MX2008000247A - Cristal de la sal de colina del compuesto azuleno. - Google Patents

Abstract

Un cristal de la sal de colina de (1S)-1,5-anhidro-1-[5-azulen-2-i lmetil)-2-hdiroxifenil)-D-glucitol que muestra un pico endotermico a 194 a 198 degree C medido a traves de calorimetria de exploracion diferencial (analisis DSC) y que muestra picos principales a aproximadamente 2((??) 5.58, 14.72, 16.80, 17.82, 21.02, y 22.46 medido por difraccion de polvo para rayos X. De esta forma, un cristal de un compuesto de azuleno se puede producir el cual esta en una sola forma de cristal, tiene una calidad constante, se puede producir con buena calidad de reproduccion, y puede ser provisto establemente como un cristal de una sustancia de farmaco para uso en la preparacion de un farmaceutico y es excelente en estabilidad en almacenamiento.

Description

CRISTAL DE LA SAL DE COLINA DEL COMPUESTO AZULENO CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a una sal de colina, un cristal de la sal de colina y un cristal de hidrato de la sal de colina de (lS)-l,5-anhidro-l- [5-azu en-2-ilmetil) -2-hidroxifenil] -D-glucitol (de aquí en adelante referido para formar de vez en cuando un "compuesto A de azuleno" o simplemente "compuesto A) . Más particularmente, la presente invención se refiere a una sal de colina, un cristal de la sal de colina y un cristal de hidrato de la sal de colina del compuesto A de azuleno que se obtiene con una excelente capacidad de reproducción como cristales con una sola forma de cristal que tiene una calidad constante, de esta forma siendo establemente disponible con un cristal de una sustancia de fármaco utilizada para preparar farmacéuticos, y teniendo una excelente estabilidad en almacenamiento y para una composición farmacéutica particularmente útil como un agente para tratar diabetes . ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Los inventores de la presente invención previamente describieron que (ÍS) -1 , 5-anhidro-l- [5-azulen-2-ilmetil) -2-hidroxifenil] -D-glucitol (compuesto A de azuleno) como un compuesto útil como un farmacéutico, particularmente como un inhibidor del co-transportador de Na+-glucosa, para tratar y prevenir la diabetes, tal como diabetes mellitus dependiente Ref. 189241 de insulina (diabetes de tipo 1) y diabetes mellitus no dependiente de insulina (diabetes de tipo 2), enfermedades con resistencia a insulina, y varias enfermedades asociadas con diabetes que incluyen obesidad (WO 2004/013118 (Documento de Patente 1) , ver Ejemplo 75) . Fórmula Química 1 BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Aunque el Documento de Patente 1 describe un compuesto A de azuleno de forma libre, no existen descripciones específicas de una sal del compuesto A. Como resultado de estudios extensivos sobre el compuesto A de azuleno dé forma libre descrito en el Documento de Patente 1, los inventores han confirmado que existen dos tipos de cristales de hidrato y cinco de cristales de anhídrido. En la forma de cristal del compuesto A de forma libre es variable, y es técnicamente difícil obtener cristales objetivo como una sola forma de cristal en la preparación de un compuesto farmacéutico en bruto con buena calidad de reproducción. Por consiguiente, es técnicamente difícil suministrar establemente cristales para un compuesto farmacéutico en bruto con una calidad constante, y extremadamente difícil a nivel de costo establemente suministrar los cristales del compuesto farmacéutico en bruto. Por consiguiente, ha sido imposible utilizar el compuesto A en forma libre como el compuesto en bruto en la preparación de un farmacéutico en la práctica. Después, como resultado de los estudios extensivos de los cris-tales de la sal de Na, cristales de la sal de K, cristales de la sal de Li, y cristales de la sal de Ca, que son comúnmente utilizados como farmacéuticos y una sustancia de fármaco se encontró que es extremadamente difícil establemente suministrar cristales de la sal de Na, cristales de sal de K, y cristales de la sal de Li, con una calidad constante, ya que estos cristales de sal cambian sus formas al liberar componentes volátiles a una baja temperatura. Además, ya que los cristales de 1/2 de la sal de Ca se obtienen solamente en una forma combinada con dimetilformamida (DMF) , los problemas de toxicidad debido a la DMF son inevitables . La presente invención se logra con el fin de resolver estos problemas y tiene el objeto de proporcionar cristales del compuesto A de azuleno que se obtiene con una excelente calidad de reproducción como una sola forma de cristal que tiene una calidad constante, teniendo una alta posibilidad de ser establemente suministrado como un cristal de una sustancia de fármaco utilizada para preparar farmacéuticos a un costo razonable, y tener una excelente estabilidad en almacenamiento. Con el fin de lograr el objeto antes mencionado, los inventores de la presente invención han conducido estudios extensivos sobre una sal de colina [ (CH3)3N+CHCH2OH] que no se utiliza comúnmente como un farmacéutico. Como resultado, los inventores han encontrado que una sal de colina del compuesto A se puede obtener con una excelente calidad de reproducción como cristales como una sola forma de cristal que tiene una calidad constante, que pueden establemente suministrarse como un cristal de una sustancia de fármaco utilizada para preparar farmacéuticos, y tiene una excelente estabilidad en almacenamiento y que, aunque una sal de colina del compuesto A produce un cristal de hidrato de la sal de colina del compuesto A cuando se procesa bajo condiciones de alta humedad, el cristal de hidrato también puede ser útil como una sustancia de fármaco para preparar farmacéuticos . Estos hallazgos han conducido a la finalización de la presente invención. Es decir, con el fin de obtener el objeto anterior, las siguientes sales de colina, los cristales de la sal de colina, y los cristales de hidrato de la sal de colina del compuesto A de azuleno, es la composición farmacéutica particularmente adecuada como un agente para tratar diabetes son provistos de acuerdo con la presente invención. [1] Una sal de colina de (ÍS) -1, 5-anhidro-1- [5-azulen-2-ilmetil) -2-hidroxif.enil] -D-glucitol . [2] Un cristal de la sal de colina de <1S)-1,5-anhidro-1- [5-azulen-2-ilmetil) -2-hidroxifenil] -D-glucitol que tiene un pico endotérmico a 194 a 198aC medidos a través del análisis de calorimetría de exploración diferencial (análisis DSC) . [3] Un cristal de la sal de colina de (1S)-1,5-anhidro-1- [5-azulen-2-ilmetil) -2-hidroxifenil] -D-glucitol -que tiene picos principales a aproximadamente 2?(a) de 5.58, 14.72, 16.80, 17.82, 21.02, y 22.46 medidos por difracción de polvo para rayos X. [4] Un cristal de la sal de colina de {1S)-1,5-anhidro-1- [5-azulen-2-ilmetil) -2-hidroxifenil] -D-glucitol -que tiene un pico endotérmico de 194 a 198aC medido a través del análisis de calorimetría de exploración diferencial {análisis DSC) y picos principales a aproximadamente 2?(e) de 5.58, 14.72, 16.80, 17.82, 21.02, y 22.46 medidos por difracción de polvo para rayos X. [5] Un cristal de hidrato de la sal de colina de (ÍS) -1, 5-anhidro-l-{5-azulen-2-ilmetil) -2-hidroxifenil] -D-glucitol que tiene un pico endotérmico amplio a aproximadamente 78SC y un pico endotérmico a 195 a 199aC medido a través del análisis de calorimetría de exploración diferencial (análisis DSC) . [6] Un cristal de hidrato de la sal de colina de (1S) -1, 5-anhidro-l- [5-azulen-2-ilmetil) -2-hidroxifenil] -D-glucitol que tiene picos principales de aproximadamente 2? ( a ) de 5.66, 17.08, 17.66, 19.02, 19.58, y 22.14 medidos por difracción de polvo para rayos X. [7] Un cristal de hidrato de la sal de colina de (1S) -1, 5-anhidro-l- [5-azulen-2-ilmetil) -2-hidroxifenil] -D-glucitol que tiene un pico endotérmico amplio a aproximadamente 78SC y un pico endotérmico a 195 a 199SC medidos a través del análisis de calorimetría de exploración diferencial (análisis DSC) y picos principales a aproximadamente 2?(a) de 5.66, 17.08, 17.66, 19.02, 19.58, y 22.14 medidos por difracción de polvo para rayos X. [8] Una composición farmacéutica que comprende el cristal de la sal de colina de acuerdo con [1] , el cristal de sal de colina de acuerdo con .cualquiera de [2] a [4] , o el cristal del hidrato de sal de colina de acuerdo con cualquiera de [5] a [7] como un ingrediente efectivo. [9] La composición farmacéutica de acuerdo con [8], que además comprende un excipiente farmacéuticamente aceptable. [10] La composición farmacéutica de acuerdo con [8] o [9] que es un agente para tratar diabetes . Una sal de colina, un cristal de la sal de colina, y un cristal de hidrato de la sal de colina del compuesto A de azuleno se puede obtener con una excelente calidad de reproducción como cristales como una sola forma de cristal que tiene una calidad constante, de esta forma siendo establemente suministrado como un cristal de una sustancia de fármaco utilizada para preparar farmacéuticos, y que tiene excelente estabilidad en almacenamiento, y una composición farmacéutica particularmente útil como u agente para tratar diabetes se proporcionan de acuerdo con la presente invención. BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La Figura 1 es una gráfica del análisis de calorimetría de exploración diferencial (gráfica del análisis DSC) de los cristales 4-<azulen-2-ilmetil) -2-ß-D-glucopiranosilfenolato de [ (2-hidroxietil) trimetilamonio] (sal de colina del compuesto A de azuleno) . La Figura 2 es una gráfica de difracción de polvo para rayos X de cristales de 4- (azulen-2-ilmetil) -2-ß-D-glucopiranosilfenolato . de [ (2-hidroxietil) trimetilamonio] (sal de colina del compuesto A de azuleno) . La Figura 3 es una gráfica del análisis de calorimetría de exploración diferencial (gráfica de análisis DSC) de un hidrato de 4- (azulen-2-ilmetil) -2-ß-D-glucopiranosilfenolato de [ (2-hidroxietil) trimetilamonio] (hidrato de la sal de colina del compuesto A de azuleno) . La Figura' 4 es una gráfica de la difracción de polvo para rayos X de cristales de un hidrato de 4-(azulen-2-ilmetil) -2-ß-D-glucopiranosilfenolato de [ (2-hidroxietil) trimetilamonio] {hidrato de la sal de colina del compuesto A de azuleno) . La Figura 5 es una gráfica del análisis de calorimetría de exploración diferencial {gráfica del análisis DSC) de cristales de [4- (azulen-2-ilmetil) -2-ß-D-glucopiranosilfenolato de sodio] (sal de sodio del compuesto A de azuleno) . La Figura 6 es una gráfica de difracción de polvo para rayos X de los cristales de [4- {azulen-2-ilmetil) -2-ß-D-glucopiranosilfenolato de sodio] (sal de sodio del compuesto A de azuleno) . La Figura 7 es una gráfica del análisis de calorimetría de exploración diferencial (gráfica del análisis DSC) de los cristales de [4-{azulen-2-ilmetil) -2-ß-D-glucopiranosilfenolato de potasio] (sal de potasio del compuesto A de azuleno) . La Figura 8 es una gráfica de difracción de polvo para rayos X de cristales de [4- (azulen-2-ilmetil)~2-ß-D-glucopiranosilfenolato de potasio] {sal de potasio del compuesto A de azuleno) . La Figura 9 es una gráfica del análisis del calorimetría de exploración diferencial (-gráfica del análisis DSC) de los cristales de [4- (azulen-2-ilmetil) -2-ß-D- glucopiranosilfenolato de litio] (sal de litio del compuesto A de azuleno) . La Figura 10 es una gráfica de difracción de polvo para rayos' X de cristales de [4- (azulen-2-ilmetil) -2-ß-D-glucopiranosilfenolato de litio] (sal de litio del compuesto A de azuleno) . La Figura 11 es una gráfica del análisis de calorimetría de exploración diferencial (gráfica del análisis DSC) de los cristales de [4-{azulen-2-ilmetil) -2-ß-D-glucopiranosilfenolato de hemicalcio] (1/2- de la sal de calcio del compuesto A de azuleno) . La Figura 12 es una gráfica de difracción de polvo para rayos X de cristales de [4- (azulen-2-ilmetil) -2-ß-D-glucopiranosilfenolato de hemicalcio] (1/2 de la sal de calcio del compuesto A de azuleno) • La Figura 13 es una gráfica del análisis de calorimetría de exploración diferencial (gráfica del análisis DSC) del íhidrato del cristal-1 de (ÍS) -1,5-anhidro-l- [5-azulen-2-ilmetil) -2-hidroxifenil] -D-glucitol] (hidrato de cristal-1 del compuesto A de azuleno) . La Figura 14 es una gráfica de difracción de polvo para rayos X del {hidrato del cristal-1 de (1S) -1,5-anhidro- 1- [5-azulen-2-ilmetil) -2-hidroxifenil] -D-glucitol] {hidrato de cristal-1 del compuesto A de azuleno) . La Figura 15 es una gráfica del análisis de calorimetría de exploración diferencial (gráfica del análisis DSC) del [hidrato del cristal-2 de (ÍS) -1,5-anhidro-l- [5-azulen-2-ilmetil) -2-hidroxifenil] -D-glucitol] (hidrato de cristal-2 del compuesto A de azuleno) . La Figura 16 es una gráfica de difracción de polvo para rayos X del [hidrato del cristal-2 de (1S) -1, 5-anhidro-1- [5-azulen-2-ilmetil) -2-hidroxifenil] -D-glucitol] (hidrato de cristal-2 del compuesto A de azuleno) . La Figura 17 es una gráfica de difracción de la energía de rayos X (calentamiento de la energía de rayos X) del [anhídrido del cristal-1 de (1S) -1, 5-anhidro-l- [5-azulen-2-ilmetil) -2-hidroxifenil] -D-glucitol] (anhídrido de cristal-1 del compuesto A de azuleno) . La Figura 18 es una gráfica de difracción de polvo para rayos X (calentamiento por energía de rayos X) del [anhídrido del cristal-1 de (ÍS) -1, 5-anhidro-l- [5-azulen-2-ilmetil) -2-hidroxifenil] -D-glucitol] (anhídrido de cristal-2 del compuesto A de azuleno) . La Figura 19 es una gráfica del análisis de calorimetría de exploración diferencial (gráfica del análisis DSC) del [anhídrido del cristal-3 de (ÍS) -1, 5-anhidro-l- [5-azulen-2-ilmetil) -2-hidroxifenil] -D-glucitol] (anhídrido de cristal-3 del compuesto A de azuleno) . La Figura 20 es una gráfica de difracción de polvo para rayos X del [anhídrido del cristal-3 de (1S)-1,5- anhidro-1- [5-azulen-2-ilmetil) -2-hidroxifenil] -D-glucitol] (anhídrido de cristal-3 del compuesto A de azuleno) . La Figura 21 es una gráfica del análisis de calorimetría de exploración diferencial (gráfica del análisis DSC) del [anhídrido del cristal-4 de (1S) -1, 5-anhidro-l- [5-azulen-2-ilmetil) -2-hidroxifenil] -D-glucitol] -(anhídrido de cristal-4 del compuesto A de azuleno) . La Figura 22 es una gráfica de difracción de la energía de rayos X del [anhídrido del cristal-4 de {1S)-1,5-anhidro-l-[5-azulen-2-ilmetil) -2-hidroxifenil] -D-glucitol] (anhídrido de cristal-4 del compuesto A de azuleno) . La Figura 23 es una gráfica del análisis de calorimetría de exploración diferencial (gráfica del análisis de DSC) del [anhídrido del cristal-5 de (1S) -1, 5-anhidro-l- [5-azulen-2-ilmetil) -2-hidroxifenil] -D-glucitol] (anhídrido de cristal-5 del compuesto A de azuleno) . La Figura 24 es una gráfica de difracción de polvo para rayos X del [anhídrido del cristal-5 de (1S)-1,5-anhidro-l-[5-azulen-2-ilmetil) -2-hidroxifenil] -D-glucitol] (anhídrido de cristal-5 del compuesto A de azuleno) . DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN El mejor modo de llevar a cabo la presente invención se describirá a continuación. Una sal de colina, un cristal de la sal de colina, un cristal del hidrato de la sal de colina (de aquí adelante referido para formar de vez en cuando "cristales de la invención") del compuesto de azuleno A ( (1S) -l,5-anhidro-l-í5-azulen-2-ilmetil) -2-hidroxifenil] -D-glucitol) que tiene estructuras químicas mostradas a continuación. Como se mencionó anteriormente, a diferencia de los dos tipos de cristales de hidrato, cinco tipos de cristales de anhídrido, cristales de la sal de Na, cristales de la sal de K, cristales de la sal de Li, cristales de la sal de CA del compuesto A de azuleno de forma libre, los cristales de la presente invención se obtienen con una excelente calidad de reproducción como cristales como una sola forma de cristal que tiene calidad constante, que pueden establemente ser suministrados como un cristal de una sustancia de fármaco utilizada para preparar farmacéuticos, y tiene excelente estabilidad en almacenamiento. La diferencia de estas formas de cristal se puede distinguir a través del un análisis de calorímetro de exploración diferencial (análisis DSC) , y difracción de polvo para rayos X. "Los cristales de la invención" incluyen, además de los cristales de la sal de colina y los cristales del hidrato de colina antes mencionados, una mezcla de cristales de la sal de colina y cristales del hidrato del hidrato de la sal de colina y una mezcla del cristal de la sal de colina y el cristal del hidrato de la sal de colina.

Fórmula Química 2 Fórmula Química 3 Específicamente, entre los cristales de la invención, el cristal de la sal de colina tiene un pico endotérmico a 194 a 198aC medido a través de calorimetría de exploración diferencial (análisis DSC) y/o tiene picos principales a aproximadamente 2?(a) de 5.58, 14.72, 16.80, 17.82, 21.02, y 22.46 medidos por difracción de polvo para rayos X, y el cristal del hidrato de la sal de colina tiene un pico endotérmico amplio a aproximadamente 78aC y un pico endotérmico a 195 a 19 aC medido a través de calorimetría de exploración diferencial (análisis DSC) y/o picos a aproximadamente 2?(a) de 5.66, 17.08, 17.66, 19.02, 19.58, y 22.14 medidos por difracción de polvo para rayos X. Entre los cristales de la invención, el cristal de la sal de colina y el cristal del hidrato de la sal de colina se caracterizan a través del ángulo de difracción (2?(2)) y la intensidad relativa medida a través de difracción de polvo para rayos X, las cuales respectivamente se muestran en la Tabla 1 y Tabla 2. Debido a la naturaleza de los datos obtenidos a través de la difracción de polvo para rayos X, el intervalo de la estructura de cristal y el patrón global son importantes en la identificación de los cristales, y la intensidad relativa, la cual más o menos varía de acuerdo con la dirección del crecimiento del cristal, el tamaño de las partículas, y las condiciones de medición, no deberán estrictamente ser construidas. TABLA 1 TABLA 2 El análisis de difracción de polvo para rayos X y calorimetría de exploración diferencial (análisis DSC) se condujeron bajo las siguientes condiciones. (Difracción de polvo para rayos X) Se utilizó "MAC Science MXP1STAHF22" equipado con un tubo de rayos X de cobre bajo las condiciones de una corriente de 40 mA, un voltaje de tubo de 40 ó 200 kV, un ancho de muestreo de 0.020a, un grado de exploración de 3a/minuto, una longitud de onda de 1.54056 Á, y ángulos de medición del rango de difracción de (2?) : 3 ó 5 a 40aC. {Análisis de calorímetro de exploración diferencial (análisis DSC) ) Se utilizó "TA Instru ent TA 5000" a una temperatura de temperatura ambiente a 30 aC (1 aC/min) y Tin grado de alimentación N2 de 50 ml/min utilizando una charola de muestreo de aluminio. (Método de preparación) Los cristales de la invención se pueden preparar a partir del compuesto A de azuleno de forma libre descrito en el Ejemplo 75 del Documento de Patente 1 a través de una reacción formadora de sal común. La composición farmacéutica de la presente invención contiene cristales de la invención y además puede comprender un excipiente farmacéuticamente aceptable, y es particularmente útil como un agente para el tratamiento contra la diabetes.

La composición farmacéutica que contiene uno o dos o más de los tipos de cristales de la invención como ingredientes efectivos se puede formar en tabletas, polvos, granulos delicados, granulos, cápsulas, pildoras, preparaciones líquidas, inyecciones, supositorios, ungüentos, agentes en pasta, y similares, utilizando excipientes, vehículos y otros aditivos que se utilizan comúnmente para preparar farmacéuticos. Estas preparaciones se administran oral o no oralmente. Aunque una dosis química de los cristales de la invención para un ser humano es apropiadamente determinada tomando en consideración los síntomas, peso, edad, sexo, y similares del paciente al cual se administra el farmacéutico, una dosis diaria para un adulto es usualmente de 0.1 a 500 mg por administración oral y 0.01 a 100 mg por administración no oral . Estas dosis se prescriben al paciente para una sola vez o a través de varias aplicaciones. Ya que una dosis fluctúa de acuerdo con las varias condiciones, una dosis más pequeña que el rango anterior es suficiente en algunos casos . Una tableta, un polvo, un granulo y similar se utilizan como una composición sólida de los cristales de la invención para administración oral. En tal composición sólida, uno o más compuestos activos se mezclan con por lo menos un diluyente inerte tal como lactosa, manitol, glucosa, hidroxipropilcelulosa, celulosa microcristalina, almidón, polivinilpirrolidona, y aluminometasilicato de magnesio. De acuerdo con la práctica común, la composición puede contener aditivos diferentes del diluyente inerte. Por ejemplo, un lubricante tal como estearato de magnesio, un disgregante como ácido glicólico de celulosa de calcio, un estabilizador tal como lactosa, y se puede agregar un agente solubilizador o un adyuvante solubilizante tal como ácido glutámico o ácido aspártico. Según se requiere, las tabletas o pildoras pueden ser provistas como un recubrimiento de azúcar tal como un recubrimiento de sacarosa, gelatina, hidroxipropilcelulosa, o ftalato de hidroxipropilmetilcelulosa, o una película de una sustancia entérica o soluble en el estómago. La composición líquida para administración oral contiene un emulsificador farmacéuticamente aceptable, un agente de solución, un agente de suspensión, jarabe, elíxir y similar, así como un diluyente inerte común tal como agua purificada y alcohol etílico. Además de los diluyentes inertes, la composición puede contener un agente de ayuda tal como un agente solubilizante, un adyuvante solubilizante, un agente humectante, y un agente de suspensión, así como un edulcorante, agente saborizante, un perfume, y un agente antiséptico. La preparación de inyección para ser administrada no de forma oral contiene un agente de solución acuoso estéril o no acuoso, un agente de suspensión, y un emulsificante. Como ejemplos del agente de solución acuosa y el diluyente acuoso para un agente de suspensión, el agua destilada para inyección y una solución salina fisiológica pueden darse. Como ejemplos del ag.ente de solución no acuoso y diluyente no acuoso de un agente de suspensión, los aceites vegetales tales como propilenglicol, polietilenglicol, y aceite de olivo; alcoholes tales como alcohol etílico; y Polisolvato 80 (nombre comercial) pueden ser dados. La composición además puede contener otros aditivos tales como un agente isotónico, un agente antiséptico, un agente de humectación, un emulsificante, un dispersante, un estabilizador (por ejemplo, lactosa) , un agente solubilizante, y un adyuvante solubilizante. Estos aditivos están esterilizados a través de filtración a través de un filtro de suspensión de bacteria además de un desinfectante, o irradiación. Una composición sólida estéril se puede preparar a partir de estos aditivos y disolverse en agua aséptica o un solvente estéril para inyección antes del uso. Ejemplos La presente invención se describirá con mayor detalle por medio de los ejemplos que no pretenden ser limitantes de la presente invención.

Ejemplo 1 Cristal de 4- (azulen-2-ilmetil) -2-ß-D-glucopiranosilfenolato de [ (2-hidroxietil) trimetilamonio] (sal de colina del compuesto A de azuleno) . Se agregó hidróxido de colina (solución acuosa al 50%) (0.06 ml) a una solución de (ÍS) -1, 5-anhidro-l- [5-azulen-2-ilmetil)-2-hidroxifenil] -D-glucitol (1.0 g) en metanol (10 ml) , y la mezcla se agitó a temperatura ambiente. El solvente se evaporó bajo presión reducida, y se co-evaporó con tolueno, seguido por secado bajo presión reducida. Después de la adición de etanol (20 ml) , la mezcla se calentó con agitación hasta que se disolvió completamente el residuo. La mezcla se dejó enfriar a temperatura ambiente. Los cristales depositados se recolectaron a través de filtración, se lavaron con etanol, y se secaron a 50aC bajo presión reducida. Después de la adición de etanol {46 ml) al sólido resultante (1.15 g) , la mezcla se calentó con agitación hasta que se disolvió completamente el sólido. La mezcla se dejó enfriar a temperatura ambiente. Los cristales depositados se recolectaron a través de filtración, se lavaron con etanol, y se secaron a 50-C bajo presión reducida para obtener 4- (azulen-2-ilmetil) -2-ß-D-glucopiranosilfenolato de [ (2-hidroxietil) trimetilamonio] (1.02). Una gráfica calorimétrica de exploración diferencial (gráfica del análisis DSC) se muestra en la Figura 1, y la gráfica de difracción de polvo para rayos X se muestra en la Figura 2. Ejemplo 2 Cristal de 4- (azulen-2-ilmetil) -2-ß-D-glucopiranosilfenolato de [ (2-hidroxietil) trimetilamonio] (hidrato de la sal de colina del compuesto A de azuleno) . Se conservó 4- (azulen-2-ilmetil) -2-ß-D-glucopiranosilfenolato de (2-hidroxietil) trimetilamonio (sal de colina) {1.00 g) durante una semana en un desecador en donde se ajustó la humedad relativa a 93% utilizando nitrato de potasio a 25aC para obtener cristales de hidrato de 4- (azulen-2-ilmetil) -2-ß-D-glucopiranosilfenolato de [ (2-hidroxietil) trimetilamonio] (hidrato de la sal de colina) (1.04 g) . La gráfica de calorimetría de exploración diferencial (gráfica DSC) se muestra en la Figura 3, y la gráfica de difracción de polvo para rayos X se muestra en la Figura 4. Ejemplo Comparativo 1 Cristales de [4- (azulen-2-ilmetil) -2-ß-D-glucopiranosilfenolato de sodio] (sal de sodio del compuesto A de azuleno. Se agregó etanol (10 ml) y metanol {10 ml) a (1S)- 1, 5-anhidro-l-[5-azulen-2-ilmetil) -2-hidroxifenil] -D-glucitol (991 mg) . Después de la adición de ÍM de solución acuosa de hidróxido de sodio {2.5 ml) , la mezcla se agitó a temperatura ambiente. El solvente se evaporó bajo presión reducida y se co-evaporó con tolueno, seguido por destilación azeotrópica. El sólido resultante se secó a 55aC bajo presión reducida. Se agregó una mezcla de 5:1 de 2-propanol y agua (7.2 ml) al sólido (360 mg) , y la mezcla se calentó con agitación hasta que se disolvió completamente el sólido. Después de dejar que la mezcla se enfriara a temperatura ambiente, los cristales depositados se recolectaron a través de filtración, se lavaron con una mezcla de 5:1 de 2-propanol y agua, y se secaron a 45aC bajo presión reducida para obtener 4- (azúlen2-ilmetil) -2-ß-D-glucopiranosilfenolato de sodio (193 mg) . Ya que los cristales resultantes cambiaron la forma debido a la disociación de los componentes volátiles a baja temperatura, fue muy difícil establemente suministrar un producto con una calidad constante. Una gráfica calorimétrica de exploración diferencial (gráfica DSC) se muestra en la Figura 5, y la gráfica de difracción de polvo para rayos X se muestra en la Figura 6. Ejemplo Comparativo 2 Cristales de 4- {azulen-2-ilmetil) -2-ß-D-glucopiranosilfenolato de potasio (sal de potasio del compuesto A de azuleno) . Los cristales de 4- (azulen-2-ilmetil) -2-ß-D-glucopiranosilfenolato de potasio se obtendrán en la misma forma que en el Ejemplo comparativo 1, excepto que se utilizó ÍM de solución acuosa de hidróxido de potasio en lugar de ÍM de solución acuosa de hidróxido de sodio . Ya que los cristales resultantes cambiaron de forma debido a la disociación de los componentes volátiles a baja temperatura, fue muy difícil establemente suministrar un producto con una calidad constante. La gráfica calorimétrica de exploración diferencial {gráfica DSC) se muestra en la Figura 7, y la gráfica de difracción de polvo para rayos X se muestra en la Figura 8. Ejemplo Comparativo 3 Cristales de [4- (azulen-2-ilmetil) -2-ß-D-glucopiranosilfenolato de litio] (sal de litio del compuesto A de azuleno) . Los cristales de 4- (azulen-2-ilmetil) -2-ß-D-glucopiranosilfenolato de litio se obtuvieron en la misma forma que en el Ejemplo 1 excepto por el uso de ÍM de solución acuosa de hidróxido de litio en lugar de ÍM de solución acuosa de hidróxido de sodio. Ya que los cristales resultantes cambiaron de forma debido a la disociación de los componentes volátiles a baja temperatura, fue muy difícil establemente suministrar un producto con una calidad constante. Una gráfica calorimétrica de exploración diferencial (gráfica DSC) se muestra en la Figura 9, y la gráfica de difracción de polvo para rayos X se muestra en la Figura 10.

Ejemplo Comparativo 4 Cristales de [4-{azulen-2-ilmetil) -2-ß-D-glucopiranosilfenolato de hemicalcio (1/2 de sal de calcio del compuesto A de azuleno) . Se agregó metanol (3.5 ml) y ÍM de solución acuosa de hidróxido de sodio (2.15 ml) a [ (ÍS) -1, 5-anhidro-l- [5-azulen-2-ilmetil) -2-hidroxifenil] -D-glucitol (850 mg) y la mezcla se agitó a temperatura ambiente. El solvente se evaporó bajo presión reducida, y el residuo se disolvió en agua (15 ml) . Después de la adición de una solución de cloruro de calcio {477 mg) en agua {2.5 ml) , la mezcla se agitó a temperatura ambiente. El sólido depositado se recolectó a través de_ filtración y se lavó . con agua y 2-propanol . El sólido resultante se secó con calentamiento bajo presión reducida. Se agregó tetrahidrofurano al sólido, y los componentes insolubles se removieron a través de filtración. El filtrado se concentró, y el sólido resultante se secó con calentamiento bajo presión reducida. Se agregó dimetilformamida (DMF) (1.0 ml) y agua (2.0 ml) al sólido (200 mg) , y la mezcla se calentó con agitación hasta que el sólido se disolvió completamente. Después de dejar la mezcla se enfriara a temperatura ambiente, los cristales depositados se recolectaron a través de filtración, se lavaron con agua, y se secaron a 60SC bajo presión reducida para obtener 4- (azulen-2-ilmetil) -2-ß-D-glucopiranosilfenolato de hemicalcio (65 mg) . Los cristales se obtuvieron solamente en una forma combinada con DMS que causó un problema de toxicidad. Una gráfica calorimétrica de exploración diferencial (gráfica DSC) se muestra en la Figura 11, y la gráfica de difracción de polvo para rayos X se muestra en la Figura 12 , Ejemplo Comparativo 5 [Hidrato del cristal-1 de (1S)-1, 5-anhidro-l- [5-azulen-2-ilmetil)-2-hidroxifenil] -D-glucitol] (hidrato del cristal-1 del compuesto A de azuleno) . Una mezcla de 1:1 de 2-propanol y agua (7.5 ml) se agregó a (1S)-1, 5-anhidro-l- [5-azulen-2-ilmetil) -2-hidroxifenil] -D-glucitol (300 mg) , y la mezcla se calentó con agitación hasta que el sólido se disolvió completamente. Después de dejar que la mezcla se enfriara a temperatura ambiente, los cristales depositados se recolectaron a través de filtración, se lavaron con una mezcla de 1:2 de 2-propanol y agua, y se secó a 45aC bajo presión reducida para obtener el hidrato del cristal-1 de (ÍS) -1, 5-anhidro-l- [5-azulen-2- ilmetil) -2-hidroxifenil] -D-glucitol (222 mg) . Los cristales se deshidrataron a través de calentamiento o secado bajo •presión reducida, y tuvieron características de ser transformados en el anhídrido del cristal-3 del compuesto A de azuleno. Sin embargo, la transformación en el anhídrido del cristal-1 del compuesto A de azuleno y el anhídrido del cristal-2 del compuesto A de azuleno que tomó lugar en el curso de la transformación en el anhídrido del cristal-3 difirió -entre los lotes. La calidad de reproducción de esta forma no se logró a través de la recristalización. La gráfica calorimétrica de exploración diferencial (gráfica DSC) se muestra en la Figura 13, y la gráfica de difracción de polvo para rayos X se muestra en la Figura 14. Ejemplo Comparativo 6 [Hidrato del cristal-2 de (ÍS) -1, 5-anhidro-l- [5-azulen-2-ilmetil) -2-hidroxifenil] -D-glucitol] {hidrato del cristal-2 del compuesto A de azuleno) . Se agregó etanol (2.0 ml) a (ÍS) -1, 5-anhidro-l- [5-azulen-2-ilmetil) -2-hidroxifenil] -D-glucitol (500 mg) , y la mezcla se calentó con agitación hasta que el sólido se disolvió completamente. Después de dejar la mezcla enfriar a temperatura ambiente, los cristales depositados se recolectaron a través de filtración, se lavaron con etanol, y se secaron a 45aC bajo presión reducida para obtener el hidrato del cristal-2 de (1S) -1, 5-anhidro-l-[5-a-zulen-2-ilmetil) -2-hidroxifenil] -D-glucitol (122 mg) . Los cristales se obtuvieron solamente en un lote a través de recristalización, indicando que no hubo reproducción. En la gráfica calorimétrica de exploración diferencial {gráfica DSC) se muestra en la Figura 15, y la gráfica de difracción de polvo para rayos X se muestra en la Figura 16.

Ejemplo Comparativo 7 [Anhídrido del crital-1 (ÍS) -1, 5-anhidro-l- [5-azulen-2-ilmetil) -2-hidroxifenil] -D-glucitol] (anhídrido del cristal-1 del compuesto A de azuleno) . El hidrato del cristal-1 de (1S) -1, 5-anhidro-l- [5-azulen-2-ilmetil) -2-hidroxifenil] -D-glucitol obtenido en el Ejemplo Comparativo 5 se colocó .en una charola de muestreo de aluminio para un uso exclusivo con un analizador de calorimetría de exploración diferencial (analizador DSC) y se calentó bajo una atmósfera de nitrógeno a una velocidad de 102C/min para confirmar la producción del anhídrido del cristal-1 de {lS)-l,5-anhidro-l-[5-azulen-2-ilmetil)-2-hidroxifenil] -D-glucitol a aproximadamente 100aC. El hidrato del cristal-1 de (1S) -1, 5-anhidro-l- [5-azulen-2-ilmetil) -2-hidroxifenil] -D-glucitol obtenido en el Ejemplo Comparativo 5 se colocó en una placa de muestreo de cobre para el uso exclusivo con un aparato de difracción de polvo para rayos X de calentamiento para analizar la difracción de polvo para rayos X en una atmósfera de nitrógeno a 100aC. La producción del anhídrido del cristal-1 de (ÍS) -1, 5-anhidro-l- [5-azulen-2-ilmetil) -2-hidroxifenil] -D-glucitol se confirmó. Este cristal, el cual se produjo a través de un tratamiento de calor del hidrato del cristal-1 del compuesto A de azuleno, es estable solamente a alta temperatura y no se puede aislar a temperatura ambiente. La gráfica de difracción de polvo para rayos X (calentamiento por energía de rayos X) se muestra en la Figura 17. Ejemplo Comparativo 8 [Anhídrido del cristal-2 de (ÍS) -1, 5-anhidro-l-[5-azulen-2-ilmetil) -2-hidroxifenil] -D-glucitol] (anhídrido del cristal-2 del compuesto A de azuleno) . El hidrato del cristal-1 de (ÍS) -1, 5-anhidro-l- [5-azulen-2-ilmetil) -2-hidroxifenil] -D-glucitol obtenido en el Ejemplo Comparativo 5 se colocó en una charola de muestreo de aluminio para un uso exclusivo con un analizador DSC y se calentó bajo una atmósfera de nitrógeno a una velocidad de 102C/min para confirmar la producción del anhídrido del cristal-2 de (ÍS) -1, 5-anhidro-l- [5-azulen-2-ilmetil) -2-hidroxifenil] -D-glucitol a aproximadamente 140aC. El hidrato del cris-tal-1 de (1S) -1, 5-anhidro-l- [5-azulen-2-ilmetil) -2-hidroxifenil] -D-glucitol obtenido en el Ejemplo Comparativo 5 se colocó en una placa de. muestreo de cobre para el uso exclusivo con un aparato de difracción de polvo para rayos X de calentamiento para analizar la difracción de polvo para rayos X en una atmósfera de nitrógeno a aproximadamente 140aC para obtener el anhídrido del cristal-2 de (ÍS) -1, 5-anhidro-1- [5-azulen-2-ilmetil) -2-hidroxifenil] -D-glucitol . Este cristal, el cual se produjo a través de un tratamiento de calor del hidrato del cristal-1 de los compuestos A de azuleno, es estable solamente a alta temperatura y no se puede aislar a temperatura ambiente. La gráfica de difracción de polvo para rayos X (calentamiento por energía de rayos X) se muestra en la Figura 18. Ejemplo Comparativo 9 [Anhídrido del cristal-3 (ÍS) -1, 5-anhidro-l- [5-azulen-2-ilmetil) -2-hidroxifenil] -D-glucitol] {anhídrido del cristal-3 del compuesto A de azuleno) . El hidrato del cristal-1 (ÍS) -1, 5-anhidro-l- [5-azulen-2-ilmetil) -2-hidroxifenil] -D-glucitol obtenido en el Ejemplo Comparativo 5 se colocó en una charola de muestreo de aluminio para un uso exclusivo con un analizador de calorimetría de exploración diferencial {analizador DSC) y se calentó a 150aC en una atmósfera de nitrógeno a una velocidad de 10aC/min para confirmar la producción del anhídrido del cristal-3 de (ÍS) -1, 5-anhidro-l- [5-azulen-2-ilmetil) -2-hidroxifenil] -D-glucitol . Este cristal se produjo solamente a través de un tratamiento de calor del hidrato del cristal-1 de los compuestos A de azuleno, y no se pudo obtener a través de recristalización. Una gráfica calorimétrica de exploración diferencial (gráfica DSC) se muestra en la Figura 19, y la gráfica de difracción de polvo para rayos X se muestra en la Figura 20.

Ejemplo Comparativo 10 [Anhídrido del cristal-4 (ÍS) -1, 5-anhidro-l- [5-azulen-2-ilmetil) -2-hidroxifenil] -D-glucitol] {anhídrido del cristal-4 del compuesto A de azuleno) . El hidrato del cristal-2 de (ÍS) -1, 5-anhidro-l- [5-azulen-2-ilmetil) -2-hidroxifenil] -D-glucitol obtenido en el Ejemplo Comparativo 6 se colocó en una charola de muestreo de aluminio para un uso exclusivo con un analizador de calorimetría de exploración diferencial (analizador DSC) y s calentó a 185aC en una atmósfera de nitrógeno a una velocidad de 10aC/min para confirmar la producción del anhídrido del cristal-4 de (ÍS) -1, 5-anhidro-l- [5-azulen-2-ilmetil) -2-hidroxifenil] -D-glucitol. Este cristal se produjo solamente a través de un tratamiento de calor del hidrato del cristal-2 de los compuestos A de azuleno, y no se pudo obtener a través de recristalización. Una gráfica calorimétrica de exploración diferencial (gráfica DSC) se muestra en la Figura 21, y la gráfica de difracción de polvo para rayos X se muestra en la Figura 22. Ejemplo Comparativo 11 [Anhídrido del cristal-5 (1S) -1, 5-anhidro-l- [5-azulen-2-ilmetil) -2-hidroxifenil] -D-glucitol] (anhídrido del cristal-5 del compuesto A de azuleno) . Se agregó acetonitrilo (3.0 ml) al (15) -1,5-anhidro-1- [5-azulen-2-ilmetil) -2-hid oxifenil] -D-glucitol (300 mg) , y la mezcla se calentó con agitación hasta que el sólido se disolvió completamente. Después de dejar enfriar la mezcla a temperatura ambiente, los cristales depositados se recolectaron a través de filtración, se lavaron acetonitrilo, y se secaron a 452C bajo presión reducida para obtener el anhídrido del cristal-5 de (ÍS) -1, 5-anhidro-l-{5-azulen-2-ilmetil) -2-hidroxifenil] -D-glucitol {101 mg) . El cristal se obtuvo solamente en un lote a través de recristalización, indicando que no hubo reproducción. Se confirmaron dos picos exotérmicos en el análisis de calorimetría de exploración diferencial (análisis DSC) sugiriendo una inhabilidad para producir cristales como una sola forma de cristal. Una gráfica calorimétrica de exploración diferencial (gráfica DSC) se muestra en la Figura 23, y la gráfica de difracción de polvo para rayos X se muestra en la Figura 24. Prueba de Estabilidad en Almacenamiento Se colocó (2-hidroxietil) trimetilamonio-4-{azulen-2-ilmetil) -2-ß-D-glucopiranosilfenolato (46 g) en una bolsa de polietileno, y la abertura de la bolsa se cerró con una banda de cordón. La bolsa se colocó en otra bolsa de polietileno conteniendo gel de sílice (12 g) . La abertura de la bolsa se cerró con una banda de cordón. La bolsa se colocó en una lata metálica, la cual se selló herméticamente y se almacenó en un lugar oscuro a 40aC y 75% de HR durante 6 meses. Aparte de esto, se colocó (2- hidroxietil) trimetilamonio-4- (azulen-2-ilmetil) -2-ß-D-glucopiranosilfenolato (10 g) en un contenedor café abierto y se almacenó en un lugar oscuro a 40aC y 75% de HR durante 6 meses . Los resultados se muestran en la Tabla 3. TABLA 3 * El compuesto se confirmó que cambia en hidrato inmediatamente después del inicio del almacenamiento bajo las condiciones anteriores .

Con base en los resultados en la Tabla 3, en donde no se vio ningún cambio en la cantidad y el valor cuantitativo de los compuestos análogos, tanto el anhídrido como el hidrato de 4- (azulen-2-ilmetil) -2-ß-D-glucopiranosilfenolato de [ (2-hidroxietil) trimetilamonio] se confirmaron como siendo compuestos estables. A partir de los resultados de los ejemplos anteriores y los ejemplos comparativos, se puede ver que la sal del compuesto A de azuleno con una base tal como sodio, potasio, litio, o calcio -que son comúnmente utilizados en medicinas tienen un forma transformable a través de la disociación de los componentes volátiles a una temperatura baja. Además, los cristales de la sal de 1/2 que pueden existir solamente en una forma combinada con DMF tienen un problema de toxicidad causada por el DMF. De esta forma, los cristales no se pueden utilizar como farmacéuticas. Además, existen siete tipos de formas de cristal en el compuesto A de azuleno en forma libre, es decir, el hidrato del cristal-1, el hidrato del cristal-2, el anhídrido del cristal-1, el anhídrido del cristal-2, el anhídrido del cristal-3, el anhídrido del cristal-4, y el anhídrido del cristal-5. Algunos de estos cristales se transformaron en otras formas de cristal, algunos cristales se pueden reproducir solamente con dificultad o pueden establemente existir solamente a alta temperatura, involucrando la dificultad en el aislamiento a temperatura ambiente, y otros cristales se pueden producir solamente a través de tratamiento con calor. Estos cristales se pueden obtener en algunos casos pero no se pueden obtener en otros casos, utilizando las mismas condiciones. De esta forma es difícil obtener cristales como una sola forma de cristal controlando la producción de los polimorfos. Por consiguiente, se ha encontrado que un producto farmacéutico no se puede producir a partir de cristales del compuesto A de azuleno de forma libre.

A diferencia de los cristales de varias sales y los cristales del compuesto A de azuleno de forma libre, los cristales de la invención se pueden producir como cristales como una sola forma de cristal con excelente calidad de reproducción, pueden establemente ser suministrados como sustancias de fármaco de un farmacéutico, y tener una estabilidad en almacenamiento superior. Debido a este éxito, la producción como un farmacéutico ha sido lograda por primera vez. Prueba Farmacológica [Prueba para confirmar el efecto de la inhibición de la actividad del co-transportador de glucosa Na+ humano (SGLT2 humano) ] 1) Preparación del vector de expresión SGLT2 humano En primer lugar, el ADNc de estructura de cadena individual se transcribió inversamente a partir del ARN total originado del riñon humano (fabricado por BD Biosciences Clontech) utilizando un Sperscript II (fabricado por Invitrogen Corporation) y un hexámero aleatorio. En segundo lugar, utilizando ADNc como una plantilla, un fragmento de ADN que codifica el SGLT2 humano (Wells R. G. y otros, Am. J. Physiol., 1992, 263 (3) F459) se amplificó a través de la reacción de PCR utilizando polimerasa de ADN Pyrobest {fabricado por Takara Bio Inc.) Se utilizó un iniciador en donde se insertó un sitio Hing III y un sitio EcoRl en el lado 5 ' y en el lado 3 ' del f agmento de ADN respectivamente) . El fragmento amplificado se clonó en un vector pCR2.1-Topo utilizando un kit de clonación Topo TA (fabricado por Invitrogen Corporation) , y el vector clonado se transfectó en una célula competente de Escherichia coli JM109. Se cultivaron clones resistentes a ampicilina en un medio LB conteniendo ampicilina (100 mg/l) . Se purificó un plásmido a partir de la Escherichia coli cultivada utilizando el método de Hanahan (ver Maniatis y otros, "Molecular Cloning") . Un fragmento de ADN para codificar un SGLT2-humano se obtuvo a través de la digestión de Hind JJJ/EcoRI y se ligó y se clonó en el mismo sitio del vector de expresión pcDNA3.1 (fabricado por Invitrogen Corporation) utilizando una ligasa de ADN T4 (fabricada por Roche Diagnostics) . El clon ligado se transfectó en una célula competente de Escherichia coli JM109 en la misma forma como se describió anteriormente y se cultivó en un medio LB conteniendo ampicilina, y un vector de expresión SGLT2 humano se obtuvo utilizando el método de Hanahan. 2) Preparación de las células de expresión SGLT2 humanas El vector de expresión SGLT2 humano se transfectó en células CHO-Kl utilizando Lipofectamina 2000 (fabricada por Invitrogen Corporation) . La célula se cultivó en un medio F12 de Ham (fabricado por Nissui Pharmaceutical Co., Ltd) conteniendo Penicilina {50 IU/ml, fabricada por Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd.), estreptomicina (50 µg/ml, fabricado por Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd.), Geneticina (40 µg/ml, fabricado por Invitrogen Corporation) , y 10% de suero de bovino fetal en presencia de 5% de C02 a 37 aC durante 2 semanas, y -se obtuvieron los clones resistentes a Geneticina. Una célula que establemente expresa el SGLT2 humano, que exhibe un consumo dependiente de sodio de metil-a-D-glucopiranosida, se obtuvo de entre estos clones (ver los siguientes párrafos para el método para medir la ingesta de metil-a-D-glucopiranosida) . 3) Medición de la inhibición de la ingesta de metil-a-D-glucopiranosida Después de remover el medio de una célula CHO establemente expresa el SGLT2 humano, se agregó una solución reguladora de pH de pretratamiento {solución reguladora de pH de pH 7.4 conteniendo cloruro de colina (140 mM) , cloruro de potasio (2 mM) , cloruro de calcio (1 mM) , cloruro de magnesio (1 mM) , ácido 2-[4-(2-hidroxietil)-l-piperazinil] etansulfónico (10 mM) , y tris (hidroximetil)aminometano (5 mM) en una cantidad de 100 µl por cavidad, y se incubó a 37 aC durante 20 minutos. Se agregaron 11 µl de metil-a-D- (U-14C) glucopiranosida (fabricado por Amersham Pharmacia Biotech) y se mezclaron con 1,000 µl de una solución reguladora de pH para la ingesta conteniendo un cristal de prueba (solución reguladora de .pH de pH 7.4 conteniendo cloruro de sodio (140 mM) , cloruro de potasio (2 mM) , cloruro de calcio (1 mM) , cloruro de magnesio (1 mM) , metil-a-D-glucopiranosida (50 µM),- ácido 2- [4-{2-hidroxietil) -1-piperazinil]etansulfónico (10 mM) , y tris (hidroximetil) aminometano (5 mM) para ' reparar la solución reguladora de pH para el consumo. Una solución reguladora de pH para la ingesta sin el cristal de prueba se preparó para un grupo de control . Una solución reguladora de pH para la ingesta basal sin un cristal de prueba conteniendo cloruro de colina (140 mM) en lugar de cloruro de sodio para medir la ingesta basal en ausencia de sodio de preparó también. Después de la remoción de la solución reguladora de pH de pre-tratamiento, la solución reguladora de pH para la ingesta se agregó (25 µl por cavidad) y se incubó a 37aC durante 2 horas . Después de la remoción de la solución reguladora de pH para consumo, la solución reguladora de pH para lavado (solución reguladora de pH de pH 7. 4 conteniendo cloruro de colina (140 mM) , cloruro de potasio (2 mM) , cloruro de calcio (1 mM) , cloruro de magnesio (1 mM) , metil-a-D-glucopiranosida (10 mM) , ácido 2- [4- (2-hidroxietil) -1-piperazinil] etansulfónico (10 mM) , y tris {hidroximetil)aminometano (5 mM) se agregó (200 µl por una cavidad) . La mezcla se removió inmediatamente. Esta operación de lavado se llevó a cabo una vez más . Se agregaron 0.5% de lauril sulfato de sodio {25 µl por cavidad) para solubilizar las células. Se agregaron 75 µl de Microscint 40 (fabricado por PerkinElmer, Inc.) para la célula solubilizada, y la actividad de radiación se midió utilizando un contador de microscintilación TopCount (fabricado por PerkinElmer, Ine) . El valor obtenido a través de la substracción de la cantidad de consumo basal de la cantidad de consumo del grupo de control se definió como el 100% . -La concentración para el 50% de inhibición del valor anterior (valor IC50) se calculó a partir de la curva de concentración-inhibición utilizando el método de mínimos cuadrados . Como resultado, la sal de colina del compuesto A de azuleno mostrado en el Ejemplo 1 y el hidrato de la sal e colina del compuesto A de azuleno mostrado en el Ejemplo 2 mostraron valores equivalentes al valor {8.9 nM) mostrado en el Ejemplo 75 de la Tabla 24 del Documento de Patente 1. APLICABILIDAD INDUSTRIAL Ya que los cristales de la presente invención tienen un excelente estabilidad en almacenamiento y exhiben la acción inhibidora del co-transportador de glucosa Na+ humana y acción an-tihiperglucémica, los cristales útiles como un farmacéutico, particularmente como medicina para tratar diabetes para tratar y prevenir diabetes mellitus dependiente de insulina (diabetes de tipo 1) , diabetes mellitus no dependiente de insulina (diabetes de tipo 2) , enfermedades resistentes a insulina, y sobrepeso. La excelente estabilidad en almacenamiento y la acción de inhibición de co-transportador de glucosa Na+ humana superior y la acción- antihiperglucémica de los cristales de la presente invención ha sido confirmada a través de la prueba de estabilidad en almacenamiento anterior y la prueba farmacológica. Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (1)

1. REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones : 1.- Una sal de colina caracterizada porque es (ÍS) -1, 5-anhidro-l- [5-azulen-2-ilmetil) -2-hidroxifenil] -D-glucitol . 2.- Un cristal de la sal de colina de (1S)-1,5-anhidro-1- [5-azulen-2-ilmetil) -2-hidroxifenil] -D-glucitol, caracterizado porque tiene un pico endotérmico a 194 a 198aC medido a través de calorimetría de exploración diferencial (análisis DSC) . 3.- Un cristal de ia sal de colina de (1S)-1,5-anhidro-1- [5-azulen-2-ilmetil) -2-hidroxifenil] -D-glucitol, caracterizado porque tiene picos principales de aproximadamente 2?(s) de 5.58, 14.72, 16.80, 17.82, 21.02, y 22.46 medidos por difracción de polvo para rayos X. 4.- Un cristal de la sal de colina de (1S)-1,5-anhidro-1- [5-azulen-2-ilmetil) -2-hidroxifenil] -D-glucitol, caracterizado porque tiene un pico endotérmico a 194 a 198aC medido a través de calorimetría de exploración diferencial (análisis DSC) y picos principales a aproximadamente 2?(a) de 5.58, 14.72, 16.80, 17.82, 21.02, y 22.46 medidos por difracción de polvo para rayos X. 5. - Un cristal del hidrato de la sal de colina de (ÍS) -1, 5-anhidro-l- [5-azulen-2-ilmetil) -2-hidroxifenil] -D-glucitol caracterizado porque tiene un pico endotérmico amplio a aproximadamente 78-C y un pico endotérmico a 195 a 199 aC medido a través de calorimetría de exploración diferencial (análisis DSC) . 6.- Un cristal del hidrato de la sal de colina de (ÍS) -1, 5-anhidro-l- [5-azulen-2-ilmetil) -2-hidroxifenil] -D-glucitol, caracterizado porque tiene picos principales a aproximadamente 2?(a) de 5.66, 17.08, 17.66, 19.02, 19.58, y 22.14 medidos por difracción de polvo para rayos X. 1 . - Un cristal del hidrato de la sal de colina de (ÍS) -1, 5-anhidro-l- [5-azulen-2-ilmetil) -2-hidroxifeni1] -D-glucitol, caracterizado porque tiene un pico endotérmico amplio a aproximadamente 78eC y un pico endotérmico a 195 a 199aC medido a través de calorimetría de exploración diferencial {análisis DSC) y picos -principales a aproximadamente 2?(fi) de 5.66, 17.08, 17.66, 19.02, 19.58, y 22.14 medidos a través de difracción de polvo para rayos X. 8.- Una composición farmacéutica, caracterizada porque comprende una sal de colina de conformidad con la reivindicación 1, un cristal de la sal de colina de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4, o un cristal del hidrato de la sal de colina de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 5 a 7 como un ingrediente efectivo. 9. - La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 8, caracterizada además porque comprende un excipiente farmacéuticamente aceptable. 10.- La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 8 o la reivindicación 9, caracterizada porque es un agente para tratar diabetes .