KR100945455B1

KR100945455B1 - 글루코피라노실옥시벤질 벤젠 유도체의 결정

Info

Publication number: KR100945455B1
Application number: KR1020047014801A
Authority: KR
Inventors: 이요베아키라; 데라니시히로타카; 다타니가즈야; 요네쿠보시게루; 이사지마사유키
Original assignee: 깃세이 야쿠힌 고교 가부시키가이샤
Priority date: 2002-03-22
Filing date: 2003-03-04
Publication date: 2010-03-05
Also published as: CA2476800C; NZ535230A; EP1489089A1; HK1077830A1; PL372415A1; CA2476800A1; CN1642965A; JP4490109B2; NO20044426L; EP1489089A4; JPWO2003080635A1; NO330297B1; CN1307190C; AU2003211543B2; MXPA04009229A; KR20040099347A; PL210710B1; WO2003080635A1; US7371730B2; AU2003211543A1

Abstract

본 발명은 우수한 SGLT2 저해작용을 보이고, 고혈당증에 기인하는 질환의 예방 또는 치료약으로서 유용한 2-(4-메톡시벤질)페닐 6-O-에톡시카르보닐-β-D-글루코피라노시드의 결정, 그것을 함유하는 의약조성물, 및 그것의 용도를 제공한다.

글루코피라노실옥시벤질 벤젠 유도체, SGLT2 저해작용, 당뇨병, 비만증, 고혈당증, 의약조성물

Description

글루코피라노실옥시벤질 벤젠 유도체의 결정{CRYSTALS OF GLUCOPYRANOSYLOXYBENZYL BENZENE DERIVATIVE}

본 발명은, 2-(4-메톡시벤질)페닐 6-O-에톡시카르보닐-β-D-글루코피라노시드의 결정 및 그 용도에 관한 것이다.

하기 화학식 I로 나타내어지는 2-(4-메톡시벤질)페닐 6-O-에톡시카르보닐-β-D-글루코피라노시드는 당해 출원인에 의해 발견된 문헌 미기재의 신규한 화합물이다.

당해 화합물은, 생체내에서 활성본체인 2-(4-메톡시벤질)페닐 β-D-글루코피라노시드로 변환되어서 우수한 SGLT2 저해작용을 나타내고, 당뇨병, 당뇨병성 합병증, 비만증 등의 고혈당증에 기인하는 질환의 예방 또는 치료약으로서 유용한 화합물이다. 지금까지 당해 화합물의 결정물에 대해서는 알려져 있지 않다.

발명의 개시

종래 2-(4-메톡시벤질)페닐 6-O-에톡시카르보닐-β-D-글루코피라노시드는 아몰포스의 형태로 밖에 제조할 수 없었다. 이 아몰포스 형태는 고순도의 것을 제조하기 위해서 번잡한 정제 공정을 요하여 공업적 생산에 맞지 않았다. 또, 이 아몰포스 형태는 보존 안정성이 나빠 끈기가 있기 때문에 제제화하는 것이 곤란했다.

그래서, 본 발명자들은 보존 안정성이 양호하고, 제제화에 적합한 2-(4-메톡시벤질)페닐 6-O-에톡시카르보닐-β-D-글루코피라노시드의 결정에 대해 예의 연구를 거듭한 결과 α형 결정 및 β형 결정 2종류의 결정을 발견하고, 이들 결정이 간편한 정제 조작에 의해 고순도로 될 수 있어 공업적 생산에 적합하다는 것, 게다가 이들 결정이 예상외로 우수한 보존 안정성을 보이고, 유동성이 우수하여 제제화에 적합한 결정인 것을 발견하고, 이들 지견에 기초하여 본 발명을 완성했다.

즉 본 발명은,

(1) 2-(4-메톡시벤질)페닐 6-O-에톡시카르보닐-β-D-글루코피라노시드의 결정;

(2) 분말 X선 회절에 의한 회절 패턴이, 회절각(2θ±0.1) 5.6, 13.8, 14.6, 16.8, 17.7 및 20.8도에 특징적인 피크를 갖는 2-(4-메톡시벤질)페닐 6-O-에톡시카르보닐-β-D-글루코피라노시드의 결정(이하, α형 결정이라 칭함);

(3) 분말 X선 회절에 의한 회절 패턴이, 회절각(2θ±0.1) 4.7, 5.5, 7.3, 8.6, 14.5 및 16.7도에 특징적인 피크를 갖는 2-(4-메톡시벤질)페닐 6-O-에톡시카 르보닐-β-D-글루코피라노시드의 결정(이하, β형 결정이라 칭함);

(4) 상기 (1)∼(3) 중 어느 한 항에 기재된 결정을 유효성분으로서 함유하는 의약조성물;

(5) 고혈당증에 기인하는 질환을 예방 또는 치료하기 위한 상기 (4)에 기재된 의약조성물;

(6) 고혈당증에 기인하는 질환의 예방 또는 치료제를 제조하기 위한 상기 (1)∼(3) 중 어느 하나에 기재된 결정의 사용; 및

(7) 상기 (1)∼(3) 중 어느 1항에 기재된 결정의 치료적 유효량을 투여하는 것을 특징으로 하는 고혈당증에 기인하는 질환의 예방 또는 치료 방법에 관한 것이다.

도 1은 실시예 1에서 얻어진 2-(4-메톡시벤질)페닐 6-O-에톡시카르보닐-β-D-글루코피라노시드의 α형 결정의 분말 X선 회절도이다. 세로축은 X선 강도(cps)를 나타내고, 가로축은 회절각(2θ)을 나타낸다.

도 2는 실시예 4에서 얻어진 2-(4-메톡시벤질)페닐 6-O-에톡시카르보닐-β-D-글루코피라노시드의 β형 결정의 분말 X선 회절도이다. 세로축은 X선 강도(cps)를 나타내고, 가로축은 회절각(2θ)을 나타낸다.

발명을 실싱하기 위한 최량의 형태

본 발명의 최초의 결정은 아몰포스 형태의 2-(4-메톡시벤질)페닐 6-O-에톡시카르보닐-β-D-글루코피라노시드를 에탄올에 가열 용해 후 빙냉하에서 용기벽을 문 지르면서 결정화시켰다. 이와 같이 하여 얻어진 결정은 α형 결정 및 β형 결정의 혼합물이었지만, 하기에 나타내는 바와 같은 특정한 용매로부터 정출시킴으로써 α형 결정 및 β형 결정을 순도가 높은 결정으로서 제조할 수 있게 되었다.

즉, 본 발명의 α형 결정은 임의의 형태의 2-(4-메톡시벤질)페닐 6-O-에톡시카르보닐-β-D-글루코피라노시드를 적절한 제 1 용매(양용매)에 가열 용해하고, 필요에 따라서 제 2 용매(빈용매)를 가하여 교반 또는 방치하여 결정을 석출시커고, 다음에 석출한 결정을 단리하고 건조함으로써 제조할 수 있다.

상기 제 1 용매로서는 에탄올, 이소프로파놀, 아세트산 에틸, 아세톤 또는 메틸에틸케톤이 사용되고, 필요에 따라서 이들 용매를 2종 이상 조합하여 사용할 수 있다. 제 1 용매의 양은 용매의 종류에 따라서도 상이하지만, 통상 당해 화합물 1중량부에 대해 약 2 ∼ 약 20중량부가 사용된다.

상기 제 2 용매로서는 당해 화합물을 제 1 용매에 녹인 용액과 혼화하는 용매이면 좋고, 예를 들면 헥산, 헵탄 또는 물이 사용된다. 제 2 용매의 양은, 통상 제 1 용매 1중량부에 대해 약 0.1 ∼ 약 5중량부가 사용된다.

α형 결정을 정출할 때의 정출온도는 약 50℃ 이하, 바람직하게는 약 20 ∼ 약 50℃이며, 정출시간은 정출온도에 따라서 다르지만, 보통 약 1시간 ∼ 약 24시간이다.

한편, β형 결정은 임의의 형태의 2-(4-메톡시벤질)페닐 6-O-에톡시카르보닐-β-D-글루코피라노시드를 당해 화합물 1중량부에 대해 약 3중량부 ∼ 약10중량부, 바람직하게는 약 4중량부 ∼ 약 6중량부의 메탄올에 가열 용해하고, 이 용액을 약 30℃ ∼ 약 40℃의 온도에서 감압하에 농축하여 결정을 석출시키고, 다음에 석출한 결정을 단리하고 건조함으로써 제조할 수 있다.

또, β형 결정은 아몰포스 형태의 2-(4-메톡시벤질)페닐 6-O-에톡시카르보닐-β-D-글루코피라노시드를 약 120℃ ∼ 약 130℃의 온도에 약 1 ∼ 약 4시간 보존하는 것에 의해서도 제조할 수 있다.

이와 같이 하여 얻어진 2-(4-메톡시벤질)페닐 6-O-에톡시카르보닐-β-D-글루코피라노시드의 α 및 β형 결정은 도 1∼2의 분말 X선 회절 차트에 도시하는 바와 같이 이하의 특징적인 회절 피크에 의해 식별된다: 즉,

(1) α형 결정은, 도 1에 도시하는 바와 같은 회절각(2θ±0.1) 5.6, 13.8, 14.6, 16.8, 17.7 및 20.8도에 특징적인 피크를 갖는다;

(2) β형 결정은, 도 2에 도시하는 바와 같은 회절각(2θ±0.1) 4.7, 5.5, 7.3, 8.6, 14.5 및 16.7도에 특징적인 피크를 갖는다.

본 발명의 α형 결정 및 β형 결정은 일반적인 보존 조건(예를 들면, 25℃/60% 상대습도 등)에서는 결정형이 변화되지 않고 보존할 수 있고, 또한 화학적으로 안정하다. 또한, 이들 결정은 유동성이 우수하고 취급이 용이하여 상법에 의해 산제, 세립제, 과립제, 정제, 캡슐제 등으로 제제화 할 수 있다.

본 발명의 결정을 유효성분으로서 함유하는 의약조성물을 실제의 치료에 사용할 경우 용법에 따라 여러 제형의 것이 사용된다. 이러한 제형으로서는, 예를 들면 산제, 과립제, 세립제, 드라이시럽제, 정제, 캡슐제, 주사제, 액제, 연고제, 좌제, 첨부제 등을 들 수 있고, 경구 또는 비경구적으로 투여된다.

이들 의약조성물은 그 제형에 따라 제제학적으로 공지된 수법에 의해 적절한 부형제, 붕괴제, 결합제, 활택제, 희석제, 완충제, 등장화제, 방부제, 습윤제, 유화제, 분산제, 안정화제, 용해보조제 등의 의약품 첨가물과 적당하게 혼합 또는 희석·용해함으로써 조제할 수 있다.

본 발명의 의약조성물을 실제의 치료에 사용하는 경우, 그 유효성분인 본 발명의 결정의 투여량은 환자의 연령, 성별, 체중, 질환 및 치료의 정도 등에 따라 적당하게 결정되지만, 경구 투여의 경우 성인 1일당 약 0.1mg ∼ 약 1000mg의 범위에서, 비경구 투여의 경우에는 성인 1일당 약 0.01mg ∼ 약 300mg의 범위에서, 1회 또는 수회로 나누어서 적당하게 투여할 수 있다.

본 발명의 내용을 이하의 참고예, 실시예 및 시험예에서 더욱 상세하게 설명하지만, 본 발명은 그 내용에 한정되는 것은 아니다.

또한, 각 결정의 분말 X선 회절 데이터는 주식회사 리가쿠의 X선 회절 장치 RINT2100을 사용하여 측정했다(측정 조건; Cu선, 관전압 40kV, 관전류 40mA).

참고예 1

2-(4-메톡시벤질)페닐 2,3,4,6-테트라-O-아세틸-β-D-글루코피라노시드

2-(4-메톡시벤질)페놀(46mg)과 2,3,4,6-테트라-O-아세틸-1-O-트리클로로아세토이미도일-α-D-글루코피라노스(0.13g)의 염화 메틸렌(2mL) 용액에 3불화 붕소-디에틸에테르 착체(0.033mL)를 가하고 실온에서 1시간 교반했다. 반응 혼합물을 아미노프로필 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(용출용매: 염화 메틸렌)로 정제하고, 2- (4-메톡시벤질)페닐 2,3,4,6-테트라-O-아세틸-β-D-글루코피라노시드(0.11g)를 얻었다.

참고예 2

2-(4-메톡시벤질)페닐 β-D-글루코피라노시드

2-(4-메톡시벤질)페닐 2,3,4,6-테트라-O-아세틸-β-D-글루코피라노시드(0.11g)의 메탄올(4mL) 용액에 나트륨 메톡시드(28% 메탄올 용액, 0.12mL)를 가하고 실온에서 30분간 교반했다. 용매를 감압하에서 증류 제거하고 잔사를 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(용출용매: 염화 메틸렌/메탄올=10/1)로 정제하여, 2-(4-메톡시벤질)페닐 β-D-글루코피라노시드(65mg)를 얻었다.

참고예 3

2-(4-메톡시벤질)페닐 6-O-에톡시카르보닐-β-D-글루코피라노시드

2-(4-메톡시벤질)페닐 β-D-글루코피라노시드(0.075g)의 2,4,6-트리메틸 피리딘(2mL) 용액에 실온에서 클로로포름산 에틸(0.04mL)을 가했다. 실온에서 16시간 교반한 후 반응 혼합물에 포화 시트르산 수용액을 가하고 아세트산 에틸로 추출 했다. 추출물을 물로 세정한 후 무수황산 마그네슘으로 건조하고 용매를 감압하에서 증류제거했다. 잔사를 실리카겔 분취 박상(薄相) 크로마토그래피(전개용매: 염화 메틸렌/메탄올=10/1)에 의해 정제하고, 목적으로 하는 밴드를 긁어 취한 후 염화 메틸렌/메탄올에 의해 용출했다. 얻어진 용출액을 감압하에서 용매를 증류 제거하여, 아몰포스 형태의 2-(4-메톡시벤질)페닐 6-O-에톡시카르보닐-β-D-글루코피라노시드(0.032g)를 얻었다. 이것은 분말 X선 회절 측정 결과 식별가능한 피크를 나타내지 않았다.

실시예 1

2-(4-메톡시벤질)페닐 6-O-에톡시카르보닐-β-D-글루코피라노시드의 α형 결정

2-(4-메톡시벤질)페닐 β-D-글루코피라노시드(220g) 및 2,6-루티딘(136mL)의 아세톤(834mL) 용액에 교반하에 5∼10℃의 온도에서 클로로포름산 에틸(84mL)을 적하하고 약 10℃∼20℃에서 4시간 더 교반했다. 반응 혼합물에 물 및 아세트산 에틸을 가하고 유기층을 분리했다. 유기층을 10% 시트르산 수용액, 식염수, 10% 중조 수용액, 식염수로 순차적으로 세정하고 무수황산 나트륨으로 건조했다. 건조제를 여과분리하고 감압하에 용매를 증류제거했다. 농축물(326g)을 에탄올(1039mL) 에 가열 용해하고, 활성탄(l1g)을 더하여 5분간 교반한 후, 불용물을 셀라이트 여과했다. 여과액에 N-헥산(2046mL)을 약 30∼약 40℃의 온도에서 약 45분간 걸쳐서 적하하고 실온에서 17시간 정치했다. 이 혼합물을 빙냉하에서 2시간 더 교반한 후 석출한 결정을 여과하여, 2-(4-메톡시벤질)페닐 6-O-에톡시카르보닐-β-D-글루코피라노시드의 조(粗) 결정(202g)을 얻었다.

2-(4-메톡시벤질)페닐β-D-글루코피라노시드(220g) 및 2,6-루티딘(136mL)을 사용하여 상기와 동일한 조작을 행하고, 2-(4-메톡시벤질)페닐 6-O-에톡시카르보닐-β-D-글루코피라노시드의 조 결정을 200g 더 얻었다. 이들 조 결정을 합하고, 그 300g을 이소프로판올(4260mL) 및 메틸에틸케톤(225mL)에 가열용해하고 활성탄(15g)을 가하여 15분간 교반한 후 가열여과했다. 이 여과액에 약 50℃에서 α형 결정의 종결정을 가하고, 교반하에 약 35℃까지 약 1시간 걸쳐서 냉각하고, 또한 실온에서 하루밤 정치했다. 이 혼합물을 빙냉하에서 2시간 더 교반하고, 석출한 결정을 여과하여 얻었다. 얻어진 결정을 차가운 이소프로파놀로 세정하고 감압하에 약 60℃에서 12시간 건조하여 결정(240g)을 얻었다. 이 결정의 분말 X선 회절도는 도 1에 나타내는 바 대로이며, α형 결정인 것이 확인되었다.

실시예 2

2-(4-메톡시벤질)페닐 6-O-에톡시카르보닐-β-D-글루코피라노시드(5.0g)와 에탄올(30mL)의 혼합물을 60∼65℃로 가열하고 완전하게 용해할 때까지 교반했다. 이 혼합물을 40∼45℃까지 냉각하고, 동온도에서 1시간 교반하고, 20∼30℃에서 1시간 더 교반했다. 석출한 결정을 여과하여 얻고, 감압하에서 약 70℃에서 4시간 건조하여 결정(3.33g)을 얻었다. 이 결정은 분말 X선 회절 측정의 결과 α형 결정인 것이 확인되었다.

실시예 3

2-(4-메톡시벤질)페닐 6-O-에톡시카르보닐-β-D-글루코피라노시드(90.0g)와 아세톤(300mL)의 혼합물을 40∼45℃로 가열하고 완전하게 용해할 때까지 교반했다. 이 혼합물을 35℃까지 냉각하고, 25∼35℃의 온도에서 n-헥산(300mL)을 적하했다. 이 혼합물을 30∼35℃에서 15분간 교반한 후, n-헥산(300mL, 300mL)을 각각 20분, 5분간 걸쳐서 가하고 실온에서 하룻밤 더 교반했다. 석출한 결정을 여과하여 얻고, 아세톤-헥산(1:3)으로 세정했다. 감압하에 약 70℃에서 5시간 건조하여 결정(81.9g)을 얻었다. 이 결정은 분말 X선 회절 측정의 결과 α형 결정인 것이 확인되었다.

실시예 4

2-(4-메톡시벤질)페닐 6-O-에톡시카르보닐-β-D-글루코피라노시드의 β형 결정

참고예 3에서 얻어진 아몰포스 형태의 2-(4-메톡시벤질)페닐 6-O-에톡시카르보닐-β-D-글루코피라노시드(5.0g)를 오븐에서 125℃에서 3시간 가열했다. 실온까 지 냉각하여 결정(4.96g)을 얻었다. 이 결정의 분말 X선 회절도는 도 2에 나타내는 바 대로이며, β형 결정인 것이 확인되었다.

실시예 5

2-(4-메톡시벤질)페닐 6-O-에톡시카르보닐-β-D-글루코피라노시드(1.0g)를 메탄올(5mL)에 가열용해하고, 이 용액을 약 40℃의 온도에서 감압하에 농축하여 결정을 석출시켰다. 이 결정을 꺼내고 감압하에 약 70℃에서 5시간 건조하여 결정(0.9g)을 얻었다. 이 결정은 분말 X선 회절 측정의 결과 β형 결정인 것이 확인되었다.

시험예 1

안정성 시험

α형 결정 및 β형 결정을 하기의 조건에 보존하고, 이하의 조건의 HPLC에 의해 잔존율을 측정하고, 분말 X선 회절에 의해 결정형의 변화의 유무를 조사했다.

HPLC 조건:

검출 파장; 225nm

칼럼; Inertsil ODS-3

칼럼 온도; 30℃

이동상; 0.02mol/L 인산완충액(pH3.0): 아세토니트릴 혼액

(58:42 → 30:70)

유속; 1.0mL/min

보존 조건1; 40℃/75% 상대습도, 기밀상태, 2개월

보존 조건2; 60℃, 기밀상태, 2개월

그 결과, 본 발명의 α형 결정 및 β형 결정은, 잔존율 및 결정형에 변화가 보이지 않았고, 우수한 보존 안정성을 나타냈다.

시험예 2

인간 SGLT2 활성저해 작용 확인 시험

1) 인간 SGLT2 발현 플라스미드 벡터의 제작

SUPERSCRIPT Preamplification System(Gibco-BRL: LIFE TECHNOLOGIES제)를 사용하여, 인간 신장 유래의 총 RNA(Origene제)를 올리고 dT를 프라이머로 하여 역전사하고, PCR 증폭용 cDNA 라이브러리를 제작했다. 상기 인간 신장 cDNA 라이브러리를 주형으로 하여, 배열 번호 1 및 2로 나타내어지는 하기의 올리고 뉴클레오티드 0702F 및 0712R을 프라이머에 사용하고, Pfu DNA 중합효소(Stratagene사제)를 사용한 PCR 반응에 의해 인간 SGLT2를 코딩하는 DNA 단편을 증폭했다. 증폭된 DNA 단편을 클로닝용 벡터 pCR-Blunt(Invitrogen제)에 이 키트의 표준법에 따라 라이게이션 했다. 상법에 의해 대장균 HB101 콤피턴트 세포(도요보(주)제)에 도입한 후, 형질전환주를 카나마이신 50μg/mL를 포함하는 LB 한천배지에서 선택했다. 이 형질전환주의 1개로부터 플라스미드 DNA를 추출 정제하고, 배열 번호 3 및 4로 나타내어지는 하기의 올리고 뉴클레오티드 0714F 및 0715R를 프라이머로서 사용하고, Pfu DNA 중합효소(Stratagene사제)를 사용한 PCR 반응에 의해 인간 SGLT2를 코딩하는 DNA 단편을 증폭했다. 증폭된 DNA 단편을 제한 효소 XhoI 및 HindIII로 소화한후, Wizard Purification System(Promega제)에 의해 정제했다. 이 정제한 DNA 단편을 융합화 단백질 발현용 벡터 pcDNA3.1(-)Myc/His-B(Invitrogen제)이 대응하는 제한효소 부위에 넣었다. 상법에 의해 대장균 HB101 콤피턴트 세포(도요보(주)제)에 도입한 후, 형질전환주를 암피실린 100μg/mL을 포함하는 LB 한천배지에서 선택했다. 이 형질전환주로부터 플라스미드 DNA를 추출 정제하고, 벡터 pcDNA3.1(-)Myc/His-B의 멀티 클로닝 부위에 삽입된 DNA 단편의 염기배열을 조사했다. Wells 등에 의해 보고된 인간 SGLT2(Am. J. Physiol., Vol. 263, pp.459-465(1992))에 대하여, 이 클론은 1염기의 치환(433번째의 이소로이신을 코딩하는 ATC가 GTC로 치환)을 갖고 있었다. 이 결과 433번째의 잔기의 이소로이신이 발린으로 치환된 클론을 얻었다. 이 카르복시 말단측 최종 잔기인 알라닌의 다음부터 배열 번호 5로 나타내어지는 펩티드를 융합화한 인간 SGLT2를 발현하는 플라스미드 벡터를 KL29라고 했다.

배열 번호 1 ATGGAGGAGCACACAGAGGC

배열 번호 2 GGCATAGAAGCCCCAGAGGA

배열 번호 3 AACCTCGAGATGGAGGAGCACACAGAGGC

배열 번호 4 AACAAGCTTGGCATAGAAGCCCCAGAGGA

배열 번호5 KLGPEQKLISEEDLNSAVDHHHHHH

2) 인간 SGLT2 일과성 발현세포의 조제

인간 SGLT2 발현 플라스미드 KL29를 전기천공법에 의해 COS-7 세포(RIKEN CELL BANK RCB0539)에 도입했다. 전기천공법은 진 펄서 II(Bio-Rad Laboratories제)를 사용하고, OPTI-MEM I 배지(Gibco-BRL:LIFE TECHNOLOGIES제) 500μL에 대하여 COS-7 세포 2×10⁶개와 KL29 20μg을 포함하는 0.4cm 큐벳내에서 0.290kV, 975μF의 조건하에서 행했다. 유전자 도입 후 세포를 원심분리에 의해 회수하고 세포 1큐벳분에 대하여 1mL의 OPTI-MEM I 배지를 가하여 현탁했다. 이 세포 현탁액을 96웰 플레이트의 1웰당 125μL씩 나누어 부었다. 37℃, 5%CO₂의 조건하에 하룻밤 배양한 후, 10% 소태아혈청(산코쥰야쿠(주)제), 100유닛/mL 페니실린G 나트륨(Gibco-BRL:LIFE TECHNOLOGIES제), 100μg/mL 황산 스트렙토마이신(Gibco-BRL: LIFE TECH-NOLOGIES제)을 포함하는 DMEM 배지(Gibco-BRL: LIFE TECHNOLOGIES제)를 1웰당 125μL씩 가했다. 다음 날까지 배양하여 메틸-α-D-글루코피라노시드 흡수 저해 활성의 측정에 제공했다.

3) 메틸-α-D-글루코피라노시드 흡수 저해 활성의 측정

시험 화합물을 디메틸 술폭시드에 용해하고, 흡수용 완충액(140mM 염화나트륨, 2mM 염화칼륨, 1mM 염화칼슘, 1mM 염화마그네슘, 5mM 메틸-α-D-글루코피라노시드, 10mM 2-[4-(2-히드록시에틸)-1-피페라진일]에탄술폰산, 5mM 트리스(히드록시메틸)아미노 메탄을 포함하는 완충액 pH7.4)으로 희석하고, 저해 활성 측정용의 검체로 했다. 인간 SGLT2 일과성 발현 COS-7 세포의 배지를 제거하고, 1웰당 전처치용 완충액(140mM 염화콜린, 2mM 염화칼륨, 1mM 염화칼슘, 1mM 염화마그네슘, 10mM 2-[4-(2-히드록시에틸)-1-피페라지닐]에탄술폰산, 5mM 트리스(히드록시메틸)아미노 메탄을 포함하는 완충액 pH7.4)를 200μL 가하고, 37℃에서 10분간 정치했다. 전처치용 완충액을 제거하고, 재차 동일 완충액을 200μL 가하고, 37℃에서 10분간 정치했다. 제작한 검체 525μL에 7μL의 메틸-α-D-(U-14C) 글루코피라노시드(Am-ersham Pharmacia Biotech)를 가하여 혼합하고 측정용 완충액으로 했다. 대조군용으로 시험 화합물을 포함하지 않는 측정용 완충액을 조제했다. 또 시험 화합물 비존재하 밑 나트륨 비존재하의 기초 흡수 측정용에 염화나트륨 대신에 140mM의 염화콜린을 포함하는 기초 흡수 측정용 완충액을 동일하게 조제했다. 전처치용 완충액을 제거하고, 측정용 완충액을 1웰당 75μL씩 가하여 37℃에서 2시간 정치했다. 측정용 완충액을 제거하고, 세정용 완충액(140mM 염화콜린, 2mM 염화칼륨, 1mM 염화칼슘, 1mM 염화마그네슘, 10mM 메틸-α-D-글루코피라노시드, 10mM 2-[4-(2-히드록시에틸)-1-피페라지닐]에탄술폰산, 5mM 트리스(히드록시메틸)아미노 메탄을 포함하는 완충액 pH7.4)를 1웰당 200μL씩 가하고 곧 제거했다. 이 세정 조작을 2회 더 행하고, 0.2N 수산화 나트륨을 1웰당 75μL씩 가하여 세포를 가용화했다. 가용화액을 피코 플레이트(Packard)에 옮기고, 150μL의 마이크로신티 40(Packard)를 가하고 마이크로 플레이트 신틸레이션 카운트(Packard)로 방사 활성을 계측했다. 대조군의 흡수량으로부터 기초 흡수량을 뺀 값을 100%로 하고, 흡수량의 50%저해하는 농도(IC₅₀값)을 농도 저해 곡선으로부터 최소 제곱법에 의해 산출했다. 그 결과는 이하의 표 1에 나타내는 바 대로이다.

시험화합물	IC₅₀(nM)
참고예 2	350

본 발명의 α형 결정 및 β형 결정은, 간편한 정제 조작에 의해 용이하게 고순도로 할 수 있으므로 공업적 생산에 적합하고, 우수한 보존 안정성을 가지므로 일정한 품질의 의약품을 제조하여 공급하는 점에서 유용하다. 또한, 당해 결정은 유동성이 우수하고 취급이 용이하므로 제제화에 적합하다. 그 때문에, 본 발명의 α형 결정 및 β형 결정은 의약품 원체로서 극히 적합하다.

Claims

분말 X선 회절에 의한 회절 패턴이, 회절각(2θ±0.1) 5.6, 13.8, 14.6, 16.8, 17.7 및 20.8도에 특징적인 피크를 갖는, 2-(4-메톡시벤질)페닐 6-O-에톡시카르보닐-β-D-글루코피라노시드의 결정.
분말 X선 회절에 의한 회절 패턴이, 회절각(2θ±0.1) 4.7, 5.5, 7.3, 8.6, 14.5 및 16.7도에 특징적인 피크를 갖는, 2-(4-메톡시벤질)페닐 6-O-에톡시카르보닐-β-D-글루코피라노시드의 결정.
제 1 항 또는 제 2 항에 기재된 결정을 유효성분으로서 함유하는 것을 특징으로 하는 당뇨병 치료용 의약조성물.
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