WO2006006720A1 - γδＴ細胞の培養方法、γδＴ細胞及び治療・予防剤 - Google Patents

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culturing
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Masashi Takahara
Masato Mutou
Nami Satou
Kazuhiro Kakimi
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Definitions

  • the present invention relates to a method for culturing ⁇ 5 ⁇ cells. Further, the present invention relates to a cultivated cell (5 ⁇ cells, a therapeutic-preventive agent containing a cell cultured by the culture method.
  • cancer malignant neoplasm
  • T cells there is a therapy that activates T cells called L ⁇ (1 ymp h o kine e-a c t i v a t e d k i l l e r; lymphokine-activated killer) therapy.
  • L ⁇ (1 ymp h o kine e-a c t i v a t e d k i l l e r; lymphokine-activated killer
  • T cells There are two types of T cells: ⁇ / 3-type TCR (T cellreceptor)] 3 T cells and ⁇ -type TCR-expressing ⁇ cells. This is a therapy that activates ⁇ cells.
  • ⁇ 3 ⁇ cells are those that are mainly responsible for acquired immunity.
  • ⁇ cells are cells responsible for innate immunity. Recently, it has been found that it has cytotoxic activity (non-specific activity) against cancer cells, and research on immunotherapy using the strong antitumor activity of ⁇ cells has been conducted.
  • ⁇ ⁇ ⁇ cells recognize and activate non-peptidic antigens, and as a non-peptidic antigen, for example, alkylamines can be stimulated with bisphosphonates to activate and / or proliferate.
  • a non-peptidic antigen for example, alkylamines can be stimulated with bisphosphonates to activate and / or proliferate.
  • ⁇ cells are usually present in only 1 to 5% of peripheral blood, even if a small amount of blood is collected to activate and / or proliferate ⁇ cells, the purity and number of cells sufficient for treatment There is a problem that cannot be secured. Also treatment If the amount of blood collected from a patient is increased in order to ensure sufficient purity and cell count, there is also a problem that a great burden is placed on the patient.
  • CD 56-positive cells 5T cells
  • CD 56-negative cells ⁇ T cells positive ⁇ T cells are known to have higher cytotoxic activity than CD 56 negative ⁇ ⁇ cells (Fu j imiya, Y. eta 1. Clinical Cancer Re search Vo l. 3, 6 33— 643, Ap ril 1997), and is expected to be applied to the treatment of cancer and infectious diseases.
  • JP-A-2001-314183 describes therapeutic agents and examples using a cell group containing 50% or more of CD56-positive cells.
  • the CD56-positive cells used here are A ⁇ cells and natural killer cells (hereinafter referred to as ⁇ cells) are mixed, and only about 10% of ⁇ ⁇ 5 ⁇ cells are included. Disclosure of the invention
  • the present invention has been made in view of the above circumstances, and is capable of selectively activating and cultivating or proliferating cells from peripheral blood mononuclear cells, and capable of culturing them in high purity and in large quantities. And a therapeutic / prophylactic agent containing the ⁇ ⁇ cells obtained by the method in immunotherapy for cancer patients, infectious diseases, etc. With the goal.
  • the concentration of a bisphosphonate bone metabolizer (hereinafter abbreviated as bisphosphonate) in peripheral blood mononuclear cells is 0.05 to 100 / ⁇ and interleukin 2 (hereinafter IL— 2) (abbreviated as 2) is added so that the concentration is 50 to 20000 U / mL and cultured.
  • bisphosphonate a bisphosphonate bone metabolizer
  • IL— 2 interleukin 2
  • bisphosphonate is added to peripheral blood mononuclear cells in the culture solution so as to have a concentration of 0.05 to 100 M.
  • ⁇ ⁇ cells selectively activated and expanded or proliferated and further stimulated by adding IL-12 to 50-2000 U / mL. It can be obtained in high purity and in large quantities. Also got The T 6 ⁇ cells contain at least 40% of cells expressing CD 56.
  • the bisphosphonate is added at the start of culture.
  • ⁇ cells obtained by the present invention have a non-specific cytotoxic function, a cancer antigen-specific cytotoxic function, or both cytotoxic functions. Therefore, it can be used as a therapeutic / preventive agent for cancer diseases and infectious diseases.
  • the ⁇ 5 ⁇ cell obtained by the present invention contains a large amount of CD 56-positive ⁇ ⁇ cells having a high cytotoxic function. Therefore, by selecting for CD56-positive cells, it is possible to obtain a higher therapeutic / prophylactic effect when the same number of cells are administered.
  • the therapeutic / prophylactic agent prepared by the present invention has a non-specific cytotoxic function, a cancer antigen-specific cytotoxic function, or both cytotoxic functions.
  • High content of r ⁇ and high cytotoxic function among r ⁇ ⁇ cells Because it contains a lot of 5 T cells, it can identify cancer cells or infected cells without attacking normal cells. It is effective in the treatment of various cancer types and infectious diseases, especially when ⁇ ⁇ cells are derived from autologous lymphocytes and are administered to the patient's own immunity. It is possible to perform its function without being excluded by the system.
  • the concentration of the bisphosphonate bone metabolizing agent in the peripheral blood mononuclear cells is from 0.05 to ⁇ 10 1/1 and the concentration of IL-1 is from 50 to It is characterized by selectively activating and / or proliferating ⁇ cells by adding and culturing at 200 U / mL to obtain a cell population containing ⁇ 5 ⁇ cells with high purity. To do.
  • Bisphosphonates may have any action to suppress bone resorption and are generally used as a therapeutic agent for osteoporosis.
  • Examples thereof include pamidronic acid, a salt thereof and / or a hydrate thereof (eg, pamidronic acid Disodium pentahydrate (A redia, Novartis Pharma), alendronate, its salts and / or their hydrates (eg, sodium alendronate trihydrate (O ne 1 ast, ⁇ ⁇ ) Pharmaceutical)), zoledronic acid, its salts and / or their hydrates (for example, zole Sodium Dronate Hydrate (Zome ta, Novartis Pharma), Risedronic acid, its salts and Z or their hydrates (eg, risedronate sodium 'hydrate), ibandronic acid, its salts and Z or a hydrate thereof (eg, ibandronate disodium), incadronic acid, a salt thereof and Z or a hydrate thereof (eg, disodium incadronate),
  • peripheral blood by collecting blood.
  • the appropriate amount is 15-25 mL. If this amount can be obtained, it can be suitably cultured. However, the range is not limited to this range as long as the peripheral blood volume is sufficient at the start of culture, and the upper limit may be further increased if the burden on the donor to collect blood is small.
  • peripheral blood mononuclear cells by, for example, density gradient centrifugation. About 10 to 7 peripheral blood mononuclear cells can be obtained from 15 to 25 mL of peripheral blood.
  • a suspension of peripheral blood mononuclear cells is referred to as a cell suspension.
  • the culture medium shown here it can be used for culturing cells such as RPMI-1640 medium (Invitrogen), Dulbecco's modified Eagle medium (Invitrogen, hereinafter referred to as DMEM), Iskov medium (Invitrogen, hereinafter referred to as IMEM), etc. You may use the commercially available culture solution used.
  • serum may be added at 0.1 to 20%.
  • serum for example, fetal calf serum (Feta1CalfSerum, hereinafter referred to as FCS), AB serum, autologous plasma, or the like may be used.
  • IL-2 to the above culture solution at a concentration of 50 to 2000 UZmL, more preferably. Preferably, add 400 to 100 OUZmL.
  • 6) with IL- 2 34 to 38 ° C were added thereto, and more preferably at 37, 2-10%, and more preferably are cultured at 5% C_ ⁇ 2 presence.
  • a culture solution is appropriately added according to the number of cells to be cultured.
  • the IL-12 concentration is appropriately added so as to be 50 to 200 OU / mL, more preferably 400 to LOO OUZmL.
  • the culture period is 7 days or longer, a cell group containing ⁇ cells with high purity can be obtained. However, in order to further increase the number of r ⁇ cells, it is preferable to culture for about 14 days.
  • the ⁇ ⁇ cells obtained in this way contain a lot of CD 56 positive ⁇ ⁇ ⁇ cells with high cytotoxic function.
  • CD 56 positive ⁇ ⁇ ⁇ cells can also be selected and used. Is possible. Examples of methods for sorting CD 56-positive ⁇ cells include magnetic cell separation (Magnetic Cell Sorting, hereinafter referred to as MAC S) and flow cytometry. .
  • Magnetic Cell Sorting Magnetic Cell Sorting
  • ⁇ T cells can be efficiently proliferated.
  • the cells obtained by the culture method of the present invention are collected by centrifugation or the like.
  • the washing solution is preferably an isotonic solution having an osmotic pressure equal to that of cells, and more preferably a liquid that can be used as a pharmaceutical product.
  • physiological saline PBS ( ⁇ hosphatebuferfelineseline; phosphate buffered saline), or the like.
  • the r 3 ⁇ cells obtained after washing are collected using a centrifugal method, etc., and suspended in a liquid that can be used as a medicine, such as physiological saline, to prepare the therapeutic / preventive agent of the present invention. can do.
  • a liquid that can be used as a medicine such as physiological saline
  • the amount of the suspension liquid used is appropriately adjusted according to the number of cells to be administered and the administration method.
  • the number of r (5 ⁇ cells used in the therapeutic / prophylactic agent of the present invention is appropriately selected according to the administration method, the type of disease, the symptom of the patient, etc., but is usually 10 8 to 10 12 Z. More preferably, it is 10 9 or more.
  • cytokines such as 1 to 2 and 1 to 1 2
  • the prevention and treatment agent of the present invention it is also possible to combine cytokines such as 1 to 2 and 1 to 1 2 with the prevention and treatment agent of the present invention.
  • interferon interferon
  • prophylactic / therapeutic agent when used as a therapeutic / preventive agent for viral infections, it is possible to combine the interferon (IFN-r) and the like with the prophylactic / therapeutic agent of the present invention.
  • a method of administration for example, it may be injected intravenously, intradermally, subcutaneously, etc., may be directly injected into the affected area, or may be administered systemically as an instillation. Furthermore, it may be injected from an artery near the lesion.
  • the therapeutic / prophylactic agent of the present invention has a high content of T ⁇ 5 T cells having non-specific cytotoxic function, cancer antigen-specific cytotoxic function or both cytotoxic functions, In particular, it contains many CD 56 positive r ⁇ ⁇ cells with high cytotoxic function, so it has the ability to specifically attack cancer cells or infected cells without attacking normal cells. It is an effective treatment and prevention agent for the treatment of cancer types and infectious diseases.
  • the ⁇ 5 cells are derived from autologous lymphocytes, they can function without being excluded by the patient's own immune system when administered to the patient.
  • Example 1
  • AIM-V a culture solution AIM-V (hereinafter referred to as AIM-V (10 FCS)) to which FCS was added at 10%.
  • I L-2 was added at a concentration of 400,
  • the culture solution AIMV was added and cultured for 14 days.
  • the percentage of cells expressing ⁇ 5 T cells in the cell group obtained after 14 days of culture was determined as the fluorescence—Ac tivated C It was measured by ell Sorter (hereinafter referred to as FAC S, Epics XL-MCL ADC, Beckman Cole Yuichi). The values obtained by measurement are shown in Tables 1 to 3 below.
  • the concentration of bisphosphonate bone metabolism-improving drug should be 0 ⁇ 1 to 30 ⁇ , and IL-1 should be added to 400 to 200 OUZmL. It was confirmed that it was preferable. Further, it was confirmed that Ar ed i a is preferably added at a concentration of 1 to 30 ⁇ , On c l a st at a concentration of 1 to 30 / iM, and Zome t a at a concentration of 0.1 to 10 M. Table 1:% of T cells contained in mononuclear cells in which the concentration of IL-12 was changed when Ar e dia was used as the bisphosphonate (%)
  • Peripheral blood was collected from healthy individuals, and peripheral blood mononuclear cells were separated using a specific gravity solution for blood cell separation.
  • peripheral blood mononuclear cells obtained in 1) were suspended in the culture medium AIMV (10% FCS).
  • Ardia was added to the peripheral blood mononuclear cell suspension to a concentration of 10 M.
  • IL 1 was added so that the concentration of IL-1 was 20 00, 40 0, 700, 1 000 and 1 50 OUZmL.
  • Table 4 and Table 5 show the percentage (%) of 5 ⁇ cells when the amount of IL-2 is changed.
  • Table 4 shows the number of cells on days 7, 9, 1 and 14 and Table 5 shows the number of cells on days 0, 3, 7, 9, 1 and 14 (X 1 0 6 ) respectively.
  • peripheral blood mononuclear cells in Table 4 a) and Table 5 a) are derived from the same donor.
  • the peripheral blood mononuclear cells in Tables 4b) and 5b) are from the same donor. From these results, it was confirmed that the amount of IL-12 is preferably 400-1500 UZmL and the number of culture days is 11 days or more in order to obtain high purity and large amount of ⁇ cells.
  • Table 4 A ratio of ⁇ 5 T cells when the amount of IL-12 is changed ()
  • peripheral blood mononuclear cells were separated using a specific gravity solution for blood cell separation.
  • IL-2 was added to a concentration of 700 U / mL. Furthermore, according to the proliferation of the cells, the culture solution A I M-V was added and cultured for 14 days.
  • ⁇ cells activated and / or expanded by adding A redia to peripheral blood mononuclear cells express NKG2D.
  • ⁇ KG 2 D is an active NK cell receptor that is expressed on NK cells, ⁇ 6 T cells and CD 8 positive T cells and expresses its ligand, MI CAZB molecule.
  • Cells are known to be injured through NKG 2DZM ICA interaction.
  • EZT ratio ratio of reaction cells to target cells
  • An n + indicates the number of cells that have developed the fluorescence of Anne x i n V, and An n ⁇ indicates the number of cells that have not developed color.
  • 7 AAD + indicates the number of cells that developed 7-AAD fluorescence, and 7 AAD- indicates the number of cells that did not. That is, An n-7 AAD + is a necrotic cell, An n + 7 AAD + is a late apoptotic cell, An n + 7 AAD- is an early apoptotic cell, Ann-7 AAD- Indicates that the cell is alive.
  • CD 56-positive ⁇ ⁇ cells have higher cytotoxic activity against U 2 66 than CD 56-negative ⁇ ⁇ cells.
  • the expression of NKG 2 D was also confirmed in CD 56 negative ⁇ ⁇ cells, confirming that ⁇ ⁇ cells expressing both NKG2D and CD 56 have more efficient cytotoxic activity. It was.

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Abstract

末梢血単核球からγδＴ細胞を選択的に活性化及び／又は増殖させ、高純度かつ大量培養させることが可能なγδＴ細胞の培養方法、該方法によって培養されたγδＴ細胞並びにがん患者や感染症を対象とした免疫療法において、該方法によって培養されたγδＴ細胞を含む治療・予防剤を提供する。末梢血単核球に０．０５～１００μＭのビスホスホネートを添加することにより末梢血単核球中のγδＴ細胞を選択的に活性化及び／又は増殖させ、更に５０～２０００Ｕ／ｍＬのＩＬ−２で刺激することにより活性化及び／又は増殖させ、高純度かつ大量に増殖させることができる。このようにして得られたγδＴ細胞には高い細胞傷害活性を有するＣＤ５６陽性細胞が多く含まれるため、がん患者や感染症を対象とした治療・予防剤として有用である。

Description

明細書 r δ τ細胞の培養方法、 ァ δ τ細胞及び治療 ·予防剤 技術分野
本発明はァ <5 Τ細胞の培養方法に関する。 更に、 該培養方法によって培養さ れたァ（5Τ細胞、 該培養方法によって培養されたァ 細胞を含有する治療- 予防剤に関する。 背景技術
日本人の最も多い死亡原因として悪性新生物 （以下、 がんという） が挙げら れる。 がんの治療法としては、 三大療法と言われる外科療法、 化学療法、 放射 線療法があるが、 夫々治療の困難性や副作用等といつた問題がある。
近年、 上記三大療法の他にがんの新しい治療法として免疫細胞療法が行われ ており、 この免疫細胞療法は、 上記の三大療法のような治療の困難性や副作用 といつた問題が少ないため注目されている。
この免疫細胞療法の中に、 L ΑΚ ( 1 ymp h o k i n e - a c t i v a t e d k i l l e r ; リンフォカイン活性化キラ一） 療法という T細胞を活性 化させる療法がある。 T細胞は、 α/3型の TCR (T c e l l r e c e p t o r) を発現する ]3 T細胞とァ δ型の TCRを発現するァ δΤ細胞との 2 種類があり、 この LAK療法では Τ細胞の中でも主にひ β Τ細胞を活性化させ る療法である。 ここで、 α Ζ3Τ細胞は獲得免疫を中心に担っている Τ細胞のこ とである。
一方、 ァ δΤ細胞は、 自然免疫を担う細胞である。 最近ではがん細胞に対し て細胞傷害活性 （非特異的活性） を有することがわかり、 この τ δΤ細胞の有 する強い抗腫瘍活性を利用した免疫療法の研究が行われている。
Τ δ Τ細胞は非べプチド抗原を認識して活性化するため、 非べプチド抗原と して例えば、 アルキルアミンゃビスホスホネートでァ δΤ細胞を刺激し、 活性 化及び/又は増殖させることが可能であり、 i n V i t r oで末梢血から分 離した r δ Τ細胞に非ペプチド抗原を認識させ活性化及び/又は増殖に関する 研究がなされている（F um i M i y a g awa e t a 1. The J ou r na l o f I mm u n o 1 o g y 2001 ； 166 (9) : 550 8— 5514)。 一
しかしながら、 τ δΤ細胞は通常、末梢血中お 1〜5%しか存在しないので、 少量の血液を採取して Τ δ Τ細胞を活性化及び/又は増殖させても治療に十分 な純度及び細胞数を確保することができないといった問題がある。 また、 治療 に十分な純度及び細胞数を確保するために患者からの採血量を多くすると、 患 者に多大な負担がかかるといった問題もある。
ところで、 ァ δΤ細胞には CD 56を発現している細胞 （以下 CD 56陽性 ァ（5T細胞という） と発現していない細胞 （以下 CD 56陰性ァ δ T細胞とい う） が存在し、 CD 56陽性ァ δ T細胞は CD 56陰性ァ δ.Τ細胞に比べて、 細胞傷害活性が高いことがわかっており （Fu j im i y a, Y. e t a 1. C l i n i c a l Can c e r Re s e a r c h Vo l . 3， 6 33— 643, Ap r i l 1997)、 がんや感染症治療への応用が期待され ている。
ここで、 前記文献 （Fu j im i y a, Y. e t a 1. C l i n i c a 1 C an c e r Re s e a r c h Vo l . 3， 633-643, Ap r i 1 1 997) には CD 56陽性ァ δ Τ細胞の作成方法が記載されている が、 純度の高い CD 56陽性ァ 6 T細胞群を得るために磁気ビーズを用いて少 なくとも 3回以上の選別を行わなくてはならず、 工程が複雑であり、 費用も高 くなるという問題点が存在する。
また、 特開 200 1— 3141 83においては 50 %以上の CD 56陽性細 胞を含む細胞群を用いた治療剤と実施例があげられているが、 ここで用いられ ている CD 56陽性細胞はァ δΤ細胞とナチュラルキラ一細胞 （以下 ΝΚ細胞 という） が混在したものであり、 ァ <5 Τ細胞については 10%前後含まれてい るのみである。 発明の開示
本発明は上記事情に鑑みてなされたものであり、 末梢血単核球からァ 5Τ細 胞を選択的に活性化及び Ζ又は増殖させ、 高純度かつ大量培養させることが可 能なァ δ Τ細胞の培養方法、 該方法によって培養されたァ δ Τ細胞並びにがん 患者や感染症等を対象とした免疫療法において、 該方法によって得られたァ δ Τ細胞を含む治療 ·予防剤を提供することを目的とする。
本発明のァ 細胞の培養方法は、 末梢血単核球にビスホスホネート系骨代 謝改善薬 （以下、 ビスホスホネートと略記する） の濃度が 0. 05〜100 / Μ及びインターロイキン 2 (以下、 I L— 2と略記する） の濃度が 50〜 20 00 U/mLとなるように添加して培養することを特徴とする。
本発明のこのような構成によると、 培養液中の末梢血単核球にビスホスホネ —トを 0. 0 5〜1 0 0 Mとなるように添加することにより、 末梢血単核球 中のァ δ Τ細胞を選択的に活性化及びノ又は増殖させ、 更に I L一 2を 50〜 2000 U/mLとなるように添加して剌激することにより活性化及び Ζ又は 増殖されたァ δΤ細胞を高純度かつ大量に得ることが可能である。 また、 得ら れた T 6 Τ細胞には C D 5 6を発現した細胞が少なくとも 4 0 %以上含まれて いる。
前記ビスホスホネー卜は、 培養開始時に添加することを特徴とする。
このような構成によると、 培養開始時にビスホスホネートを添加することに より、 従来のように末梢血単核球からァ（5 T細胞を分離して培養する場合と異 なり、 ァ 5 T細胞を分離する工程を経ずに選択的に活性化及び/又は増殖させ るので、 培養の一工程を省き効率的に培養することが可能となる。
本発明により得られた Τ δ Τ細胞は非特異的な細胞傷害性機能、 がん抗原特 異的な細胞傷害性機能若しくは両方の細胞傷害性機能を有する。 従って、 がん 疾患や感染症に対する治療 ·予防剤として用いることが可能である。
また、 本発明により得られたァ 5 Τ細胞は高い細胞傷害性機能を有する C D 5 6陽性ァ δ Τ細胞を多く含んでいる。 従って、 C D 5 6陽性ァ δ Τ細胞につ いて選択することにより、 同じ細胞数を投与した場合により高い治療 ·予防効 果を得ることが可能である。
さらには、 本発明により作成された治療 ·予防剤は、 非特異的な細胞傷害性 機能、 がん抗原特異的な細胞傷害性機能若しくは両方の細胞傷害性機能を有す るァ <5 Τ細胞の含有量が高く、 r δ Τ細胞の中でも細胞傷害性機能の高い C D 5 6陽性ァ（5 T細胞を多く含むため、 正常細胞を攻撃することなしに、 がん細 胞若しくは感染細胞を特異的に攻撃する機能を有し、 様々ながん種および感染 症の治療に有効である。 特にァ δ Τ細胞が自己リンパ球由来であれば患者に投 与された際に、 患者自身の免疫系によって排除されることなく、 その機能を発 揮することが可能となる。 発明を実施するための最良の形態
以下、 本発明の実施形態について説明する。
本発明のァ 5 Τ細胞の培養方法は、 末梢血単核球にビスホスホネート系骨代 謝改善薬の濃度が 0 . 0 5〜： 1 0 0 /1 Μ及び I L一 2の濃度が 5 0〜 2 0 0 0 U/mLとなるように添加して培養することによりァ δ Τ細胞を選択的に活性 化及び/又は増殖させァ 5 Τ細胞を高純度で含む細胞集団を得ることを特徴と する。
ビスホスホネートは、 骨吸収抑制作用を有し、 一般的に骨粗鬆症治療薬とし て使用されるものであればよく、 その例として、 パミドロン酸、 その塩及び/ 又はそれらの水和物 （例えば、 パミドロン酸ニナトリウム ·五水和物 （A r e d i a、 ノバルティスファーマ））、 アレンドロン酸、 その塩及び/又はそれら の水和物 （例えば、 アレンドロン酸ナトリウム ·三水和物 （O n e 1 a s t、 萬有製薬)）、 ゾレドロン酸、 その塩及び/又はそれらの水和物 （例えば、 ゾレ ドロン酸ナトリウム ·水和物 （Z ome t a、 ノバルティスファーマ））、 リセ ドロン酸、 その塩及び Z又はそれらの水和物 （例えば、 リセドロン酸ナトリウ ム '水和物）、 ィバンドロン酸、 その塩及び Z又はそれらの水和物 （例えば、 ィ バンドロン酸ニナトリウム）、 インカドロン酸、 その塩及び Z又はそれらの水和 物 （例えば、 インカドロン酸ニナトリウム）、 ェチドロン酸、 その塩及び/又は それらの水和物 （例えば、 エヂドロン酸ニナトリウム） が挙げられ、 これらの 中で、 とりわけパミドロン酸、 アレンドロン酸、 ゾレドロン酸、 その塩及び Z Xはそれらの水和物等の窒素原子を有するもの （ァミノビスホスホネート） が 好ましい。
( 1 ) 第一の実施形態； r δ Τ細胞の培養方法
以下に、 本発明のァ <5 Τ細胞の培養方法について、 順に説明する。
1) 採血により、 末梢血を得る。 量としては 15〜25mLが適量である。 これだけの量を得られれば、 好適に培養することが可能である。 ただし、 培養 開始時に十分な末梢血量であればこの範囲に限らず、 また、 採血するドナーの 負担が少ないようであれば、 上限値が更に高くなつてもよい。
2) 例えば密度勾配遠心法により、 末梢血単核球を得る。 個数としては 15 〜 25 mLの末梢血からはおおむね 107個の末梢血単核球を得ることができ る。
3) 2) で得られたおよそ 107個の末梢血単核球を培養液 A I M-V (イン ビトロジェン） 中に懸濁する。 ここで末梢血単核球を懸濁した液を細胞懸濁液 という。 なお、 ここで示した培養液以外にも、 RPMI— 1640培地 （イン ビトロジェン）、 ダルベッコ改変イーグル培地 （インビトロジェン、 以下 DME Mという）、 イスコフ培地 （インビトロジェン、 以下 I MEMという） 等の細胞 の培養に使用される市販の培養液を使用してもよい。
また、 必要に応じて血清を 0. 1〜20 %添加してもよい。 血清として、 例 えば、 牛胎児血清 （F e t a 1 Ca l f S e r um、 以下 F C Sという）、 A B血清又は自己血漿等を使用してもよい。
4) 3 )で得られた細胞懸濁液をフラスコ、バッグ又はプレートに播種する。
5)フラスコ、バッグ又はプレート中に播種された末梢血単核球に濃度が 0. 05〜100 M、 好ましくは 0. 1〜30 AiMとなるようにビスホスホネ一 トを添加する。 ここで、 更に、 パミドロン酸、 その塩及び /又はそれらの水和 物であれば 1〜3 0 M、 アレンドロン酸、 その塩及び Z又はそれらの水和物 であれば l〜30 iM、 ゾレドロン酸、 その塩及び Z又はそれらの水和物では 0. 1〜10 Mにすることが好ましい。
6 ) 更に、 上記培養液に I L— 2を濃度が 50〜 2000 UZmL、 より好 ましくは 400〜 100 OUZmLとなるように添加する。
7) 6) で I L— 2を添加した後 34〜38°C、 より好ましくは 37 で、 2〜10%、 より好ましくは 5%C〇2存在下で培養する。 この際、 培養する細 胞数に応じ、 培養液を適宜添加する。 更に、 培養液の増加に伴い、 I L一 2の 濃度が 50〜200 OU/mL、 より好ましくは 400〜： L O O OUZmLと なるように適宜添加する。
培養期間としては 7日間以上であれば高純度でァ δΤ細胞を含む細胞群が得 られるが、 更に r δ Τ細胞の細胞数を増やすには、 1 4日間程度培養すること が好ましい。
8) このようにして得られたァ δ Τ細胞には細胞傷害性機能の高い CD 56 陽性 τ δ Τ細胞が多く含まれており、 C D 56陽性 τ δ Τ細胞について選別し、 使用することも可能である。 CD 56陽性ァ δΤ細胞を選別する方法として、 例えば磁気細胞分離法 （Magn e t i c Ce l l S o r t i ng、 以下 MAC Sという） ゃフ口一サイトメトリー （F l ow Cy t erne t r y) 等が挙げられる。
以上の方法により、 ァ δ T細胞を効率よく増殖することができる。
(2) 第二の実施形態； 了 δ Τ細胞を用いた治療 ·予防剤
次に、 本発明の培養方法によって得られた活性化： r δ Τ細胞を用いた治療 · 予防剤について説明する。
1) 本発明の培養方法によって得られた細胞を遠心分離等により回収する。
2) 回収した細胞を洗浄液で洗浄する。 洗浄液は、 細胞と浸透圧が等しい等 張液であることが好ましく、 医薬品として使用可能な液体であればより好まし い。 ここで、 患者に投与することを考慮すると、 例えば生理食塩水、 PBS (ρ ho s ph a t e bu f f e r e d s a l i ne ;リン酸緩衝生理食塩水） 等を利用することが好ましい。
3) 洗浄後に得られた r 3 τ細胞を遠心分離法等を用いて回収し、 医薬品と して可能な液体、 例えば、 生理食塩水等に懸濁して本発明の治療 ·予防剤を調 製することができる。 この際、 懸濁用液体の使用量は投与する細胞数や投与方 法に応じて適宜調整される。
本発明の治療，予防剤に用いる r (5 τ細胞数は、 投与方法、 疾病の種類、 患 者の症状等に応じて適宜選択されるが、通常、 108〜1012個 Z人であること が好ましく、 より好ましくは 109個 人以上である。
4) 生理食塩水に懸濁して δ Τ細胞を用いた治療 ·予防剤を得る。
また、 がんの治療 ·予防剤として使用する場合には、 1乙ー2及び1乙ー 1 2等のサイトカインと本発明の予防 ·治療剤とを組み合わせることも可能であ る。
更に、 ウィルス感染症の治療 ·予防剤として使用する場合には、 インターフ エロンーァ (I FN-r) 等と本発明の予防 .治療剤とを組み合わせることも 可能である。
5)投与する方法としては、例えば静脈内、 皮内、 皮下等へ注射することも、 病変部に直接注入しても、 まだ点滴として全身投与してもよい。 更に、 病変部 近辺の動脈から注入してもよい。
本発明の治療，予防剤は、 非特異的な細胞傷害性機能、 がん抗原特異的な細 胞傷害性機能若しくは両方の細胞傷害性機能を有する T <5 T細胞の含有量が高 く、 特に細胞傷害性機能の高い CD 56陽性 r δ Τ細胞を多く含んでいるので、 正常細胞を攻撃することなしに、 がん細胞若しくは感染細胞を特異的に攻撃す る機能を有し、様々ながん種および感染症の治療に有効な治療 ·予防剤となる。 特にァ <5 Τ細胞が自己リンパ球由来であれば患者に投与された際に、 患者自身 の免疫系によって排除されることなく、 その機能を発揮することが可能となる。 実施例
以下、 実施例を用いて本発明を詳細に説明する。 ただし、 本発明はこれに限 定されるものではない。 実施例 1
<τ δ τ細胞の培養方法における各種ビスホスホネートによる好適濃度の検討
>
1) まず、 健常人ドナーから末梢血を 18 OmL採血し、 血球分離用比重液 を用いて末梢血単核球を分離した。
2 ) 得られた末梢血単核球を、 FCSを 10%となるように添加した培養液 AIM— V (以下 AIM— V (10 FCS) という） に懸濁した。
3) 24we 1 1 p l a t e (SUM I LON) に、 l X l 06ZlmLの 健常人末梢血単核球を播種した。
4) r δτ細胞を活性化及び Z又は増殖するためのビスホスホネートとして Ar e d i a、 Onc l a s t、 Zome t aをそれぞれ添加し、 37°C、 5 % C O 2濃度条件下で培養を開始した。
5) 次に、 培養開始 0、 5、 7、 9、 11日後に I L— 2を濃度が 400、
1000、 200 OU/mLとなるように添加した。 更に細胞の増殖に応じて 培養液 A I M— Vを添加し、 14日間培養を行った。
6) 上述の通り、 14日間培養した後に得られた細胞群中にァ <5 T細胞を発 現している細胞の割合を F l uo r e s c e n c e— Ac t i v a t e d C e l l S o r t e r (以下 FAC Sという、 Ep i c s XL-MCL A DC、 ベックマン 'コール夕一） により測定した。 測定により、 得られた値を 以下表 1 ~ 3に示す。
これらの結果により、 高純度量なァ δ T細胞を得るには、 ビスホスホネート 系骨代謝改善薬の濃度を 0 · 1〜30 χΜに、 また I L一 2は 400〜200 OUZmLなるように添加することが好ましいことが確認された。 また Ar e d i aは 1〜30 ζΜ、 On c l a s tは l〜30 /iM、 Z ome t aは 0. 1〜10 Mの濃度で添加することがより好ましいことが確認された。 表 1 ： ビスホスホネ一トとして Ar e d i aを使用した場合に I L一 2の 濃度を変化させた単核球中に含まれるァ <5 T細胞の割合 （％)
Figure imgf000008_0001
表 2 ： ビスホスホネートとして On c l a s tを使用した場合に I L— 2 の濃度を変化させた単核球中に含まれるァ δΤ細胞の割合 （％)
I L一 2濃度 （U/mL)
O n c 1 a s t
400 1000 2000
(^M)
0 10. 1 9. 7 10. 4
1 68. 5 57. 1 69. 3
5 82. 8 82. 1 82. 3
10 89. 7 86. 5 84. 1
30 90. 2 84. 6 85. 7
50 88. 5 81. 2 77. 0
100 74. 4 62. 9 70. 9 表 3 ： ビスホスホネートとして Z ome t aを使用した場合に I L— 2の 濃度を変化させた単核球中に含まれるァ δ Τ細胞の割合 (%)
Figure imgf000009_0001
実施例 2
<T <5 T細胞の効率的増殖に係る I L— 2の最適濃度の検討 >
1) 健常人末梢血を採血し、 血球分離用比重液を用いて末梢血単核球を分離 した。
2 ) 培養液 A I M-V (1 0 %FCS) に 1) で得られた末梢血単核球を懸 濁した。
3) 24we 1 1 p l a t eに 1 X 1 06Zl mLの末梢血単核球懸濁液を 播種した。
4) 末梢血単核球懸濁液に濃度が 1 0 Mとなるように A r e d i aを添加 した。
5) 培養開始 0、 3、 7、 9、 1 1、 1 4日後に I L一 2の濃度が 2 0 0、 40 0、 700、 1 000、 1 5 0 OUZmLとなるように添加した。
6) 細胞の増殖に応じて培養液 A I M— V (1 0%FCS) を添加した。
7) 14日間培養を行った。
8) 1 4日間の培養後に得られた細胞の生細胞数をトリパンブル一を用いて 調べた。
9) また、 1 4日間の培養後に得られた細胞の表面抗原を F ACSにより調 ベ、 Τ δ Τ細胞の割合を測定した。 その結果 I L一 2を 40 0〜 1 0 0 0U/ mLを添加すると大量のァ δ Τ細胞を得ることができることが確認された。
I L— 2の量を変化させた時のァ 5 Τ細胞の割合 (%) を表 4と、 表 5に示 す。 表 4は培養 7日、 9日、 1 1日、 1 4日目の、 表 5は培養 0日、 3日、 7 日、 9日、 1 1日、 14日目の細胞数 （X 1 06個） をそれぞれ示した。
なお、 表 4 a) と表 5 a) の末梢血単核球は、 同一のドナ一由来のものであ り、 表 4 b) と表 5 b) の末梢血単核球は、 同一のドナー由来のものである。 この結果により、 高純度かつ多量なァ δ Τ細胞を得るには、 I L一 2の量は 400〜1500 UZmL、 培養日数は 1 1日以上がより好ましいことが確認 された。 表 4 ： I L一 2の量を変化させた時のァ <5 T細胞の割合 ( )
a)
Figure imgf000010_0001
Figure imgf000010_0002
表 5 ： I L一 2の量を変化させた時のァ δΤ細胞数 （X 106個) a)
I L一 2濃度
0曰 3曰 7曰 9曰 11曰 14曰 (U/mL)
200 1. 00 1. 11 3. 42 4. 88 8. 48 13. 6
400 1. 00 1. 12 3. 81 10. 6 30. 6 57. 6
700 1. 00 1. 29 4. 65 19. 5 42. 9 92. 0
1000 1. 00 1. 40 5. 43 20. 6 44. 2 97. 6
1500 1. 00 1. 35 5. 55 24. 2 48. 8 129 I L一 2濃度
0曰 3曰 7曰 9曰 11曰 14曰 (U/mL)
200 1. 00 1. 49 5. 07 22. 5 35. 0 43. 6
400 1. 00 1. 59 5. 91 25. 4 35. 3 54. 8
700 1. 00 1. 64 6. 93 24. 3 48. 3 58. 8
1000 1. 00 1. 85 5. 82 27. 0 37. 5 67. 2
1500 1. 00 1. 86 5. 82 25. 5 37. 5 48. 8 実施例 3
ぐ CD 56陽性、 CD 56陰性ァ δ Τ細胞の選別とそれぞれの細胞傷害活性の 比較 >
1) 健常人ドナーから末梢血を 40m 1採血し、 血球分離用比重液を用いて 末梢血単核球を分離した。
2) 得られた末梢血単核球を、 AIM— V (10 FCS) に懸濁した。
3) 24we 1 1 p l a t e (SUM I LON) に、 l X l 06ZlmLの 末梢血単核球を播種した。 I L— 2を 700 U/mL, Ar e d i aを 10 M添加し、 37°C、 5%C02濃度条件下で培養を開始した。
4) 培養を開始してから 0、 5、 7、 9、 11日後に I L— 2を濃度が 70 0 U/mLとなるように添加した。 更に細胞の増殖に応じて培養液 A I M-V を添加し、 14日間培養を行った。
5) 14日間培養後、得られた細胞群の表面抗原を F ACSにより測定した。 その結果、 末梢血単核球に A r e d i aを添加し、 活性化及び/または増殖さ せたァ δΤ細胞は NKG2Dを発現していることが明らかとなった。 ここで Ν KG 2 Dとは活性型 NK細胞レセプ夕一の 1つで、 NK細胞や τ 6 T細胞や C D 8陽性 T細胞に発現しており、 そのリガンドである M I CAZB分子を発現 している細胞を NKG 2DZM I C A相互反応を介して傷害することが知られ ている。 また、 CD 56を発現している細胞群が約 50 %存在していることが 確認された。 P T/JP2005/013218
11
表 6 ： 14日培養後のァ <5 T細胞の表面抗原出現頻度 （％)
Figure imgf000012_0001
6) 得られた細胞群を CD 56マイクロビーズ （M i 1 t e ny i B i o t e c) により標識し、 MACSにより、 ポジティブフラクション （CD56陽 性細胞群） とネガティブフラクション （CD 56陰性細胞群） を回収した。 得 られた細胞を反応細胞とした。 表 7 ： MACSにより分離したそれぞれのフラクションの表面抗原出現頻 度 （％)
a) ポジティブフラクション （CD 56陽性細胞）
Figure imgf000012_0002
7) 標的細胞として U266 (多発性骨髄腫細胞株).を使用し、 標的細胞と 反応細胞を区別するために、標的細胞を PKH— 26 (PKH26 . Re d F l u o r e s c e n t C e l l L i nk e r K i t、 S I GMA) で染 色した。 8) 反応細胞と標的細胞の比 （以下 EZT比という） が 0 ： 1 (標的細胞の みの対照群）、 1 : 1、 10 : 1となるように 24we 1 1 l a t eに播種 し、 37 、 5 %C〇2濃度条件下で 4時間共培養を行った。
9) 次に、 共培養した細胞を回収し、 アポト一シスの初期段階を同定する A nn e X i n Vとアポトーシス後期およびネクロ一シスを同定する 7—AAD
(ANNEX I N V— F I TCZ7—AAD K I T、 ベックマン 'コール ター） により染色し、 U266に対する細胞傷害活性を FACSにより測定し た。 FACS解析において ΡΚΗ— 26陽性細胞にゲートをかけることで標的 細胞のみを解析することができる。
表 8において、 An n +は An n e x i n Vの蛍光を発色していた細胞数、 An n—は発色していない細胞数を示す。 また、 7 AAD+は 7— AADの蛍 光を発色していた細胞数、 7 AAD—は発色していなかった細胞数を示してい る。 すなわち、 An n— 7 AAD+はネクローシスを起こしている細胞、 An n + 7 AAD +はアポトーシス後期である細胞、 An n + 7 AAD—はアポ卜 一シス初期である細胞、 Ann— 7 AAD—は生存している細胞であることを 示す。
なお、 細胞傷害活性の値は式 1により算出した。 式 1
細胞障害活性 （％)
[Ann +細胞数 （被験） ] ― [Ann +細胞数 （対照） ] ェ。
~ Ϊ怠細胞数一 [Ann+細胞数 （対照） ]
これにより、 C D 56陽性了 δ Τ細胞は C D 56陰性ァ δ Τ細胞に比べ U 2 66に対する細胞傷害活性が高いことが確認された。 また、 CD 56陰性ァ δ Τ細胞にも N K G 2 Dの発現が確認されていることから、 NKG2Dおよび C D 56両方を発現したァ δ Τ細胞がより効率の良い細胞傷害活性を持つことが 確認された。
CD 56陽性および C D56陰性細胞群の U 266に対する細胞傷 害活性
コントロール CD 56陽性 CD 56陰性
EZT比 0 ： 1 1 ： 1 10 : 1 1 ： 1 10 : 1 総細胞数 （個） 30000 30000 30000 30000 30000
Ann- 7 AAD + 142 37 36 63 47
Ann+ 7 AAD + 1958 2111 7014 1892 2694
Ann+7 AAD— 2420 5539 13102 3298 8761
Ann— 7 AAD— 25480 22313 9848 24747 18497 細胞傷害活性 （％) 0 12. 8 61. 4 3. 2 27. 6

Claims

請求の範囲
1. 末梢血単核球にビスホスホネート系骨代謝改善薬の濃度が 0. 05〜10 0 M及び I L一 2の濃度が 50〜2000 UZmLとなるように添加し て培養することを特徴とする r <5 τ細胞の培養方法。
2. 前記ビスホスホネート系骨代謝改善薬を濃度が 0. 1〜30 /χΜになるよ うに添加することを特徴とする請求項 1に記載の τ δ Τ細胞の培養方法。
3. 前記ビスホスホネート系骨代謝改善薬を、 培養開始時に添加することを特 徵とする請求項 1又は請求項 2に記載の r δ Τ細胞の培養方法。
4. 前記ビスホスホネート系骨代謝改善薬が、パミド口ン酸、 アレンドロン酸、 ゾレドロン酸、 リセドロン酸、 ィバンドロン酸、 インカドロン酸、 ェチド 口ン酸、 それらの塩及び Ζ又はそれらの水和物であることを特徴とする請 求項 1乃至請求項 3のいずれか一項に記載の r δ Τ細胞の培養方法。
5. 前記パミドロン酸、 その塩又はそれらの水和物の濃度が、 1〜30 Μで あることを特徴とする請求項 4に記載の τ δ Τ細胞の培養方法。
6. 前記アレンドロン酸、 その塩又はそれらの水和物の濃度が、 1〜3 0 Μ であることを特徴とする請求項 4に記載の τ δ Τ細胞の培養方法。
7. 前記ゾレド口ン酸、 その塩又はそれらの水和物の濃度が、 0. 1〜 1 0 ^ Μであることを特徴とする請求項 4に記載の τ δ Τ細胞の培養方法。
8. 前記 I L— 2を濃度が、 400〜1 00 OUZmLとなるように添加する ことを特徴とする請求項 1乃至請求項 7のいずれか一項に記載のァ δ Τ細 胞の培養方法。
9. 末梢血単核球にビスホスホネート系骨代謝改善薬及び I L一 2を夫々濃度 が 0. 05〜1 00 M及び 50〜2000 UZmLとなるように添加し て培養して得られることを特徴とする了 δ Τ細胞。
10. 前記ァ δ Τ細胞が、 C D 56陽性 γ 6 Τ細胞を少なくとも 25 %以上含 んでいることを特徴とする請求項 9に記載の Ύ δ Τ細胞。
1 1. 前記 τ δΤ細胞が、 CD 56陽性ァ <5 Τ細胞を少なくとも 40%以上含 んでいることを特徴とする請求項 9に記載のァ δ Τ細胞。
12. 末梢血単核球にビスホスホネート系骨代謝改善薬及び I L一 2を夫々濃 度が 0. 05〜： L 00 AiM及び 50〜200 OUZmLとなるように添 加して培養されたァ <5 T細胞を含有することを特徴とするがん及び/又 は感染症の治療 ·予防剤。
13. 前記 τ δΤ細胞が、 CD 56陽性ァ <5 Τ細胞を少なくとも 25%以上含 んでいることを特徴とする請求項 12に記載のがん及び Z又は感染症の 治療 ·予防剤。
14. 前記ァ δΤ細胞が、 CD56陽性ァ δΤ細胞を少なくとも 40%以上含 んでいることを特徴とする請求項 12に記載のがん及び/又は感染症の 治療 ·予防剤。
15. 前記ァ δΤ細胞が自己リンパ球由来であることを特徴とする請求項 12 乃至 14のいずれか一項に記載のがん及び Ζ又は感染症の治療 ·予防剤。
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