WO2006049180A1

WO2006049180A1 - 発光測定装置及び発光測定方法

Info

Publication number: WO2006049180A1
Application number: PCT/JP2005/020130
Authority: WO
Inventors: Ryuji Sawada; Yoshio Nakashima
Original assignee: Olympus Corporation
Priority date: 2004-11-01
Filing date: 2005-11-01
Publication date: 2006-05-11
Also published as: JPWO2006049180A1; US20070257182A1; EP1808688A1; US7602479B2

Abstract

　光ゆらぎ測定装置であって、顕微鏡像取得ユニットのパラメータおよび／または試料の所望の領域における発光を時系列的に観測するのに用いられる発光測定ユニットのパラメータを設定するパラメータ設定部２と、各パラメータを記憶するパラメータ記憶部４と、顕微鏡像取得ユニットにより顕微鏡像を取得する顕微鏡像取得モードと、発光測定ユニットにより所望の領域の発光を観測する発光測定モードと、のいずれか一方を選択するモード選択部３と、選択されたモードに基づいてパラメータ記憶部４に記憶されたパラメータを読み出し、該パラメータを顕微鏡像取得ユニットまたは発光測定ユニットに入力して制御する制御部１とを具備する。

Description

明細書

発光測定装置及び発光測定方法

技術分野

[0001] 本発明は、例えば、発光ゆらぎ装置などの発光測定装置及び発光測定方法に関する。

背景技術

[0002] 以下に、発光の一例である蛍光のゆらぎの解析例として、蛍光相関分光について述べる。光ネ目関分光に関し飞 f¾、 f列 J¾、 'Fluorescence correlation spectroscopy " R.Rigler, E.S.Elson (eds.) Springer (Berlin)や、金城政孝「蛋白質核酸酵素 (1999 ) Vol.44, No.9, pl431-1437、特表平 11-502608などに論じられている。蛍光相関分光を行う装置は共焦点光学顕微鏡をベースに製作されることが多い。共焦点光学顕微鏡につヽて ίま"し onfocal Microscopy T.Wilson(ed.) Academic press (London)に論じられている。共焦点光学顕微鏡の 1つであるレーザー走査型共焦点光学顕微鏡がベースに用いられることもある。共焦点レーザー走査型光学顕微鏡については、例えば特開平 10-206742に記述されている。蛍光相関分光解析装置が共焦点光学顕微鏡に組み合わされていることにより、蛍光顕微鏡像を観察、または記録しながら、蛍光の相関分光解析などの統計解析演算などを行なうことができる。

[0003] また、特表 2003— 524180は、蛍光検出装置及びその検出方法において、蛍光相関性分光技術 (FCS)とレーザー走査顕微鏡 (LSM)とを切替えて使用することを開示している。

発明の開示

[0004] 試料上の任意の地点における蛍光相関解析を行う場合、レーザー走査型顕微鏡像で任意の測定点を指定し、その地点における蛍光相関解析値を容易に得るという方法が望まれている。装置の光学系で用いられるフィルター、光路、レーザー強度等の設定は、一般的に、顕微鏡像取得用と蛍光相関測定用とでは異なる。しかしながら、顕微鏡像取得用の光学系の設定および蛍光相関測定用の光学系を自動的に再現する仕組みはこれまで存在しなカゝつた。このため、従来は顕微鏡像の取得と蛍光相関の切替が発生するたびに数多くの光学系の設定を装置の操作者自身が変更する必要があり作業が煩雑になりかつ少なからぬ時間を要していた。

[0005] 本発明は、上記課題を解決するためになされたもので、その目的とするところは、顕微鏡像測定と蛍光揺らぎ測定の切替の利便性を向上させることが可能な発光ゆらぎ測定装置及び発光ゆらぎ測定方法を提供することにある。

[0006] 上記の目的を達成するために、本発明の第 1の側面は、観察対象である試料からの発光を時系列に観測して測定を行う発光測定装置であって、入力されるパラメータに基づ!/ヽて設定される条件下で、前記試料の顕微鏡像を取得する顕微鏡像取得ュニットと、入力されるパラメータに基づいて設定される条件下で、前記顕微鏡像に対応する前記試料の所望の領域における発光を時系列的に観測する発光測定ュニットと、前記顕微鏡像を取得するのに用いられる前記顕微鏡像取得ユニットのパラメ一タおよび Zまたは前記試料の所望の領域における発光を時系列的に観測するのに用いられる前記発光測定ユニットのパラメータを設定するパラメータ設定部と、前記パラメータ設定部によって設定された各パラメータを記憶するパラメータ記憶部と、前記顕微鏡像取得ユニットにより前記顕微鏡像を取得する顕微鏡像取得モードと、前記発光測定ユニットにより前記所望の領域の発光を観測する発光測定モードと、のいずれか一方を選択するモード選択部と、前記モード選択部により選択されたモードに基づ!/、て前記記憶部に記憶されたパラメータを読み出し、該パラメータを前記顕微鏡像取得ユニットまたは前記発光測定ユニットに入力して前記顕微鏡像取得ユニットおよび Zまたは前記発光測定ユニットを制御する制御部と、を具備する。

[0007] また、本発明の第 2の側面は、第 1の側面に関わり、前記発光測定装置は、前記発光の揺らぎを測定するものである。

[0008] また、本発明の第 3の側面は、第 1の側面に関わり、前記発光は、蛍光である。

[0009] また、本発明の第 4の側面は、第 3の側面に関わり、前記顕微鏡像取得ユニットは、レーザー走査型顕微鏡部である。

[0010] また、本発明の第 5の側面は、第 4の側面に関わり、前記レーザー走査型顕微鏡部は、共焦点型である。

[0011] また、本発明の第 6の側面は、第 3の側面に関わり、前記顕微鏡像取得ユニットに入力されるパラメータは、当該顕微鏡像取得ユニットの光学系に係るパラメータである。

[0012] また、本発明の第 7の側面は、第 6の側面に関わり、前記顕微鏡像取得ユニットに入力されるパラメータは、当該顕微鏡像取得ユニットのレンズおよび Zまたはフィルタ一および Zまたはピンホールに係るものである。

[0013] また、本発明の第 8の側面は、第 3の側面に関わり、前記顕微鏡像取得ユニットに入力されるパラメータは、前記顕微鏡像取得モードの終了時に前記パラメータ記憶部に記憶される。

[0014] また、本発明の第 9の側面は、第 3の側面に関わり、前記顕微鏡像取得ユニットに入力されるパラメータは、前記顕微鏡像取得モードの開始時に前記パラメータ記憶部から読み出される。

[0015] また、本発明の第 10の側面は、第 3の側面に関わり、前記パラメータ記憶部に入力される前記発光測定ユニットに係るパラメータは、前記顕微鏡像取得ユニットの設定に連動する。

[0016] また、本発明の第 11の側面は、第 3の側面に関わり、前記発光測定ユニットに入力されるパラメータは、当該発光測定ユニットの光学系に係るパラメータである。

[0017] また、本発明の第 12の側面は、第 11の側面に関わり、前記顕微鏡像取得ユニットに入力されるパラメータは、当該顕微鏡像取得ユニットの観測領域を規定する光学系に係るものである。

[0018] また、本発明の第 13の側面は、第 12の側面に関わり、前記観測領域は複数箇所である。

[0019] また、本発明の第 14の側面は、第 11の側面に関わり、前記発光測定ユニットに入力されるパラメータは、当該発光測定ユニットのレンズおよび Zまたはフィルターおよび Zまたはミラーおよび Zまたは AOTFおよび Zまたはピンホールに係るものである

[0020] また、本発明の第 15の側面は、第 3の側面に関わり、前記発光測定ユニットに入力されるパラメータは、前記発光測定モードの終了時に前記パラメータ記憶部に記憶される。 [0021] また、本発明の第 16の側面は、第 3の側面に関わり、前記発光測定ユニットに入力されるパラメータは、前記発光測定モードの開始時に前記パラメータ記憶部から読み出される。

[0022] また、本発明の第 17の側面は、第 3の側面に関わり、前記パラメータ記憶部に入力される前記顕微鏡像取得ユニットに係るパラメータは、前記発光測定ユニットの設定に連動する。

[0023] また、本発明の第 18の側面は、第 3の側面に関わり、前記顕微鏡像取得ユニットに係るパラメータの変更が行われた場合は、前記発光測定モードの開始時に、前記発光測定ユニットの変更入力を確認する表示を行う。

[0024] また、本発明の第 19の側面は、第 3の側面に関わり、前記顕微鏡像取得ユニットと

、前記発光測定ユニットとは、一部の光学系を共有している。

[0025] また、本発明の第 20の側面は、第 19の側面に関わり、前記顕微鏡像取得ユニットと前記発光測定ユニットに入力されるパラメータは、当該顕微鏡像取得ユニットと前記発光測定ユニットに共有される光学系に係るものを含む。

[0026] また、本発明の第 21の側面は、第 3の側面に関わり、前記パラメータ設定部は、発光の観測を行なう領域を前記顕微鏡像に対応して設定する観測位置設定部を含む

[0027] また、本発明の第 22の側面は、第 3の側面に関わり、前記発光測定装置は、観測結果を表示あるいは印刷する出力部をさらに有する。

[0028] また、本発明の第 23の側面は、第 22の側面に関わり、前記出力部はパラメータと関連付けて上記表示を行なう。

[0029] また、本発明の第 24の側面は、第 3の側面に関わり、前記発光測定装置は、時間相関演算を行なうデータ処理部をさらに有する。

[0030] また、本発明の第 25の側面は、第 22の側面に関わり、前記発光測定装置は、前記時間相関演算を行なった結果をグラフ化して表示する表示部をさらに有する。

[0031] また、本発明の第 26の側面は、第 25の側面に関わり、前記グラフは、縦軸に相関値を取り、横軸に遅延時間を取る。

[0032] また、本発明の第 27の側面は、第 25の側面に関わり、前記表示部は、前記パラメ一タの、ずれかと関連付けて上記表示を行なう。

[0033] また、本発明の第 28の側面は、観察対象である試料力もの発光を時系列に観測して測定を行う発光測定方法であって、入力されるパラメータに基づいて設定される条件下で、前記試料の顕微鏡像を取得する顕微鏡像取得ステップと、入力されるパラメータに基づいて設定される条件下で、前記顕微鏡像に対応する前記試料の所望の領域における発光を時系列的に観測する発光測定ステップと、前記顕微鏡像を取得するのに用いられる顕微鏡像取得ユニットのパラメータおよび Zまたは前記試料の所望の領域における発光を時系列的に観測するのに用いられる発光測定ユニットのパラメータを設定するパラメータ設定ステップと、前記パラメータ設定ステップで設定された各パラメータを記憶するパラメータ記憶ステップと、前記顕微鏡像取得ステップで前記顕微鏡像を取得する顕微鏡像取得モードと、前記発光測定ステップで前記所望の領域の発光を観測する発光測定モードと、の!、ずれか一方を選択するモード選択ステップと、前記モード選択ステップで選択されたモードに基づ、て前記記憶ステップで記憶されたパラメータを読み出し、該パラメータに基づ、て前記顕微鏡像取得ステップまたは前記発光測定ステップを制御する制御ステップと、を具備する。

[0034] また、本発明の第 29の側面は、第 28の側面に関わり、前記発光測定方法は、前記発光の揺らぎを測定するものである。

図面の簡単な説明

[0035] [図 1]図 1は、本発明に係る発光測定装置の基本的な構成を示す図である。

[図 2]図 2は、本発明に係る発光測定装置の基本的な測定の流れを説明するためのフローチャートである。

[図 3]図 3は、本発明の実施の形態に係る蛍光揺らぎ測定装置の光学系を示す図である。

[図 4]図 4は、本発明の実施の形態に係る蛍光揺らぎ測定装置のハードウア構成を示す図である。

[図 5]図 5は、本発明の実施の形態に係る蛍光揺らぎ測定装置の操作画面を示す図であり、 LSM操作パネルが前面にある状態を示している。

[図 6]図 6は、本発明の実施の形態に係る蛍光揺らぎ測定装置の操作画面を示す図であり、 FCS操作パネルが前面にある状態を示している。

発明を実施するための最良の形態

[0036] 以下、図面を参照して本発明の実施形態を詳細に説明する。図 1は、本発明に係る発光測定装置の基本的な構成を示しており、観察対象である試料 8からの発光のゆらぎや強度を時系列に観測して測定を行うものである。この発光測定装置は、制御部 1と、パラメータ設定部 2と、モード選択部 3と、パラメータ記憶部 4と、表示部 5と、光学系 6と、対物レンズ 7とを備える。光学系 6及び対物レンズ 7は、入力されるパラメータに基づいて設定される条件下で、試料 8の顕微鏡像を取得する顕微鏡像取得ュニット (LSM)と、入力されるパラメータに基づいて設定される条件下で、顕微鏡像に対応する試料 8の所望の領域における発光を時系列的に観測する発光測定ユニット (FCS)とを含む。ノラメータ設定部 2は、顕微鏡像を取得するのに用いられる顕微鏡像取得ユニットのパラメータおよび Zまたは試料 8の所望の領域における発光を時系列的に観測するのに用いられる発光測定ユニットのノメータを設定する。パラメ一タ記憶部 4は、パラメータ設定部 2によって設定された各パラメータを記憶する。モード選択部 3は、顕微鏡像取得ユニットにより顕微鏡像を取得する顕微鏡像取得モードと、発光測定ユニットにより所望の領域の発光を観測する発光測定モードと、のいずれか一方を選択する。

[0037] 制御部 1は、モード選択部 3で選択されたモードに基づいてパラメータ記憶部 4に記憶されたパラメータを読み出し、該パラメータを顕微鏡像取得ユニットまたは発光測定ユニットに入力して顕微鏡像取得ユニットおよび Zまたは発光測定ユニットを制御する。

[0038] 図 2は、本発明に係る発光測定装置の基本的な測定の流れを説明するためのフロ一チャートである。まず、顕微鏡像取得用のパラメータを読み込む (ステップ Sl)。次に、顕微鏡像取得用に装置を設定する (ステップ S2)。より具体的には、装置内で使用されているフィルター、光路、レーザー強度等の設定を行う。次に、顕微鏡像取得ユニットによって顕微鏡像を取得する (ステップ S3)。次に、後述する FCSタブが選択されたことに応答して蛍光測定モードへ切替える (ステップ S4)。次に、顕微鏡像取得用パラメータを記憶する (ステップ S5)。次に、蛍光測定用パラメータの変更があるか否かをチェックし、変更有りの場合にはパラメータ変更入力確認メッセージを表示して (ステップ S7)、ステップ S8に進む。また、ステップ S6において変更無しの場合には直ちにステップ S8に進む。

[0039] ステップ S8では、蛍光測定用パラメータを読み込む。次に、蛍光測定用に装置を設定する (ステップ S9)。より具体的には、装置内で使用されているフィルター、光路、レーザー強度等の設定を行う。次に蛍光測定を行い (ステップ S10)、蛍光測定用パラメータを記憶する (ステップ Sl l)。次に、顕微鏡像取得の終了判断を行い (ステップ S12)、終了であると判断された場合には処理を終了する力終了でない場合にはステップ S1に戻って上記した処理を実行する。

[0040] 図 3は、本発明の実施の形態に係る蛍光揺らぎ測定装置の光学系を示す図である

[0041] この装置の光学系は、レーザーコンバイナー 101と、レーザー走査型顕微鏡 (LSM) ユニット 102と、顕微鏡部 103と、蛍光相関分光法 (FCS)ユニット 104からなる。顕微鏡部 103は光学顕微鏡として機能する。レーザーコンバイナー 101は光源である。 L SMユニット 102はレーザー走査顕微像を取得する機能を付加するためのユニットである。レーザーコンバイナー 101と LSMユニット 102と顕微鏡部 103を組み合わせることにより、顕微鏡像に加え、レーザー走査顕微像を取得できる。 FCSユニット 104 は FCS取得機能を付加するためのユニットである。本実施形態の FCSユニット 104 は、 FSC取得機能に加えクロスコリレーション取得機能も付加させることが出来る。レ一ザーコンバイナー 101と LSMユニット 102と顕微鏡部 103と FCSユニット 104を組み合わせることにより、顕微鏡像とレーザー走査顕微像と FCSとクロスコリレーションを取得することが出来る。

[0042] レーザーコンバイナー 101は、マルチラインアルゴンレーザー 105と、グリーンヘリゥムネオンレーザー 106と、ヘリウムネオンレーザー 107と、 3つのメカ-力ノレシャツタ一 108と、 3つのダイクロイツクミラー 109と、 AOTF (Acousto— Optic Tunable Filter: 音響光学可変波長フィルター) 110を有する。

[0043] マルチラインアルゴンレーザー 105は 458nmと 488nmと 514nmの光を、グリーンへリウムネオンレーザー 106は 543nmの光を、ヘリウムネオンレーザー 107は 633nmの光を発光することが出来る。

[0044] なお、レーザーには他の波長を発振するものを用いてもよい。後述の光を同一光路上に重ね合わせる機能を失わな、範囲内でダイクロイツクミラーの代わりにガラス板やミラーを用いても良い。また、メカ-カルシャッターや AOTFを用いずに、レーザーへの印加電流等を制御することでレーザー光強度を制御しても良い。

[0045] LSMユニット 102は、第 1、第 2ガルバノスキャナーミラー 115、 116と、励起ダイク口イツクミラー 180と、第 1、第 2レンズ 112、 114と、ピンホーノレ 123と、第 1、第 2、第 3ダイク口イツクミラー 125、 128、 131と、第 1、第 2、第 3ノンドノスフイノレター 126、 129 、 132と、第 1、第 2、第 3フ才トマノレチプライヤ一 127、 130、 133と、水銀ランプ 118と、水銀ランプ光導光ミラー 117とを有する。

[0046] 励起ダイクロイツクミラー 180、第 1、第 2、第 3ダイクロイツクミラー 125、 128、 131及び第 1、第 2、第 3バンドパスフィルター 126、 129、 132はそれぞれ 6穴のレボルバーターレットにセットされている。このレボルバーターレットには任意の波長特性を持つダイクロイツクミラーやバンドパスフィルターをセットすることが出来る。このようにレボルバ一ターレットを使用することにより、簡易にこれらのダイクロイツクミラー及びバンドパスフィルターを交換することが出来る。

[0047] 例えば、励起ダイクロイツクミラー設置部に、 514nmの光を反射しそれ以外の波長の光を透過するダイクロイツクミラー、 458nmと 543nmの光を反射しそれ以外を透過するミラー、 488nmと 543nmの光を反射しそれ以外を透過するミラー、 488nmと 543nmと 633 應の光を反射しそれ以外を透過するミラー、波長によらず 20%の光を反射し 80%の光を透過するビームスプリツターなどをセットすることができる。

[0048] 例えば、第 1、第 2、第 3ダイクロイツクミラー 125、 128、 131として、それぞれ 560nm 以下の光を反射し 560nm以上の光を透過するダイクロイツクミラー、 630nm以下の光を反射し 630應以上の光を透過するダイクロイツクミラー、全反射ミラーをセットする。これと同時に第 1、第 2、第 3バンドパスフィルター 126、 129、 132として、それぞれ 505 〜525nm、 560〜600nm、 660nm以上を透過するロングパスフィルターをセットする。これにより、第 1、第 2、第 3フォトマルチプライヤー 127、 130、 133では、それぞれ 505 〜525nm、 560〜600nm、 660nm以上の蛍光を感知することが出来る。 [0049] 各ダイクロイツクミラーターレットには、この他にも任意の波長特性のダイクロイツクミラ一、全反射ミラー、光を透過させるためのガラス板など、任意の光学素子をセットすることが出来る。各バンドパスフィルターターレットには、この他にも任意の波長特性のバンドパスフィルター、光を透過させるためのガラス板や空穴など、任意の光学素子をセットすることが出来る。特に、第 1、第 2バンドパスフィルター 126、 129の位置に、それぞれ 505, 560nm以上の光を透過するロングパスフィルターを設置できるようにし、第 1, 2ダイクロイツクミラー 125、 128の位置に全反射ミラーを必要に応じてセットできる用にしておくと、前出のバンドパスフィルターセットとの対応上、使い勝手がよくなる。

[0050] ピンホール 123には、ピンホール径が可変であるものが用いられる。ピンホール径を変化させることにより、 FCSの測定領域の大きさと形状を変化させることが出来る。水銀ランプ 118は水銀ランプ光導光ミラー 117に入射する。このミラーが図に直線で表される位置にあるときには、水銀ランプ力もの光は顕微鏡部 103へは導かれない。一方、このミラーが図に点線で表される位置にあるときには、水銀ランプの光が顕微鏡部 103へ導かれる。

[0051] 顕微鏡部 103は、ミラー 119と対物レンズ 120を有する。試料 121は顕微鏡部 103 に保持される。顕微鏡部のミラー 119は、以下のように設置される。すなわち、通常の顕微鏡における蛍光観察用のダイクロイツクミラーキューブのダイクロイツクミラー設置部に全反射ミラーを設置する。このようにすることにより、顕微鏡部 103の蛍光観察用の水銀ランプ用の光路に図の LSMユニット 102を接続することが出来る。また、 LS Mユニット 102に水銀ランプ 118からの蛍光像観察用の光を導入し、顕微鏡部 103 のダイクロイツクミラーキューブを蛍光像観察用のものにすることにより、通常の蛍光観察を行うことが出来る。なお、この際のダイクロイツクミラーキューブの交換は通常のダイクロイツクミラーキューブ用のターレットを使用することが出来る。顕微鏡部 103の対物レンズ 120には、 40倍もしくは 60倍の水浸対物レンズが用いられる。

[0052] FCSユニット 104は、第 4ダイクロイツクミラー 137と、第 4, 5バンドパスフィルター 13 8、 142と、第 5, 6カップリングレンズ 139、 143と、第 3, 4光ファイノく一 140、 144と、第 1, 2アバランシェフオトダイオード 141、 145とを有する。 [0053] 第 4ダイクロイツクミラー 137は 6穴の、第 4, 5バンドパスフィルター 138、 142は 4穴のレボルバーターレットにセットされている。このレボルバーターレットには任意の波長特性を持つダイクロイツクミラーやバンドパスフィルターをセットすることが出来る。このようにレボルバーターレットを使用することにより、簡易にこれらのダイクロイツクミラ一及びバンドパスフィルターを交換することが出来る。

[0054] 第 3, 4光ファイバ一 140、 144には、マノレチモードのものを用いる。マノレチモードのものを用いることにより、蛍光の導光を行うことが出来る。

[0055] LSMユニット 102とレーザーコンバイナー 101は第 1光ファイバ一 190と第 1、第 2 カップリングレンズ 111、 113により光学的に接続されている。レーザーコンバイナー 101と FCSユニット 104は第 2光ファイバ一 135と第 3,第 4カップリングレンズ 134、 1 36により光学的に接続されている。

[0056] 第 1光ファイバ一 190にはシングルモードのものを用いる。シングルモードファイバ一であるので、出射端におけるビームのプロファイルは良好である。このシングルモードファイバ一は、複数の波長の励起光を 1本の光ファイバ一により導くことが可能である。第 2光ファイバ一 135にはマルチモードのものを用いる。マルチモードのものを用いることにより、蛍光の導光を行うことが出来る。なお、第 3及び第 4カップリングレンズ 134、 136を適当なものに交換することにより、第 2光ファイバ一 135から出射した光の第 1, 2光アバランシェフオトダイオード 141、 145への結合効率を高めることが出来る。

[0057] 本実施の形態においては、測定対象粒子を CFP, YFP, GPF, RFP, DsRed,ローダミングリーン、ローダミン 6G, Alexa 633, Cy3, Cy5など多くの種類の色素で標識することが出来る。本実施形態においては、使用する色素に応じて励起光源 105〜107、励起ダイクロイツクミラー 180、第 1、第 2、第 3、第 4ダイクロイツクミラー 125、 128、 1 31、 137、第 1、第 2、第 3、第 4、第 5ノンドソスフイノレター 126、 129、 132、 138、 1 42を選択することが可能である。

[0058] 次に、上記した光学系の作用を説明する。励起光は、レーザーコンバイナー 101より射出され、第 1光ファイバ一 190、 LSMユニット 102、顕微鏡部 103を通過して試料 121に到る。試料 121からの蛍光は、顕微鏡部 103、 LSMユニット 102、第 2光フアイバー 135を通過して FCSユニット 104に到る。

[0059] マルチラインアルゴンレーザー 105は 458nmと 488nmと 514nmの光を、グリーンへリウムネオンレーザー 106は 543nmの光を、ヘリウムネオンレーザー 107は 633nmの光を発光する。各レーザーから出力された光はダイクロイツクミラー 109によって同一光路に重ね合わせられる。各レーザーのレーザー光射出口に設けたシャッター 108と AO TF110により、各レーザー波長について所望の出力を組み合わせた光が得られる。これを第 1カップリングレンズ 111を通して第 1光ファイバ一 190へ結合する。

[0060] 第 1光ファイバ一 190からのレーザー光は LSMユニット 102に入射され、第 2カップリングレンズ 113により平行光にされる。この光は励起ダイクロイツクミラー 180によつて反射され、第 1ガルバノスキャナーミラー 115、第 2ガルバノスキャナーミラー 116を経て顕微鏡部 103へ入射される。

[0061] 顕微鏡部 103へ入射された光はミラー 119で反射され、対物レンズ 120で試料 12 1に集光される。試料 121から発せられた蛍光は、対物レンズ 120で集光され、ミラー 119で反射されて LSMユニット 102に入射される。

[0062] LSMユニット 102に入射した蛍光は第 1、第 2ガルバノスキャナーミラー 115、 116 で反射され、励起ダイクロイツクミラー 180を透過する。その後、第 1レンズ 122で集光される。集光位置に設置されたピンホール 123を通過した蛍光は第 2レンズ 124で平行光にされる。第 2レンズ 124を通過した後、第 1の波長領域の蛍光は第 1ダイクロイツクミラー 125で反射され、第 1バンドパスフィルター 126を通過して第 1フォトマルチプライヤ一 127で感知される。第 2の波長領域の蛍光は第 1ダイクロイツクミラー 125を透過し、第 2ダイクロイツクミラー 128で反射され、第 2バンドパスフィルター 129を通過して第 2フォトマルチプライヤー 130で感知される。第 3の波長領域の蛍光は第 1ダイク口イツクミラー 125及び第 2ダイクロイツクミラー 128を透過し、第 3ダイクロイツクミラー 1 31で反射され、第 3バンドパスフィルター 132を通過して第 3フォトマルチプライヤー 1 33で感知される。

[0063] 第 3ダイクロイツクミラー 131を通過した蛍光は第 3カップリングレンズ 134で集光され、第 2光ファイバ一 135へ結合される。第 2光ファイバ一 135からのレーザー光は FCS ユニット 104に入射され、第 4カップリングレンズ 136により平行光にされる。この光は第 4ダイクロイツクミラー 137によって分光される。第 4の波長領域の光は第 4ダイクロイックミラー 137によって反射され、第 4バンドパスフィルター 138を透過し、第 5カツプリングレンズ 139をとおして第 3光ファイバ一 140へ結合される。この蛍光は第 1ァバランシェフオトダイオード 141により感知される。第 5の波長領域の光は第 4ダイクロイツクミラー 137を透過し、第 5バンドパスフィルター 142を透過し、第 6カップリングレンズ 1 43をとおして第 4光ファイバ一 144へ結合される。この蛍光は第 2アバランシェフオトダィオード 145により感知される。

[0064] 試料 121上の励起レーザー光の焦点及び観察位置は、互いに走査方向が直交している第 1ガルバノスキャナーミラー 115と第 2ガルバノスキャナーミラー 116とにより、 X軸走査と Y軸走査が行われる。これにより、試料 121上の励起レーザー光の焦点及び観察位置は試料面内で 2次元走査される。これに、対物レンズ 120または試料 12 1の光軸方向の移動を加えることにより、試料上の励起レーザー光の焦点及び観察位置を試料内で 3次元走査することも可能である。

[0065] 図 4は、本発明の実施の形態に係る蛍光揺らぎ測定装置のハードウェア構成を示す図である。この装置は、レーザーコンバイナー 101と、 LSMユニット 102と、顕微鏡咅 103と、 FCSユニット 104と、帘1』御装置 205と、ネ目関解析ボード 206と、ノーソナノレコンピューター 207よりなる。

[0066] レーザーコンバイナー 101と、 LSMユニット 102と、顕微鏡部 103と、 FCSユニット 104内の各電動部はこの制御装置 205により制御可能である。顕微鏡 103内では、対物レンズ 120の位置が制御可能である。レーザーコンバイナー 101内では、各メカ二カルシャッター 108と AOTF110力制御装置 205により制御される。 LSM102内では、第 1,第 2ガルバノスキャナーミラー 115、 116の角度と、第 1レンズ 122の位置またはピンホール 123の位置と、第 1、第 2、第 3ダイクロイツクミラー 125、 128、 131 の種類と、第 1、第 2、第 3バンドパスフィルター 126、 129、 132の種類と、水銀ランプ光導光ミラー 117と、水銀ランプシャッターが制御装置により制御可能である。 FCS ユニット 104の中では、第 4ダイクロイツクミラー 137の種類と、第 4、第 5バンドパスフィルター 138、 142の種類と、第 3、第 4光ファイバ一 140、 144のバンドパスフィルター側の端面の位置が制御可能である。これらの電動パーツの制御及び状態把握はパ一ソナルコンピューター 207を介して行われる。

[0067] FCSユニット 104からは第 1及び第 2アバランシェフオトダイオード 141、 145力ら第 4 及び第 5の波長領域の蛍光の強度を示す光強度値が出力される。相関解析ボード 2 06では、該光強度値の統計解析がなされ、その結果である光強度統計解析値が出力される。光強度統計解析値はパーソナルコンピューター 207へ出力される。次に時間相関演算により、第 4及び第 5の波長領域のそれぞれの蛍光の自己相関関数が求められる。演算結果はグラフ化して表示部に表示することも可能である。この場合、縦軸に相関値を取り、横軸に遅延時間を取る。また、第 4と第 5の波長領域の蛍光の相互相関関数を求めることが可能である。

[0068] 試料画像については、従来の LSM装置と同様に取得する。すなわち、第 1、第 2ガルバノスキャナーミラー 115、 116及び対物レンズ 120の制御により、測定点を 3次元的に走査する。各測定点における、各蛍光波長の強度をそれぞれ第 1、第 2、第 3フオトマルチプライヤー 127、 130、 133により検出する。各測定点位置及び各測定点における各蛍光波長領域の蛍光信号強度はパーソナルコンピューター 207上で処理され、画像化される。これにより、各蛍光波長域の 3次元 LSM画像を取得する。この試料画像上で、 1つもしくは複数の FCS測定点を指定する。これにより、指定された点における FCS測定が同時もしくは擬似的に同時に行われる。

[0069] 本測定装置はコンピューターにより制御されるが、本実施形態の操作画面は図 5および図 6のようなものである。図 5は LSM操作パネルが前面にある状態を示し、図 6は FCS操作パネルが前面にある状態を示す。

[0070] 図 5の LSMタブ 301を押すことで LSM操作パネルを前面に出すことができ、図 6の FCSタブ 401を押すことで FCS操作パネルを前面に出すことができる。 FCS操作パネルが前面にあるときに LSMタブ 301を押すと、 LSM操作パネルが前面になると同時に FCS操作パネル内のすべてのパラメーターが保存され、直前の LSM測定に用いられていた LSM操作パネル内のすぺてのパラメーターにしたがって装置の状態が LSM測定用に再設定される。一方、 LSM操作パネルが前面にあるときに FCSタブ 4 01を押すと、 FCS操作パネルが前面になると同時に LSM操作パネル内のすべてのパラメーターが保存され、直前の FCS測定に用いられていた FCS操作パネル内のすぺてのパラメーターにしたがって装置の状態力 SFCS測定用に再設定される。

[0071] 以下に、図 5の LSM操作パネルを説明する。 LSMタブ 301を押すことで、この操作パネルを前面に出すことが出来る。 LSM設定読み込みボタン 302および LSM設定保存ボタン 303により、本操作パネル内のすべてのパラメーターの読み込みおよび保存が出来る。なお、保存されたデータの内容は実験終了後も容易に確認できる。本操作パネル内のすべのパラメーターとは、すなわちズーム倍率、 LSM画像取得速度、第 1、第 2、第 3チャンネルの表示色、第 1、第 2、第 3チャンネルの印加電圧、第 1、第 2、第 3チャンネルのゲイン、第 1、第 2、第 3チャンネルのオフセット、蛍光の光軸とピンホール 123の中心の X軸および Y軸上の相対位置、ピンホール 123径の大きさ、マルチラインアルゴンレーザー用レーザーシャッター 108の状態、グリーンへリゥムネオンレーザー用レーザーシャッター 108の状態、ヘリゥムネオンレーザー用レ一ザ一シャッター 108の状態、 458nmのレーザー光強度、 488nmのレーザー光強度、 515nmのレーザー光強度、 543nmのレーザー光強度、 633nmのレーザー光強度、水銀ランプシャッターの状態、水銀ランプ導光用ミラー 117の状態、励起ダイクロイツクミラー 180、第 1、第 2、第 3ダイクロイツクミラー 125、 128、 131、第 1、第 2、第 3バンドノスフィルター 126、 129、 132を含む。

[0072] なお、第 1、第 2、第 3のチャンネルの信号は第 1、第 2、第 3のフォトマルチプライヤ一 127、 130、 133からの信号に対応する。 LSMの測定の開始および終了は LSM 動作開始/終了ボタン 304によって指示される。 LSM像は LSM像表示ウィンドウ 305 に表示される。 LSM像は縦 512x横 512画素で構成される。 LSM画像読み込みボタン 306および LSM画像保存ボタン 307により、前記顕微鏡像の読み込みおよび保存が可能である。ズーム倍率設定スライダー 308により LSM画像の拡大倍率が 1倍力も 10倍まで設定できる。 LSM画像取得速度設定ボタン 309により、 LSM画像の取得速度の設定が可能である。前記速度は slow、 normal, fastの 3つより選択でき、それぞれ 5,000、 50,000、 500,000Hzで各画素のデータを取得する。第 1、第 2、第 3チャンネルのデータの表示色設定ボタン 310、 314、 318の操作により、第 1、第 2、第 3チヤンネルの表示色は Blue、 Green, Redの 3つより選択可能である力既に他のチャンネルの表示用に選択されたものは重ねてすることのないように選択不可になる。また、 Noneを選択することにより表示しないこと可能である。第 1、第 2、第 3チャネルの印加電圧設定スライダー 311、 315、 319により第 1、第 2、第 3のフォトマルチプライヤ一 127、 130、 133の印加電圧を設定することが可能である。設定可能な範囲は 0V より使用されるフォトマルチプライヤーが耐えられる最大値までである。第 1、第 2、第 3チャンネルのゲイン設定スライダー 312、 316、 320およびオフセット設定スライダー 313、 317、 321により、第 1、第 2、第 3チャンネルのゲインおよびオフセットを設定できる。これらの設定により、第 1、第 2、第 3チャンネルの LSMシグナルを調整して重ねあわせて表示することが出来る。蛍光の光軸とピンホール 123の中心の相対位置は、グラフィカルなボタン 322または X軸 323、 Y軸 324用のピンホール位置調整スライダーによって制御される。これにおいて、 Χ,Υ軸ともに光軸に垂直であり両軸とも最大移動範囲 lmm以上であり、 1000ステップより細かい分解能で動作させることが出来る。ピンホール径調整スライダー 325によって、ピンホール径を調整することが出来る

[0073] マルチラインアルゴンレーザー 105、グリーンヘリウムネオンレーザー 106、ヘリウムネオンレーザー 107のシャッター 108は、それぞれ対応するシャッター制御ボタン 32 6、 327、 328によって開閉が制御される。 458, 488, 515, 543, 633nmの励起光強度は、それぞれ対応するスライダー 329〜333によって 0%から 100%間での範囲で 1%より細かい分解能で制御される。本実施形態では、 LSM像の取得とは別に、水銀ランプ 118を使用した通常の蛍光像観察も可能である。このための水銀ランプのシャッターの開閉は水銀ランプシャッター制御ボタン 334で行う。また、水銀ランプ光を導入する際には水銀ランプ導光用ミラー 117をセットする必要があるが、これは水銀ランプ導光用ミラー制御ボタン 335で行う。励起光を透過し蛍光を反射する励起ダイクロイツクミラー 180は、励起光波長と蛍光波長によって選択される必要があるが、励起ダイク口イツクミラー制御ボタン 336によりターレット内の 6枚のミラー力も選択できる。

[0074] 第 1、第 2、第 3バンドパスフィルター 126、 129、 132および第 1、第 2、第 3ダイク口イツクミラー 125、 128、 131は、それぞれのターレット内にある 6枚の素子の中力もの一枚を、それぞれの制御ボタンによって選択することが出来る。

[0075] 以下に、図 6の FCS操作パネルを説明する。 FCSタブ 401を押すことで、この操作パネルを前面に出すことが出来る。 FCS設定読み込みボタン 402および FCS設定保存ボタン 403により、本操作パネル内のすべてのパラメータの読み込みおよび保存が出来る。なお、保存されたデータの内容は実験終了後も容易に確認できる。本操作パネル内のすべのパラメータとは、すなわち FCS測定点数、各 FCS測定点の位置、各点の FCS測定時間、蛍光の光軸とピンホール 123の中心の X軸および Y軸上の相対位置、ピンホール 123径の大きさ、マルチラインアルゴンレーザー用レーザーシャッター 108の状態、グリーンヘリウムネオンレーザー用レーザーシャッター 108の状態、ヘリウムネオンレーザー用レーザーシャッター 108の状態、 458nmのレーザー光強度、 488nmのレーザー光強度、 515nmのレーザー光強度、 543nmのレーザー光強度、 633nmのレーザー光強度、水銀ランプシャッターの状態、水銀ランプ導光用ミラー 117の状態、励起ダイクロイツクミラー 180、第 1、第 2、第 3ダイクロイツクミラー 12 5、 128、 131、第 1、第 2、第 3ノンドパスフィルター 126、 129、 132を含む。なお、本実施形態では複数点の FCS測定の実施に際して、まず各地点の測定を順番に行い (これを 1サイクルとする)、このサイクルを複数回実施している。この 1サイクルを微小時間で実施することにより、各点を擬似的に同時に測定している。 FCS測定の開始および中断は FCS動作開始/終了ボタン 404によって指示される。 FCS測定点数設定ボタン 408により FCSの測定点数を 1点力も 4点まで設定できる。 FCS測定点位置設定ボタン 409により、 FCSの各測定点の LSM像上での位置を取得した LSM像の範囲内で 1画素の分解能で設定することが可能である。 LSM像は LSM像表示ウィンドウ 405に表示され、 FCSの測定点もこの画像上に十字で表示される。この表示をマウスのドラッグアンドドロップで移動させることでも、 FCS測定点位置の設定が可能である。なお、マウスカーソルを前記表示にあわせることによつても各測定点の座標を表示させることが出来る。 LSM画像読み込みボタン 406および LSM画像保存ボタン 407により、前記 LSM像の読み込みおよび保存が可能である力このとき LSM像と FCS測定点位置表示が重ねられたイメージが読み込みまたは保存される。その他の操作ボタン 422〜442の機能は対応する LSM測定の設定用のボタン 322〜342と同様であるが、もっぱら FCS測定の設定用である。

本実施形態では、上記の構成を用いて、試料画像上で 1つもしくは複数の FCS測定点を指定し、前記指定された点における FCS測定が同時もしくは擬似的に同時に行われる。これにより、各地点における被測定物質の拡散時間の変化の起こるタイミングがわかる。また、このようにして複数の地点において同時もしくは擬似的に同時に取得された FCSデータより、各地点間の自己相関の比較が行われる。これにより、例えば地点 Aにおける被測定物質の拡散時間の変化と、地点 Bにおけるそれが比較され、両地点を拡散時間の変化が伝わる速度を知ることが出来る。

[0077] 本実施形態において、試料に細胞を用い、細胞内のタンパク質の拡散時間の変化を測定することが可能である。この拡散時間の変化は被測定タンパク質と他のタンパク質との結合状態や、被測定タンパク質の重合状態、立体構造などを示す。細胞の情報伝達はこれらの変化を介しておこなわれるため、拡散速度の変化を追跡することで細胞内や細胞間の情報伝達の様子を知ることが出来る。また、この測定を細胞を対象に複数点において同時、もしくは擬似的に同時に行うことにより、両地点を情報が伝わる速度などを知ることが出来る。

[0078] この発明の実施の形態の各構成は、当然、各種の変形、変更が可能である。例えば、複数の励起光学系や複数の検出光学系で構成したり、検出された信号を様々に処理したりして、特殊な効果を得ることができる。特に LSMおよび FCSの状態の読み込み、保存の対象は本実施形態に挙げたものだけでなぐ FCSユニット、顕微鏡内の各種設定、制御を対象にしてもよい。

[0079] その他、本発明は上記実施形態に限定されるものではなぐ実施段階ではその要旨を変更しな、範囲で種々変更することが可能である。

[0080] さらに、上記実施の形態には、種々の段階の発明が含まれており、開示されている複数の構成要件における適宜な組み合わせにより種々の発明が抽出できる。例えば、実施の形態に示されている全構成要件からいくつかの構成要件が削除されても、発明が実施しょうとする課題の欄で述べた課題を解決でき、発明の効果の欄で述べられている効果が得られる場合には、この構成要件が削除された構成が発明として抽出できる。

産業上の利用可能性

[0081] 本発明によれば、顕微鏡像測定と蛍光揺らぎ測定の切替時に各種の設定を!、ち、ち行う手間を省くことができ、装置の利便性を向上させることができる。

Claims

請求の範囲

[1] 観察対象である試料力の発光を時系列に観測して測定を行う発光測定装置であつて、

入力されるパラメータに基づいて設定される条件下で、前記試料の顕微鏡像を取得する顕微鏡像取得ユニットと、

入力されるパラメータに基づいて設定される条件下で、前記顕微鏡像に対応する前記試料の所望の領域における発光を時系列的に観測する発光測定ユニットと、前記顕微鏡像を取得するのに用いられる前記顕微鏡像取得ユニットのパラメータおよび Zまたは前記試料の所望の領域における発光を時系列的に観測するのに用いられる前記発光測定ユニットのパラメータを設定するパラメータ設定部と、

前記パラメータ設定部によって設定された各パラメータを記憶するパラメータ記憶部と、

前記顕微鏡像取得ユニットにより前記顕微鏡像を取得する顕微鏡像取得モードと、前記発光測定ユニットにより前記所望の領域の発光を観測する発光測定モードと、の!、ずれか一方を選択するモード選択部と、

前記モード選択部により選択されたモードに基づいて前記記憶部に記憶されたパラメータを読み出し、該パラメータを前記顕微鏡像取得ユニットまたは前記発光測定ユニットに入力して前記顕微鏡像取得ユニットおよび zまたは前記発光測定ユニットを制御する制御部と、

を具備する発光測定装置。

[2] 前記発光測定装置は、前記発光の揺らぎを測定するものである請求項 1に記載の発光測定装置。

[3] 前記発光は、蛍光である請求項 1記載の発光測定装置。

[4] 前記顕微鏡像取得ユニットは、レーザー走査型顕微鏡部である請求項 3に記載の発光測定装置。

[5] 前記レーザー走査型顕微鏡部は、共焦点型である請求項 4に記載の発光測定装置

[6] 前記顕微鏡像取得ユニットに入力されるパラメータは、当該顕微鏡像取得ユニットの光学系に係るパラメータである請求項 3に記載の発光測定装置。

[7] 前記顕微鏡像取得ユニットに入力されるパラメータは、当該顕微鏡像取得ユニットのレンズおよび Zまたはフィルターおよび Zまたはピンホールに係るものである請求項

6に記載の発光測定装置。

[8] 前記顕微鏡像取得ユニットに入力されるパラメータは、前記顕微鏡像取得モードの終了時に前記パラメータ記憶部に記憶される請求項 3に記載の発光測定装置。

[9] 前記顕微鏡像取得ユニットに入力されるパラメータは、前記顕微鏡像取得モードの開始時に前記パラメータ記憶部から読み出される請求項 3に記載の発光測定装置。

[10] 前記パラメータ記憶部に入力される前記発光測定ユニットに係るパラメータは、前記顕微鏡像取得ユニットの設定に連動する請求項 3に記載の発光測定装置。

[11] 前記発光測定ユニットに入力されるパラメータは、当該発光測定ユニットの光学系に係るパラメータである請求項 3に記載の発光測定装置。

[12] 前記顕微鏡像取得ユニットに入力されるパラメータは、当該顕微鏡像取得ユニットの観測領域を規定する光学系に係るものである請求項 11に記載の発光測定装置。

[13] 前記観測領域は複数箇所である請求項 12に記載の発光測定装置。

[14] 前記発光測定ユニットに入力されるパラメータは、当該発光測定ユニットのレンズおよび Zまたはフィルターおよび Zまたはミラーおよび Zまたは AOTFおよび Zまたはピンホールに係るものである請求項 11に記載の発光測定装置。

[15] 前記発光測定ユニットに入力されるパラメータは、前記発光測定モードの終了時に前記パラメータ記憶部に記憶される請求項 3に記載の発光測定装置。

[16] 前記発光測定ユニットに入力されるパラメータは、前記発光測定モードの開始時に前記パラメータ記憶部から読み出される請求項 3に記載の発光測定装置。

[17] 前記パラメータ記憶部に入力される前記顕微鏡像取得ユニットに係るパラメータは、前記発光測定ユニットの設定に連動する請求項 3に記載の発光測定装置。

[18] 前記顕微鏡像取得ユニットに係るパラメータの変更が行われた場合は、前記発光測定モードの開始時に、前記発光測定ユニットの変更入力を確認する表示を行う請求項 3に記載の発光測定装置。

[19] 前記顕微鏡像取得ユニットと、前記発光測定ユニットとは、一部の光学系を共有している請求項 3に記載の発光測定装置。

[20] 前記顕微鏡像取得ユニットと前記発光測定ユニットに入力されるパラメータは、当該顕微鏡像取得ユニットと前記発光測定ユニットに共有される光学系に係るものを含む請求項 19に記載の発光測定装置。

[21] 前記パラメータ設定部は、発光の観測を行なう領域を前記顕微鏡像に対応して設定する観測位置設定部を含む請求項 3に記載の発光測定装置。

[22] 前記発光測定装置は、観測結果を表示あるいは印刷する出力部をさらに有する請求項 3に記載の発光測定装置。

[23] 前記出力部はパラメータと関連付けて上記表示を行なう請求項 22に記載の発光測定装置。

[24] 前記発光測定装置は、時間相関演算を行なうデータ処理部をさらに有する請求項 3 に記載の発光測定装置。

[25] 前記発光測定装置は、前記時間相関演算を行なった結果をグラフ化して表示する表示部をさらに有する請求項 22に記載の発光測定装置。

[26] 前記グラフは、縦軸に相関値を取り、横軸に遅延時間を取る請求項 25に記載の発光測定装置。

[27] 前記表示部は、前記パラメータのいずれ力と関連付けて上記表示を行なう請求項 25 に記載の発光測定装置。

[28] 観察対象である試料からの発光を時系列に観測して測定を行う発光測定方法であつて、

入力されるパラメータに基づいて設定される条件下で、前記試料の顕微鏡像を取得する顕微鏡像取得ステップと、

入力されるパラメータに基づいて設定される条件下で、前記顕微鏡像に対応する前記試料の所望の領域における発光を時系列的に観測する発光測定ステップと、前記顕微鏡像を取得するのに用いられる前記顕微鏡像取得ユニットのパラメータおよび Zまたは前記試料の所望の領域における発光を時系列的に観測するのに用いられる前記発光測定ユニットのパラメータを設定するパラメータ設定ステップと、前記パラメータ設定ステップで設定された各パラメータを記憶するパラメータ記憶ステツプと、

前記顕微鏡像取得ステップで前記顕微鏡像を取得する顕微鏡像取得モードと、前記発光測定ステップで前記所望の領域の発光を観測する発光測定モードと、の、ずれか一方を選択するモード選択ステップと、

前記モード選択ステップで選択されたモードに基づいて前記記憶ステップで記憶されたパラメータを読み出し、該パラメータに基づヽて前記顕微鏡像取得ステップまたは前記発光測定ステップを制御する制御ステップと、

を具備する発光測定方法。

前記発光測定方法は、前記発光の揺らぎを測定するものである請求項 28に記載の発光測定方法。