WO2007032376A1 - 分泌型ＩｇＡ及びＩｇＧ抗体誘導剤 - Google Patents

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Hideki Hasegawa
Tetsutarou Sata
Takeshi Kurata
Toshiaki Tanaka
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Masami Moriyama
Hideki Hasegawa
Tetsutarou Sata
Takeshi Kurata
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Definitions

  • the present invention relates to a method for inducing production of secretory IgA and IgG antibodies specific for flavivirus by nasally administering an adjuvant together with a vaccine which is an inactivated antigen of Flavivirus (Flavivirus).
  • the present invention also relates to a method for inducing the production of the secretory IgA and IgG antibodies by nasal administration, thereby preventing the infection of flavivirus force, and also to the secretory IgA and IgG antibody inducers. .
  • Flavivirus infectious diseases caused by Flavivirus have been regarded as a problem.
  • infectious diseases caused by West Nile virus, dengue virus, Japanese encephalitis virus, yellow fever virus, tick-borne encephalitis virus, hepatitis C virus, etc. are major problems worldwide.
  • a hantavirus infection is a zoonotic disease caused by a hantavirus that uses a mouse as a natural host, and the virus is excreted in the feces and urine of the mouse, often fresh or dried feces. It is said that urinary power can also be transmitted by inhaling the virus as an aerosol. In addition, it is thought to be infected by touching the nose, eyes or mouth through the mouse.
  • Hantaviruses that cause HFRS are widely distributed in the Eurasian continent, and the main ones are huntans hosted by the Apodemus agrarius found in the Korean peninsula, the northern to central parts of China, and the Far Eastern Russia. It is a virus. About tens of thousands of patients are reported annually in China, thousands in Russia, and hundreds in South Korea. Rattus norvegicus has a worldwide distribution of rattus norvegicus. (Seoul) Virus, which has not been reported in Japan after a patient infected with a medical animal experiment facility in 1984, but the rat inhabiting Japan's harbor area still owns the virus. Therefore, it is necessary to pay attention to the occurrence of this patient in the future.
  • IgA antibodies secreted from mucous membranes are very effective in protecting against respiratory infections such as influenza caused by air infection.
  • cross-protection against viruses of different types is mainly carried out by IgA antibodies secreted in the mucosa, and these IgA antibodies are induced in humans who recovered after spontaneously suffering from influenza virus. It is said that infection is protected against the epidemic of mutant viruses.
  • influenza vaccines As a method for protecting infection from a virus or pathogen in an uninfected individual, there is a method of intentionally inducing an antibody by inoculating a vaccine that is an inactive antigen derived from the virus or pathogen.
  • influenza vaccines As such, influenza vaccines, cholera vaccines, typhus vaccines, vaccination vaccines, BCG vaccines, and the like are known.
  • Flaviviruses including HFRS and HPS hantaviruses Considering infectious diseases, basically infections caused by powerful viruses can be regarded as respiratory infections, just like influenza virus.
  • Patent Document 1 As an adjuvant from natural resources, it has been reported that the powder of ceramicized oyster shellfish has an adjuvant effect (Patent Document 1).
  • Patent Document 1 Japanese Patent Application 2004-133268
  • Non-Patent Document 1 J. Clinical Investigation, 110 (8), 1175-1184 (2002)
  • the present inventors examined nasal administration of inactive antigens of flaviviruses such as hunterviruses using these substances having a specific adjuvant action, and effectively on mucous membranes. IgA antibody secretion and IgG antibody response in serum were obtained, and it was confirmed that a protective effect against a flavivirus such as a lethal dose of hantavirus was observed, and the present invention was completed. .
  • the present invention provides production of secretory IgA and IgG antibodies specific to flaviviruses such as hantaviruses using Poly (I: C) and ceramicized oyster powder as an adjuvant. It is an object of the present invention to provide a nasal vaccine that induces the disease. Another object of the present invention is to provide a method for preventing infection by flaviviruses by inducing the secretory IgA and IgG antibodies. Means for solving the problem
  • the present invention for solving a difficult problem includes, as one aspect thereof, specifically, an inactivating antigen derived from Frapivirus, and Poly (I: C) or ceramicized oyster shell powder power as an adjuvant.
  • This vaccine is a nasal vaccine characterized in that it obtains a good secretion of IgA antibody on the nasal mucosa and obtains an IgG antibody response in serum.
  • the present invention provides, as another aspect, specifically, a flavivirus characterized by administering Poly (I: C) or ceramicized mussel powder as an adjuvant together with an inactive shark antigen of flavivirus. It is a method for inducing virus-specific IgA and IgG antibodies, and more specifically, a method for inducing secretory IgA and IgG antibodies characterized by administration to the sucker mucosa.
  • An inactivated antigen derived from flaviviruses such as hantavirus provided by the present invention, and a vaccine that also has poly (I: C) or ceramicized oyster powder power as an adjuvant, are administered nasally, thereby causing flavivirus Production of secretory IgA and IgG antibodies in the respiratory mucosal tissue specific to.
  • Secretory IgA and IgG antibodies are the main immunoglobulins in the exocrine fluid, and are pathogen-specific IgA and IgG antibodies that help protect against mucosal surface infection, and include secretions such as saliva, nasal discharge, intestine, and trachea. It is common in medium or colostrum and is also present in serum. Therefore, administration of the vaccine provided by the present invention effectively induces the production of IgA and IgG antibodies and protects against flavivirus infection.
  • Poly (I: C) used as a vaccine adjuvant is a ligand of Toll-like receptor (TLR) 2 It is a single-stranded RNA and as a TLR ligand that stimulates the innate immune system, it exhibits the ability to acquire protective immunity against the attack of microorganisms such as pathogens or viruses.
  • TLR Toll-like receptor
  • Double-stranded RNA that is a ligand of TLR containing Pol y (I: C) Double-stranded R that does not enhance its vaccine ability when administered together with actin as an adjuvant Poly (I: C) itself, NA, enhances the protective immunity against attack of various pathogens or pathogens such as viruses, in particular by pathogens by inducing virus or pathogen-specific IgA antibodies and Ig G antibodies. Defend infection.
  • Poly (I: C) which is a double-stranded RNA used in the present invention, can be used in various low to high sizes as its base pair (bp). It has been found that those exhibiting a superior response to the immune response need to have a molecular size of 300 bp or more. For example, Poly (I: C) of 100-LOOObp can be easily obtained by Toray Industries Co., Ltd. as having such a molecular size.
  • the secreted IgA and IgG antibody inducer provided by the present invention is a ceramicized oyster shell powder used as a vaccine adjuvant, which is a powder obtained by baking oyster shells, It is a porous fine powder.
  • This solution has a sterilizing action or a bactericidal action, and is said to have an effect of removing traces of harmful substances such as residual agricultural chemicals. Ceramicized oyster shell powder itself has already been marketed as a product. Is.
  • the vigorous ceramicized oyster shell powder as an adjuvant used in the present invention is a porous fine powder as observed by an electron micrograph, and has an amorphous structure of about 10 to LOO / zm. It consists of things. Therefore, it acts on the activation of antigen-presenting cells as a vaccine carrier due to its porosity.
  • a vaccine administered with the secretory IgA and IgG antibody inducer provided by the present invention together with Poly (I: C) or ceramicized oyster powder as an adjuvant it is inoculated into the body.
  • An antigenic suspension or solution usually containing infectious agents or portions of infectious agents, that produces active immunity.
  • Antigenic parts that make up a vaccine are generally natural products, synthetic products or genetically engineered proteins, peptides, polysaccharides or similar that have been purified from microorganisms (e.g., viruses or bacteria) or microbial forces. It may be a product.
  • live vaccines or inactive vaccines include flavivirus infection live vaccines.
  • the inactive antigen referred to in the present invention refers to an antigen that has lost its infectivity, and is a complete virus particle virion, an incomplete virus particle, a virion-constituting particle, a post-translationally modified product, a virus Examples include lion non-constitutive protein, its post-translational modification, infection protective antigen, and neutralization epitope.
  • Inactivation can be performed, for example, by physical (for example, X-ray irradiation, heat, ultrasonic) or chemical (formalin, mercury, alcohol, chlorine) operations.
  • the secretory IgA and IgG antibody inducer provided by the present invention is preferably administered in a mucosal administration form.
  • the mucous membranes in vertebrates include the inner walls of particularly extrinsic luminal organs such as the digestive, respiratory, excretory, and genital organs.
  • mucosal administration which is a preferable administration form of the present invention includes, for example, nasal administration (nasal administration), buccal administration, intravaginal administration, upper respiratory tract administration, alveolar administration and the like. Of these, intranasal mucosal administration is preferred.
  • the nasal cavity is the gate of the infection route of respiratory infections caused by flaviviruses such as hantavirus, so mucosal administration causes a secretory IgA antibody reaction, and secretory IgA antibody is introduced into mucosal epithelial cells. Production and production of IgG antibodies in serum are linked to protection against respiratory infections.
  • the pathogen as a target that induces the production of secretory IgA and IgG antibodies, which is the object of the present invention, and exerts immune defense is a microorganism that can cause a disease or disorder to the host.
  • Specific examples include Flavininoles such as West Nile virus, Hunter virus, Dengue virus, Japanese encephalitis virus, yellow fever virus, tick-borne encephalitis virus, and hepatitis C virus.
  • the doses of the secretory IgA antibody and the IgG inducer provided by the present invention cannot be generally limited depending on the age, weight and administration method of the subject to be administered, but are usually administered orally per day for an adult.
  • the dose is about 10 to 500 mg, and in the case of mucosal administration, particularly nasal administration, about 0.1 to LOmg, preferably about 0.1 to Lmg.
  • Poly (I: C) was used as an adjuvant as a synthetic double-stranded RNA, and the ability to induce neutralizing antibodies of inactivated virus or subunit antigen as an inactivated antigen, and thus the anti-pathogen effect, were confirmed. (material)
  • Virus Hantavirus strain (National Institute of Infectious Diseases (Tokyo) also obtained).
  • Vaccine Hantavirus strain (National Institute of Infectious Diseases); Ether-treated inactive Vaccine vaccine Adjuvant: CTB * [Contains CTB (cholera toxin B subunit), 0.1% CT (cholera toxin)] as a positive control, Poly (I: C)
  • mice Five 6-week-old BALBZc mice (Japan SLC Co., Ltd., Tokyo) were used in each group. Inoculate 5 L of the mouse nose with 1 ⁇ g of the Hantavirus strain vaccine with Poly (I: C), 0.1 g, 1 g, 3 / zg, and 10 g as adjuvants, and 3 weeks later. The vaccine was injected nasally with no adjuvant or with adjuvant, and two weeks later, 1 OOpfu hantavirus was inoculated into each nose at 1.2 L for infection.
  • Poly I: C
  • the vaccine was injected nasally with no adjuvant or with adjuvant, and two weeks later, 1 OOpfu hantavirus was inoculated into each nose at 1.2 L for infection.
  • Poly (I: C) 10 g and 1 ⁇ g only, vaccine only, and no treatment were included.
  • nasal washes and serum were collected, IgA in nasal washes and IgG in serum were measured by ELISA, and virus titers in nasal washes were measured by plaque assay using MDCK cells.
  • mice immunized intranasally in a similar manner lethal dose of 40LD (10 4 ⁇ ⁇ 5 ° (50%
  • the amount of IgA induced in the nasal mucosa was dependent on the amount of Poly (I: C), and as the amount of Poly (I: C) was increased, the adjuvant effect was recognized.
  • mice died within a week (5-5) and The virus titer of the lung 3 days after infection was 10 6 pfu or more.
  • Vaccine Ether-treated hantavirus vaginal vaccine; formalin-inactivated whole virus particle vaginal vaccine (Inactivated wnole particle vaccine)
  • NC vaccine NC vaccine (mean) (mean) ( ⁇ . ⁇ ⁇ g) (0.1 ⁇ g) ( ⁇ . ⁇ ⁇ g) 0.1 ⁇ g) (2 () Ether-treated HA Ether-treated HA 1.4 3.1 Ether treatment HA Poly (l: C) Ether treatment HA Poly (l: C) 1.9 4.2 Whole virus particles Whole virus particles 5.0 5.3 Whole virus particles Poly (l: C) Whole virus particles Poly (l: C) 7.8 6.2 1-tel treated HA CTB * Ether-treated HA CTB * 7.1 6.9 Anti-NA Pile- NA Primary vaccine (0 week) Secondary vaccine (3 week) NW-IgA Serum-IgA
  • NC vaccine NC vaccine (average) (average)
  • Notavirus spilit—product vaccine (0.4 g) was administered intranasally to BALBZc mice (6 weeks old, female), 0.1 g of various sizes of Poly (I: C), 3 The same vaccine was administered a second time after a week.
  • Vaccine Hantavirus strain (National Institute of Infectious Diseases (Tokyo) also obtained).
  • Vaccine Hantavirus strain (National Institute of Infectious Diseases); Ether-treated inactive Vaccine vaccine Adjuvant: CTB * [contains CTB (cholera toxin B subunit), 0.1% CT (cholera toxin)] as a positive control, Ceramic powder
  • mice Six 6-week-old BalbZc female mice were used in each group. Inoculate 3 ⁇ g of the vaccine with 10 ⁇ g and 100 ⁇ g of ceramicized oyster powder as adjuvant and inject 5 ⁇ L of each nose, and after 3 weeks and 5 weeks, apply the same amount of vaccine to the same adjuvant. Two weeks later, I was inoculated with lOOpfu hantavirus one by one nose.
  • CTB * [contains CTB (cholera toxin B subunit), 0.1% CT (cholera toxin)], and 3 g vaccine only, and no treatment I kept a group.
  • nasal lavage fluid and serum are collected, IgA antibody in nasal lavage fluid and IgG antibody in serum are used for ELISA, and virus titer in nasal lavage fluid is determined by plaque assay using MDCK cells. Measured with
  • mice nasally immunized mice were infected with 20 ⁇ L of a 40LD lethal dose of virus.
  • the class of IgG antibodies in the induced serum is IgG antibodies compared to IgG antibodies.
  • Example 5 Infection experiment using newborn mice (suckling mice) Infection experiment using a newborn mouse (suckling mouse) was conducted as a mouse for infection experiment. By nasal administration, antigen (nontavirus) and Poly (I: C) as an adjuvant were administered to the newborn mouse. The antibody titer was measured.
  • antigen nonavirus
  • Poly I: C
  • the IgA antibody titer in 1 mL of mouse nasal washing at that time was about 200 ngZmL, and the IgG antibody titer in serum was 3 to 4 ⁇ gZmL.
  • the present invention can be applied to mucosal vaccines of other pathogens, and its medical contribution is great.

Abstract

　ハンタウイルスを始めとするフラビウイルスに特異的な分泌型ＩｇＡ及びＩｇＧ抗体の産生を誘導させる経鼻用ワクチンを提供すること、及び、当該分泌型ＩｇＡ及びＩｇＧ抗体を誘導させることによりフラビウイルスによる感染を防御する方法を提供するものであり、フラビウイルス由来の不活化抗原、及びアジュバントとしてＰｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）またはセラミック化ホッキ貝粉末からなるワクチンを経鼻投与することを特徴とする、良好な鼻粘膜上でのＩｇＡ抗体の分泌と、血清中でのＩｇＧ抗体応答を得ることを特徴とする経鼻用ワクチンであり、また、フラビウイルスの不活化抗原と共にアジュバントとしてＰｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）またはセラミック化ホッキ貝粉末を吸器粘膜に投与することを特徴とするフラビウイルス特異的ＩｇＡ及びＩｇＧ抗体を誘導させる方法である。

Description

明 細 書
分泌型 IgA及び IgG抗体誘導剤
技術分野
[0001] 本発明は、フラビウィルス (Flavivirus)の不活化抗原であるワクチンと共にアジュバ ントを経鼻投与することにより、フラビウィルスに特異的な分泌型 IgA及び IgG抗体の 産生を誘導させる方法に関する。また本発明は、経鼻投与することにより、当該分泌 型 IgA及び IgG抗体の産生を誘導させ、それによりフラビウィルス力ゝらの感染を防御 する方法、さらには分泌型 IgA及び IgG抗体誘導剤に関する。
背景技術
[0002] 最近フラビウィルス (Flavivirus)による感染症が問題視されてきて 、る。フラビウィル スのなかでも、ウェストナイルウィルス、デングウィルス、 日本脳炎ウィルス、黄熱ウイ ルス、ダニ媒介性脳炎ウィルス、 C型肝炎ウィルス等による感染症は、世界的に大き な問題となっている。
またそれに加えて最近、フラビウィルスの一種であるハンタウィルスによる感染症も 大きく問題視される様になつてきた。ところで、ハンタウィルスによる感染症が日本に おいて注目されたのは、 1970年代半ばから、各地の医学系動物実験施設において ラットの取り扱い者の間に原因不明熱の患者が相次いで発生した時である。その当 時は原因が不明であり、 1984年まで発生が相次ぎ、合計 127症例が報告され、その うち 1例の死亡例があった。
[0003] また、先の大戦前に、中国と旧ソ連邦の国境を流れるアムール川の流域で流行が あり、また旧日本軍が中国東北部（旧満州）に進駐した際に不明熱に遭遇し、「流行 性出血熱」として報告された。その後、朝鮮戦争の時に国連軍のあいだに約 3, 200 例の不明熱が報告され、大いに注目された。韓国の高麗大学の李教授等が、感染 症が大流行をきたした流行地のァカネズミ (Apodemus)力 病因ウィルスを初めて分 離し、ァカネズミを捕獲した場所の j 11 (Hantaan river：ハンタン〗 11：漠灘江)の名をとつ てハンタン（Hantann)ウィルスと命名した。
[0004] 上記したこれらの疾病は、いずれもフラビウィルス属のハンタンウィルスの仲間に起 因するものであり、 1982年に世界保健機構 (WHO)は、 日本において本症に関する 研究集会を開催し、以降分離された類似ウィルスをノ、ンタンウィルスの名の下に、ブ ニヤウィルス科の 5番目の新し!/、属としてハンタ（Hanta)ウィルス属として命名し、ノヽ ンタウィルス (Hanta virus)と総称することとし、本症を腎症候性出血熱（Hemorrhagic Fever with Renal Syndrome : HFRS)と呼称することと決定した。
[0005] ハンタウィルス感染症は、ネズミを自然宿主とするハンタウィルスによる人獣共通感 染症であり、該ウィルスはネズミの糞、尿中に排出され、多くは、新鮮な糞または乾燥 した糞、尿中力もエアロゾルとしてウィルスを吸い込むことにより感染する力 ネズミの 咬傷でも感染するとされている。さらに、ネズミに触れたものを介して鼻、 目又は口に 触れることで感染すると考えられて 、る。
[0006] HFRSを起こすハンタウィルスは、ユーラシア大陸に広く分布しており、主要なもの は、朝鮮半島、中国の北部から中央部及び極東ロシアにみられるセスジァカネズミ（ Apodemus agrarius)を宿主とするハンタンウィルスである。中国ではおよそ年間数万 人、ロシアでは数千人、韓国では数百人規模での患者が報告されており、広く世界 的に分布しているドブネズミ（Rattus norvegicus)に保有されているのはソウル (Seoul) ウィルスであり、 日本では 1984年の医学系動物実験施設感染患者の後は発生の報 告はないが、我が国の港湾地域に生息するドブネズミは、今日においても当該ウィル スを保有して 、ることから、今後この患者の発生に注意する必要がある。
[0007] 一方、 1993年に米国南西部で、肺水腫を伴う急性の呼吸困難による死亡がナパ ホインディアンのあいだ複数報告された。 HFRSと異なり腎症候を伴わず、急性の呼 吸器症状を示し、約 50%が死亡したが、病因ウィルスはハンタウィルスであった。こ のハンタウィルス肺症候群（Hantavirus pulmonary Syndrome： HPS)は、北米のみなら ず、 1995年には南米においてもハンタウィルスによる感染症の発症の報告がなされ ている。
[0008] HFRSや、北米あるいは南米の HPS等のハンタウィルス感染症では、ヒトからヒトへの 感染は起こらないと考えられている。ところが、 1996年 9月の南アルゼンチンで報告 されたケースでは、住民及び訪問者 18例と、患者に関わったが、当地を訪れていな い 2例の HPSが発生し、致死率は 50%であった。患者にはネズミとの接触が考えられ ず、ヒトからヒトへの感染が起こった例であり、ウィルス学的証拠も示され、重大な問題 となったが、その後は終息し、再発生は起こっていない。
[0009] し力しながら、世界的にドブネズミ等が生活の場に蔓延して 、る今日では、ネズミの 糞を介在して空気感染する HFRSや HPS等のハンタウィルス感染症が何時発生しても お力しくない状況にあり、事実上記したように、中国、極東ロシア、韓国では毎年その 発生が報告されており、このハンタウィルスによる感染に対するワクチンの開発が強く 望まれて 、るのが現状である。
特に、毎年の発生件数が数多く報告されている中国、極東ロシア、韓国等において は、力かる感染症に対するワクチンの提供は急務であると!/、える。
[0010] ところで、空気感染によるインフルエンザ等の呼吸器感染症の防御には、粘膜より 分泌される特異的 IgA抗体が非常に有効であることが知られて ヽる。特に型の異なる ウィルスに対する交叉防御は、粘膜で分泌される IgA抗体が主に担っており、インフ ルェンザウィルスに自然罹患した後に回復したヒトには、この IgA抗体が誘導されて おり、同亜型の変異型ウィルスの流行に対しても感染防御ができているとされている
[0011] 一方、未感染の個体におけるウィルスまたは病原菌からの感染を防御する方法とし て、ウィルスまたは病原菌由来の不活ィ匕抗原であるワクチンを接種し、意図的に抗体 を誘導させる方法があり、そのようなものとしてインフルエンザワクチン、コレラワクチン 、チフスワクチン、種痘ワクチン、 BCGワクチン等などが知られている。
[0012] そのなかでもインフルエンザ、重症急性呼吸器感染症候群（SARS)等の呼吸器疾 患は、呼吸器官からの感染によるものであり、したがってそのワクチンの投与により呼 吸器粘膜での免疫応答が求められている。し力しながら、現在用いられている皮下 注射によるワクチンでは、粘膜免疫応答が得られず、交叉防御能を有する、より効果 的なワクチンの開発が求められているのが現状である。特に、呼吸器粘膜における 分泌型 IgA抗体の誘導方法として、鼻腔投与 (経鼻投与）による鼻粘膜へ抗原を接 種する方法があるが、抗原の接種のみでは十分な抗体応答がみられず、より効果的 な免疫応答発現のためには、ワクチンと同時に投与するアジュバントが必要となる。
[0013] 力かる観点に立脚して HFRSや HPSのハンタウィルスをはじめとするフラビウィルス 感染症を考察すると、基本的には力かるウィルスによる感染は、インフルエンザウィル スと同様に呼吸器感染症として捉えることができる。
したがって、呼吸器粘膜上における分泌型 IgA抗体の産生を誘導し、血清中での I gG抗体応答が得られれば、効果的なハンタウィルスをはじめとするフラビウィルス感 染症の予防となり得ることとなる。
[0014] そのためには、当該ウィルスの不活性抗原を粘膜投与、特に経鼻投与してやれば よいが、これらウィルスの不活性抗原のワクチン効果をより完全なものとするには、ヮ クチンに対するアジュバント作用を有する物質を同時に投与することが必要である。 これまで、そのようなワクチンに対するアジュバント作用を有する物質が種々提案さ れてきており、例えば、最近では、イノシン酸とシチジル酸と力 なるポリヌクレオチド コポリマーである Poly (I : C)にアジュバント作用があることが報告されている（非特許 文献 1)。
また、天然資源からのアジュバントとして、セラミック化ホツキ貝の粉末にアジュバン ト作用があることが報告されて 、る (特許文献 1)。
特許文献 1 :特願 2004— 133268
非特許文献 1 :J. Clinical Investigation, 110(8), 1175-1184 (2002)
[0015] 本発明者らはこれらの特異的なアジュバント作用を有する物質を用いて、ハンタウ ィルスをはじめとするフラビウィルスの不活性抗原を経鼻投与することを検討し、効果 的に粘膜上での IgA抗体分泌と、血清中における IgG抗体応答が得られ、さらに致 死量のハンタウィルスをはじめとするフラビウィルスに対する感染防御効果が認めら れることを確認し、本発明を完成させるに至った。
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0016] したがって、本発明は、 Poly (I : C)並びにセラミック化ホツキ貝粉末をアジュバントと して利用した、ハンタウィルスをはじめとするフラビウィルスに特異的な分泌型 IgA及 び IgG抗体の産生を誘導させる経鼻用ワクチンを提供することを課題とする。また、本 発明は、別の態様として、当該分泌型 IgA及び IgG抗体を誘導させることによりフラビ ウィルスによる感染を防御する方法を提供することを課題とする。 課題を解決するための手段
[0017] 力かる課題を解決するための本発明は、その一態様として、具体的には、フラピウ ィルス由来の不活化抗原、およびアジュバントとして Poly (I： C)またはセラミック化ホ ツキ貝粉末力もなるワクチンを経鼻投与することを特徴とする、良好な鼻粘膜上での I gA抗体の分泌と、血清中での IgG抗体応答を得ることを特徴とする経鼻用ワクチン である。
[0018] さらに本発明は、別の態様として、具体的には、フラビウィルスの不活ィ匕抗原と共に アジュバントとして Poly (I： C)またはセラミック化ホツキ貝粉末を投与することを特徴と するフラビウィルス特異的 IgA及び IgG抗体を誘導させる方法であり、より具体的には 、吸器粘膜に投与することを特徴とする分泌型 IgA及び IgG抗体誘導させる方法で ある。
発明の効果
[0019] 本発明が提供するハンタウィルスをはじめとするフラビウィルス由来の不活化抗原、 およびアジュバントとして Poly (I： C)またはセラミック化ホツキ貝粉末力もなるワクチン を経鼻投与することにより、フラビウィルスに特異的な呼吸器粘膜組織における分泌 型 IgA及び IgG抗体の産生が誘導される。
分泌型 IgA及び IgG抗体は、外分泌液中の主要な免疫グロブリンであり、粘膜表面 の感染防御に役立っている病原菌特異的 IgA及び IgG抗体であって、唾液、鼻汁、 腸、気管などの分泌液中、あるいは初乳中に多くみられ、また血清中にも存在する。 したがって、本発明が提供するワクチンを投与することによりこの IgA及び IgG抗体の 産生が効果的に誘導され、フラビウィルスによる感染を防御するものである。
発明を実施するための最良の形態
[0020] 本発明が提供する分泌型 IgA及び IgG抗体誘導剤において、ワクチンのアジュバ ントとして使用される Poly (I : C)は、 Toll様レセプター（Toll— like receptor :TLR) のリガンドである 2本鎖 RNAであり、自然免疫系を刺激する TLRのリガンドとして、病 原菌あるいはウィルス等の微生物の攻撃に対する防御免疫獲得能を発揮する。 事実、 Poly(I : C)を含む TLRのリガンドである 2本鎖 RNA力 アジュバントとしてヮ クチンと共に投与された場合には、そのワクチン能を増強させるのではなぐ二本鎖 R NAである Poly(I : C)自体が、種々の病原菌あるいはウィルス等の病原体の攻撃に 対する防御免疫能を増強せしめ、特にウィルスまたは病原菌特異的 IgA抗体及び Ig G抗体を誘導させることによって病原体による感染を防御する。
[0021] 本発明で使用する二本鎖 RNAである Poly (I : C)は、その分子の大きさとしては、 その塩基対 (bp)として低〜高サイズの種々のものを用いることが可能である力 免疫 応答に対してより優れた応答を発揮するものは、 300bp以上の分子サイズを有するこ とが必要であることが判明した。そのような分子サイズを有するものとして、例えば、 1 00〜： LOOObpの Poly(I : C)は、東レ株式会社力も容易に入手することができる。
[0022] 一方、本発明が提供する分泌型 IgA及び IgG抗体誘導剤にぉ ヽて、ワクチンのァ ジュバントとして使用されるセラミック化ホツキ貝粉末は、ホツキ貝を焼成して得た粉末 であり、多孔質の微粉末である。この溶解液には、除菌作用あるいは殺菌作用を有し 、また微量有害物質、例えば残留農薬等の除去効果があるとされており、セラミック化 ホツキ貝粉末自体は、すでに製品として市販されて ヽるものである。
[0023] 本発明で使用するアジュバントとしての力かるセラミック化ホツキ貝粉末は、その電 子顕微鏡写真を観察すると、多孔質性の微粉末であり、 10〜： LOO /z m程度の不定 形の構造物よりなるものである。したがって、その多孔質性によりワクチンのキャリアと して、抗原提示細胞の活性化に作用する。
[0024] 一方、本発明が提供する分泌型 IgA及び IgG抗体誘導剤により、アジュバントとして の Poly (I： C)或いはセラミック化ホツキ貝粉末と共に投与されるワクチンとしては、身 体中に接種されて、活性な免疫を生成する、通常感染性因子または感染因子のある 部分を含む抗原性懸濁液または溶液である。ワクチンを構成する抗原性部分は、一 般的には微生物 (例えば、ウィルスまたは細菌など)または微生物力も精製された天 然の産生物、合成生成物または遺伝子操作したタンパク質、ペプチド、多糖または 同様な産生物であってもよ 、。
[0025] 本発明においては、生ワクチン或いは不活ィ匕ワクチンとしては、具体的には、フラビ ウィルス感染症の生ワクチンをあげることができる。
また、本発明にいう不活ィ匕抗原とは、感染能を失わせた抗原をいい、完全ウィルス 粒子であるビリオン、不完全ウィルス粒子、ビリオン構成粒子、その翻訳後修飾体、ビ リオン非構成タンパク質、その翻訳後修飾体、感染防御抗原、中和反応のェピトープ などを挙げられることができる。不活ィ匕は、例えば、物理的（例えば、 X線照射、熱、 超音波）、化学的（ホルマリン、水銀、アルコール、塩素）などの操作により行うことが できる。
[0026] 本発明が提供する分泌型 IgA及び IgG抗体誘導剤の投与は、粘膜投与の形態に より行うのが好ましい。脊椎動物における粘膜には、消化器、呼吸器、排出器、生殖 器などの特に外通性の中腔器官の内壁が含まれる。したがって、本発明の好ましい 投与形態である粘膜投与としては、例えば、鼻腔投与 (経鼻投与)、口腔投与、膣内 投与、上気道投与、肺胞投与などをあげることができる。そのなかでも鼻腔内粘膜投 与が好ましい。鼻腔は特に、ハンタウィルスをはじめとするフラビウィルスによる呼吸 器感染症疾患の感染経路の門戸であることから、粘膜投与により分泌型 IgA抗体反 応を引き起こし、粘膜上皮細胞中に分泌型 IgA抗体を産生させること、及び血清中 に IgG抗体を産生させることは、呼吸器感染症の防御に結びつくものである。
[0027] したがって、本発明の目的である分泌型 IgA及び IgG抗体の産生が誘導され、免 疫防御を発揮する対象としての病原体は、宿主に対して疾患または障害を発生し得 る微生物であり、具体的には、ウェストナイルウィルス、ハンタウィルス、デングウィル ス、 日本脳炎ウィルス、黄熱ウィルス、ダニ媒介性脳炎ウィルス、 C型肝炎ウィルス等 のフラビゥイノレスである。
[0028] 本発明が提供する分泌型 IgA抗体及び IgG誘導剤の投与量は、投与する対象者 の年齢、体重、投与方法により一概に限定し得ないが、通常成人 1日当たり、経口投 与の場合には、 10〜500mg程度であり、また粘膜投与、特に経鼻投与の場合には 、 0. 1〜： LOmg、好ましくは、 0. 1〜： Lmg程度である。
実施例
[0029] 以下に本発明を、具体的実施例により、さらに詳細に説明する。
[0030] m ι 合成ニ 鎖 RN Aである ρ0ιν (τ： οの ig A、 ^c ^
合成二本鎖 RNAとして Poly (I： C)をアジュバントとして用いて、不活化抗原として 不活ィ匕ウィルスまたはサブユニット抗原の中和抗体惹起能、ひ 、ては抗病原体効果 を確認した。 (材料）
マウス： BALBZcマウス（6週齢、雌性）
ウィルス：ハンタウィルス株（国立感染症研究所 (東京)力も入手した)。
ワクチン：ハンタウィルス株（国立感染症研究所）；エーテル処理不活ィ匕ワクチン アジュバント：ポジティブコントロールとして CTB * [CTB (コレラ毒素 Bサブユニット） 、0. 1%CT (コレラ毒素）を含む]、 Poly(I : C)
[0031] (方法）
6週齢の BALBZcマウス（日本 SLC (株）、東京）各群 5匹ずつ用いた。ハンタウィ ルス株ワクチン 1 μ gを、それぞれのアジュバントとして Poly (I : C)、0. 1 g、 1 g、 3 /z g、 10 gと共にマウスの鼻に 5 Lを接種し、その 3週間後同量のワクチンを、ァ ジュバントなし、もしくはアジュバント有りのものとして経鼻接種し、さらに 2週間後に 1 OOpfuのハンタウィルスを片鼻に 1. 2 Lずつ接種し感染を行った。
コントロールとして Poly (I： C) 10 gおよび 1 μ gのみ、ワクチンのみ、処置なしの群 をおいた。
感染 3日後に、鼻腔洗浄液、血清を回収し、鼻腔洗浄液中の IgAおよび血清中の I gGを ELISA法により、また、鼻腔洗浄液中のウィルス価を、 MDCK細胞を用いたプ ラークアツセィで測定した。
[0032] 同様の方法で経鼻免疫したマウスに、 40LD の致死量（104· ΙΟ5° (50%の発
50
育鶏卵において免疫性を示すウィルス量の約 10000倍量）のハンタウィルスを 20 μ
L感染させ、その生存を観察した。
[0033] また、 Poly (I : C)の中枢神経系への安全性を調べるため、 0. 25 g、 2. 5 g、 2
5 μ gの Poly (I： C)を 25 μ Lの PBSに溶解し、二段針を用いて脳内接種を行った。 接種後の体重の変化を測定し、また生存を観察した。
なお、対照群として 2. 5 g、 10 g、 25 gの CTB * (CTB, 0. 1%CTを含む） を同様に 25 μ Lの PBSに溶解した溶液を脳内に接種した群をおいた。
[0034] (結果）
(1) Poly (I： C)をアジュバントに用いた経鼻ハンタウィルスワクチンによる抗体誘導と 感染防御について Poly (I:C)の粘膜アジュバント能を評価した。 6週間前に 1 μ gのワクチンを 0.1 g 〜 10 gに量を振った Poly (I:C)と共に経鼻接種し、さらに 2週間前に同量のヮクチ ンを、ワクチンのみまたはアジュバントと共に経鼻接種した。経鼻粘膜での IgA抗体 応答と、血中 IgG応答を表 1にまとめた。
[表 1]
Figure imgf000010_0001
[0036] Poly (I:C)の用量依存性のアジュバント効果をみるために、 Poly (I:C)の量は 0.
1 μ gから 10 gまで段階的に増やし、そのアジュバント作用をみた。
その結果、表 1に示した結果力 も判明するように、鼻腔粘膜に IgAの応答のため には、最低で 0.： L gの Poly (I:C)を初回免疫時に使用すると応答が認められること が半 lj明した。
[0037] 鼻腔粘膜に誘導される IgAの量は、 Poly (I:C)の量に依存的であり、 Poly(I:C)の 量を増やせば増やすほどそのアジュバント効果が認められた。
2回の免疫ともに、 Poly (I:C)を用いると、 Poly(I:C): gの量で鼻腔洗浄液中に lOOngZmL以上の IgAの分泌がみられ、初回のみの免疫の場合には 3 μ gの Poly (I： C)添加で、 lOOngZmL以上の特異的 IgA抗体の誘導が認められた。
血清中の IgGの産生も同時に検討した力 その産生は、 IgAの分泌に相関するもの であり、： gのワクチンを Poly (I:C)と共に 4週間間隔で 2回免疫すると、 1.6 μ g/ mLの血中 IgGが得られた。
[0038] また、同様の免疫条件で 2回目の免疫の 2週間後に lOOpfuのハンタウィルスを、片 鼻 1. 2 Lずつ感染を行った場合には、ワクチンを接種しないコントロール群では、 鼻腔洗浄液中に 102pfu,mL以上のウィルス価に、ウィルス増殖が認められた。 これに対し、 Poly (I : C)を併用して経鼻ワクチン接種を 2回行った群では、完全に ウィルス増殖が抑制されており、また、ワクチン単独で 1 μ g以上を 2回免疫した群、な らびに 3 μ g以上の Poly (I : C)を初回免疫時のみ使用した群では、全くウィルス抑制 効果は認められな力つた。
[0039] また、 1 g、 0. 1 gの Poly (I : C)を初回のみ併用接種した群においても、 10。· ¾ iu/m 101· 6pfuZmLと、顕著なウィルスの増殖抑制が認められた。なお、ヮクチ ンのみの 2回投与群では、ウィルスの増殖抑制は全く認められな力つた。
これらの結果をまとめて表 2に示した。
[0040] [表 2]
Figure imgf000011_0001
水： pく 0. 001
(2) Poly (I： C)の併用経鼻ワクチン接種による致死量のハンタウィルス感染による肺 炎の防御効果について
6週間前に 1 μ gのワクチンと Poly(I : C)を 10 g、 3 gおよび 1 μ g併用して経鼻 接種し、 2週間前にワクチンのみで追加免疫し、 40LD のハンタウィルス 20 μ Lを感
50
染させ、肺炎の防御能を調べた。
ワクチンを接種しない群では、マウスは 1週間以内に前例（5Ζ5)が死亡し、ウィル ス感染 3日後の肺のウィルス価も 106pfu以上であった。
これに対してワクチン接種群では、 1 μ g以上の Poly (I： C)を併用接種することで、 全マウスは生存していた。この結果を表 3に示す。
[表 3]
Figure imgf000012_0001
[0043] 以上の事実から、 Poly (l : C)は、感染防御に十分な分泌型 IgA抗体を産生してお り、粘膜 IgA抗体応答を引き出すことが判明した。
[0044] ¾施例 2：不活化ウィルス粒早 Polv (T： C) W并用する終息ハンタウィルスワクチン して fflいた のチ方 カ
(材料）
ワクチン：エーテル処理ハンタウィルス ΗΑワクチン；ホルマリン不活化全ウィルス粒 Ν しワクチン (Inactivated wnole particle vaccine)
マウス： BALBZcマウス（6週齢、雌性）
(方法）
ハンタウィルスのホルマリン不活化全ウィルス粒子 NCワクチン（Inactivated whole p article vaccine) 0. 1 μ gを、 Poly (I : C) [ 100— lOOObp :東レ] 0. 1 gと、併用経鼻 ハンタウィルスワクチンのワクチン成分としてマウス： BALBZcマウス（6週齢、雌性） に投与し、 3週間後に同じワクチンを 2回目投与した。
その 1週間後にマウスの鼻洗浄液と血清中の抗体応答を、それぞれ粘膜および全 身の防御免疫の指標として測定した。
[0045] (結果）
それらの結果を表 4に示した。
[0046] [表 4] 抗 -HA 杭- HA 一次ワ クチン （0週目） 二次ワ クチン （3週目） NW-IgA 血清- IgA
NC ワクチン NC ワクチン (平均値） (平均値） (Ο.ΐ μ g) (0.1 ^ g) (Ο.ΐ μ g) 0.1 ^ g) (2 ( ) ェ一テル処理 HA ェ一テル処理 HA 1.4 3.1 エーテル処理 HA Poly(l:C) エーテル処理 HA Poly(l:C) 1.9 4.2 全ウィルス粒子 全ウィルス粒子 5.0 5.3 全ウィルス粒子 Poly(l:C) 全ウィルス粒子 Poly(l:C) 7.8 6.2 ェ一テル処理 HA CTB* ェ一テル処理 HA CTB* 7.1 6.9 抗 -NA 杭- NA 一次ワ クチン （0週目） 二次ワ クチン (3週目） NW-IgA 血清- IgA
NC ワクチン NC ワクチン (平均値） (平均値）
(0.1 μ g) ( Λ g) (。■ g) o. g) (2 ( ) ェ一テル処理 HA ェ一テル処理 HA 1.1 0.9 エーテル処理 HA Poly(l:C) エーテル処理 HA Poly(l:C) 1.5 2.9 全ウィルス粒子 全ウィルス粒子 3.5 3.7 全ウィルス粒子 Poly(i:C) 全ウィルス粒子 Poly(i:C) 5.4 5.4 ェ一テル処理 HA CTB* ェ一テル処理 HA 6.2 6.2
[0047] 表中の結果力 判明するように、不活ィ匕全ウィルス粒子を Poly (I:C)併用ハンタウ ィルスワクチンのワクチン成分として用いたときも、粘膜の防御免疫および全身の防 御免疫が高められていた。
し力も、ワクチンと Poly (I:C)とをそれぞれ 0. 1 μ gで用いたときであっても、 spilit -product vaccineを CTB *と併用して安全なウィルス感染阻止が予測されるアジ ュバント活性の陽性対照群と同等の応答を示した。
さらにこれらの応答は、 spilit— product vaccineを Poly (I:C)と共に用いた場合 よりも高力つた。
以上の事実から、 spilit— product vaccineのみならず、他の形態のワクチンを使 用した場合でも、 Poly (I： C)併用経鼻ワクチンの有用性が確認された。
[0048] 実施例 3： Polv (I： C)の分子の大きさの確認
(材料）
ウイノレス：ハンタウイノレス
Poly(l:C):
サイズ (L)： l〜300bp (Fluka)
サイズ（M) :100〜1000bp (東レ）
サイズ (H)： > 3. 3 X 106bp (Fluka) Poly(A:U)
マウス： BALBZcマウス（6週齢、雌性）
(方法）
ノヽンタウィルスの spilit— product vaccine (0. 4 g)を、種々の大きさの Poly (I : C)の 0. 1 gと、 BALBZcマウス（6週齢、雌性）に経鼻投与し、 3週間後に同じワク チンを 2回目投与した。
その 1週間後にマウスの鼻洗浄液と血清中の HAと NAに対する抗体応答を、それ ぞれ粘膜および全身の防御免疫の指標として測定した。
[0049] (結果）
その結果を表 7に示した。
[0050] [表 5]
Figure imgf000014_0001
[0051] 表中に示した結果力も判明するように、 Poly(I : C)の分子の大きさが 10〜300bp を用いた実験群では、他の群よりも低い粘膜応答が認められた。したがって、アジュ バントとして有用な Poly (I： C)の分子の大きさは、約 300bp以上と考えられた。
[0052] ¾施例 4 :アジュバン してセラミック化ホツキ目粉末 使用した、終蠱ワクチンによる 体謙 膽防御糊
1.材料
材料として、以下のものを使用した。
マウス： BALBZcマウス（6週齢、雌性） ウィルス：ハンタウィルス株（国立感染症研究所 (東京)力も入手した)。 ワクチン：ハンタウィルス株（国立感染症研究所）；エーテル処理不活ィ匕ワクチン アジュバント：ポジティブコントロールとして CTB * [CTB (コレラ毒素 Bサブユニット） 、 0. 1%CT (コレラ毒素）を含む]、セラミックス化ホツキ貝末粉末
[0053] 2.方法
6週齢の BalbZc雌性マウスを、各群 5匹ずつ用いた。ワクチン 3 μ gを、アジュバン トとしてセラミック化ホツキ貝粉末 10 μ gおよび 100 μ gと共に、それぞれの鼻に 5 μ L を接種し、 3週後および 5週後に、同量のワクチンを同様のアジュバントと共に経鼻接 種し、さらに 2週間後に lOOpfuのハンタウィルスを片鼻 1. ずつ接種し、感染を 行った。
アジュバントのポジティブコントロールとして、 CTB * [CTB (コレラ毒素 Bサブュ- ット）、 0. 1%CT (コレラ毒素）を含む]を 投与群、および 3 gのワクチンのみの 投与群、ならびに処置なしの群をおいた。
感染 3日後に鼻腔洗浄液、血清を回収し、鼻腔洗浄液中の IgA抗体および血清中 の IgG抗体を、 ELISA法を用いて、また鼻腔洗浄液中のウィルス価を、 MDCK細胞 を用いたプラークアツセィ法で測定した。
同様に、経鼻免疫したマウスに 40LD の致死量のウィルスを 20 μ L感染してその
50
生存を観察した。
[0054] 3.結果
セラミック化ホツキ貝粉末の粘膜アジュバント能の評価は、 6週間前に 3 gのヮクチ ンを、 10 g〜100 gに量を振ったセラミックス化ホツキ貝粉末と共に経鼻接種し、 更に 2週間間隔で 2回同量のワクチンを同様のアジュバントと共に経鼻接種した。経 鼻粘膜での IgA抗体応答と血中 IgG抗体応答を検討することで行った。
セラミック化ホツキ貝粉末の用量依存的なアジュバント効果をみるために、セラミック ス化ホツキ貝粉末の用量を 10 gと 100 gの 2種類とし、そのアジュバント作用を検 討した。その結果、セラミック化ホツキ貝粉末を 10 g用いた場合に鼻腔粘膜に IgA 抗体の応答が認められた。鼻腔粘膜に誘導される IgA抗体の量は、セラミック化ホッ キ貝粉末の用量に依存的であり、 100 /z gに増量すると、そのアジュバント効果がより 一層認められていた。
[0055] また、同様の免疫条件下で 3回目の免疫を行い、その 2週間後に lOOpfuの PR8ゥ ィルスを、片鼻に 1. 2 Lずつ注入し、ウィルス感染を行った。ワクチンを接種しない コントロール群では、鼻腔洗浄液中に 103pfuZmL以上のウィルス価にウィルス増殖 が認められた。しかし、セラミック化ホツキ貝粉末をアジュバントとして併用して経鼻ヮ クチン接種を 3回行った群では、完全にウィルス増殖が抑制されていた。なお、ヮクチ ンのみを単独で 3 gずつ 3回免疫した群では、全くウィルス増殖抑制効果は認めら れなかった。
以上の結果から、セラミック化ホツキ貝粉末には強力なアジュバント効果があること が確認された。
これらの結果をまとめて表 6に示した。
[0056] [表 6]
Figure imgf000016_0001
水 :p< 0. 05
[0057] また、誘導される血清中の IgG抗体のクラスは、 IgG 抗体に比較して IgG抗体が
2a 1 より一層誘導されており、 Th2型優位の免疫誘導が行われていることが示された。そ の結果を表 7に示した。
[0058] [表 7]
Figure imgf000016_0002
[0059] 実施例 5：新生マウス（suckling mouse)を用いた感染実験 感染実験用マウスとして、新生マウス (suckling mouse)を用いた感染実験を行った 経鼻投与により、新生マウスに抗原 (ノヽンタウィルス）とアジュバントとして Poly (I : C )を投与し、そのときの抗体価を測定した。
抗原 1 μ g及び Poly(I : C) 10 gを、 3週間間隔で 2回接種を行い、その 1週間後 にマウスの鼻洗浄液と血清中の抗体応答を測定した。
そのときのマウス鼻洗浄液 lmL中の IgA抗体価は 200ngZmL程度であり、血清中 の IgG抗体価は 3〜4 μ gZmLであった。
また、抗原 1 μ g及び Poly(I : C) 3 gを、 3週間間隔で 2回接種を行い、その 1週 間後にマウスの鼻洗浄液と血清中の抗体応答を測定したときのマウス鼻洗浄液 lmL 中の IgA抗体価は lOOngZmL程度であり、血清中の IgG抗体価は 2〜3 gZmL であった。
産業上の利用可能性
以上説明したように、フラビウィルス (Flavivirus)の不活ィ匕抗原であるワクチンと共に アジュバントとして Poly (I： C)或いはセラミック化ホツキ貝粉末を経鼻投与することに より、フラビウィルスに特異的な分泌型 IgA及び IgG抗体の産生を誘導させ、ウィルス または病原体による感染を防御し得る。
今日、ワクチンのアジュバントとして効果的なアジュバントが無い現状では、本発明 は他の病原体の粘膜ワクチンへの応用しうるものであり、その医療上の貢献度は多 大なものである。

Claims

請求の範囲
[1] フラビウィルス由来の不活ィ匕抗原、およびアジュバントとして Poly (I : C)或いはセラ ミック化ホツキ貝粉末からなることを特徴とする分泌型 IgA及び IgG抗体誘導剤。
[2] 呼吸器粘膜に投与することを特徴とする請求項 1に記載の分泌型 IgA及び IgG抗 体誘導剤。
[3] フラビウィルスがウェストナイルウィルス、ハンタウィルス、デングウィルス、日本脳炎 ウィルス、黄熱ウィルス、ダニ媒介性脳炎ウィルスまたは C型肝炎ウィルスである請求 項 1または 2に記載の分泌型 IgA及び IgG抗体誘導剤。
[4] ウィルス由来の不活ィ匕抗原と共にアジュバントとして Poly (I： C)或いはセラミツクイ匕 ホツキ貝粉末を投与することを特徴とするウィルス特異的 IgA及び IgG抗体を誘導さ せる方法。
[5] 呼吸器粘膜に投与することを特徴とする請求項 4に記載の分泌型 IgA及び IgG抗 体誘導させる方法。
[6] ウィルスがウェストナイルウィルス、ハンタウィルス、デングウィルス、日本脳炎ウィル ス、黄熱ウィルス、ダニ媒介性脳炎ウィルスまたは C型肝炎ウィルスである請求項 4ま たは 5に記載のウィルス特異的 IgA及び IgG抗体を誘導させる方法。
[7] Poly (I： C)或いはセラミック化ホツキ貝粉末力もなることを特徴とするフラビウィルス 由来の不活化抗原に対するアジュバント作用物質。
[8] ウィルスがウェストナイルウィルス、ハンタウィルス、デングウィルス、日本脳炎ウィル ス、黄熱ウィルス、ダニ媒介性脳炎ウィルスまたは C型肝炎ウィルスである請求項 7に 記載のアジュバント作用物質。
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