いるため、 核酸試料 A〜E間の識別情報の組み合わせは 「1 1 1 1 1」 となる。 これらの識別情報の組み合わせは、 各相補核酸ごとに全部異なっている。 従つ て、 前記プローブごとに割り当てられた数値のパターンと、 検出結果めパター ンとを照合し、検出結果が組み合わせどおり、十なわち Y値のパターンどおりに 得られたときは、 核酸アレイに搭載されている核酸プローブの種類及び位置は 正しいと判断することができる。 '
例えば、 シグナルが有りのときは 「十」 、 シグナルが無しのときは 「―」 と し、 プローブ 1の検出結果として、 試料 A〜Eの順に 「十、. 一、 一、 一、 一」 と いう結果が得られたと仮定すると、 この検.出結果と
Figure imgf000017_0001
'「 1, 0 0 0 0」 との照 合結果は合致することになる。 上記検出結果 （ 「十」 、 「一」 ） は数値として 表すことができる。 そこで、 検出結果を二進法としてそれぞれ 「1」 及び 「0」 で表すと、 検出結果は割り当てた数 fitYi ( 「1 0 0 0 0」 ） となり、 正しい位 置に核酸が固定されていると判断することができる。 次に、 24種類の核酸プローブが搭載された核酸ァレイを、 3種類の蛍光シグナ ルにより検査する態様を考えてみる。 蛍光標識は 3種類使用されるため、識別情 報数（N) は 3つである。 プローブ数 （M) と識別情報を上記式に代入すると、 確認作業を行う場合のアレイの必要枚数 Xaは、 3枚となる。
ここで、 3枚の各アレイにハイブリダィゼーション反応させるための相補核 酸試料をぞれぞれ調製し、 試料 A、 試料 B及び試料 Cとする （表 2 ) 。 識別情報 として、 「0」 は緑色の蛍光標識を、 「1」 は黄色の蛍光標識を、 「2」 は赤 色の蛍光標識を表すものとし、 表 2の試料 A〜Cの欄に 「0」 、 「1」 又は 「2」 のいずれかを付与する。
この場合は、 Xa= 3であり、 N+ 1 = 3であるから、 表 2のプローブ 1〜24に 割り当てられる数値 Yは、 A〜Cの欄に示す 「0」 、 「1」 及び 「0」 の数字に より三進法で 3桁の数字として表すことができる。 表 2
Figure imgf000018_0001
各核酸アレイにおける検出結果を各相補核酸ごとに見ていくと、 例えばプロ ーブ 1に対する相補核酸については、核酸試料 A〜Cのいずれも緑色の蛍光標識 がされているため、 核酸試料 A〜C間の識別情報の組み合わせは 「0 0 0」 とな り、 プローブ 6に対する相補核酸については核酸試料 A〜C間の識別情 の組み 合わせは 「0 1 2」 となる。 これらの識別情報の組み合わせも、 各相補核酸ご とに全部異なっている。 従って、 識別情報に対応する検出結果が組み合わせど おりに得られたときは、 核酸アレイに搭載されている核酸プローブの種類及ぴ 位置は正しいと判断することができる。
2 . 核酸アレイの品質検査方法。
上記の方法に基づいて、 該核酸アレイの 1ロットを、 該核酸アレイの出荷時 に検査を行い、 核酸アレイの品質管理基準の 1つとして利用することが可能で ある。
核酸プロ一ブの搭載位置を確認するための品質検査に用いられる核酸ァレイ は、 同一ロットで大量に作られた核酸アレイのうちから準備されることが望ま しい。 本方法においては、 どのような核酸アレイについても適用が可能である 力 個々のプローブスポット位置が物理的に混ざり合うことのない方法で製造 されうる核酸マイクロアレイであることが好ましい。 このような核酸マイクロ アレイは、 中空糸等にプローブを固定化し、 それを束ねた上でスライスするこ とにより得ることができる。 中^糸へのプローブの固定は均一に行うことがで きるため、 上記スライスによつて得られたマイクロアレイを用いて核酸プロ一 ブ搭載位置を決定する場合は、 同一ロット内における検査を、 品質がばらつく ことなく、 かつ高精度に行うことができる、。
また、 プローブ搭載位置の確認について、 核酸アレイを複数、 使用すること ができない場合は、 一度ハイブリダィゼーシヨンを行った核酸アレイを再利用 することも可能である。 具体的には、 ハイブリダィゼーシヨン後、 核酸プロ一 ブと、 相補核酸試料とのハイブリッドを解離する。 ハイブリッドを解離するた めには、 核酸アレイを水などに浸漬した上で、 一定温度以上に加熱することで 可能となる。 解離させた核酸アレイは、 プローブの固定化状況、 もしくはシグ ナル残存の状況に応じて再利用が可能となる。 乾燥基板上に作製された核酸ァ レイについては、 再利用を行うことを勧めていない場合が多いが、 常湿潤状態 で利用される核酸アレイについては、ハイブリッドの解離を行いやすく、且つ、 固定化されたプローブが乾燥基板に比較してはがれにくいことから、 シグナル の有無程度の識別情報であれば特に誤認識されることはない。 実施例
以下、 実施例により本発明をさらに具体的に説明する。 但し、 本発明はこれ ら実施例に限定されるものではない。 核酸アレイの作製
核酸プローブの合成
核酸アレイを作製するために、表 3に示す配列番号 1番から 192番で示される オリゴ DNAを合成した。 表 3
Figure imgf000020_0001
61
Figure imgf000021_0001
f90而 900Zdf/ェ：) d 86滅 OOZ OAV 100 gcctgaactagccaatcagatcaactctgtcttgggcgtttgaactcagggagggaggcccttgg
101 ctgacaagtcttaatcaactaggcgagaggcaacttctttcagtagtcaagtggtctaaatcatt
102 caagttcagctccacgtgtgccatcagtggatccgatccgtccagccatggcttcctattccaag
103 gcaagtgtacagatctgtgtagaggaatgtgtgtatatttacctcttcgtttgctcaaacatgag
104 ctgaccctgaagttttcctaccccaaggagagttactcgacagtccataagtcaactgttgtgtg
105 tcacttgctgaacgccgtgaccgatgctttggtttgggtgattgccaagagcggcatctcctccc
106 ctgttgtcctccccttgggcggctgagagccccagctgacatggaaatacagttgttggcctccg
107 caaaaatgacccccatttgtgtgacttcattgagacacattacctgaatgagcaggtgaaagcca
108 ggcctgggtaggatcatgtatacggtatttgaacatacattccatgtacgagaaggagatgaaca
109 gctattattttctttaaagaatgctgggtgttgcatttctggaccctccacttcaatctgagaag
110 ctctttctgcatggttgtgtccctagtcctaagctttggttctttagggtgactgtggtaagaag
111 attgcgaagaacctgctctccgcgcctctcggtgctccaaatggacatcacgaagccagtgcaga
112 tcatgctaacgcagcagttgcaaacattttgaagagagaccgtcgggggctgaggggcaacgaag
113 gacacgtgatgggaagctggtgtctgagtcctctgacgtcctgcccaagtgaacagctgcggcag
114 tctgtatgacaacccgggatcgtttgcaagtaactgaatccattgcgacattgtgaaggcttaaa
115 tgctgtgtttactctcccgtgtgccttcgcgtccgggttgggagcttgctgtgtctaacctccaa
116 ttgtatcacggattacaatgaacgcagtgcagagccccaaagctcaggctattgttaaatcaata
117 gcctacatgacacagttggatttattctgccaaacctgtgtaggcattttataagctacatgttc
118 tagtggggactagtgaatgacttgacctgtgacctcaatacaataaatgtgatcccccacccaaa
119 cagcacaaggaggatgtgatatgtgggggagtgagcactgggttgggagccgggtcctggtttcc
120 cactgttagatagttggaaaggggaaattctgtttaagcgaaagtggtatcatcctaggtaagct
121 cttccaagctctgcttcctcagtttccaaaatggaaccacctcacctccgcagcacccgacttac
122 cccctttgccattgatcaagccatattcaggtcctaggttgccacctgatagatactgcttaaca
123 cgacgacaccgttcgtggggtcccctggtgcttctatcctaataccatcgacgtccctccagaag
124 tttgggagagacttgttttggatgccccctaatccccttctcccctgcactgtaaaatgtgggat
125 gcctcccttggtctgcccagccctcggttagccctgcctgaatcagtagatacttgaacgagtcc
126 ctgcgcccctagctgggatctggtacctggactaggctaattacagcttctccccaacaggaaac
127 aac tec tgtacttgaagctgagacc teat atgacgtggccttcgtgttgtcagagagtgtctgga
128 ctgagaggggaagcggccctaagggagtgtctaagaacaaaagcgacccattcagagactgtccc
129 tgcatgaatgaagaccctgcaaagcgacccaaatttgacatgattgtgcctatccttgagaagat '
130 acagctgtagcaactttgtgtctgaagatgactcggaaacccagtccgtgtccagctttagttca
131 tgccctgtggaatgggctcaaggttcctgagacacccgattcctgcccaaacagctgtatttata
132 gcagaagcagacctagaccctagcgttcccccttatgactctcttcagacttatgcctatgaggg
133 ccagacaaaatttgagaatacataaacaacgcattgccacggaaacatacagaggatgccttttc
134 cagctctagaggtcacagtatcctcgtttgaaagataattaagatcccccgtggagaaagcagtg
135 tccaaggctcaccgcagaagcagtagcagcggggaccaatcatcagactccttgaactcccccac
136 ccacatgttaaccctctagctgataatgcaaacactaactgggggattttatttataagggctct
137 gggcctttccaagattgctgtttttgttttggagcttcaagactttgcatttcctagtatttctg
138 aaactgctatagcctaagcggctgtttactgcttttcattagcagttgctcacatgtctttgggt
139 tgaatgagatgcgtgaccagtacgagcagatggcagagaaaaaccgcagagacgctgagacctgg
140 tgatgctctgcgaagggctcttcgtggcagacgtcaccgatttcgagggctggaaggctgcgatt
141 gggggtgctctttggacactggattatgaggaatggataaatggatgagctagggctctgggggt
142 tgctgtggcttcaccaactatacggattttgaggactcaccctacttcaaagagaacagtgcctt
143 gaggataacattggcgggaggggagttaactggcaggcatggcaaggttgcatatgtaataaagt
144 tgatgatgaggaagaagaagaagaagggggctcatggggccgtgggaacccaaggttccatagtc
145 ccaggacaaaggccgctttgaactctaccgtgccacgttttatgccgctgagataatgtgtggac
146 tccatttctctgagggacctttagttggctctgtgggactgttccggatgggcctctgggtcact
147 agcagctgcctagggggtgtccaaggagcagagaaaactactagatgtgaacttgaagaaggttg
148 gtggttggtgtcctgctcatcatcctgattgtgctgctggtcgtctttctccctcagagcagtga
149 aatctgcattctgtcaggcacccgtagaaagacctcagtacatgctttgcactctcctttgctcc
150 tacatccagtaccaaggcttccgggtccagctggaatccatgaagaagctgagtgacctggaggc 151 ccaaattcaagatacaggtatccccgtttttacaacagatgttcatgcccctgcttcatgcaatt
152 gaattggatttgaagaactcgactttatgtgatcatggtattggtatacatgtggggtggagaac
153 acgattttcttctgtagaatgtttgacttcgtattgacccttatctgtaaaacacctatttggga
154 gcacgcatttttgttgccttggttttacctgtagactgtggaactattttaccttaagacctgaa
155 gtggaaggactgattgagaatgttccaatccaaatgaatgcatcacaacttacaatgctgctcat
156 gctgctctcattggaattgcaggatctggctactgtgtcattgtggcagcccttggcttagcaga
157 caaatttaataaggaaccatgtaatggtagcagtacctccctaaagcattttgaggtaggggagg
158 aacaaaaatctgggaatggtctgccgaaaaccgaccgacccggttgattggccaccgcttgtcct
159 tcctaacctgccggggtcattccccaccaaacaccccatactaaggagccatgagccacctggac
160 cggagggaactgcagggagaccaacttatttagagcgaattggacatggataaaaaccccagtgg
161 tgctgggtaccaggactcacctctgacaagcaggagaaggtaagggcccggtcagctccaaggag
162 gccaaaggaagtctaaggaattagtagtgttcccatcacttgtttggagtgtgctattctaaaag
163 cataaagttgctggccagcttttacctcttgcatataatctgttgaagaggaatctgtttgcaga
164 gcaaactcatggatggctcttataccaggagaagataaggtatgccagagtgtatttgagagaaa
165 ctgttcagatgatctttcattcaatgtgttcctgttgggcgttactagaaactatggaaaactgg
166 tgggtacactttgtaccagtgtcggcctccactgatgctggtgctcaggcacctctgtccaagga
167 accagggtaccctgtcttggtggttaggggccacttttcctttgaggctctagtggaggtggatg
168 ggttgagaagagcttttcggacctgttactaccccaagctgtgtaatatacttgtataacagaaa
169 ctaaggccattgacgtggcctgcgatctcagtgacaatgatctgcttctggatctcactgttgcc
170 tgacagccaccgggtcatcaccttcgcaaaccaggacgactacatatcattccggcaccatgtgt
171 ctccagcatctcaactccgtctgtctactgtgtgagacttcggcggaccattaggaatgagatcc '
172 cgattacagggacaacagcagttgatacaccaaaatcggcaagctatcttaaaccagtttgcagc
173 agaaggagcaatggtacgctggcatcaacccctcggacggtatcaactcagaggtcctggaagcc
174 ccccaaaggatggtcacacaccagcactttatacacttctggctcacaggaaagtgtctgcagta
175 atgccttgtacccccaccgtgcaggttgtggccggttttctccgcaggttgaacatggaaataaa
176 ttggtgcaagtcttgggagcgtgatctagattacactgcaccattcccaagttaatcccctgaaa
177 ttccatccactgcccatgaccctgttccctgtctataaatccccagttttccatggtatattcag
178 gtatattaaagcaccaaattcatgtacagcatgcatcacggatcaatagactgtacttattttcc
179 ggcttcggacaaaatatctctgagttctgtgtattttcagtcaaaactttaaacctgtagaatca
180 agtggagctgtttgacttggagaataacccagagtacgtgtccagcggagggggctttggaccgg '
181 tgagaactcgtggtacttcagtgtccctccccctgtattgtgacaaggtaattctgtggtatcag
182 ctaatacgatgcatatactgaagggcaaggactttgaccatgtcaattttcagccgagaatggtc
183 accaccatggttacagcggatgccccgagactctgcttggtaaacgtggcagagcagaatgggag
184 aaggcagagagtcagacccttcaatggaaggagagtgcttgggatcgattatgtgacttaaagtc
185 gtctgagcttctttagctaggctaaaacaccttggcttgt tat tgcctc tact tt gat tctgata
186 gcatttaattcaaagagaggggagcatccattattggtacatgtgggcttttaaaaactccatcc
187 gcaccaacatgtaaccggcatgtttccagcagaagacaaaaagacaaacatgaaagtctagaaat
188 atgcctgcccagttccctttttatttgcagaagctgtgagttttgttcacaattaggttcctagg
189 gtgccactagttaaatgccgaattctcatctggatgttaccatcaaacatcagtacacttgtcat
190 cagctgcctgttttgcatggtatttgcaaaaatgcctcttgcgtgaggaaatcttttaccatttt
191 gacaatgctgatggaagaccagactggaaagtggatcgactcctccttcattgattctaaattca
192 ggttagttgatcaagaattttggggtgggggttgcggagaaatcaagtttaaaattccttctgat 核酸アレイの製造
図 1に示す配列固定器具を利用して中空繊維束を製造した。なお、図中の X、 y、 zは直交の 3次元軸であり、 X軸は繊維の長手方向と一致する。
まず、 直径 0.32mmの孔 (11)が、 孔の中心間距離を 0.42mm として、 縦 12 列、横各 19列で合計 228個設けられた厚さ 0.1mmの多孔板 (21)を 2枚を準備 した。 これらの多孔板を重ね合わせて、 そのすベての孔に、 ポリカーボネート 中空繊維 (31) (三菱エンジニアリングプラスチック社製 カーボンブラック 1 質量％添加） を 1本づつ、 通過させた。
X軸方向に各繊維に 0.1Nの張力をかけた状態で 2枚の多孔板の位置を移動 させて、中空繊維の一方の端部から 20mmの位置と 100mmの位置の 2ケ所に 固定した。 即ち、 2枚の多孔板の間隔を 80mmとした。
次いで、 多孔板間の空間の周囲 3面を板状物 (41)で囲った。 このようにして 上部のみが開口状態にある容器を得た。 、
次に、 この容器の上部から容器内に樹脂原料を流し込んだ。 樹脂としては、 ポリウレタン樹脂接着剤 （日本ポリウレタン工業 （株） ニッポラン 4276、 コロ ネート 4403) の総重量に対し、 2.5質量％のカーボンブラックを添加したもの を使用した。 25°Cで 1週間静置して樹脂を硬化させた。 次いで多孔板と板状物 を取り除き、 中空繊維束を得た。
次に、 表 4に示す質量比で混合した単量体及び開始剤を含むゲル前駆体重合 性溶液をァレイに固定する核酸プローブ毎にそれぞれ調製した。 表 4
組 成 質 量 比
(核酸プローブ；濃度）
N， N-ジメチルアクリルアミ ド 3 . 4 2 %
N, N-メチレンビスアクリルアミ ド 0 . 3 8 %
2,2'-7f ビス [2-(2-イミタ、、ソ、、リン- 2-ィル)フ。ロノ、。ン] 0 . 1 %
シ、、ハイに口クロライド (VA-044)
水 9 6 . 2 %
核酸プローブ溶液 5 p mol/1 次に、 図 2に示した配置になるように、 中空繊維束の対応する中空繊維の中 空部に上記で作製した各核酸プローブを含むゲル前駆体重合性溶液を充填する ために、 該重合性溶液の入つた容器及び上記で作製した中空繊維束をデシケー ター内に設置した。 デシケーター内を減圧状態にしたのち、 中空繊維束の各糸 の封しされていない端部を所定の前記重合性溶液の入った容器に浸漬した。 デ シケーター内に窒素ガスを封入し、 中空繊維の中空部にキヤプチヤープローブ を含むゲル前駆体重合性溶液を導入した。 次いで、 容器内を 70°Cとし、 3時間 かけて重合反応を行った。
このようにして核酸プローブがゲル状物を介して中空繊維の中空部に保持さ れた中空繊維束を得た。
次に得られた中空繊維束を、 ミクロトームを用いて繊維の長手方向と直交す る方向でスライスし、厚さ 0.25mmの薄片シート（核酸アレイ）を 300枚得た。 核酸アレイは、 図 2に示すプローブ位置で作製した。 なお、 図中の数字はプ ローブの配列番号を示し、 核酸アレイには、、 それぞれの配列番号に示す塩基配 列を有するプローブが配置されている。 Bは、 核酸プローブの入っていないス ポットを示す。 核酸プローブ搭載位置同定用核酸試料群の作製
上記で作製した核酸ァレイのプロ一ブ位置を同定するための核酸試料 （ォリ ゴ DNA) を下記の通り作製した。 これらの核酸試料は、 対応する各プローブ の 3'側の一部と相補である部分を含んでおり、 且つ、 核酸試料の 5'側には GT の繰り返し配列からなる塩基配列であつて配列番号 385番と相補である塩基配 列を含んでいる。 なお、 配列番号 385番は、 5'側に Cy5標識を施したオリゴ DNAを lOOpmol/μ Ιの濃度で作製したものである。
プローブ'配列と、 その相補鎖を含むプローブ搭載位置確認用核酸試料の配列 との対応関係は、配列番号 1が配列番号 193に対応し、配列番号 2が配列番号 194に対応し、それ以降は順に、配列番号 192番が配列番号 384と対応する（表 3、 5 )。 上記プローブ表における配列の一部は、表 5の対応する配列の一部に 相補的であり、 それぞれの検体は、 上述のプローブと配列番号対応の順に二本 鎖を形成する配列を保持している。 例えば、 表 5における配列番号 193の塩基 配列のうち小文字で表した配列は、 表 3における配列番号 1に示す塩基配列の 下線部分（33〜65番目の配列） と相補的であり、 二本鎖を形成できるようにな つている。 fZ
Figure imgf000026_0001
df/ェ:) d 86滅 OOZ OAV 9Z
Figure imgf000027_0001
0Zdf/ェ:) d 86滅 00Z OAV
Figure imgf000028_0001
340 CTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCtcactgctctgagggagaaagacgacc '
341 CTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCggagcaaaggagagtgcaaagcatgtactg
342 CTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCgcctccaggtcactcagcttcttcatg
343 CTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCaattgcatgaagcaggggcatgaacatctgttg
344 CTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCgttctccaccccacatgtataccaataccatg
345 CTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCtcccaaataggtgttttacagataagggtcaatacgaag
346 CTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCttcaggtcttaaggtaaaatagttccacagtctacagg
347 CTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCatgagcagcattgtaagttgtgatgcattcatttggattg
348 ' CTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCtctgctaagccaagggctgccacaatg
349 CTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCcctcccctacctcaaaatgctttagggag
350 CTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCaggacaagcggtggccaatcaaccg
351 CTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCgtccaggtggctcatggctccttag
352 CTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCccactggggtttttatccatgtccaattcgc
353 CTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCctccttggagctgaccgggcc
354 CTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCcttttagaatagcacactccaaacaagtgatgggaac
355 CTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCtctgcaaacagattcctcttcaacagattatatgcaagag
356 CTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCtttctctcaaatacactctggcataccttatcttctcc
357 CTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCccagttttccatagtttctagtaacgcccaacag
358 CTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCtccttggacagaggtgcctgagcac
359 CTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCcatccacctccactagagcctcaaagg
360 CTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCtttctgttatacaagtatattacacagcttggggtagtaacag
361 CTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCggcaacagtgagatccagaagcagatcattg
362 CTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCacacatggtgccggaatgatatgtagtcgtc
363 CTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCggatctcattcctaatggtccgccgaag '
364 CTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCgctgcaaactggtttaagatagcttgccgattttg
365 CTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCggcttccaggacctctgagttgatacc
366 CTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCtactgcagacactttcctgtgagccagaag,
367 CTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCtttatttccatgttcaacctgcggagaaaaccgg
368 CTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCtttcaggggattaacttgggaatggtgcagtg
369 CTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCctgaatataccatggaaaactggggatttatagacagg
370 CTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCggaaaataagtacagtctattgatccgtgatgcatgc
371 CTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCtgattctacaggtttaaagttttgactgaaaatacacagaactca
372 CTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCccggtccaaagccccctccg
373 CTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCctgataccacagaattaccttgtcacaatacaggg
374 CTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCgaccattctcggctgaaaattgacatggtcaaag
375 CTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCctcccattctgctctgccacgtttacc
376 CTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCgactttaagtcacataatcgatcccaagcactctc
377 CTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCtatcagaatcaaagtagaggcaataacaagccaaggtg
378 CTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCggatggagtttttaaaagcccacatgtaccaataatgg
379 CTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCatttctagactttcatgtttgtctttttgtcttctgctggaaac
380 CTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCcctaggaacctaattgtgaacaaaactcacagcttc
381 CTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCatgacaagtgtactgatgtttgatggtaacatccagatg
382 CTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCaaaatggtaaaagatttcctcacgcaagaggcatttttgc
383 CTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCtgaatttagaatcaatgaaggaggagtcgatccactttc
384 CTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCatcagaaggaattttaaacttgatttctccgcaacccc
385 Cy5-GAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAG これら核酸試料を表 6に記載の通りに混合し、 8本のプローブ位置同定用試 料を作製した。 表 6
Figure imgf000030_0001
241 0 0 1 1 0 0 0 1
242 0 0 1 1 0 0 1 0
243 0 0 1 1 0 0 1 1
244 0 0 1 1 0 1 0 0
245 0 0 1 1 0 1 0 1
246 0 0 1 1 0 1 1 0
247 0 0 1 1 0 1 1 1
248 0 0 1 1 1 0 0 0
249 ' 0 0 1 1 , 1 0 0 1
250 0 0 1 1 1 0 1 0
251 0 0 1 1 1 0 1 1
252 0 0 1 1 1 1 0 0
253 0 0 1 1 1 1 0 1
254 0 0 1 1 1 1 1 0
255 0 0 1 1 1 1 1 1'
256 0 1 0 0 0 0 0 0
257 0 1 0 0 0 0 0 1
258 0 1 0 0 0 0 1 0
259 0 1 0 0 ； 0 0 1 1
260 0 1 0 0 0 1 0 ο.
261 0 1 0 0 0 1 0 1
262 0 1 0 0 0 1 1 0
263 0 1 0 0 0 1 1 1
264 0 1 0 0 1 0 0 0 '
265 0 1 0 0 1 0 0 1
266 0 1 . 0 0 1 0 1 0
267 0 1 0 0 1 0 1 1
268 0 1 0 0 1 1 0 0
269 0 1 0 0 1 1 0 1
270 0 1 0 0 1 1 1 0
271 0 1 0 0 1 1 1 1
272 0 1 0 1 0 0 0 0
273 0 1 0 1 0 0 0 1
274 0 1 0 1 0 0 1 , 0
275 0 1 0 1 0 0 1 1 276 0 1 0 1 0 1 0 0
277 0 1 0 1 0 1 0 1
278 0 1 0 1 0 1 1 0
279 0 1 0 1 0 1 1 1
280 0 1 0 1 1 0 0 0
281 0 1 0 1 1 0 0 1
282 0 1 0 1 1 0 1 0
283 0 1 0 1 1 0 1 1
284 0 1 0 1 1 1 0 0
285 0 1 0 1 1 1 0 1
286 0 1 0 1 1 1 1 0
287 0 1 0 1 1 1 1 1
288 0 1 1 0 0 0 0 0
289 0 1 1 0 0 0 0 1
290 0 1 1 0 0 0 1 0
291 0 1 1 0 0 0 1 1 οε
Figure imgf000032_0001
C90Z C/900Zdf/X3d 86嫁 00 OAV 343 1 0 0 1 0 1 1 1
344 1 0 0 1 1 0 0 0
345 1 0 0 1 1 0 0 1
346 1 0 0 1 1 0 1 0
347 1 0 0 1 1 0 1 1
348 1 0 0 1 1 1 0 0
349 1 0 0 1 1 1 0 1
350 1 0 0 1 1 1 1 0
351 ' 1 0 0 1 1 1 1 1
352 1 0 1 0 0 0 0 0
353 1 0 - 1 0 0 0 0 1
354 1 0 1 0 0 0 1 0
355 1 0 1 0 0 0 1 1
356 1 0 1 0 0 1 0 0
357 1 0 1 0 0 、 1 0 1'
358 1 0 1 0 0 1 1 0
359 1 0 1 0 0 1 1 1
360 1 0 1 0 1 0 0 0
361 1 0 1 0 1 0 0 1
362 1 0 1 0 1 0 1 0
363 1 0 1 0 1 0 1 1
364 1 0 1 0 1 1 0 0
365 1 0 1 0 1 1 0 1
366 1 0 1 0 1 1 1 0 .
367 1 0 1 0 1 1 1 1
368 1 0 1 1 0 0 0 0
369 1 0 1 1 0 0 0 1
370 1 0 1 1 0 0 1 0
371 1 0 1 1 0 0 1 1
372 1 0, 1 1 0 1 0 0
373 1 0 1 1 0 1 0 1
374 1 0 1 1 0 1 1 0
375 1 0 1 1 0 1 1 1
376 1 0 1 1 1 0 0 0
377 ' 1 0 1 1 1 0 0 1
378 1 0 1 1 1 0 1 0
379 1 0 1 1 1 0 1 1
380 1 0 1 1 1 1 0 0
381 1 0 1 1 1 1 0 1
382 1 0 1 1 1 1 1 0
383 1 0 1 1 1 1 1 1
384 1 1 0 0 0 0 0 0 表 6中、 「1」 は、 表 6の左欄に記載の配列番号で示される塩基配列を有する 相補核酸が試料中に含まれていることを意味する。 「0」 は、 表 6の左欄に記載 の配列番号で示される塩基配列を有する相補核酸が試料中に含まれていないこ とを意味する。 試料 1〜8には、 「1」 と表示した各配列番号のモデル検体は、 500ρηιο1/5 1づっそれぞれ混和し、 最終液量が 500 μ 1となるように純水を添 加し、 調製した。 即ち、 試料 1から 8に含まれるそれぞれのモデル検体の濃度 が lpmol/μ ΐとなるように調製した。 また、 配列番号 193から 384までの全て の検体の、 試料 1から試料 8までの検体投入の有無のパターンが、 全て異なる ように試料を組み合わせた。
上記の表にしたがって作成された 8種類の試料 0.2 / 1 (各 0.2pmol) に、 配 列番号 385の Cy5標識検体を 0.2 l(20pmol)を加え、下記の条件でハイブリダ ィゼーシヨンを行った。 核酸アレイに各 1枚ずつ、 計 8枚ハイブリダィゼーシ ヨンを行った。 、 '
·標識ォリゴヌクレオチド
(配列番号 193から 384より選ばれた組み合わせ） 各 0.2pmol
• Cy5標識ォリゴヌクレオチド （配列番号 385) 20pmol
• 2xSSC (塩化ナトリウム 300mM、クェン酸ナトリウム 30mM、 pH 7.0)
• 0.2% SDS (ドデシル硫酸ナトリウム） ハイブリダイゼーション反応、 洗浄及び検出操作
上述の通り作製した核酸ァレイに、上記の通り調製した核酸試料を接触させ、 恒温槽中で、 65°Cで 1時間ハイブリダィゼーシヨンを行つた。
ハイブリダィゼーション後、 2xSSC， 0.2%SDSの混合溶液及び 2xSSCを用 いて洗浄を^い、 検出を行った。 検出操作は、 冷却 CCDカメラ方式の核酸ァ レイ自動検出装置を用いて、 アレイを 2xSSC 中に浸漬し、 カバーガラスをか ぶせた後に、 標識核酸試料分子の蛍光シグナル強度を測定した。 結果
試料 1から試料 8までの検出画像を図 3に示す。 図 3の結果をもとに、 核酸 プローブ種類とその搭載位置の確認を行う場合、たとえば図 2中の、縦 (R) = l、 横 (C) = 2 (配列番号 96) のシグナルの ON/OFFを、 試料 1から試料 8まで順 に並べると、 「OFF、 ON、 ON、 OFF, OFF, OFF, OFF, OFFJ となる。 表 6を見ると、 このような組み合わせで検体が入っているものは、 配列番号 96 に対応する検体である配列番号 288番のみである。 従って、 R=l、 C=2には配 列番号 288と相補な配列である核酸プローブ、 すなわち配列番号 96で示され る核酸プローブが間違いなく搭載されていることが確認された。 同様にして、 今回得られたそれぞれの核酸プローブ位置におけるシグナルの ON/OFF を比 較した表を表 7に記載した。 表 7において、 「検体投入の有無 （予定）」 は、 各 配列番号のプローブに割り当てた数値であり、 「0」はそのプローブに対する相 補核酸が含まれていないことを、 「1」はそのプローブに対する相補核酸が含ま れていることを示す。 なお、 シグナルの ON/OFFについては、 S/N比が 5以 上のものを ONとし、それ以下のものを OFFとしたが、表 7中の「ON」「OFF」 は、 それぞれ二進法で 「1」 「0」 に置き換えることができる。 表 7
Figure imgf000035_0001
2
Figure imgf000036_0001
£90而 900Zdf/ェ:) d 86滅 OOZ OAV 98
Figure imgf000037_0001
£90而 900Zdf/ェ:) d 86滅 OOZ OAV 351 1 0 0 1 1 1 1 1 10 16 ON OFF OFF ON ON ON ON ON 159
352 1 0 1 0 0 0 0 0 10 17 ON OFF ON OFF OFF OFF OFF OFF 160
353 1 0 1 0 0 0 0 1 10 18 ON OFF ON OFF OFF OFF OFF ON 161
354 1 0 1 0 0 0 1 0 11 2 ON OFF ON OFF OFF OFF ON OFF 162
355 1 0 1 0 0 0 1 1 11 3 ON OFF ON OFF OFF OFF ON ON 163
356 1 0 1 0 0 1 0 0 11 4 ON OFF ON OFF OFF ON OFF OFF 164
357 1 0 1 0 0 1 0 1 11 5 ON OFF ON OFF OFF ON OFF ON 165
358 1 0 1 0 0 1 1 0 11 6 ON OFF ON OFF OFF ON ON OFF 166
359 1 0 1 0 0 1 1 1 11 7 ON OFF ON OFF OFF ON ON ON 167
360 1 0 1 0 1 0 0 0 11 8 ON OFF ON OFF ON OFF OFF OFF 168
361 1 0 1 0 1 0 0 1 11 9 ON OFF ON OFF ON OFF OFF ON 169
362 1 0 1 0 1 0 1 0 11 10 ON OFF ON OFF ON OFF ON OFF 170
363 1 0 1 0 1 0 1 1 11 11 ON OFF ON OFF ON OFF ON ON 171
364 1 0 1 0 1 1 0 0 11 12 ON OFF ON OFF ON ON OFF OFF 172
365 1 0 1 0 1 1 0 1 11 13 ON OFF ON OFF ON ON OFF ON 173
366 1 0 1 0 1 1 1 0 11 14 ON OFF ON OFF ON ON ON OFF 174
367 1 0 1 0 1 1 1 1 11 15 ON OFF ON OFF ON ON ON ON 175
368 1 0 1 1 0 0 0 0 11 16 ON .OFF ON ON OFF ■ OFF OFF OFF 176
369 1 0 1 1 0 0 0 1 11 17 ON OFF ON ON OFF OFF OFF ON 177
370 1 0 1 1 0 0 1 0 11 18 ON OFF ON ON OFF OFF ON OFF 178
371 1 0 1 1 0 0 1 1 12 2 ON OFF ON ON OFF OFF ON ON 179
372 1 0 1 1 0 1 0 0 12 3 ON OFF ON ON OFF ON OFF OFF 180
373 1 0 1 1 0 1 0 1 12 4 ON OFF ON ON OFF ON OFF ON 181
374 1 0 1 1 0 1 1 0 12 5 ON OFF ON ON OFF ON ON OFF 182
375 1 0 1 1 0 1 1 1 12 6 ON OFF ON ON OFF ON ON ON 183
376 1 0 1 1 1 0 0 0 12 7 ON OFF ON ON ON OFF OFF OFF 184
377 1 0 1 1 1 0 0 1 12 8 ON OFF ON ON ON OFF OFF ON 185
378 1 0 1 1 1 0 1 0 12 12 ON OFF ON ON ON OFF ON OFF 186
379 1 0 1 1 1 0 1 1 12 13 ON OFF ON ON ON OFF ON ON 187
380 1 0 1 1 1 1 0 0 12 14 ON OFF ON ON ON ON OFF OFF 188
381 1 0 1 1 1 1 0 , 1 12 15 ON OFF ON ON ON ON OFF ON 189
382 1 0 1 1 1 1 1 0 12 16 ON OFF ON ON ON ON ON OFF 190
383 1 0 1 1 1 1 1 1 12 17 ON OFF ON ON ON ON ON ON 191
384 1 1 0 0 0 0 0 0 12 18 ON ON OFF OFF OFF OFF OFF OFF 192 アレイ上に搭載された全ての核酸プ口一ブ毎に、 シグ士ルのパターンが異な ること、 また、 試料 1から 8中に含まれる相補核酸分子から予想されるシグナ ルのパターンと、 実際のシグナルのパターンが一致したことより、 これらの核 酸プローブが、 予定通りの位置に存在することが確認された。 本手法により、 核酸プローブの搭載位置が確認できることが明らかになった。 配列表フリーテキスト
配列番号 1〜 3 8 5 ：合成 DNA 産業上の利用可能性
本発明により、 核酸アレイ上に搭載されている個々の核酸プローブの種類と 位置を、 該核酸プローブと、 その相補配列を含む核酸とのハイブリダィゼーシ ョンによって確認する方法が提供される。
核酸ァレイ上の各プローブが所定の位置に配置されているかを確認すること は、 DNAマイクロアレイの品質管理上、 最も重要な検査項目であるため、 本発 明により、 そのプローブの配置位置を正確且つ ^便に検査することができる。

Claims

請 求 の 範 囲 . 核酸アレイに搭載されている核酸プローブの搭載状況を確認する方法であ つて、 以下の工程：
(a) 核酸アレイに搭載された核酸プローブが属する区画数、及び 1以上の任意 の識別情報を定義する工程、 '
(b) 次式
X= {log (N+i) M} +1
( Nは識別情報の数、 Mは核酸ァレイに搭載された核酸プローブが属する 区画数を表す。 ）
で示される式を用いて Xを算出し、 Xの整数部分の数字を搭載状況の確認に 必要な核酸アレイ数 Xaと定義し、 前記区画に属する核酸プローブのそれぞ れに、 N + 1進法で表される数値であって Xaと同数の桁数を有する数 ίίΎ を重複しないように割り当てる工程、 .
(c) 前記核酸プローブの塩基配列の全部又は一部と相補的な塩基配列を含む 相補核酸分子を調製し、 前記割り当てられた数値 Υのそれぞれの桁ごとに、 それぞれの桁の数字に基づいて相補核酸分子を混合して核酸アレイ数 Xa個 分の核酸試料群を作製するとともに、 Xa個の核酸アレイを作製する工程、
(d) 工程 (C)で作製された Xa個の核酸アレイのそれぞれに、 対応する前記核酸 試料群'を接触させ、 核酸アレイに搭載されている锌酸プローブと俞記相補 核酸分子とのハイプリッドに由来するシグナルを検出する工程、 並びに
(e) 検出されたシグナルの発現パターンと、 前記割り当てられた数 ίίΥのバタ 一ンとを照合する工程
を含む、 前記方法。 . 核酸プローブの搭載状況が、 核酸プローブの種類及び/又は位置に関する ものである請求項 1に記載の方法。 . 識別情報が、 シグナルの有無、 シグナルの強度及び標識の種類からなる群 から選ばれる少なくとも 1つである請求項 1に記載の方法。
4 . 検出されたシグナルの発現パターンは、 識別情報に基づいて N + 1進 ¾feで 数値化されたものである、 請求項 1に記載の方法。
5 . 請求項 1〜4のいずれか 1項に記載の方法により得られた結果に基づいて 核酸ァレイの品質を検査するごとを特徴とする核酸ァレイの品質検査方法。
PCT/JP2006/322063 2005-10-28 2006-10-30 核酸アレイにおけるプローブ搭載位置の確認方法 WO2007049827A1 (ja)

Priority Applications (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN2006800397611A CN101297199B (zh) 2005-10-28 2006-10-30 核酸阵列的探针搭载位置的确认方法
EP06832420.1A EP1947456B1 (en) 2005-10-28 2006-10-30 Method of confirming probe-loading position in nucleic acid array
JP2006547644A JP4009311B2 (ja) 2005-10-28 2006-10-30 核酸アレイにおけるプローブ搭載位置の確認方法
US12/091,522 US8014958B2 (en) 2005-10-28 2006-10-30 Method for confirming positions on which probes are immobilized in nucleic acid array

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2005-315190 2005-10-28
JP2005315190 2005-10-28

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2007049827A1 true WO2007049827A1 (ja) 2007-05-03

Family

ID=37967925

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2006/322063 WO2007049827A1 (ja) 2005-10-28 2006-10-30 核酸アレイにおけるプローブ搭載位置の確認方法

Country Status (5)

Country Link
US (1) US8014958B2 (ja)
EP (1) EP1947456B1 (ja)
JP (1) JP4009311B2 (ja)
CN (1) CN101297199B (ja)
WO (1) WO2007049827A1 (ja)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2014176308A (ja) * 2013-03-13 2014-09-25 Mitsubishi Rayon Co Ltd マイクロアレイ、その製造方法、及びその用途

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2003279576A (ja) * 2002-03-07 2003-10-02 Samsung Electronics Co Ltd Ｄｎａチップの品質管理方法
JP2003535054A (ja) * 2000-04-26 2003-11-25 アトフィナ チタン、ニオブ、タンタル、錫またはアンチモンをベースにしたルイス酸から得られるイオン性液体と、その使用
JP2005531315A (ja) * 2002-06-28 2005-10-20 ロゼッタ インファーマティクス エルエルシー マイクロアレイの品質を評価する方法

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1147590C (zh) * 1999-08-13 2004-04-28 杨梦甦 基于比率法检测dna芯片荧光信号的方法
CN1111735C (zh) * 2000-02-19 2003-06-18 吴昌 用于生物芯片质量鉴定的色点检查法
CN1314587A (zh) * 2000-03-20 2001-09-26 上海博道基因开发有限公司 一种荧光标记效率检测的方法
JP2003536054A (ja) 2000-03-29 2003-12-02 ポリプローブ，インコーポレイテッド 核酸マイクロアレイ用の品質管理試薬
AU2001286929A1 (en) * 2000-09-01 2002-03-13 Board Of Regents, The University Of Texas System Compositions and methods for the generation of single stranded cdna microarrays with accurate universal quantitation reference

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2003535054A (ja) * 2000-04-26 2003-11-25 アトフィナ チタン、ニオブ、タンタル、錫またはアンチモンをベースにしたルイス酸から得られるイオン性液体と、その使用
JP2003279576A (ja) * 2002-03-07 2003-10-02 Samsung Electronics Co Ltd Ｄｎａチップの品質管理方法
JP2005531315A (ja) * 2002-06-28 2005-10-20 ロゼッタ インファーマティクス エルエルシー マイクロアレイの品質を評価する方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
See also references of EP1947456A4 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2014176308A (ja) * 2013-03-13 2014-09-25 Mitsubishi Rayon Co Ltd マイクロアレイ、その製造方法、及びその用途

Also Published As

Publication number Publication date
EP1947456B1 (en) 2015-08-12
EP1947456A4 (en) 2012-10-31
CN101297199A (zh) 2008-10-29
CN101297199B (zh) 2011-12-28
US20090247419A1 (en) 2009-10-01
EP1947456A1 (en) 2008-07-23
JP4009311B2 (ja) 2007-11-14
US8014958B2 (en) 2011-09-06
JPWO2007049827A1 (ja) 2009-04-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP6020164B2 (ja) 核酸の検出方法
US20040096962A1 (en) Kit used for fabricating an integrated biomolecule sensor
US6448387B1 (en) Polymeric arrays adapted for high expressing polynucleotides
US20070105100A1 (en) Process for assay of nucleic acids by competitive hybridization using a dna microarray
US20020006614A1 (en) Detecting structural or synthetic information about chemical compounds
US8173367B2 (en) In situ dilution of external controls for use in microarrays
JP2006230335A (ja) 遺伝子の検出方法
JP4009311B2 (ja) 核酸アレイにおけるプローブ搭載位置の確認方法
JP2004520052A (ja) 遺伝的特性を検出するための生化学的方法及び装置
JP5569122B2 (ja) 生体分子検出用デバイス
US6830886B1 (en) Supports for the parallel identification and transcription profiling of polynucleic acids
JP5294963B2 (ja) 標的物質の処理方法及び標的物質の総量を求める方法
CN1573330A (zh) 制备微阵列和检验它的方法
JP2010197226A (ja) マイクロアレイ用基板およびマイクロアレイ
KR101017199B1 (ko) 핵산 마이크로어레이를 이용한 핵산 검출 방법
JP2007075095A (ja) ｍｉＲＮＡ搭載マイクロアレイ
JP2005031066A (ja) 固定化核酸プローブの処理方法、核酸の検出方法、核酸濃度分析方法、および核酸検出用キット
JP2010190823A (ja) マイクロアレイ用基板およびマイクロアレイ
JP2007006723A (ja) 核酸マイクロアレイ及びそれを用いた核酸検出方法
JP5394045B2 (ja) マウスＡｃｉｄｉｃｒｉｂｏｓｏｍａｌｐｈｏｓｐｈｏｐｒｏｔｅｉｎＰ０遺伝子の検出方法
JP2008035801A (ja) マイクロアレイを用いた相同性の高い配列を有する核酸の存在比率を推定する方法
KR20110046865A (ko) 마이크로어레이의 품질 결정 방법
JPWO2004090129A1 (ja) Ｄｎａマイクロアレイ、その製造方法及びその使用方法
JP2009240264A (ja) 標的核酸の塩基配列の判定方法
JP2006078387A (ja) プローブ担体のプローブ配置方法

Legal Events

Date Code Title Description
WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 200680039761.1

Country of ref document: CN

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2006547644

Country of ref document: JP

121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application
WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 12091522

Country of ref document: US

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2006832420

Country of ref document: EP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2594/CHENP/2008

Country of ref document: IN