CN115505016A - 一种β-半乳糖苷酶活化的ABT-263前药及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种β‑半乳糖苷酶活化的ABT‑263前药及其制备方法与在衰老相关疾病中的应用，该前药通过季铵盐方式将ABT‑263和含半乳糖苷的自裂解连接链进行连接制备一系列前药。该前药具有优异的PBS稳定性，经衰老细胞高表达的β‑半乳糖苷酶活化后释放毒性分子ABT‑263，可增强对衰老细胞的选择性，可应用于制备抗衰老药物。

Description

一种β-半乳糖苷酶活化的ABT-263前药及其制备方法与应用

技术领域

本发明属于药物制剂前药设计领域，涉及β-半乳糖苷酶活化的那维妥拉(Navitoclax)即ABT-263前药及其制备方法与应用。

背景技术

细胞衰老是指细胞进入稳定的周期停滞状态，其主要由损伤性刺激引起，包括端粒缩短、DNA损伤以及致癌信号转导等。细胞衰老的典型特征包括细胞周期停滞(上调p21、p16等细胞周期抑制剂)、氧化损伤(活性氧ROS水平升高)、抗凋亡(抗凋亡蛋白BCL-2家族表达上调)、代谢变化(衰老相关的β-半乳糖苷酶(SA-β-gal)累积)、细胞形态增大、异染色质聚集(SAHF)和衰老相关的分泌表型(SASP)。

细胞衰老不是一个静态的细胞终点，它是与组织修复、癌症、年龄相关疾病等都有紧密联系的一系列动态过程。其中，SASP是衰老细胞发挥其多效性生物学功能的主要机制。SASP作为细胞损伤应激反应的结果，在病理的早期阶段会激活免疫系统、招募免疫细胞，从而清除受损伤的细胞实现组织修复，对人体是有益的。然而，随着年龄的增加及损伤的持续存在，“衰老-清除-再生”过程不能完全进行，导致衰老细胞由于无法被及时清除而长期积累。一方面，衰老细胞占据原来正常细胞的位置影响细胞再生；另一方面，衰老细胞不断分泌SASP影响周围的细胞、组织，形成慢性炎症甚至促进组织退化和恶性转化，参与癌症及特发性肺纤维化(IPF)、糖尿病、动脉粥样硬化、关节炎、骨质疏松等多种与年龄相关的疾病。

由于衰老细胞需要数周到数月的时间才能重新积累且不会分裂，抗衰老药物即使只消除30％的衰老细胞也足以缓解功能障碍，对于目前尚缺乏有效的治疗手段的疾病具有深远意义。BCL-2与BCL-xL、BCL-W等同属BCL-2蛋白家族，具有抑制细胞凋亡的作用。BCL-2抑制剂通过诱导细胞凋亡实现对衰老细胞选择性清除。那维妥拉(ABT-263)是抗凋亡蛋白BCL2、BCL-xL抑制剂，有研究表明其通过清除由于辐照而产生的衰老上皮细胞缓解了小鼠的肺纤维化，并能够清除骨髓和肌肉中的衰老干细胞恢复干细胞功能。然而，ABT-263对中性粒细胞及血小板有毒副作用，在二期临床研究中出现严重的血小板毒性，致使其进一步的临床研究受到限制。因此利用前药策略开发ABT-263前体药物，期望能够降低毒副作用，提高其对衰老细胞的选择性尤为急切。

发明内容

细胞衰老与癌症以及IPF等多种疾病密切相关，因此对衰老细胞靶向清除的研究具有重要意义。本发明的目的是为了克服临床现有抗衰老药物Navitoclax(ABT-263)血小板毒性大的缺陷而提出的一种β-半乳糖苷酶活化的ABT-263前药及其制备方法与应用。将β-半乳糖苷酶活化连接子与ABT-263通过季铵盐键连接构建前药体系。该类前药进入衰老细胞后，可以被衰老相关的β-半乳糖苷酶激活，释放出药物ABT-263，有效杀伤不同类型的衰老细胞；同时由于正常细胞中β-半乳糖苷酶活性较低，前药不被激活，大大降低血小板毒性，提高ABT-263对衰老细胞的选择性。

本发明的第二个目的在于提供上述ABT-263前药的合成方法。

本发明的第三个目的是提供上述ABT-263前药在药物制剂中的应用。

本发明通过以下技术方案实现上述目的：

本发明所述的ABT-263前药及其药学上可接受的盐、溶剂合物、多晶型体或异构体，结构如通式I所示：

其中，R₁独立选自H，NO₂，NHCO-R₂或CON-R₂。

R₂独立包括马来酰亚胺且由以下结构表示：

X包括CF₃COO^-，Cl^-，Br^-或I^-。

进一步地，本发明ABT-263前药优选结构如下：

其中，R₁为H或NO₂；X为Br^-。

一种上述前药的制备方法，制备反应过程如下式所示：

反应步骤包括：

a)化合物1和化合物ABT-263溶于有机溶剂，加热的条件下反应生成季铵盐II；化合物1和ABT-263投料摩尔比为1：0.5～1；有机溶剂为N，N-二甲基甲酰胺或乙腈，或2-丁酮，或甲苯或数种混合；反应温度为40-80℃；反应时间为12-48小时；

b)化合物II溶于有机溶剂中，加入碱脱去乙酰基保护，制得通式I。所述有机溶剂为甲醇、乙醇、乙腈、四氢呋喃及水中的一种或数种混合；所述碱为氨水、三乙胺、甲醇钠、氢氧化锂、氢氧化钠及氢氧化钾中的一种或数种混合。

一种药物组合物，包括所述β-半乳糖苷酶活化ABT-263前药及其药学上可接受的盐、溶剂合物、多晶型体或异构体和药学上可接受的载体。

一种所述β-半乳糖苷酶活化ABT-263前药及其药学上可接受的盐、溶剂合物、多晶型体或异构体和药学上可接受的载体。

一种所述β-半乳糖苷酶活化ABT-263前药及其药学上可接受的盐、溶剂合物、多晶型体或异构体在制备抗肿瘤药物中的应用。

一种所述β-半乳糖苷酶活化ABT-263前药及其药学上可接受的盐、溶剂合物、多晶型体或异构体在制备治疗特发性肺纤维化药物中的应用。

一种所述的药物组合物在制备抗肿瘤药物中的应用。

一种所述的药物组合物在制备治疗特发性肺纤维化药物中的应用。

本发明具有以下有益效果：

本发明合成一系列ABT-263前药，将β-半乳糖苷酶活化连接子与ABT-263通过季铵盐键连接构建前药体系。本发明前药可在在衰老相关β-半乳糖苷酶作用下水解糖苷键，继而促发1，6裂解，释放出ABT-263，选择性凋亡衰老细胞。本发明解决ABT-263这类没有羟基或氨基化合物药物的前药连接问题；改善ABT-263水溶性，提高生物利用度；提高ABT-263对衰老细胞的选择性，降低其毒副作用。

附图说明

图1为化合物Ia的PBS(pH＝7.4)稳定性示意图；

图2为化合物Ia的ABS(pH＝5.0)稳定性示意图；

图3为化合物Ia在小鼠血浆的稳定性示意图；

图4为化合物Ia在人血浆的稳定性示意图；

图5为化合物Ia的β-半乳糖苷酶活化曲线图；

图6为化合物Ia对正常细胞和衰老细胞的细胞毒性示意图。

具体实施方式

结合以下具体实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明，实施例不构成对本发明的限制。

实施例1

化合物Ia的合成

化合物IIa的制备：

氮气保护下，将化合物ABT-263(1g，1.02mmol)和化合物1a(578mg，1.02mmol)溶于10ml乙腈中，加热至70℃反应24小时。反应液减压浓缩，通过反相硅胶柱色谱纯化，得到白色固体IIa(300mg,，收率20％)。¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ8.13(d,J＝6.9Hz,2H),7.97(d,J＝9.0Hz,1H),7.86(d,J＝8.4Hz,1H),7.71(d,J＝8.6Hz,2H),7.48(d,J＝8.7Hz,1H),7.38(s,2H),7.30(d,J＝6.9Hz,4H),7.20(d,J＝6.7Hz,1H),7.12(d,J＝8.3Hz,2H),6.96(d,J＝9.2Hz,1H),6.79(d,J＝8.7Hz,2H),5.64(d,J＝7.5Hz,1H),5.39(s,1H),5.35–5.21(m,2H),4.69(q,J＝13.5Hz,2H),4.54(t,J＝6.2Hz,1H),4.22(t,J＝6.5Hz,1H),4.12(d,J＝6.0Hz,3H),3.93(s,4H),3.60(s,1H),3.51(s,7H),3.16(s,4H),2.79(s,2H),2.26(d,J＝33.0Hz,8H),2.15(s,3H),2.01(d,J＝5.0Hz,8H),1.95(s,3H),1.64(dt,J＝14.6,6.7Hz,1H),1.43(t,J＝5.9Hz,2H),0.96(s,6H)。

化合物Ia的制备：

氮气保护下，将化合物IIa(300mg，0.2mmol)溶于30m氨气的甲醇溶液(7mol/ml)中，室温反应3小时。减压除去溶剂，通过反相硅胶柱分离得到白色固体Ia(260mg，收率90％)。¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ8.20(d,J＝2.1Hz,1H),8.11(s,1H),7.97(d,J＝9.3Hz,1H),7.85(d,J＝8.9Hz,1H),7.76(d,J＝8.5Hz,2H),7.51(d,J＝8.8Hz,1H),7.41(d,J＝8.0Hz,2H),7.26(d,J＝7.2Hz,4H),7.16(d,J＝8.3Hz,3H),7.09(d,J＝9.1Hz,1H),6.96(d,J＝8.7Hz,2H),5.07(d,J＝7.7Hz,1H),4.67(s,2H),4.24(s,2H),4.09–3.79(m,10H),3.74(d,J＝3.1Hz,3H),3.70–3.46(m,10H),3.21(d,J＝13.0Hz,3H),2.79(s,2H),2.43–2.20(m,5H),2.04(s,2H),1.47(d,J＝6.5Hz,2H),0.98(s,6H)。

实施例2

化合物Ia的PBS稳定性实验

配置化合物Ia的10mM DMSO母液，吸取10μL分别加入到1mL的PBS(pH＝7.4)和ABS(pH＝5.0)缓冲液中。放置于恒温振荡器中37℃震荡，分别在1，2，3，5，7天取样100μL加入到100μL乙腈中充分摇匀，使用高效液相色谱测定底物含量。实验结果见附图中图1和图2。在两种pH环境化合物Ia都稳定。

实施例3

化合物Ia的血浆稳定性实验

吸取10μL化合物Ia母液(10mM)分别加入到1mL的人血浆和小鼠血浆中。放置于恒温振荡器中37℃震荡，分别在1，2，3，5，7天取样100μL加入到200μL乙腈中，4℃离心，吸取上清液，使用高效液相色谱测定底物含量。实验结果见附图中图3和图4。化合物Ia在人血浆和小鼠血浆中均能稳定存在。

实施例4

化合物Ia的酶释实验

5μL10mM化合物Ia母液用pH7.4 PBS稀释成480ul，加入20μL12500U/mL β-半乳糖苷酶的PBS溶液于37度恒温箱内震荡。取样时间点：1h、2h、4h、8h、12h、24h、48h。每次取100μL上述溶液，加入200μL冰的甲醇-乙腈(v/v，1∶1)溶液，涡旋1分钟，4度9000rpm离心半小时，使用高效液相色谱测定底物含量。实验结果见附图中图5。37度条件下，化合物Ia在β-半乳糖苷酶催化下，24小时内基本完全释放ABT-263。进一步证实了该前药在衰老细胞中可以释放出活性药物ABT-263。

实施例5

化合物Ia杀伤正常和衰老细胞实验

IMR90细胞密度达到80％左右，辐照12Gy，培养10天；对照细胞为相对应同代数未经过辐照细胞。96孔板细胞铺板密度为，衰老细胞8000/孔，对照组细胞4000/孔。待细胞贴壁后用EMEM+10％血清的培养基配制不同浓度的化合物，Nav(ABT-263)、Ia的浓度为0.00244、0.15625、0.3125、0.625、1.25、2.5、5μM。细胞给药孵育72小时后每孔加25μL CTG试剂(避光加)，避光反应10min。反应结束后用排枪转移80μL至白色96微孔板上，上机检测荧光发光信号。实验结果见附图中图6。前药Ia对衰老细胞的杀伤作用强于正常细胞，具有选择性杀伤衰老细胞的作用，且选择性高于ABT-263。

Claims (8)

1.一种β-半乳糖苷酶活化的ABT-263前药，具有通式I所示结构及其药学上可接受的盐、溶剂合物、多晶型体或异构体：

其中，R₁独立选自H、NO₂、NHCO-R₂或CON-R₂；

R₂独立包括马来酰亚胺且由以下结构表示：

X包括CF₃COO^-、Gl^-、Br^-或I^-。

2.一种权利要求1所述的通式I所示的β-半乳糖苷酶活化的ABT-263前药及其药学上可接受的盐、溶剂化物、多晶型体或异构体，选自：

其中，R₁独立选自H或NO₂；X包括Br^-。

3.一种权利要求1所述的β-半乳糖苷酶活化的ABT-263前药的制备方法，其特征在于，该方法制备反应过程如下式所示：

反应步骤包括：

a)化合物1和化合物ABT-263溶于有机溶剂，加热的条件下反应生成季铵盐II；化合物1和ABT-263投料摩尔比为1∶0.5～1；有机溶剂为N，N-二甲基甲酰胺或乙腈，或2-丁酮，或甲苯或数种混合；反应温度为40-80℃；反应时间为12-48小时；

b)化合物II溶于有机溶剂中，加入碱脱去乙酰基保护，制得通式I；所述有机溶剂为甲醇、乙醇、乙腈、四氢呋喃及水中的一种或数种混合；所述碱为氨水、三乙胺、甲醇钠、氢氧化锂、氢氧化钠及氢氧化钾中的一种或数种混合。

4.一种药物组合物，包括权利要求1所述β-半乳糖苷酶活化的ABT-263前药及其药学上可接受的盐、溶剂合物、多晶型体或异构体和药学上可接受的载体。

5.一种权利要求1所述β-半乳糖苷酶活化的ABT-263前药及其药学上可接受的盐、溶剂合物、多晶型体或异构体在制备抗肿瘤药物中的应用。

6.一种权利要求1所述β-半乳糖苷酶活化的ABT-263前药及其药学上可接受的盐、溶剂合物、多晶型体或异构体在制备治疗特发性肺纤维化药物中的应用。

7.一种权利要求4所述的药物组合物在制备抗肿瘤药物中的应用。

8.一种权利要求4所述的药物组合物在制备治疗特发性肺纤维化药物中的应用。

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