WO2007026829A1

WO2007026829A1 - 小粒子低比重リポ蛋白の定量方法および定量キット

Info

Publication number: WO2007026829A1
Application number: PCT/JP2006/317243
Authority: WO
Inventors: Yasuki Itoh
Original assignee: Denka Seiken Co., Ltd.
Priority date: 2005-08-31
Filing date: 2006-08-31
Publication date: 2007-03-08
Also published as: JPWO2007026829A1; JP5548733B2; EP1930442A1; JP5042023B2; JP2012165761A; EP1930442B1; US20090263844A1; DE602006018035D1; US8697378B2; EP1930442A4

Abstract

　検体の前処理操作をすることなしに、迅速かつ簡便な自動分析装置対応のsmall,dense LDLの分別測定ができる方法の提供。被検体試料にポリオキシエチレン－ポリオキシプロピレン共重合体またはその誘導体の存在下にコレステロール測定用酵素を添加し、ポリオキシエチレン－ポリオキシプロピレン共重合体またはその誘導体をリポ蛋白質のうちsmall,dense LDLに選択的に作用させ、生成したコレステロール量を測定することを特徴とするsmall,dense LDLコレステロールの定量方法。

Description

明細書

小粒子低比重リポ蛋白の定量方法および定量キット

技術分野

[0001] 本発明は、動脈硬化の診断に重要な small,dense LDL中のコレステロール測定方法と測定試薬に関する。

背景技術

[0002] 低密度リポ蛋白（LDL)は血液中におけるコレステロール運搬の主役であり、動脈硬化性疾患の危険因子であるが、 LDLの中でも特に粒子サイズが小さく平均的な LDL より高比重な、 small.dense LDLは動脈硬化惹起性が通常の LDLより数倍高くなることが知られている。 small.dense LDLの増加は動脈硬化性疾患の主要な危険因子の 1 つであり、分別測定することは臨床上極めて重要である。

[0003] 従来の small,dense LDL測定法は、超遠心法、電気泳動法、高速液体クロマトダラフィーを用いる方法などがあるが、この方法は高価な設備を必要とし、測定に非常に時間を要するため簡便ではな、。

[0004] 自動分析装置を用いて small,dense LDLを測定する方法としては、イオン強度の差により小粒子 LDLを混濁または溶解させ吸光度の差により小粒子 LDLを測定する方法 (特開 2003-28882号公報）がある。しかし、この方法では濁りによる吸光度差を測定しているため、特異性や精度が不十分であった。

[0005] また、 small,dense LDL中のコレステロールや中性脂肪を、ポリア-オンと二価陽ィオンからなる分離剤と自動分析装置対応の試薬の組み合わせて測定する方法 (WO 2004/053500)が知られている。この方法では、超遠心法や電気泳動法に比べ簡便に _Small,d_ense LDL中の脂質成分が測定でき、特異性や精度に優れている力検体を前処理し LDLを small,dense LDLとそれ以外の LDLに分離する操作が必要であった特許文献 1：特開 2003-28882号公報

特許文献 2： WO2004/053500号公報

発明の開示発明が解決しょうとする課題

[0006] 本発明の目的は、検体の前処理操作をすることなしに、迅速かつ簡便な自動分析装置対応の small,dense LDLの分別測定法を提供することである。

課題を解決するための手段

[0007] 本発明者らは種々のリポ蛋白を含有する被検体試料中のコレステロールをコレステロールエステラーゼならびにコレステロールォキシダーゼもしくはコレステロールデヒドロゲナーゼにて測定する際、あら力じめ _small,dense LDLとそれ以外の LDLに対する反応性が異なる界面活性剤を作用させることにより small,dense LDL中のコレステロールを選択的に測定することを検討し、ポリオキシエチレン—ポリオキシプロピレン共重合体またはその誘導体力 mall,dense LDLに選択的に作用し、 small,dense LDL中のコレステロールを測定できることを見いだし、本発明を完成するに至った。

[0008] すなわち、本発明は以下の方法およびキットを提供する。

[0009] (1) 被検体試料にポリオキシエチレンポリオキシプロピレン共重合体またはその誘導体の存在下にコレステロール測定用酵素を添加し、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレン共重合体またはその誘導体をリポ蛋白質のうち small,dense LDLに選択的に作用させ、生成したコレステロール量を測定することを特徴とする small,dense LDLコレステロールの定量方法。

[0010] (2) さらに非イオン性および Zまたは陰イオン性界面活性剤を添加することを特徴とする（1)の方法。

[0011] (3) コレステロール測定用酵素がコレステロールエステラーゼならびにコレステロ一ルォキシダーゼもしくはコレステロールデヒドロゲナーゼカもなることを特徴とする（1) または（2)の方法。

[0012] (4) さらにホスホリパーゼおよび Zまたはリポプロテインリパーゼを添加することを特徴とする（1)〜（3)の、ずれかの方法。

[0013] (5) ポリオキシエチレンポリオキシプロピレン共重合体またはその誘導体をリポ蛋白質のうち small,dense LDLに選択的に作用させる前に、 small,dense LDL以外のリポ蛋白中のコレステロールを small,dense LDLコレステロール定量反応系外に導くことを特徴とする（1)〜 (4)の、ずれかの方法。 [0014] (6) 被検体試料にポリオキシエチレンポリオキシプロピレン共重合体またはその誘導体の存在下でコレステロール測定用酵素を添加し、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレン共重合体またはその誘導体をリポ蛋白質のうち small,dense LDLに選択的に作用させ、生成したコレステロール量を測定するための、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレン共重合体もしくはその誘導体ならびにコレステロール測定用酵素を含む small,dense LDLコレステロールの定量用キット。

[0015] (7) さらに非イオン性および Zまたは陰イオン性界面活性剤を含む（6)の small,den se LDLコレステロール定量用キット。

[0016] (8) コレステロール測定用酵素がコレステロールエステラーゼおよびコレステロールォキシダーゼまたはコレステロールデヒドロゲナーゼからなる（6)または（7)の small,d ense LDLコレステロール定量用キット。

[0017] (9) さらにホスホリパーゼおよび Zまたはリポプロテインリパーゼを含む（6)〜（8)の V、ずれかの small,dense LDLコレステロール定量用キット。

[0018] (10) ポリオキシエチレンポリオキシプロピレン共重合体またはその誘導体をリポ蛋白質のうち small,dense LDLに選択的に作用させる前に、 small,dense LDL以外のリポ蛋白中のコレステロールを small,dense LDLコレステロール定量反応系外に導くための試薬を含む（6)〜（9)の!、ずれかの small,dense LDLコレステロール定量用キッ

[0019] (11) 被検体試料中の small,dense LDLコレステロールを定量する方法において、被検体試料にポリオキシエチレンポリオキシプロピレン共重合体またはその誘導体の存在下にコレステロール測定用酵素を添カ卩し、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレン共重合体またはその誘導体をリポ蛋白質のうち small,dense LDLに選択的に作用させ、生成したコレステロールを測定する工程力なる方法。

[0020] (12) small, dense LDLコレステロールを含む被検体試料中の small,dense LDLコレステロールを定量するための、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレン共重合体もしくはその誘導体を含む small,dense LDLコレステロール測定用試薬。

[0021] (13) small, dense LDLコレステロールを含む被検体試料中の small,dense LDLコレステロールを定量するための、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレン共重合体の small.dense LDLコレステロール測定用試薬としての使用。

発明の効果

[0022] ポリオキシエチレンポリオキシプロピレン共重合体またはその誘導体をリポ蛋白質を含む被検体試料に添加することにより、リポ蛋白中の small,dense LDLをフィルタ一や遠心分離を用いた分離操作をすることなぐ直接、選択的に測定することができる。

[0023] 本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願 2005-252091号の明細書および Zまたは図面に記載される内容を包含する。

図面の簡単な説明

[0024] [図 1]リポプロテインリパーゼを添カ卩した場合の、 Large LDLおよび small,dense LDLに対する反応性を示す図である。

発明を実施するための最良の形態

[0025] 以下、本発明について詳細に説明する。

[0026] リポタンパク質は大きく VLDL、 LDLおよび HDLの分画に分けられ、 LDLはさらに sma ll'dense LDLとそれ以外の亜分画に分けられる。 small, dense LDLを小粒子 LDL、 SL DL(small LDL), dense LDLと呼ぶこともあり、またそれ以外の LDLを LLDL(large LDL) 、 Light LDLと呼ぶこともある。これらの分画および亜分画は、粒子サイズまたは比重により区別できる。その粒子サイズの直径は、報告者により異なるが VLDLが 30nm〜8 Onm (30nm〜75nm)で、 LDLが 22nm〜28nm(19nm〜30nm)、 HDLが直径 7〜10nmである。比重は、 VLDL力 S1.006以下、 LDL力 Sl.019〜1.063、 HDL力 1.063〜1.21である。 LDL粒子直径はグラジェントゲル電気泳動（GGE) (JAMA, 260, p.1917-21, 1988)、 N MR (HANDBOOK OF LIPOPROTEIN TESTING 2^nd Edition, Nader Rifai他編、 p.60 9-623、 AACC PRESS : TheFats of Life Summer 2002、 LVDD 15 YEAR ANNIVERSA RY ISSUE, Volume AVI No.3、 p.15- 16)により測定でき、比重は超遠心分離による分析 (Atherosclerosis, 106, p.241-253, 1994: Atherosclerosis, 83, p.59, 1990)に基づいて決定できる。

[0027] 本発明の方法で測定しょうとする small,dense LDLは、一般的には LDL画分のうち直径が約 22.0〜約 25.5nmの亜分画、比重 1.040〜1.063の亜分画を指す。 LDLを大きさにより亜分画に分けているのは、 LDLのうち粒子径が小さいものが動脈硬化惹起性が高ぐ LDLの中でもより悪性度が高いので、 LDLの中でも小さいものを分別測定する必要があった力である。 LDL内で直径分布や比重分布は連続しており、比重がどの程度以上のものが特に悪性度が高、と、うように明確に区別できるものではな、。従って、上記の比重 1.040〜1.063という値も small,dense LDLの特性として確立したものではなぐ広く用いられており確立した値といえる LDLの比重範囲 1.019〜1.063を中央点で分けたものである。例えば、別の報告では 1.044〜1.060に分画される (Athe rosclerosis: 106 241-253 1994)。 small,dense LDLの比重をどの範囲にするかは、報告者により若干の違いがある力いずれもその範囲で分別した場合の small,dense LD Lの存在が臨床的な悪性度と関連している。

[0028] 本発明にお、て、 small,dense LDLと!、う場合、 LDLのうち比重が小さ!/、ものであつて、臨床的に動脈硬化惹起性がそれ以外の LDLよりも大きいもの、好ましくは LDLの比重範囲のうち中央点より上の比重範囲に属するもの、さらに好ましくは比重 1.040〜 1.063の範囲に属する LDLをいう。

[0029] 本発明の方法は通常、自動分析装置内で行われる。本発明の方法では Large LDL コレステロールから分離、差別化して _Small,dense LDLコレステロールを測定するために、コレステロ一ノレエステラーゼ、コレステロ一ノレォキシダーゼまたはコレステロ一ノレデヒドロゲナーゼ等のコレステロール測定用酵素を small,dense LDLに選択的に作用させる界面活性剤の存在下で行う。また、コレステロール測定用酵素を small,dense L DL以外のリポ蛋白に作用するのを抑制する界面活性剤の存在下で行うこともできる。コレステロール測定用酵素を _small,dense LDLに選択的に作用させることは、見方を変えればコレステロール測定用酵素を small,dense LDL以外のリポ蛋白への作用を抑制することとも言えるので、結果的に同じことを意味し、両目的を達成する界面活性剤は同一のものを指す場合がありうる。前記界面活性剤はコレステロールエステラーゼ、コレステロ一ノレォキシダーゼまたはコレステロ一ノレデヒドロゲナーゼ等のコレステロール測定用酵素の活性を上昇させる界面活性剤と共に用いても良いし、単独で用いることでさる。

[0030] 上記 small,dense LDLに対するコレステロール測定用酵素を選択的に作用させる界面活性剤としてはポリオキシエチレンポリオキシプロピレン共重合体またはその誘導体が挙げられる。ポリオキシエチレンポリオキシプロピレン共重合体またはその誘導体は small,dense LDLに選択的に作用し、結果的にコレステロールエステラーゼならびにコレステロールォキシダーゼもしくはコレステロールデヒドロゲナーゼの small, dense LDL以外のリポ蛋白への作用を抑制する。ポリオキシエチレンポリオキシプロピレン共重合体またはその誘導体を被検体試料中の small,dense LDLに選択的に作用させることで small,dense LDL中のコレステロールが選択的に遊離し、次いでコレステロール測定用酵素を _small,dense LDL中のコレステロールに反応させる。「ポリオキシエチレンポリオキシプロピレン共重合体またはその誘導体をリポ蛋白質の中の small.dense LDLに選択的に作用させる」とは、リポ蛋白質の中の small,dense LDL中のコレステロールをポリオキシエチレンポリオキシプロピレン共重合体またはその誘導体の作用により選択的に遊離させることをいう。「small,dense LDLに選択的に作用させる」とは、リポ蛋白質の中の small,dense LDLに主に作用させること、好ましくは sm all, dense LDLのみに作用させることをいう。遊離したコレステロールにコレステロール測定用酵素を反応させることにより、コレステロールを測定することができる。

ポリオキシエチレンポリオキシプロピレン共重合体またはその誘導体としては、例えば一般式 (I)および (Π)および (ΙΠ)

RO- (C H 0) - (C H 0) - (C H 0)— H (I)

2 4 a 3 6 b 2 4 c

RO- (C H O) - (C H O) - (C H O) -H (ll)

3 6 d 2 4 e 3 6 f

[式中 a、 b、および cならびに d、 e、および fは整数を表し、 Rは水素原子または直鎖、分岐のアルキルを表す]

Η(θ2Η₄0) -(CsI-IsO)

H(C2H40) _X -(G₃H60) ,

[式中 x、 yは整数を表す]

で表される化合物が挙げられる。（I)においてポリオキシプロピレンの数 (式中の b)は 1〜200が好ましぐ 20〜150がより好ましぐ 30〜100が特に好ましい。ポリオキシェチレンの数（式中の aおよび c)はそれぞれ 1〜200が好ましぐ 1〜100がより好ましぐ 1〜 60が特に好ましい。 Rで示される直鎖または分岐のアルキル基としては炭素数 1〜30 が好ましぐ炭素数 2〜25が特に好ましい。（Π)においてポリオキシプロピレンの数（式中の e)は 20〜100が好ましぐポリオキシエチレンの数（式中の dおよび f)はそれぞれ 1〜60が好ましい。 (III)においてポリオキシプロピレンの数（式中の y)は 2〜30が好ましい。ポリオキシエチレンの数（式中の X)は 1〜50が好ましぐ 1〜30が特に好ましい

[0032] ポリオキシエチレンポリオキシプロピレン共重合体またはその誘導体の濃度としては 0.1〜10gZLが好ましぐ 0.3〜5gZLがより好ましぐ 0.5〜3gZLが特に好ましい。あるいは、 0.01〜l% (w/w)が好ましぐ 0.03〜0.5%(w/w)がより好ましぐ 0.05〜0.3% (w/w)が特に好ましい。

[0033] ポリオキシエチレンポリオキシプロピレン共重合体またはその誘導体は、疎水基の分子量およびエチレンォキシド付加量を変えることにより、作用するリポ蛋白の比重が変化し得る。例えば、疎水基分子量力 ¾50〜3850であり、総エチレンォキシド％が 10〜80%のポリオキシエチレンポリオキシプロピレン共重合体またはその誘導体は好適に small,dense LDLに作用し得る。

[0034] ポリオキシエチレンポリオキシプロピレン共重合体またはその誘導体が small,dens e LDL以外の LDLに作用する場合は、あら力じめポリオキシエチレンポリオキシプロピレン共重合体またはその誘導体が作用する LDLを small,dense LDLコレステロ一ル定量反応系外に導けばよい。

[0035] ポリオキシエチレンポリオキシプロピレン共重合体またはその誘導体として、例えばプル口ニック 17R-4、プル口ニック L-64、プル口ニック PE3100、プル口ニック P-85、プル口-ック F-88、プル口ニック P- 103、プル口ニック F-127等のプル口ニック（登録商標 )系界面活性剤 (BASF社、旭電化工業株式会社)などが挙げられる。

[0036] また、上記界面活性剤にさらに非イオン界面活性剤および陰イオン界面活性剤を加えることができる。これらの界面活性剤は、コレステロールエステラーゼならびにコレステロールォキシダーゼもしくはコレステロールデヒドロゲナーゼの活性を上昇させる。 [0037] 前記非イオン界面活性剤および陰イオン界面活性剤の親水性親油性バランス (HL

B)は 12〜14が好ましい。

[0038] 非イオン性界面活性剤としてはポリオキシエチレン誘導体等が挙げられ、特にポリォキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンアルキレンアルキルエーテル

、ポリオキシエチレンアルキルフエ-ルエーテルが好ましぐアルキル基としては炭素数 8以上が好ましぐ例えばォクチル基、ノ-ル基が好ましい。具体的には、エマルゲン（登録商標） 909、ェマルゲン 100シリーズ、ェマルゲン 210P、 220、 306P、 320P、 404 、 408、 409P、 420、 430、 705、 707、 709、 1108、 1118S- 70、 1135S- 70、 1150S- 70、 408 5、 2020G- HA、 2025G、 PI-20T (花王株式会社）、パーソフト NK60 (日本油脂株式会社）などのポリオキシエチレンアルキルエーテル、ェマルゲン LS-106、 LS-110、 LS-1 14、 MS-110 (花王株式会社）等のポリオキシエチレンアルキレンアルキルエーテル、ノ-オン HS-208、 HS-210、 NS-208.5、 NS210 (日本油脂株式会社）などのポリオキシエチレンォクチルフエ-ルエーテル、その他ノ-オン L-4、 0-6 (日本油脂株式会社）などのポリオキシエチレン誘導体が挙げられる。その中でも、ェマルゲン 909、 109P、 4 09P、 709P、 PI- 20T、 LSI 10 (花王株式会社）、パーソフト NK60、ノ-オン HS- 208、 HS -210、 L-4、 NS-208.5, NS-210、 0-6 (日本油脂株式会社）が好ましい。

[0039] ポリオキシエチレン誘導体の濃度は 0.1〜50gZLが好ましぐ 0.5〜10gZLが特に好ましい。あるいは、 0.01〜5%(w/w)が好ましぐ 0.05〜l%(w/w)が特に好ましい。

[0040] 陰イオン性界面活性剤としてはアルキル硫酸ナトリウム、ポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸ナトリウム、アルキルベンゼンスルフォン酸ナトリウムが好ましい。具体的には、トラックス H-45 (日本油脂株式会社)、ポリオキシエチレンスルホコハク酸ラゥリル 2ナトリウムであるサクシ-一ド 3LN (日本油脂株式会社)が好まし、。

[0041] 陰イオン性界面活性剤の濃度は 0.1〜20gZLが好ましぐ 0.5〜10gZLが特に好ましい。あるいは、 0.01〜2%(w/w)が好ましぐ 0.05〜l%(w/w)が特に好ましい。

[0042] 本発明の small,dense LDLコレステロールの測定は水溶液中、好ましくは緩衝液中で行われる。緩衝液に使用する緩衝剤としてはトリス、トリエタノールァミン、ダットの緩衝液等のアミンを含む緩衝液が好ましぐ特にグッドの緩衝液としては Bis-Tris、 PIPE S、 BES、 MOPSO、 HEPESおよび POPSOが好ましい。緩衝液の pHは 5〜9が好ましく、緩衝液の濃度は 10〜500mmol/Lが好ましい。

[0043] リポ蛋白質に界面活性剤を作用させることにより、リポ蛋白質中のコレステロールが遊離し、該コレステロールに酵素（コレステロールエステラーゼならびにコレステロ一ルォキシダーゼもしくはコレステロールデヒドロゲナーゼ）を反応させることによりコレステロールが分解、酸化される。

[0044] 本発明におけるコレステロールエステラーゼとしてはコレステロールエステルを加水分解する酵素であれば特に限定されず、動物または微生物由来のコレステロールェステラーゼを用いることができる。コレステロールエステラーゼの濃度は 0.01〜50U/m L力 S好ましく、 0.1〜10U/mLが特に好ましい。

[0045] コレステロールォキシダーゼとしては、コレステロールを酸化する能力を有する酵素であれば特に限定されず、動物または微生物由来のコレステロールォキシダーゼを用いることができる。コレステロールォキシダーゼの濃度は 0.01〜20U/mLが好ましく、 0.1〜lU/mLが特に好ましい。

[0046] コレステロールデヒドロゲナーゼとしてはコレステロールを酸化して酸化型補酵素を還元する能力を有する酵素であれば特に限定されず、動物または微生物由来のコレステロールデヒドロゲナーゼを用いることができる。コレステロールデヒドロゲナーゼの濃度は 0.01〜200U/mLが好ましぐ 0.1〜100U/mLが特に好ましい。

[0047] 本発明では small,dense LDLに対する反応選択性を高めるためにさらにホスホリパーゼおよび Zまたはリポプロテインリパーゼを用いることができる。

[0048] ホスホリパーゼとしてはホスホリパーゼ A2、ホスホリパーゼじ、ホスホリパーゼ1)、リゾホスホリパーゼ等を用いることができ、使用濃度は 0.01〜10U/mLが好ましぐ 0.01〜5

U/mLがさらに好ましく、 0.01〜 1 U/mLが特に好まし!/、。

[0049] リポプロテインリパーゼはリポタンパク質を分解する能力を有する酵素であれば特に限定されず動物または微生物由来のリポプロテインリパーゼを用いることができる。リポプ口ティンリパーゼの使用濃度は 0.01〜10U/mLが好ましぐ 0.01〜5U/mLがさらに好ましぐ 0.01〜lU/mLが特に好ましい。

[0050] コレステロール測定用酵素としてコレステロールエステラーゼおよびコレステロールォキシダーゼを用いる場合、酵素反応により過酸化水素が生成する。発生した過酸化水素はペルォキシダーゼの存在下で水素供与体と水素受容体とのカップリング反応により形成される色素（有色キノン）により波長 400〜700nmで測定することにより定量することができる。

[0051] 水素供与体としてはァ-リン誘導体が好ましぐァ-リン誘導体としては N ェチル

-N- (2—ヒドロキシ一 3—スルホプロピル） 3—メチルァ-リン（TOOS)、 N—ェチル一 N— (2—ヒドロキシ一 3—スルホプロピル） -3, 5—ジメチルァ-リン（MAOS)、 N —ェチルー N— (3—スルホプロピル）—3—メチルァ-リン（TOPS)、 N— (2 ヒドロキシ一 3—スルホプロピル） -3, 5—ジメトキシァ-リン（HDAOS)、 N— (3—スルホプロピル）ァ-リン（HALPS)、 N—（3—スルホプロピル）ー3—メトキシー5—ァ-リン（HMMP S)等があげられる。水素供与体の使用濃度は最終濃度で 0.1〜1.5mmol/Lが好ましい。

[0052] 水素受容体としては 4ーァミノアンチピリンやメチルベンゾチアゾロンヒドラゾン等を用!/、ることができる。

[0053] コレステロール測定用酵素としてコレステロールエステラーゼおよびコレステロールデヒドロゲナーゼを用いる場合、酵素反応により NAD (P)カゝら NAD (P) Hが発生する。発生した NAD (P) Hは 330〜400nmでの吸光度を測定することにより定量することができる。

[0054] 本発明では small,dense LDLに対する反応選択性をさらに高めるために被検体試料中の small,dense LDL以外のリポ蛋白である HDLや VLDL、 Large LDLなどに含まれるコレステロールを small,dense LDLコレステロール定量反応系外に導!、てもよ!/、。 small.dense LDLコレステロール定量反応系外に導くとは、 HDLや VLDL、 Large LDL などに含まれるコレステロールが small,dense LDLコレステロールの定量に影響を及ぼさないように、 HDL、 VLDL、 Large LDLなどに含まれるコレステロールを消去、凝集させたり、後の工程で反応しないよう阻害したりする等のことを言う。

[0055] 消去とは被検体試料中の物質を分解し、その分解物が次の工程において検出されないようにすることを意味する。この場合、 small.dense LDL以外に作用する界面活性剤として HDL値が 13以上 15以下のポリオキシエチレン誘導体が挙げられ、具体例としては、ポリオキシエチレンラウリルエーテル、ポリオキシエチレンセチルエーテル、ポリォキシエチレンォレイルエーテル、ポリオキシエチレン高級アルコールエーテル、ポリォキシエチレンォクチルフエニルエーテル、ポリオキシエチレンノニルフエニルエーテル、ポリオキシエチレンベンジルフエ-ルエーテル等で HLB値が 13以上 15以下の化合物がある。上記界面活性剤の濃度は、 0.1〜10g/L程度が好ましぐさらに好ましくは 0.3〜5.0g/L程度である。あるいは、 0.01〜l%(w/w)程度が好ましぐさらに好ましくは 0.03〜0.5%(w/w)程度である。

[0056] この場合、 small,dense LDL以外のリポ蛋白中コレステロールの消去には上記界面活性剤の他、コレステロールエステラーゼ、コレステロールォキシダーゼを作用させ発生した過酸ィ匕水素を、カタラーゼを用いて水と酸素に分解する方法、およびペルォキシダーゼを用いて水素供与体と過酸ィ匕水素を反応させ無色キノンに転ィ匕する方法を挙げることができる力これらに限定されるものではない。

[0057] 本発明にはイオン強度調整剤として 1価の陽イオンおよび Zまたは 2価の陽イオンおよびその塩を用いることができる。イオン強度調整剤を添加することにより、 small.de nse LDLが分離しやすくなる。具体的には塩ィ匕ナトリウム、塩ィ匕カリウム、塩化マグネシゥム、塩化マンガン、塩化カルシウム、塩化リチウム、塩化アンモニゥム、硫酸マグネシゥム、硫酸カリウム、硫酸リチウム、硫酸アンモ-ゥム、酢酸マグネシウム等を用いることができる。濃度は 0〜100mmolZLで使用される。

[0058] 反応温度は 2°C〜45°Cで行うことが好ましぐ 25°C〜40°Cで行うことがさらに好ましい。

[0059] 反応時間は 1〜30分間で行うことが好ましぐ 3〜15分で行うことがさらに好ましい。

[0060] 本発明の被検体試料として血清、血漿を使用することができるが、これらに限定されるものではない。

[0061] 凝集とは、被検体試料中の物質を凝集させる凝集剤や、被検体試料中の物質に対する抗体等を用いその凝集物が次の工程にぉヽて検出されなヽようにすることを意味する。ここで凝集剤とは、化学反応によって凝集を惹起させるものであり、また抗体とは、特定のリポ蛋白分画に対する抗体であって、免疫凝集反応を生じさせるものである。例えば反応液には必要に応じてリポ蛋白凝集剤を含有させることができる。リポ蛋白凝集剤としてはリンタングステン酸、へパリン、デキストラン硫酸などのポリア-ォンやその塩、およびマグネシウム、マンガン、カルシウム等の 2価陽イオンが挙げられる。

[0062] 本発明で用いる自動分析装置として、例えば、 TBA-120FR'200FR (東芝)、 JCA-B M1250- 1650 · 2250 (日本電子）、 HITACHI7180 · 7700 (日立）、 AU2700 (OLYMPUS) 等が挙げられる。

[0063] 本発明の方法においては、第 1工程において被検体試料にポリオキシエチレンポリオキシプロピレン共重合体もしくはその誘導体ならびにコレステロール測定用酵素を添カ卩し、 small,dense LDL中のコレステロールを遊離、分解し、第 2工程において、コレステロールの分解物を定量する。ポリオキシエチレンポリオキシプロピレン共重合体もしくはその誘導体は small,dense LDLへの選択性が高いため、上記工程により、 small.dence LDLを選択的に定量することができる。第 1工程の前に、被検体試料中の small,dense LDL以外のリポ蛋白である HDLや VLDL、 Large LDLなどに含まれるコレステロールを small, dense LDLコレステロール定量反応系外に導く工程を含んでいてもよい。 small, dense LDLコレステロール定量反応系外に導く工程とは、 HDL や VLDL、 Large LDLなどに含まれるコレステロール力 small,dense LDLコレステロ一ルの定量に影響を及ぼさないように、 HDL、 VLDL、 Large LDLなどに含まれるコレステロールを消去、凝集させたり、後の工程で反応しないよう阻害したりする等の工程のことである。

[0064] 第 1工程の前の被検体試料中の small,dense LDL以外のリポ蛋白である HDLや VL DL、 Large LDLなどに含まれるコレステロールを small,dense LDLコレステロール定量反応系外に導く工程においては、例えば、コレステロールエステラーゼゃコレステロールォキシダーゼ等のコレステロール測定用酵素を添カ卩し、 small.dense LDL以外のリポ蛋白である HDLや VLDL、 Large LDLなどに含まれるコレステロールに作用させ、発生した過酸ィ匕水素をカタラーゼにより分解することにより、 small, dense LDL以外のリポ蛋白である HDLや VLDL、 Large LDLなどに含まれるコレステロールを small,dense LDLコレステロール定量反応系外に導くことができる。その後、系にポリオキシェチレン—ポリオキシプロピレン共重合体もしくはその誘導体を、必要に応じて界面活性剤と共に添加すればよい。系中のコレステロール測定用酵素、ポリオキシエチレンーポリオキシプロピレン共重合体もしくはその誘導体、あるいはさらに界面活性剤の作用で、 small,dense LDLコレステロール力過酸化水素が発生し、該過酸化水素を定量すればよい。

[0065] 本発明の測定方法を実施するに当たり、用!ヽる試薬を複数の試薬組成物に分けてもよい。本発明においては、試薬としてはポリオキシエチレンポリオキシプロピレン共重合体もしくはその誘導体、コレステロールエステラーゼやコレステロールォキシダーゼ等のコレステロール測定用酵素、界面活性剤、過酸化水素を分解するカタラーゼ、過酸ィ匕水素力もカップリング反応により色素を形成させるためのペルォキシダーゼ、水素供与体、緩衝液等が用いられる。これらの試薬の各試薬組成物への振り分けは、試薬の安定性等を考慮して適宜分配される。例えば、試薬を第 1試薬組成物と第 2試薬組成物の 2つに分け、第 1試薬組成物にコレステロールエステラーゼゃコレステロールォキシダーゼ等のコレステロール測定用酵素等を含ませ、第 2試薬組成物にポリオキシエチレンポリオキシプロピレン共重合体もしくはその誘導体、コレステロール測定用酵素の活性を上昇させるための界面活性剤等が含ませることができる。第 2試薬組成物には、さらにホスホリーパーゼ又はリポプ口ティンリパーゼを含ませてもよい。このような 2つの試薬組成物を用いる場合、被検体試料に第 1試薬組成物を添加し、 1〜10分間、好ましくは 5分間程度反応させたのち、第 2試薬組成物を添加し、さらに 1〜10分間、好ましくは 5分間程度反応させ、形成された色素を定量すればよい。

[0066] また、あらかじめ small, dense LDL以外のリポ蛋白である HDLや VLDL、 Large LDLなどに含まれるコレステロールを消失させた被検体試料を用いて、本発明の上記第 1 工程及び第 2工程を実施してもよい。例えば、被検体から遠心分離により small, dens e LDL分画を分離し、測定してもよい。

[0067] 本発明は、 small.dense LDLコレステロールを含む被検体試料中の small,dense LD Lコレステロールを定量するための、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレン共重合体もしくはその誘導体を含む small,dense LDLコレステロール測定用試薬をも包含する。

[0068] 本発明は、 small.dense LDLコレステロールの定量用キットをも包含する。該キットは、少なくともポリオキシエチレンポリオキシプロピレン共重合体もしくはその誘導体を含む。該キットは、さらにコレステロール測定用酵素を含んでいてもよい。該キットは、さらに非イオン性および Zまたは陰イオン性界面活性剤を含んで、てもよ、。該キットは、さらに、 small,dense LDL以外のリポ蛋白中のコレステロールを small,dense LDL コレステロール定量反応系外に導くための試薬を含んでいてもよい。 small.dense LD Lコレステロール定量反応系外に導くための試薬は、上記の、 small,dense LDL以外のリポ蛋白中のコレステロールを消去、凝集、阻害するための試薬である。

[0069] 本発明は、さらに small, dense LDLコレステロールを含む被検体試料中の small,dens e LDLコレステロールを定量するための、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレン共重合体の small,dense LDLコレステロール測定用試薬としての使用をも包含する。実施例

[0070] 以下、本発明を実施例に基づき具体的に説明するが、本発明は下記実施例に限定されるものではない。

[0071] 実施例 1

第 2試薬組成物中に各種ポリオキシエチレンポリオキシプロピレン共重合体を用 V、た以下の試薬組成物を調製した。

[0072]

第 1試薬組成物

PIPES緩衝液， pH7. 0 50mmo l /L コレステロ一ノレエステラーゼ 0. 6U/mL コレステロ一ノレォキシダーゼ 0. 5U/mL カタラーゼ 600U/mL 牛血淸アルプミン 5%

T00S 2. Ommo l /L 第 2試薬組成物

PIPES緩衝液， pH 7. 0 50mmo l /L ポリオキシエチレン一ポリオキシプロピレン共重合体 0. 3%

4 —ァミノアンチピリン 4. Ommo l /L ぺノレオキシダーゼ 4. 0単位/ mL ァジ化ナトリウム 0. 05% 被検体試料としてヒト血清 30例を使用した。

[0073] 血清試料 4 Lに第 1試薬組成物 300 Lを加え、 37°Cで 5分間反応させた後に、第 2試薬組成物 100 Lをカ卩ぇ 5分間反応させ、 600nmにおける吸光度を測定した。

[0074] デンカ生研社製の small,dense LDLコレステロール測定用試薬キット sd LDL- C「生研」を比較対照として用いて small,dense LDLコレステロール濃度を一次回帰分析により比較した。その結果を表 1に示す。表 1は、各種ポリオキシエチレンポリオキシプロピレン共重合体を用いた本発明品と small,dense LDLコレステロール測定用試薬キット sd LDL- C「生研」との相関係数一覧を示す表である。

[0075] 表 1に示すように、各種ポリオキシエチレンポリオキシプロピレン共重合体を含む試薬組成物を用いた場合の測定値は small,dense LDLコレステロール測定用試薬キット sd LDL-C「生研」を用いた場合の測定値と良好な相関性を示した。これは、本発明の方法により small, dense LDLコレステロールを精度よく測定できることを示している

[表 1] ポリオキシエチレン一ポリ疎水基分子総エチレンォキシド％相関係数ォキシプロピレン共重合体里

①プル口ニック PE3100 950 10 0. 787

②プル口ニック L-64 1750 40 0. 710

③プル口ニック 17R- 4 1700 40 0. 792

④プルロニック P- 85 2250 50 0. 630

⑤プノレロニック F— 88 2250 80 0. 695

⑥プルロニック P— 103 3250 30 0. 758

⑦プル口ニック F-127 3850 70 0. 708 界面活性剤は①は BASF社製、 ②〜⑦は旭電化工業 (株)社製。実施例 2

実施例 1の第 2試薬組成物中に、更に非イオン性界面活性剤を添加した以下の試薬組成物を調製した。

第丄試薬組成物

PIPES緩衝液， pH7. 0 aOnimol /しコレステロ一ノレエステラーゼ 0. 6U/mしコレステロ一ノレ才キシダーゼ 0. 5U/mL カタラーゼ 600U/mL 牛血清アルプミン 0. 5%

T00S 2. Ommol/L 第 2試薬組成物

PIPES緩衝液， pH7. 0 50ramol/L ポリォキシェチレン一ポリォキシプロピレン共重合体 0. 3% ポリォキシエチレンノ -ノレフエノ一/レエーテノレ

ェマルゲン 909 [花王㈱社製] 1%

4 —ァミノアンチピリン Ommol /L ぺ /レ才キシタ— tr 0 -位/ mL アジ化ナトリゥム 05% 超遠心法により分離したコレステロール含有量 lOOmg/dLの small,dense LDL分画および同含有量 100mg/dLの Large LDL分画、各 4 ^ Uこ第 1試薬組成物 300 Lを加え、 37°Cで 5分間反応させた後に、第 2試薬組成物 100 Lを加え 5分間反応させ、 600η mにおける吸光度を測定した。

[0078] その結果、 small.dense LDL分画のうち大部分が反応して測定されたのに対し、 Lar ge LDL分画は 67%のみしか測定されなカゝつた。つまり、試薬組成物中に非イオン性界面活性剤をカ卩えることにより、 small, dense LDLの反応性力加えない場合に比べて増加する。

[0079] また、非イオン性界面活性剤である 109P、 409P、 709P、 PI-20T、 LSI 10 (花王株式会社）、パーソフト NK60、ノ-オン HS- 208、 210、 L- 4、 NS- 208.5、 210、 0- 6 (日本油脂株式会社)をェマルゲン 909の代わりに用いて同様の実験を行い、試薬組成物中に非イオン性界面活性剤をカ卩えることにより、 small.dense LDLの反応性が、加えない場合に比べて増加することも確認できた。

[0080] 従って、非イオン性界面活性剤を添加することにより small,dense LDL中のコレステロールを効率的に測定することができる。

[0081] 実施例 3

被検体試料としてのヒト血清 30例に対し、実施例 2で使用した試薬組成物を用いて測定を行った。

[0082] 血清試料 4 Lに第 1試薬組成物 300 Lをカ卩え、 37°Cで 5分間反応させた後に、第 2試薬組成物 100 Lをカ卩ぇ 5分間反応させ、 600nmにおける吸光度を測定した。

[0083] デンカ生研社製の small,dense LDLコレステロール測定用試薬キット sd LDL- C「生研」を比較対照として用いて small,dense LDLコレステロール濃度を一次回帰分析により比較した。その結果を表 2に示す。表 2は、各種ポリオキシエチレンポリオキシプロピレン共重合体と非イオン性界面活性剤を用いた本発明品と small,dense LDLコレステロール測定用試薬キット sd LDL-C「生研」との相関係数一覧を示す表である。

[0084] 表 2に示すように、各種ポリオキシエチレンポリオキシプロピレン共重合体と非ィオン性界面活性剤を用いた場合の測定値は small,dense LDLコレステロール測定用試薬キット sd LDL-C「生研」を用いた場合の測定値と良好な相関性を示した。また、実施例 1の場合に比べ、相関係数が良好になっていることがわかる。これは、非ィォン性界面活性剤を添カ卩した本発明の方法により small,dense LDLコレステロールを精度よく測定できることを示してヽる。

[表 2]

[0085] 実施例 4

実施例 1の第 2試薬組成物中に、更に陰イオン性界面活性剤を添加した以下の試薬組成物を調製した。

[0086] 第 1試薬組成物

PIPES緩衝液， pH7, 0 tjOmmol/L コレステロ一ノレエステラ■— 0.6U/mL コレステロ一ノレォキシダ'一セ 0.5U/mL カタラーゼ 600U/mL 牛血清アルブミン 0.5% T00S 2. Ommol/し第 2試薬組成物

PIPES緩衝液， pH7.0 50mmo丄ポリオキシエチレン一ポリオキシプロピレン共重合体 0.3% ポリォキシエチレンノエノレフエノーノレエーテノレ

トラックス H- 45 [日本油脂㈱社製] 1%

4 —ァミノアンチピリン 4. Ommol/しぺノレォキシダ一ゼ 4.0 ψ-iiL/mL ァジ化ナトリウム 0.05 超遠心法により分離したコレステロール含有量 100mg/dLの small, dense LDL分画および同含有量 100mg/dLの Large LDL分画、各 4 Lに第 1試薬組成物 300 Lを加え、 37°Cで 5分間反応させた後に、第 2試薬組成物 100 Lを加え 5分間反応させ、 600η mにおける吸光度を測定した。 [0087] その結果、 small.dense LDL分画のうち大部分が反応して測定されたのに対し、 Lar ge LDL分画は 69%のみしか測定されなカゝつた。つまり、試薬組成物中に陰イオン性界面活性剤をカ卩えることにより、 small, dense LDLの反応性力加えない場合に比べて増加する。

[0088] また、陰イオン性界面活性剤であるサクシ-一ド 3LN (日本油脂株式会社)をトラックス H-45の代わりに用いて同様の実験を行ヽ、試薬組成物中に陰イオン性界面活性剤をカ卩えることにより、 small, dense LDLの反応性力加えない場合に比べて増加することも確認できた。

[0089] 従って、陰イオン性界面活性剤を添加することにより small,dense LDL中のコレステロールを効率的に測定することができる。

[0090] 実施例 5

被検体試料としてのヒト血清 30例に対し、実施例 4で使用した試薬組成物を用いて測定を行った。

[0091] 血清試料 4 Lに第 1試薬組成物 300 Lをカ卩え、 37°Cで 5分間反応させた後に、第 2試薬組成物 100 Lをカ卩ぇ 5分間反応させ、 600nmにおける吸光度を測定した。

[0092] デンカ生研社製の small,dense LDLコレステロール測定用試薬キット sd LDL- C「生研」を比較対照として用いて small,dense LDLコレステロール濃度を一次回帰分析により比較した。その結果を表 3に示す。表 3は、各種ポリオキシエチレンポリオキシプロピレン共重合体と陰イオン性界面活性剤を用いた本発明品と small,dense LDLコレステロール測定用試薬キット sd LDL-C「生研」との相関係数一覧を示す表である。

[0093] 表 3に示すように、各種ポリオキシエチレンポリオキシプロピレン共重合体と陰ィオン性界面活性剤を用いた場合の測定値は small,dense LDLコレステロール測定用試薬キット sd LDL-C「生研」を用いた場合の測定値と良好な相関性を示した。また、実施例 1の場合に比べ、相関係数が良好になっていることがわかる。これは、陰ィォン性界面活性剤を添カ卩した本発明の方法により small,dense LDLコレステロールを精度よく測定できることを示して、る。

[表 3] ポリオキシエチレン一ポリ陰イオン性界面活総ェチレンォキ相関係数ォキシプロピレン共重合体性剤シド％

①プル口ニック PE3100 サクシニード 3LN 10 0. 812

②プル口ニック L-64 トラックス H- 45 40 0. 744

[0094] 実施例 6

実施例 1の第 2試薬糸且成物中に、更にリポプロテインリパーゼを各 0、 2、 4、 5U/mL 添加した以下の試薬組成物を調製した。

[0095] 第 1試薬組成物

PIPES緩衝液， pH7. 0 50mmol /L コレステロ一ノレエステラーゼ 0. 6U/mL コレステロールォキシダーゼ 0. 5U/mL カタラーゼ 600U/mL 牛血清アルプミン 0. 5%

T00S 2. Ommo l /L

第 2試薬組成物

PI PES緩衝液， pH7. 0 50匪 ol A ポリオキシェチレン一ポリオキシプロピレン共重合体

プル口ニック 17R-4またはプル口ニック L-64 [旭電化工業（株）社製] 0. 3% 4—ァミノアンチピリン 4. Ommo l /L ペルォキシダーゼ 4. 0単位/ mL リポプロテインリパーゼ LPL- 31 1 [東洋紡績（株）社製] 0, 2， 4， 5U/mL ァジ化ナトリウム 0. 05% 超遠心法により分離したコレステロール含有量 100mg/dLの small,dense LDL分画、 Large LDL分画、各 4 Lに第 1試薬組成物 300 μ Lを加え、 37°Cで 5分間反応させた後に、第 2試薬組成物 100 Lをカ卩ぇ 5分間反応させ、 600nmにおける吸光度を測定した。

[0096] その結果を図 2に示す。

[0097] 図 2に示すように、試薬糸且成物中にリポプロテインリパーゼをカ卩えることにより、 small, dense LDLの反応性が Large LDL反応性に比べて著しく増加する。従って、リポプロティンリパーゼを添カ卩することにより small,dense LDL中のコレステロールを効率的に柳』定することができる。

本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。

Claims

請求の範囲

[1] 被検体試料にポリオキシエチレンポリオキシプロピレン共重合体またはその誘導体の存在下にコレステロール測定用酵素を添カ卩し、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレン共重合体またはその誘導体をリポ蛋白質のうち small,dense LDLに選択的に作用させ、生成したコレステロール量を測定することを特徴とする small,dense LDL コレステロールの定量方法。

[2] さらに非イオン性および Zまたは陰イオン性界面活性剤を添加することを特徴とする請求項 1記載の方法。

[3] コレステロール測定用酵素がコレステロールエステラーゼならびにコレステロールォキシダーゼもしくはコレステロールデヒドロゲナーゼ力なることを特徴とする請求項 1 または 2に記載の方法。

[4] さらにホスホリパーゼおよび Zまたはリポプロテインリパーゼを添加することを特徴とする請求項 1〜3のいずれ力 1項に記載の方法。

[5] ポリオキシエチレンポリオキシプロピレン共重合体またはその誘導体をリポ蛋白質のうち small,dense LDLに選択的に作用させる前に、 small,dense LDL以外のリポ蛋白中のコレステロールを small,dense LDLコレステロール定量反応系外に導くことを特徴とする請求項 1〜4のいずれ力 1項に記載の方法。

[6] 被検体試料にポリオキシエチレンポリオキシプロピレン共重合体またはその誘導体の存在下でコレステロール測定用酵素を添カ卩し、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレン共重合体またはその誘導体をリポ蛋白質のうち small,dense LDLに選択的に作用させ、生成したコレステロール量を測定するための、ポリオキシエチレンポリォキシプロピレン共重合体もしくはその誘導体ならびにコレステロール測定用酵素を含む small,dense LDLコレステロールの定量用キット。

[7] さらに非イオン性および Zまたは陰イオン性界面活性剤を含む請求項 6記載の sma ll.dense LDLコレステロール定量用キット。

[8] コレステロール測定用酵素がコレステロールエステラーゼおよびコレステロールォキシダーゼまたはコレステロールデヒドロゲナーゼからなる請求項 6または 7に記載の sm all, dense LDLコレステロール定量用キット。さらにホスホリパーゼおよび Zまたはリポプロテインリパーゼを含む請求項 6〜8の V、ずれか 1項に記載の small, dense LDLコレステロール定量用キット。

ポリオキシエチレンポリオキシプロピレン共重合体またはその誘導体をリポ蛋白質のうち small,dense LDLに選択的に作用させる前に、 small,dense LDL以外のリポ蛋白中のコレステロールを small,dense LDLコレステロール定量反応系外に導くための試薬を含む請求項 6〜9の!、ずれか 1項に記載の small,dense LDLコレステロール定直用³ rット。

被検体試料中の _small,dense LDLコレステロールを定量する方法において、被検体試料にポリオキシエチレンポリオキシプロピレン共重合体またはその誘導体の存在下にコレステロール測定用酵素を添カ卩し、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレン共重合体またはその誘導体をリポ蛋白質のうち small,dense LDLに選択的に作用させ、生成したコレステロールを測定する工程力なる方法。

small, dense LDLコレステロールを含む被検体試料中の small,dense LDLコレステロールを定量するための、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレン共重合体もしくはその誘導体を含む small,dense LDLコレステロール測定用試薬。

small, dense LDLコレステロールを含む被検体試料中の small,dense LDLコレステロールを定量するための、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレン共重合体の small, dense LDLコレステロール測定用試薬としての使用。