WO2006108559A2 - Vorrichtung und verfahren zur untersuchung einer probenflüssigkeit - Google Patents

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WO2006108559A2
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Ralf-Peter Peters
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Definitions

  • the present invention relates to an apparatus and a method for examining a sample liquid, in particular by means of the ELISA method.
  • the present invention is concerned with microfluidic systems or devices whose structures have a size of about 1 to 1000 ⁇ m and / or whose cavities each have a volume of about 1 to 1000 ⁇ l.
  • the following statements relate in particular to devices and methods in which capillary, pressure and / or centrifugal forces act and are crucial in particular for the function.
  • ELISA comes from the English language and means "enzyme-linked immunosorbent assay".
  • this term is to be understood as meaning a process in which an enzyme is bound to an analyte, in particular to a complex of an analyte and an antibody.
  • a substrate is modified or converted into a detection substrate, in particular a fluorescent substance or the like, in a detection reaction.
  • a detection substrate By detecting the detection substrate, a quantitative determination of the analyte in the sample liquid is possible.
  • a dilution series of the sample liquid is usually examined in this way.
  • the ELISA method is usually performed manually or automatically - for example by means of pipetting robots - on an open pipetting plate with, for example, 96 open Aufhahmehuntn.
  • a sample liquid to be examined is diluted several times in succession in the receiving chambers in order to achieve different dilution ratios.
  • the sample liquid with the different dilution ratios is pipetted into prepared Aumahmehuntn in which an analyte in the sample liquid can be bound to immobilized antibodies.
  • multiple rinsing with a washing liquid takes place. Then one is sent to a add antibody bound enzyme.
  • the detection antibody binds to the complex of analyte and immobilized antibody.
  • a substrate is added, which is converted or modified by the enzyme into a detection substrate.
  • This detection reaction is very time critical. The stopping of the detection reaction takes place, for example, by adding acid. The problem is that this can not be done simultaneously in all Aufhahmehuntn in which the detection reaction takes place, and that at higher volumes by diffusion and / or mixing processes different delays may occur.
  • the detection substrate is determined, for example, optically, in particular by fluorescence measurement or the like. From the values determined, the concentration of the analyte in the sample liquid can be determined.
  • the described method is very complicated and error-prone. In particular, inaccuracies add up due to the large number of individual steps.
  • the preparation of the receiving chambers for immobilizing the antibody is correspondingly expensive and also associated with the use of large amounts of liquid.
  • the reactions often proceed very slowly, so that the ELISA method in the hitherto customary form is very time-consuming.
  • WO 03/018198 A1 discloses microfluidic devices in which a liquid, in particular a sample liquid, can be conducted from a receiving chamber into connected chambers and divided into defined individual quantities and / or with one other liquid can be mixed and preferably react. Similar microfluidic systems are also known from US 6,706,519 Bl, US 6,719,682 B2, US 2004/0203136 A1, WO 00/78455 A1 and WO 01/87485 A2.
  • US 2004/0203136 A1 discloses a method and an apparatus for the examination and dilution of samples and reaction liquids.
  • Several dosing channels are connected via a common channel to a first receiving chamber for a sample and can be filled with the sample.
  • a second receiving chamber for a dilution liquid is connected to the common channel and thus to the metering channels.
  • the dilution liquid is conducted via the common channel into the metering channels, so that the metered sample quantities are transferred into subsequent mixing chambers, which are finally completely filled by the inflowing dilution liquid. This does not allow optimal or universal dilution.
  • the present invention has for its object to provide an apparatus and a method for examining a sample liquid, wherein a cost-effective, rapid and / or accurate quantitative examination, in particular by means of the ELISA method, is made possible.
  • One aspect of the present invention resides in a plurality of first metering chambers for preferably exclusively receiving sample liquid - A -
  • first, common Aufhahmehunt and a plurality of second metering chambers for preferably exclusive inclusion of a dilution liquid from a second, common Aumahmehunt provide.
  • the first and / or second metering chambers vary in their volumes.
  • the first and second metering chambers are pairwise associated with each other and each associated with an associated reaction chamber, so that by pressure and / or centrifugal forces contained in the first and second metering chambers volumes of sample liquid and dilution liquid into the respective associated reaction chambers are transferable and miscible, whereby the sample liquid is diluted with different dilution ratios.
  • This proposed dilution is also referred to below as the "parallel dilution".
  • the inaccuracies or errors arising in the prior art, such as US 2004/0203136 A1, by using common channels or the like, are avoided.
  • the metering of the first and second fluid is carried out independently of each other, so that otherwise occurring subsequent errors in the dosage can be avoided.
  • the first and second metering chambers are preferably connected via separate channels to the first and second Aumahmehunt so that no undefined premixtures, impurities or mixing errors can occur.
  • the two liquids are mixed only in the respective reaction chamber - ie quickly or selectively and / or under defined conditions, so that, for example fast reactions can take place in a defined manner.
  • the liquids from the first and second metering chambers can be transferred and mixed simultaneously or successively into the reaction chambers.
  • the volumes of the first and second metering chambers vary in opposite directions. If the metering chambers are arranged, for example, in two rows running parallel to each other or parallel, the volume of the first metering chambers increases in one direction (in particular optionally in or opposite to the filling direction), while the volume of the second metering chambers decreases in this direction.
  • a dilution series can be realized over a large dilution range.
  • the individual sums of the mating pairs of first and second metering chambers are the same.
  • This is an optimal space utilization, especially on a CD, conducive.
  • equal volumes of diluted sample liquid with different dilution ratios result, so that correspondingly the other subsequent cavities, in particular reaction chambers and the like, can all be uniformly designed for the same volumes, whereby the design is simplified and standardized.
  • a single parallel dilution suffices to cover a sufficiently large dilution range.
  • at least one further, preferably also parallel, dilution can take place after the first parallel dilution.
  • This sub-dilution can be done, for example, only for one, for example, the already diluted with the largest dilution ratio Probenfact- keitsmenge.
  • several or all of the liquid volumes of differently diluted sample liquid produced by the first parallel dilution may each be subjected to a separate further, in particular likewise parallel, dilution.
  • the dilution liquid already used or supplied for the first dilution is preferably used for the further dilution. Then a renewed supply of dilution liquid is not required, whereby the handling simplifies, in particular the required pipetting of liquids is minimized.
  • a (third) common Aumahmekanimer is provided for a plurality of reaction chambers.
  • several liquids can be supplied one after the other in the receiving chamber-that is to say sequentially-for example by pipetting or in some other way-in particular, therefore, externally or externally.
  • reaction chambers it becomes possible to prepare several or all reaction chambers in a suitable manner with minimal effort, in particular with very few pipetting operations, ie, for example, to immobilize a reagent, such as an antibody or the like, in the reaction chambers.
  • a reagent such as an antibody or the like
  • the common receiving chamber assigned to the reaction chambers allows the detection reaction to be carried out, for example by feeding corresponding liquids with the enzyme, the substrate or the like, with minimal pipetting effort.
  • reaction chambers are each assigned a detection or examination chamber and the detection reactions which preferably take place enzymatically by an immobilized enzyme in the reaction chambers can be stopped by the liquid present in the reaction chambers being introduced into the associated examination chamber - Preferably by pressure, capillary and / or centrifugal forces - is transferred.
  • This transfer takes place in particular simultaneously for several or all reaction chambers, so that the detection reactions can also be stopped simultaneously in these reaction chambers.
  • the examination in particular the detection of detection substrate or the like formed in the respective liquid, can then take place successively in the examination chambers as required.
  • a considerably greater accuracy is achieved when stopping the particular enzymatic table and accordingly time-critical detection reactions allows.
  • FIG. 1 shows a not to scale view of a part of a proposed device according to a first embodiment
  • Fig. 2 is a schematic view of part of a proposal
  • Fig. 3 is a not to scale view of a portion of a proposed device according to a third embodiment.
  • FIG. 1 shows a part of a proposed device 1 according to a first embodiment in a very schematic view, not to scale.
  • the proposed device 1 is, in particular, a microfluidic system which preferably has the shape of a round disk, for example a compact disk (CD) or the like, and accordingly has an axis of rotation 2 indicated in FIG. 1 for generating Centrifugal forces is rotatable.
  • CD compact disk
  • FIG. 1 shows a part of a proposed device 1 according to a first embodiment in a very schematic view, not to scale.
  • the proposed device 1 is, in particular, a microfluidic system which preferably has the shape of a round disk, for example a compact disk (CD) or the like, and accordingly has an axis of rotation 2 indicated in FIG. 1 for generating Centrifugal forces is rotatable.
  • CD compact disk
  • the proposed device 1 is used to examine a sample liquid 3, in particular by means of the ELIS A method.
  • the following description is therefore directed essentially to the application or implementation of the ELISA method, where necessary, also supplementary or alternative measures or process steps can be performed.
  • the proposed device 1 or the proposed method can in principle also be used for other examinations or methods.
  • Fig. 1 shows the sample liquid 3 immediately after filling in a first, common Aufhahmehunt 4.
  • first metering chambers 5 - in the illustrated embodiment four first metering chambers 5a to 5d - are to the first Aufhahmehunt 4 by corresponding channels or the like.
  • - In DarStellungsbeispiel by channel 18 - connected and preferably arranged in a row in the circumferential direction.
  • FIG. 1 shows the device 1 in a state immediately after the sample liquid 3 has been introduced into the first receiving chamber 4, ie before the sample liquid 3 flows into the first metering chambers 5.
  • the device 1 has a second common receiving chamber 7 for receiving a diluting liquid 8.
  • a second receiving chamber 7 for receiving a diluting liquid 8.
  • the diluting liquid 8 flows via channel 19 into the second metering chambers 9. Excess diluting liquid 8 can, if required, flow into an optionally provided second collecting chamber 10.
  • the channel 19 preferably connects the second Aufhahmehunt 7 with the second collection chamber 10.
  • the metering chambers 5 and 9 are preferably formed, for example by means not shown guide elements for the liquids 3 and 8, that the metering chambers 5, 9 and possibly the channels are completely filled without gas or air inclusion. Displaced air can escape via the preferably open collector chambers 6, 10 and / or via vent openings, not shown, which are associated in particular with the channels 18 and 19 and / or the metering chambers 5, 9.
  • the first and second metering chambers 5 and 9 are reaction chambers 11 - corresponding to the number of first and second metering chambers 5a to 5d and 9a to 9d in the illustrated embodiment, that is, four reaction chambers 11a to 11a
  • Hd - assigned which are arranged in the illustrated embodiment preferably in a row parallel to the first and second metering chambers 5, 9 and / or with respect to the rotation axis 2 radially outside the first and second metering chambers 5, 9.
  • the first and second metering chambers 5, 9 are preferably assigned in pairs to each other and each one reaction chamber 11, each pair is fluidly connected to the associated reaction chamber 11 by corresponding, in particular radially extending, preferably channel-like compounds 12, for example, the first metering chamber 5b and second metering chamber 9b with the associated reaction chamber I Ib.
  • the letters a to d thus indicate the assignment of the individual chambers 5, 9, 11 and 16 in the representation example. Accordingly, the liquid transfer takes place, in particular for dilution, mixing and / or reaction.
  • the first metering chambers 5 and 9 with the sample liquid 3 and the dilution liquid 8 preferably automatically fill themselves due to pressure and / or capillary forces, in particular when filling the liquid 3 or 8 in associated Aufhahmehuntn 4 and 7 by means of a non-illustrated Pipette o. The like. And due to the pressure exerted on the liquid 3 and 8, respectively.
  • other forces possibly even centrifugal forces, depending on the arrangement and design, alternatively or additionally be used.
  • the volumes of sample liquid 3 present in the first metering chambers 5 and the volumes of dilution liquid 8 present in the second metering chambers 9 can then be transferred into the respective associated reaction chamber 11 by appropriate centrifugal forces (caused by corresponding rotation of the device 1 about the axis of rotation 2).
  • centrifugal forces caused by corresponding rotation of the device 1 about the axis of rotation 2.
  • radial transfer takes place, the sample liquid 3 and dilution liquid 8 mixing in each case.
  • other forces for example pressure forces, capillary forces or the like, can act to convert the said volumes into the reaction chambers 11.
  • the first metering chambers 5 and / or second metering chambers 9 vary in their volumes. In fact, the volumes are selected such that different dilution ratios of the sample liquid 3 are achieved in the reaction chambers 11.
  • both the volumes of the first metering chambers 5 and the volumes of the second metering chambers 9 vary.
  • a first metering chamber 5d with a small volume is assigned a second metering chamber 9d with a large volume and vice versa.
  • this is achieved by the volume of the first metering chambers 5 increasing or decreasing in a circumferential direction and the volumes of the second metering chambers 9 decreasing or increasing inversely in this circumferential direction.
  • the sums of the volumes of the pairwise associated first and second metering chambers 5a and 9a, 5b and 9b, 5c and 9c and 5d and 9d are at least substantially equal.
  • the individual volumes of differently diluted sample liquid 3 are of equal size and the reaction chambers 11 and any other downstream chambers or the like can be made uniformly large.
  • the reaction chambers 11 and any other downstream chambers or the like can be made uniformly large.
  • the previous and in the following description is always turned off on the respective volume of the metering chambers 5 and 9 respectively.
  • well-defined volumes are required.
  • valve devices, obstacles or liquid stops are present and transferred and mixed, valve devices, obstacles or liquid stops, not shown, For example, to the connections 12 to the channels 18, 19 associated vents and / or the like. Provided.
  • first separation points T a to T le for the liquid 3 in the first channel 18 is formed, in particular between the first Aufnah- measuring chamber 4 and the first metering chamber 5 a, between the individual dosing chambers 5 and between the last dosing chamber 5d, and the first plenum 6.
  • second separation points T 2a to T 2e are formed for the liquid 8 in the second channel 19, in particular between the second receiving chamber 7 and the following second metering chamber 9a, see between the second metering chambers 9 and between the last metering chamber 9d and the second Receiving chamber 10.
  • the first and second separation points T can alternatively or additionally be formed at the transition to individual chambers and / or other suitable locations.
  • channel stops KSi and KS 2 are formed in the channel 18 and 19 between the last separation point Ti e and T 2e and the respective collection chamber 6 or 10 or at the transition to the respective collection chamber 6 and 10, respectively Such flow resistance for the respective liquid 3 and 8 to form that when filling initially the first and second metering chambers 5 and 9 are completely filled with the respective liquid 3 and 8, before this in the associated collection chamber 6 or 10 can continue to flow.
  • first liquid stops Si 3 to S d and second liquid stops S 2a to S 2d are preferably in the radially extending connections 12 between the respective first metering chambers 5 and the second metering chambers 9 and the second metering chambers 9 and the reaction chambers 11.
  • these liquid stops S can alternatively or additionally also be formed at the transitions to the respective chambers.
  • the first liquid stops Si prevent the sample liquid 3 from undesirably filling the second metering chambers 9 when the first metering chambers 5 are filled.
  • the first liquid stops S] also prevent the diluting liquid 8 from undesirably filling the first metering chambers 5 or displacing the sample liquid 3 from the first metering chambers 5 when filling the second metering chambers 9.
  • liquid stops for example, be provided at the transition of the compounds 12 in the respective second metering chambers 9.
  • the second liquid stops S 2 prevent the dilution liquid 8 from undesirably flowing into the reaction chambers 11 during the filling of the second metering chambers 9, whereby a defined metering would no longer be possible.
  • the channel stops KS and the liquid stops S are formed in such a way, or tuned to the liquids 3 and 8 or to the particular during the filling by means not shown pipettes o. The like. Occurring pressures that the first and second liquid stops S 1 and S second during the filling of the first and second metering chambers 5, 9 with the liquids 3, 8 can not be overcome, but only in the later desired transfer of the individual volumes of liquid 3 and 8 from the metering chambers 5, 9 in the reaction chambers 11, in particular only with corresponding rotation of the device 1 or only with corresponding centrifugal forces.
  • the liquid stops S are designed such that the second liquid stops S 2 can be opened or overcome before the first liquid stops S].
  • first and second liquid stops S This can also be achieved with the same or similar configuration and characteristic of the first and second liquid stops S, that greater centrifugal forces than in the first liquid stops Si occur at the second liquid stops S 2 , the S radially outward relative to the first liquid Si stops or act.
  • the separation points T and liquid stops S lead to defined volumes of liquid 3 and 8, which are mixed together.
  • the liquid 3 or 8 breaks off at the separation points T and then flows via the respective, in particular radial, connection 12 into the associated reaction chamber 11
  • the volume of liquid assigned to the second metering chamber 9b is determined or defined by the two second separation points T 2b and T 2c and the two liquid stops S 1b and 2b .
  • the to be transferred and metered volume of sample liquid 3 is, for example, for the first metering chamber 5b through the two separation points T 1 and T b] c and stop by the liquid Si b limited. This applies correspondingly to the other liquid volumes of the further metering chambers 5, 9.
  • the separation points T by corresponding, not shown ventilation o.
  • the liquid stops S and / or the channel stops KS are preferably formed by a corresponding constriction, sudden cross-sectional widening and / or modification of the wetting behavior, so that the respective liquid 3, 8, 14 can not or can not readily overcome the respective stop S, KS. Rather, in particular, a predetermined, for the individual stops S, KS, if necessary, different centrifugal force, compressive force o. The like. Required to overcome the respective stop S, KS can.
  • reaction chamber 11 a desired reaction and in particular a plurality of desired reactions can then take place or be carried out, as will be discussed in more detail later.
  • the reaction chambers 11 are preferably first prepared before the diluted sample liquid 3 is supplied. This preparation takes place in particular before the sample liquid 3 is introduced into the first receiving chamber 4 and the diluting liquid 8 into the second receiving chamber 7 and will be explained in more detail below.
  • the device 1 preferably has one, in particular only a single, common receiving chamber 13 for receiving a liquid 14, in particular a sequential receptacle of different liquids 14, such as a reaction liquid, a washing liquid, a blocking or fixing liquid, a substrate liquid or the like. on.
  • the reaction chambers 11 are connected to the third receiving chamber 13, so that in particular by pressure, capillary and / or centrifugal forces a filled into the receiving chamber 13 liquid 14 via corresponding channels or the like.
  • a channel 20 preferably extends in the circumferential direction and / or parallel to the channels 18 and 19 - in the
  • Reaction chambers 11 can flow. Excessive and / or extruded
  • Liquid 14 is preferably collected in an optionally provided, third collection chamber 15, wherein an optimal channel stop KS 3 can ensure that the liquid 14 completely fills the reaction chambers 11 before it flows into the third collection chamber 15.
  • the device 1 is embodied such that the third receiving chamber 13 is first completely emptied or emptied before another liquid 14 is supplied to the third receiving chamber 13, for example by pipetting.
  • the emptying of the third Aufhahmehunt 13 can be achieved, for example, that after filling the third receiving chamber 13 with a liquid 14 by capillary forces automatically flows through the reaction chambers 11 and possibly the third collection chamber 15 until the third Aufhahmehunt 13 fully. is constantly emptied. Additionally or alternatively, this can be achieved by centrifugal forces, in particular in the case of a radial gradient (increase in the radial distance to the pivot point 2) of the channel 20 to the third collection chamber 15, and corresponding rotations of the device 1, and / or other forces.
  • reaction chambers 11 can be emptied again, if necessary, before a new liquid 14 is introduced into the third receiving chamber 13 and this new liquid 14 flows into the reaction chambers 11.
  • the prior emptying of the reaction chamber 11 is then preferably carried out by centrifugal forces, not shown valve means or the like. To allow a controlled emptying of the reaction chambers 11.
  • a liquid 14 containing a reagent, preferably an antibody, is first of all introduced into the third receiving chamber 13 and passed into the reaction chambers 11 in order to immobilize the reagent in the reaction chambers 11, in particular To bind the antibody in the appropriately prepared reaction chambers 11 and to coat the Discussskammem 11 with the antibody.
  • reaction chambers 11 are rinsed with a washing liquid, which is filled as the next liquid 14 in the third Aumahmehunt 13, to remove unbound reagent.
  • analyte contained in the sample liquid 3 can bind in the illustrated embodiment, in particular to the immobilized reagent, in particular the immobilized antibody.
  • unbound analyte is rinsed or washed from the reaction chambers 11, in particular by a single filling of a washing liquid 14 in the third Aufhahmehunt 13 to displace the existing liquids 3, 8 from the reaction chambers 11, and / or by centrifugal forces or other forces.
  • another liquid 14, which in particular contains an enzyme bound to a detection antibody, is fed to the reaction chambers 11, in that this liquid 14 is again supplied to the third receiving chamber 13.
  • the detection antibody is designed such that it binds together with the enzyme to the complexes formed from the immobilized antibodies and the analyte in the reaction chambers 11.
  • Unbound detection antibodies and enzymes are subsequently rinsed out of the reaction chambers 11 in a washing step by preferably supplying a further washing liquid 14 once.
  • a substrate solution as further liquid 14 is preferably again supplied to the reaction chambers 11 via the third receiving chamber 13.
  • the substrate is converted or modified by the enzymes in the reaction chambers 11 in an enzymatic detection reaction, so that a later detectable detection substrate, in particular a fluorescent or other dye or the like, is formed.
  • a later detectable detection substrate in particular a fluorescent or other dye or the like
  • the supply of the various liquids 14, which preferably takes place exclusively via the common third receiving chamber 13 by sequential supply of the liquids 14, allows a very quick and easy preparation of the reaction chambers 11 and / or conducting the reactions in the reaction chambers 11, wherein the Pipettieraufwand , the required washing steps and / or the required amounts of liquid compared with the prior art - in particular over the conventional ELIS A method in an open pipetting plate - are significantly reduced.
  • the detection reactions are particularly preferably stopped by separating the liquid with the substrate and the detection substrate from the (immobilized) enzymes, reaction catalysts or other reaction partners and / or additionally provided examination chambers 16, by the liquid in the reaction chambers 11 containing the substrate and the detection substrate to stop the detection reactions in each case in an associated examination chamber 16 is transferred.
  • This transfer preferably takes place simultaneously for several or all reaction chambers 11, so that the detection reactions are stopped at the same time.
  • the said transfer or stopping by centrifugal forces by the device 1 is rotated accordingly.
  • the transfer is additionally or alternatively also possible by other forces, for example pressure or capillary forces, by means of corresponding valves or the like.
  • a sequential examination or detection of the detection substrate in the examination chambers 16 can take place-in particular optically, for example by fluorescence measurement. From the values obtained and taking into account the different dilution ratios, an extremely accurate, in particular quantitative, determination of the analyte in the sample liquid 3 can then be carried out.
  • reaction chambers 11 may be associated with an optionally provided, indicated in Fig. 1 by dashed lines collecting channel 17, which is connected for example via the examination chambers 16 and corresponding, preferably radial connections 12 to the reaction chambers 11 in order to empty the reaction chambers 11 liquid from the reaction chambers 11, in particular when the reaction chambers 11 are emptied by centrifugal forces by corresponding rotation of the device 1. These liquids can then be discharged through the examination chambers 16 or through not shown, direct connections or the like. Into the collecting channel 17. Such an emptying of the reaction chambers 11 can be carried out, for example, to remove liquids 3, 8 and / or 14 before feeding a new liquid 14 into the reaction chambers 11.
  • third liquid stops S 3a to S 3C i are preferably formed in the (radial) connections 12 between the reaction chambers 11 and the checking chambers 16.
  • the third liquid stops S 3 can in particular, together with the second liquid stops S 2, prevent an undesired escape of the liquid 14 into other regions, so that the liquids 14 are desirably for example only in the third collection chamber 15 or, if necessary, when the third liquid stop S is overcome 3 can be emptied or derived via the examination chambers 16 and optional fourth liquid stops S 4 into the collecting channel 17.
  • the third liquid stops S 3 ensure a defined holding of the liquid volumes of liquids 3 and 8 transferred or metered into the reaction chambers 11, thus preventing uncontrolled and undesirable outflow from the reaction chambers 11.
  • separating points or liquid stops not shown in the channel 20 or in other connections between the reaction chambers 11 and / or to the third receiving chamber 13 or third collecting chamber 15 may be provided, as required, to prevent unwanted transfer of diluted sample liquid 3 from a reaction chamber 11 in an adjacent reaction chamber 11 - for example, when mixing by accelerating and decelerating - to be able to prevent.
  • the channel 20 and, in particular, its sections extending between the individual reaction chambers 11 may also have a different course, deviating in the radial direction, from the course with an at least substantially constant distance or radius to the pivot point 2, in order to prevent unwanted transfer of dilute sample liquid 3 between individual reaction chambers 11 to prevent.
  • fourth liquid stops S 4a to S 4d are arranged in the radial connections 12 between the examination chambers 16 and the optional collection channel 17, in order to prevent an undefined outflow or discharge of liquid from the examination chambers 16.
  • the third and fourth liquid stops S 3 and S 4 can in turn also be formed, as required, at the transitions from the reaction chambers 11 and 16 to the respective connections 12.
  • the parallel dilution it should be noted that preferably in a single dilution step-that is, in a parallel dilution-3 to 20, in particular about 10, dilutions or different dilution ratios are produced. Of course, several can parallel dilutions occur simultaneously on the device 1. Accordingly, the device 1 may, if necessary, also have a plurality of arrangements, as shown in FIG.
  • the preferably provided curvature has been omitted in the preferably provided ring structure for placement on a round disk, such as a CD or the like, in order to allow a better clarity.
  • a round disk such as a CD or the like
  • the illustration of FIG. 2 is also not to scale.
  • the illustrated lengths, widths, proportions and the like do not correspond to the absolutely necessary or preferred conditions. This is also the case in the illustration according to FIG. 1.
  • a further dilution ie a lower dilution
  • This further dilution is again carried out in the illustration shown in FIG. 2 as a parallel dilution.
  • an under-dilution or further dilution for several or all reaction chambers 11 may be provided.
  • the further parallel dilution takes place substantially in accordance with the parallel dilution already explained above by means of the first and second metering chambers 5 and 9 and the downstream reaction chambers 11.
  • additional first metering chambers 5 'and additional second metering chambers 9' are provided.
  • the additional metering chambers 5 'and 9' preferably have corresponding volume ratios - in particular correspondingly reduced absolute volume - as the first and second metering chambers 5 and 9.
  • the transfer of the individual liquid volumes into the associated additional reaction chambers 11 ' is again preferably effected by centrifugal forces.
  • other forces in particular pressure and / or capillary forces may act, or valves or the like may be used.
  • another additional or additional dilution liquid can be separately supplied to the additional second metering chambers 9 'via an additional receiving chamber (not shown) for further dilution.
  • reaction chambers 11 the contents of which are not further diluted, each associated with additional reaction chambers IT, which are arranged in particular to a corresponding extent as the further dilution serving additional reaction chambers 11 'in order for all dilution stages a simultaneous examination, in particular binding of the analyte the immobilized reagent to ensure or facilitate.
  • an additional first collection chamber 6 ' may be provided, which is connected to receive additional sample liquid 3 to the additional first metering chambers 5'.
  • an additional second collection chamber 10 ' may be provided, which is arranged to receive excess dilution liquid 8 at the additional second metering chambers 9'.
  • the first metering chambers 5 are connected in parallel to a first, in particular common channel 18, which leads from the first receiving chamber 4 to the first collecting chamber 6.
  • a filling by pressure for example by attaching a pipette, not shown, or the like.
  • To the first, open receiving chamber 4, wherein thereby taking place (partial) filling of the first collection is melamine chamber 6 with appropriate dimensioning uncritical.
  • the first channel 18 is emptied after filling the first metering chamber 5 - in particular by capillary and / or centrifugal forces - before transferring the sample liquid 3 from the first metering chambers 5 into the associated reaction chambers 11 into the first collecting chamber 6.
  • This allows particularly accurate dosages, which then lead to correspondingly precise dilution series in the subsequent mixing with dilution liquid 8 and in particular in the ELISA method to very accurate quantitative results.
  • the second metering chambers 9 are preferably connected in a corresponding manner parallel to a second, in particular common, channel 19, which connects the second receiving chamber 7 to the second collecting chamber 10. Accordingly, the second metering chambers 9 can be filled faster with the diluting liquid 8.
  • the filling with the diluting liquid 8 also follows by pressure, in particular by applying a pipette, not shown, or the like.
  • the second channel 19 is preferably completely emptied into the second collection chamber 10 after filling the second metering chambers 9, in particular by capillary and / or centrifugal forces, before the dilution liquid 8 is transferred from the second metering chambers 9 into the associated reaction chambers 11 becomes.
  • This results in a very accurate dosage, since the dilution liquid 8 defined at the transitions (separation points T 2 ) from the channel 19 to the metering chambers 9 and corresponding connections tears off, as already explained above for the sample liquid 3 and the first metering chambers 5. Accordingly, this allows particularly accurate dilution series and in particular very accurate quantitative investigations according to the ELISA method or in any other way.
  • the first and second channels 18, 19 are preferably emptied simultaneously.
  • the separation points T are formed in particular by corresponding constrictions and / or kinks to ensure the desired defined tearing of the liquid.
  • the parallel connection provided in the third embodiment of the first metering chambers 5 to the first channel 18 and / or the second metering chambers 9 to the second channel 19 allows, as already explained, a particularly fast and parallel filling of the chambers 5 and 9 and is required Also, independently of other aspects and features of the present Ausruhrungsformen feasible.
  • the channels 18 and 19 preferably have in turn channel stops KS 1 and KS 2 to the respective collection chamber 6 and 10 down to ensure that first the respective metering chambers 5 and 9 are completely filled before the corresponding liquid 3 and 8 in the associated collection chamber 6 and 10 can continue to flow.
  • the channel stops KS are designed such that they are supplied by the respective liquid 3 or 8 of the pressure for feeding - for example, by a pipette, not shown, with which the respective liquid is supplied to the associated Aumahmehunt 4 and 7 - (first) can be overcome after complete filling of the associated metering chambers 5 and 9 respectively.
  • complete filling of the metering chambers 5 and 9 with the respective liquid 3 or 8 can be ensured.
  • the channels 18 and 19 are preferably substantially rectilinear or with only minor dislocations or kinks and / or preferably without V or U-shaped arcs.
  • the channels 18 and 19 alternatively or additionally preferably have a radial gradient, in particular between the respective start and end or the respective Aumahmehunt 4 and 7 and 6 and 10 collecting chamber, so that the centrifugal forces increasing with increasing radius lead, with appropriate rotation of the device 1, to the desired emptying of the channels 18, 19.
  • the associated first metering chambers 5 and second metering chambers 9 are not connected in series as in the first or second embodiment (the order being freely selectable) or connected in series to the associated reaction chambers 11, but preferably in parallel or quasi connected in parallel to the associated reaction chambers 11. Particularly preferred is the "quasi-parallel" connection, which is explained in more detail below with reference to FIG. 3.
  • the second metering chambers 9 are connected via connections 12, which preferably extend at least substantially radially, to the associated reaction chambers 11.
  • the second liquid stops S 2 prevent an uncontrolled flow of the diluting liquid 8 from the second metering chambers 9 via the connections 12 into the reaction chambers 11.
  • the first metering chambers 5 are now in turn - preferably via first liquid stops Si - connected to the associated compounds 12, in particular after each of the second liquid stops S 2 .
  • the first liquid stops Si are each formed, for example, by a corresponding constriction or sudden cross-sectional widening, so that the sample liquid 3 from the first metering chambers 5 - preferably even upon reaching an angular velocity or centrifugal force, which leads to a transfer of the diluting liquid 8 from the second metering chambers 9 leads into the associated reaction chambers 11 - not or not readily transferred to the associated reaction chambers 11 via the connections 12. Rather, preferably a downstream wetting - in particular the liquid stops Si - by the dilution liquid 8 is required.
  • the feed can also be reversed, ie the dilution liquid 8 can be introduced into sample liquid streams in the connections 12.
  • the third embodiment it is not decisive whether the first liquid stops S 1 or the second liquid stops S 2 are first overcome by the respective liquid 3 or 8, since in both cases thorough mixing of the two liquids 3 and 8 - At least in the reaction chambers 11 - can be reached. Accordingly, the third embodiment is a very robust system.
  • Another aspect of the third embodiment is that, for example, the channels 18, 19, but also other cavities, connections 12 or the like., Not always on a flat side of the carrier - especially not on the flat side, in which the chambers 4 to 7, 9 to 11, 13, 15 and 16 - must be formed, in which the cavities, channels or the like. Are formed. Rather, in the illustration according to FIG. 3, the sections indicated by dashed lines are preferably formed on the underside, while the solid cavities, channels and the like are preferably formed on the upper side or from the upper side. The upper and lower side cavities, channels and the like are then connected to one another by means of corresponding apertures, bores or the like. This allows much greater freedom in the design of the device 1, in particular with regard to the arrangement, configuration and connection of the chambers.
  • the cavities, channels and the like which are preferably formed by the flat sides (upper and lower sides), are then covered on each flat side, preferably by a cover (not shown), for example a foil or disk, so that an at least quasi-closed system is formed , Only the required openings, for example for filling the chambers 4, 7, 13 and for venting or the like. Then then, possibly even closable, openings to the environment.
  • reaction chambers 11 are not shown to scale. It should also be noted that the volumes of individual NEN chambers can also vary greatly depending on the depth of the chambers. Furthermore, examination chambers 16 according to the first or second embodiment can of course also be connected to the reaction chambers 11 if required.
  • the device 1 according to a feasible also independent of the present embodiment aspect of the present invention of several, preferably segmental modules M constructed, which can be arranged for example by means of an adapter or holder, not shown, in a disc-shaped configuration.
  • This modular design allows the combination of different examinations as needed. In Fig. 3, only a single module M is shown schematically.
  • first, second and third embodiments can also be combined as desired. Furthermore, individual aspects can also be used independently of the present embodiments in other embodiments or applications.
  • the mixing of the sample liquid 3 with the dilution liquid 8 - especially in the reaction chambers 11 - can be required or achieved by braking and accelerating the rotation of the device 1.
  • the diameter of the device 1 or the CD is preferably about 50 to 250 mm, in particular about 125 mm.
  • the thickness is preferably 1 to 6 mm, in particular about 3 mm.
  • the device 1 is preferably made of a suitable plastic.
  • the depth or width of the microstructures is preferably 20 to 1000 ⁇ m, in particular approximately 200 ⁇ m, in the illustrated embodiment.
  • All microstructures are preferably covered by a suitable, not shown or transparent cover. Only the receiving chambers 4, 7 and 13, possibly the collecting chambers 6, 10, 15, if necessary, the collecting channel 17 and / or other not shown vent openings or the like are formed open to the outside. Thus, the evaporation losses can be minimized and accordingly work with high accuracy with low volumes of liquid.
  • the volumes of liquids to be used are about 10 to 2,000 ⁇ l per liquid, preferably only about 50 to 200 ⁇ l.
  • the sum of the volumes of the paired first and second metering chambers 5, 9 is preferably 1 to 100 .mu.l, in particular about 10 ul.
  • the said sum and the respective volumes of the reaction chambers 11 and the examination chambers 16 are the same.
  • sample liquid and dilution liquid 8 are preferably also very generally understood as different liquids.
  • the ELISA method or another method can be very easily and very quickly and in particular with the use of very small amounts of liquid and thus cost-effective. Furthermore, a minimization of the required pipetting steps or other processes for the supply of liquids is made possible. In particular, a very precise examination in the form of a precise quantitative determination of an analyte in the sample liquid is made possible.

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Abstract

Es werden eine Vorrichtung und ein Verfahren zur Untersuchung einer Probenflüssigkeit vorgeschlagen, wobei insbesondere das ELISA-Verfahren sehr einfach, schnell und mit hoher Genauigkeit durchgeführt werden kann. Hierzu werden eine Probenflüssigkeit und eine Verdünnungsflüssigkeit jeweils mehreren Dosierkammern unterschiedlicher Volumina zugeführt, so daß die Probenflüssigkeit in zugeordnete Reaktionskammern in einem Verdünnungsschritt in unterschiedlichen Verdünnungsverhältnissen verdünnbar ist. Den Reaktionskammern sind verschiedene Flüssigkeiten nacheinander mittels einer gemeinsamen Aufnahmekammer zuführbar. Zum Anhalten der Nachweisreaktion werden die Flüssigkeiten aus dem Reaktionskammern in zugeordnete Untersuchungskammern überführt.

Description

Vorrichtung und Verfahren zur Untersuchung einer Probenflüssigkeit
Die vorliegende Erfindung betrifft eine Vorrichtung und ein Verfahren zur Untersuchung einer Probenflüssigkeit, insbesondere mittels des ELISA- Ver- fahrens.
Die vorliegende Erfindung befaßt sich mit mikrofluidischen Systemen bzw. Vorrichtungen, deren Strukturen eine Größe von etwa 1 bis 1000 μm und/oder deren Kavitäten jeweils ein Volumen von etwa 1 bis 1000 μl aufweisen. Die nachfolgenden Ausführungen beziehen sich insbesondere auf Vorrichtungen und Verfahren, bei denen Kapillar-, Druck- und/oder Zentrifugalkräfte wirken und insbesondere für die Funktion entscheidend sind.
Der Begriff "ELISA" kommt aus dem Englischen und bedeutet "enzyme- linked immunosorbent assay". Dieser Begriff ist bei der vorliegenden Erfindung im Sinne eines Verfahrens zu verstehen, bei dem ein Enzym an einen Analyten, insbesondere an einen Komplex aus einem Analyten und einem Antikörper, gebunden wird. Mittels des Enzyms wird in einer Nachweisreaktion ein Substrat in ein Nachweissubstrat, insbesondere eine fluoreszierende Sub- stanz oder dgl., modifiziert bzw. umgewandelt. Durch eine Erfassung des Nachweissubstrats ist eine quantitative Bestimmung des Analyten in der Probenflüssigkeit möglich. Um eine hohe Genauigkeit und einen entsprechenden Meßbereich zu ermöglichen, wird üblicherweise eine Verdünnungsreihe der Probenflüssigkeit auf diese Weise untersucht.
Bisher wird das ELISA- Verfahren üblicherweise manuell oder automatisiert - beispielsweise mittels Pipettierrobotern - auf einer offenen Pipettierplatte mit beispielsweise 96 offenen Aufhahmekammern durchgeführt. Eine zu untersuchende Probenflüssigkeit wird in den Aufhahmekammern nacheinander mehr- fach verdünnt, um unterschiedliche Verdünnungsverhältnisse zu erreichen. Anschließend wird die Probenflüssigkeit mit den unterschiedlichen Verdünnungsverhältnissen in vorbereitete Aumahmekammern pipettiert, in denen ein Analyt in der Probenflüssigkeit an immobilisierte Antikörper gebunden werden kann. Nach einer verhältnismäßig langen Reaktionszeit erfolgt ein mehr- faches Spülen mit einer Waschflüssigkeit. Dann wird ein an einen Nachwei- santikörper gebundenes Enzym zugeben. Der Nachweisantikörper bindet an dem Komplex aus Analyt und immobilisiertem Antikörper. Anschließend sind wieder verschiedene Waschschritte erforderlich. Dann wird ein Substrat zugegeben, das von dem Enzym in ein Nachweissubstrat umgewandelt bzw. modi- fiziert wird. Diese Nachweisreaktion ist sehr zeitkritisch. Das Anhalten der Nachweisreaktion erfolgt beispielsweise durch Zugabe von Säure. Problematisch ist, daß dies nicht gleichzeitig in allen Aufhahmekammern erfolgen kann, in denen die Nachweisreaktion abläuft, und daß bei größeren Volumina durch Diffusions- und/oder Mischvorgänge unterschiedliche Verzögerungen auftreten können. Schließlich wird das Nachweissubstrat beispielsweise optisch, insbesondere durch Fluoreszenzmessung oder dgl., bestimmt. Aus den ermittelten Werten läßt sich die Konzentration des Analyten in der Probenflüssigkeit bestimmen. Das erläuterte Verfahren ist sehr aufwendig und fehleranfällig. Insbesondere addieren sich Ungenauigkeiten aufgrund der Viel- zahl der einzelnen Schritte. Des weiteren ist auch die Vorbereitung der Aufnahmekammern zur Immobilierung des Antikörpers entsprechend aufwendig und ebenfalls mit dem Einsatz großer Flüssigkeitsmengen verbunden. Darüber hinaus laufen die Reaktionen aufgrund der großen Flüssigkeitsmengen und dementsprechend großen Diffusionswege oftmals sehr langsam ab, so daß das ELISA- Verfahren in der bisher üblichen Form sehr zeitaufwendig ist.
Der Artikel "Design of a Compact Disk-like Microfluidic Platform for Enzy- me-Linked Immunosorbent Assay" von Siyi Lai et al, Analytical Chemistry, Band 76, Nr. 7, 1. April 2004, Seiten 1832 bis 1837, beschreibt ein mikroflui- disches System in Form einer sogenannten Compact Disk (CD) für einzelne Schritte des ELI S A- Verfahrens. Es werden eine Probenflüssigkeit, eine Waschflüssigkeit, eine Flüssigkeit mit einem Nachweisantikörper und eine Substratflüssigkeit in entsprechende Aumahmekammern gefüllt, die nacheinander durch entsprechend unterschiedliche Rotation der CD in eine einzige zugeordnete Reaktionskammer zur entsprechenden Reaktion geleitet werden. So können einzelne Schritte in dem mikrofluidischen System durchgeführt werden. Jedoch verringert sich der Pipettieraufwand noch nicht wesentlich, da gegenüber dem herkömmlichen ELIS A- Verfahren lediglich die jeweils mehrfachen Waschschritte vermieden werden konnten. Generell sind bereits eine Vielzahl von mikrofluidischen Systemen in Form von CDs bekannt, bei denen eine Steuerung von Flüssigkeitsströmen durch Rotation der CD, also durch Zentrifugalkräfte, erfolgt.
Die WO 03/018198 Al, WO 03/072257 Al und WO 2004/061414 A2 offenbaren mikrofluidische Vorrichtungen, bei denen eine Flüssigkeit, insbesondere eine Probenflüssigkeit, von einer Aufnahmekammer in angeschlossene Kammern geleitet und in definierte Einzelmengen aufgeteilt werden kann und/oder mit einer anderen Flüssigkeit gemischt werden und vorzugsweise reagieren kann. Ähnliche mikrofluidische Systeme sind auch aus den US 6,706,519 Bl, US 6,719,682 B2, US 2004/0203136 Al, WO 00/78455 Al und WO 01/87485 A2 bekannt.
Die US 2004/0203136 Al offenbart ein Verfahren und eine Vorrichtung zur Untersuchung und Verdünnung von Proben und Reaktionsflüssigkeiten. Mehrere Dosierkanäle sind über einen gemeinsamen Kanal an eine erste Aufnahmekammer für eine Probe angeschlossen und mit der Probe füllbar. Weiter ist eine zweite Aufnahmekammer für eine Verdünnungsflüssigkeit an den gemeinsamen Kanal und damit an die Dosierkanäle angeschlossen. Bei entspre- chend starker Rotation wird die Verdünnungsflüssigkeit über den gemeinsamen Kanal in die Dosierkanäle geleitet, so daß die dosierten Probenmengen in sich anschließende Mischkammern überführt werden, die schließlich von der nachströmenden Verdünnungsflüssigkeit vollständig gefüllt werden. Dies gestattet keine optimale bzw. universell einsetzbare Verdünnung.
Der vorliegenden Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, eine Vorrichtung und ein Verfahren zur Untersuchung einer Probenflüssigkeit anzugeben, wobei eine kostengünstige, schnelle und/oder genaue quantitative Untersuchung, insbesondere mittels des ELISA- Verfahrens, ermöglicht wird.
Die obige Aufgabe wird durch eine Vorrichtung gemäß Anspruch 1 oder 12 oder durch ein Verfahren gemäß Anspruch 18 oder 25 gelöst. Vorteilhafte Weiterbildungen sind Gegenstand der Unteransprüche.
Ein Aspekt der vorliegenden Erfindung liegt darin, mehrere erste Dosierkammern zur vorzugsweise ausschließlichen Aufnahme von Probenflüssigkeit aus - A -
einer ersten, gemeinsamen Aufhahmekammer sowie mehrere zweite Dosierkammern zur vorzugsweise ausschließlichen Aufnahme einer Verdünnungsflüssigkeit aus einer zweiten, gemeinsamen Aumahmekammer vorzusehen. Die ersten und/oder zweiten Dosierkammern variieren in ihren Volumina. Die ersten und zweiten Dosierkammern sind paarweise einander zugeordnet und jeweils mit einer zugeordneten Reaktionskammer verbunden, so daß durch Druck- und/oder Zentrifugalkräfte die in den ersten und zweiten Dosierkammern enthaltenen Volumina an Probenflüssigkeit und Verdünnungsflüssigkeit in die jeweils zugeordneten Reaktionskammern überführbar und mischbar sind, wodurch die Probenflüssigkeit mit unterschiedlichen Verdünnungsverhältnissen verdünnt wird. Dieses vorschlagsgemäße Verdünnen wird nachfolgend auch kurz als das "parallele Verdünnen" bezeichnet. So kann mit minimalem Pipettieraufwand - es müssen nur die erste und zweite gemeinsame Aufnahmekammer mit Flüssigkeiten von außen gefüllt werden - eine Ver- dünnungsreihe der Probenflüssigkeit mit sehr hoher Genauigkeit realisiert werden.
Insbesondere werden bei der vorschlagsgemäßen Verdünnung die beim Stand der Technik, wie der US 2004/0203136 Al, durch Benutzen gemeinsamer Kanäle o. dgl. entstehenden Ungenauigkeiten bzw. Fehler vermieden. Die Dosierung der ersten und zweiten Flüssigkeit erfolgt nämlich unabhängig voneinander, so daß ansonsten auftretende Folgefehler bei der Dosierung vermieden werden können. Weiter sind die ersten und zweiten Dosierkammern vorzugsweise über separate Kanäle an die erste bzw. zweite Aumahmekammer angeschlossen, so daß keine Undefinierten Vormischungen, Verunreinigungen oder Mischfehler auftreten können.
Ein weiterer Vorteil gegenüber dem Stand der Technik, wie der US 2004/0203136 Al, liegt darin, daß die beiden Flüssigkeiten erst in der jeweili- gen Reaktionskammer - also schnell bzw. gezielt und/oder unter definierten Bedingungen - gemischt werden, so daß beispielsweise schnell ablaufende Reaktionen definiert ablaufen können. Insbesondere können die Flüssigkeiten aus den ersten und zweiten Dosierkammern gleichzeitig oder nacheinander in die Reaktionskammern definiert überführt und gemischt werden. Besonders bevorzugt variieren die Volumina der ersten und zweiten Dosierkammern entgegengesetzt. Wenn die Dosierkammern beispielsweise in zwei nebeneinander bzw. parallel verlaufenden Reihen angeordnet sind, nimmt das Volumen der ersten Dosierkammern in einer Richtung (insbesondere wahl- weise in oder entgegen der Füllrichtung) zu, während das Volumen der zweiten Dosierkammern in dieser Richtung abnimmt. So kann bei geringem Platzbedarf und bei geringen Flüssigkeitsvolumina eine Verdünnungsreihe über einen großen Verdünnungsbereich realisiert werden.
Vorzugsweise sind die einzelnen Summen der zusammengehörenden Paare von ersten und zweiten Dosierkammern gleich. Dies ist einer optimalen Platzausnutzung, insbesondere auf einer CD, zuträglich. Des weiteren ergeben sich so gleiche Volumina an verdünnter Probenflüssigkeit mit unterschiedlichen Verdünnungsverhältnissen, so daß dementsprechend die weiteren sich an- schließenden Kavitäten, insbesondere Reaktionskammern und dgl., alle einheitlich auf die gleichen Volumina ausgelegt sein können, wodurch das Design vereinfacht und vereinheitlicht wird.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform genügt eine einzige parallele Verdünnung um einen ausreichend großen Verdünnungsbereich abzudecken. Jedoch kann bedarfsweise auch nach der ersten parallelen Verdünnung mindestens eine weitere, vorzugsweise ebenfalls parallele Verdünnung erfolgen. Diese Unterverdünnung kann beispielsweise nur für eine, beispielsweise die bereits mit dem größten Verdünnungsverhältnis verdünnte Probenflüssig- keitsmenge erfolgen. Jedoch können bedarfsweise auch mehrere oder alle durch die erste parallele Verdünnung erzeugten Flüssigkeitsvolumina unterschiedlich verdünnter Probenflüssigkeit jeweils einer separaten weiteren, insbesondere ebenfalls parallelen Verdünnung unterzogen werden.
Vorzugsweise wird zu der weiteren Verdünnung die bereits für die erste Verdünnung verwendete bzw. zugeführte Verdünnungsflüssigkeit eingesetzt. Dann ist eine nochmalige Zuführung von Verdünnungsflüssigkeit nicht erforderlich, wodurch die Handhabung vereinfacht, insbesondere das erforderliche Pipettieren von Flüssigkeiten minimiert wird. Gemäß einem weiteren, auch unabhängig realisierbaren Aspekt der vorliegenden Erfindung ist eine (dritte) gemeinsame Aumahmekanimer für mehrere Reaktionskammern vorgesehen. Insbesondere können in der Aufnahmekam- mer mehrere Flüssigkeiten nacheinander - also sequentiell - beispielsweise durch Pipettieren oder in sonstiger Weise — insbesondere also extern bzw. von außen - zugeführt werden. So wird eine gemeinsame Einfüllöffhung für insbesondere verschiedene Flüssigkeiten geschaffen und nutzbar. Ein unerwünschtes Vermischen der verschiedenen Flüssigkeiten in der Aufnahme- kammer und eine sequentielle Überführung in die vorzugsweise parallel ange- schlossenen Reaktionskammern werden dadurch ermöglicht, daß die Aufnahmekammer jeweils vor Aufnahme einer neuen Flüssigkeit geleert wird, insbesondere selbsttätig durch Kapillarkräfte und/oder durch Zentrifugalkräfte.
Insbesondere wird es so möglich, mehrere oder alle Reaktionskammern mit minimalem Aufwand - insbesondere mit besonders wenigen Pipettiervorgän- gen - in geeigneter Weise vorzubereiten, also beispielsweise ein Reagenz, wie einen Antikörper oder dgl., in den Reaktionskammern zu immobilisieren. Alternativ oder zusätzlich gestattet die den Reaktionskammern zugeordnete, gemeinsame Aufnahmekammer ein Durchführen der Nachweisreaktion, bei- spielsweise durch Zuführen entsprechender Flüssigkeiten mit dem Enzym, dem Substrat oder dgl., mit minimalem Pipettieraufwand.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung liegt darin, daß den Reaktionskammern jeweils eine Detektions- bzw. Untersuchungskammer zugeordnet ist und die in den Reaktionskammern vorzugsweise enzymatisch durch ein immobilisiertes Enzym ablaufenden Nachweisreaktionen dadurch angehalten werden können, daß die in den Reaktionskammern befindliche Flüssigkeit in die zugeordnete Untersuchungskammer - vorzugsweise durch Druck-, Kapillar- und/oder Zentrifugalkräfte - überführt wird. Diese Überführung erfolgt insbesondere gleichzeitig für mehrere oder alle Reaktionskammern, so daß die Nachweisreaktionen auch gleichzeitig in diesen Reaktionskammern angehalten werden können. Die Untersuchung, insbesondere die Erfassung von in der jeweiligen Flüssigkeit gebildetem Nachweissubstrat oder dgl., kann dann bedarfsweise nacheinander in den Untersuchungskammern erfolgen. So wird ei- ne wesentlich größere Genauigkeit beim Anhalten der insbesondere enzyma- tisch verlaufenden und dementsprechend zeitkritischen Nachweisreaktionen ermöglicht.
Weitere Vorteile, Merkmale, Eigenschaften und Aspekte der vorliegenden Er- findung ergeben sich aus den Ansprüchen und der folgenden Beschreibung bevorzugter Ausführungsformen anhand der Zeichnung. Es zeigt:
Fig. 1 eine nicht maßstabsgerechte Ansicht eines Teils einer vorschlagsgemäßen Vorrichtung gemäß einer ersten Ausführungs- form;
Fig. 2 eine schematische Ansicht eines Teils einer vorschlagsgemäßen
Vorrichtung gemäß einer zweiten Ausführungsform; und
Fig. 3 eine nicht maßstabsgerechte Ansicht eines Teils einer vorschlagsgemäßen Vorrichtung gemäß einer dritten Ausführungsform.
In den Figuren werden für gleiche oder ähnliche Teile dieselben Bezugszei- chen verwendet, wobei entsprechende oder vergleichbare Eigenschaften und Vorteile erreicht werden, auch wenn eine wiederholte Beschreibung weggelassen ist.
Fig. 1 zeigt in einer nicht maßstabsgerechten, sehr schematischen Ansicht ei- nen Teil einer vorschlagsgemäßen Vorrichtung 1 gemäß einer ersten Ausführungsform. Bei der vorschlagsgemäßen Vorrichtung 1 handelt es sich insbesondere um ein mikrofluidisches System, das vorzugsweise die Form einer runden Scheibe, beispielsweise einer Compact Disk (CD) oder dgl., aufweist und dementsprechend um eine in Fig. 1 angedeutete Drehachse 2 zur Erzeu- gung von Zentrifugalkräften rotierbar ist. Jedoch sind auch andere Konfigurationen und Gestaltungen möglich.
Die vorschlagsgemäße Vorrichtung 1 dient einer Untersuchung einer Probenflüssigkeit 3, insbesondere mittels des ELIS A- Verfahrens. Die nachfolgende Beschreibung ist daher im wesentlichen auf die Anwendung bzw. Durchführung des ELISA- Verfahrens gerichtet, wobei bedarfsweise auch ergänzende oder alternative Maßnahmen bzw. Verfahrensschritte durchgeführt werden können. Jedoch kann die vorschlagsgemäße Vorrichtung 1 bzw. das vorschlagsgemäße Verfahren grundsätzlich auch für sonstige Untersuchungen bzw. Verfahren eingesetzt werden.
Fig. 1 zeigt die Probenflüssigkeit 3 unmittelbar nach dem Einfüllen in eine erste, gemeinsame Aufhahmekammer 4. Mehrere erste Dosierkammern 5 — beim Darstellungsbeispiel vier erste Dosierkammern 5a bis 5d - sind an die erste Aufhahmekammer 4 durch entsprechende Kanäle oder dgl. - beim DarStellungsbeispiel durch Kanal 18 - angeschlossen und vorzugsweise in einer Reihe in Umfangsrichtung angeordnet.
Die Probenflüssigkeit 3 strömt von der ersten Aufhahmekammer 4 in die angeschlossenen, ersten Dosierkammern 5, wobei Luft und/oder überschüssige Probenflüssigkeit 3 in eine optionale erste Sammelkammer 6 weiterströmen kann. Der Kanal 18 verbindet also die erste Aufnahmekammer 4 mit der ersten Sammelkammer 6. Fig. 1 zeigt die Vorrichtung 1 in einem Zustand unmittelbar nach dem Einfüllen der Probenflüssigkeit 3 in die erste Aufhahmekammer 4, also bevor die Probenflüssigkeit 3 in die ersten Dosierkammern 5 strömt.
Die Vorrichtung 1 weist eine zweite gemeinsame Aufhahmekammer 7 zur Aufnahme einer Verdünnungsflüssigkeit 8 auf. An die zweite Aufnahmekammer 7 sind mehrere zweite Dosierkammern 9 - beim Darstellungsbeispiel vier zweite Dosierkammern 9a bis 9d - angeschlossen, die beim Darstellungsbeispiel ebenfalls in einer Reihe und zumindest im wesentlichen parallel zu den ersten Dosierkammern 5 angeordnet sind. Die Verdünnungsflüssigkeit 8 strömt über Kanal 19 in die zweiten Dosierkammern 9. Überschüssige Verdünnungsflüssigkeit 8 kann bedarfsweise in eine optional vorgesehene zweite Sammelkammer 10 strömen. Der Kanal 19 verbindet vorzugsweise die zweite Aufhahmekammer 7 mit der zweiten Sammelkammer 10. Die Fig. 1 zeigt die Vorrichtung 1 in dem Zustand unmittelbar nach dem Einfüllen der Verdünnungsflüssigkeit 8 in die zweite Aufhahmekammer 7, also bevor die Verdünnungsflüssigkeit 8 die zweiten Dosierkammern 9 und die damit verbundenen Kanäle bzw. den Kanal 19 und ggf. die Sammelkammer 10 füllt. Die Dosierkammern 5 und 9 sind vorzugsweise so ausgebildet, beispielsweise durch nicht dargestellte Führungselemente für die Flüssigkeiten 3 bzw. 8, daß die Dosierkammern 5, 9 und ggf. die Kanäle vollständig ohne Gas- bzw. Luft- einschluß gefüllt werden. Verdrängte Luft kann über die vorzugsweise offen ausgebildeten Sammelkammern 6, 10 und/oder über nicht dargestellte Entlüf- tungsöffhungen, die insbesondere den Kanälen 18 und 19 und/oder den Dosierkammern 5, 9 zugeordnet sind, entweichen.
Den ersten und zweiten Dosierkammern 5 und 9 sind Reaktionskammern 11 — entsprechend der Anzahl der ersten bzw. zweiten Dosierkammern 5a bis 5d bzw. 9a bis 9d beim Darstellungsbeispiel also vier Reaktionskammern 1 Ia bis
Hd - zugeordnet, die beim Darstellungsbeispiel vorzugsweise in einer Reihe parallel zu den ersten und zweiten Dosierkammern 5, 9 und/oder bezüglich der Drehachse 2 radial außerhalb der ersten und zweiten Dosierkammern 5, 9 angeordnet sind.
Die ersten und zweiten Dosierkammern 5, 9 sind vorzugsweise paarweise einander und jeweils einer Reaktionskammer 11 zugeordnet, wobei jedes Paar mit der zugeordneten Reaktionskammer 11 durch entsprechende, insbesondere radial verlaufende, vorzugsweise kanalartige Verbindungen 12 fluidisch verbunden ist, beispielsweise also die erste Dosierkammer 5b und die zweite Dosierkammer 9b mit der zugeordneten Reaktionskammer I Ib. Die Buchstaben a bis d geben beim Darstellungsbeispiel also die Zuordnung der einzelnen Kammern 5, 9, 11 und 16 an. Dementsprechend erfolgt auch die Flüssigkeits- Überführung, insbesondere zur Verdünnung, Mischung und/oder Reaktion.
Beim Darstellungsbeispiel füllen sich die ersten Dosierkammern 5 und 9 mit der Probenflüssigkeit 3 bzw. der Verdünnungsflüssigkeit 8 vorzugsweise selbsttätig aufgrund von Druck- und/oder Kapillarkräften, insbesondere beim Einfüllen der Flüssigkeit 3 bzw. 8 in zugeordnete Aufhahmekammern 4 bzw. 7 mittels einer nicht dargestellten Pipette o. dgl. und aufgrund des dabei auf die Flüssigkeit 3 bzw. 8 ausgeübten Drucks. Jedoch können auch sonstige Kräfte, ggf. sogar Zentrifugalkräfte, je nach Anordnung und Ausbildung, alternativ oder zusätzlich hierzu eingesetzt werden. Anschließend können durch entsprechende Zentrifugalkräfte (verursacht durch entsprechende Rotation der Vorrichtung 1 um die Drehachse 2) die in den ersten Dosierkammern 5 vorhandenen Volumina an Probenflüssigkeit 3 und die in den zweiten Dosierkammern 9 vorhandenen Volumina an Verdün- nungsflüssigkeit 8 in die jeweils zugeordnete Reaktionskammer 11 - beim Darstellungsbeispiel also radial - überfuhrt werden, wobei sich die Probenflüssigkeit 3 und Verdünnungsflüssigkeit 8 jeweils mischen. Jedoch können zur Überfuhrung der genannten Volumina in die Reaktionskammern 11 zusätzlich oder alternativ auch sonstige Kräfte, beispielsweise Druckkräfte, Kapillarkräfte oder dgl. wirken.
Die ersten Dosierkammern 5 und/oder zweiten Dosierkammern 9 variieren in ihren Volumina. Und zwar sind die Volumina derart gewählt, daß in den Reaktionskammern 11 unterschiedliche Verdünnungsverhältnisse der Proben- flüssigkeit 3 erzielt werden.
Insbesondere variieren sowohl die Volumina der ersten Dosierkammern 5 als auch die Volumina der zweiten Dosierkammern 9. Beispielsweise ist einer ersten Dosierkammer 5d mit kleinem Volumen eine zweite Dosierkammer 9d mit großem Volumen und umgekehrt zugeordnet. Beim Darstellungsbeispiel wird dies dadurch erreicht, daß die Volumen der ersten Dosierkammern 5 in einer Umfangsrichtung zu- oder abnehmen und die Volumina der zweiten Dosierkammern 9 in dieser Umfangsrichtung umgekehrt ab- oder zunehmen. Dies gestattet eine Verdünnungsreihe mit einem großen Verdünnungsbereich - also insbesondere von einem niedrigen Verdünnungsverhältnis bis zu einem großen Verdünnungsverhältnis, beispielsweise von 1 :1 bis 1:1000 - und/oder eine sehr platzsparende, kompakte Anordnung der Dosierkammern 5, 9 mit entsprechend geringem Platz- bzw. Flächenbedarf.
Besonders bevorzugt sind die Summen der Volumina der paarweise einander zugeordneten ersten und zweiten Dosierkammern 5a und 9a, 5b und 9b, 5c und 9c sowie 5d und 9d zumindest im wesentlichen gleich. Auf diese Weise kann neben einem besonders kompakten Aufbau erreicht werden, daß die einzelnen Volumina an unterschiedlich verdünnter Probenflüssigkeit 3 gleich groß sind und die Reaktionskammern 11 und eventuelle sonstige nachgeord- nete Kammern oder dgl. einheitlich groß ausgebildet sein können. In der bisherigen und in der nachfolgenden Beschreibung wird immer auf das jeweilige Volumen der Dosierkammern 5 bzw. 9 abgestellt. Um genaue, definierte Verdünnungsverhältnisse zu erhalten, sind genau definierte Volumina erforderlich. Damit bei der Überführung der Probenflüssigkeit 3 und der Verdünnungsflüssigkeit 8 aus den ersten und zweiten Dosierkammern 5 und 9 in die zugeordneten Reaktionskammern 11 jeweils nur definierte Volumina der Flüssigkeiten 3, 8 vorliegen und überführt und gemischt werden, sind nicht dargestellte Ventileinrichtungen, Hindernisse oder Flüssigkeitsstops, bei- spielsweise zu den Verbindungen 12 hin, den Kanälen 18, 19 zugeordnete Be- lüftungsöffnungen und/oder dgl. vorgesehen.
Beim Darstellungsbeispiel sind erste Trennstellen Tla bis Tle für die Flüssigkeit 3 im ersten Kanal 18 gebildet, insbesondere zwischen der ersten Aufnah- mekammer 4 und der ersten Dosierkammer 5 a, zwischen den einzelnen Dosierkammern 5 und zwischen der letzten Dosierkammer 5d und der ersten Sammelkammer 6. Entsprechend sind zweite Trennstellen T2a bis T2e für die Flüssigkeit 8 im zweiten Kanal 19 gebildet, insbesondere zwischen der zweiten Aufnahmekammer 7 und der folgenden zweiten Dosierkammer 9a, zwi- sehen den zweiten Dosierkammern 9 und zwischen der letzten Dosierkammer 9d und der zweiten Aufnahmekammer 10. Die ersten und zweiten Trennstellen T können jedoch alternativ oder zusätzlich auch am Übergang zu einzelnen Kammern und/oder an sonstigen geeigneten Stellen gebildet sein.
Weiter sind beim Darstellungsbeispiel vorzugsweise Kanalstops KSi und KS2 im Kanal 18 bzw. 19 zwischen der letzten Trennstelle Ti e bzw. T2e und der jeweiligen Sammelkammer 6 bzw. 10 oder am Übergang zu der jeweiligen Sammelkammer 6 bzw. 10 hin gebildet, um einen derartigen Strömungswiderstand für die jeweilige Flüssigkeit 3 bzw. 8 zu bilden, daß beim Einfüllen zu- nächst die ersten bzw. zweiten Dosierkammern 5 bzw. 9 vollständig mit der jeweiligen Flüssigkeit 3 bzw. 8 gefüllt werden, bevor diese in die zugeordnete Sammelkammer 6 bzw. 10 weiterströmen kann.
Beim Darstellungsbeispiel sind vorzugsweise erste Flüssigkeitsstops Si3 bis Sjd und zweite Flüssigkeitsstops S2a bis S2d in den vorzugsweise radial verlaufenden Verbindungen 12 zwischen den jeweiligen ersten Dosierkammern 5 und zweiten Dosierkammern 9 bzw. den zweiten Dosierkammern 9 und den Reaktionskammern 11 angeordnet. Diese Flüssigkeitsstops S können jedoch alternativ oder zusätzlich auch an den Übergängen zu den jeweiligen Kammern gebildet sein.
Die ersten Flüssigkeitsstops Si verhindern, daß beim Füllen der ersten Dosierkammern 5 die Probenflüssigkeit 3 in unerwünschter Weise die zweiten Dosierkammern 9 füllt. Umgekehrt verhindern die ersten Flüssigkeitsstops S] auch, daß die Verdünnungsflüssigkeit 8 beim Füllen der zweiten Dosierkam- mern 9 in unerwünschter Weise die ersten Dosierkammern 5 füllen bzw. die Probenflüssigkeit 3 aus den ersten Dosierkammern 5 verdrängen kann. Jedoch können hierzu auch zusätzliche, nicht dargestellte Flüssigkeitsstops, beispielsweise am Übergang der Verbindungen 12 in den jeweiligen zweiten Dosierkammern 9 vorgesehen sein.
Die zweiten Flüssigkeitsstops S2 verhindern, daß beim Füllen der zweiten Dosierkammern 9 die Verdünnungsflüssigkeit 8 nicht in unerwünschter Weise bereits in die Reaktionskammern 11 strömt, wodurch eine definierte Dosierung nicht mehr möglich wäre.
Die Kanalstops KS und die Flüssigkeitsstops S sind derart ausgebildet, bzw. auf die Flüssigkeiten 3 und 8 bzw. auf die bei der Befüllung insbesondere mittels nicht dargestellter Pipetten o. dgl. auftretenden Drücke abgestimmt, daß die ersten und zweiten Flüssigkeitsstops S1 und S2 während des Füllens der er- sten und zweiten Dosierkammern 5, 9 mit den Flüssigkeiten 3, 8 nicht überwunden werden können, sondern erst bei der späteren gewünschten Überführung der einzelnen Volumina an Flüssigkeit 3 und 8 aus den Dosierkammern 5, 9 in die Reaktionskammern 11, insbesondere erst bei entsprechender Rotation der Vorrichtung 1 bzw. erst bei entsprechenden Zentrifugalkräften. Die Flüssigkeitsstops S sind dabei derart ausgebildet, daß die zweiten Flüssigkeitsstops S2 vor den ersten Flüssigkeitsstops S] öffnen bzw. überwunden werden können. Dies kann auch bei gleicher oder ähnlicher Ausgestaltung und Eigenschaft der ersten und zweiten Flüssigkeitsstops S dadurch erreicht werden, daß bei den zweiten Flüssigkeitsstops S2, die gegenüber dem ersten Flüs- sigkeitsstops Si radial weiter außen liegen, größere Zentrifugalkräfte als bei den ersten Flüssigkeitsstops Si auftreten bzw. wirken. Die Trennstellen T und Flüssigkeitsstops S fuhren zu definierten Volumina an Flüssigkeit 3 und 8, die miteinander gemischt werden. Beim Überführen der Flüssigkeitsvolumina aus den ersten und zweiten Dosierkammern 5, 9 in die Reaktionskammer 11 reißt die Flüssigkeit 3 bzw. 8 jeweils an den Trennstellen T ab und strömt dann über die jeweilige, insbesondere radiale Verbindung 12 in die zugeordnete Reaktionskammer 11. Entsprechend wird das beispielsweise der zweiten Dosierkammer 9b zugeordnete Flüssigkeitsvolumen durch die beiden zweiten Trennstellen T2b und T2c sowie die beiden Flüssigkeits- stops Slb und S2b bestimmt bzw. festgelegt. Das zu überführende bzw. dosierte Volumen an Probenflüssigkeit 3 wird beispielsweise für die erste Dosierkammer 5b durch die beiden Trennstellen T1 b und T] c und durch den Flüssigkeits- stop Sib begrenzt. Dies gilt in entsprechender Weise für die anderen Flüssigkeitsvolumina der weiteren Dosierkammern 5, 9.
Vorzugsweise sind die Trennstellen T durch entsprechende, nicht dargestellte Belüftungen o. dgl. gebildet. Die Flüssigkeitsstops S und/oder die Kanalstops KS sind vorzugsweise durch eine entsprechende Verengung, sprunghafte Querschnittserweiterung und/oder Modifizierung des Benetzungsverhaltens gebildet, so daß die jeweilige Flüssigkeit 3, 8, 14 nicht oder nicht ohne weiteres den jeweiligen Stop S, KS überwinden kann. Vielmehr ist insbesondere eine vorbestimmte, für die einzelnen Stops S, KS bedarfsweise unterschiedliche Zentrifugalkraft, Druckkraft o. dgl. erforderlich, um den jeweiligen Stop S, KS überwinden zu können.
Hinsichtlich der erforderlichen und/oder möglichen konstruktiven Lösungen, um definierte Volumina sicherzustellen und/oder geeignete Strukturen und Anordnungen zum Aufteilen und/oder Mischen von Flüssigkeitsmengen bereitzustellen, wird auf den eingangs genannten Stand der Technik verwiesen, der hiermit diesbezüglich ergänzend oder alternativ als Offenbarung eingeführt wird.
Die voranstehend erläuterte "parallele Verdünnung" gestattet die Erzeugung einer Verdünnungsreihe in einem einzigen Schritt, so daß allenfalls nur gerin- ge Verdünnungsfehler auftreten. Insbesondere kann so das bei der bisher übli- chen, sequentiellen Verdünnung auftretende Problem der Summierung von Einzelfehlern vermieden werden.
In jeder Reaktionskammer 11 können dann eine gewünschte Reaktion und insbesondere mehrere gewünschte Reaktionen ablaufen bzw. durchgeführt werden, worauf später noch näher eingegangen wird. Zur Durchführung des ELISA- Verfahrens werden die Reaktionskammern 11 vorzugsweise vor Zuführung der verdünnten Probenflüssigkeit 3 zunächst vorbereitet. Diese Vorbereitung erfolgt insbesondere vor dem Einfüllen der Probenflüssigkeit 3 in die erste Aufhahmekammer 4 und der Verdünnungsflüssigkeit 8 in die zweite Aumahmekammer 7 und wird nachfolgend näher erläutert.
Die Vorrichtung 1 weist vorzugsweise eine, insbesondere nur eine einzige, gemeinsame Aufhahmekammer 13 zur Aufnahme einer Flüssigkeit 14, insbe- sondere sequentiellen Aufnahme verschiedener Flüssigkeiten 14, wie einer Reaktionsflüssigkeit, einer Waschflüssigkeit, einer Blockier- bzw. Fixierflüssigkeit, einer Substratflüssigkeit oder dgl., auf. Die Reaktionskammern 11 sind an die dritte Aufnahmekammer 13 angeschlossen, so daß insbesondere durch Druck-, Kapillar- und/oder Zentrifugalkräfte eine in die Aufhahme- kammer 13 eingefüllte Flüssigkeit 14 über entsprechende Kanäle oder dgl. - beim Darstellungsbeispiel über einen Kanal 20, der vorzugsweise in Um- fangsrichtung und/oder parallel zu den Kanälen 18 bzw. 19 verläuft - in die
Reaktionskammern 11 strömen kann. Überschießende und/oder verdrängte
Flüssigkeit 14 wird vorzugsweise in einer optional vorgesehenen, dritten Sammelkammer 15 aufgefangen, wobei ein optimaler Kanalstop KS3 dafür sorgen kann, daß die Flüssigkeit 14 erst die Reaktionskammern 11 vollständig füllt, bevor sie in die dritte Sammelkammer 15 strömt.
Insbesondere ist die Vorrichtung 1 derart ausgebildet, daß die dritte Aufhah- mekammer 13 zunächst wieder vollständig geleert wird oder geleert werden kann, bevor eine weitere Flüssigkeit 14 der dritten Aufhahmekammer 13 — beispielsweise durch Pipettieren - zugeführt wird. Das Leeren der dritten Aufhahmekammer 13 kann beispielsweise dadurch erreicht werden, daß nach dem Füllen der dritten Aufnahmekammer 13 mit einer Flüssigkeit 14 diese durch Kapillarkräfte selbsttätig in die Reaktionskammern 11 und ggf. die dritte Sammelkammer 15 durchströmt, bis die dritte Aufhahmekammer 13 voll- ständig geleert ist. Zusätzlich oder alternativ kann dies durch Zentrifugalkräfte, insbesondere bei radialem Gefälle (Zunahme des radialen Abstands zum Drehpunkt 2) des Kanals 20 zur dritten Sammelkammer 15 hin, und entsprechende Rotationen der Vorrichtung 1, und/oder sonstige Kräfte erreicht wer- den.
Zusätzlich können auch die Reaktionskammern 11 bei Bedarf zunächst wieder geleert werden, bevor eine neue Flüssigkeit 14 in die dritte Aufnahmekammer 13 eingefüllt wird und diese neue Flüssigkeit 14 in die Reaktionskammern 11 strömt. Das vorherige Leeren der Reaktionskammer 11 erfolgt dann vorzugsweise durch Zentrifugalkräfte, nicht dargestellte Ventileinrichtungen oder dgl., um ein gesteuertes Leeren der Reaktionskammern 11 zu ermöglichen.
Zur Vorbereitung der Reaktionskammem 11 für das ELI S A- Verfahren wird insbesondere zunächst eine Flüssigkeit 14 mit einem Reagenz, vorzugsweise einem Antikörper, in die dritte Aufnahmekammer 13 eingefüllt und in die Reaktionskammern 11 geleitet, um das Reagenz in den Reaktionskammern 11 zu immobilisieren, insbesondere den Antikörper in den entsprechend vorbereiteten Reaktionskammern 11 zu binden bzw. die Reaktionskammem 11 mit dem Antikörper zu beschichten.
Nach einer bestimmten Inkubations- bzw. Reaktionszeit werden die Reaktionskammern 11 mit einer Waschflüssigkeit, die als nächste Flüssigkeit 14 in die dritte Aumahmekammer 13 gefüllt wird, gespült, um ungebundenes Rea- genz zu entfernen.
Mit einer weiteren Flüssigkeit 14 folgt bedarfsweise eine Blockierung der noch freien, also insbesondere von Antikörpern nicht besetzten Bindungsstellen, um ein späteres Undefiniertes Binden anderer Reagenzien zu blockieren, bzw. Fixierung des immobilisierten Reagenzes bzw. der immobilisierten Antikörper in den Reaktionskammern 11.
Nach einem ggf. nochmaligem Spülen mit einer Waschflüssigkeit und ggf.
Leeren sind dann die Reaktionskammern 11 vorbereitet, um die verdünnte Probenflüssigkeit 3 - also die Probenflüssigkeit 3 und die Verdünnungsflüs- sigkeit 8 aus den zugeordneten ersten und zweiten Dosierkammern 5 und 9 - aufzunehmen.
Nach dem Überführen der Probenflüssigkeit 3 zusammen mit der Verdün- nungsflüssigkeit 8 in die Reaktionskammern 11 kann die eigentliche Nachweisreaktion bzw. eine erste Reaktion zur Untersuchung der Probenflüssigkeit 3 erfolgen. Ein in der Probenflüssigkeit 3 enthaltener Analyt kann beim Darstellungsbeispiel insbesondere an das immobilisierte Reagenz, insbesondere den immobilisierten Antikörper, binden. Nach einer vorzugsweise bestimmten bzw. definierten Reaktionszeit wird nicht gebundener Analyt aus den Reaktionskammern 11 gespült bzw. gewaschen, insbesondere durch einmaliges Einfüllen einer Waschflüssigkeit 14 in die dritte Aufhahmekammer 13, um die vorhandenen Flüssigkeiten 3, 8 aus den Reaktionskammern 11 zu verdrängen, und/oder durch Zentrifugalkräfte oder sonstige Kräfte.
Anschließend wird eine weitere Flüssigkeit 14, die insbesondere ein an einen Nachweisantikörper gebundenes Enzym enthält, den Reaktionskammern 11 zugeführt, indem diese Flüssigkeit 14 wiederum der dritten Aufhahmekammer 13 zugeführt wird. Der Nachweisantikörper ist derart ausgebildet, daß er zu- sammen mit dem Enzym an den Komplexen bindet, die aus den immobilisierten Antikörpern und dem Analyten in den Reaktionskammern 11 gebildet sind.
Ungebundene Nachweisantikörper und Enzyme werden anschließend in ei- nem Waschschritt durch vorzugsweise einmaliges Zuführen einer weiteren Waschflüssigkeit 14 aus den Reaktionskammem 11 gespült.
Schließlich wird eine Substratlösung als weitere Flüssigkeit 14 vorzugsweise wiederum über die dritte Aufnahmekammer 13 den Reaktionskammern 11 zugeführt. Das Substrat wird von den Enzymen in den Reaktionskammern 11 in einer enzymatischen Nachweisreaktion umgewandelt bzw. modifiziert, so daß ein später nachweisbares Nachweissubstrat, insbesondere ein fluoreszierender oder sonstiger Farbstoff oder dgl., gebildet wird. Auf das Anhalten der Nachweisreaktionen in den Reaktionskammern 11 und die weitere Untersu- chung wird später noch näher eingegangen. Die Zufuhrung der verschiedenen Flüssigkeiten 14, die vorzugsweise ausschließlich über die gemeinsame dritte Aufnahmekammer 13 durch sequentielle Zuführung der Flüssigkeiten 14 erfolgt, gestattet eine sehr schnelle und einfache Vorbereitung der Reaktionskammern 11 und/oder Führung der Reak- tionen in den Reaktionskammern 11, wobei der Pipettieraufwand, die erforderlichen Waschschritte und/oder die erforderlichen Flüssigkeitsmengen gegenüber dem Stand der Technik - insbesondere gegenüber dem herkömmlichen ELIS A- Verfahren in einer offenen Pipettierplatte - wesentlich verringert werden.
Bisher wurden die in den Reaktionskammern 11 ablaufenden, bereits genannten, insbesondere enzymatischen oder katalytischen Nachweisreaktionen durch Zugabe einer Säure, einer Base oder sonstigen Stopplösung oder dgl. angehalten, beispielsweise durch Inaktivierung der Enzyme bzw. katalyti- sehen Reaktion. Dies ist grundsätzlich auch bei der vorschlagsgemäßen Vorrichtung 1 möglich.
Besonders bevorzugt erfolgt das Anhalten der Nachweisreaktionen jedoch durch Trennen der Flüssigkeit mit dem Substrat und Nachweissubstrat von den (immobilisierten) Enzymen, Reaktionskatalysatoren oder sonstigen Reaktionspartnern und/oder mittels zusätzlich vorgesehener Untersuchungskammern 16, indem die in den Reaktionskammern 11 befindliche Flüssigkeit mit dem Substrat und Nachweissubstrat zum Anhalten der Nachweisreaktionen jeweils in eine zugeordnete Untersuchungskammer 16 überführt wird. Dieses Überführen erfolgt vorzugsweise für mehrere oder alle Reaktionskammern 11 gleichzeitig, so daß die Nachweisreaktionen zeitgleich angehalten werden. Insbesondere erfolgt das genannte Überführen bzw. Anhalten durch Zentrifugalkräfte, indem die Vorrichtung 1 entsprechend rotiert wird. Jedoch ist das Überführen zusätzlich oder alternativ auch durch sonstige Kräfte, beispiels- weise Druck- oder Kapillarkräfte, mittels entsprechender Ventile oder dgl. möglich.
Das genannte Überführen der Flüssigkeiten aus den Reaktionskammern 11, in denen die Enzyme und/oder sonstige für die Nachweisreaktionen erforderliche Reagenzien immobilisiert sind, in die Untersuchungskammern 16 ermöglicht ein sehr einfaches und hochgradig simultanes Anhalten der Nachweisreaktio- nen, so daß gegenüber dem Stand der Technik ein wesentlich definierterer Verfahrensablauf und damit eine wesentlich genauere Bestimmung des Analy- ten ermöglicht werden.
Nach der Überführung der Flüssigkeiten mit dem Nachweissubstrat in die Untersuchungskammern 16 kann eine sequentielle Untersuchung bzw. Detektion des Nachweissubstrats in den Untersuchungskammern 16 - insbesondere optisch, beispielsweise durch Fluoreszenzmessung - erfolgen. Aus den gewonnen Werten und unter Berücksichtigung der unterschiedlichen Verdünnungs- Verhältnisse kann dann eine äußerst genaue, insbesondere quantitative Bestimmung des Analyten in der Probenflüssigkeit 3 erfolgen.
Zusätzlich oder alternativ kann den Reaktionskammern 11 auch ein optional vorgesehener, in Fig. 1 gestrichelt angedeuteter Sammelkanal 17 zugeordnet sein, der beispielsweise über die Untersuchungskammern 16 und entsprechende, vorzugsweise radiale Verbindungen 12 an die Reaktionskammern 11 angeschlossen ist, um zur Leerung der Reaktionskammern 11 Flüssigkeit(en) aus den Reaktionskammern 11 aufzunehmen, insbesondere wenn die Reaktionskammern 11 durch Zentrifugalkräfte durch entsprechendes Rotieren der Vor- richtung 1 geleert werden. Diese Flüssigkeiten können dann durch die Untersuchungskammern 16 hindurch oder durch nicht dargestellte, direkte Verbindungen oder dgl. in den Sammelkanal 17 ausgetragen werden. Ein derartiges Leeren der Reaktionskammern 11 kann beispielsweise zum Entfernen von Flüssigkeiten 3, 8 und/oder 14 vor Zuführung einer neuen Flüssigkeit 14 in die Reaktionskammern 11 erfolgen.
Beim Darstellungsbeispiel sind vorzugsweise dritte Flüssigkeitsstops S3a bis S3Ci in den (radialen) Verbindungen 12 zwischen den Reaktionskammern 11 und Überprüfungskammern 16 gebildet. Die dritten Flüssigkeitsstops S3 kön- nen insbesondere zusammen mit den zweiten Flüssigkeitsstops S2 ein unerwünschtes Ausweichen der Flüssigkeit 14 in andere Bereiche verhindern, so daß die Flüssigkeiten 14 in erwünschter Weise beispielsweise nur in die dritte Sammelkammer 15 oder bedarfsweise bei Überwindung der dritten Flüssigkeitsstops S3 über die Untersuchungskammern 16 und optionale vierte Flüs- sigkeitsstops S4 in den Sammelkanal 17 entleert bzw. abgeleitet werden können. Die dritten Flüssigkeitsstops S3 sorgen insbesondere für ein definiertes Halten der in die Reaktionskammern 11 überführten bzw. zudosierten Flüssigkeitsvolumina an Flüssigkeiten 3 und 8, verhindern also ein unkontrolliertes und un- erwünschtes Abfließen aus den Reaktionskammern 11.
Zusätzlich können bedarfsweise im Kanal 20 oder in sonstigen Verbindungen zwischen den Reaktionskammern 11 und/oder zu der dritten Aufhahmekam- mer 13 bzw. dritten Sammelkammer 15 hin nicht dargestellte Trennstellen oder Flüssigkeitsstops vorgesehen sein, um eine unerwünschte Überführung von verdünnter Probenflüssigkeit 3 aus einer Reaktionskammer 11 in eine benachbarte Reaktionskammer 11 — beispielsweise beim Mischen durch Beschleunigen und Abbremsen - verhindern zu können.
Zusätzlich oder alternativ können der Kanal 20 und insbesondere dessen sich zwischen den einzelnen Reaktionskammern 11 erstreckende Abschnitte auch abweichend von dem Verlauf mit zumindest im wesentlichen konstantem Abstand bzw. Radius zum Drehpunkt 2 einen anderen, in radialer Richtung abweichenden Verlauf aufweisen, um ein unerwünschtes Überführen von ver- dünnter Probenflüssigkeit 3 zwischen einzelnen Reaktionskammern 11 zu verhindern. Entsprechendes gilt auch für die anderen Kanäle 18 und 19 bzw. die jeweiligen Kanalabschnitte zwischen den Dosierkammern 5 bzw. 9.
Vorzugsweise sind vierte Flüssigkeitsstops S4a bis S4d in den radialen Verbin- düngen 12 zwischen den Untersuchungskammern 16 und dem optionalen Sammelkanal 17 angeordnet, um ein Undefiniertes Abfließen oder Ableiten von Flüssigkeit aus den Untersuchungskammern 16 zu verhindern.
Die dritten und vierten Flüssigkeitsstops S3 und S4 können wiederum je nach Bedarf auch an den Übergängen von den Reaktionskammern 11 bzw. 16 zu den jeweiligen Verbindungen 12 gebildet sein.
Hinsichtlich der parallelen Verdünnung ist anzumerken, daß vorzugsweise in einem einzigen Verdünnungsschritt - also bei einer parallelen Verdünnung - 3 bis 20, insbesondere etwa 10 Verdünnungen bzw. unterschiedliche Verdünnungsverhältnisse erzeugt werden. Selbstverständlich können auch mehrere parallele Verdünnungen gleichzeitig auf der Vorrichtung 1 erfolgen. Entsprechend kann die Vorrichtung 1 bedarfsweise auch mehrere Anordnungen, wie in Fig. 1 gezeigt, aufweisen.
Nachfolgend wird eine zweite Ausführungsform der vorschlagsgemäßen Vorrichtung 1 und des vorschlagsgemäßen Verfahrens anhand von Fig. 2 näher erläutert, wobei die nachfolgenden Ausführungen lediglich auf wesentliche Unterschiede gegenüber der ersten Ausführungsform beschränkt werden. Sonstige Vorteile, Aspekte und Eigenschaften ergeben sich also in entsprechender Weise wie bei der ersten Ausführungsform.
Bei der Darstellung gemäß Fig. 2 wurde die vorzugsweise vorgesehene Krümmung bei der vorzugsweise vorgesehenen Ringstruktur zur Anordnung auf einer runden Scheibe, wie einer CD oder dgl., weggelassen, um eine bes- sere Übersichtlichkeit zu ermöglichen. Weiter ist die Darstellung gemäß Fig. 2 ebenfalls nicht maßstabsgerecht. Insbesondere entsprechen die dargestellten Längen, Breiten, Größenverhältnisse und dgl. nicht den unbedingt erforderlichen bzw. bevorzugten Verhältnissen. Dies ist ebenso bei der Darstellung gemäß Fig. 1 der Fall.
In Fig. 2 sind aus Vereinfachungsgründen außerdem keine Flüssigkeiten 3, 8, 14 dargestellt. Jedoch gelten die diesbezüglichen Ausführungen bei der ersten Ausfuhrungsform und auch hinsichtlich des sonstigen Verfahrensablaufs entsprechend für die in Fig. 2 dargestellte, zweite Ausführungsform. Weiter ist in Fig. 2 aus Vereinfachungsgründen der optionale Sammelkanal 17 weggelassen.
In Fig. 2 sind ferner aus Vereinfachungsgründen keine Trennstellen T5 Flüs- sigkeitsstops S und Kanalstops KS dargestellt. Die diesbezüglichen Erläute- rungen und Anordnungen bei der ersten Ausführungsform gelten jedoch für die zweite Ausführungsform entsprechend oder ergänzend.
Bei der zweiten Ausführungsform erfolgt im Gegensatz zu der ersten Ausfüh- rungsform nach der parallelen Verdünnung eine weitere Verdünnung, also ei- ne Unterverdünnung. Diese weitere Verdünnung ist bei dem in Fig. 2 gezeigten Darstellungsbeispiel wiederum als parallele Verdünnung ausgeführt. Beim Darstellungsbeispiel erfolgt lediglich eine weitere Verdünnung nur einer bereits einmal verdünnten Probenflüssigkeit aus nur einer Reaktionskammer 11. Jedoch kann bedarfsweise auch eine Unterverdünnung bzw. weitere Verdünnung für mehrere oder alle Reaktionskammern 11 vorgesehen sein.
Die weiter parallele Verdünnung erfolgt im wesentlichen entsprechend wie die bereits oben erläuterte parallele Verdünnung mittels der ersten und zweiten Dosierkammern 5 und 9 sowie der nachgeordneten Reaktionskammern 11. Für die weitere parallele Verdünnung sind daher zusätzliche erste Dosier- kammern 5' und zusätzliche zweite Dosierkammern 9' sowie zusätzliche Reaktionskammern 11 ' vorgesehen. Die zusätzlichen Dosierkammern 5' und 9' weisen vorzugsweise entsprechende Volumenverhältnisse - bei insbesondere entsprechend verringertem Absolutvolumen - wie die ersten und zweiten Dosierkammern 5 und 9 auf.
Die Zuführung von bereits einmal verdünnter Probenflüssigkeit in die zusätzlichen ersten Dosierkammern 5' erfolgt von der vorgeschalteten Reaktionskammer 11, die im Fall der Weiterverdünnung eigentlich nur eine Mischkammer darstellt. Den zusätzlichen zweiten Dosierkammern 9' wird wiederum Verdünnungsflüssigkeit 8, insbesondere die überschüssige Verdünnungsflüssigkeit 8 für die erste Verdünnung zugeführt, beispielsweise über die Sammelkammer 10.
Die Überführung der einzelnen Flüssigkeitsvolumina in die zugeordneten zu- sätzlichen Reaktionskammern 11' erfolgt wiederum vorzugsweise durch Zentrifugalkräfte. Jedoch können alternativ oder zusätzlich auch sonstige Kräfte, insbesondere Druck- und/oder Kapillarkräfte wirken, bzw. Ventile oder dgl. eingesetzt werden.
Jedoch kann für die weitere Verdünnung auch nochmals separat eine andere oder zusätzliche Verdünnungsflüssigkeit über eine nicht dargestellte zusätzliche Aufnahmekammer den zusätzlichen zweiten Dosierkammern 9' zugeführt werden.
Sofern nur eine teilweise weitere Verdünnung erfolgt, wie in Fig. 2 dargestellt, sind vorzugsweise aber nicht zwingend auch denjenigen Reaktions- kammern 11, deren Inhalt nicht weiter verdünnt wird, jeweils zusätzliche Reaktionskammern I T zugeordnet, die insbesondere auf einen entsprechenden Umfang wie die der weiteren Verdünnung dienenden zusätzlichen Reaktionskammern 11 ' angeordnet sind, um für alle Verdünnungsstufen eine gleichzei- tige Untersuchung, insbesondere Bindung des Analyten an das immobilisierte Reagenz, sicherzustellen bzw. zu erleichtern.
Optional kann auch eine zusätzliche erste Sammelkammer 6' vorgesehen sein, die zur Aufnahme von überschüssiger Probenflüssigkeit 3 an die zusätzlichen erste Dosierkammern 5' angeschlossen ist. Optional kann auch eine zusätzliche zweite Sammelkammer 10' vorgeschlossen sein, die zur Aufnahme von überschüssiger Verdünnungsflüssigkeit 8 an die zusätzlichen zweiten Dosierkammern 9' angeordnet ist.
Nachfolgend wird eine dritte Ausführungsform der vorschlagsgemäßen Vorrichtung 1 und des vorschlagsgemäßen Verfahrens anhand von Fig. 3 näher erläutert, wobei sich die nachfolgenden Ausführungen lediglich auf wesentliche Unterschiede gegenüber der ersten und zweiten Ausführungsform beschränken. Die bisherigen Erläuterungen gelten also ergänzend oder entspre- chend.
Bei der dritten Ausführungsform sind die ersten Dosierkammern 5 parallel an einen ersten, insbesondere gemeinsamen Kanal 18 angeschlossen, der von der ersten Aufnahmekammer 4 zu der ersten Sammelkammer 6 führt. Dies hat den Vorteil, daß eine schnellere Befüllung der ersten Dosierkammern 5 mit Probenflüssigkeit 3 möglich ist, da diese parallel, also gleichzeitig berüllbar sind. Insbesondere erfolgt eine Befüllung durch Druck, beispielsweise durch Ansetzen einer nicht dargestellten Pipette oder dgl., an die erste, offene Aufnahmekammer 4, wobei eine dabei erfolgende (teilweise) Füllung der ersten Sam- melkammer 6 bei entsprechender Dimensionierung unkritisch ist.
Der erste Kanal 18 wird nach dem Füllen der ersten Dosierkammer 5 - insbesondere durch Kapillar- und/oder Zentrifugalkräfte - vor dem Überführen der Probenflüssigkeit 3 aus den ersten Dosierkammern 5 in die zugeordneten Re- aktionskammern 11 in die erste Sammelkammer 6 entleert. Dies führt zu einer besonders genauen Dosierung, da so ein definiertes "Abreißen" der Proben- flüssigkeit 3 an den Übergängen (Trennstellen Ti) vom Kanal 18 zu den einzelnen ersten Dosierkammern 5 bzw. entsprechenden Verbindungen erreicht wird. Dies ermöglicht besonders genaue Dosierungen, die dann zu entsprechend genauen Verdünnungsreihen bei dem anschließenden Mischen mit Ver- dünnungsflüssigkeit 8 und insbesondere bei dem ELISA-Verfahren zu sehr genauen quantitativen Ergebnissen fuhren.
Die zweiten Dosierkammern 9 sind vorzugsweise in entsprechender Weise parallel an einen zweiten, insbesondere gemeinsamen Kanal 19 angeschlos- sen, der die zweite Aufhahmekammer 7 mit der zweiten Sammelkammer 10 verbindet. Entsprechend können die zweiten Dosierkammern 9 schneller mit der Verdünnungsflüssigkeit 8 befüllt werden. Vorzugsweise folgt die Befüllung mit der Verdünnungsflüssigkeit 8 ebenfalls durch Druck, insbesondere durch Ansetzen einer nicht dargestellten Pipette oder dgl.
Des weiteren wird auch der zweite Kanal 19 nach dem Füllen der zweiten Dosierkammern 9 vorzugsweise vollständig in die zweite Sammelkammer 10 entleert, insbesondere durch Kapillar- und/oder Zentrifugalkräfte, bevor die Verdünnungsflüssigkeit 8 aus den zweiten Dosierkammern 9 in die zugeord- neten Reaktionskammern 11 überführt wird. Dies ergibt wiederum eine sehr genaue Dosierung, da die Verdünnungsflüssigkeit 8 definiert an den Übergängen (Trennstellen T2) vom Kanal 19 zu den Dosierkammern 9 bzw. entsprechenden Anschlüssen abreißt, wie bereits oben für die Probenflüssigkeit 3 und die ersten Dosierkammern 5 erläutert. Entsprechend ermöglicht dies beson- ders genaue Verdünnungsreihen und insbesondere sehr genaue quantitative Untersuchungen gemäß dem ELISA-Verfahren oder in sonstiger Weise. Der erste und zweite Kanal 18, 19 werden vorzugsweise gleichzeitig entleert.
Die Trennstellen T sind insbesondere durch entsprechende Verengungen und/oder Abknickungen gebildet, um das gewünschte definierte Abreißen der Flüssigkeit zu gewährleisten.
Der bei der dritten Ausführungsform vorgesehene parallele Anschluß der ersten Dosierkammern 5 an den ersten Kanal 18 und/oder der zweiten Dosier- kammern 9 an den zweiten Kanal 19 gestattet, wie bereits erläutert, ein besonders schnelles und paralleles Füllen der Kammern 5 bzw. 9 und ist bedarfs- weise auch unabhängig von anderen Aspekten und Merkmalen der vorliegenden Ausruhrungsformen realisierbar.
Die Kanäle 18 und 19 weisen vorzugsweise wiederum Kanalstops KS1 bzw. KS2 zur jeweiligen Sammelkammer 6 bzw. 10 hin auf, um sicherzustellen, daß zunächst die jeweiligen Dosierkammern 5 bzw. 9 vollständig gefüllt werden, bevor die entsprechende Flüssigkeit 3 bzw. 8 in die zugehörige Sammelkammer 6 bzw. 10 weiterströmen kann. Insbesondere sind die Kanalstops KS derart ausgelegt, daß diese von der jeweiligen Flüssigkeit 3 bzw. 8 von dem Druck zur Zuführung - beispielsweise durch eine nicht dargestellte Pipette, mit der die jeweilige Flüssigkeit in die zugeordnete Aumahmekammer 4 bzw. 7 zugeführt wird - (erst) nach vollständigem Füllen der zugeordneten Dosierkammern 5 bzw. 9 überwunden werden können. So kann ein vollständiges Füllen der Dosierkammern 5 und 9 mit der jeweiligen Flüssigkeit 3 bzw. 8 si- chergestellt werden.
Um ein vollständiges Leeren zu ermöglichen oder unterstützen, verlaufen die Kanäle 18 und 19 vorzugsweise weitgehend geradlinig oder mit nur geringen Versetzungen oder Abknickungen und/oder vorzugsweise ohne V- oder U- förmige Bögen. Um ein vollständiges Leeren zu ermöglichen oder unterstützen, weisen die Kanäle 18 und 19 alternativ oder zusätzlich vorzugsweise ein radiales Gefälle - insbesondere zwischen dem jeweiligen Anfang und Ende bzw. der jeweiligen Aumahmekammer 4 bzw. 7 und Sammelkammer 6 bzw. 10 - auf, so daß die mit zunehmenden Radius ansteigenden Zentrifugalkräfte bei entsprechender Rotation der Vorrichtung 1 zu dem gewünschten Leeren der Kanäle 18, 19 führen.
Bei der dritten Ausführungsform sind die einander zugeordneten ersten Dosierkammern 5 und zweiten Dosierkammern 9 nicht in Serie wie bei der ersten oder zweiten Ausführungsform (wobei die Reihenfolge frei wählbar ist) geschaltet bzw. in Serie an die zugeordneten Reaktionskammern 11 angeschlossen, sondern vorzugsweise parallel oder quasi-parallel an die zugeordneten Reaktionskammern 11 angeschlossen. Besonders bevorzugt ist der "quasi- parallel" Anschluß, der nachfolgend näher anhand von Fig. 3 erläutert wird. Die zweiten Dosierkammern 9 sind über Verbindungen 12, die vorzugsweise zumindest im wesentlichen radial verlaufen, an die zugeordneten Reaktionskammern 11 angeschlossen. Die zweiten Flüssigkeitsstops S2 verhindern ein unkontrolliertes Abfließen der Verdünnungsflüssigkeit 8 aus den zweiten Do- sierkammern 9 über die Verbindungen 12 in die Reaktionskammern 11.
Die ersten Dosierkammern 5 sind nun ihrerseits - vorzugsweise über erste Flüssigkeitsstops Si - an die zugeordneten Verbindungen 12 angeschlossen, insbesondere jeweils nach den zweiten Flüssigkeitsstops S2. Die ersten Flüs- sigkeitsstops Si sind jeweils beispielsweise durch eine entsprechende Verengung oder sprunghafte Querschnittserweiterung gebildet, so daß die Probenflüssigkeit 3 aus den ersten Dosierkammern 5 - vorzugsweise auch bei Erreichen einer Winkelgeschwindigkeit bzw. Zentrifugalkraft, die zu einer Übertragung der Verdünnungsflüssigkeit 8 aus den zweiten Dosierkammern 9 in die zugeordneten Reaktionskammern 11 führt - nicht oder nicht ohne weiteres in die zugeordneten Reaktionskammern 11 über die Verbindungen 12 übertragen wird. Vielmehr ist vorzugsweise eine abströmseitige Benetzung - insbesondere der Flüssigkeitsstops Si - durch die Verdünnungsflüssigkeit 8 erforderlich. Erst dann kann die Probenflüssigkeit 3 die Flüssigkeitsstops Si oder sonstige Anschlüsse zu den Verbindungen 12 hin überwinden und zusammen mit der Verdünnungsflüssigkeit 8 dann in die zugeordneten Reaktionskammern 11 strömen. Die seitliche bzw. parallele Einleitung der Probenflüssigkeit 3 in die Verdünnungsflüssigkeitsströme führt bereits zu einer ersten Vermischung bzw. zu einem besseren Mischen, so daß insbesondere in den Reakti- onskammern 11 dann eine sehr gute Durchmischung erreichbar ist.
Die bevorzugte spezielle Ausbildung (Verjüngung) der Flüssigkeitsstops S kann bedarfsweise auch entfallen. Alternativ können statt dessen auch nicht dargestellte Ventileinrichtungen eingesetzt werden.
Weiter ist es auch möglich, daß die Übertragung einerseits der Verdünnungsflüssigkeit 8 aus den zweiten Dosierkammern 9 und andererseits der Probenflüssigkeit 3 aus den ersten Dosierkammern 5 - insbesondere bei Erreichen und Überschreiten einer bestimmten Winkelgeschwindigkeit oder Zentrifu- galkraft - quasi gleichzeitig erfolgt. In diesem Fall wird ebenfalls ein (erstes) Durchmischen der Flüssigkeiten 3, 8 durch die Zugabe der Probenflüssigkeit 3 in die Verdünnungsflüssigkeitsströme in den Verbindungen 12 erreicht.
Bedarfsweise kann die Zuführung auch umgekehrt erfolgen, also die Verdün- nungsflüssigkeit 8 in Probenflüssigkeitsströme in den Verbindungen 12 eingeleitet werden. Die obigen Ausführungen gelten dann entsprechend.
Bei der dritten Ausführungsform ist es nicht entscheidend, ob die ersten Flüs- sigkeitsstops S1 oder die zweiten Flüssigkeitsstops S2 zuerst von der jeweili- gen Flüssigkeit 3 bzw. 8 überwunden werden, da in beiden Fällen eine gute Durchmischung der beiden Flüssigkeiten 3 und 8 - zumindest in den Reaktionskammern 11 - erreichbar ist. Dementsprechend handelt es sich bei der dritten Ausführungsform um ein sehr robustes System.
Ein weiterer Aspekt der dritten Ausführungsform liegt darin, daß beispielsweise die Kanäle 18, 19, aber auch sonstige Kavitäten, Verbindungen 12 oder dgl., nicht immer auf einer Flachseite des Trägers - insbesondere nicht auf der Flachseite, in der die Kammern 4 bis 7, 9 bis 11, 13, 15 und 16 - gebildet sein müssen, in dem die Kavitäten, Kanäle oder dgl. gebildet sind. Vielmehr sind bei der Darstellung gemäß Fig. 3 die gestrichelt angedeuteten Abschnitte vorzugsweise auf der Unterseite gebildet, während die durchgezogenen Kavitäten, Kanäle und dgl. vorzugsweise auf der Oberseite bzw. von der Oberseite her gebildet sind. Die ober- und unterseitigen Kavitäten, Kanäle und dgl. sind dann durch entsprechende Durchbrechungen, Bohrungen oder dgl. miteinan- der verbunden. Dies ermöglicht wesentlich größere Freiheiten bei dem Design der Vorrichtung 1, insbesondere hinsichtlich der Anordnung, Konfiguration und Verbindung der Kammern. Die vorzugsweise von den Flachseiten (ober- und unterseitig) her gebildeten Kavitäten, Kanäle und dgl. sind dann auf jeder Flachseite vorzugsweise durch eine nicht dargestellte Abdeckung, beispiels- weise eine Folie oder Scheibe, abgedeckt, so daß ein zumindest quasi geschlossenes System gebildet wird. Lediglich die erforderlichen Öffnungen, beispielsweise zur Befüllung der Kammern 4, 7, 13 und zur Entlüftung oder dgl. stellen dann, ggf. sogar verschließbare, Öffnungen zur Umgebung dar.
Bei der dritten Ausführungsform sind die Reaktionskammem 11 nicht maßstabsgerecht dargestellt. Weiter ist anzumerken, daß die Volumen der einzel- nen Kammern auch je nach Tiefe der Kammern sehr stark variieren können. Des weiteren können sich an die Reaktionskammern 11 bei Bedarf selbstverständlich auch Untersuchungskammern 16 entsprechend der ersten oder zweiten Ausfuhrungsform anschließen.
Besonders bevorzugt ist die Vorrichtung 1 gemäß einem auch unabhängig von der vorliegenden Ausführungsform realisierbaren Aspekt der vorliegenden Erfindung aus mehreren, vorzugsweise segmentartigen Modulen M aufgebaut, die beispielsweise mittels eines nicht dargestellten Adapters oder Halters in einer scheibenförmigen Konfiguration anordenbar sind. Dieser modulare Aufbau gestattet die Kombination verschiedener Untersuchungen je nach Bedarf. In Fig. 3 ist lediglich schematisch ein einziges Modul M dargestellt.
Die einzelnen Merkmale und Aspekte der ersten, zweiten und dritten Ausfüh- rungsform können auch beliebig miteinander kombiniert werden. Des weiteren können einzelne Aspekte auch unabhängig von den vorliegenden Ausführungsformen bei sonstigen Ausführungsformen oder Anwendungen eingesetzt werden.
Die Mischung der Probenflüssigkeit 3 mit der Verdünnungsflüssigkeit 8 - insbesondere in den Reaktionskammern 11 — kann durch Bremsen und Beschleunigen der Drehung der Vorrichtung 1 gefordert oder erreicht werden.
Der Durchmesser der Vorrichtung 1 bzw. der CD, beträgt vorzugsweise etwa 50 bis 250 mm, insbesondere etwa 125 mm. Die Dicke beträgt vorzugsweise 1 bis 6 mm, insbesondere etwa 3 mm. Die Vorrichtung 1 ist vorzugsweise aus einem geeigneten Kunststoff hergestellt.
Die Tiefe bzw. Breite der Mikrostrukturen, also insbesondere der beschriebe- nen Kammern, Kanäle, Verbindungen und dgl. beträgt beim Darstellungsbeispiel vorzugsweise 20 bis 1000 μm, insbesondere etwa 200 μm.
Alle Mikrostrukturen sind vorzugsweise durch eine geeignete, nicht dargestellte bzw. transparente Abdeckung überdeckt. Lediglich die Aufhahme- kammern 4, 7 und 13, ggf. die Sammelkammern 6, 10, 15 bedarfsweise der Sammelkanal 17 und/oder sonstige nicht dargestellte Entlüftungsöffhungen oder dgl. sind nach außen hin offen ausgebildet. So können die Verdunstungsverluste minimiert und dementsprechend mit hoher Genauigkeit mit geringen Flüssigkeitsvolumina gearbeitet werden.
Die einzusetzenden Volumen an Flüssigkeiten betragen pro Flüssigkeit etwa 10 bis 2.000 μl, vorzugsweise nur etwa 50 bis 200 μl.
Die Summe der Volumina der paarweise zugeordneten ersten und zweiten Dosierkammern 5, 9 beträgt vorzugsweise 1 bis 100 μl, insbesondere etwa 10 μl. Entsprechendes gilt für die Volumina der Reaktionskammern 11 und der Untersuchungskammern 16. Insbesondere sind die genannte Summe und die jeweiligen Volumina der Reaktionskammern 11 und der Untersuchungskammern 16 gleich.
Zusätzlich oder alternativ zu der Verdünnung der Probenflüssigkeit 3 durch die Verdünnungsflüssigkeit 8 kann auch ein Mischen beliebiger Flüssigkeiten 3 und 8 — also beispielsweise zweier miteinander reagierender Flüssigkeiten 3 und 8 - erfolgen. Insbesondere kann es sich dann statt der Verdünnungsflüssigkeit 8 um eine Reaktionsflüssigkeit 8 oder dgl. handeln. Entsprechend sind die Begriffe "Probenflüssigkeit" und "Verdünnungsflüssigkeit" vorzugsweise auch sehr allgemein als unterschiedliche Flüssigkeiten zu verstehen.
Mit der vorschlagsgemäßen Vorrichtung 1 und dem vorschlagsgemäßen Verfahren kann das ELISA- Verfahren oder ein sonstiges Verfahren sehr einfach und sehr schnell und insbesondere unter Einsatz von sehr geringen Flüssigkeitsmengen und damit auch kostengünstig durchgeführt werden. Des weiteren wird eine Minimierung der erforderlichen Pipettierschritte oder sonstiger Vorgänge zur Zuführung von Flüssigkeiten ermöglicht. Insbesondere wird eine sehr genaue Untersuchung in Form einer genauen quantitativen Bestim- mung eines Analyten in der Probenflüssigkeit ermöglicht.

Claims

Patentansprüche:
1. Vorrichtung (1) zur Untersuchung einer Probenflüssigkeit (3), insbesondere mittels des ELISA-Verfahrens, mit einer ersten, gemeinsamen Aumahmekammer (4) zur Aufnahme der Probenflüssigkeit (3), mit mehreren ersten Dosierkammern (5), die zur Aufnahme von Probenflüs- sigkeit (3), insbesondere durch Druck- und/oder Kapillarkräfte, an die erste Aufnahmekammer (4) angeschlossenen sind, mit einer zweiten, gemeinsamen Aufnahmekammer (7) zur Aufnahme einer Verdünnungsflüssigkeit (8), mit mehreren zweiten Dosierkammern (9), die zur ausschließlichen Aufnahme von Verdünnungsflüssigkeit (8), insbesondere durch Druck-, Kapillar- und/oder Zentrifugalkräfte, an die zweite Aufhahmekammer (7) angeschlossen sind, mit mehreren Reaktionskammern (11), wobei die ersten und/oder zweiten Dosierkammern (5, 9) in ihren Volumina variieren, wobei die ersten und zweiten Dosierkammern (5, 9) paarweise ein- ander zugeordnet sind und wobei jedes Paar mit einer zugeordneten Reaktionskammer (11) verbunden ist, so daß durch Druck- und/oder Zentrifugalkräfte die in den ersten und zweiten Dosierkammern (5, 9) enthaltenen Volumina an Probenflüssigkeit (3) und Verdünnungsflüssigkeit (8) paarweise in die zugeordneten Reaktionskammern (11) überfuhrbar und mischbar sind, wodurch die Probenflüssigkeit (3) mit unterschiedlichen Verdünnungsverhältnissen verdünnbar ist.
2. Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Volumina der ersten Dosierkammern (5), insbesondere ausgehend von der ersten Auf- nahmekammer (4), zu- oder abnehmen und die Volumina der zweiten Dosierkammern (9) entgegengesetzt zu den Volumina der zugeordneten ersten Dosierkammern (5) ab- oder zunehmen.
3. Vorrichtung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Summen der jeweils paarweise zugeordneten Volumina der ersten und zweiten Dosierkammern (5, 9) gleich sind.
4. Vorrichtung nach einem der voranstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die verdünnte Proben flüssigkeit (3) aus mindestens einer der Reaktionskammern (11) weiter verdünnbar ist.
5. Vorrichtung nach einem der voran stehenden Ansprüche, dadurch gekenn- zeichnet, daß die ersten Dosierkammern (5) parallel, insbesondere über einen ersten Kanal (18), an die erste, gemeinsame Aufhahmekammer (4) zur Aufnahme der Probenflüssigkeit (3) angeschlossen sind, insbesondere wobei der erste Kanal (18) vor Überführung der Probenflüssigkeit (3) aus den ersten Dosierkammern (5) in die zugeordneten Reaktionskammern (11) entleerbar ist.
6. Vorrichtung nach einem der voranstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die zweite Dosierkammern (9) parallel, insbesondere über einen zweiten Kanal (19), an die zweite, gemeinsame Aumahmekammer (7) zur Aufnahme der Verdünnungsflüssigkeit (8) angeschlossen sind, insbesondere wobei der zweite Kanal (19) vor Überführung der Verdünnungsflüssigkeit (8) aus den zweiten Dosierkammern (9) in die zugeordneten Reaktionskammern
(11) entleerbar ist.
7. Vorrichtung nach einem der voranstehenden Ansprüche, dadurch gekenn- zeichnet, daß jede zweite Dosierkammer (9) über eine Verbindung (12) an eine zugeordnete Reaktionskammer (11) angeschlossen ist und jede zugeordnete erste Dosierkammer (5) parallel an die zugeordnete Reaktionskammer (11) oder - insbesondere über einen Flüssigkeitsstop (S1) - an diese Verbindung
(12) angeschlossen ist, vorzugsweise wobei die Verdünnungsflüssigkeit (8) bei der Überführung von der zweiten Dosierkammer (9) in die Reaktionskammer (11) den Anschluß oder Flüssigkeitsstop (S]) der zugeordneten ersten Dosierkammer (5) abströmseitig benetzt, um die Überführung der Probenflüssigkeit (3) aus der ersten Dosierkammer (5) in die Reaktionskammer (11) zu unterstützen und insbesondere den Flüssigkeitsstop (S1) zu überwinden und/oder um ein Mischen der Probenflüssigkeit (3) mit der Verdünnungsflüs- sigkeit (8) zu bewirken, insbesondere in dem Abschnitt der Verbindung (12) vom Anschluß der ersten Dosierkammer (5) bis zur Reaktionskammer (11).
8. Vorrichtung nach einem der voranstehenden Ansprüche, dadurch gekenn- zeichnet, daß an mindestens eine der Reaktionskammern (11) oder parallel an mehrere Reaktionskammern (11) jeweils zusätzliche erste Dosierkammern (5') zur Aufnahme von verdünnter Probenflüssigkeit (3), insbesondere durch Druck-, Zentrifugal- und/oder Kapillarkräfte, angeschlossenen sind, und daß zusätzliche zweite Dosierkammern (9') zur Aufnahme von Verdünnungsflüssigkeit (8), insbesondere durch Druck-, Zentrifugal- und/oder Kapillarkräfte, an die zweite Aufnahmekammer (7), eine den zweiten Dosierkammern (9) zugeordnete Sammelkammer (10) für Verdünnungsflüssigkeit (8) oder eine zusätzliche Zuführung von Verdünnungsflüssigkeit (8) angeschlossenen sind, wobei die zusätzlichen ersten und/oder zweiten Dosierkammern (5', 9') in ih- ren Volumina variieren, wobei die zusätzlichen ersten und zweiten Dosierkammern (51, 9') paarweise einander zugeordnet sind und wobei jedes Paar mit einer zugeordneten zusätzlichen Reaktionskammer (H') verbunden ist, so daß durch Druck- und/oder Zentrifugalkräfte die in den zusätzlichen ersten und zweiten Dosierkammern (5', 9') enthaltenen Volumina an bereits einmal ver- dünnter Probenflüssigkeit (3) und Verdünnungsflüssigkeit (8) paarweise in die zugeordneten zusätzlichen Reaktionskammern (H') überführbar und mischbar sind, wodurch die bereits einmal verdünnte Probenflüssigkeit (3) mit unterschiedlichen Verdünnungsverhältnissen weiter verdünnbar ist.
9. Vorrichtung nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Volumina der zusätzlichen ersten Dosierkammern (51) zu- oder abnehmen und die Volumina der zusätzlichen zweiten Dosierkammern (9') entgegengesetzt zu den Volumina der zugeordneten zusätzlichen ersten Dosierkammern (5') ab- oder zunehmen.
10. Vorrichtung nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß die Summen der jeweils paarweise zugeordneten Volumina der zusätzlichen ersten und zweiten Dosierkammern (5', 9') gleich sind. 11. Vorrichtung nach einem der voranstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Vorrichtung (1) eine dritte Aufhahmekammer (13) zur insbesondere sequentiellen Aufnahme einer oder mehrerer Flüssigkeiten (14), wie einer Flüssigkeit mit einem Reagenz, insbesondere einem Antikörper, einer Waschflüssigkeit, wie einer Blockierflüssigkeit, insbesondere zur Blockierung freier Bindungsstellen in den Reaktionskammern (11,
11'), wie einer Flüssigkeit mit einem Enzym, das insbesondere an einem Nachweisantikörper gebunden ist, und/oder wie einer Flüssigkeit mit einem Substrat, aufweist.
12. Vorrichtung (1) zur Untersuchung einer Probenflüssigkeit (3), insbesondere mittels des ELISA- Verfahrens, vorzugsweise nach einem der voranstehenden Ansprüche, mit einer ersten Aufhahmekammer (4) zur Aufnahme der Probenflüssigkeit
(3), mit einer dritten Aufnahmekammer (13) zur sequentiellen Aufnahme verschiedener Flüssigkeiten (14), und mit mehreren Reaktionskammern (11, 11'), denen die Probenflüssigkeit (3) und die verschiedenen Flüssigkeiten (14) nacheinander zuführbar sind, wobei die Vorrichtung (1) derart ausgebildet ist, daß die dritte Aufhahme- kammer (13) jeweils vor einer erneuten Aufnahme einer Flüssigkeit (14) geleert wird.
13. Vorrichtung nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß die Vorrichtung (1) derart ausgebildet ist, daß eine Flüssigkeit mit einem Reagenz, insbe- sondere einem Antikörper, eine Waschflüssigkeit, wie eine Blockierflüssigkeit, insbesondere zur Blockierung freier Bindungsstellen in den Reaktionskammern (11, 11'), wie eine Flüssigkeit mit einem Enzym, das insbesondere an einem Nachweisantikörper gebunden ist, und/oder eine Flüssigkeit mit einem Substrat von der dritten Aufnahmekammer (14) aufnehmbar ist bzw. sind.
14. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 11 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß mehrere oder alle Reaktionskammern (11) zur sequentiellen Aufhah- me der Flüssigkeit(en) (14) durch Druck-, Kapillar- und/oder Zentrifugalkräfte an die dritte Aufnahmekammer (13) angeschlossen sind.
15. Vorrichtung nach einem der voranstehenden Ansprüche, dadurch gekenn- zeichnet, daß die Vorrichtung (1) mindestens eine den Reaktionskammern (11, 11') und/oder nachgeordneten Untersuchungskammern (16) zugeordnete Sammelkammer (15) und/oder einen Sammelkanal (17) zur Aufnahme der Flüssigkeiten (3, 8, 14) aufweist.
16. Vorrichtung nach einem der voranstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Vorrichtung (1) den Reaktionskammern (11) und/oder zusätzlichen Reaktionskammern (H') zugeordnete Untersuchungskammern (16) aufweist, so daß in den Reaktionskammern (11, 11') ablaufende Nachweisreaktionen insbesondere gleichzeitig angehalten werden können, indem in den Reaktionskammern (11, 11') befindliche Flüssigkeiten (14), insbesondere durch Druck-, Kapillar- und/oder Zentrifugalkräfte, jeweils in die zugeordneten Untersuchungskammern (16), insbesondere gleichzeitig, überführbar sind, insbesondere wobei in den Reaktionskammern (11, 11') immobilisierte Reagenzien, wie Enzyme, angeordnet sind.
17. Vorrichtung nach einem der voranstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Vorrichtung (1) als mikrofluidisches System, insbesondere in Form einer runden Scheibe, wie einer CD, ausgebildet und/oder aus vorzugsweise segmentartigen Modulen (M) aufgebaut ist.
18. Verfahren zur Untersuchung einer Probenflüssigkeit (3), insbesondere mittels des ELISA- Verfahrens, wobei die Probenflüssigkeit (3) einer ersten, gemeinsamen Aufnahmekammer (4) zugeführt und von dieser in mehrere erste Dosierkammern (5) weitergeleitet wird, wobei eine Verdünnungsflüssigkeit (8) einer zweiten, gemeinsamen Aufnah- mekammer (7) zugeführt und von dieser in mehrere zweite Dosierkammern (9) weitergeleitet wird, wobei die ersten und/oder zweiten Dosierkammern (5, 9) in ihren Volumina variieren, die ersten und zweiten Dosierkammern (5, 9) paarweise einander zugeordnet sind und durch Druck- und/oder Zentrifugalkräfte die in den ersten und zweiten Dosierkammern (5, 9) enthaltenen Volumina an Probenflüssigkeit (3) und Verdünnungsflüssigkeit (8) paarweise in zugeordnete Reaktionskammern (11) überführt und gemischt werden, wodurch die Probenflüssigkeit (3) mit unterschiedlichen Verdünnungs Verhältnissen verdünnt und anschließend untersucht wird.
19. Verfahren nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, daß ein erster Kanal (18), an den die ersten Dosierkammern (5) zur Zuführung der Probenflüs- sigkeit (3) von der ersten Aufnahmekammer (4) angeschlossen sind, zuerst entleert wird, bevor die Probenflüssigkeit (3) aus den ersten Dosierkammern (5) in die zugeordneten Reaktionskammern (11) überführt wird, und/oder daß ein zweiter Kanal (19), an den die zweiten Dosierkammern (9) zur Zuführung der Verdünnungsflüssigkeit (8) von der zweiten Aufnahmekammer (4) ange- schlössen sind, zuerst entleert wird, bevor die Probenflüssigkeit (3) aus den zweiten Dosierkammern (9) in die zugeordneten Reaktionskammern (11) überführt wird.
20. Verfahren nach Anspruch 18 oder 19, dadurch gekennzeichnet, daß zur oder während der Überführung der Probenflüssigkeit (3) aus der ersten Dosierkammer (5) in die zugeordnete Reaktionskammer (11) über eine Verbindung (12) diese Verbindung von der Verdünnungsflüssigkeit (8) bei der Überführung von der zugeordneten zweiten Dosierkammer (9) in die Reaktionskammer (11) durchströmt wird, vorzugsweise wobei die Verdünnungsflüssig- keit (8) bei der Überführung von der zweiten Dosierkammer (9) in die Reaktionskammer (11) den Anschluß einer zugeordneten ersten Dosierkammer (5) abströmseitig benetzt, um die Überführung der Probenflüssigkeit (3) aus der ersten Dosierkammer (5) in die Reaktionskammer (11) zu unterstützen und insbesondere einen Kapillarstop (20) zu überwinden.
21. Verfahren nach einem der Ansprüche 18 bis 20, dadurch gekennzeichnet, daß während der Überführung der Probenflüssigkeit (3) und der Verdünnungsflüssigkeit (8) aus den Dosierkammern (5, 9) in die zugeordnete Reaktionskammer (11) über jeweilige Verbindungen (12) die Probenflüssigkeit (3) seitlich in die durch die Verbindungen (12) strömende Verdünnungsflüssigkeit (8) oder umgekehrt eingeleitet wird, insbesondere um die Flüssigkeiten (3, 8) bereits in den Verbindungen (12) zu mischen.
22. Verfahren nach einem der Ansprüche 18 bis 21, dadurch gekennzeichnet, daß die Probenflüssigkeit (3) und die Verdünnungsflüssigkeit (8) parallel oder gleichzeitig in die jeweilige Reaktionskammer (11) insbesondere zur besseren Mischung überfuhrt werden.
23. Verfahren nach einem der Ansprüche 18 bis 23, dadurch gekennzeichnet, daß die verdünnte Probenflüssigkeit (3) aus mindestens einer der Reaktionskammern (11) weiter verdünnt wird.
24. Verfahren nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, daß zur weiteren Verdünnung die bereits einmal verdünnte Probenflüssigkeit (3) aus einer Re- aktionskammer (11) an zusätzliche erste Dosierkammern (51) geleitet wird und daß die Verdünnungsflüssigkeit (8) an zusätzliche zweite Dosierkammern (9') geleitet wird, wobei die zusätzlichen ersten und/oder zweiten Dosierkammern (5', 9') in ihren Volumina variieren und die zusätzlichen ersten und zweiten Dosierkammern (5', 9') paarweise einander zugeordnet sind, so daß durch Druck- und/oder Zentrifugalkräfte die in den zusätzlichen ersten und zweiten Dosierkammern (5', 9') enthaltenen Volumina an bereits einmal verdünnter Probenflüssigkeit (3) und Verdünnungsflüssigkeit (8) paarweise in zugeordnete zusätzliche Reaktionskammern (H1) überführt und gemischt werden, wodurch die bereits einmal verdünnte Probenflüssigkeit (3) mit unterschiedlichen Verdünnungsverhältnissen weiter verdünnt und anschließend untersucht wird.
25. Verfahren zur Untersuchung einer Probenflüssigkeit (3), insbesondere mittels des ELISA- Verfahrens, vorzugsweise nach einem der Ansprüche 18 bis 24, wobei in Reaktionskammern (11, H1) Nachweisreaktionen zum Nachweis eines Analyten in der Probenflüssigkeit (3) ablaufen, wobei den Reaktionskammern (11, 11') nacheinander durch Druck-, Zentrifu- gal- und/oder Kapillarkräfte verschiedene Flüssigkeiten (14) über eine gemeinsame dritte Aufhahmekammer (13) zugeführt werden, wobei die dritte Aufnahmekammer (13) jeweils vor Aufnahme einer neuen Flüssigkeit (14) selbsttätig durch Kapillarkräfte und/oder durch Zentrifugalkräfte geleert wird.
26. Verfahren nach einem der Ansprüche 18 bis 25, dadurch gekennzeichnet, daß den Reaktionskammern (11, I T) nacheinander verschiedene Flüssigkeiten (14), wie eine Flüssigkeit mit einem Reagenz, insbesondere einem Antikörper, wie eine Waschflüssigkeit, wie eine Blockierflüssigkeit, insbesondere zur Blockierung freier Bindungsstellen in den Reaktionskammern (11, I T), wie eine Flüssigkeit mit einem Enzym, das insbesondere an einen Nachweisantikörper gebunden ist, und/oder wie eine Flüssigkeit mit einem Substrat, vorzugsweise über eine gemeinsame dritte Aufnahmekammer (13), insbesondere durch Druck-, Kapillar- und/oder Zentrifugalkräfte, zugeführt werden.
27. Verfahren nach Anspruch 25 oder 26, dadurch gekennzeichnet, daß die dritte Aufnahmekammer (13) jeweils vor Aufnahme einer neuen Flüssigkeit (14) geleert wird, insbesondere selbsttätig durch Kapillarkräfte und/oder durch Zentrifugalkräfte.
28. Verfahren nach einem der Ansprüche 18 bis 27, dadurch gekennzeichnet, daß die Reaktionskammern (11, 11') vor Zuführung der Probenflüssigkeit (3) mit einem vorzugsweise immobilisierten Reagenz, insbesondere einem Antikörper, versehen, insbesondere beschichtet werden.
29. Verfahren nach Anspruch 28, dadurch gekennzeichnet, daß nach Immobilisierung des Reagenzes noch freie Bindungsstellen in den Reaktionskammern (11, 11') mittels einer Blockierflüssigkeit blockiert werden.
30. Verfahren nach Anspruch 28 oder 29, dadurch gekennzeichnet, daß je- weils nach dem Beschichten und/oder Blockieren, insbesondere jeweils nur einmalig, eine Waschflüssigkeit zum Spülen durch die Reaktionskammern (11, 11') geleitet wird.
31. Verfahren nach einem der Ansprüche 28 bis 30, dadurch gekennzeichnet, daß anschließend die Probenfiüssigkeit (3) mit dem jeweiligen Verdünnungs- verhältnis, insbesondere durch Druck-, Kapillar- und/oder Zentrifugalkräfte, in die jeweilige Reaktionskammer (11, 11') geleitet wird.
32. Verfahren nach Anspruch 31, dadurch gekennzeichnet, daß nach einer be- stimmten Reaktionszeit und/oder Bindung eines Analyten in der Probenflüssigkeit (3) an das Reagenz die Reaktionskammern (11, 11') gespült werden, dann ein an die Verbindung aus Reagenz und Analyten bindendes Nachweisreagenz, insbesondere ein Nachweisantikörper mit einem Enzym, in die Reaktionskammern (11, 11') geleitet wird und schließlich das ungebundene Nach- weisreagenz bzw. ungebundene Enzym wieder ausgewaschen wird.
33. Verfahren nach Anspruch 32, dadurch gekennzeichnet, daß nach dem Auswaschen des ungebundenen Nachweisreagenzes bzw. ungebundenen Enzyms ein Substrat in die Reaktionskammern (11, 11') geleitet wird, das von dem Nachweisreagenz bzw. Enzym, insbesondere enzymatisch, in einer Nachweisreaktion in eine Nachweissubstanz modifiziert oder umgewandelt wird.
34. Verfahren nach einem der Ansprüche 18 bis 33, dadurch gekennzeichnet, daß in den Reaktionskammern (11, 11') eine insbesondere enzymatische oder sonstige katalytische Nachweisreaktion zum Nachweis eines Analyten in der Probenflüssigkeit (3) abläuft und dabei ein Nachweissubstrat erzeugt wird.
35. Verfahren nach einem der Ansprüche 32 bis 34, dadurch gekennzeichnet, daß die Nachweisreaktion in mehreren oder allen Reaktionskammern (11, 11') gleichzeitig angehalten wird, indem die in den jeweiligen Reaktionskammern (11, 11') befindliche Flüssigkeit (14) mit dem Substrat und dem Nachweissubstrat aus den Reaktionskammern (11, 11') in zugeordnete Untersuchungskammern (16), vorzugsweise durch Druck-, Kapillar- und/oder Zentrifugal- kräfte, überfuhrt wird und dadurch für die Nachweisreaktion erforderliche Reaktionspartner getrennt werden.
36. Verfahren nach einem der Ansprüche 18 bis 35, dadurch gekennzeichnet, daß das Verfahren in einem mikrofluidischen System, insbesondere in Form einer runden Scheibe, wie einer CD5 und/oder in einem Aufbau aus vorzugsweise segmentartigen Modulen (M) durchgeführt wird, insbesondere wobei zur Erzeugung von Zentrifugalkräften zur Steuerung des Verfahrensablaufs das mikrofluidische System zu bestimmten Zeitpunkten, für bestimmte Zeitdauern und/oder mit bestimmten Rotationsgeschwindigkeiten rotiert wird.
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