WO2007007628A1 - アズレン系化合物のコリン塩結晶 - Google Patents

アズレン系化合物のコリン塩結晶 Download PDF

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ylmethyl
choline salt
glucitol
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Masakazu Imamura
Takayuki Suzuki
Takeshi Murakami
Keita Nakanishi
Hiroshi Uebayashi
Haruka Nakamura
Masamichi Yuda
Naoko Amenomiya
Yuuji Awamura
Hiroshi Tomiyama
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Astellas Pharma Inc.
Kotobuki Pharmaceutical Co., Ltd.
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    • C07D309/08—Heterocyclic compounds containing six-membered rings having one oxygen atom as the only ring hetero atom, not condensed with other rings having no double bonds between ring members or between ring members and non-ring members with hetero atoms or with carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. ester or nitrile radicals, directly attached to ring carbon atoms
    • C07D309/10—Oxygen atoms

Definitions

  • the present invention relates to (1S) -1,5 anhydro 1- [5- (azulene 2-ylmethyl) 2 hydroxyphenyl] D-glucitol (hereinafter referred to as “azulenic compound A” or simply “i ⁇ ”).
  • Compound A azulenic compound A
  • choline salt crystals and choline salt hydrate crystals More specifically, a single crystal having a certain quality can be obtained with good reproducibility, and can be stably supplied as a crystal of a drug substance used in the manufacture of a pharmaceutical, and has excellent storage stability.
  • Background art relating to choline salts of azulene compounds A, choline salt crystals and choline salt hydrate crystals, and pharmaceutical compositions containing these as active ingredients, particularly useful as therapeutic agents for diabetes
  • Patent Document 1 discloses a free form of azulene compound A
  • the salt of Compound A is not specifically described
  • two types of hydrate crystals and five types of anhydrous The presence of physical crystals was confirmed.
  • the free form of Compound A has various crystal forms, and it has proved technically difficult to obtain the desired single crystal with high reproducibility in the drug substance manufacturing process. Therefore, it is technically difficult to stably supply a drug substance crystal having a certain quality, and it is extremely difficult to stably supply this crystal even in terms of cost. It turned out to be. Therefore, the problem is that it is practically impossible to use the free form of Compound A as a drug substance in the manufacture of pharmaceuticals.
  • Na salt crystals, K salt crystals, Li salt crystals, and Ca salt crystals which are commonly used as pharmaceuticals and drug substances.
  • Na salt crystals, K salt crystals, and Li salt crystals are each at low temperatures. Since volatile components such as mosquitoes are desorbed and changed, it was extremely difficult to stably supply a drug substance with a certain quality. It was also found that the crystal of lZ2Ca salt was obtained only as a dimethylformamide (DMF) solvate, and therefore the toxicity problem caused by DMF could not be avoided.
  • DMF dimethylformamide
  • the present invention has been made to solve the above-mentioned problems, and a single crystal having a certain quality can be obtained with good reproducibility, and is stable as a crystal of a drug substance used in the manufacture of a medicine.
  • An object of the present invention is to provide crystals of azulene-based compound A having high storage stability and excellent storage stability.
  • a single crystal having a certain quality can be obtained with good reproducibility, and can be stably supplied as a crystal of a drug substance used in the manufacture of a medicine, and has excellent storage stability.
  • the ability of the choline salt of Compound A to form a new hydrate crystal of the choline salt of Compound A by processing at high humidity S this hydrate crystal is also effectively used as a drug substance
  • the present invention has been completed. That is, in order to achieve the above object, according to the present invention, the following choline salt of azulene compound A, choline salt crystals and choline salt hydrate crystals, and these as active ingredients, particularly as a therapeutic agent for diabetes. Good Suitable pharmaceutical compositions are provided.
  • Powder X-ray diffraction shows 2 ⁇ (°) 5. 58, 14. 72, 16. 80, 17. 82, 21. 02 and 22. 46 1, 5 Anhydro-1 [5 (azulene-2 dimethyl) -2-hydroxyphenol] —D-glucitol choline salt crystal.
  • [0011] [4] It has an endothermic peak at 194 to 198 ° C by differential scanning calorimetry analysis (DSC analysis) and 2 ⁇ (°) by powder X-ray diffraction 5. 58, 14. 72, 16. 80, 17. (1S)-1, 5 Anhydro-1 [5 (Azulene-2-ylmethyl) —2-Hydroxyphenol] -D Glucitol choline with main peak near 82, 21.02 and 22.46 Salt crystals.
  • DSC analysis Differential scanning calorimetry analysis has a broad endothermic peak near 78 ° C and an endothermic peak between 195 and 199 ° C. (IS) — 1, 5 Anhydro 1 [5- (Azulene-2-ylmethyl) 2-hydroxyphenol] D Glucitol choline salt hydrate crystal.
  • [0013] [6] X-ray powder diffraction 20 0 (°) 5. 66, 17. 08, 17. 66, 19. 02, 19. 58 and 22. 14 around main peak, (1S)- 1, 5 Anhydro 1 [5 (Azulene-2-ylmethyl) 2-hydroxyphenol] Choline salt hydrate crystal of D-glucitol.
  • DSC analysis Differential scanning calorimetry analysis has a broad endothermic peak near 78 ° C and an endothermic peak at 195 to 199 ° C, and 20 (°) by powder X-ray diffraction 5.
  • D Glucitol choline salt hydrate crystal [7]
  • [0015] [8] The choline salt according to [1], the choline salt crystal according to any one of [2] to [4], or any one of the above [5] to [7].
  • a pharmaceutical composition comprising the choline salt hydrate crystals of as an active ingredient.
  • a single crystal having a certain quality can be obtained with good reproducibility, and can be stably supplied as a crystal of a drug substance used in the manufacture of a pharmaceutical product.
  • An excellent azulene compound A choline salt, choline salt crystal and choline salt hydrate crystal, and a pharmaceutical composition containing these as active ingredients, particularly suitable as a therapeutic agent for diabetes, are provided.
  • D Darcopyranosylphenolate (Azulene compound ⁇ choline salt) is a differential scanning calorimeter analysis diagram (DSC analysis diagram).
  • FIG. 2 is a differential scanning calorimeter analysis diagram (DSC analysis diagram) of a crystal of a Japanese product.
  • FIG. 3 is a powder X-ray diffraction pattern of a crystal of a Japanese product.
  • FIG. 6 is a powder X-ray diffraction pattern of a crystal of [sodium 4- (azulene-2-ylmethyl) -2- ⁇ -D-darcopyranosyl phenolate] (azulene-based sodium salt).
  • FIG. 2 is a powder X-ray diffraction pattern of a crystal of NOLATO] (potassium compound A potassium salt).
  • FIG. 9 Differential scanning calorimetry analysis diagram (DSC analysis diagram) of the crystal of [Lithium 4- (azulenic 2-ylmethyl) -2- ⁇ -D-darcopyranosylphenolate] (lithium salt of azulene compound ⁇ ) ).
  • FIG. 10 is a powder X-ray diffraction pattern of a crystal of [lithium 4- (azulene-2-ylmethyl) -2- ⁇ -D-darcopyranosylphenol] (a lithium salt of an azulene compound).
  • FIG. 11 Differential scanning calorimetry analysis diagram (DSC analysis diagram) of [hemicalcium 4- (azulene 2-ylmethyl) 2- ⁇ -D-darcopyrano sylphenolate] (1Z2 calcium salt of azulene compound ⁇ ) ).
  • FIG. 12 is a powder X-ray diffraction pattern of a crystal of [hemicalcium 4- (azulene-2-ylmethyl) -2- ⁇ -D-darcopyrano sylphenolate] (1Z2 calcium salt of azulene compound ⁇ ).
  • FIG. 14 [(1S) — 1,5 Anhydro 1- [5- (Azulene 2-ylmethyl) 2 Hydroxyl] D Glucitol Hydrate Crystal 1] (Azulene Compound A Hydrate FIG. 2 is a powder X-ray diffraction pattern of crystal 1).
  • FIG. 4 is a powder X-ray diffraction pattern of crystal 2).
  • FIG. 3 is a powder X-ray diffraction (temperature rising powder X-ray) diagram of FIG.
  • FIG. 2 is a powder X-ray diffraction (temperature-programmed powder X-ray) diagram of an anhydrous crystal 2] (anhydrous crystal 2 of azulene-based compound A).
  • FIG.20 [(1 S) — 1, 5—Anhydro 1— [5 (Azulene-2-Inolemethinole) 2 Hydroxyphenol] D Glucitol Anhydride Crystal 3] (Azulene Compound A Anhydride Crystal 3) FIG.
  • FIG.24 [(1 S) — 1, 5—Anhydro 1— [5 (Azulene-2-Inolemethinole) 2 Hydroxyphenol] D Glucitol Anhydride Crystal 5] (Azulene Compound A Anhydride Crystal 5) FIG.
  • Choline salt, choline salt crystal and choline salt hydrate crystal of the azulene compound A ((1 S) 1,5 anhydro 1 [5 (azulene 2-ylmethyl) -2-hydroxyphenol] -D glucitol) of the present invention (Hereinafter sometimes referred to as “the crystal of the present invention”) has the chemical structural formula shown below.
  • the crystals of the present invention include two types of hydrate crystals of azulene compound A, and five types of anhydride crystals, Na salt crystals, K salt crystals, Li salt crystals, and Ca salts.
  • crystal of the present invention refers to a mixture of a choline salt crystal and a choline salt hydrate crystal, a choline salt crystal and a choline salt hydrate crystal, in addition to the above choline salt crystal and choline salt hydrate crystal. This means a concept that includes mixed crystals.
  • the choline salt crystal has an endothermic peak at 194 to 198 ° C. by differential scanning calorimetry analysis (DSC analysis), and 20 (° C. by Z or powder X-ray diffraction). ) 5.58, 1 4.72, 16.80, 17.82, 21.02 and 22.46, and the choline salt hydrate crystals are analyzed by differential scanning calorimetry analysis (DSC Analysis) has a broad endothermic peak near 78 ° C, an endothermic peak at 195 to 199 ° C, and 2 ⁇ (°) 5.66, 17.08, 17. Main peaks near 66, 19. 02, 19.58 and 22.14.
  • the diffraction angle (2 ⁇ (°;)) in the powder X-ray diffraction spectrum is shown in Table 1 for the choline salt crystal and in Table 2 for the choline salt hydrate crystal, respectively. And is characterized by relative intensity. Powder X-ray diffraction is based on the nature of the data, and the crystal lattice spacing and overall pattern are important in determining the identity of the crystal. The relative intensity depends somewhat on the crystal growth direction, particle size, and measurement conditions. Since it can change, it should not be understood strictly.
  • the crystal of the present invention can be produced by free physical strength of azulene compound A described in Example 75 of Patent Document 1 by a normal salt formation reaction.
  • the medicinal thread composition of the present invention contains the above-mentioned crystal of the present invention as an active ingredient, and further contains a pharmaceutically acceptable carrier, and is particularly useful as a therapeutic agent for diabetes. It is useful.
  • a pharmaceutical composition containing one or more of the crystals of the present invention as an active ingredient is a tablet, powder, or the like using a carrier or excipient for pharmaceutical preparations or other additives that are commonly used. It is prepared into fine granules, granules, capsules, pills, solutions, injections, suppositories, ointments, patches, etc. and is administered orally or parenterally.
  • the clinical dose of the crystal of the present invention for human beings is appropriately determined in consideration of the symptoms, weight, age, sex, etc. of the patient to which it is applied, but usually 0.1 to 500 mg orally per day for an adult. Oral 0.01 to: LOOmg, which is administered once or in several divided doses. Since the dosage varies depending on various conditions, it may be less than the above dosage range and may be sufficient.
  • the solid composition for oral administration of the crystal of the present invention tablets, powders, granules and the like are used.
  • one or more active substance forces at least one inert diluent such as lactose, mannitol, glucose, hydroxypropyl cellulose, microcrystalline cellulose, starch, poly It is mixed with bull pyrrolidone and magnesium aluminate metasilicate.
  • the composition comprises additives other than an inert diluent, for example, a lubricant such as magnesium stearate, a disintegrant such as calcium glycolate, a stabilizer such as ratatose, It may contain a solubilizing agent or solubilizing agent such as gnoretamic acid or aspartic acid. If necessary, tablets or pills may be coated with a sugar coating such as sucrose, gelatin, hydroxypropyl cellulose, hydroxypropyl methylcellulose phthalate, or a film of a gastric or enteric substance.
  • a lubricant such as magnesium stearate
  • a disintegrant such as calcium glycolate
  • a stabilizer such as ratatose
  • solubilizing agent or solubilizing agent such as gnoretamic acid or aspartic acid.
  • tablets or pills may be coated with a sugar coating such as sucrose, gelatin, hydroxypropyl cellulose, hydroxypropyl methylcellulose phthalate, or
  • Liquid compositions for oral administration include pharmaceutically acceptable emulsions, solutions, suspensions, syrups, elixirs and the like, commonly used inert diluents, Examples include purified water and ethyl alcohol.
  • This composition may contain solubilizers, solubilizers, wetting agents, suspending agents, sweeteners, flavors, fragrances, preservatives in addition to the inert diluent. Good.
  • Injections for parenteral administration include sterile aqueous or non-aqueous solutions, suspensions, and emulsions.
  • aqueous solution and suspension diluent include distilled water for injection and physiological saline.
  • diluents for non-aqueous solutions and suspensions include vegetable oils such as propylene glycol, polyethylene glycol and olive oil; Alcohols such as alcohol; polysorbate 80 (trade name).
  • Such a composition further comprises an isotonic agent, preservative, wetting agent, emulsifier, dispersant, stabilizer.
  • Additives such as (eg, ratatoses), solubilizers or solubilizers may be included. These are sterilized by, for example, filtration through a bacteria-retaining filter, blending with a bactericide or irradiation. These can also be used by preparing a sterile solid composition and dissolving it in sterile water or a sterile solvent for injection before use.
  • the differential scanning calorimeter analysis diagram (DSC analysis diagram) of this crystal is shown in Fig. 5, and the powder X-ray diffraction diagram is shown in Fig. 6.
  • lithium 4 (azulene 2-ylmethyl) -2- ⁇ D darcopyranosylphenolate was obtained using a 1M aqueous lithium hydroxide solution instead of a 1M aqueous sodium hydroxide solution. Since the obtained crystals are in a form in which volatile components are desorbed and changed from a low temperature, it is extremely difficult to stably supply a product having a certain quality.
  • the differential scanning calorimeter analysis diagram (DSC analysis diagram) of this crystal is shown in Fig. 9, and the powder X-ray diffraction diagram is shown in Fig. 10.
  • the obtained crystal is dehydrated by heating or drying under reduced pressure, and has a property of transferring to the anhydrous crystal 3 of the azulene compound A. Meanwhile, the anhydrous crystal 1 of the azulene compound A, the absence of the azulene compound A The mode of transition to water crystal 2 was different from lot to lot, and reproducibility in recrystallization was not obtained.
  • the differential scanning calorimeter analysis diagram (DSC analysis diagram) of this crystal is shown in FIG. 13, and the powder X-ray diffraction diagram is shown in FIG.
  • DSC analysis differential scanning calorimetry analysis
  • Table 3 The results are shown in Table 3.
  • Polyethylene bag double 4 0.26 0.62 0.22 99.0
  • the free form of the azulene compound A includes hydrate crystal 1, hydrate crystal 2, anhydride crystal 1, anhydride crystal 2, anhydride crystal 3, anhydride crystal 4, and anhydride.
  • Each crystal has the property of transitioning to other crystals, is difficult to reproduce in recrystallization operations, is stable only at high temperatures and cannot be isolated at room temperature, or heated. It was generated only during processing.
  • These crystals have the disadvantage that crystals can be obtained or cannot be obtained even under certain conditions, for example, under specific conditions, and the formation of crystal polymorphs is controlled, It was hard to get a single crystal. Therefore, it became clear that the free form crystals of azulene compound A cannot be commercialized as pharmaceutical products.
  • the crystals of the present invention provide a single crystal having a certain quality with good reproducibility and is stably supplied as a crystal of a drug substance. It was also excellent in storage stability, and this made it possible to make a product as a pharmaceutical product for the first time.
  • single-stranded cDNA was reverse-transcribed from total RNA derived from human kidney (Clontech) using Superscript II (Gibco) and random hexamer.
  • human SGLT2 (Wells RG et al., Am. J. Physiol, 1992, 263 (3) F459) was encoded by PCR using Pyrobe st DNA polymerase (manufactured by Takara).
  • the DNA fragment to be amplified was amplified (a primer in which a Hind III site was introduced on the 5 ′ side and an EcoRI site on the 3 ′ side of the DNA fragment was used).
  • the amplified fragment was cloned into pCR2.1-Topo vector using Topo TA Cloning kit (manufactured by Invitrogen), introduced into a competent cell of Escherichia coli JM109 strain, and ampicillin resistant clones were ampicillin ( Growing in LB medium containing lOOmgZL).
  • a plasmid was purified from the grown Escherichia coli by the method of Hanahan (see Maniatis et al., Molecular Cloning), and this plasmid was digested with HindIII and EcoRI. Ligation using T4 DNA ligase (Roche Diagnostics) and cloning.
  • the ligated clone was introduced into a competent cell of E. coli strain JM109 in the same manner as described above, grown in LB medium containing ampicillin, and a human SGLT2 expression vector was obtained by the method of Hanahan.
  • the human SGLT2 expression vector was introduced into CHO-K1 cells using Lipofectamine 2000 (G3 ⁇ 4co). After gene transfer, the cells were treated with penicillin (50 IUZmL, manufactured by Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd.), streptomycin (50 ⁇ gZmL, manufactured by Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd.), Geneticin (40 ⁇ g / mL 0 Gibco), and 10% Ushi fetal serum. Contains Ham, s F12 medium (manufactured by Nissui Pharmaceutical), 37 ° C, 5 Culturing for about 2 weeks in the presence of% CO gave a geneticin resistant clone. These claws
  • Cells that stably expressed human SGLT2 were selected using the specific activity of sugar uptake in the presence of sodium relative to the steady level as an index (see the next paragraph for details of the method for measuring sugar uptake).
  • Human SGLT2 stably expressing CHO cell culture medium was removed, and pretreatment buffer per well (140 mM choline chloride, 2 mM potassium chloride, lmM calcium chloride, 1 mM magnesium chloride, 2— [4— (2 hydroxyethyl) —1 [Piperazyl] ethanesulfonic acid 10 mM and tris (hydroxymethyl) aminomethane 5 mM buffer solution pH7.4) was added to 100 L and allowed to stand at 37 ° C. for 20 minutes.
  • pretreatment buffer per well 140 mM choline chloride, 2 mM potassium chloride, lmM calcium chloride, 1 mM magnesium chloride, 2— [4— (2 hydroxyethyl) —1 [Piperazyl] ethanesulfonic acid 10 mM and tris (hydroxymethyl) aminomethane 5 mM buffer solution pH7.4
  • Incorporation buffer containing test crystals salt sodium 140 mM, salt potassium 2 mM, calcium chloride lmM, magnesium chloride lmM, methyl- ⁇ —D-darcobilanoside 50 0 2, 2 [4- (2-hydroxyethyl) 1—piperazyl-] ethanesulfonic acid 10 mM, tris (hydroxymethyl) aminomethane 5 mM buffer pH7.4 4) 11 ⁇ L of methyl-1000-z L — D— (U— 14C) darcoviranoside (Amersham Pharmacia Biotech And mixed to obtain a buffer for uptake. An uptake buffer containing no test crystals was prepared in the control group. In addition, a basal uptake buffer containing 140 mM salty choline was prepared in the same manner for basal uptake measurement in the absence of test crystals and sodium, instead of salty sodium.
  • the pretreatment buffer was removed, 25 ⁇ L of the uptake buffer was added per tool, and allowed to stand at 37 ° C for 2 hours.
  • Remove the uptake buffer and wash buffer (choline chloride 140 mM, potassium chloride 2 mM, calcium chloride lmM, magnesium chloride lmM, methyl- ⁇ — D-darcobilanoside 10 mM, 2-[4— (2 hydroxyethyl) 1 —Pipelajur]
  • a buffer solution containing 10 mM ethanesulfonic acid and 5 mM tris (hydroxymethyl) aminomethane, pH 7.4) was added in an amount of 200 L / ul and immediately removed.
  • the choline salt of azulene compound A shown in 1 and the choline salt hydrate of azulene compound A shown in Example 2 are equivalent to the values (8.9 nM) shown in Example 75 in Table 24 of Patent Document 1. The value of was shown.
  • the crystal of the present invention is excellent in storage stability and has an inhibitory action on Na + glucose cotransporter and a hypoglycemic action. ), Non-insulin dependent diabetes mellitus (type 2 diabetes), insulin resistance disease and obesity treatment, and prevention thereof.

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Abstract

　示差走査熱量計分析（ＤＳＣ分析）で１９４～１９８°Cに吸熱ピークを有するとともに、粉末Ｘ線回折で２θ（°）５．５８、１４．７２、１６．８０、１７．８２、２１．０２及び２２．４６付近に主ピークを有する、（１Ｓ）－１，５－アンヒドロ－１－［５－（アズレン－２－イルメチル）－２－ヒドロキシフェニル］－Ｄ－グルシトールのコリン塩結晶とすることにより、一定の品質を有する単一の結晶が再現性よく得られ、医薬の製造に用いられる原薬の結晶として安定的に供給されることが可能で、かつ、保存安定性に優れたアズレン系化合物の結晶が提供される。

Description

ァズレン系化合物のコリン塩結晶
技術分野
[0001] 本発明は、 (1S) - 1, 5 アンヒドロ一 1— [5— (ァズレン一 2—ィルメチル） 2 ヒ ドロキシフエ-ル] D グルシトール（以下、 「ァズレン系化合物 A」又は単に「ィ匕合 物 A」ということがある）のコリン塩、コリン塩結晶及びコリン塩水和物結晶に関する。さ らに詳しくは、一定の品質を有する単一の結晶が再現性よく得られ、医薬の製造に 用いられる原薬の結晶として安定的に供給されることが可能で、保存安定性に優れ たァズレン系化合物 Aのコリン塩、コリン塩結晶及びコリン塩水和物結晶、並びにこれ らを有効成分として含有する、特に糖尿病治療剤として有用な医薬組成物に関する 背景技術
[0002] 本発明者等は、下記化学構造式で示される、（1S)— 1, 5 アンヒドロー 1 [5—（ ァズレン— 2—ィルメチル）—2—ヒドロキシフエ-ル]—D—グルシトール（ァズレン系 化合物 A)力 医薬、特に、 Na+ グルコース共輸送体阻害剤として、例えば、インス リン依存性糖尿病（1型糖尿病）、インスリン非依存性糖尿病（2型糖尿病）等の糖尿 病の他、インスリン抵抗性疾患、及び肥満を含む各種糖尿病関連疾患の治療、並び にこれらの予防に有用な化合物であることを報告している（国際公開第 2004Z013 118号パンフレット（以下特許文献 1と称する）：実施例 75参照)。
[0003] [化 1]
Figure imgf000003_0001
発明の開示
[0004] 上記特許文献 1には、ァズレン系化合物 Aのフリー体は記載されているものの、化 合物 Aの塩については具体的には記載されていないため、まず、特許文献 1に記載 された化合物 Aのフリー体について鋭意研究した結果、 2種類の水和物結晶、及び 5 種類の無水物結晶の存在が確認された。また、化合物 Aのフリー体の結晶形は多様 であるとともに、原薬の製造工程において目的とする単一の結晶を再現性よく得るこ とは技術的に困難であることがわ力つた。従って、一定の品質を有する原薬の結晶を 安定的に供給することも技術的に困難であり、このものを安定的に供給することは、コ スト的に見ても、極めて困難なことであることが判明した。従って、化合物 Aのフリー体 を医薬の製造における原薬として用いることは、実際上、不可能であるという問題が めつに。
[0005] 次に、医薬や原薬として通常用いられる Na塩結晶、 K塩結晶、 Li塩結晶、 Ca塩結 晶を鋭意研究した結果、 Na塩結晶、 K塩結晶、 Li塩結晶はそれぞれ低温カゝら揮発 性成分が脱離して変化する形態を有するものであるため、一定の品質を有する原薬 を安定的に供給することは極めて困難であることがわ力つた。また、 lZ2Ca塩の結 晶は、ジメチルホルムアミド（DMF)和物としてのみ得られ、それ故、 DMFに起因す る毒性の問題を回避することができないことがわ力つた。
[0006] 本発明は、上述の問題を解決するためになされたものであり、一定の品質を有する 単一の結晶が再現性よく得られ、医薬の製造に用いられる原薬の結晶として安定的 、かつ、合理的な製造コストでの供給可能性が高い、保存安定性に優れたァズレン 系化合物 Aの結晶を提供することを目的とする。
[0007] 上述の目的を達成するため、本発明者等は、医薬としては通常用いられていない コリン [ (CH ) N+CH CH OH]塩について鋭意研究した結果、化合物 Aのコリン塩
3 3 2 2
の場合、一定の品質を有する単一の結晶が再現性よく得られ、医薬の製造に用いら れる原薬の結晶として安定的に供給することが可能で、保存安定性に優れていること を見出すとともに、化合物 Aのコリン塩は、高湿度で処理することで新たに化合物 A のコリン塩の水和物結晶を生成する力 S、この水和物結晶も医薬の原薬として有効に 用いられることを見出し、本発明を完成させた。すなわち、上記目的を達成するため 、本発明によれば、以下のァズレン系化合物 Aのコリン塩、コリン塩結晶及びコリン塩 水和物結晶、並びにこれらを有効成分として含有する、特に糖尿病治療剤として好 適な医薬組成物が提供される。
[0008] [1] (1S) - 1, 5 アンヒドロ一 1— [5— (ァズレン一 2—ィルメチル） 2 ヒドロキシ フエ-ル]—D グルシトールのコリン塩。
[0009] [2]示差走査熱量計分析 (DSC分析)で 194〜198°Cに吸熱ピークを有する、 (1S) —1, 5 アンヒドロ一 1— [5— (ァズレン一 2—ィルメチル） 2 ヒドロキシフエ-ル] — D グルシトールのコリン塩結晶。
[0010] [3]粉末 X線回折で 2 Θ (° ) 5. 58、 14. 72、 16. 80、 17. 82、 21. 02及び 22. 46 付近に主ピークを有する、 (1S) - 1, 5 アンヒドロー 1 [5 （ァズレンー2 ィルメ チル）—2—ヒドロキシフエ-ル]—D—グルシトールのコリン塩結晶。
[0011] [4]示差走査熱量計分析 (DSC分析)で 194〜 198°Cに吸熱ピークを有するとともに 、粉末 X線回折で 2 Θ (° ) 5. 58、 14. 72、 16. 80、 17. 82、 21. 02及び 22. 46付 近に主ピークを有する、 (1S) - 1, 5 アンヒドロー 1 [5 （ァズレンー2—ィルメチ ル）—2—ヒドロキシフエ-ル]—D グルシトールのコリン塩結晶。
[0012] [5]示差走査熱量計分析 (DSC分析)で 78°C付近にブロードな吸熱ピークと、 195 〜199°Cに吸熱ピークとを有する、（IS)— 1, 5 アンヒドロ一 1— [5— (ァズレン一 2 ィルメチル） 2—ヒドロキシフエ-ル] D グルシトールのコリン塩水和物結晶。
[0013] [6]粉末 X線回折で 2 0 (° ) 5. 66、 17. 08、 17. 66、 19. 02、 19. 58及び 22. 14 付近に主ピークを有する、 (1S) - 1, 5 アンヒドロー 1 [5 （ァズレンー2 ィルメ チル） 2—ヒドロキシフエ-ル] D—グルシトールのコリン塩水和物結晶。
[0014] [7]示差走査熱量計分析 (DSC分析)で 78°C付近にブロードな吸熱ピークと、 195 〜199°Cに吸熱ピークとを有するとともに、粉末 X線回折で 2 0 (° ) 5. 66、 17. 08、 17. 66、 19. 02、 19. 58及び 22. 14付近に主ピークを有する、 (1S) - 1, 5—アン ヒドロ一 1— [5— (ァズレン一 2—ィルメチル） 2 ヒドロキシフエ-ル] D グルシ トールのコリン塩水和物結晶。
[0015] [8]前記 [1]に記載のコリン塩、前記 [2]〜 [4]のいずれかに記載のコリン塩結晶又 は、前記 [5]〜 [7]の 、ずれかに記載のコリン塩水和物結晶を有効成分として含有 する医薬組成物。
[0016] [9]さらに製薬学的に許容される担体を含有する前記 [8]に記載の医薬組成物。 [0017] [10]糖尿病治療剤である前記 [8]又は [9]に記載の医薬組成物。
[0018] 本発明によって、一定の品質を有する単一の結晶が再現性よく得られ、医薬の製 造に用いられる原薬の結晶として安定的に供給されることが可能で、保存安定性に 優れたァズレン系化合物 Aのコリン塩、コリン塩結晶及びコリン塩水和物結晶、並び にこれらを有効成分として含有する、特に糖尿病治療剤として好適な医薬組成物が 提供される。
図面の簡単な説明
[0019] [図 1] [ (2 ヒドロキシェチル）トリメチルアンモ -ゥム 4— (ァズレン一 2—ィルメチル）
- 2- β D ダルコピラノシルフエノラート] (ァズレン系化合物 Αのコリン塩）の結晶 の示差走査熱量計分析図 (DSC分析図)である。
[図 2] [ (2 ヒドロキシェチル）トリメチルアンモ -ゥム 4— (ァズレン一 2—ィルメチル） - 2- β D ダルコピラノシルフエノラート] (ァズレン系化合物 Αのコリン塩）の結晶 の粉末 X線回折図である。
[図 3] [ (2 ヒドロキシェチル）トリメチルアンモ -ゥム 4— (ァズレン一 2—ィルメチル） —2— β—D—ダルコピラノシルフエノラートの水和物] (ァズレン系化合物 Αのコリン 塩水和物)の結晶の示差走査熱量計分析図 (DSC分析図)である。
[図 4] [ (2 ヒドロキシェチル）トリメチルアンモ -ゥム 4— (ァズレン一 2—ィルメチル） —2— β—D—ダルコピラノシルフエノラートの水和物] (ァズレン系化合物 Αのコリン 塩水和物）の結晶の粉末 X線回折図である。
[図 5] [ナトリウム 4— (ァズレン一 2—ィルメチル）—2— β—D—ダルコピラノシルフ エノラート] (ァズレン系化合物 Αのナトリウム塩)の結晶の示差走査熱量計分析図（D SC分析図）である。
[図 6] [ナトリウム 4— (ァズレン一 2—ィルメチル）—2— β—D—ダルコピラノシルフ エノラート] (ァズレン系化合物 Αのナトリウム塩)の結晶の粉末 X線回折図である。
[図 7] [カリウム 4— (ァズレン一 2—ィルメチル） 2— β—D—ダルコピラノシルフェ ノラート] (ァズレン系化合物 Αのカリウム塩)の結晶の示差走査熱量計分析図（DSC 分析図)である。
[図 8] [カリウム 4— (ァズレン一 2—ィルメチル） 2— β—D—ダルコピラノシルフェ ノラート] (ァズレン系化合物 Aのカリウム塩)の結晶の粉末 X線回折図である。
[図 9] [リチウム 4— (ァズレン一 2—ィルメチル）—2— β—D—ダルコピラノシルフェ ノラート] (ァズレン系化合物 Αのリチウム塩)の結晶の示差走査熱量計分析図（DSC 分析図)である。
[図 10] [リチウム 4— (ァズレン一 2—ィルメチル）—2— β—D—ダルコピラノシルフ エノラート] (ァズレン系化合物 Αのリチウム塩)の結晶の粉末 X線回折図である。
[図 11] [へミカルシウム 4— (ァズレン一 2—ィルメチル） 2— β—D—ダルコピラノ シルフエノラート] (ァズレン系化合物 Αの 1Z2カルシウム塩）の結晶の示差走査熱量 計分析図 (DSC分析図)である。
[図 12] [へミカルシウム 4— (ァズレン一 2—ィルメチル）—2— β—D—ダルコピラノ シルフエノラート] (ァズレン系化合物 Αの 1Z2カルシウム塩）の結晶の粉末 X線回折 図である。
[図 13][(1S)— 1, 5 アンヒドロ一 1— [5— (ァズレン一 2—ィルメチル） 2 ヒドロ キシフ -ル] D グルシトールの水和物結晶 1] (ァズレン系化合物 Aの水和物 結晶 1)の示差走査熱量計分析図 (DSC分析図)である。
[図 14][(1S)— 1, 5 アンヒドロ一 1— [5— (ァズレン一 2—ィルメチル） 2 ヒドロ キシフ -ル] D グルシトールの水和物結晶 1] (ァズレン系化合物 Aの水和物 結晶 1)の粉末 X線回折図である。
[図 15][(1S)— 1, 5 アンヒドロ一 1— [5— (ァズレン一 2—ィルメチル） 2 ヒドロ キシフエ-ル] D グルシトールの水和物結晶 2] (ァズレン系化合物 Aの水和物 結晶 2)の示差走査熱量計分析図 (DSC分析図)である。
[図 16][(1S)— 1, 5 アンヒドロ一 1— [5— (ァズレン一 2—ィルメチル） 2 ヒドロ キシフエ-ル] D グルシトールの水和物結晶 2] (ァズレン系化合物 Aの水和物 結晶 2)の粉末 X線回折図である。
[図 17][(1S)— 1, 5 アンヒドロ一 1— [5— (ァズレン一 2—ィルメチル） 2 ヒドロ キシフ -ル] D グルシトールの無水物結晶 1] (ァズレン系化合物 Aの無水物 結晶 1)の粉末 X線回折 (昇温粉末 X線）図である。
[図 18][(1S)— 1, 5 アンヒドロ一 1— [5— (ァズレン一 2—ィルメチル） 2 ヒドロ キシフエ-ル] D グルシトールの無水物結晶 2] (ァズレン系化合物 Aの無水物 結晶 2)の粉末 X線回折 (昇温粉末 X線）図である。
[図 19] [ (1S)— 1, 5 アンヒドロ一 1— [5— (ァズレン一 2—ィルメチル） 2 ヒドロ キシフエ-ル] D グルシトールの無水物結晶 3] (ァズレン系化合物 Aの無水物 結晶 3)の示差走査熱量計分析図 (DSC分析図)である。
[図 20] [ ( 1 S)— 1 , 5—アンヒドロ 1— [5 (ァズレン一 2 イノレメチノレ） 2 ヒドロ キシフエ-ル] D グルシトールの無水物結晶 3] (ァズレン系化合物 Aの無水物 結晶 3)の粉末 X線回折図である。
[図 21] [ (1S)— 1, 5 アンヒドロ一 1— [5— (ァズレン一 2—ィルメチル） 2 ヒドロ キシフ -ル] D グルシトールの無水物結晶 4] (ァズレン系化合物 Aの無水物 結晶— 4)の示差走査熱量計分析図 (DSC分析図)である。
[図 22] [ ( 1 S)— 1 , 5—アンヒドロ 1— [5 (ァズレン一 2 イノレメチノレ） 2 ヒドロ キシフ -ル] D グルシトールの無水物結晶 4] (ァズレン系化合物 Aの無水物 結晶—4)の粉末 X線回折図である。
[図 23] [ ( 1 S)— 1 , 5—アンヒドロ 1— [5 (ァズレン一 2 イノレメチノレ） 2 ヒドロ キシフエ-ル] D グルシトールの無水物結晶 5] (ァズレン系化合物 Aの無水物 結晶 5)の示差走査熱量計分析図 (DSC分析図)である。
[図 24] [ ( 1 S)— 1 , 5—アンヒドロ 1— [5 (ァズレン一 2 イノレメチノレ） 2 ヒドロ キシフエ-ル] D グルシトールの無水物結晶 5] (ァズレン系化合物 Aの無水物 結晶 5)の粉末 X線回折図である。
発明を実施するための最良の形態
以下、本発明を実施するための最良の形態を具体的に説明する。
本発明のァズレン系化合物 A ( ( 1 S) 1 , 5 アンヒドロ 1 [5 （ァズレン 2— ィルメチル）—2—ヒドロキシフエ-ル]—D グルシトール）のコリン塩、コリン塩結晶 及びコリン塩水和物結晶（以下、「本発明結晶」ということがある）は、下記に示す化学 構造式を有している。また、本発明結晶は、上述のように、ァズレン系化合物 Aのフリ 一体の 2種類の水和物結晶、及び 5種類の無水物結晶、 Na塩結晶、 K塩結晶、 Li塩 結晶、 Ca塩結晶とは異なり、一定の品質を有する単一の結晶が再現性よく得られ、 医薬の製造に用いられる原薬の結晶として安定的に供給されることが可能で、保存 安定性に優れたものである。これらの結晶形の相違は、特に、示差走査熱量計分析 (DSC分析)及び粉末 X線回折によって区別される。なお、「本発明結晶」とは、上述 のコリン塩結晶及びコリン塩水和物結晶に加えて、コリン塩結晶とコリン塩水和物結 晶との混合物、及びコリン塩結晶とコリン塩水和物結晶との混晶をも含む概念を意味 する。
[0021] [化 2]
Figure imgf000009_0001
[0023] すなわち、本発明結晶のうち、コリン塩結晶は、示差走査熱量計分析 (DSC分析） で 194〜198°Cに吸熱ピークを有し、及び Z又は粉末 X線回折で 2 0 (° ) 5. 58、 1 4. 72、 16. 80、 17. 82、 21. 02及び 22. 46付近に主ピークを有するものであり、コ リン塩水和物結晶は、示差走査熱量計分析 (DSC分析)で 78°C付近にブロードな吸 熱ピークと、 195〜199°Cに吸熱ピークとを有し、及び Z又は、粉末 X線回折で 2 Θ ( ° ) 5. 66、 17. 08、 17. 66、 19. 02、 19. 58及び 22. 14付近に主ピークを有する ものである。 [0024] 本発明結晶のうち、コリン塩結晶は表 1に、また、コリン塩水和物結晶は表 2にそれ ぞれ示される、粉末 X線回折スペクトルにおける回折角（2 Θ (° ；) )及び相対強度に よって特徴付けられる。なお、粉末 X線回折はデータの性質上、結晶の同一性認定 においては結晶格子間隔や全体的なパターンが重要であり、相対強度は結晶成長 の方向、粒子の大きさ、測定条件によって多少は変わり得るものであるから、厳密に 解されるべきではない。
[0025] [表 1]
Figure imgf000010_0001
[0026] [表 2]
Figure imgf000010_0002
[0027] 「粉末 X線回折」及び「示差走査熱量計分析 (DSC分析)」はそれぞれ以下の条件 で測定した。
(粉末 X線回折）
「MAC Science MXP18TAHF22Jを用い、管球： Cu、管電流： 40mA、管電 圧： 40又は 200kV、サンプリング幅： 0. 020° 、走査速度： 3° Zmin、波長： 1. 54 056 A、測定回折角範囲（2 Θ )： 3又は 5〜40° の条件で測定した。
(示差走査熱量計分析 (DSC分析) )
「TA Instrument TA 5000」を用い、室温〜 300°C (10°CZmin)、 N (50ml
2
Zmin)、アルミニウム製サンプルパンの条件で測定した。
[0028] (製造法）
本発明結晶は、特許文献 1の実施例 75に記載されたァズレン系化合物 Aのフリー 体力 通常の造塩反応によって製造することができる。
[0029] 本発明の医薬糸且成物は、上述の本発明結晶を有効成分として含有するものであり 、さらに製薬学的に許容される担体を含有するものであり、特に、糖尿病治療剤とし て有用なものである。
[0030] 本発明結晶の 1種又は 2種以上を有効成分として含有する医薬組成物は、通常用 いられている製剤用の担体ゃ賦形剤、その他の添加剤を用いて、錠剤、散剤、細粒 剤、顆粒剤、カプセル剤、丸剤、液剤、注射剤、坐剤、軟膏、貼付剤等に調製され、 経口的又は非経口的に投与される。
[0031] 本発明結晶のヒトに対する臨床投与量は適用される患者の症状、体重、年齢や性 別等を考慮して適宜決定されるが、通常成人 1日当たり経口で 0. l〜500mg、非経 口で 0. 01〜： LOOmgであり、これを 1回或いは数回に分けて投与する。投与量は種 々の条件で変動するので、上記投与量範囲より少な!、量で十分な場合もある。
[0032] 本発明結晶の経口投与のための固体組成物としては、錠剤、散剤、顆粒剤等が用 いられる。このような固体組成物においては、一つ又はそれ以上の活性物質力 少な くとも一つの不活性な希釈剤、例えば乳糖、マン-トール、ブドウ糖、ヒドロキシプロピ ルセルロース、微結晶セルロース、デンプン、ポリビュルピロリドン、メタケイ酸アルミン 酸マグネシウムと混合される。組成物は、常法に従って、不活性な希釈剤以外の添 加剤、例えばステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤や繊維素グリコール酸カルシ ゥムのような崩壊剤、ラタトースのような安定化剤、グノレタミン酸又はァスパラギン酸の ような可溶化剤又は溶解補助剤を含有していてもよい。錠剤又は丸剤は必要により ショ糖、ゼラチン、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース フタレート等の糖衣又は胃溶性若しくは腸溶性物質のフィルムで被膜してもよ 、。
[0033] 経口投与のための液体組成物は、薬剤的に許容される乳濁剤、溶液剤、懸濁剤、 シロップ剤、エリキシル剤等を含み、一般的に用いられる不活性な希釈剤、例えば精 製水、エチルアルコールを含む。この組成物は不活性な希釈剤以外に可溶化剤、溶 解補助剤、湿潤剤、懸濁剤のような補助剤、甘味剤、風味剤、芳香剤、防腐剤を含 有していてもよい。
[0034] 非経口投与のための注射剤としては、無菌の水性又は非水性の溶液剤、懸濁剤、 乳濁剤を包含する。水性の溶液剤、懸濁剤の希釈剤としては、例えば注射剤用蒸留 水及び生理食塩水が含まれる。非水溶性の溶液剤、懸濁剤の希釈剤としては、例え ばプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、ォリーブ油のような植物油；ェチル アルコールのようなアルコール類；ポリソルベート 80 (商品名）等がある。
[0035] このような組成物は、更に等張化剤、防腐剤、湿潤剤、乳化剤、分散剤、安定化剤
(例えば、ラタトース）、可溶化剤又は溶解補助剤のような添加剤を含んでもよい。こ れらは例えばバクテリア保留フィルターを通す濾過、殺菌剤の配合又は照射によって 無菌化される。これらはまた無菌の固体組成物を製造し、使用前に無菌水又は無菌 の注射用溶媒に溶解して使用することもできる。
実施例
[0036] 以下本発明を実施例によって具体的に説明する力 本発明はこれらの実施例によ つて何ら限定されるものではない。
[0037] (実施例 1)
[ (2 ヒドロキシェチル）トリメチルアンモ -ゥム 4— (ァズレン— 2—ィルメチル）― 2- β D ダルコピラノシルフエノラート] (ァズレン系化合物 Αのコリン塩）の結晶
(1S) - 1, 5—アンヒドロ 1— [5 (ァズレン一 2 イノレメチノレ） - 2-ヒドロキシフ ヱ-ル] D グルシトール（1. Og)のメタノール（10mL)溶液にアルゴン雰囲気下、 コリンヒドロキシド（50%水溶液） (0. 6mL)を加え、室温にて攪拌した。減圧下溶媒 を留去し、さらにトルエンをカ卩えて共沸した後、減圧乾燥した。残渣にエタノール（20 mL)を加え、完全に溶解するまで加熱攪拌した。この混合物を室温まで放冷し、析 出した結晶をろ過し、エタノールで洗浄後、減圧下 50°Cで乾燥した。得られた個体（ 1. 15g)にエタノール (46mL)をカ卩え、完全に溶解するまで加熱攪拌した。この混合 物を室温まで放冷し、析出した結晶をろ過し、エタノールで洗浄後、減圧下 50°Cで 乾燥し、（2 ヒドロキシェチル）トリメチルアンモ -ゥム 4— (ァズレン— 2—ィルメチ ル） 2— β—D—ダルコピラノシルフエノラート（1. 02g)を得た。この結晶の示差走 查熱量計分析図 (DSC分析図)を図 1に、粉末 X線回折図を図 2に示す。
[0038] (実施例 2)
[ (2 ヒドロキシェチル）トリメチルアンモ -ゥム 4— (ァズレン— 2—ィルメチル）― 2- β D ダルコピラノシルフエノラートの水和物] (ァズレン系化合物 Αのコリン塩 水和物）の結晶
(2 ヒドロキシェチル）トリメチルアンモ -ゥム 4— (ァズレン— 2—ィルメチル）—2 - β—D—ダルコピラノシルフエノラート（コリン塩） (1. OOg)を、温度 25°Cで、硝酸力 リウムを用 、て調湿した相対湿度 93 %のデシケーターに 1週間保存することにより、（ 2 ヒドロキシェチル）トリメチルアンモ -ゥム 4— (ァズレン— 2—ィルメチル）—2— β—D—ダルコピラノシルフエノラートの水和物結晶（コリン塩水和物）（1. 04g)を得 た。この結晶の示差走査熱量計分析図 (DSC分析図)を図 3に、粉末 X線回折図を 図 4に示す。
[0039] (比較例 1)
[ナトリウム 4— (ァズレン一 2—ィルメチル）—2— β—D—ダルコピラノシルフエノ ラート] (ァズレン系化合物 Αのナトリウム塩)の結晶
(1S) - 1, 5—アンヒドロ 1— [5 (ァズレン一 2 イノレメチノレ） - 2-ヒドロキシフ ェ -ル] -D-グルシトール（99 lmg)にエタノール（ 10mL)とメタノール（ 10mL)を 加えた。 1M水酸ィ匕ナトリウム水溶液（2. 5mL)を加え、室温にて攪拌した。減圧下 溶媒を留去し、さらにトルエンを加えて共沸した。得られた個体を減圧下 55°Cで乾燥 した。この固体（360mg)〖こ、 2 プロパノール：水 = 5 : 1 (7. 2mL)をカ卩え、完全に 溶解するまで加熱攪拌した。この混合物を室温まで放冷し、析出した結晶をろ過し、 2 プロパノール：水 = 5 : 1で洗浄後、減圧下 45°Cで乾燥してナトリウム 4 （ァズレ ン一 2 ィルメチル）—2— β— D—ダルコピラノシルフエノラート（ 193mg)を得た。 得られた結晶は、低温から揮発性成分が脱離して変化する形態であるため、一定の 品質を有する製品を安定的に供給することは極めて困難なものであった。この結晶 の示差走査熱量計分析図 (DSC分析図）を図 5に、粉末 X線回折図を図 6に示す。
[0040] (比較例 2)
[カリウム 4— (ァズレン一 2—ィルメチル） 2— β—D—ダルコピラノシルフェノラ ート] (ァズレン系化合物 Αのカリウム塩)の結晶
比較例 1と同様の方法により、 1M水酸ィ匕ナトリウム水溶液の代わりに 1M水酸ィ匕カ リウム水溶液を用いてカリウム 4— (ァズレン— 2—ィルメチル）—2— β— D—ダル コピラノシルフエノラートを得た。得られた結晶は、低温から揮発性成分が脱離して変 化する形態であるため、一定の品質を有する製品を安定的に供給することは極めて 困難なものであった。この結晶の示差走査熱量計分析図 (DSC分析図）を図 7に、粉 末 X線回折図を図 8に示す。
[0041] (比較例 3)
[リチウム 4— (ァズレン一 2—ィルメチル）—2— β—D—ダルコピラノシルフェノラ ート] (ァズレン系化合物 Αのリチウム塩)の結晶
比較例 1と同様の方法により、 1M水酸ィ匕ナトリウム水溶液の代わりに 1M水酸化リ チウム水溶液を用いてリチウム 4 （ァズレン 2 ィルメチル）—2— β D ダル コピラノシルフエノラートを得た。得られた結晶は、低温から揮発性成分が脱離して変 化する形態であるため、一定の品質を有する製品を安定的に供給することは極めて 困難なものであった。この結晶の示差走査熱量計分析図 (DSC分析図）を図 9に、粉 末 X線回折図を図 10に示す。
[0042] (比較例 4)
[へミカルシウム 4— (ァズレン一 2—ィルメチル）—2— β—D—ダルコビラノシル フエノラート] (ァズレン系化合物 Αの 1Z2カルシウム塩）の結晶
( 1S) - 1 , 5—アンヒドロ 1— [5 (ァズレン一 2 イノレメチノレ） - 2 -ヒドロキシフ ェ-ル]— D グルシトール（850mg)にメタノール（3. 5mL)、 1M水酸化ナトリウム 水溶液（2. 15mL)を加え、室温にて攪拌した。減圧下溶媒を留去し、残渣を水（15 mL)に溶解した。塩化カルシウム（477mg)を水（2. 5mL)に溶解したものを加え、 室温にて攪拌した。析出した固体をろ過し、水、 2—プロパノールで洗浄した。得られ た個体を減圧下加熱乾燥した。この固体にテトラヒドロフランを加え、不溶物をろ過し 、ろ液を濃縮して得られた個体を減圧下加熱乾燥した。この固体（200mg)にジメチ ルホルムアミド (DMF) ( 1. OmL)、水（2. OmL)をカ卩え、完全に溶解するまで加熱攪 拌した。この混合物を室温まで放冷し、析出した結晶をろ過し水で洗浄後、減圧下 6 0°Cで乾燥してへミカルシウム 4— (ァズレン— 2—ィルメチル）—2— β— D グル コピラノシルフエノラート（65mg)を得た。結晶は DMF和物としてのみ得られ、 DMF に起因する毒性の問題を回避することができないものであった。この結晶の示差走査 熱量計分析図 (DSC分析図)を図 11に、粉末 X線回折図を図 12に示す。
[0043] (比較例 5)
[ ( 1 S)— 1 , 5—アンヒドロ 1— [5 (ァズレン一 2 イノレメチノレ） - 2 -ヒドロキシフ ニル] D グルシトールの水和物結晶 1] (ァズレン系化合物 Aの水和物結晶 - 1)
(1S) - 1, 5—アンヒドロ 1— [5 (ァズレン一 2 イノレメチノレ） - 2-ヒドロキシフ ェ -ル] D グルシトール（300mg)に 2 プロパノール：水 = 1 : 2 (7. 5mL)をカロ え、完全に溶解するまで加熱攪拌した。この混合物を室温まで放冷し、析出した結晶 をろ過し、 2 プロパノール:水 = 1 : 2で洗浄後、減圧下 45°Cで乾燥して（IS)—1, 5 アンヒドロ一 1— [5— (ァズレン一 2—ィルメチル） 2 ヒドロキシフエ-ル] D グルシトールの水和物結晶 1 (222mg)を得た。得られた結晶は、加熱又は減圧 乾燥により脱水し、ァズレン系化合物 Aの無水物結晶 3に転移する性質を示す力 その間、経由するァズレン系化合物 Aの無水物結晶 1、ァズレン系化合物 Aの無 水物結晶 2への転移の様式はロット間で異なり、再結晶での再現性が得られなか つた。この結晶の示差走査熱量計分析図 (DSC分析図)を図 13に、粉末 X線回折図 を図 14に示す。
[0044] (比較例 6)
[ ( 1 S)— 1 , 5—アンヒドロ 1— [5 (ァズレン一 2 イノレメチノレ） 2 ヒドロキシフ ニル] D グルシトールの水和物結晶 2] (ァズレン系化合物 Aの水和物結晶 2)
( 1 S)— 1 , 5—アンヒドロ 1— [5 (ァズレン一 2 イノレメチノレ） 2 ヒドロキシフ ェ-ル]— D グルシトール（500mg)にエタノール（2. OmL)をカ卩え、完全に溶解す るまで加熱攪拌した。この混合物を室温まで放冷し、析出した結晶をろ過し、エタノー ルで洗浄後、減圧下 45°Cで乾燥して（IS)—1, 5 アンヒドロー 1 [5 （ァズレン - 2—ィルメチル） - 2-ヒドロキシフエ-ル] D グルシトールの水和物結晶— 2 (1 22mg)を得た。この結晶は、再結晶において 1ロットのみで得られただけであり、再 現されなかった。この結晶の示差走査熱量計分析図 (DSC分析図）を図 15に、粉末 X線回折図を図 16に示す。
[0045] (比較例 7)
[ ( 1 S)— 1 , 5—アンヒドロ 1— [5 (ァズレン一 2 イノレメチノレ） 2 ヒドロキシフ ニル] D グルシトールの無水物結晶 1] (ァズレン系化合物 Aの無水物結晶 - 1)
比較例 5で得た（IS)—1, 5 アンヒドロー 1 [5 （ァズレン 2 ィルメチル） 2—ヒドロキシフヱ-ル] D グルシトールの水和物結晶 1を、示差走査熱量計分 析装置 (DSC分析装置）において、専用のアルミニウム製サンプルパンに充填し、窒 素雰囲気下、 10°CZminの昇温速度で加熱した際に、約 100°Cにおいて、（IS)— 1, 5 アンヒドロ一 1— [5— (ァズレン一 2—ィルメチル） 2 ヒドロキシフエ-ル]― D グルシトールの無水物結晶 1の生成を確認した。また、比較例 5で得た（1S) —1, 5 アンヒドロ一 1— [5— (ァズレン一 2—ィルメチル） 2 ヒドロキシフエ-ル] D グルシトールの水和物結晶 1を、昇温粉末 X線回折装置において、専用の 銅製試料板に充填し、窒素雰囲気下、 100°Cにおける粉末 X線回折測定において、 (1S)— 1, 5 アンヒドロ一 1— [5— (ァズレン一 2—ィルメチル） 2 ヒドロキシフエ -ル] D グルシトールの無水物結晶 1の生成を確認した。この結晶は、ァズレ ン系化合物 Aの水和物結晶 1の加熱処理にお!、て生成するが、高温でのみ安定 に存在する結晶形であり、室温では単離されな力つた。この結晶の粉末 X線回折 (昇 温粉末 X線）図を図 17に示す。
(比較例 8)
[ ( 1 S)— 1 , 5—アンヒドロ 1— [5 (ァズレン一 2 イノレメチノレ） 2 ヒドロキシフ ニル] D グルシトールの無水物結晶 2] (ァズレン系化合物 Aの無水物結晶 2)
比較例 5で得た（IS)—1, 5 アンヒドロー 1 [5 （ァズレン 2 ィルメチル） 2—ヒドロキシフエ-ル] D グルシトールの水和物結晶 1を、 DSC装置において 、専用のアルミニウム製サンプルパンに充填し、窒素雰囲気下、 10°CZminの昇温 速度で加熱した際に、約 140°Cにおいて、（1S)—1, 5 アンヒドロー 1 [5 （ァズ レン— 2—ィルメチル）—2—ヒドロキシフエ-ル]—D グルシトールの無水物結晶— 2の生成を確認した。また、比較例 5で得た（IS)—1, 5 アンヒドロ 1— [5— (ァズ レン— 2—ィルメチル）—2—ヒドロキシフエ-ル]—D グルシトールの水和物結晶— 1を、昇温粉末 X線回折装置において、専用の銅製試料板に充填し、窒素雰囲気下 、 140°Cにおける粉末 X線回折測定において、（1S)—1, 5 アンヒドロー 1 [5—（ ァズレン 2—ィルメチル） 2—ヒドロキシフエ-ル] D—グルシトールの無水物結 晶ー 2の生成を確認した。この結晶は、ァズレン系化合物 Aの水和物結晶 1の加熱 処理において生成する力 高温でのみ安定に存在する結晶形であり、室温では単離 されなかった。この結晶の粉末 X線回折 (昇温粉末 X線）図を図 18に示す。
[0047] (比較例 9)
[ ( 1 S)— 1 , 5—アンヒドロ 1— [5 (ァズレン一 2 イノレメチノレ） 2 ヒドロキシフ ニル] D グルシトールの無水物結晶 3] (ァズレン系化合物 Aの無水物結晶 3)
比較例 5で得た（IS)—1, 5 アンヒドロー 1 [5 （ァズレン 2 ィルメチル） 2—ヒドロキシフヱ-ル] D グルシトールの水和物結晶 1を、示差走査熱量計分 析装置 (DSC分析装置）において、専用のアルミニウム製サンプルパンに充填し、窒 素雰囲気下、 10°CZminの昇温速度で 150°Cまで加熱して（1S)— 1, 5 アンヒド 口一 1— [5— (ァズレン一 2—ィルメチル） 2 ヒドロキシフエ-ル]—D グルシトー ルの無水物結晶 3を得た。この結晶は、ァズレン系化合物 Aの水和物結晶 1の 加熱処理においてのみ生成し、再結晶からは得られな力つた。この結晶の示差走査 熱量計分析図 (DSC分析図)を図 19に、粉末 X線回折図を図 20に示す。
[0048] (比較例 10)
[ ( 1 S)— 1 , 5—アンヒドロ 1— [5 (ァズレン一 2 イノレメチノレ） 2 ヒドロキシフ ニル] D グルシトールの無水物結晶 4] (ァズレン系化合物 Aの無水物結晶 4)
比較例 6で得た（IS)—1, 5 アンヒドロー 1 [5 （ァズレン 2 ィルメチル） 2—ヒドロキシフヱ-ル] D グルシトールの水和物結晶 2を、示差走査熱量計分 析装置 (DSC分析装置）において、専用のアルミニウム製サンプルパンに充填し、窒 素雰囲気下、 10°CZminの昇温速度で 185°Cまで加熱して（1S)— 1, 5 アンヒド 口一 1— [5— (ァズレン一 2—ィルメチル） 2 ヒドロキシフエ-ル]—D グルシトー ルの無水物結晶 4を得た。この結晶は、ァズレン系化合物 Aの水和物結晶 2の 加熱処理においてのみ生成し、再結晶からは得られな力つた。この結晶の示差走査 熱量計分析図 (DSC分析図)を図 21に、粉末 X線回折図を図 22に示す。 [0049] (比較例 11)
[ (1S) - 1, 5—アンヒドロ 1— [5 (ァズレン一 2 イノレメチノレ） - 2-ヒドロキシフ ニル] D グルシトールの無水物結晶 5] (ァズレン系化合物 Aの無水物結晶 - 5)
(1S) - 1, 5—アンヒドロ 1— [5 (ァズレン一 2 イノレメチノレ） - 2-ヒドロキシフ ェ-ル]— D グルシトール（300mg)にァセトニトリル（3. OmL)をカ卩え、完全に溶解 するまで加熱攪拌した。この混合物を室温まで放冷し、析出した結晶をろ過し、ァセト 二トリルで洗浄後、減圧下 45°Cで乾燥して（1S)— 1, 5 アンヒドロ 1— [5— (ァズ レン— 2—ィルメチル）—2—ヒドロキシフエ-ル]—D グルシトールの無水物結晶— 5 (101mg)を得た。この結晶は、再結晶において 1ロットのみで得られ、再現されな かった。なお、示差走査熱量計分析 (DSC分析)で 2本の吸熱ピークが確認されたこ とから、単一結晶として得られない可能性がある。この結晶の示差走査熱量計分析 図（DSC分析図）を図 23に、粉末 X線回折図を図 24に示す。
[0050] (保存安定性試験）
(2 ヒドロキシェチル）トリメチルアンモ -ゥム 4— (ァズレン— 2—ィルメチル）—2 - β—D—ダルコピラノシルフエノラート（46g)をポリエチレン袋に入れてビーズバン ドで封鎖し、さらにシリカゲル（12g)を入れたポリエチレン袋に入れてビーズバンドで 封鎖したものを、金属缶に入れて密栓し、暗所、温度 40°C、相対湿度 75%の条件下 で 6箇月間保存した。別に、（2 ヒドロキシェチル）トリメチルアンモ-ゥム 4— (ァズ レン一 2—ィルメチル）—2— β—D—ダルコピラノシルフエノラート（10g)を開放した 褐色容器に入れて、暗所、温度 40°C、相対湿度 75%の条件下で 6箇月間保存した 。その結果を表 3に示す。
[0051] [表 3] 保存 類縁物質（％)
定量（％) 保存条件 期間 (HPLC) 水分（％)
(HPLC)
(月） 個々の最大 里
保存開始時 0 0.26 0.61 0.39 99.0
40 °C, 75 %E.H.
シリカゲノレ 2 0.26 0.66 0.29 99.5
ポリエチレン袋 (二重） 4 0.26 0.62 0.22 99.0
金属缶 6 0.27 0.44 0.19 99.5
(無水物）
40 °C, 75 %R.H.
2 0.25 0.58 3.78 99.2
掲色ガラス容器
4 0.24 0.57 3.59 99.9
開放
6 0.24 0.43 3.61 98.8
(水和物 *)
註： *上記の保存条件では、 保存開始後すみやかに水和物に変化することが確 認された。
[0052] 表 3から、いずれの保存条件でも、類縁物質の量及び定量値に変化はないため、（
2 ヒドロキシェチル）トリメチルアンモ -ゥム 4— (ァズレン— 2—ィルメチル）—2— β D ダルコピラノシルフヱノラートの無水物及び水和物は、どちらも安定な化合 物であることが明ら力となった。
[0053] 以上の実施例、比較例の結果から、先ず、ァズレン系化合物 Αと、医薬品として通 常用いられるナトリウム、カリウム、リチウム、又はカルシウムとのアルカリ類との塩は、 低温においてすら揮発性成分が脱離して変化する形態であり、 lZ2Ca塩結晶の場 合には DMF和物でしか存在し得ないために、 DMFに起因する毒性の問題を回避 できな 、と 、う欠点を有し、これらの結晶を使用して医薬品としての製品化できな 、こ とが明ら力となった。
[0054] また、ァズレン系化合物 Aのフリー体には、水和物結晶 1、水和物結晶 2、無水 物結晶 1、無水物結晶 2、無水物結晶 3、無水物結晶 4、及び無水物結晶 —5からなる、合計 7種類もの結晶形が存在している。そして、それぞれの結晶は、他 の結晶に転移する性質を有していたり、再結晶操作において、再現が困難だったり、 高温でのみで安定に存在し室温では単離できな力つたり、加熱処理においてのみ生 成するものであった。そして、それらの結晶は、所定の条件、例えば、特定の条件下 であっても、結晶が取得できたり、できな力つたりするという欠点を有し、結晶多形の 生成を制御して、単一の結晶を取得することはできな力つた。従って、ァズレン系化 合物 Aのフリー体の結晶では、医薬品としては製品化できないことが明らかとなった。 一方、上記各種塩の結晶およびフリー体の各種結晶とは異なり、本発明結晶は、 一定の品質を有する単一の結晶が再現性良く得られ、医薬の原薬の結晶として安定 的に供給されることができ、保存安定性にも優れたものであって、これにより医薬品と しての製品ィ匕が初めて可會となつた。
[0055] (薬理試験）
[ヒト Na+—グルコース共輸送体 (ヒト SGLT2)活性阻害作用確認試験]
1)ヒト SGLT2発現ベクターの作製
まず、 Superscript II (Gibco社製）とランダムへキサマーを用いて、ヒト腎臓由来の全 RNA(Clontech社製）から 1本鎖 cDNAを逆転写した。次に、これを铸型とし、 Pyrobe st DNAポリメラーゼ（Takara社製）を用いた PCR反応により、ヒト SGLT2 (Wells R. G. et al.， Am. J. Physiol, 1992, 263(3)F459)をコードする DNA断片を増幅した（こ の DNA断片の 5'側に Hind IIIサイトが、 3'側に EcoRIサイトが導入されるようなプライ マーを用いた)。
増幅された断片を Topo TA Cloningキット（Invitrogen社製）を用いて pCR2.1- Topo ベクターにクロー-ングし、大腸菌 JM109株のコンビテントセルに導入して、アンピシ リン耐性を示すクローンをアンピシリン（lOOmgZL)を含む LB培地中で増殖した。 増殖した大腸菌から Hanahanの方法（Maniatisら、 Molecular Cloningを参照）によりプ ラスミドを精製し、このプラスミドを HindIII、 EcoRI消化して得られるヒト SGLT2をコード する DNA断片を、発現ベクター pcDNA3.1 (Invitrogen社製）の同サイトに T4 DNA リガーゼ（Roche Diagnostics社製）を用いてライゲーシヨンし、クローユングした。ライ ゲーシヨンしたクローンを、上記と同様に大腸菌 JM109株のコンビテントセルに導入 し、アンピシリンを含む LB培地中で増殖させ、 Hanahanの方法によりヒト SGLT2発現 ベクターを取得した。
[0056] 2)ヒト SGLT2安定発現細胞の作製
ヒト SGLT2発現ベクターを Lipofectamine2000 (G¾co社製）を用いて CHO— K1細 胞に導入した。遺伝子導入後、細胞をペニシリン（50IUZmL。大日本製薬社製)、 ストレプトマイシン（50 μ gZmL。大日本製薬社製）、 Geneticin (40 μ g/mL0 Gibco 社製)と 10%ゥシ胎児血清を含む Ham， s F12培地（日水製薬社製）中で、 37°C、 5 %CO存在下で 2週間ほど培養し、 Geneticin耐性のクローンを得た。これらのクロー
2
ンの中からヒト SGLT2を安定発現する細胞を、定常レベルに対するナトリウム存在下 の糖取り込みの比活性を指標に選択し、取得した (糖取り込みの測定方法の詳細に ついては、次段落参照)。
[0057] 3)メチルー α— D ダルコビラノシド取り込み阻害活性の測定
ヒト SGLT2安定発現 CHO細胞の培地を除去し、 1ゥエルあたり前処置用緩衝液 ( 塩化コリン 140mM、塩化カリウム 2mM、塩化カルシウム lmM、塩化マグネシウム 1 mM、 2— [4— (2 ヒドロキシェチル）—1—ピペラジ -ル]エタンスルホン酸 10mM 、トリス（ヒドロキシメチル）ァミノメタン 5mMを含む緩衝液 pH7. 4)を 100 Lカロえ、 3 7°Cで 20分間静置した。
試験結晶を含む取り込み用緩衝液 (塩ィ匕ナトリウム 140mM、塩ィ匕カリウム 2mM、 塩化カルシウム lmM、塩化マグネシウム lmM、メチルー α— D—ダルコビラノシド 5 0 Μ、 2 [4— (2—ヒドロキシェチル） 1—ピペラジ -ル]エタンスルホン酸 10m M、トリス（ヒドロキシメチル）ァミノメタン 5mMを含む緩衝液 pH7. 4) 1000 /z Lに 11 μ Lのメチルー — D— (U— 14C)ダルコビラノシド（Amersham Pharmacia Biotech 社製)を加え混合し、取り込み用緩衝液とした。対照群に試験結晶を含まない取り込 み用緩衝液を調製した。また、試験結晶及びナトリウム非存在下の基礎取り込み測 定用に塩ィ匕ナトリウムに替えて 140mMの塩ィ匕コリンを含む基礎取り込み用緩衝液を 同様に調製した。
[0058] 前処置用緩衝液を除去し、取り込み用緩衝液を 1ゥヱルあたり 25 μ Lずつ加え 37 °Cで 2時間静置した。取り込み用緩衝液を除去し、洗浄用緩衝液 (塩化コリン 140m M、塩化カリウム 2mM、塩化カルシウム lmM、塩化マグネシウム lmM、メチルー α — D—ダルコビラノシド 10mM、 2 - [4— (2 ヒドロキシェチル） 1—ピぺラジュル] エタンスルホン酸 10mM、トリス（ヒドロキシメチル）ァミノメタン 5mMを含む緩衝液 pH 7. 4)を 1ゥヱルあたり 200 Lずつ加え、すぐに除去した。この洗浄操作を更に 1回 行い、 0. 5%ラウリル硫酸ナトリウムを 1ゥエルあたり 25 Lずつ加え、細胞を可溶ィ匕 した。ここに 75 μ Lのマイクロシンチ 40 (Packard社製）をカ卩えマイクロシンチレーショ ンカウンタートップカウント (Packard社製）にて放射活性を計測した。対照群の取り込 み量力も基礎取り込み量を差し引いた値を 100%とし、取り込み量の 50%阻害する 濃度 (IC 値)を濃度 阻害曲線から最小二乗法により算出した。その結果、実施例
50
1で示したァズレン系化合物 Aのコリン塩及び実施例 2で示したァズレン系化合物 A のコリン塩水和物は、特許文献 1の表 24における実施例 75で示した値（8. 9nM)と 同等の値を示した。
産業上の利用可能性
[0059] 本発明結晶は、保存安定性に優れるとともに、 Na+ グルコース共輸送体阻害作用 及び血糖降下作用を有するため、医薬、特に、糖尿病治療剤として、例えば、インス リン依存性糖尿病（1型糖尿病）、インスリン非依存性糖尿病（2型糖尿病）、インスリン 抵抗性疾患及び肥満の治療、並びにこれらの予防に有効である。
[0060] 本発明結晶の、優れた保存安定性及び顕著な Na+ グルコース共輸送体阻害作 用及び血糖降下作用は、上記に示す保存安定性試験、並びに薬理試験により確認 された。

Claims

請求の範囲
[1] (IS)— 1, 5 アンヒドロ一 1— [5— (ァズレン一 2—ィルメチル） 2 ヒドロキシフ ェ -ル]—D グルシトールのコリン塩。
[2] 示差走査熱量計分析 (DSC分析)で 194〜198°Cに吸熱ピークを有する、（IS)— 1, 5 アンヒドロ一 1— [5— (ァズレン一 2—ィルメチル） 2 ヒドロキシフエ-ル]― D グルシトールのコリン塩結晶。
[3] 粉末 X線回折で 2 Θ (° ) 5. 58、 14. 72、 16. 80、 17. 82、 21. 02及び 22. 46付 近に主ピークを有する、 (1S) - 1, 5 アンヒドロー 1 [5 （ァズレンー2—ィルメチ ル）—2—ヒドロキシフエ-ル]—D グルシトールのコリン塩結晶。
[4] 示差走査熱量計分析 (DSC分析)で 194〜198°Cに吸熱ピークを有するとともに、 粉末 X線回折で 2 0 (° ) 5. 58、 14. 72、 16. 80、 17. 82、 21. 02及び 22. 46付 近に主ピークを有する、 (1S) - 1, 5 アンヒドロー 1 [5 （ァズレンー2—ィルメチ ル）—2—ヒドロキシフエ-ル]—D グルシトールのコリン塩結晶。
[5] 示差走査熱量計分析 (DSC分析)で 78°C付近にブロードな吸熱ピークと、 195〜1 99°Cに吸熱ピークとを有する、 (1S) - 1, 5 アンヒドロ一 1— [5— (ァズレン一 2— ィルメチル） 2—ヒドロキシフエ-ル] D グルシトールのコリン塩水和物結晶。
[6] 粉末 X線回折で 2 0 (° ) 5. 66、 17. 08、 17. 66、 19. 02、 19. 58及び 22. 14付 近に主ピークを有する、 (1S) - 1, 5 アンヒドロー 1 [5 （ァズレンー2—ィルメチ ル）ー2—ヒドロキシフエ-ル] D グルシトールのコリン塩水和物結晶。
[7] 示差走査熱量計分析 (DSC分析)で 78°C付近にブロードな吸熱ピークと、 195〜1 99°Cに吸熱ピークとを有するとともに、粉末 X線回折で 2 0 (° ) 5. 66、 17. 08、 17 . 66、 19. 02、 19. 58及び 22. 14付近【こ主ピークを有する、 (1S) - 1, 5 アンヒド 口一 1— [5— (ァズレン一 2—ィルメチル） 2 ヒドロキシフエ-ル]—D グルシトー ルのコリン塩水和物結晶。
[8] 請求項 1に記載のコリン塩、請求項 2〜4のいずれかに記載のコリン塩結晶又は、 請求項 5〜7のいずれかに記載のコリン塩水和物結晶を有効成分として含有する医 薬組成物。
[9] さらに製薬学的に許容される担体を含有する請求項 8に記載の医薬組成物。 [10] 糖尿病治療剤である請求項 8又は 9に記載の医薬組成物。
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