JP2003207450A

JP2003207450A - 蛍光強度測定方法および装置

Info

Publication number: JP2003207450A
Application number: JP2002159178A
Authority: JP
Inventors: Toshiji Shiraishi; 利治白石; Teruo Fujii; 輝夫藤井; Shoiku Ko; 鍾▲いく▼ 洪
Original assignee: Aida Engineering Ltd
Current assignee: Aida Engineering Ltd
Priority date: 2001-11-09
Filing date: 2002-05-31
Publication date: 2003-07-25
Anticipated expiration: 2022-05-31
Also published as: JP3731882B2

Abstract

(57)【要約】【課題】バックグランドノイズに影響されずに、蛍光強
度の時間変化特性を精度よく測定することができる蛍光
強度測定方法および装置を提供することにある。【解決手段】この発明は、画像撮像部により撮像された
キャピラリ画像の所定の位置に所定の大きさの領域を設
定して、キャピラリ内を泳動するサンプルに励起光を照
射してサンプルが発する蛍光光の画像を採取して、領域
内の蛍光光の平均値を算出してこの平均値による時間−
蛍光強度の特性を測定するものである。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】この発明は、蛍光強度測定方
法および装置に関し、詳しくは、マイクロチップ泳動路
（キャピラリ）上で泳動された試料（サンプル）に励起
光を照射してサンプルからの蛍光を受光してその強度を
測定する際に、バックグランドノイズに影響されずに、
蛍光強度の時間変化特性を精度よく測定することができ
るような蛍光強度測定方法および装置に関する。

【０００２】

【従来の技術】従来のマイクロチップは、板状で実質的
に透明体であり、特開平１０−２４６７２１号等に記載
されているように、数十μｍ〜百μｍ程度の十字の泳動
路溝が透明なプラスチップ基板の内部に基板の面に沿っ
て設けられ、溝の各端部には上部が開口したポッド（２
ｍｍφ程度の穴）がリザーバとして設けられている。こ
のポッドの１つあるいはいくつかから電気泳動液（GE
L）が溝に注入されて充填された後に、ポッドの１つに
サンプルが充填される。そして、そのポッドに対して同
じ溝の対向する側のポッドに＋Ｖの高電圧が印加されて
サンプルを導入溝に沿って電気泳動させる（導入処
理）。所定の時間経過後に泳動の途中で導入溝の十字路
のクロスポイントに目的のものが泳動してきたタイミン
グを見計らって、ポッドの電圧印加を切り換えて泳動溝
を分画溝側に切り換える。さらに、目標のポッドに向け
てサンプルを所定の一定時間泳動させる（分画処理）。
これにより、例えば、ＤＮＡ解析などでは泳動路で分画
され分離されたサンプル（例えば目的のＤＮＡバンド部
分）を光学的なレーザ光等を用いた検出装置で検出し、
その鎖長解析などが行われる。あるいは、一定時間経過
後に目的の位置に到達した分画されたサンプル、例え
ば、分画された目的のＤＮＡバンド部分に励起光を照射
してその蛍光強度を測定するとともに、目的とするＤＮ
Ａを切り出してポッドに回収する。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】ＤＮＡ塩基配列の長い
ものはその長さに応じて泳動速度も遅くなり、発光幅も
広がって、連続塩基による波形の重なりが起こる。この
場合の検出波形信号は、単独塩基による正規波形の信号
とならずに、検出波形が隣接波形信号と重なって連接波
形信号となってしまう。また、泳動の際に発生する各塩
基のスマイリングやピッチ変動によっても波形信号の重
なりが発生して連接波形信号を発生させる原因になる。
さらに、本来のＤＮＡ塩基配列と同時にデオキシ状態で
反応が停止したＤＮＡ塩基が検出されるので、それが各
完全結合のＤＮＡ塩基の検出信号に対してゴースト信号
となって現れてくる。このような信号波形も波形の連接
を発生させる原因になる。しかも、対象となる目的のＤ
ＮＡ自体がポッドに注入されていないのに、あるいは分
画されていない状態で検査や測定が行われることも多々
ある。

【０００４】蛍光強度の測定としては、発光ダイオード
からの照射光をサンプルに照射し、受光素子として、例
えば、ＡＰＤ（アバランシ・ホト・ダイオード）を用い
てピンポイントで蛍光強度を測定することが行われてい
る。しかし、キャピラリの泳動路にゴミやほこりがあっ
て、それが蛍光を発し、それがバックグランドノイズと
して測定値に乗り、蛍光強度の測定精度を低下させる問
題がある。また、キャピラリの側壁は、平坦度がよいと
言えず、ギザギザしていて、測定位置が側壁近傍に位置
すると、側壁に滞留した蛍光物質からノイズが発生し
て、それにより誤検出することがある。その結果、サン
プル本来の蛍光強度に対応した測定データが得られない
欠点がある。しかし、現在のところ、ピンポイントの測
定位置がキャピラリの適正な位置になっているか否かを
確認する手段はない。一方、蛍光顕微鏡採取した画像を
ＣＣＤカメラを介して電気信号に変換してコンピュータ
を介してその画像表示することで、広い視野の観察画像
を得ることも可能である。しかし、これでは、蛍光強度
の時間的な変化特性を測定することはできない。この発
明の目的は、このような従来技術の問題点を解決するも
のであって、バックグランドノイズに影響されずに、蛍
光強度の時間変化特性を精度よく測定することができる
蛍光強度測定方法および装置を提供することにある。

【０００５】

【課題を解決するための手段】このような目的を達成す
るためのこの第１の発明の蛍光強度測定方法および装置
の特徴は、画像撮像部により撮像されたキャピラリ画像
の所定の位置に所定の大きさの領域を設定して、キャピ
ラリ内を泳動するサンプルに励起光を照射し、サンプル
が発する蛍光光の画像を採取して、採取された画像に基
づいて領域内の蛍光光の強度の平均値を算出してこの平
均値による時間−蛍光強度の特性測定をするものであ
る。さらに、第２の発明の蛍光強度測定方法および装置
の特徴は、前記の領域内の蛍光光の強度の最大値あるい
はその平均値が前記の領域において試料が発する蛍光光
の強度あるいはその平均値の最大値を越えた所定値以上
あるいはバックグランドノイズを排除できる所定値以上
のときに前記の領域をキャピラリ画像上で移動させるも
のである。

【０００６】

【発明の実施の形態】このように、第１の発明にあって
は、キャピラリ内を泳動するサンプルに励起光を照射し
てサンプルが発する蛍光光の画像を採取して、キャピラ
リ画像の所定の位置に所定の大きさで設定された領域内
での蛍光光の平均値を算出して時間−蛍光強度の特性を
測定するようにしている。このように、ある限定された
領域における平均値を算出して蛍光強度を得るようにし
ているので、ゴミやほこりなどからの蛍光光が検出デー
タに混在していてもほとんど影響されないで所望の測定
値を得ることができる。また、ここで設定される領域
は、サンプル、例えば、目的とするＤＮＡバンドの泳動
時間に合わせた大きさの領域を設定することが可能であ
り、かつ、ゴミやほこり、キャピラリの側壁などを避け
て領域設定することができる。これによりバックグラン
ドノイズに影響されずに、精度の高い測定値を得ること
ができる。さらに、第２の発明にあっては、設定された
領域内にあるいはその近傍にゴミ等があるときに、さに
には、測定位置が側壁近傍の不適切な位置に設定されて
いるときなどに、設定領域をキャピラリ画像上で移動さ
せることにより、そのような位置を回避して領域設定が
できるので、蛍光強度の大きいゴミやほこりなどからの
蛍光光が検出データに混在することがなくなり、所望の
測定値を得ることができる。その結果、蛍光強度の時間
変化特性を精度よく測定することができる蛍光強度測定
方法および装置を容易に実現できる。

【０００７】

【実施例】図１は、この発明の蛍光強度測定方法を適用
したＤＮＡ蛍光強度測定装置の一実施例のブロック図、
図２は、その測定処理のタイミングチャート、図３は、
その外観説明図、図４は、蛍光強度の測定波形の説明
図、図５は、観測画像の説明図、図６は、観測画像にお
ける領域設定と泳動時間対蛍光特性の説明図、そして図
７は、指定領域内の蛍光強度測定処理のフローチャー
ト、図８は、この発明の蛍光強度測定方法を適用したＤ
ＮＡ蛍光強度測定装置の他の実施例のブロック図、そし
て図９は、キャピラリにおける指定領域とゴミとの関係
の説明図である。図１において、１は、ＤＮＡ蛍光強度
測定装置であって、図３に示すように、マイクロチップ
２を挟んで、上部に観察画像撮像部３が設けられ、下部
に一点蛍光強度の蛍光強度測定部４が設けられている。
観察画像撮像部３により生成されたビデオ信号は、画像
処理・制御装置５とＶＴＲ６とに入力され、蛍光強度測
定部４により検出された信号は、画像処理・制御装置５
に入力されて所定の処理（後述）が行われる。

【０００８】観測画像撮像部３は、図１に示すように、
励起光照射系３１と受光系３２、ビデオ信号処理回路３
３、そしてシャッタ駆動回路３４とが内蔵されていて、
励起光照射系３１は、冷陰極放電灯(例えば、水銀放電
灯、メタルハライドランプなどの蛍光励起波長を有する
白色光源)の光源３１１からの光をシャッター３１２、
バンドパスフィルタ３１３を経て波長λ＝５１０〜５６
０ｎｍの光を通過させて、これをマイクロチップ２に対
して垂直な受光系の光軸Ｌ1に対して波長分離面が４５
°の角度で配置されたダイクロイックミラー３１４に照
射する。このダイクロイックミラー３１４により照射光
は、落射方向に反射されて、マイクロチップ２の表面に
対峙する形でこれの垂直上部に設けられた対物レンズ３
２１を経てマイクロチップ２の表面にキャピラリを含む
広い視野範囲で照射される。この波長λ＝５１０〜５６
０ｎｍの光の照射により、マイクロチップ２のキャピラ
リ（泳動路）上を泳動する蛍光強度測定途上のサンプル
は、励起されて蛍光を発生する。その蛍光光は、受光系
３２の対物レンズ３２１を経てダイクロイックミラー３
１４に至り、上部へと抜けて蛍光光の波長に対応するλ
＝５９０ｎｍの通過帯域を持つロングパスフィルタ３２
２を通り、ＣＣＤイメージセンサ３２３により受光され
る。これによる受光光は、電気信号に変換され、その検
出信号は、ＣＣＤイメージセンサ３２３からビデオ信号
処理回路３３のビデオ信号生成回路３２４に入力され
る。ここで検出信号は、ビデオ信号として生成され、ビ
デオ信号処理回路３３に内蔵されたＡ／Ｄ変換器（Ａ／
Ｄ）３２５によりＡ／Ｄ変換されてデジタル値として画
像処理・制御装置５の画像メモリ（フレームメモリ）５
１に転送される。なお、Ａ／Ｄ３２５は、コントローラ
３２６からの制御によりＡ／Ｄ変換処理をする。ところ
で、励起光は、ショートパスフィルタあるいはバンドパ
スフィルタを通して試料に照射されるので、ここでのシ
ョートパスフィルタはバンドパスフィルタが用いられて
もよい。また、試料からの蛍光は、ロングパスフィルタ
あるいはバンドパスフィルタを通して受光されるので、
ここでのロングパスフィルタはバンドパスフィルタが用
いられてもよい。これらのことは、後述する蛍光強度測
定部４においても同様である。

【０００９】ビデオ信号生成回路３２４は、ビデオ信号
処理回路３３のコントローラ３２６の制御下でＡ／Ｄ変
換前のビデオ信号をＶＴＲ６に転送して観測画像として
ＶＴＲ６に記録する。ビデオ信号生成回路３２４は、ビ
デオ信号生成回路３２４でビデオ信号を生成する際に偶
数番目のフレームコマ落とし制御をするコントローラ３
２６を有していて、奇数番目のフレームのビデオ信号の
み、ＶＴＲ６と画像メモリ５１に送出する。このとき、
奇数番目のフレームのビデオ信号を次の偶数番目のフレ
ームに差し込んで送出する。また、このとき同時にコマ
落としタイミング信号ＦＳを画像処理・制御装置５に送
出する。さらに、ビデオ信号生成回路３２４は、このコ
マ落としタイミング信号ＦＳをシャッタ駆動回路３４に
も送出する。シャッタ駆動回路３４は、この信号ＦＳを
受けて奇数番目のフレームの期間（タイミング信号ＦＳ
がＨＩＧＨレベル（以下“Ｈ”），図２（ａ）参照）の
間にシャッター３１２をＯＮにして開き、偶数番目のフ
レームの期間の間（タイミング信号ＦＳがＬＯＷレベル
（以下““Ｌ”））、シャッター３１２をＯＦＦにして
閉じる。なお、タイミング信号ＦＳは、垂直同期信号Ｖ
sync信号をフリップフロップ等を介して１／２分周する
ことで得ることができる。コントローラ３２６は、画像
処理・制御装置５からの制御信号ＳＲを受けたときに
は、これに応じてＶＴＲ６から記録されたビデオ信号を
読出してＡ／Ｄ変換器３２５によりＡ／Ｄ変換してそれ
を画像メモリ５１に順次転送して記録する処理を行う。
なお、画像処理・制御装置５からの制御信号は、前記の
制御信号ＳＲのほか、ＶＴＲ６に対する録画、再生、巻
き戻し、早送りなど、通常のＶＴＲ６の操作のための制
御信号が送出される。コントローラ３２６は、これら制
御信号を画像処理・制御装置５から受けて、これらに応
じてＶＴＲ６に対して指定された操作する。

【００１０】蛍光強度測定部４は、図１に示すように、
励起光照射系４１と受光系４２とが内蔵されていて、励
起光照射系４１は、青色ＬＥＤの光源４１１からの光を
バンドパスフィルタ４１２を経て波長λ＝５１０〜５６
０ｎｍの光を通過させて、これをマイクロチップ２に対
して垂直な受光系の光軸Ｌ2に対して波長分離面が４５
°の角度で配置されたダイクロイックミラー４１３に照
射する。ダイクロイックミラー４１３により照射光は、
ここで垂直上方に反射されて、マイクロチップ２の裏面
に対峙する形でこれの垂直上部に設けられた対物レンズ
４２１を経てマイクロチップ２の裏面から測定位置にピ
ンポイントで照射される。マイクロチップ２の測定位置
の泳動路にこの波長λ＝５１０〜５６０ｎｍの光がピン
ポイント照射されると、マイクロチップ２の泳動路を泳
動する測定対象のサンプルは、蛍光を発し、その蛍光光
は、受光系４２の対物レンズ４２１を経てダイクロイッ
クミラー４１３に至り、蛍光光の波長に対応するλ＝５
９０ｎｍを下方に通過させ、ロングパスフィルタ４２２
を通って、ＡＰＤ（アバランシー・ホト・ダイオード）
センサ４２３により受光される。これによる受光光の検
出信号は、ＡＰＤセンサ４２３からバッファアンプ４２
４に入力されてここで増幅され、Ａ／Ｄ変換回路（Ａ／
Ｄ）４２５に入力されてＡ／Ｄ変換回路４２５によりＡ
／Ｄ変換されてデジタル値として画像処理・制御装置５
に転送される。なお、Ａ／Ｄ４２５の制御信号は、図示
していないが、画像処理・制御装置５から変換制御のタ
イミング信号を受けてもよい。

【００１１】画像処理・制御装置５は、マイクロプロセ
ッサ（ＭＰＵ）５０と、画像メモリ５１、波形メモリ５
２、メモリ５３、ＣＲＴディスプレイ（ＣＲＴ）５４、
キーボード５５、マウス５５ａ、プリンタ（図示せ
ず）、そしてインタフェース５６等からなり、バス５７
を介してこれら回路がＭＰＵ５０と相互に接続されてい
る。ＡＰＤセンサ４２３で受光した蛍光強度を示す信号
は、インタフェース５６を介して受けて時間対蛍光強度
の波形データ（図４参照）として波形データメモリ５２
に記憶され、ＣＲＴディスプレイ５４あるいはプリンタ
に出力される。さらに、バス５７を介して接続されたＨ
ＤＤ（ハードディスク装置）等の記憶装置５８には測定
した画像データ（画像メモリ５１に記憶されたもの）が
ファイルとして記憶され、また、測定に必要な各種デー
タファイル、プログラムなどがこれに格納されている。

【００１２】ＭＰＵ５０は、バス５７を介してコマ落と
しタイミング信号ＦＳの立下がり信号（図２（ａ）参
照、タイミング信号ＦＳが“Ｈ”から“Ｌ”の時点）を
割込み信号として受けて、このタイミング信号ＦＳに同
期してインタフェース５６を介して青色ＬＥＤの光源４
１１を駆動する。そのための駆動信号ＤＳを光源４１１
に送出する（図２（ｃ）参照）。これにより、この信号
ＤＳを受けて奇数番目のフレームの期間の間光源４１１
がＯＦＦし、偶数番目のフレームの期間の間、光源４１
１がＯＮになって、サンプルを励起して蛍光を発生させ
る。発生した蛍光は、透明なマイクロチップ２から外部
へと放射される。その結果、図２に示すように、シャッ
ター３１２が閉じているとき、言い換えれば、マイクロ
チップ２に光源３１１からの光が照射されていないとき
に光源４１１からの光がマイクロチップ２（そのキャピ
ラリ部分）に照射されて、これによりサンプルの蛍光強
度を測定することができる。逆に、シャッター３１２が
開いているときには、言い換えれば、マイクロチップ２
に光源４１１からの光が照射されていないときには光源
３１１からの光がマイクロチップ２に照射されて、蛍光
による映像を観測画像として採取することができる。な
お、シャッター３１２は、インタフェース５６、シャッ
タ駆動回路３４を介してＭＰＵ５０により開閉制御され
る。

【００１３】ＡＰＤセンサ４２３により検出された蛍光
強度は、バッファアンプ４２３，Ａ／Ｄ変換回路４２４
を経てデジタル値としてインタフェース５６に入力され
る。そして、コマ落としタイミング信号ＦＳに同期し
て、ＭＰＵ５０は、インタフェース５６，バス５８を介
してこのデジタル値を受けて、これをＭＰＵ５０が波形
メモリ５２に順次測定データとして記憶する。その結
果、波形メモリ５２には、タイミング信号ＦＳをサンプ
ルタイミングとして時間対蛍光強度のデータがデジタル
値でそれぞれの測定時点（１／３０秒間隔）においてそ
れぞれ検出された蛍光強度が順次記憶されていき、結果
として、例えば、図４に示すような波形信号が記憶され
る。なお、横軸は時間（秒）であり、縦軸は蛍光強度で
ある。また、コマ落としタイミング信号ＦＳは、ビデオ
信号の各フレームに対応して発生するので、インターレ
ースをしない場合には、その周期は１／３０秒となる。
そこで、図２に示すようなタイミングで、観測画像デー
タと測定データ（蛍光強度の時間的な変化）とが採取さ
れることになる。一方、画像メモリ５１には、図５に示
すような蛍光による画像が記憶される。

【００１４】さて、メモリ５３には、観測画像表示処理
プログラム５３ａ、領域設定・データ抽出プログラム５
３ｂと、蛍光強度特性表示プログラム５３ｃ、作業領域
５３ｄ、パラメータ領域５３ｅ、そして各種の処理プロ
グラム（図示せず）が格納されている。観測画像表示処
理プログラム５３ａは、ＭＰＵ５０により実行されて、
ＭＰＵ５０は、ＶＴＲ６から記録されたビデオ信号を読
出す制御信号ＳＲを発生して画像メモリ５１に各フレー
ムの画像データを順次受けてそれを表示データに展開し
て観測画像としてＣＲＴ５４に表示する処理をする（図
５参照）。領域設定・データ抽出プログラム５３ｂは、
領域設定の機能キー入力に応じてＭＰＵ５０により実行
されて、ＭＰＵ５０は、シャッター３１２を開き、バン
ドパスフィルタ３１３と、ロングパスフィルタ３２２を
光路から外して（これらフィルタの移動機構は図示せ
ず）、マイクロチップ２の視野範囲の画像を画像メモリ
５１に採取し、それを画像メモリ５１から読出して、表
示データに展開し、ＣＲＴ５４の画面上に表示する。こ
のとき白色光がマイクロチップ２に照射されて、図６
（ａ）に示すようなキャピラリ画像が表示され、これに
加えて矩形の設定領域６０を測定画面上に重ね表示す
る。そして、重ね表示された設定領域６０の大きさをマ
ウス操作に応じて変更する制御をする。このとき、マウ
ス５５ａの操作で決定された矩形枠の大きさのデータを
パラメータ領域５３ｄに領域設定データとして記憶す
る。なお、このときには蛍光強度測定部４は動作してい
ない。また、領域設定・データ抽出プログラム５３ｂ
は、所定測定開始機能キーに応じてメインプログラムか
らコールされて、パラメータ領域５３ｄに記憶されてい
る、観測画像データにおいて図６（ａ）に示す領域６０
の範囲を示す領域設定データを読出してこれに従って、
タイミング信号ＦＳの立下がり信号（１／３０秒）に同
期して動作して１／３０秒ごとに画像メモリ５１に記憶
された観測画像データ（ビデオ信号処理回路３３から得
られるビデオ信号のＡ／Ｄ変換データからなる画像デー
タ）から指定された領域６０内のデータのみを抽出す
る。そして、その領域６０内のデータ値の平均値（蛍光
強度の平均値）を明るさの平均値として算出して作業領
域５３ｃに時間経過（１／３０秒ごと）に対応して順次
記憶していく。さらに、作業領域５３ｃに記憶された新
規の平均値を時間経過対応の測定データとしてＨＤＤ５
８に転送して特定データの所定の領域に順次記憶する。
そして、蛍光強度特性表示プログラム５３ｃをコールす
る。

【００１５】蛍光強度特性表示プログラム５３ｃは、Ｍ
ＰＵ５０により実行されて、所定の機能キー入力によ
り、波形データメモリ５５のデータを読出して表示デー
タを生成して、ＣＲＴ５４の画面上に表示する。これに
より図４に示すような波形信号を表示する。また、領域
設定・データ抽出プログラム５３ｂの実行後にコールさ
れて、このプログラムがＭＰＵ５０に実行されたときに
は、ＭＰＵ５０は、ＨＤＤ５８から前記の記憶された測
定データを所定の領域から読出して、リアルタイムで平
均値のデータを追加したグラフとして縦軸と横軸を加え
た形でＣＲＴ５４に表示する。その結果、図６（ｂ）に
示すような蛍光強度の時間に対する明るさのグラフがＣ
ＲＴ５４の画面上に表示される。なお、こでの領域設定
・データ抽出プログラム５３ｂは、キャピラリ上の複数
箇所に設定領域６０を設定することが可能である。ま
た、リアルタイムで時間対蛍光強度の特性表示が可能で
ある。この領域設定・データ抽出プログラム５３ｂのＭ
ＰＵ５０の処理を除いて、全体的なプログラム処理につ
いては、所定の機能キーに押下に応じて前記した各プロ
グラムがメインプログラムからコールされて順次実行さ
れていくだけでの単純な流れとなるので、その説明は割
愛する。

【００１６】図７は、ＭＰＵ５０による領域設定・デー
タ抽出プログラム５３ｂの実行による指定領域内の蛍光
強度測定処理のフローチャートである。以下、これにつ
いて具体的に説明する。所定の領域設定の機能キーの入
力により、まず、領域設定・データ抽出プログラム５３
ｂがＭＰＵ５０に実行されて、シャッター３１２を開
き、バンドパスフィルタ３１３と、ロングパスフィルタ
３２２を光路から外す（ステップ１０１）。これにより
光源３１１からの光がマイクロチップ２に照射される。
そして、マイクロチップ２の視野範囲の画像を画像メモ
リから読込み、画面上に表示する（ステップ１０２）。
次に、マウスの操作に応じて設定領域６０の位置と大き
さの設定待ちに入り（ステップ１０３、１０４）、設定
が終了すると、ステップ１０４でＹＥＳとなり、設定領
域６０の位置と面積（大きさ）のデータが読込まれ、パ
ラメータ領域５３ｅに記憶される（ステップ１０５）。
次に、次の領域設定あるか否かの判定をして（ステップ
１０６）。視野範囲で別の箇所に領域を設定する場合
（設定領域６０を２個以上する場合）には、ここでＹＥ
Ｓとなり、ステップ１０３へと戻る。そして、ステップ
１０５でパラメータ領域５３ｅにさらに別に設定領域の
位置と面積とが記憶される。

【００１７】ステップ１０６の判定でＮＯとなると、所
定の測定開始キー入力待ちに入り（ステップ１０７）、
測定開始キーが押下された時点で、シャッター３１２を
閉じて、バンドパスフィルタ３１３と、ロングパスフィ
ルタ３２２を光路に挿入する（ステップ１０８）。次
に、実際の測定に入り、シャッター３１２をタイミング
信号ＦＳに応じて１／３０秒おきに開閉制御して、タイ
ミング信号ＦＳの立下がり信号の入力待ちに入り（ステ
ップ１０９）、タイミング信号ＦＳの立下がり信号を受
けた時点で画像メモリ５１から設定領域６０のデータを
抽出する（ステップ１１０）。そして、抽出したデータ
値の平均値を算出して（ステップ１１１）、その平均値
を作業領域５３ｃに記憶する（ステップ１１２）。作業
領域５３ｃに記憶された新規の平均値データは、時間経
過対応の測定データ（特性データ）としてＨＤＤ５８の
所定の領域に転送されて追加記憶される（ステップ１１
３）。ここで、蛍光強度特性表示プログラム５３ｃをコ
ールして、ＨＤＤ５８の所定の領域に記憶された測定デ
ータを読出して図６（ｂ）に示す波形をＣＲＴ５４上の
画面上に表示する（ステップ１１４）。そして、次に所
定の終了キーの入力の有無により、処理終了かの判定を
して（ステップ１１５）、ここでＮＯのときにはステッ
プ１０９へと戻り、次の平均値を算出して作業領域５３
ｃに記憶する。そして、ステップ１１４においては、図
６（ｂ）のグラフに新しく測定したデータが加えられ、
そのグラフが画面上に表示されていく。ここで、測定と
してある時間が経過して所定量の平均値が測定データと
してグラフ表示された時点で、ステップ１１５におい
て、測定終了判定がなされ、ステップ１１５の判定でＹ
ＥＳとなると、ここでの処理が終了する。

【００１８】このような処理によりリアルタイムで順次
図６（ｂ）に示す波形がＣＲＴ５４上の画面上に表示さ
れていく。また、前記のステップ１０６では、次の領域
を設定するようにしているので、複数の領域を設定した
ときには、それぞれの領域に対応して画像メモリ５１に
記憶された観測画像からデータを抽出してそれぞれに平
均値を算出することができる。このときには、それぞれ
別の測定データとしてＨＤＤ５８の各領域にそれぞれ記
憶するようにし、それぞれ別の特性グラフとして順次表
示する。このことで、効率よく、キャピラリの泳動路の
複数の箇所から蛍光特性を採取でき、かつ、比較判定で
きる。さらに、設定領域６０の大きさが自由に選択でき
ることにより、ゴミ，ほこりなどから発する蛍光のバッ
クグランドノイズを排除することができる。また、ＤＮ
Ａ等のサンプルの泳動速度に合わせた大きさを設定領域
６０として選択することが可能になる。さらに、この設
定領域６０は、その位置が選択できるので、測定位置を
適正な位置に設定できる。これによりキャピラリの側壁
に発生する蛍光ノイズを排除して精度の高い測定ができ
る。実施例では、タイミング信号ＦＳに応じてピンポイ
ント蛍光強度の測定と観察画像による設定領域における
蛍光強度の平均値の測定とを交互に行っているが、この
ような切換えを行うと、測定タイミングが一定の周期と
なるので、蛍光強度の測定が連続的にできない問題があ
る。そこで、蛍光強度の平均値を算出する場合に、設定
領域の大きさによっては１個分に対応した検出ができな
くなることがある。このような場合においては、特に、
泳動速度が速いときには、進行方向に長い設定領域を設
定するとよい。逆に、狭い間隔で連続して流れて来るサ
ンプルに対しては、進行方向に短い設定領域として、必
要に応じてキャピラリの横断方向に長く領域を設定する
とよい。

【００１９】さて、一般的にゴミ等は、強い蛍光および
反射光を発生する。そのため設定領域６０として指定さ
れた領域あるいはその近傍にゴミ等がある場合には、的
確な蛍光強度が測定できない。図８は、このような問題
に対処する実施例である。図８の実施例では、オペレー
タが指定した設定領域６０あるいはこれの近傍にゴミ等
がある場合に設定領域６０を移動させる処理を行う。図
８の画像処理・制御装置５のメモリ５３にはゴミ等の検
出・指定領域移動プログラム５３ｆが設けられている。
画像処理・制御装置５の内部は、図１の実施例ほど詳細
に説明していないが、前記のゴミ等の検出・指定領域移
動プログラム５３ｆとパラメータ領域５３ｅに記憶する
データを除いては、図１の構成と同一であるので、同一
の符号で示してある。その他の構成要素も図１に示す構
成要素と同一のものは同一の符号で示してある。それら
の説明はここでは割愛する。図９は、ゴミと設定領域６
０との関係を示すものである。図９において、点線枠で
示す７は、マイクロチップ２のキャピラリ２ａ上に設定
されたイメージセンサ３２３の視野であり、８は、キャ
ピラリ２ａ上に付着したゴミである。指定された設定領
域６０は、図示するように、ゴミ８がある場所か、その
近傍に位置している。この状態をゴミ等の検出・指定領
域移動プログラム５３ｆの処理により検出して、設定領
域６０（指定領域）を視野７内のキャピラリ２ａ上にお
いて、一定距離Ｄだけ別の場所に移動させて、例えば、
点線で示す位置に設定領域６０を設定して、この領域の
データを撮像した画像データから抽出して蛍光強度を検
出する。

【００２０】ゴミ等の検出・指定領域移動プログラム５
３ｆは、図７に示す蛍光強度測定処理のフローチャート
において、ステップ１０６の、領域設定あるか否かの判
定でＮＯとなったときに、ＭＰＵ５０によりコールされ
てＭＰＵ５０により実行される。そして、点線で示すよ
うに、この処理の終了後にステップ１０７の所定の測定
開始キー入力待ちに入ることはせずに、ステップ１０８
の処理に移る。これにより画像データを採取してこのデ
ータから設定領域６０において視野に試料が入っていな
い状態で蛍光強度を測定するモードに入る。すなわち、
ＭＰＵ５０は、このプログラム５３ｆを実行して、図７
のステップ１０８からステップ１０９へと入り、ステッ
プ１１１の処理に至り、点線で示すステップ１１１ａの
処理へと移る。ここで、ステップ１１１で算出された設
定領域６０における平均値が所定値Ｋ以上か否かの判定
をする。この判定の結果、平均値が所定値Ｋ未満である
ときには、点線で示すステップ１０７の測定キーの入力
待ち処理に入り、本来の測定モードとなる。ここで、所
定値Ｋは、試料が発する蛍光光の強度の平均値の最大値
を越える値であり、ゴミ等からの受光と区分けできる値
である。ここで検出される設定領域６０内での蛍光光の
強度は、平均値に限定されるものではなく、ピーク値あ
るいは合計値等であってもよい。この場合には、ステッ
プ１１１で平均値を算出するのではなく、ピーク値ある
いは合計値を算出することになる。また、ステップ１１
１ａの判定処理のときには、試料はキャピラリ上（ある
いは設定領域６０）を流れていないので、ゴミ等からの
受光強度が測定できる。ステップ１１１ａの判定で平均
値が所定値Ｋ以上であるときには、設定領域６０を所定
の距離Ｄだけキャピラリ２ａ上において上流側あるいは
下流側に移動した後に、図７のステップ１０９からステ
ップ１１１の処理を再び行う。そして、設定領域６０に
おける平均値が所定値Ｋ以上か否かの判定をする（ステ
ップ１１１ａ）。この判定においても前記の判定で平均
値が所定値Ｋ以上であるときには、さらに所定の距離Ｄ
だけキャピラリ２ａ上において、例えば、流れを横断す
る方向へ移動した後に、同じ処理する。このようにし
て、平均値が所定値Ｋ未満になる位置を探し出して、設
定領域６０を指定された位置の近傍の位置に再設定す
る。なお、前記距離Ｄの値と前記所定値Ｋの値は、キー
ボード５５から入力されてパラメータ領域５３ｅにあら
かじめ記憶されているものである。

【００２１】さて、図８では、ロングパスフィルタ３２
２とＣＣＤイメージセンサ３２３との間にイメージイン
テンシファイア（ＩＩＦ，これは映像増倍管，マイクロ
チャネルプレート型映像増倍装置など）３２４が設けら
れている。このイメージインテンシファイア３２４の増
倍率をコントローラ３２６からの制御信号Ｓiで制御す
ることで、撮像できる画像のダイナミックレンジを拡大
することができる。ところで、３μｍ〜１０μｍ角程度
のピンポイント測定点を持つＡＰＤセンサ４２３を備え
る蛍光強度測定部４は、例えば、１．２ｍｍ×１．０ｍ
ｍ程度の所定の視野を持つＣＣＤイメージセンサ３２３
等のいわゆるＣＣＤカメラよりも撮像対象の明暗に対す
る検出ダイナミックレンジが広い。そこで、この蛍光強
度測定部４の広いダイナミックレンジの蛍光強度検出を
利用して観察画像撮像部３が撮像できる画像の明暗の範
囲を広げる撮像感度制御をイメージインテンシファイア
３２４の制御で行う。そのために、画像処理・制御装置
５は、１／３０秒ごとに蛍光強度測定部４により検出さ
れ、波形メモリ５２に記憶された蛍光強度に応じてコン
トローラ３２６を制御して制御信号Ｓiを発生させる。
この制御信号Ｓiの値に応じてイメージインテンシファ
イア３２４は、蛍光強度に応じて適正な映像を撮影でき
る増幅率に設定される。なお、前記の撮像感度制御の制
御は、ＣＣＤイメージセンサ３２３において行ってもよ
い。

【００２２】先に説明したように、図８の実施例におい
ては、ステップ１１１ａにおいて比較基準とされる所定
値Ｋは、試料が発する蛍光光の強度の平均値の最大値を
越える値であり、ゴミ等からの受光と区分けできる値で
ある。ここで、試料をＤＮＡとした場合に、ほとんどの
物質は、蛍光を発し、ＤＮＡより明るい光が検出される
が、中にはＤＮＡより暗い異物もある。このような場合
には、所定値Ｋを前記した値より小さくする必要があ
る。ところで、所定値と比較対象とされる平均値の測定
は、前記したように、設定領域６０において視野に試料
が入っていない状態で行われる。言い換えれば、これ
は、試料、例えば、ＤＮＡがキャピラリの視野に流れて
くる前に行われる。この状態で異物がないときには、泳
動液や外乱ノイズなどにより発生するそのときのバック
グランドノイズによる蛍光強度が検出される。そこで、
ＤＮＡより暗い異物に対処するためには、前記の所定値
Ｋは、そのときのバックグランドノイズによる蛍光強度
とＤＮＡより暗い異物の蛍光強度との間の値に設定する
とよい。すなわち、このような所定値Ｋの設定は、測定
される試料よりも暗い蛍光を発生し、測定に影響を与え
る異物の蛍光強度を別途測定して、それをメモリに記憶
しておくか、入力する。そして、蛍光強度の測定に当た
ってキャピラリの視野におけるバックグランドノイズに
よる蛍光強度の平均値を測定する。このノイズの平均値
と、入力されたあるいはメモリ記憶してある前記の異物
の蛍光強度との間の値を前記所定値Ｋとして算出してメ
モリに記憶し、ステップ１１１ａの比較基準とするもの
である。なお、試料よりも暗い蛍光を発生し、測定に影
響を与える異物の蛍光強度がバックグランドノイズより
も比較的大きいときには、別途測定することは不要であ
り、単にバックグランドノイズによる蛍光強度の平均値
あるいはその最大値よりも少し多きな値を所定値Ｋ、言
い換えれば、バックグランドノイズを排除できるような
値を設定するだけであってもよい。

【００２３】以上説明してきたが、実施例においては、
観測画像は、蛍光光をロングパスフィルタ３２２を通し
て観測しているが、ロングパスフィルタ３２２を削除し
て直接蛍光光をＣＣＤにより受光して蛍光光の観測画像
を採取してもよい。また、領域設定・データ抽出プログ
ラム５３ｂをＭＰＵ５０が実行したときには、シャッタ
ー３１２を開き、バンドパスフィルタ３１３と、ロング
パスフィルタ３２２を光路から外すことができ、このと
きには、マイクロチップ２の視野範囲の画像を白色光を
照射した形で画像メモリ５１に採取することができる。
これによりキャピラリ内にゲルが正常に入っているかど
うか、キャピラリ内にあわが入っていないかどうかなど
の観察映像を蛍光強度測定系の励起光に影響されること
なく、判定することができる。さらに、一点蛍光測定系
の位置が適正な位置にあるか否かの判定も可能である。
このような観測をする場合には白色照射が非常に有効に
なるが、白色照射ではなく、励起光を照射して領域設定
等をすることができることはもちろんである。また、実
施例では、ＣＣＤ３２３にシャッタがある場合に言及し
ていないが、ＣＣＤ３２３にシャッタがある場合には、
このシャッタをタイミング信号ＦＳに同期させて、シャ
ッタ３１２の開閉動作とは逆になるように開閉動作をさ
せるとよい。さらに、蛍光映像をＣＣＤイメージセンサ
３２３（撮像するカメラ）は、ＣＣＤのイメージセンサ
に限定されるものではなく、ＭＯＳ型ＢＢＤ等のイメー
ジセンサ等を用いることができることはもちろんであ
る。またさらに、実施例では、領域設定６０の選択設定
の後に蛍光強度測定に入り、設定領域の蛍光強度の平均
値を得て、時間−蛍光強度特性を画面上に表示している
が、領域設定６０の設定と蛍光強度の測定とは、切り離
して、それぞれ独立に行ってもよいことはもちろんであ
る。なお、ここでの平均値には、設定領域の合計値とし
て算出されたものも含むものである。設定領域の平均値
と合計値は、算出して得た結果を割り算して算出する
か、否かの相違でしかないからである。

【００２４】実施例では、波形メモリ、画像メモリをプ
ログラムを格納したメモリと独立に設けているが、波形
メモリ、画像メモリをプログラムを格納したメモリに領
域として確保し、これらメモリを一体的に形成してもよ
い。実施例において、観測画像の採取と蛍光強度の測定
を切換える周期は、ビデオ信号の各フレームに対応して
発生するようにしているが、インターレースをする場合
には、１フィールドが１／６０秒となるので、採取画像
がインターレースとなように、奇数番目のフィールドと
次の偶数番目のフィールドとの連続する２フィールドを
１／３０秒で採取し、次の奇数番目のフィールドと次の
偶数番目のフィールドとの連続する２フィールドをコマ
落としするようにすればよい。採取画像や一点蛍光測定
の期間は、１／３０秒のうちのある一定期間で行われて
もよいことはもちろんである。また、１フレームの画像
をより高速に採取する場合には、切換える周期は、１／
３０秒に限定されないことはもちろんである。さらに、
実施例でのコマ落としは、１フレームおきにしている
が、泳動速度が遅いサンプルの場合には、コマ落としフ
レームを数フレームとして観測画像を数フレームおきに
採取してもよい。逆に、泳動速度が速いサンプルの場合
には、コマ落としフレームを数フレームに１回として観
測画像のフレームを増加させてもよい。さらに、ＶＴＲ
６は、ＨＤＤを内蔵するデジタルの録画再生装置であっ
てもよく、ビデオテープに記憶するものに限定されな
い。また、実施例では、設定領域６０を矩形として説明
しているが、これは、矩形に限定されるものではなく、
例えば、キャピラリの泳動路が湾曲している場合などに
はそれに併せて湾曲させてもよい。

【００２５】

【発明の効果】以上の説明のとおり、この発明にあって
は、キャピラリ内を泳動するサンプルに励起光を照射し
てサンプルが発する蛍光光の画像を採取して、キャピラ
リ画像の所定の位置に所定の大きさで設定された領域内
での蛍光光の平均値を算出して時間−蛍光強度の特性を
測定するようにしている。このように、ある限定された
領域における平均値を算出して蛍光強度を得るようにし
ているので、ゴミやほこりなどからの蛍光光が検出デー
タに混在していてもほとんど影響されないで所望の測定
値を得ることができる。その結果、蛍光強度の時間変化
特性を精度よく測定することができる蛍光強度測定方法
および装置を容易に実現できる。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、この発明の蛍光強度測定方法を適用し
たＤＮＡ蛍光強度測定装置の一実施例のブロック図であ
る。

【図２】図２は、その処理のタイミングチャートであ
る。

【図３】図３は、その外観説明図である。

【図４】図４は、蛍光強度の測定波形の説明図である。

【図５】図５は、観測画像の説明図である。

【図６】図６（ａ）は、観測画像における領域設定の説
明図、図６（ｂ）は、泳動時間対蛍光特性の説明図であ
る。

【図７】図７は、指定領域内の蛍光強度測定処理のフロ
ーチャートである。

【図８】図８は、この発明の蛍光強度測定方法を適用し
たＤＮＡ蛍光強度測定装置の他の実施例のブロック図で
ある。

【図９】図９は、キャピラリにおける指定領域とゴミと
の関係の説明図である。

【符号の説明】

１…ＤＮＡ蛍光強度測定装置、２…マイクロチップ、３
…観察画像撮像部、４…一点蛍光強度測定部、５…画像
処理・制御装置、６…ＶＴＲ、３１，４１…励起光照射
系、３２，４２…受光系、３３…ビデオ信号処理回路、
３４…シャッタ駆動回路、５０…マイクロプロセッサ
（ＭＰＵ）、５１…画像メモリ（フレームメモリ）、５
２…波形メモリ、５３…メモリ、５４…ＣＲＴディスプ
レイ（ＣＲＴ）、５５…キーボード、５６…インタフェ
ース、５７…バス、５８…外部記憶装置、５３ａ…観測
画像表示処理プログラム、５３ｂ…領域設定・データ抽
出プログラム、５３ｃ…蛍光強度特性表示プログラム、
５３ｄ…作業領域、５３ｅ…パラメータ領域、５３ｆ…
ゴミ等の検出・指定領域移動プログラム５３ｆ、３１２
…シャッター、３１３，４１２…ショートパスフィル
タ、３１４，４１３…ダイクロイックミラー、３２１，
４２１…対物レンズ、３２２，４２２…ロングパスフィ
ルタ、３２３…ＣＣＤイメージセンサ、３２４…ビデオ
信号生成回路、３２５…Ａ／Ｄ変換器、３２６…制御回
路、４１１…青色ＬＥＤの光源、４２３…ＡＰＤセン
サ、４２４…バッファアンプ、４２５…Ａ／Ｄ変換回路
（Ａ／Ｄ）。

フロントページの続き (72)発明者洪鍾▲いく▼ アメリカ合衆国、カリフォルニア州91106 −1824、パサディナ、ノースミシガンアヴェニュー165−207 Ｆターム(参考） 2G043 AA01 BA16 CA03 DA05 EA01 EA19 FA01 FA03 GA08 GB28 HA01 HA02 HA11 HA15 JA02 KA02 KA05 LA03 NA01 NA06

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】マイクロチップのキャピラリ画像を採取し
てこの画像から蛍光強度を測定する蛍光強度測定方法に
おいて、画像撮像部により撮像された前記キャピラリ画像の所定
の位置に所定の大きさの領域を設定して、前記キャピラ
リ内を泳動する試料に励起光を照射し、前記試料が発す
る蛍光光の前記画像を採取して、採取された前記画像に
基づいて前記領域内の蛍光光の強度の平均値を算出して
この平均値による時間−蛍光強度の特性測定をすること
を特徴とする蛍光強度測定方法。
【請求項２】前記前記所定の大きさの領域は、その位置
と大きさが任意に選択できるものであり、さらに、前記
蛍光光を受光してその受光信号に基づいて前記試料の蛍
光強度を検出する蛍光強度測定部を有し、前記画像撮像
部の撮像光学系と前記蛍光強度測定部の前記蛍光強度の
検出光学系とが前記マイクロチップを挟んで対向して配
置され、所定の周期で前記撮像光学系の蛍光励起光と前
記検出光学系の蛍光励起光とを交互に前記試料に照射
し、前記画像の採取と前記蛍光強度の測定とがそれぞれ
の前記照射光の照射タイミングに合わせて行われる請求
項１記載の蛍光強度測定方法。
【請求項３】前記画像撮像部は、前記蛍光強度測定部の
測定範囲に対してより広い視野を有するものであり、さ
らに、ビデオ信号録画再生装置を有し、前記所定の周期
は、１／３０秒であり、前記画像撮像部は、１／３０秒
おきに１フレームの画像を採取して前記ビデオ信号録画
再生装置に記憶する請求項２記載の蛍光強度測定方法。
【請求項４】前記所定の大きさの領域は、前記キャピラ
リ上の複数の箇所に設定され、同時に複数の箇所に測定
データを得る請求項１記載の蛍光強度測定方法。
【請求項５】前記領域内の蛍光光の強度あるいはその平
均値が前記領域において前記試料が発する蛍光光の強度
の最大値あるいはその平均値の最大値を越えた所定値以
上のときに前記領域を前記キャピラリ画像上で移動させ
る請求項１記載の蛍光強度測定方法。
【請求項６】前記領域内の蛍光光の強度あるいはその平
均値が前記領域におけるバックグランドノイズを排除で
きる値として設定された所定値か、これ以上のときに前
記領域を前記キャピラリ画像上で移動させる請求項１記
載の蛍光強度測定方法。
【請求項７】マイクロチップのキャピラリ画像を採取し
てこの画像から蛍光強度を測定する蛍光強度測定装置に
おいて、画像撮像部により撮像された前記キャピラリ画像の所定
の位置に所定の大きさの領域を設定する設定手段と、前
記キャピラリ内を泳動する試料に励起光を照射する照射
光学系と、前記試料が発する蛍光光の前記画像を採取す
る画像撮像部と、前記領域内の蛍光光の強度の平均値を
算出する平均値算出手段とを備え、前記強度による時間
−蛍光強度の特性測定をすることを特徴とすることを特
徴とする蛍光強度測定装置。
【請求項８】前記設定手段による前記所定の大きさの領
域は、その位置と大きさが任意に設定できるものであ
り、さらに、前記蛍光光を受光してその受光信号に基づ
いて前記試料の蛍光強度を検出する蛍光強度測定部と、
所定の周期で前記撮像光学系の励起光と前記検出光学系
の励起光とを交互に前記試料に照射する制御手段とを有
し、前記画像撮像部の撮像光学系と前記蛍光強度測定部
の前記蛍光強度の検出光学系とが前記マイクロチップを
挟んで対向して配置されていて、前記画像の採取と前記
蛍光強度の測定とがそれぞれの前記励起光の照射タイミ
ングに合わせて行われる請求項７記載の蛍光強度測定装
置。
【請求項９】前記画像撮像部は、前記蛍光強度測定部の
測定範囲に対してより広い視野を有するものであり、さ
らに、ビデオ信号録画再生装置を有し、前記所定の周期
は、１／３０秒であり、前記画像撮像部は、１／３０秒
おきに１フレームの画像を採取して前記ビデオ信号録画
再生装置に記憶する請求項８記載の蛍光強度測定装置。
【請求項１０】前記所定の大きさの領域は、前記キャピ
ラリ上の複数の箇所に設定され、同時に複数の箇所に測
定データを得る請求項７記載の蛍光強度測定装置。
【請求項１１】前記領域内の蛍光光の強度あるいはその
平均値が前記領域において前記試料が発する蛍光光の強
度の最大値あるいはその平均値の最大値を越えた所定値
以上のときに前記領域を前記キャピラリ画像上で移動さ
せる請求項７記載の蛍光強度測定装置。
【請求項１２】前記領域内の蛍光光の強度あるいはその
平均値が前記領域におけるバックグランドノイズを排除
できる値として設定された所定値か、これ以上のときに
前記領域を前記キャピラリ画像上で移動させる請求項７
記載の蛍光強度測定装置。