MXPA04009229A - Cristales derivados de glucopiranosiloxibencil benceno. - Google Patents

Abstract

Se pretende proporcionar cristales de 2-(4-metoxibencil)fenil6-O-etoxicarbonil-¦-D-glucopiranosida, los cuales exhiben un efecto inhibitorio excelente de SGLT2 y son utiles como preventivos o un remedio para enfermedades causadas por la hiperglucemia, composiciones medicinales que contienen los mismos y el uso de los mismos.

Description

CRISTALES DE DERIVADOS DE GLUCOPIRANOSILOXIBENCIL BENCENO Campo de la Invención La presente invención se refiere a cristales de 2-(4-metoxibencil)fenil 6-0-etoxicarbonil-p-D-glucopiranosida, y sus usos. Antecedentes de la Invención La 2-(4-Metoxibenc¡l)fenil 6-0-etoxicarbonil- -D-glucopiranosida es representada por la fórmula (I): y es un compuesto nuevo no conocido en las literaturas, el cual ha sido descubierto por el presente solicitante. Este compuesto es convertido in vivo en la forma activa de la 2-(4-metoxibencil)fenil ß-D-glucopiranosida, la cual exhibe actividades inhibitorias excelentes contra el SGLT2 y es útil para el tratamiento o prevención de enfermedades asociadas con la hiperglucemia, tales como la diabetes melitus, complicaciones diabéticas, obesidad y similares. Ninguna de las formas cristalinas de este compuesto habían sido conocidas hasta la fecha.

Sumario de la invención La 2-(4-metoxibencil)fenil 6-0-etoxicarbonil- -D-glucopiranosida podría haber sido preparada solamente en una forma amorfa hasta la fecha. Para la preparación de la forma amorfa de dicho compuesto en alta pureza, han sido requeridos pasos de purificación algo complicados. Además, la forma amorfa de dicho compuesto tiene estabilidades insatisfactorias, y es difícil de preparar en formulaciones debido a su propiedad viscosa. Los presentes inventores investigaron extensamente las formas cristalinas de la 2-(4-metoxibencil)fenil 6-0-etoxicarbonil- -D-glucopiranosida las cuales tiene una buena estabilidad en almacenamiento, y son adecuadas para la formulación, y se ha descubierto que la 2-(4-metoxibencil)fenil 6-0-etoxicarbonil-p-D-glucopiranosida tiene dos formas cristalinas "forma cristalina a" y "forma cristalina ß". Además, los presentes inventores han descubierto inesperadamente que estas formas cristalinas podrían ser preparadas en purezas altas mediante procedimientos convenientes de purificación y que tenían buenas estabilidades y capacidades en el almacén, y capacidades de flujo, y por consiguiente, son adecuadas para la formulación. Basados en estos descubrimientos, se ha realizado la presente invención. Por lo tanto, la presente invención proporciona: (1) un cristal de 2-(4-metoxibencil)fenil 6-0-etoxicarbonil-ß-D-glucopiranosida; (2) un cristal de 2-(4-metoxibencil)fenil 6-0-etoxicarbon i ?-ß-D-glucopiranosida, el cual muestra un patrón de difracción del polvo por rayos-X que tiene características de pico en un ángulo de difracción (2T ± 0.1) de 5.6, 13.8, 14.6, 16.8, 17.7 y 20.8 grados (al que nos referimos en lo sucesivo como la "forma cristalina a"); (3) un cristal de 2-(4-metoxibencil)fenil 6-0-etoxicarbon i ?-ß-D-glucopiranosida, el cual muestra un patrón de difracción del polvo por rayos-X que tiene características pico en un ángulo de difracción (2T ± 0.1) de 4.7, 5.5, 7.3, 8.6, 14.5 y 16.7 grados (al que nos referimos en lo sucesivo como "forma cristalina ß"); (4) una composición farmacéutica la cual comprende, como ingrediente activo, un cristal de acuerdo con cualquiera de los puntos anteriores del (1) al (3); (5) la composición farmacéutica de acuerdo con el punto (4) anterior, para la prevención o tratamiento de una enfermedad asociada con la hiperglucemia; (6) el uso de un cristal de acuerdo con cualquiera de los puntos del (1) al (3) anteriores, para la fabricación de un medicamento para prevenir o tratar una enfermedad asociada con la hiperglucemia; (7) un método para prevenir o tratar una enfermedad asociada con la hiperglucemia, el cual comprende la administración de una cantidad terapéuticamente efectiva de un cristal de acuerdo con cualquiera de los puntos del (1) al (3) anteriores. Breve Descripción de los Dibujos La figura 1 es un patrón de difracción de polvo por rayos-X de una forma cristalina a de la 2-(4-metoxibencil)fenil 6-0-etoxicarbonil-p-D-glucopiranosida preparada en el ejemplo 1, en donde la ordenada muestra la intensidad de rayos-X en cps, y la abscisa muestra el ángulo de difracción de 2T. La figura 2 es un patrón de difracción de polvo por rayos-X de la forma cristalina ß de la 2-(4-metoxibencil)fenil 6-0-etoxicarbonil-p-D-glucopiranosida, preparada en el ejemplo 4, en donde la ordenada muestra la intensidad de rayos-X en cps, y la abscisa muestra un ángulo de difracción en 2T. Descripción Detallada de la Invención Las formas cristalinas a y ß de la presente invención pueden ser preparadas de la manera siguiente. En primer lugar, se obtuvieron cristales de la 2-(4-metoxibencil)fenil 6-0-etoxicarbonil- -D-glucopiranosida mediante la disolución de una forma amorfa de dicho compuesto en etanol bajo calentamiento, y luego rayando una pared de un recipiente para la cristalización bajo el enfriamiento por hielo. Los cristales fueron obtenidos en una mezcla de formas cristalinas a y ß. Los presentes inventores han estudiado ansiosamente las condiciones de cristalización y descubrieron que las formas cristalinas a y ß de la presente invención podrían ser preparadas en una forma cristalina pura, cristalizándolas a partir de un solvente particular, tal y como se describe más adelante. La forma cristalina de la presente invención puede ser preparada de la manera siguiente. Se disuelve una forma arbitraria de la 2-(4-metoxibencil)fenil 6-0-etoxicarbonil-p-D-glucopiranosida en un primer solvente adecuado (al que nos referimos también como un "buen solvente") bajo calentamiento. Posteriormente, se le agrega a la solución, si se requiere, un segundo solvente (al que también nos referimos como un "solvente pobre") y la mezcla resultante es agitada o retenida para cristalización. Los cristales precipitados son recolectados y secados para producir la forma cristalina a. Los ejemplos de los primeros solventes incluyen etanol, isopropanol, acetato de etilo, acetona o metil etil cetona, los cuales pueden ser utilizados solos o con una mezcla de uno o más solventes. La cantidad de los primeros solventes varía dependiendo del tipo del solvente y generalmente se encuentra en un rango de aproximadamente 2 hasta aproximadamente 20 partes en peso sobre la base de una parte en peso de la 2-(4-metoxibencil)fenil 6-0- etoxicarbonil- -D-glucopiranosida. Los ejemplos de los segundos solventes, los cuales pueden ser miscibles con una solución del compuesto en un primer solvente, incluyen hexano, heptano y agua.. La cantidad de los segundos solventes varía dependiendo del tipo de solvente y generalmente se encuentra en un rango de aproximadamente 0.1 hasta aproximadamente 5 partes en peso sobre la base de una parte en peso de un primer solvente. La temperatura de cristalización para la forma cristalina a generalmente es inferior a 50°C, preferentemente en un rango de aproximadamente 20 hasta aproximadamente 50°C. El tiempo de cristalización varía dependiendo de la temperatura de cristalización, y generalmente es en un rango de aproximadamente 1 hasta aproximadamente 24 horas. La forma cristalina ß de la presente invención puede ser preparada de la manera siguiente. Se disuelve una forma arbitraria de 2-(4-metoxibencil)fenil 6-0-etoxicarbonil- -D-glucopiranosida en metanol, cuya cantidad generalmente es un rango de aproximadamente 3 hasta aproximadamente 10 partes en peso, preferentemente de aproximadamente 4 hasta aproximadamente 6 partes en peso, en la base de una parte en peso de la 2-(4-metoxibencil)feníl 6-0-etoxicarbonil- -D-glucopiranosida. Posteriormente, la solución es concentrada bajo presión reducida a una temperatura de aproximadamente 30°C hasta aproximadamente 40°C para la cristalización, y los cristales precipitados son recolectados y secados para producir la forma cristalina ß. Alternativamente, la forma cristalina ß puede ser preparada calentando una forma amorfa de la 2-(4-metoxibencil)fenil 6-0-etoxicarbonií-p-D-glucopiranosida a una temperatura de aproximadamente 120°C hasta aproximadamente 140°C durante un período de aproximadamente 1 hasta aproximadamente 4 horas. Las formas cristalinas a y ß obtenidas de esta manera pueden ser identificadas por sus picos de difracción característicos, tal y como se muestran en las gráficas de difracción de polvo por rayos-X de la figura 1 ó 2; (1) la forma cristalina a tiene picos característicos en un ángulo de difracción (2T ± 0.1) de 5.6, 13.8, 14.6, 16.8, 17.7 y 20.8 grados tal y como se ilustró en la figura 1; (2) la forma cristalina ß tiene picos característicos en un ángulo de difracción (2T ± 0.1) de 4.7, 5.5, 7.3, 8.6, 14.5 y 16.7 grados tal y como se ilustró en la figura 2. Las formas cristalinas a y ß de la presente invención pueden ser almacenadas bajo condiciones de almacenamiento generales, tales como a una temperatura de 25°C/humedad relativa de 60% o similares por un período de largo sin cambiar sus formas cristalinas y también son químicamente estables. Las formas cristalinas a y ß de la presente invención tienen capacidades de flujo excelentes, y buenas propiedades de manejo, y pueden ser formuladas en polvos, granulos finos, gránulos, tabletas, cápsulas o similares de acuerdo con los métodos convencionales. En el caso del uso de una composición farmacéutica que comprende un cristal de la presente invención como ingrediente activo, se pueden administrar varias formas de dosificación dependiendo de sus usos. Las formas de dosificación de ejemplo incluyen polvos, gránulos, gránulos finos, jarabes secos, tabletas, cápsulas, inyecciones, líquidos, ungüentos, supositorios, cataplasmas y similares, los cuales son administrados oral o parenteralmente. Las composiciones farmacéuticas pueden ser formuladas mezclando, diluyendo o disolviendo el ingrediente activo con aditivos farmacéuticos apropiados, tales como excipientes, agentes de desintegración, enlazadores, lubricantes, diluyentes, reguladores, agentes isotónicos, conservadores, agentes de humedecimiento, agentes de emulsificación, agentes de dispersión, agentes de estabilización, agentes de solubilización y similares, de acuerdo con los procedimientos convencionales de formulación, dependiendo de sus formas de dosificación. En el caso del uso de una composición farmacéutica para un tratamiento médico, la dosificación de un cristal de la presente invención como ingrediente activo es determinada de manera correcta dependiendo de la edad, sexo o peso corporal del paciente individual, la severidad de la enfermedad, la condición que va a ser tratada y similares. Una dosificación típica para la administración oral se encuentra en un rango de aproximadamente 0.1 mg hasta aproximadamente 1000 mg por día por humano adulto. Una dosificación típica para la administración parenteral se encuentra en un rango de aproximadamente 0.01 mg hasta aproximadamente 300 mg por día por humano adulto. Las dosificaciones pueden ser administradas en una sola dosis o en dosis divididas, por ejemplo, de una a varias veces diariamente. EJEMPLOS Los ejemplos siguientes, ejemplos de referencia y ejemplos de prueba, ilustran la invención con mayor detalle.

Sin embargo deberá quedar entendido que no deberán ser interpretados como limitantes del alcance de la presente invención de manera alguna. Los patrones de difracción de polvo por rayos-X de cada forma cristalina fueron obtenidos utilizando un analizador de difracción de rayos-X, RINT2100 (Rigaku), el cual fue operado en un voltaje del tubo de 40 kV y una corriente eléctrica del tubo de 40 mA, utilizando un rayo Cu. Ejemplo de Referencia 1. 2-(4-Metoxibencil)fenil 2,3,4,6-tetra-0-acetil- -D-glucopiranosida. Se le agregó a una solución de 2-(4-metoxibenc¡l)fenol (46 mg) y 2 , 3,4 ,6-tetra-0-acetil-1 -O-tricloroacetoimdoil-a-D-glucopiranosa (0.13 g) en diclorometano (2 ml_) un complejo de éter dietílico y trifloruro de boro (0.033 mL) y la mezcla fue agitada a temperatura ambiente durante 1 hora. La mezcla de reacción fue purificada mediante cromatografía de columna sobre un gel sílice aminopropilo (eluyente: diclorometano) para producir 2-(4-metoxibencil)fenil 2,3,4,6-tetra-0-acetil-p-D-glucopiranosida (0.11 g). 1 H-NMR (CDC13) d ppm: 1.91 (3H, s), 2.03 (3H, s), 2.05 (3H, s), 2.08 (3H, s), 3.77 (3H, s), 3.80 - 3.95 (3H, m), 4.17 (1H, dd, J = 2.5, 12.2Hz), 4.29 (1H, dd, J = 5.5, 12.2Hz), 5.11 (1H, d, J = 7.5Hz), 5.10 - 5.25 (1H, m), 5.25 - 5.40 (2H, m), 6.75 -6.85 (2H, m), 6.95 - 7.10 (5H, m), 7.10 - 7.25 (1H, m).

Ejemplo de Referencia 2. 2-(4-Metoxibencil)fenil ß-D-glucopiranosida. Se agregó metoxido sódico (solución en metanol al 28%; 0.12 mL) a una solución de 2-(4-metoxibencil)fenil 2,3,4,6-tetra-O-acetil-p-D-glucopiranosida (0.11 g) en metanol (4 mL), y la mezcla fue agitada a temperatura ambiente durante 30 minutos. El solvente fue removido bajo presión reducida. El residuo fue purificado por cromatografía de columna sobre gel de sílice (eluyente: diclorometano/metanol = 10/1), para producir 2-(4-metoxibencil)fenil ß-D-glucopiranosida (65 mg). 1 H- MR (CD3OD) d ppm: 3.35 - 3.55 (4H, m), 3.69 (1H, dd, J = 5.1, 12.1Hz), 3.73 (3H, s), 3.80 - 4.00 (2H, m), 4.03 (1H, d, J = 15.1Hz), 4.91 (1H, d, J = 7.4Hz), 6.75 - 6.85 (2H, m), 6.85 - 6.95 (1H, m), 6.95 - 7.10 (1H, m), 7.10 - 7.20 (4H, m).

Ejemplo de Referencia 3. 2-(4-Metoxibencil)fenil 6-0-etoxicarbonil-p-D-glucopiranosida.

A una solución de 2-(4-metoxibencil)fenil ß-D-glucopiranosida (0.075 g) en 2,4,6-trimetilpiridina (2 mL), se le agregó cloroformato de etilo (0.04 mL) a temperatura ambiente. Después de que la mezcla fue agitada a temperatura ambiente durante 16 horas, se le agregó una solución acuosa saturada de ácido cítrico a la mezcla de reacción, y la mezcla fue extractada con acetato de etilo. El extracto fue lavado con agua y secado sobre sulfato de magnesio anhidro y el solvente fue removido bajo presión reducida. El residuo fue purificado por cromatografía preparatoria de capa delgada sobre gel de sílice (eluyente: diclorometano/metanol = 10/1) para producir una forma amorfa de 2-(4-metoxibencil)fenil 6-0-etoxicarbonil-p-D-glucopiranosida (0.032 g). Como resultado del análisis de difracción de polvo por rayos-X, la substancia amorfa no muestra picos diferentes. 1 H-NMR (CD3OD) d ppm: 1.23 (3H, t, J = 7.1Hz), 3.30 - 3.65 (4H, m), 3.74 (3H, s), 3.93 (1H, d, J = 15.1Hz), 4.02 (1H, d, J = 15.1Hz), 4.05 - 4.20 (2H, m), 4.29 (1H, dd, J = 6.4, 11.7 Hz), 4.45 (1H, dd, J = 2.2, 11.7Hz), 4.89 (1H, d, J = 7.4Hz), 6.75 - 6.85 (2H, m), 6.85 - 7.05 (2H, m), 7.05 - 7.2 (4H, m). Ejemplo 1. Forma cristalina a de 2-(4-metoxibencil)fenil 6-0-etoxicarbonil-p-D-glucopiranosida. A una solución agitada de 2-(4-metoxibencil)fenil ß-D-glucopiranosida (220 g) y 2,6-lutidina (136 mL) en acetona (834 mL) se le agregó cloroformato de etilo (84 mL), a una temperatura de aproximadamente 5°C hasta aproximadamente 10°C. Posteriormente, la mezcla fue agitada a una temperatura de aproximadamente 10°C hasta aproximadamente 20°C durante 4 horas. A la mezcla de reacción se le agregó agua y acetato de etilo, y la capa orgánica fue separada. La capa orgánica fue lavada sucesivamente con una solución acuosa al 10% de ácido cítrico, salmuera, una solución acuosa al 10% de bicarbonato de sodio y salmuera, y secada sobre sulfato de sodio anhidro. El secante fue removido por filtración y el solvente del filtrado fue removido bajo presión reducida. El residuo (326 g) fue disuelto en etanol (1039 mL) bajo calentamiento y la solución resultante fue tratada con carbón activado (11 g). Después de que la mezcla fue agitada durante 5 minutos, los materiales insolubles fueron filtrados a través de celita. Al filtrado se le agregó n-hexano (2046 mL) a una temperatura de aproximadamente 30°C hasta aproximadamente 40°C durante un período de aproximadamente 45 minutos y se permitió que la mezcla resultante permaneciera a temperatura ambiente durante 17 horas. Posteriormente, la mezcla fue agitada bajo enfriamiento con hielo durante 2 horas y los cristales precipitados fueron recolectados por filtración para producir cristales puros de 2-(4-metoxibencil)fenil 6-0-etoxicarbonil-p-D-glucopiranosida (202 g). El mismo procedimiento descrito anteriormente utilizando otra 2-(4-metoxibencil)fenil ß-D-glucopiranosida (220 g) y 2,6-lutidina (136 ml_) produjo cristales crudos de 2-(4-metoxibencil)fenil 6-0-etoxicarbonil- -D-glucopiranosida (200 g). Los cristales crudos fueron combinados y una porción de 300 g de los cristales crudos, isopropanol (4260 ml_) y metil etil cetona (225 ml_) fueron calentados con agitación hasta que apareció una solución clara. La solución fue tratada con carbón activado (15 g) y la mezcla fue agitada durante 15 minutos y filtrada. Al filtrado se le sembraron cristales de la forma cristalina a a una temperatura de aproximadamente 50°C, y la mezcla fue enfriada a una temperatura de aproximadamente 35°C durante 1 hora con agitación. Posteriormente, se permitió que la mezcla permaneciera durante la noche y luego fue agitada bajo un enfriamiento por hielo durante 2 horas. Los cristales precipitados fueron recolectados mediante filtración, lavados con isopropanol frío y secados a una temperatura de aproximadamente 60°C durante 12 horas bajo presión reducida para producir 240 g de cristales. Como un resultado del análisis de difracción de polvo por rayos-X, los cristales fueron identificados como forma cristalina a, en la figura 1 se muestran un patrón de difracción de rayos-X de los cristales. Ejemplo 2. Forma cristalina a de 2-(4-metoxibencil)fenil 6-0-etoxicarbonil- -D-glucopiranosida. Una mezcla de 2-(4-metoxibencil)fenil 6-0-etoxicarbonil-ß-D-glucopiranosida (5.0 g) y etanol (30 ml_) fueron calentados a una temperatura de 60°C a 65°C con agitación hasta que pareció ser una solución clara. Se permitió que la solución se enfriara a una temperatura de 40°C a 45°C, y se agitó a la misma temperatura durante 1 hora y a una temperatura de 20°C a 30°C durante otra hora. Los cristales precipitados fueron recolectados mediante filtración y secados a una temperatura de aproximadamente 70°C durante 4 horas bajo presión reducida para producir 3.33 g de cristales. Como un resultado del análisis de difracción de polvo por rayos-X, los cristales fueron identificados como la forma cristalina a. Ejemplo 3. Forma cristalina a de 2-(4-metoxibencil)fenil 6-0- etoxicarbonil-p-D-glucopiranosida. Una mezcla de 2-(4-metoxibencil)fen¡l 6-0-etoxicarbonil-ß-D-glucopiranosida (90.0 g) y acetona (300 mL) fue calentada a una temperatura de 40°C a 45°C con agitación hasta que pareció ser una solución clara. Se permitió que la solución se enfriara a una temperatura de 35°C y se le agregó n-hexano (300 mL) al mismo a una temperatura de 25°C a 35°C. La mezcla fue agitada a una temperatura de 30°C a 35°C durante 15 minutos, y se le agregó otro n-hexano (300 mL) durante 20 minutos. Además, el n-hexano (300 mL) fue agregado durante 5 minutos, y la mezcla resultante fue agitada a temperatura ambiente durante toda la noche. Los cristales precipitados fueron recolectados mediante filtración, lavados con acetona/n-hexano (1:3) y secados a una temperatura de aproximadamente 70°C durante 5 horas bajo presión reducida para producir 81.9 g de cristales. Como resultado el análisis de difracción de polvo por rayos-X, los cristales fueron identificados como forma cristalina a. Ejemplo 4. Forma cristalina ß de 2-(4-metoxibenc¡l)fenil 6-0-etoxicarbonil-p-D-glucopiranosida. La forma amorfa de 2-(4-metoxibencil)fenil 6-0-etoxicarbonil-p-D-glucopiranosida (5.0 g) obtenida en el Ejemplo de Referencia 3 fue colocada en un horno, y calentada a una temperatura de 125°C durante 3 horas. Después se le permitió enfriarse a la temperatura ambiente, y se obtuvieron 4.9 g de cristales. Como resultado del análisis de difracción de polvo por rayos-X, los cristales fueron identificados como la forma cristalina ß. Un patrón de difracción de polvo por rayos-X de los cristales se muestra en la figura 2. Ejemplo 5. Forma cristalina ß de 2-(4-metoxibencil)fenil 6-0-etoxicarbonil-p-D-glucopiranosida. Una mezcla de 2-(4-metoxibencil)fenil 6-0-etoxicarbonil-ß-D-glucopiranosida (1.0 g) y metanol (5 ml_) fue calentada con agitación, hasta que pareció ser una solución clara. La solución fue concentrada bajo presión reducida hasta el secado. Los cristales precipitados fueron recolectados y secados a una temperatura de aproximadamente 70°C durante 5 horas bajo presión reducida para producir 0.9 g de cristales. Como resultado del análisis de difracción de polvo por rayos-X, los cristales fueron identificados como la forma cristalina ß.

Ejemplo de Prueba 1 Prueba de estabilidad Las pruebas de estabilidad se llevaron a cabo bajo las siguientes condiciones para las formas cristalinas y ß. Los porcentajes residuales de las substancias de pruebas fueron determinados por HPLC y los cambios en la forma cristalina fueron examinados por análisis de difracción de polvo por rayos-X. Condiciones HPLC: detección; 225 nm, columna; Intertsil ODS-3, temperatura de la columna; 30°C, fase móvil; 0.02 mol/L de regulador de fosfato (pH 3.0): acetonitrilo = 58:42? 30:70, rango de flujo; 1.0 mL/min. Condiciones de almacenamiento: 1) 40°C/75% RH, 2 meses, tapado apretadamente. 2) 60°C, 2 meses, tapado apretadamente. Como resultado, las formas cristalinas a y ß de la presente invención no indican cambios en sus formas cristalinas y porcentaje residual, y tienen excelentes estabilidades de almacenamiento.

Ejemplo de Prueba 2. Ensayo para el efecto inhibitorio de la actividad del SGLT2 humano 1) Construcción del vector plásmido que expresa el SGLT2 humano.

La preparación de la librería del cADN para la amplificación de PCR fue realizada mediante transcripción inversa de un ARN total obtenido del riñon humano (gen Orí) con un oligo dT como el cebador, utilizando el sistema SUPERSCRIPT de preamplificación (Gibco-BRL: LIFE TECHNOLOGIES). El fragmento de ADN que codifica el SGLT2 humano se utilizó la reacción PCR amplificando mediante Polimerasa de ADN Pfu (Stratangene), en la cual la biblioteca de cADN de riñon humano descrita anteriormente fue utilizada como plantilla y los siguientes oligonucleótidos 0702F y 0712R, presentados como el Número de Secuencia 1 y 2 respectivamente, fueron utilizados como cebadores. El fragmento de ADN amplificado fue ligado dentro de un pCR-Blut ( I nvitrogen), un vector para clonación, de acuerdo con el método estándar del equipo. La célula competente Escherichia coli HB101 (Toyobo), fue transformada de acuerdo con el método usual y luego se realizó la selección de los transformantes en un medio LB de agar en un contenido de 50 µg/mL de canamicina. Después de que el ADN plásmido fue extractado y purificado de uno de los transformantes, se realizó la amplificación del fragmento de ADN que codifica el SGLT2 humano mediante una reacción utilizada de PCR de Polimerasa de ADN Pfu (Stratagene), en la cual los siguientes oligonucleótidos 0714F y 0715R, presentaron un Número de Secuencia 3 y 4, respectivamente, y fueron utilizados como cebadores. El fragmento de ADN amplificado fue digerido con enzimas de restricción, Xho I y Hind III, y luego purificado con un Sistema de Purificación Wizard (Promega). Este fragmento de ADN purificado fue insertado en los sitios de clonación múltiples correspondientes del pcDNA3.1 (-) Myc/His-B (Invitrogen), un vector para expresión de la proteína de fusión. La célula competente Escherichia coli HB101 (Toyobo), fue transformada de acuerdo con el método usual y luego se llevó a cabo la selección del transformante en el medio de agar LB con un contenido de 10 g/mL de ampicilina. Después de que fue extractado el ADN plásmido y purificado de este transformante, la secuencia básica del fragmento ADN fue insertada en los sitios de clonación múltiples del pcDNA3.1 (-) Myc/His-B que fueron analizados. Este clon tenía una sola substitución básica (ATC la cual codifica la isoleucina-433 que fue substituida por GTC) comparada con el SGLT2 humano reportado por Wells et al en (Am. J. Physiol., Vol. 263, páginas 459 a 465 (1992)). Secuencialmente se obtuvo un clon en el cual la valina es substituida por la isoleucina-433. Este vector plásmido que expresa la SGLT2 humana en la cual el péptido se presentó como la Secuencia Número 5, fue fusionado con el residuo de alanina con la terminal carboxilo que fue designada como KL29. Secuencia Número 1 ATGGAGGAGCACACAGAGGC Secuencia Número 2 GGCATAGAAGCCCCAG AGGA Secuencia Número 3 AACCTCGAG ATGGAGGAGCACACAG AGGC Secuencia Número 4 AACAAGCTTGGCATAGAAGCCCCAGAGGA Secuencia Número 5 KLGPEQKLI SEEDLNSAVDH H HHH H 2) Preparación de las células que expresan transitoriamente la SGLT2 humana. El KL29, el plásmido que codifica la SGLT2 humana, fue transfectado en células COS-7 (BANCO DE CÉLULAS RIKEN RCB0539), por medio de electroporación . La electroporación se llevó a cabo con un GENE PULSER II (Bio-Rad Laboratories) bajo la condición: 0.290 kV, 975 µ?, 2 X 106 de células COS-7, y 20 µ9 de KL29 en 500 µ? de un medio OPTI-MEM I (Gibco-BRL: LIFE TECHNOLOGIES), en una cubeta de tipo de 0.4 cm. Después de la transferencia del gen, las células fueron cultivadas mediante centrifugación y se volvieron a suspender en el medio OPTI-MEM I (1 mL/cubeta). A cada depósito en una placa de 96 depósitos, se le agregaron 125 µL· de esta suspensión celular. Después del cultivo durante la noche a una temperatura de 37°C bajo C02 al 5%, se le agregaron 125 µ? de medio de DMEM el cual está conteniendo suero fetal bovino al 10% (Sanko Jyunyaku), 100 unidades/mL de penicilina sódica G (Gibco-BRL: LIFE TECHNOLOGIES), 100 µg/mL de sulfato de estreptomicina (Gibco-BRL: LIFE TECHNOLOGIES) a cada depósito. Después del cultivo hasta el día siguiente, estas células fueron utilizadas para la medición de la actividad inhibitoria contra la asimilación de la metil-a-D-glucopiranosida. 3) Medición de la actividad inhibitoria contra la asimilación de metil-a-D-glucopiranosida Después de que un compuesto de prueba fue disuelto en dimetil sulfóxido y diluido con un regulador de asimilación (un regulador con un pH de 7.4 con un contenido de 140 mM de cloruro de sodio, 2 mM de cloruro de potasio, 1 mM de cloruro de calcio, 1 mM de cloruro de magnesio, 5 mM de metil-a-D-glucopiranosida, 10 mM de ácido 2-[4-(2-hidroxietil)-1-piperazinil]etano sulfónico, y 5mM de tris(hidroximetil)aminometano), cada diluyente fue utilizado como una muestra de prueba para la medición de la actividad inhibitoria. Después de la remoción del medio de las células COS-7 que expresan transitoriamente la SGLT2 humana, a cada depósito se le agregaron 200 µL· de regulador previamente tratado (un regulador de pH 7.4 con un contenido de 140 mM de cloruro de colina, 2 mM de cloruro de potasio, 1 mM de cloruro de calcio, 1 mM cloruro de magnesio, 10 mM de ácido 2-[4-(2-hidroxietil)-1 -piperazinil)etano sulfónico, y 5 mM de tris(hidroximetil)aminometano), y las células fueron incubadas a una temperatura de 37°C durante 10 minutos. Después de que se removió el regulador de tratamiento previo, se le agregaron nuevamente 200 µ?_ del mismo regulador, y las células fueron incubadas a una temperatura de 37°C durante 10 minutos. El regulador para la medición fue preparado agregando 7 µ?_ de met¡l-a-D-(U-14C) glucopiranosida (Amersham Pharmacia Biotech), a 525 µ?_ de la muestra de prueba preparada. Para el control, el regulador se preparó sin el compuesto de prueba para la medición. Para el estimado de la asimilación basal en ausencia del compuesto de prueba y sodio, fue preparado de un modo similar el regulador para la medición de la asimilación basal, el cual contiene 140 tnM de cloruro de colina, en vez de cloruro de sodio,. Después de que fue removido el regulador de tratamiento previo, se le agregaron 75 µ?_ de regulador de medición a cada depósito, las células fueron incubadas a una temperatura de 37°C durante 2 horas. Después de que fue removido el regulador para la medición, agregaron a cada deposito 200 µ?_ de regulador de lavado (un regulador de pH 7.4 que contiene 140 m de cloruro de colina, 2 mM de cloruro de potasio, 1 mM de cloruro de calcio, 1 mM de cloruro de magnesio, 10 mM de metil-a-D-glucopiranosida , 10 mM de ácido 2-[4-(2-hidroxietil)-1 -piperazinil)etano sulfónico, y 5 mM de tris(hidroximetil)aminometano) y se removió inmediatamente. Después de dos lavados adicionales, las células fueron solubllizadas mediante la adición de 75 µL· de hidróxido de sodio al 0.2 N a cada deposito. Después de que los lisatos celulares fueron transferidos al PicoPlate (Packard), y se le agregaron 150 µ?_ de MicroScint-40 (Packard), por cada depósito, se midió la radioactividad con un contador de centelleo de microplacas TopCount (Packard). La diferencia en la asimilación fue obtenida como un valor del 10%, restando la radioactividad en la asimilación basal de la del control y luego las concentraciones en las cuales fue inhibido un 50% de la asimilación (Valor IC50) fueron calculados a partir de la curva de inhibición de concentración por el método del mínimo cuadrado. El resultado se muestra en la siguiente tabla 1. [Tabla 1] APLICABILIDAD INDUSTRIAL Las formas cristalinas a y ß de la presente invención pueden ser preparadas en una pureza alta mediante • procedimientos convenientes de purificación y son adecuadas para la producción comercial. Las formas cristalinas a y ß de la presente invención tienen buenas estabilidades en el almacén y son adecuados para la producción y el suministro de una calidad constante de medicamentos. Además, las formas cristalinas a y ß de la presente invención tienen unas buenas capacidades de flujo y propiedades de manejo y son adecuadas para la formulación. Por lo tanto, las formas cristalinas a y ß de la presente invención, son útiles como una substancia de fármaco.

Claims (3)

1. REIVINDICACIONES 1. Un cristal de 2-(4-metoxibencil)fenil 6-0-etoxicarbonil-p-D-glucopiranosida.
2. 2. El cristal tal y como se describe en la reivindicación 1, el cual muestra un patrón de difracción de polvo por rayos-X que tiene características pico en un ángulo de difracción (2T ± 0.1) de 5.6, 13.8, 14.6, 16.8, 17.7 y 20.8 grados. 3. El cristal tal y como se describe en la reivindicación 1, caracterizado porque muestra un patrón de difracción de polvo por rayos-X que tiene características pico en un ángulo de difracción (2T ± 0.1) de 4.7, 5.5, 7.3, 8.6, 14.5 y 16.7 grados. 4. Una composición farmacéutica la cual comprende, como ingrediente activo, un cristal tal y como se describe en cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 3. 5. Una composición farmacéutica tal y como se describe en la reivindicación 4, para la prevención o tratamiento de una enfermedad asociada con la hiperglucemia. 6. El uso de un cristal tal y como se describe en cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 3, para la elaboración de un medicamento para la prevención o tratamiento de una enfermedad asociada con la hiperglucemia. 7. Un método para la prevención o tratamiento de una enfermedad asociada con la hiperglucemia, la cual comprende la administración de una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto tal y como se describe en cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la
3. 3.