WO2005113745A1 - コハク酸生産菌及びコハク酸の製造方法 - Google Patents

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WO2005113745A1
WO2005113745A1 PCT/JP2005/009233 JP2005009233W WO2005113745A1 WO 2005113745 A1 WO2005113745 A1 WO 2005113745A1 JP 2005009233 W JP2005009233 W JP 2005009233W WO 2005113745 A1 WO2005113745 A1 WO 2005113745A1
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WO
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gene
activity
strain
succinic acid
poxb
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PCT/JP2005/009233
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English (en)
French (fr)
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Keita Fukui
Jun Nakamura
Kayo Akiyama
Hiroyuki Kojima
Original Assignee
Ajinomoto Co., Inc.
Mitsubishi Chemical Corporation
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/40—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carboxyl group including Peroxycarboxylic acids
    • C12P7/44—Polycarboxylic acids
    • C12P7/46—Dicarboxylic acids having four or less carbon atoms, e.g. fumaric acid, maleic acid
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
    • C12N15/77—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for Corynebacterium; for Brevibacterium

Definitions

  • the present invention relates to the fermentation industry, and relates to a method for efficiently producing succinic acid by a fermentation method using coryneform bacteria.
  • Anaerobic bacteria such as the genus Anaerobiospirillum (Anaerobiospirillum) and the genus Actinobacillus (Actinobacillus) have been used (see Patent Documents 1 and 2 or Non-Patent Document 1).
  • anaerobic bacteria When anaerobic bacteria are used, the product yield is high, but on the other hand, large amounts of organic compounds such as CSL (corn steep liquor) are required in the medium due to the need for many nutrients to grow. It is necessary to add a nitrogen source. Adding a large amount of these organic nitrogen sources not only raises the cost of culture but also raises the cost of refining when extracting products, which is not economical.
  • Aerobic bacteria such as coryneform bacteria
  • the cells are grown, then collected, washed, and produced as quiescent cells without aeration with oxygen to produce succinic acid.
  • Patent Documents 3 and 4 There is also a known method (see Patent Documents 3 and 4).
  • the amount of organic succinic acid to be produced, the production concentration, and the cell concentration are economical because the amount of organic nitrogen added is small and the cells can be sufficiently grown in a simple medium.
  • improvement such as improvement of the production speed per unit and simplification of the manufacturing process.
  • Pyruvate oxidase is an enzyme that produces acetic acid from pyruvic acid and water (EC 1.2.2.2).
  • a method for producing pantothenic acid is known.
  • Patent Document 1 U.S. Pat.No. 5,143,833
  • Patent Document 2 U.S. Pat.No. 5,504,004
  • Patent Document 3 JP-A-11-113588
  • Patent Document 4 JP-A-11 196888
  • Patent Document 5 JP-A-11-206385
  • Patent Document 6 JP-A-6-14781
  • Patent Document 7 JP-A-7-67683
  • Patent Document 8 International Publication No. 99Z06532 pamphlet
  • Patent Document 9 European Patent Application Publication No. 1096013
  • Patent Document 10 International Publication No. 02Z36797 pamphlet
  • Patent Document 11 International Publication No. 02Z072855 pamphlet
  • Patent Document 12 International Publication No. 02/29020 Pamphlet
  • Patent Document 13 European Patent Application Publication No. 1 108 790
  • Non-Patent Document 2 Microbiology.1999 Feb; 145 (Pt 2): 503-13
  • An object of the present invention is to provide a coryneform bacterium capable of efficiently producing succinic acid.
  • the present invention is as follows.
  • a coryneform bacterium having a succinic acid-producing ability wherein the coryneform bacterium is modified so that the activity of pyruvetoxidase is reduced.
  • the coryneform bacterium according to any one of (1) to (7) or a treated product thereof is allowed to act on an organic raw material in a reaction solution containing carbonate ions, bicarbonate ions or carbon dioxide, whereby the reaction is carried out.
  • a method for producing succinic acid comprising producing and accumulating succinic acid in a solution, and collecting succinic acid from the reaction solution.
  • a method for producing a succinic acid-containing polymer comprising a step of producing succinic acid by the method of (8) or (9) and a step of polymerizing the obtained succinic acid.
  • FIG. 1 is a view showing a procedure for constructing a plasmid pBS3.
  • FIG. 2 is a view showing a procedure for constructing a plasmid pBS4S.
  • FIG. 3 is a view showing a procedure for constructing a plasmid p ⁇ ldh56-l.
  • FIG. 4 is a view showing a procedure for constructing plasmid pBS4S :: ⁇ poxB.
  • FIG. 5 is a view showing acetic acid by-product rates of a poxB-disrupted strain and a control strain.
  • FIG. 6 is a view showing a procedure for constructing a plasmid pBS5T :: ⁇ ack.
  • FIG. 7 is a diagram showing a procedure for constructing plasmid pBSCT :: ⁇ ptaack.
  • FIG. 8 is a view showing a procedure for constructing a plasmid pBS5T :: ⁇ poxB.
  • FIG. 9 is a view showing a procedure for constructing a plasmid pBS4S :: ⁇ ach.
  • FIG. 10 is a view showing a procedure for constructing plasmid pBSCT :: ⁇ acp.
  • coryneform bacterium includes bacteria which are conventionally classified into the genus Brevipacterium and are currently classified into the genus Corynebacterium (Int. J. Syst. BacterioL, 41, 255). (1981)), and also includes bacteria of the genus Brevibataterirum, which is closely related to the genus Corynebacterium. Examples of such coryneform bacteria include the following.
  • succinic acid-producing ability refers to the ability to accumulate succinic acid in a medium when the coryneform bacterium of the present invention is cultured. This succinic acid-producing ability may be the one inherently possessed by the coryneform bacterium or a property imparted by breeding.
  • coryneform bacterium having a succinic acid-producing ability include Brevibataterim. Flavam MJ233 ⁇ ldh strain having reduced ratatate dehydrogenase activity (JP-A-11-206385) and pyruvate carboxylase.
  • Brevibataterum flavum MJ233 / pPCPYC strain (WO 01/27258, JP-A-11-196887) having enhanced phosphoenolpyruvate carboxylase activity, or Brevibacterium flavum MJ-233 (FERM) BP-1497), MJ-233 AB-41 (FER M BP-1498), Brevibataterum 'Ammoniagenes ATCC6872, Corynenocterium' Glutamicum ATCC31831, and Brevibataterimu 'Ratatofu amentum AT CC13869.
  • Brevibataterum 'Flavum' may now be classified as Corinebataterum 'Glutamicum' (Lielbl, W., Ehrmann, M., Ludwig, W. and Schleifer, KH, International Journal of Systematic Bacteriology, 1991, vol. 41, p255-260), Brevibataterim 'Flavum MJ-233 strain, and its mutant MJ-233AB-41 strain, Corynebacterium 'Glutamicum' shall be the same strain as MJ-233 strain and MJ-233 AB-41 strain.
  • the coryneform bacterium of the present invention is a coryneform bacterium having the succinic acid-producing ability as described above, and a coryneform bacterium modified so that pyruvate oxidase activity is reduced.
  • a coryneform bacterium modified so that pyruvate oxidase activity is reduced In the breeding of the coryneform bacterium of the present invention, either the modification of imparting succinic acid-producing ability or modifying pyruvate oxidase (EC 1.2.2.2) activity may be performed first.
  • “Pyruvate oxidase activity” refers to an activity of catalyzing a reaction for producing acetic acid from pyruvic acid and water. "Modified to reduce pyruvate oxidase activity” means that the pyruvate oxidase activity has become lower than the specific activity of an unmodified strain, for example, a wild-type coryneform bacterium. Compared to the unmodified strain, pyruvate oxidase activity is preferably reduced to 50% or less per cell, more preferably to 30% or less, and more preferably to 10% or less. Is particularly preferred. “Reduced” includes the complete loss of activity.
  • the wild-type coryneform bacterium used as a comparative control for the activity is, for example, Brevibatate terium 'ratatophamentum ATCC13869 as a wild type strain, and Brevibatate territory' ratatofarmentum Aldh strain as an unmodified strain. Is mentioned.
  • Pilbetoxidase activity was determined by the method of Chang et al. (Chang Y. and Cronan J. E.
  • Examples of pyruvoxidase having the above activity include a protein having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 49.
  • the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 49 may have an amino acid sequence containing one or several amino acid substitutions, deletions, insertions, or additions as long as it has pyruvate oxidase activity.
  • several means for example, 2 to 20, preferably 2 to 10, and more preferably 2 to 5.
  • Modified to reduce pyruvate oxidase activity refers to, for example, cells or Such cases include cases in which the number of molecules of pyruvate oxidase is reduced, and cases in which the activity of pyruvate oxidase per molecule is reduced. Specifically, it can be achieved by deleting a gene encoding pyruvatoxidase on a chromosome, or modifying an expression control sequence such as a promoter or Shine-Dalgarno (SD) sequence. Examples of the pyruvate oxidase gene on the chromosome include a DNA containing the nucleotide sequence of base numbers 996 to 2732 of SEQ ID NO: 48.
  • Stringent conditions refer to conditions under which a so-called specific hybrid is formed and a non-specific hybrid is not formed. If possible to clearly numerically I spoon conditions This Shimese force example is difficult, 60 ° C, 1 X SSC , 0. 1 0/0 SDS, preferably ⁇ or, 0. 1 X SSC, 0. 1 0/0 Ne th at those salt concentrations SDS, good Mashiku than once include conditions for washing 2-3 times.
  • the pyruvate oxidase gene (hereinafter referred to as the poxB gene) can be obtained, for example, by registering the gene with GenBank! (GenBank Accession No. NC-003450).
  • a synthetic oligonucleotide can be synthesized and cloned by performing a PCR reaction using the chromosome of Corynebacterium 'daltamicum' as type I.
  • sequences of coryneform bacteria such as Brevibacterium 'ratatophamentumum, whose base sequence has been determined by the genome project in recent years, can also be used.
  • Chromosomal DNA is obtained from a DNA donor bacterium, for example, by the method of Saito and Miura (H. Saito and K. Miura, Biochem. Biophys. Acta, 72, 619 (1963), Bioengineering Experiments, Edited by the Society, pages 97 to 98, Baifukan, 1992) and the like.
  • the poxB gene or a part thereof prepared as described above can be used for gene disruption.
  • the gene used for gene disruption is homologous enough to cause homologous recombination with the poxB gene on the chromosomal DNA of the coryneform bacterium to be disrupted (for example, a gene having the nucleotide sequence of base numbers 996-2732 of SEQ ID NO: 48). Therefore, such a homologous gene can also be used.
  • the homology to the extent of causing homologous recombination is preferably 70% or more, more preferably 80% or more, even more preferably 90% or more, particularly Preferably, it means 95% or more homology.
  • homologous recombination can occur between DNAs that can hybridize with the above genes under stringent conditions.
  • Stringent conditions refer to conditions under which a so-called specific hybrid is formed and a non-specific hybrid is not formed. It is difficult to clarify this condition clearly, but as an example, 60. C, 1 ⁇ SSC, 0.1% SDS, preferably, 0.1 ⁇ SSC, 0.1% SDS, a salt concentration corresponding to 0.1 times, more preferably, 2 to 3 times washing conditions.
  • a partial poxB gene is deleted to prepare a deletion type poxB gene modified so as to produce a normally functioning pyruvetoxidase
  • the poxB gene on the chromosome can be destroyed by transforming a coryneform bacterium with the DNA containing the gene and causing recombination between the deleted gene and the gene on the chromosome.
  • Such gene disruption by gene substitution using homologous recombination has already been established, and there are a method using linear DNA and a method using a plasmid containing a temperature-sensitive replication origin (US Pat. No. 6,303,383). Or JP-A-05-007491).
  • Gene disruption by gene replacement using homologous recombination as described above can also be performed using a plasmid that does not have replication ability on the host.
  • a plasmid for recombination is prepared by inserting a temperature-sensitive replication origin, a deletion type poxB gene, a sacB gene encoding levan sucrose, and a marker gene exhibiting drug resistance such as chloramuecole.
  • the sacB gene encoding levan sucrose is a gene used for efficiently selecting a strain in which the vector portion has been removed from the chromosome (Schafer. A. et al. Gene 145). (1994) 69-73). That is, in the case of coryneform bacterium, when levan eucase is expressed, levan produced by assimilating sucrose works lethally and cannot grow. Therefore, if the strain carrying the levan cyclase-loaded vector remaining on the chromosome is cultured on a sucrose-containing plate, it cannot grow, and only the strain from which the vector has been removed can be selected on the sucrose-containing plate.
  • sacB gene or its homologous gene a gene having the following sequence can be used.
  • Bacillus' subtilis sacB GenBank Accession Number X02730 (SEQ ID NO: 41)
  • Bacillus ami liquorifaciens sacB GenBank Accession Number X52988
  • Zymomonas mobilis sacB GenBank Accession Number L33402
  • Notyl's stearothermophilus surB GenBank Accession Number U34874 Lactobacillus ⁇ San Francisensis: frfA GenBank Accession Number AJ508391 acetopacta ⁇ ⁇ ⁇ Xylinas: lsxA GenBank Accession Number AB034152
  • a coryneform bacterium is transformed with the above-mentioned recombinant plasmid. Transformation may be performed according to the transformation method reported so far. For example, as described in Escherichia coli K-12, a method for increasing the permeability of DNA by treating recipient cells with salt calcium (Mandel, M. and Higa. , J. Mol. Biol., 53, 159 (1970)), and a method for preparing DNA and introducing DNA by preparing a cell in a growth stage, such as that reported for Bacillus' subtilis (Dancan, CH, Wilson. GA and Young. FE, Gene, 1,153 (1977)). Or Bacillus' subtilis, actinomycetes and yeast! A method for introducing a recombinant DNA into a DNA recipient using the cells of a DNA recipient (Chang. S. and Choen. SN, Molec. Gen. Genet., 168, 111 (1979);
  • coryneform bacterium can also be transformed by the electric pulse method (Sugimoto et al., JP-A-2-207791).
  • the temperature-sensitive plasmids of coryneform bacteria include p48K and pSFKT2 (the
  • the transformant obtained as described above is cultured at a temperature (25 ° C) in which the temperature-sensitive replication origin does not function, and a strain into which the plasmid has been introduced is obtained. Incubate the plasmid-introduced strain at high temperature to remove the temperature-sensitive plasmid, and spread the strain on a plate containing antibiotics. Since temperature-sensitive plasmids cannot replicate at high temperatures, strains from which plasmids have been eliminated cannot grow on plates containing antibiotics, but, with very low frequency, the poxB gene on the plasmid and the poxB gene on the chromosome. Recombinant strains appear.
  • the strain in which the recombinant DNA has been integrated into the chromosome undergoes recombination with the poxB gene sequence originally present on the chromosome, and two fusion genes of the chromosomal poxB gene and the deleted poxB gene are obtained. It is inserted into the chromosome with the other part of the recombinant DNA (vector part, temperature-sensitive replication origin and drug resistance marker) interposed therebetween.
  • the gene is dropped from the chromosomal DNA together with the vector portion (including the temperature-sensitive replication origin and drug resistance marker).
  • the normal poxB gene is left on the chromosomal DNA and the deleted poxB gene is cut out, and conversely, the deleted ach gene is left on the chromosomal DNA and the normal poxB gene is cut out. is there.
  • the cut DNA is retained in the cells in the form of a plasmid.
  • the poxB gene on the plasmid loses its cellular power along with the plasmid. Then, a strain in which the poxB gene has been disrupted can be obtained by selecting a strain in which the deleted poxB gene remains on the chromosome by PCR, Southern hydridation, or the like.
  • the same gene disruption can be performed by using a plasmid having no replication ability in coryneform bacteria instead of the above-mentioned temperature-sensitive plasmid.
  • a plasmid having no replication ability in coryneform bacteria a plasmid capable of replication in Escherichia coli is preferred, for example, pHSG299 (manufactured by Takara Bio Inc.) and pHSG399 (manufactured by Takara Bio Inc.).
  • coryneform bacteria may be irradiated with ultraviolet light or N-methyl-N'-nitro-N-ditoxin.
  • Examples of the method include a method in which a mutagen is used in a usual mutagenesis treatment such as rosogazine (NTG) or nitrous acid treatment, and a strain with reduced pyruvate oxidase activity is selected.
  • ratate dehydrogenase activity means an activity of catalyzing a reaction of reducing pyruvic acid to produce lactic acid using NADH as a coenzyme.
  • the reduced ratate detohydrogenase activity means that the LDH activity is reduced as compared to the non-modified LDH strain.
  • the LDH activity may be reduced as compared to the non-modified LDH strain or the wild strain, but is preferably reduced to 50% or less per cell, more preferably to 30% or less. It is particularly preferred that it is reduced to 10% or less per preferred bacterial cell. Further, the LDH activity may be completely lost.
  • the decrease in LDH activity can be confirmed by measuring the LDH activity by the method of L. Kanarek et al. (L. Kanarek and R ⁇ . Hill, J. Biol. Chem. 239, 4202 (1964)). .
  • the coryneform bacterium of the present invention can be obtained by producing a coryneform bacterium having a reduced LDH activity, and further modifying the coryneform bacterium so as to reduce the pyruvate oxidase activity.
  • the modification for decreasing the LDH activity and the modification for decreasing the pyruvate oxidase activity may be performed first.
  • the ldh gene for example, a gene having the sequence shown in SEQ ID NO: 43 can be used, and gene disruption and the like can be performed in the same manner as in the poxB gene.
  • any one of phosphotransacetylase hereinafter PTA
  • ACK acetate kinase
  • ACH acetyl CoA hydrase
  • the term "phosphotransacetylase (PTA) activity” refers to an activity of transferring phosphate to acetyl CoA and catalyzing a reaction for generating acetyl phosphate, and is an activity of acetate kinase.
  • ZE refers to the activity of catalyzing the reaction that produces acetic acid from acetylphosphoric acid and ADP.Acetyl-CoA nodose (ACH) refers to the activity of catalyzing the reaction that produces acetic acid from acetyl-CoA and water.
  • acyl phosphatase (ACP) refers to an activity of catalyzing a reaction of producing acetic acid or phosphoric acid or carboxylic acid and phosphoric acid from acetyl phosphate.
  • each enzyme for example, the following genes of Corynebacterium dartamicum registered in GenBank can be used.
  • NC_003450 complementary strand of 2936506-2937891 of NC-003450 (base numbers 956 to 1942 of SEQ ID NO: 45)
  • PTA activity has been reduced means that PTA activity has been reduced as compared to an unmodified PTA strain.
  • the PTA activity may be reduced as compared to the non-modified PTA strain or the wild-type strain, but is preferably reduced to 50% or less per cell, more preferably to 30% or less. It is particularly preferred that it is reduced to 10% or less per preferred bacterial cell. Further, the PTA activity may be completely deleted. The decrease in PTA activity can be confirmed by measuring PTA activity by the method of Klotzsch et al. (Klotzsch, HR, Meth Enzymol. 12, 381-386 (1969)).
  • the coryneform bacterium obtained can be obtained by preparing a coryneform bacterium having reduced POXB activity, and further modifying the coryneform bacterium to reduce PTA activity. However, the modification for decreasing the PTA activity and the modification for decreasing the POXB activity may be performed first.
  • ACK activity is decreased means that ACK activity is decreased as compared with a wild-type strain or an ACK-unmodified strain.
  • the ACK activity may be reduced as compared to the ACK non-modified strain or the wild-type strain, but is preferably reduced to 50% or less per cell compared to the ACK non-modified strain. It is particularly preferable that the concentration be reduced to 10% or less per more preferable bacterial cell. Further, the ACK activity may be completely lost.
  • the decrease in ACK activity can be confirmed by measuring the ACK activity according to the method of Ramponi et al. (Ramponi G "Meth. Enzymol. 42, 409-426 (1975)).
  • the coryneform bacterium can be obtained by constructing a coryneform bacterium with reduced POXB activity and further modifying the ACK activity to reduce ACK activity, provided that the modification for decreasing ACK activity and the modification for decreasing POXB activity are performed. Modification may be performed first.
  • ACH activity is reduced may be reduced as compared with a non-modified ACH strain or a wild-type strain. It is particularly preferred that the concentration is reduced to 50% or less per cell, more preferably 30% or less, and it is particularly preferred that the concentration is reduced to 10% or less per cell. Also, the ACH activity may be completely deficient. The decrease in ACH activity is determined by the method of Gergely J., et al. (Gergely, J., Hele. P. & Ramkrishnan. CV (1952) J. Biol. Chem. 198 p323-334). Can be confirmed.
  • a coryneform bacterium with reduced ACH and POXB activities can be obtained by constructing a coryneform bacterium with reduced ACH activity and further modifying it to reduce POXB activity.
  • any of the modification for decreasing the POXB activity and the modification for decreasing the ACH activity may be performed first.
  • acyl phosphatase (hereinafter ACP) activity is reduced means that ACP activity is reduced as compared with a wild-type strain or a non-modified ACP strain.
  • the ACP activity may be reduced as compared with the wild-type strain or the ACP non-modified strain, but is reduced to 50% or less per cell, more desirably 10% or less per cell, compared to the ACP non-modified strain. It is preferred that Also ACP activity may be completely absent.
  • the fact that the ACP activity was reduced can be confirmed by measuring the ACP activity by a method similar to the ACK activity described above (Ramponi G., Meth. Enzymol. 42, 409-426 (1975)). .
  • a coryneform bacterium with reduced ACH and ACP activities can be obtained by constructing a coryneform bacterium with reduced ACH activity and further modifying the coryneform bacterium to reduce ACP activity. However, either the modification for decreasing the ACP activity or the modification for decreasing the ACH activity may be performed first.
  • PC pyruvate carboxylase
  • the activity of pyruvate carboxylase is enhanced means that the activity of PC is increased with respect to a wild-type strain or an unmodified strain such as a parent strain.
  • the activity of PC can be measured by the method of Peters-Wendisch P.G et al. (Peters-Wendisch P.G. et al. Microbiology 143, 1095-1103 (1997)).
  • the pc gene encoding the PC protein used in the method of the present invention encodes a gene whose base sequence has already been determined or a protein having PC activity by the method described below.
  • a DNA fragment obtained by isolating a DNA fragment from a chromosome of a microorganism, animal or plant, and determining the base sequence can be used.
  • a gene synthesized according to the sequence can also be used.
  • the pyruvate carboxylase gene of Corynebacterium glutamicum ATCC13032 GenBank Accession No. NCgl0659 gene SEQ ID NO: 60
  • PC genes derived from the following organisms can also be used.
  • the DNA fragment containing the pc gene is inserted into an appropriate expression plasmid, for example, pUC118 (manufactured by Takara Bio Inc.), and then introduced into an appropriate host microorganism, for example, Escherichia coli JM109 (manufactured by Takara Bio Inc.). Can be expressed.
  • the expression of pyruvate carboxylase, which is the expressed pc gene product, is confirmed by measuring the PC activity of the transformant by the above-mentioned known method and comparing the non-transforming activity with the PC activity of the extracted crude enzyme solution. , Can be confirmed.
  • a DNA fragment containing the pc gene into an appropriate plasmid, for example, a plasmid vector containing at least a gene responsible for the replication and replication function of the plasmid in a coryneform bacterium, recombination capable of highly expressing pc in a coryneform bacterium
  • the promoter for expressing the pc gene is a promoter capable of being a promoter possessed by a coryneform bacterium, and is not limited to the base sequence for initiating transcription of the pc gene. If so, it could be a good promoter.
  • the plasmid vector into which the pc gene can be introduced is not particularly limited as long as it contains at least a gene that controls the replication and growth function in coryneform bacteria. Specific examples thereof include plasmid pCRY30 described in JP-A-3-210184; plasmids pCRY21, pCRY2KE and pCRY2KX described in JP-A-2-72876 and US Pat. No. 5,185,262.
  • a plasmid vector used in a coryneform bacterium host vector system includes a gene that controls the replication replication function of the plasmid in the coryneform bacterium and a gene in the coryneform bacterium.
  • those having a gene controlling the function of stabilizing a plasmid are preferred.
  • plasmids pCRY30, pCRY21, pCRY2KE, pCRY2KX, pCRY31, pCRY3KE and pCRY3KX are preferably used.
  • a coryneform bacterium with enhanced pc gene expression can be obtained. Transformation can be performed, for example, by the electric pulse method (Res. Microbiol, Vol. 144, p. 181-185, 1993).
  • the PC activity can also be enhanced by introducing, replacing, or amplifying a pc gene on the chromosome by a known homologous recombination method to achieve high expression.
  • By disrupting the pox gene in the thus obtained PC gene highly expressing strain it is possible to obtain a bacterial strain in which the PC activity is enhanced and the pyruvetoxidase activity is reduced. Either reduction of pyruvate oxidase activity or enhancement of PC activity may be performed first.
  • a bacterium modified so as to enhance its activity is particularly effective for producing substances, particularly for producing succinic acid.
  • succinic acid By culturing the coryneform bacterium obtained as described above in a medium, producing and accumulating succinic acid in the medium, and collecting succinic acid from the medium, succinic acid can be efficiently produced.
  • the above bacteria are used in the production reaction of succinic acid, those obtained by slant culture on a solid medium such as an agar medium may be directly used for the reaction, but the above bacteria are preliminarily cultured in a liquid medium (seed culture). It is preferable to use one that has been used. Bacteria that have been seed-cultured in this way can be produced by reacting the bacteria with an organic material while growing the same in a medium containing the organic material. Alternatively, the cells can be produced by collecting the cells obtained by growing the cells and reacting the cells with an organic material in a reaction solution containing an organic material.
  • aerobic coryneform bacteria In order to use Escherichia coli in the method of the present invention, it is preferred that the bacteria be cultured under ordinary aerobic conditions and then used in the reaction.
  • a medium used for the culture a medium usually used for culturing a microorganism can be used.
  • a general medium obtained by adding a natural nutrient source such as a meat extract, a yeast extract, or peptone to a composition comprising inorganic salts such as ammonium sulfate, potassium phosphate, and magnesium sulfate. it can.
  • a natural nutrient source such as a meat extract, a yeast extract, or peptone
  • a composition comprising inorganic salts such as ammonium sulfate, potassium phosphate, and magnesium sulfate.
  • a processed product of bacterial cells can also be used.
  • the treated cells include immobilized cells in which the cells are immobilized with acrylamide, carrageenan, etc., crushed cells, crushed cells, centrifuged supernatant, or supernatant treated with ammonium sulfate. A partially purified fraction and the like can be mentioned.
  • the organic raw material used in the production method of the present invention is not particularly limited as long as it is a carbon source capable of assimilating succinic acid by assimilation of the present microorganism.
  • galactose, ratatose, dalcose, funolectose, and glyceronorrhea are used.
  • carbohydrates such as sucrose, sucrose, starch, and cenatose; and fermentable carbohydrates such as glycerin, mannitol, xylitol, polyalcohols such as ribitol, and glucose, fructose and glycerol are preferred.
  • Glucose is particularly preferred.
  • starch saccharified solution, molasses and the like containing the above-mentioned fermentable carbohydrate are also used. These fermentable carbohydrates can be used alone or in combination.
  • concentration of the organic raw material used is not particularly limited, but it is advantageous to make it as high as possible without impairing the production of succinic acid, usually 5 to 30% ( 1 ⁇ ⁇ 7), preferably 10 to 10%.
  • the reaction is performed within the range of 20% ( 1 ⁇ 7). Further, the organic raw material may be additionally added in accordance with the decrease of the organic raw material with the progress of the reaction.
  • the reaction solution containing the organic raw material is not particularly limited, and a force medium using water, a buffer, a medium, or the like is most preferable.
  • the reaction solution is preferably a reaction solution containing a nitrogen source, an inorganic salt, and the like.
  • the nitrogen source is not particularly limited as long as the microorganism can assimilate and produce succinic acid, and specific examples thereof include ammonium salts, nitrates, urea, soybean hydrolyzate, and casein hydrolyzate. , Peptone, yeast extract, meat extract, corn steep liquor, and other various organic and inorganic nitrogen compounds.
  • Metal salts such as phosphates, sulfates, magnesium, potassium, manganese, iron, and zinc are used.
  • growth promoting factors such as vitamins such as biotin, pantothenic acid, inositol and nicotinic acid, nucleotides and amino acids are added as necessary.
  • the pH of the reaction solution is adjusted by adding sodium carbonate, sodium bicarbonate, potassium carbonate, potassium bicarbonate, magnesium carbonate, sodium hydroxide, calcium hydroxide, magnesium hydroxide, or the like. be able to. Since the pH in this reaction is usually pH 5 to 10, preferably pH 6 to 9.5, the pH of the reaction solution may be adjusted within the above range depending on the need for alkaline substances, carbonates, urea, etc., even during the reaction. Adjust within.
  • the medium preferably contains carbonate ions, bicarbonate ions or carbon dioxide (carbon dioxide). Carbonate or bicarbonate ions are also supplied with magnesium carbonate, sodium carbonate, sodium bicarbonate, potassium carbonate, potassium bicarbonate power, which can also be used as a neutralizing agent. It can also be supplied from these salts or carbon dioxide. Specific examples of the carbonate or bicarbonate salts include magnesium carbonate, ammonium carbonate, sodium carbonate, potassium carbonate, ammonium bicarbonate, sodium bicarbonate, potassium bicarbonate and the like. The carbonate ions and bicarbonate ions are added at a concentration of 0.001 to 5M, preferably 0.1 to 3M, and more preferably 1 to 2M. When carbon dioxide is contained, 50 mg to 25 g, preferably 100 mg to 15 g, and more preferably 150 mg to 10 g per liter of the solution is contained.
  • the optimum growth temperature of the bacteria used in this reaction is usually 25 ° C to 35 ° C.
  • the temperature during the reaction is usually 25 ° C to 40 ° C, preferably 30 ° C to 37 ° C.
  • the amount of the cells used for the reaction is not particularly limited, but 1 to 700 gZL, preferably 10 to 500 gZL, more preferably 20 to 400 gZL is used.
  • the reaction time is preferably 1 hour to 168 hours, more preferably 3 hours to 72 hours.
  • the reaction for producing succinic acid may be carried out with aeration and stirring, or may be carried out under anaerobic conditions without aeration and without supply of oxygen.
  • the anaerobic condition means that the reaction is performed with the dissolved oxygen concentration in the solution kept low.
  • the dissolved oxygen concentration is 0 to 2 ppm, preferably 0 to 2 ppm. It is desirable to carry out the reaction at about 1 ppm, more preferably at 0 to 0.5 ppm.
  • Methods for this purpose include, for example, sealing the container and reacting without ventilation, adding a sulfite, supplying an inert gas such as nitrogen gas, and causing the reaction, and venting an inert gas containing carbon dioxide. Can be used.
  • Succinic acid accumulated in the reaction solution can be separated and purified from the reaction solution according to a conventional method. Specifically, after removing solids such as bacterial cells by centrifugation, filtration, etc., desalting with ion-exchange resin, etc., the succinic acid is separated and purified by crystallization or column chromatography. Can be.
  • a succinic acid-containing polymer can be produced by producing succinic acid by the above-mentioned method of the present invention and then conducting a polymerization reaction using the obtained succinic acid as a raw material.
  • the succinic acid-containing polymer may be a homopolymer or a copolymer with another polymer raw material.
  • the succinic acid produced in the present invention is processed into polymers such as polyesters and polyamides. Can be used.
  • succinic acid-containing polymer examples include a succinic polyester obtained by polymerizing a diol such as butanediol and ethylene glycol and succinic acid, and a succinic acid obtained by polymerizing a diamine such as hexamethylene diamine and succinic acid. Acid polyamide and the like.
  • succinic acid or a composition containing the succinic acid obtained by the production method of the present invention can be used for food additives, pharmaceuticals, cosmetics, and the like.
  • the sacB gene was obtained by PCR using chromosomal DNA of Bacillus subtilis as type I and SEQ ID NOS: 1 and 2 as primers.
  • the PCR reaction was performed using LA taq (TaKaRa) for 1 cycle of incubation at 94 ° C for 5 minutes, followed by denaturation at 94 ° C for 30 seconds, association at 49 ° C for 30 seconds, and extension at 72 ° C for 2 minutes. The powerful cycle was repeated 25 times.
  • the resulting PCR product was purified by a conventional method, digested with Bglll and BamHI, and subjected to blunting. This fragment was digested with Avail of pHSG299 and inserted into the blunted site.
  • a plasmid in which the Smal site in the kanamycin resistance gene sequence present on PBS3 was disrupted by base substitution without amino substitution was obtained by crossover PCR.
  • PCR is performed using pBS3 as a type II and synthetic DNAs of SEQ ID NOS: 3 and 4 as primers to obtain an amplification product on the N-terminal side of the kanamycin resistance gene.
  • PCR was performed using pBS3 as type III and the synthesized DNAs of SEQ ID NOS: 5 and 6 as type III.
  • the PCR reaction was performed using Pyrobest DNA Polymerase (Takara Bio Inc.) for 5 cycles at 98 ° C for 5 minutes, followed by denaturation at 98 ° C for 10 seconds, association at 57 ° C for 30 seconds, and extension at 72 ° C for 1 minute.
  • the desired PCR product can be obtained by repeating the following cycle 25 times.
  • SEQ ID NOS: 4 and 5 are partially complementary, and the Smal site present in this sequence is destroyed by base substitution without amino acid substitution.
  • the above kanamycin resistance gene N-terminal and C-terminal gene products are mixed so as to be almost equimolar, and this is mixed.
  • PCR was performed using the synthetic DNAs of SEQ ID NOS: 3 and 6 as primers to obtain a mutated Km-resistant gene amplification product.
  • the PCR reaction uses Pyrobest DNA Polymerase (Takara Bio Inc.), after one cycle of incubation at 98 ° C for 5 minutes, denaturation 98 ° C 10 seconds, association 57 ° C 30 seconds, extension 72 ° C 1.5 minutes.
  • the desired PCR product can be obtained by repeating the cycle 25 times.
  • the PCR product was purified by a conventional method, digested with Banll, and inserted into the Banll site of pBS3 described above.
  • the gene fragment of ratato dehydrogenase (hereinafter abbreviated as ldh gene) derived from Brevibatadium ratatofamentum 2256 lacking the ORF is a previously released base sequence of the gene of Corynebacterium glutamicum ATCC13032 (ATCC13032). It was obtained by crossover PCR using synthetic DNA designed as a primer with reference to GenBank Database Accession No. NC_003450 (NCgl2810). Specifically, using the chromosomal DNA of Brevibacterium lactofermentum 2256 strain as type I, PCR was performed by a conventional method using the synthetic DNAs of SEQ ID NOs: 7 and 8 as primers to amplify the ldh gene N-terminal amplification product.
  • PCR was carried out by a conventional method using the genomic DNA of Brevibata terium 'ratatophamentum 2256 strain genomic DNA and the synthetic DNAs of SEQ ID NOS: 9 and 10 as primers. I got it.
  • SEQ ID NOS: 8 and 9 are complementary to each other and have a structure in which the entire sequence of the ORF of ldh is deleted.
  • the 2256 strains of Brevi Bata Terimu 'Ratoto Armamentum' can be obtained from the American 'Type-Carcia I' collection (ATCC) (Address ATCC, PO Box 1549, Manassas, VA 20108, United States of America) .
  • ATCC American 'Type-Carcia I' collection
  • the N-terminal and C-terminal gene products of the above ldh are mixed so as to be almost equimolar, and this is sequenced as ⁇ -type.
  • PCR was performed by a conventional method using the synthetic DNAs of Nos. 11 and 12 as primers to obtain a mutagenized ldh gene amplification product.
  • the resulting PCR product was purified by a conventional method, digested with Sail, and inserted into the above-mentioned Sail site of PBS4S.
  • FIG. 3 shows a construction diagram of the plasmid.
  • Brevibata terium 'ratatofarmentum 2256 strain was transformed by the electric pulse method using a high concentration of plasmid P ⁇ ldh56-l, and CM-Dex medium (25 g / L glucose, 10g / L, Yeast Extratato 10g / L, KH PO lg / L ⁇ MgSO ⁇ 7 ⁇ O 0.4g / L ⁇ FeSO ⁇ 7 ⁇ ⁇ 0.01g / L, MnSO ⁇ 7 ⁇ ⁇ 0.01g / L
  • these first fibrils were cultured overnight at 31.5 ° C in a CM-Dex liquid medium containing no kanamycin and appropriately diluted, and then kanamycin-free 10% Dex-S10 medium containing sucrose (sucrose 10 g / L, polypeptone 10 g / L, yeast extratato 10 g / L, KH
  • the strains thus obtained include those in which the ldh gene has been replaced with a mutant derived from pAldh56-l and those in which the ldh gene has returned to the wild type. Whether the ldh gene is mutant or wild-type can be easily confirmed by directly subjecting cells obtained by culturing on Dex-S10 agar medium to PCR and detecting the ldh gene. it can. When the ldh gene was analyzed using primers for amplifying the ldh gene (SEQ ID NO: 7 and SEQ ID NO: 10), it was found that the PCR product with a smaller PCR product size than the chromosomal DNA of the 2256 strain was degraded.
  • Brevibata terium "ratatophamentum 2256” The gene fragment lacking the ORF of the pyruvate oxidase gene (hereinafter referred to as poxB) was obtained from the previously published Corynebacterium daltamicum ATCC13032.
  • Synthetic DNA designed with reference to the nucleotide sequence of the gene (NCgl2521 of GenBank Accession No. NC003450) was obtained by crossover PCR using as a primer. Specifically, PCR was performed using Brevibata teratium ratatophamentum 2256 strain genomic DNA as type I and the synthetic DNAs of SEQ ID NOS: 29 and 30 as primers to obtain an N-terminal amplification product of poxB gene. .
  • PCR is performed using genomic DNA of Brevibata terium 'ratatofamentumum 2256 strain as type III and synthetic DNAs of SEQ ID NOS: 31 and 32 as primers. SEQ ID NOS: 30 and 31 are complementary to each other.
  • KOD-plus- TOYOBO
  • the cycle of elongation at 68 ° C for 40 seconds was repeated 30 times.
  • PCR was carried out using the synthetic DNAs of SEQ ID NOS: and 34 as primers to obtain a mutated poxB gene amplification product.
  • the PCR reaction was performed using KOD-plus- (TOYOBO), after one cycle of incubation at 94 ° C for 2 minutes, followed by denaturation at 94 ° C for 10 seconds, association at 55 ° C for 30 seconds, and extension at 68 ° C for 70 seconds. This cycle was repeated 30 times to obtain the target mux-introduced poxB gene amplification product.
  • the generated PCR product was purified by a conventional method, digested with Xbal, and inserted into the Xbal site of PBS4S constructed in Example 1 (B) above.
  • transformation was performed using a combinatorial cell of Escherichia coli JM109 (manufactured by Takara Bio Inc.), and LB containing 100 ⁇ LB of IPTG, 40 ⁇ g / ml of X-Gal and 25 / zg / ml of kanamycin was used. It was spread on a medium and cultured overnight. Then appear The isolated white colonies were picked and separated into single colonies to obtain transformants. Plasmids were extracted from the resulting transformants, and those into which the desired PCR product had been inserted were named pBS4S :: ⁇ poxB.
  • Figure 4 shows the construction process of pBS4S :: ⁇ .
  • pBS4S :: ⁇ poxB obtained in ( ⁇ ) above does not contain a region that enables autonomous replication in coryneform bacterium cells, it is extremely low frequency when transforming coryneform bacterium with this plasmid.
  • the strain Brevibataterium 'ratatophamentum 2256 ⁇ (Wh) strain constructed in Example 2 was transformed by a high-concentration plasmid pBS4S :: ⁇ poxB by an electric pulse method, and kanamycin 25 ⁇ g / ml was transformed.
  • the cells were applied to a CM-Dex medium containing the cells and cultured at 31.5 ° C for about 30 hours.
  • the strain grown on this medium underwent homologous recombination between the poxB gene fragment of this plasmid and the same gene on the genome of Brevibataterium 'ratatafamentum 2256 ⁇ (Wh) strain, resulting in the same genome.
  • the kanamycin resistance gene and the SacB gene derived from the plasmid have been inserted.
  • these first fibrils were cultured overnight at 31.5 ° C in a CM-Dex liquid medium containing no kanamycin and appropriately diluted. It was spread on Dex-S10 medium containing sucrose, and cultured at 31.5 ° C for about 30 hours.
  • the strains thus obtained include those in which the poxB gene has been replaced with a mutant derived from pBS4S :: A poxB and those in which the poxB has returned to the wild type. Whether the poxB gene is mutant or wild-type can be easily confirmed by directly subjecting cells obtained by culturing on Dex-S10 agar medium to PCR and detecting the poxB gene. it can. Analysis of the poxB gene using primers for PCR amplification (SEQ ID NO: 29 and SEQ ID NO: 32) should reveal a 2.4 kb DNA fragment for the wild type and a 1.2 kb DNA fragment for the mutant with the deletion region.
  • sucrose-insensitive strain As a result of analyzing the sucrose-insensitive strain by the above method, a strain having only the mutant gene was selected, and the strain was named 2256A (Wh, poxB) strain. This poxB disruption strain Also called.
  • Production culture was performed. The culture was shaken at 31.5 ° C for about 48 hours to terminate the culture before the sugar in the medium was exhausted.
  • the 2256 ⁇ (ldh, poxB) strain had a succinic acid production equivalent to that of the parent 2256 ⁇ (Wh) strain compared to its parent strain, 2256 ⁇ (Wh).
  • acetic per acid 2256 ⁇ (Wh, p 0X B ) is about 1/3 to 2/3 becomes significantly acetate strain-produced. From these results, it was shown that the elimination or reduction of poxB activity was effective in reducing acetic acid under anaerobic conditions.
  • the ORF-deleted gene fragment of the acetate kinase gene (hereinafter referred to as ack) of Brevibata terium 'ratatofamentum 2256 strain was obtained by using the previously disclosed gene of Corynebacterium glutamicum ATCC13032 (NCgl2656 of GenBank Database Accession No. NC_003450; SEQ ID NO: 45), and the DNA was designed by crossover PCR using as a primer. Specifically, PCR was performed using Brevibacterium 'ratatophamentum 2256 strain genomic DNA as type I and synthetic DNAs of SEQ ID NOS: 13 and 14 as primers to obtain an amplification product on the N-terminal side of the ack gene.
  • PCR was performed using genomic DNA of strain 2256 strain Brevibata terium 'lactofermentum' as a primer and synthetic DNAs of SEQ ID NOS: 15 and 16 as primers.
  • SEQ ID NOs: 14 and 15 are partially complementary.
  • the PCR reaction was carried out using KOD-plus- (TOYOBO) for one cycle of incubation at 94 ° C for 2 minutes, and then N-terminal side was denatured at 94 ° C for 10 seconds, association at 55 ° C for 30 seconds, and extended 68
  • the cycle at 30 ° C for 30 seconds and the cycle for denaturation at 94 ° C for 10 seconds, association at 55 ° C for 30 seconds, and extension at 68 ° C for 2 minutes were repeated 30 times on the C-terminal side.
  • the terminal and C-terminal gene products are mixed so that they are almost equimolar, and the resulting mixture is subjected to PCR using the synthetic DNAs of SEQ ID NOS: 17 and 18 as primers to obtain a mutated ack gene amplification product.
  • the PCR reaction was performed using KOD-plus- (manufactured by Toyobo Co., Ltd.) after one cycle of incubation at 94 ° C for 2 minutes, followed by denaturation at 94 ° C for 10 seconds, association at 55 ° C for 30 seconds, and extension at 68 ° C for 2.5 minutes. This cycle was repeated 30 times to obtain the target mutated ack gene amplification product.
  • the generated PCR product was purified by a conventional method, digested with Xbal, and inserted into the Xbal site of PBS5T constructed in Example 1 (C) above.
  • transformation was performed using a combinatorial cell of Escherichia coli JM109 (manufactured by Takara Bio Inc.), and an LB medium containing IPTG 100 ⁇ M, X-Gal 40 ⁇ g / ml and kanamycin 25 g / ml. And cultured. Thereafter, the emerged white colonies were picked and separated into single colonies to obtain transformants.
  • a plasmid was extracted from the resulting transformant, and the one into which the desired PCR product had been inserted was named pBS5T :: Aack.
  • Figure 6 shows the construction process of pBS5T :: A ack.
  • the origin of replication of coryneform bacteria in pBS5T :: ⁇ ack obtained in (A) above is temperature-sensitive.
  • the plasmid is capable of autonomous replication in coryneform bacteria at 25 ° C, but not at 31.5 ° C (or 34 ° C).
  • Brevibataterium 'ratatophamentum 2256 ⁇ (Wh) strain was transformed by an electric pulse method, applied to a CM-Dex medium containing 25 ⁇ g / ml of kanamycin, and incubated at 25 ° C. ⁇ After culturing, the colonies that appeared were isolated and used as transformants. This transformant carries the plasmid.
  • transformants were cultured at ⁇ 34 ° C. in the above CM-Dex medium without kanamycin, diluted appropriately, and spread on a CM-Dex medium containing 25 ⁇ g / ml of kanamycin.
  • the cells were cultured at ° C for about 30 hours.
  • the strain grown on this medium underwent homologous recombination between the ack gene fragment of the plasmid and the same gene on the genome of Brevibataterium ratatofamentum 2256 ⁇ (Wh) strain, and as a result, the plasmid
  • the kanamycin resistance gene and SacB gene derived from E. coli are inserted.
  • the strains thus obtained include those in which the ack gene has been replaced with a mutant derived from pBS5T :: A ack and those in which the ack gene has returned to the wild type. Whether the ack gene is mutant or wild type can be easily confirmed by directly subjecting the cells obtained by culturing on Dex-S10 agar medium to PCR and detecting the ack gene. it can. Analysis of the ack gene using primers for PCR amplification (SEQ ID NO: 13 and SEQ ID NO: 16) should reveal a 3.7 kb DNA fragment for the wild type and a 2.5 kb DNA fragment for the mutant with the deletion region. . As a result of analyzing the sucrose-insensitive strain by the above method, a strain having only the mutant gene was selected, and the strain was named 2256A (Wh, ack).
  • the ORF of acetate kinase (ack) and phosphotransacetylase gene (hereinafter referred to as pta) of Brevibata terium 'ratatophamentum 2256 strain has an operon structure, and these ORFs are deleted simultaneously. It is possible to do.
  • These gene fragments were obtained by synthesizing a synthetic DNA designed with reference to the nucleotide sequence of the gene of Corynebate teratium 'Dartamicum ATCC13032 (NCgl2656 and 2657 of GenBank Database Accession No. Obtained by crossover PCR used as a primer.
  • PCR was performed using Brevibata terium 'ratatophamentum 2256 genomic DNA as type I and the synthetic DNAs of SEQ ID NOs: 19 and 20 as primers to obtain an N-terminal amplification product of the pta gene.
  • PCR was performed using Brevibata terium 'ratatophamentum 2256 genomic DNA as type I and synthetic DNAs of SEQ ID NOS: 21 and 16 as primers.
  • SEQ ID NOs: 20 and 21 are partially complementary.
  • the PCR reaction was carried out using KOD-plus- (TOYOBO) for 2 cycles of incubation at 94 ° C for 2 minutes.
  • the N-terminal side was denatured at 94 ° C for 10 seconds, associated at 55 ° C for 30 seconds, and extended.
  • Power cycle at 68 ° C for 30 seconds, C-terminal denaturation at 94 ° C for 10 seconds, association at 55 ° C for 30 seconds, extension at 68 ° C
  • Each cycle with 2 minutes of force was repeated 30 times.
  • PCR was performed using the synthetic DNAs of SEQ ID NOS: 22 and 18 as primers to obtain the amplified pta-ack gene amplification product.
  • KOD-plus- TOYOBO
  • incubation at 94 ° C for 2 minutes, followed by denaturation at 94 ° C for 10 seconds, association at 55 ° C for 30 seconds, and extension at 68 ° C for 2.5 minutes.
  • the cycle was repeated 30 times to obtain the target mutagenized pta-ack gene amplified product.
  • the resulting PCR product was purified by a conventional method, digested with Xbal, and inserted into the Xbal site of pBS5T.
  • transformation was carried out using a competent cell of Escherichia coli JM109 (manufactured by Takara Bio Inc.), and an LB medium containing IPTG 100 M, X-Gal 40 g / ml and kanamycin 25 g / ml was used. And cultured overnight. Thereafter, the emerged white mouth was caught and single colonies were separated to obtain a transformant.
  • pBS5T Apta-ack
  • FIG. 1 A plasmid was extracted from the obtained transformant, and one into which the desired PCR product had been inserted was named pBS5T :: Apta-ack.
  • the origin of replication of coryneform bacteria in pBS5T is temperature-sensitive.
  • the plasmid is capable of autonomous replication in coryneform bacteria at 25 ° C, but not at 31.5 ° C (or 34 ° C).
  • the plasmid was used to transform Brevibataterium 'ratatophamentum 2256 A (ldh) strain by the electric pulse method, and the transformant was applied to a CM-Dex medium containing 25 ⁇ g / ml of kanamycin and incubated at 25 ° C. ⁇ After culturing, the colonies that appeared were isolated and used as transformants. This transformant carries the plasmid.
  • transformants were cultured at ⁇ 34 ° C. in a CM-Dex liquid medium without kanamycin, diluted appropriately, and spread on a CM-Dex medium containing 25 ⁇ g / ml of kanamycin.
  • the cells were cultured at ° C for about 30 hours.
  • the strain grown on this medium undergoes homologous recombination between the pta-ack gene fragment of the plasmid and the same gene on the genome of Brevibataterium 'ratatophamentum 2256 ⁇ (Wh) strain, resulting in the same genome.
  • the kanamycin resistance gene and SacB gene derived from the plasmid have been inserted.
  • these first fibrous recombinants were prepared without kanamycin! / ⁇ CM-Dex liquid medium. After culturing at 31.5 ° C and appropriately diluting, the cells were applied to Dex-S10 medium containing 10% sucrose without kanamycin, and cultured at 31.5 ° C for about 30 hours. As a result, about 50 strains that were considered to be sucrose-insensitive by dropping the SacB gene by the second homologous recombination were obtained.
  • the strains obtained in this manner include those that have been replaced by mutants derived from their pta and ack gene powers 3 ⁇ 4BS5T :: A pta-ack and those that have returned to the wild type.
  • Whether the ack gene is a mutant or wild type can be easily confirmed by directly subjecting the cells obtained by culturing on Dex-S10 agar medium to PCR and detecting pta and the ack gene. Can be confirmed.
  • Analysis using primers (SEQ ID NO: 19 and SEQ ID NO: 16) for PCR amplification of the pta-ack gene should reveal a DNA fragment of 5.0 kb in the wild type and 2.7 kb in the mutant with the deletion region. is there.
  • sucrose-insensitive strain As a result of analysis of the sucrose-insensitive strain by the above method, a strain having only the mutant gene was selected, and the strain was named 2256A (ldh, pta, ack).
  • the gene fragment lacking the ORF of the pyruvate oxidase gene (hereinafter referred to as poxB) was obtained from the previously published Corynebacterium daltamicum ATCC13032.
  • poxB pyruvate oxidase gene
  • the DNA was obtained by crossover PCR using as a primer a synthetic DNA designed with reference to the nucleotide sequence of the gene (NCgl2521 of GenBank Database Accession No. NC-003450; SEQ ID NO: 48).
  • PCR was performed using genomic DNA of Brevibata terium 'ratatophamentum 2256 strain genomic DNA as a primer and the synthetic DNAs of SEQ ID NOS: 23 and 24 as primers to obtain an amplified product at the N-terminal side of the poxB gene.
  • PCR is performed using genomic DNA of Brevibata terium 'ratatofamentum 2256 strain type II and synthetic DNAs of SEQ ID NOS: 25 and 26 as primers. SEQ ID NOS: 24 and 25 are complementary to each other.
  • PCR reaction KOD Using plus- (TOYOBO), one cycle of incubation at 94 ° C for 2 minutes on both N-terminal side and C-terminal side, denaturation 94 ° C 10 seconds, association 55 ° C 30 seconds, extension 68 ° C A cycle of forty seconds was repeated 30 times.
  • the above-mentioned poxB N-terminal and C-terminal gene products were mixed so as to be approximately equimolar, respectively, and the resulting mixture was designated as ⁇ type and SEQ ID NO: 27.
  • PCR was performed using the synthetic DNAs of the above and primers as primers to obtain a mutated poxB gene amplification product.
  • the PCR reaction was performed using KOD-plus- (TOYOBO), after one cycle of incubation at 94 ° C for 2 minutes, followed by denaturation at 94 ° C for 10 seconds, association at 55 ° C for 30 seconds, and extension at 68 ° C for 70 seconds. This cycle was repeated 30 times to obtain the target mux-introduced poxB gene amplification product.
  • the generated PCR product was purified by a conventional method, digested with Xbal, and inserted into the Xbal site of PBS5T constructed in Example 1 (C) above.
  • transformation was carried out using a combinatorial cell of Escherichia coli JM109 (manufactured by Takara Bio Inc.), and LB medium containing IPTG 100 ⁇ ⁇ , X-Gal 40 ⁇ g / ml and kanamycin 25 g / ml was used. And cultured overnight. After that, the emerged white colonies were picked and separated into single colonies to obtain transformants. Plasmids were extracted from the resulting transformants, and those into which the desired PCR product had been inserted were named pBS5T :: ⁇ poxB.
  • the construction process of pBS5T :: ⁇ is shown in FIG.
  • the origin of replication of coryneform bacteria in pBS5T :: ⁇ poxB obtained in (B) above is temperature-sensitive.
  • the plasmid is capable of autonomous replication in coryneform bacterium cells at 25 ° C and becomes incapable of autonomous replication at a power of 31.5 ° C (or 34 ° C).
  • the plasmid was used to transform Brevibataterium 'ratatophamentum 2256 A (ldh, pta, ack) strain by the electric pulse method, and the transformant was applied to a CM-Dex medium containing 25 ⁇ g / ml of kanamycin.
  • the cells were cultured at 25 ° C for 2 ⁇ , and the resulting colonies were isolated and used as transformants. This transformant should carry the plasmid.
  • these first recombinants were cultured in CM-Dex liquid medium without kanamycin at 31.5 ° C, diluted appropriately, and kanamycin-free! / ⁇ Dex containing 10% sucrose.
  • the cells were applied to -S10 medium and cultured at 31.5 ° C for about 30 hours. As a result, about 50 strains that were considered to be sucrose-insensitive due to the loss of the SacB gene due to the second homologous recombination were obtained.
  • the strains thus obtained include those in which the poxB gene has been replaced by a mutant derived from pBS5T :: A poxB and those in which the poxB gene has returned to the wild type. Whether the acetate kinase gene is mutant or wild type can be confirmed by directly subjecting cells obtained by culturing on Dex-SlO agar medium to PCR and detecting the poxB gene. It can be easily checked. When the poxB gene is analyzed using primers for PCR amplification (SEQ ID NO: 23 and SEQ ID NO: 26), a DNA fragment of 2.4 kb can be detected in the wild type and a 1.2 kb DNA fragment can be detected in the mutant having the deletion region.
  • strain having only the mutant gene was selected, and the strain was named 2256A (Wh, pta, ack, poxB). This strain is also called pta, ack, poxB-disrupted strain.
  • PCR is performed using Brevibata terium 'ratatophamentum 2256 genomic DNA as a type I, and the synthetic DNAs of SEQ ID NOS: 35 and 36 as primers to obtain an amplification product on the C-terminal side of the ach gene.
  • PCR is performed using Brevibata terium 'ratatophamentum 2256 strain genomic DNA as a type I and synthetic DNAs of SEQ ID NOS: 37 and 38 as primers.
  • SEQ ID NOs: 36 and 37 are complementary to each other.
  • PCR was carried out using the synthetic DNAs of (1) and (4) as primers to obtain mutated ach gene amplification products.
  • the PCR reaction was carried out using KOD-plus- (TOYOBO) for 2 cycles of incubation at 94 ° C for 2 minutes, followed by denaturation at 94 ° C for 10 seconds, association at 55 ° C for 30 seconds, and extension at 68 ° C for 90 seconds. Another cycle was repeated 30 times to obtain the target mutated ach gene amplification product.
  • the resulting PCR product was purified by a conventional method, digested with Xbal, and inserted into the Xbal site of pBS4S constructed in Example 1 (B) above.
  • Brevibata terium 'ratatophamentum, 2256 A (Wh, pta, ack, poxB) and 2256 strains were transformed by the electric pulse method using high concentration plasmid pBS4S :: ⁇ ach, and kanamycin 25 ⁇ g / ml of CM-Dex medium and cultured at 31.5 ° C for about 30 hours.
  • the strains grown on this medium contained the ach gene fragment of the plasmid and Brevibacterium 'ratatofamentum 2256 A (ldh), 2256 A (ldh, pta, ack) and 2256 A (ldh, pta, ack, poxB).
  • the strains thus obtained include those in which the ach gene has been replaced by a mutant derived from pBS4S :: A ach and those in which the ach gene has returned to the wild type. Whether the ach gene is mutant or wild-type can be easily confirmed by directly subjecting cells obtained by culturing on Dex-SlO agar medium to PCR and detecting the ach gene. it can. Analysis using the primers (SEQ ID NO: 35 and SEQ ID NO: 38) for PCR amplification of the ach gene should reveal a DNA fragment of 2.9 kb in the wild type and 1.4 kb in the mutant with the deletion region. .
  • sucrose-insensitive strain As a result of analyzing the sucrose-insensitive strain by the above method, a strain having only the mutant gene was selected, and the strain obtained from the 2256 A (ldh, pta, ack, poxB) strain was transformed into 2256 ⁇ (ldh , pta, ack, poxB, ach) strains. This strain is also called ach, pta, ack, poxB disruptant.
  • acp acetyl phosphatase gene
  • PCR is performed using genomic DNA of Brevibata terium 'ratatophamentum 2256 strain ⁇ as a type II and synthetic DNAs of SEQ ID NOS: 54 and 55 as primers to obtain an amplification product on the C-terminal side of the acp gene.
  • PCR is performed using Brevibata terium 'ratatophamentum 2256 genomic DNA as a template and synthetic DNAs of SEQ ID NOs: 56 and 57 as primers.
  • SEQ ID NOS: 30 and 31 are complementary to each other.
  • the PCR reaction was performed using KOD-plus- (manufactured by Toyobo Co., Ltd.), after 1 cycle of incubation at 94 ° C for 2 minutes on both N-terminal side and C-terminal side, denaturation 94 ° C for 10 seconds, association 55 ° C A cycle of 30 seconds and elongation at 68 ° C for 35 seconds was repeated 30 times.
  • the acp N-terminal and C-terminal gene products were mixed so as to be almost equimolar, respectively, and the resulting mixture was designated as SEQ ID NO.
  • PCR was performed using the synthetic DNAs of 58 and 59 as primers to obtain a mutation-introduced acp gene amplification product.
  • the generated PCR product was purified by a conventional method, digested with Xbal, and inserted into the Xbal site of PBS5T constructed in Example 1 (C) above. Using this DNA, transformation was performed using a combinatorial cell of Escherichia coli JM109 (manufactured by Takara Bio Inc.), and LB containing 100 ⁇ LB of IPTG, 40 ⁇ g / ml of X-Gal and 25 / zg / ml of kanamycin was used. It was spread on a medium and cultured overnight. After that, the emerged white colonies were picked and separated into single colonies to obtain transformants.
  • FIG. 10 shows the construction process of pBS5T :: A acp.
  • pBS5T :: ⁇ acp obtained in (A) above does not contain a region that enables autonomous replication in coryneform bacterium cells, it is extremely low frequency when coryneform bacterium is transformed with this plasmid.
  • Brevibata terium 'ratatophamentum 2256 A (ldh, pta, ack, poxB) strain is transformed by the electric pulse method using a high concentration of plasmid PBS5T :: ⁇ acp and contains 25 ⁇ g / ml of kanamycin.
  • the cells were applied to a CM-Dex medium and cultured at 31.5 ° C for about 30 hours.
  • the strain grown on this medium was subjected to homologous recombination between the acp gene fragment of the plasmid and the same gene on the genome of Brevibataterium 'lactofermentum 2256A (ldh, pta, ack, poxB) strain.
  • the kanamycin resistance gene and the SacB gene derived from the plasmid are inserted into the same genome!
  • the strains thus obtained include those in which the acp gene has been replaced by a mutant derived from pBS5T :: A acp and those in which the wild-type has been returned. Whether the acp gene is mutant or wild type can be easily confirmed by directly subjecting cells obtained by culturing on Dex-S10 agar medium to PCR and detecting the acp gene. it can.
  • the acp gene is analyzed using primers for PCR amplification (SEQ ID NO: 54 and SEQ ID NO: 57), a DNA fragment of 1.3 kb should be recognized in the wild type, and a l.Okb DNA fragment should be recognized in the mutant having the deletion region. is there.
  • succinic acid production culture was carried out with a silicone stopper tightly closed. The culture was shaken at 31.5 ° C for about 24 hours, and the culture was terminated before the sugar in the medium was exhausted. After completion of the culture, the accumulated amount of succinic acid and by-product acetic acid in the culture solution was analyzed by liquid chromatography after appropriately diluting the culture solution.
  • the column used was two Shim-pack SCR-102H (Simazu) connected in series, and the sample was eluted at 40 ° C using 5 mM p-toluenesulfonic acid.
  • the accumulated amount of succinic acid and by-product acetic acid in the culture solution was analyzed by liquid chromatography after appropriately diluting the culture solution.
  • the column used was two Shim-pack SCR-102H (Simazu) connected in series, and the sample was eluted at 40 ° C. using 5 mM p-toluenesulfonic acid.
  • the eluate is neutralized with a 20 mM Bis-Tris aqueous solution containing 5 mM p-toluenesulfonic acid and 100 ⁇ M EDTA, and succinic acid and by-product acetic acid are measured by measuring the electric conductivity with CDD-IOAD (Simazu). It was measured. Table 3 shows the results.
  • the present invention is useful for fermentative production of succinic acid.
  • Succinic acid is useful as a raw material for biodegradable polymers or as a raw material for foods, pharmaceuticals, cosmetics, and the like.

Abstract

　コハク酸生産能を有し、ピルベートオキシダーゼの活性が低下するように改変されたコリネ型細菌を用いてコハク酸を生産する。

Description

明 細 書
コハク酸生産菌及びコハク酸の製造方法
技術分野
[0001] 本発明は、発酵工業に関し、コリネ型細菌を利用した発酵法によりコハク酸を効率 よく製造する方法に関する。
背景技術
[0002] コハク酸などの非ァミノ有機酸を発酵により生産する場合、通常、
Anaerobiospirillum (アナエロビォスピリラム）属、 Actinobacillus (ァクチノバチルス）属 等の嫌気性細菌が用いられている (特許文献 1、 2、又は非特許文献 1参照)。嫌気 性細菌を用いる場合は、生産物の収率が高いが、その一方では、増殖するために多 くの栄養素を要求するために、培地中に多量の CSL (コーンスティープリカ一）などの 有機窒素源を添加する必要がある。これらの有機窒素源を多量に添加することは培 地コストの上昇をもたらすだけでなぐ生産物を取り出す際の精製コストの上昇にもつ ながり経済的でない。
[0003] コリネ型細菌のような好気性細菌を好気性条件下で一度培養し、菌体を増殖させ た後、集菌、洗浄し、静止菌体として酸素を通気せずにコハク酸を生産する方法も知 られている（特許文献 3又は 4参照)。この場合、菌体を増殖させるに当たっては、有 機窒素の添加量が少なくてよぐ簡単な培地で十分増殖できるため経済的ではある 力 目的とするコハク酸の生成量、生成濃度、及び菌体当たりの生産速度の向上、 製造プロセスの簡略ィ匕等改善の余地があった。
[0004] また、コリネ型細菌を代表とする好気性細菌を酸素制限条件で培養を行うと乳酸、 酢酸等の目的物質以外の有機酸が副生物として過剰に蓄積し、菌体生育が抑制さ れ、発酵生産性が大幅に低下する。また、副生物の有機酸を中和するためのカウン ターイオンも過剰に必要となり、経済的でない。このような課題を解決するために、副 生乳酸に関してはラタテートデヒドロゲナーゼ活性が低減したコリネ型細菌を用いるこ とにより、その低減ィ匕が行われている（特許文献 5参照)。
[0005] しかし、上記ラタテートデヒドロゲナーゼ活性の低減したコリネ型細菌でも酢酸が著 量副生する。ェシエリヒア属細菌においては、これまでに培養液中の酢酸低減の解 決手段として、酢酸資化遺伝子 (aceP)の発現を強化する方法 (特許文献 6参照）、 ACEタンパク質をコードする遺伝子の発現を強化する方法 (特許文献 7参照)等が知 られている。これらは培養液中に放出された酢酸を積極的に資化させることにより酢 酸の副生減を図るものである。また、ェシエリヒア属細菌において、酢酸の生合成を 弱化することにより副生酢酸を抑制する方法として、フォスフォアセチルトランスフェラ ーゼとラタテートデヒドロゲナーゼを欠損させたェシエリヒア'コリを用いたコハク酸の 製造方法 (特許文献 8参照）が知られて 、る。
[0006] コリネ型細菌において、酢酸資化に関与する酵素としてアセテートキナーゼ、フォス フォトランスァセチラーゼ (非特許文献 2参照）が報告されている。また、酢酸生成に は、ピルべートォキシダーゼ（特許文献 9参照）、ァシルフォスファターゼ、アルデヒド デヒドロゲナーゼ、ァセチル CoAノ、イド口ラーゼ等複数の酵素が関与することが推定 される。し力しながら、どの酵素が酢酸合成に寄与しているか明確でな力つたため、 今まで、コリネ型細菌で酢酸生合成系酵素を低下させた菌株を用いてコハク酸生産 を行う方法は知られて 、なかった。
[0007] ピルべートォキシダーゼは、ピルビン酸と水から、酢酸を生成する酵素（EC 1.2.2.2 )であり、ピルべートォキシダーゼを欠損させた腸内細菌群を用いた L—アミノ酸の製 造方法 (特許文献 10参照)、ピルペートォキシダーゼを欠損させた腸内細菌群を用い た D—パントテン酸の製造方法 (特許文献 11参照）、ピルペートォキシダーゼを欠損 させたコリネ型細菌を用いた D—パントテン酸の製造方法 (特許文献 12参照）が知ら れている。
コリネバタテリゥム.ダルタミカムでもピルべートォキシダーゼの遺伝子配列は明らか になっており、ピルべートォキシダーゼ遺伝子の発現を低下させたコリネ型細菌を用 いた L—アミノ酸の製造法も知られていた (特許文献 13参照)。しかし、コリネ型細菌 において、ピルべ一トォキシダーゼのコハク酸生合成系への関与は知られておらず、 嫌気発酵条件でピルべートォキシダーゼ遺伝子を発現させて解析した報告もなかつ た。
特許文献 1 :米国特許第 5, 143, 833号明細書 特許文献 2 :米国特許第 5, 504, 004号明細書
特許文献 3：特開平 11― 113588号公報
特許文献 4：特開平 11 196888号公報
特許文献 5：特開平 11― 206385号公報
特許文献 6：特開平 6— 14781号公報
特許文献 7：特開平 7— 67683号公報
特許文献 8：国際公開第 99Z06532号パンフレット
特許文献 9 :欧州特許出願公開第 1096013号明細書
特許文献 10：国際公開第 02Z36797号パンフレット
特許文献 11：国際公開第 02Z072855号パンフレット
特許文献 12：国際公開第 02/29020号パンフレット
特許文献 13 :欧州特許出願公開第 1 108 790号明細書
特干文献 1 international Journal of systematic Bacteriology, vol. 49, p207— 216、 1999年
非特許文献 2 : Microbiology. 1999 Feb; 145 (Pt 2):503- 13
発明の開示
[0008] 本発明は、コハク酸を効率よく生産することのできるコリネ型細菌を提供することを 課題とする。
[0009] 本研究者らは上記課題を解決するために鋭意検討を行った結果、コリネ型細菌に お 、てピルべートォキシダーゼ活性を低下させることにより、酢酸の副生が低減して 、コハク酸が効率よく生産されることを見出し、本発明を完成するに至った。
[0010] 即ち、本発明は、以下のとおりである。
(1)コハク酸生産能を有するコリネ型細菌であって、ピルべ一トォキシダーゼの活 性が低下するように改変されたコリネ型細菌。
(2) 前記ピルべートォキシダーゼ力 下記 (A)又は (B)に記載のタンパク質である 請求項 1に記載のコリネ型細菌、
(A)配列番号 49に示すアミノ酸配列を有するタンパク質、又は
(B)配列番号 49に示すアミノ酸配列にお 、て、 1若しくは数個のアミノ酸の置換、 欠失、挿入、または付カ卩を含むアミノ酸配列を有し、かつ、ピルべートォキシダーゼ 活性を有するタンパク質。
(3) 染色体上のピルべートォキシダーゼ遺伝子が破壊されたことによりピルべート ォキシダーゼ活性が低下した、（1)又は（2)のコリネ型細菌。
(4) 前記ピルべートォキシダーゼ遺伝子力 下記（a)又は（b)に記載の DNAであ る（3)のコリネ型細菌、
(a)配列番号 48の塩基番号 996— 2732の塩基配列を含む DNA、又は
(b)配列番号 48の塩基番号 996— 2732の塩基配列又は同塩基配列から調製さ れ得るプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダィズし、かつ、ピルべ一トォキ シダーゼ活性を有するタンパク質をコードする DNA。
(5) さらに、ホスホトランスァセチラーゼ、アセテートキナーゼ及びァセチル CoAノヽ イド口ラーゼからなる群より選ばれる 1種又は 2種以上の酵素の活性が低下するように 改変された、 (1)〜 (4)のいずれかのコリネ型細菌。
(6) さらに、ラタテートデヒドロゲナーゼ活性が低下するように改変された（1)〜（5 )の！、ずれかのコリネ型細菌。
(7) さらに、ピルべ一トカルボキシラーゼ活性が上昇するように改変された（1)〜（ 6)の!、ずれかのコリネ型細菌。
(8) (1)〜（7)のいずれかのコリネ型細菌またはその処理物を、炭酸イオン、重炭 酸イオンまたは二酸化炭素を含有する反応液中で有機原料に作用させることにより、 該反応液中にコハク酸を生成蓄積させ、該反応液からコハク酸を採取することを特徴 とするコハク酸の製造方法。
(9) 嫌気的条件下において、前記細菌又はその処理物を有機原料に作用させる ことを特徴する（8)の製造方法。
(10) (8)又は（9)の方法によりコハク酸を製造する工程、及び得られたコハク酸を 重合させる工程を含む、コハク酸含有ポリマーの製造方法。
図面の簡単な説明
[図 1]プラスミド pBS3の構築手順を示す図。
[図 2]プラスミド pBS4Sの構築手順を示す図。 [図 3]プラスミド p Δ ldh56-lの構築手順を示す図。
[図 4]プラスミド pBS4S:: Δ poxBの構築手順を示す図。
[図 5]poxB破壊株及び対照株の酢酸の副生率を示す図。
[図 6]プラスミド pBS5T:: Δ ackの構築手順を示す図。
[図7]プラスミド pBSCT:: Δ pta- ackの構築手順を示す図。
[図 8]プラスミド pBS5T:: Δ poxBの構築手順を示す図。
[図 9]プラスミド pBS4S:: Δ achの構築手順を示す図。
[図 10]プラスミド pBSCT:: Δ acpの構築手順を示す図。
発明を実施するための最良の形態
[0012] 以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する
[0013] < 1 >本発明に用いられるコリネ型細菌
本発明において、「コリネ型細菌」とは、従来ブレビパクテリゥム属に分類されていた 力 現在コリネバタテリゥム属に分類されている細菌も含み（Int. J. Syst. BacterioL, 41, 255(1981))、またコリネバタテリゥム属と非常に近縁なブレビバタテリゥム属細菌を 含む。このようなコリネ型細菌の例として以下のものが挙げられる。
コリネバタテリゥム ·ァセトァシドフィラム
コリネバタテリゥム ·ァセトグルタミカム
コリネバタテリゥム ·アル力ノリティカム
コリネバタテリゥム ·カルナェ
コリネバタテリゥム ·ダルタミカム
コリネバタテリゥム 'リリウム
コリネバタテリゥム 'メラセコーラ
コリネバタテリゥム ·サーモアミノゲネス
コリネバタテリゥム 'ノヽーキユリス
ブレビバタテリゥム .ディバリカタム
ブレビバタテリゥム 'フラバム
ブレビバタテリゥム ·インマリオフィラム
ブレビバタテリゥム ·ラタトフアーメンタム ブレビバタテリゥム 'ロゼゥム
ブレビバタテリゥム.サッカロリティカム
ブレビバタテリゥム .チォゲ二タリス
コリネバタテリゥム ·アンモニアゲネス
ブレビバタテリゥム ·アルバム
ブレビバクテリウム'セリヌム
ミクロバタテリゥム ·アンモニアフィラム
[0014] 本発明において、「コハク酸生産能」とは、本発明のコリネ型細菌を培養したときに、 培地中にコハク酸を蓄積する能力をいう。このコハク酸生産能は、コリネ型細菌が本 来的に有するものであってもよぐ育種によって付与される性質であってもよい。
[0015] 育種によってコハク酸生産能を付与するには、代謝制御変異株の取得、 目的物質 の生合成系酵素が増強された組換え株の創製等、従来、コリネ型細菌の育種に採用 されてきた方法を適用することが出来る（アミノ酸発酵、（株)学会出版センター、 1986 年 5月 30日初版発行、第 77〜100頁参照)。これらの方法において、付与される代謝 制御変異や増強される目的物質生合成系酵素の増強等の性質は、単独でもよぐ 2 種又は 3種以上であってもよい。代謝制御変異等の性質の付与と、生合成系酵素の 増強が組み合わされてもよい。コハク酸生合成系酵素としては、例えば、後述するよ うなピルビン酸カルボキシラーゼが挙げられる。
[0016] コハク酸生産能を有するコリネ型細菌の特に好ましい具体例としては、ラタテートデ ヒドロゲナーゼ活性が低下したブレビバタテリゥム .フラバム MJ233 Δ ldh株（特開平 11 - 206385号公報）や、ピルビン酸カルボキシラーゼ又はホスホェノールピルビン酸 カルボキシラーゼ活性が強化されたブレビバタテリゥム ·フラバム MJ233/pPCPYC株（ 国際公開第 01/27258号パンフレット、特開平 11— 196887号公報）、またブレビバ クテリゥム 'フラバム MJ— 233 (FERM BP— 1497)、同 MJ— 233 AB— 41 (FER M BP— 1498)、ブレビバタテリゥム 'アンモニアゲネス ATCC6872、コリネノ クテ リウム 'グルタミカム ATCC31831、及びブレビバタテリゥム'ラタトフアーメンタム AT CC13869等が挙げられる。なお、ブレビバタテリゥム 'フラバムは、現在、コリネバタ テリゥム 'グルタミカムに分類される場合もあり（Lielbl, W., Ehrmann, M., Ludwig, W. and Schleifer, K. H., International Journal of Systematic Bacteriology, 1991, vol. 41, p255-260)、上記ブレビバタテリゥム 'フラバム MJ— 233株、及びその変異株 MJ— 2 33 AB— 41株は、それぞれ、コリネバタテリゥム 'グルタミカム MJ— 233株及び MJ - 233 AB— 41株と同一の株であるものとする。
[0017] < 2 >本発明のコリネ型細菌の構築
本発明のコリネ型細菌は、上記のようなコハク酸生産能を有するコリネ型細菌であ つて、かつピルべートォキシダーゼ活性が低下するように改変されたコリネ型細菌で ある。本発明のコリネ型細菌の育種において、コハク酸生産能の付与とピルべートォ キシダーゼ (EC 1.2.2.2)活性を低下させる改変は、どちらを先に行ってもよい。
[0018] 「ピルべートォキシダーゼ活性」は、ピルビン酸と水から酢酸を生成する反応を触媒 する活性をいう。「ピルべートォキシダーゼ活性が低下するように改変された」とは、ピ ルベートォキシダーゼ活性力 非改変株、例えば野生株のコリネ型細菌の比活性よ りも低くなつたことをいう。ピルべートォキシダーゼ活性は非改変株と比較して、菌体 当たり 50%以下に低下していることが好ましぐ 30%以下に低下していることがより好 ましぐ 10%以下に低下していることが特に好ましい。「低下」には活性が完全に消失 した場合も含まれる。なお、活性の比較対照となる野生株のコリネ型細菌としては、例 えば、野生株としてはブレビバタテリゥム 'ラタトフアーメンタム ATCC13869、非改変株 としてはブレビバタテリゥム 'ラタトフアーメンタム A ldh株が挙げられる。ピルべ一トォキ シダーゼ活性は、 Changらの方法（Chang Y. and Cronan J. E.
JRJ.Bacteriol.151, 1279-1289(1982))〖こより、活性を測定することによって確認するこ とがでさる。
[0019] 上記活性を有するピルべートォキシダーゼとしては、例えば、配列番号 49に示す アミノ酸配列を有するタンパク質を挙げることができる。また、ピルべートォキシダーゼ 活性を有する限りにおいて、配列番号 49に示すアミノ酸配列において、 1若しくは数 個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、または付加を含むアミノ酸配列を有するものであつ てもよい。ここで、数個とは、例えば、 2〜20個、好ましくは 2〜10個、より好ましくは 2 〜5個を意味する。
[0020] 「ピルべートォキシダーゼ活性が低下するように改変された」とは、例えば、細胞あ たりのピルべートォキシダーゼの分子数が低下した場合や、分子あたりのピルべート ォキシダーゼ活性が低下した場合等が該当する。具体的には、染色体上のピルべ ートォキシダーゼをコードする遺伝子を欠損させたり、プロモーターやシャインダルガ ルノ (SD)配列等の発現調節配列を改変したりすることなどによって達成される。染色 体上のピルべートォキシダーゼ遺伝子としては、例えば、配列番号 48の塩基番号 99 6〜2732の塩基配列を含む DNAを挙げることができる。また、ピルべートォキシダ ーゼ活性を有するタンパク質をコードする限り、配列番号 48の塩基番号 996〜2732 の塩基配列又は同塩基配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件下で ハイブリダィズする DNAであってもよい。「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異 的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。こ の条件を明確に数値ィ匕することは困難である力 一例を示せば、 60°C、 1 X SSC, 0 . 10/0SDS、好ましく ίま、 0. 1 X SSC、 0. 10/0SDSにネ目当する塩濃度で、 1回より好 ましくは 2〜3回洗浄する条件が挙げられる。
[0021] ピルべートォキシダーゼ遺伝子（以下 poxB遺伝子と呼ぶ）の取得は、例えば、 GenBankに登録されて!、る配列 (GenBank Accession No. NC— 003450の
2776766-2778505番目の相補鎖）に基づき、合成オリゴヌクレオチドを合成し、コリネ ノ クテリゥム 'ダルタミカムの染色体を铸型として PCR反応を行うことによってクロー- ングできる。また、近年ゲノムプロジェクトにより、塩基配列が決定されているブレビバ クテリゥム 'ラタトフアーメンタム等のコリネ型細菌の配列も利用できる。染色体 DNAは 、 DNA供与体である細菌から、例えば、斎藤、三浦の方法（H. Saito and K.Miura, Biochem.B iophys. Acta, 72, 619 (1963)、生物工学実験書、日本生物工学会編、 97 〜98頁、培風館、 1992年参照）等により調製することができる。
[0022] 上記のようにして調製した poxB遺伝子又はその一部を遺伝子破壊に使用すること ができる。ただし、遺伝子破壊に用いる遺伝子は破壊対象のコリネ型細菌の染色体 DNA上の poxB遺伝子（例えば、配列番号 48の塩基番号 996— 2732の塩基配列を 有する遺伝子）と相同組換えを起こす程度の相同性を有して ヽればよ 、ため、このよ うな相同遺伝子も使用することができる。ここで、相同組換えを起こす程度の相同性と は、好ましくは 70%以上、より好ましくは 80%以上、さらに好ましくは 90%以上、特に 好ましくは 95%以上の相同性を意味する。また、上記遺伝子とストリンジェントな条件 下でハイブリダィズし得る DNA同士であれば、相同組換えは起こり得る。「ストリンジ ェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリツ ドが形成されない条件をいう。この条件を明確に数値ィ匕することは困難であるが、一 例を示せば、 60。C、 1 X SSC, 0. 1%SDS、好ましくは、 0. 1 X SSC、 0. 1%SDS に相当する塩濃度で、 1回より好ましくは 2〜3回洗浄する条件が挙げられる。
[0023] 上記のような遺伝子を使用し、例えば、 poxB遺伝子の部分配列を欠失し、正常に 機能するピルべ一トォキシダーゼを産生しな ヽように改変した欠失型 poxB遺伝子を 作製し、該遺伝子を含む DNAでコリネ型細菌を形質転換し、欠失型遺伝子と染色 体上の遺伝子で組換えを起こさせることにより、染色体上の poxB遺伝子を破壊するこ とが出来る。このような相同組換えを利用した遺伝子置換による遺伝子破壊は既に 確立しており、直鎖状 DNAを用いる方法や温度感受性複製起点を含むプラスミドを 用いる方法などがある（米国特許第 6303383号明細書、又は特開平 05-007491号公 報)。また、上述のような相同組換えを利用した遺伝子置換により遺伝子破壊は、宿 主上で複製能力を持たないプラスミドを用いても行うことが出来る。
[0024] 欠失型の poxB遺伝子を宿主染色体上の poxB遺伝子と置換するには、例えば以下 のようにすればよい。まず、温度感受性複製起点、欠失型 poxB遺伝子、レバンシユー クラーゼをコードする sacB遺伝子及びクロラムフエ-コール等の薬剤耐性を示すマー カー遺伝子を挿入して組換え用プラスミドを調製する。
[0025] ここで、レバンシユークラーゼをコードする sacB遺伝子は、染色体上からベクター部 分が脱落した菌株を効率よく選択する為に使用される遺伝子である（Schafer.A.et al.Gene 145 (1994)69-73)。すなわち、コリネ型細菌では、レバンシユークラ一ゼを発 現させると、シユークロースを資化することによって生成したレバンが致死的に働き、 生育することが出来ない。従って、レバンシユークラーゼを搭載したベクターが染色 体上に残ったままの菌株をシユークロース含有プレートで培養すると生育できず、ベ クタ一が脱落した菌株のみシユークロース含有プレートで選択することが出来る。
[0026] sacB遺伝子又はその相同遺伝子は、以下のような配列の遺伝子を用いることが出 来る。 バチルス'ズブチルス： sacB GenBank Accession Number X02730 (配列番号 41) バチルス ·アミ口リキュファシエンス： sacB GenBank Accession Number X52988 ザィモモナス ·モビリス： sacB GenBank Accession Number L33402
ノ チルス'ステアロサーモフィラス： surB GenBank Accession Number U34874 ラクトバチルス ·サンフランシセンシス： frfA GenBank Accession Number AJ508391 ァセトパクタ^ ~ ·キシリナス： lsxA GenBank Accession Number AB034152
ダルコンァセトバクタ^ ~ ·ジァゾトロフィカス： lsdA GenBank Accession Number L41732
[0027] 次に、上記組換えプラスミドでコリネ型細菌を形質転換する。形質転換は、これまで に報告されている形質転換法に従って行えばよい。例えば、ェシエリヒア'コリ K— 12 につ 、て報告されて 、るような、受容菌細胞を塩ィ匕カルシウムで処理して DNAの透 過性を増加させる方法（Mandel,M.and Higa.A., J.Mol.Biol.,53 ,159 (1970) )があり、 バチルス'ズブチルスについて報告されているような、増殖段階の細胞カゝらコンビテン トセルを調整し DNAを導入する方法（Dancan,C.H.， Wilson.G.A and Young.F.E , Gene , 1,153 (1977) )がある。あるいは、バチルス'ズブチルス、放線菌類及び酵母に つ！、て知られて 、るような DNA受容菌の細胞を組換え DNAを DNA受容菌に導入 する方法（Chang.S. and Choen.S.N., Molec. Gen. Genet., 168, 111 (1979);
Bibb.M.J., WardJ.M. and Hopwood.O.A., Nature, 274, 398 (1978); Hinnen.A., HicksJ.B. and Fink'G.R" Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75 1929 (1978))も応用できる 。また、コリネ型細菌の形質転換は、電気パルス法 (杉本ら、特開平 2-207791号公報 )によっても行うことができる。
[0028] コリネ型細菌の温度感受性プラスミドとしては、 p48K及び pSFKT2 (以上、特開
2000-262288号公報参照）、 pHSC4 (フランス特許公開 1992年 2667875号公報、特開 平 5-7491号公報参照）等が挙げられる。これらのプラスミドは、コリネ型細菌中で少な くとも 25°Cでは自律複製することができる力 37°Cでは自律複製できない。 pHSC4を 保持するェシエリヒア .コリ _112571は、 1990年 10月 11日に通商産業省工業技術院生 命工学工業技術研究所 (現独立行政法人産業技術総合研究所特許微生物寄託 センター）（干 305-5466 日本国茨城県つくば巿東 1丁目 1番地 1中央第 6)に受託番 号 FERM P-11763として寄託され、 1991年 8月 26日にブダペスト条約に基づく国際寄 託に移管され、 FERM BP-3524の受託番号で寄託されている。
[0029] 上記のようにして得られる形質転換体を温度感受性複製起点が機能しな!、温度（ 25°C)で培養し、プラスミドを導入した株を取得する。プラスミド導入株を高温で培養 し、温度感受性プラスミドを脱落させ、抗生物質を含有するプレートに本菌株を塗布 する。温度感受性プラスミドは高温で複製できないので、プラスミドが脱落した菌株は 、抗生物質を含有したプレートでは生育出来ないが、ごくわずかの頻度であるが、プ ラスミド上の poxB遺伝子と染色体上の poxB遺伝子と組換えを起こした菌株が出現す る。
[0030] こうして染色体に組換え DNAが組み込まれた株は、染色体上にもともと存在する poxB遺伝子配列との組換えを起こし、染色体の poxB遺伝子と欠失型の poxB遺伝子 との融合遺伝子 2個が組換え DNAの他の部分 (ベクター部分、温度感受性複製起 点及び薬剤耐性マーカー）を挟んだ状態で染色体に挿入されて ヽる。
[0031] 次に、染色体 DNA上に欠失型の poxB遺伝子のみを残すために、ベクター部分（ 温度感受性複製起点及び薬剤耐性マーカーを含む）とともに染色体 DNAから脱落 させる。その際、正常な poxB遺伝子が染色体 DNA上に残され、欠失型 poxB遺伝子 が切り出される場合と、反対に欠失型 ach遺伝子が染色体 DNA上に残され、正常な poxB遺伝子が切り出される場合がある。いずれの場合も、温度感受性複製起点が機 能する温度で培養すれば、切り出された DNAはプラスミド状で細胞内に保持される 。次に、温度感受性複製起点が機能しない温度で培養すると、プラスミド上の poxB遺 伝子は、プラスミドとともに細胞力も脱落する。そして、 PCRまたはサザンノヽイブリダィ ゼーシヨン等により、染色体上に欠失型 poxB遺伝子が残った株を選択することによつ て poxB遺伝子が破壊された株を取得することができる。
[0032] なお、上記温度感受性プラスミドに換えて、コリネ型細菌内で複製能を持たないプ ラスミドを用いても、同様の遺伝子破壊を行うことが出来る。コリネ型細菌内で複製能 を持たないプラスミドは、ェシエリヒア'コリで複製能力を持つプラスミドが好ましぐ例 えば、 pHSG299(宝バイオ社製) pHSG399(宝バイオ社製)等が挙げられる。
[0033] なお、ピルべートォキシダーゼの活性を低下させる方法としては、上述の遺伝子操 作法以外に、コリネ型細菌を、紫外線照射または N—メチルー N'—ニトロ— N—二ト ロソグァ-ジン (NTG)もしくは亜硝酸等の通常変異処理に用いられて 、る変異剤に よって処理し、ピルべートォキシダーゼの活性が低下した菌株を選択する方法が挙 げられる。
[0034] 本反応においては、上記ピルべートォキシダーゼ活性の低下に加えて、ラタテート デヒドロゲナーゼ（以下 LDHと呼ぶことがある）活性が低下するように改変された細菌 株を用いるとより有効である。ラタテートデヒドロゲナーゼ活性とは、 NADHを補酵素と して、ピルビン酸を還元して乳酸を生成する反応を触媒する活性を意味する。「ラタテ 一トデヒドロゲナーゼ活性が低下された」とは、 LDH非改変株と比較して LDH活性が 低下していることをいう。 LDH活性は、 LDH非改変株や野生株と比較して低下してい ればよいが、菌体当たり 50%以下に低下していることが好ましぐ 30%以下に低下して いることがより好ましぐ菌体当たり 10%以下に低下していることが特に好ましい。また 、 LDH活性は完全に欠損していてもよい。 LDH活性が低下したことは L.Kanarekらの 方法（L.Kanarek and R丄. Hill, J. Biol. Chem.239, 4202 (1964))により LDH活性を測 定することによって確認することができる。本発明のコリネ型細菌は、 LDH活性が低 下したコリネ型細菌を作製し、さらに、ピルべートォキシダーゼ活性が低下するように 改変することにより得ることができる。ただし、 LDH活性を低下させるための改変と、ピ ルベートォキシダーゼ活性を低下させるための改変は 、ずれを先に行ってもょ 、。 ldh遺伝子としては、例えば配列番号 43に示す配列を有する遺伝子を使用すること ができ、上記 poxB遺伝子と同様の方法により遺伝子破壊等を行うことができる。
[0035] 本発明にお!/、ては、ピルべートォキシダーゼ活性の低下に加えて、ホスホトランス ァセチラーゼ (以下 PTA)、アセテートキナーゼ (以下 ACK)、ァセチル CoAハイド口ラー ゼ (ACH)のいずれかの活性が低下するように改変された細菌株を用いるとより有効 であり、これらの 2以上の酵素活性が低下するように改変された細菌株を用いると更 に有効であり、これらの活性が全て低下するように改変された細菌株を用いると特に 有効であり、さらにァシルフォスァターゼを欠損させた細菌株を用いると更に有効であ る。
[0036] 本発明で、ホスホトランスァセチラーゼ (PTA)活性とは、ァセチル CoAにリン酸を転 移し、ァセチルリン酸を生成する反応を触媒する活性をを意味し、アセテートキナー ゼ (ACK)とは、ァセチルリン酸と ADPから酢酸を生成反応を触媒する活性を意味し、 ァセチル CoAノヽイド口ラーゼ（ACH)とはァセチル CoAと水から酢酸を生成する反応を 触媒する活性を意味し、ァシルフォスファターゼ (ACP)は、ァセチルリン酸からリン酸 と酢酸、またはカルボン酸とリン酸を生成する反応を触媒する活性を意味する。
[0037] これらの活性を低下させるには、上述の各酵素をコードする遺伝子を破壊すること により、または、各酵素をコードする遺伝子のプロモーターや、シャインダルガルノ（ SD)配列等発現調節配列を改変することによって達成される。遺伝子破壊方法は上 述の poxB遺伝子破壊方法と同様の方法で行うことが出来る。
[0038] 各酵素をコードする遺伝子は、例えば GenBankに登録されているコリネバタテリゥム •ダルタミカムの以下の遺伝子が利用できる。
pta遺伝子（ホスホアセチルトランスフェラーゼ） GenBank Accession No. NC_003450 の NCgl2657 (NC— 003450の 2936506-2937891番目の相補鎖）（配列番号 45の塩基番 号 956〜1942)
ack遺伝子（アセテートキナーゼ）、 GenBank Accession No. NC_003450の NCgl2656 (NC_003450の 2935313-2936506番目の相補鎖） （配列番号 45の塩基番号 1945〜 3135)
ach遺伝子（ァセチル- CoAハイド口ラーゼ）（GenBank Accession No.NC— 003450の NCgl2480 (NC— 003450の 2729376-2730884番目の相補鎖）（配列番号 50) acp遺伝子（ァシルフォスファターゼ） GENEBANK accession No.NC— 003450の NCgll987
(NC_003450の 2183107-2183391番目の相補鎖） （配列番号 52)
[0039] 「ホスホトランスァセチラーゼ (以下 PTA)活性が低下した」とは、 PTA非改変株と比較 して PTA活性が低下していることをいう。 PTA活性は、 PTA非改変株や野生株と比較 して低下していればよいが、菌体当たり 50%以下に低下していることが好ましぐ 30% 以下に低下していることがより好ましぐ菌体当たり 10%以下に低下していることが特 に好ましい。また、 PTA活性は完全に欠損していてもよい。 PTA活性が低下したことは 、 Klotzschらの方法（Klotzsch, H. R., Meth Enzymol. 12, 381-386(1969))により、 PTA活性を測定することによって確認することができる。 POXB及び PTA活性が低下 したコリネ型細菌は、 POXB活性が低下したコリネ型細菌を作製し、さらに、 PTA活性 が低下するように改変することにより得ることができる。ただし、 PTA活性低下のため の改変と POXB活性低下のための改変は、いずれを先に行ってもよい。
[0040] 「アセテートキナーゼ (以下 ACK)活性が低下した」とは、野生株または、 ACK非改変 株と比較して ACK活性が低下していることをいう。 ACK活性は、 ACK非改変株や野 生株と比較して低下していればよいが、 ACK非改変株と比較して、菌体当たり 50% 以下に低下していることが好ましぐ 30%以下に低下していることがより好ましぐ菌体 当たり 10%以下に低下していることが特に好ましい。また、 ACK活性は完全に欠損し ていてもよい。 ACK活性が低下したことは、 Ramponiらの方法（Ramponi G" Meth. Enzymol. 42,409-426(1975))〖こより、 ACK活性を測定することによって確認することが できる。 POXB及び ACK活性が低下したコリネ型細菌は POXB活性が低下したコリネ 型細菌を構築し、さらに ACK活性が低下するように改変することより得ることができる。 ただし、 ACK活性低下のための改変と、 POXB活性低下のための改変は、いずれを 先に行ってもよい。
[0041] 「ァセチル CoAノヽイド口ラーゼ（以下 ACH)活性が低下した」は、 ACH非改変株や野 生株と比較して低下していればよいが， ACH非改変株と比較して、菌体あたり 50%以 下に低下していることが好ましぐ 30%以下に低下していることがより好ましぐ菌体当 たり 10%以下に低下していることが特に好ましい。また、 ACH活性は完全に欠損して いてもよい。 ACH活性が低下したことは、 GergelyJ.,らの方法（Gergely,J.， Hele.P. & Ramkrishnan.C.V. (1952) J.Biol.Chem. 198 p323- 334)〖こより、 ACH活性を測定する ことによって確認することができる。 ACH及び POXB活性が低下したコリネ型細菌は、 ACH活性が低下したコリネ型細菌を構築し、さらに、 POXB活性が低下するように改 変することにより得ることができる。ただし、 POXB活性低下のための改変と、 ACH活 性低下のための改変はいずれを先に行ってもよい。
[0042] また、「ァシルホスファターゼ (以下 ACP)活性が低下した」とは、野生株又は、 ACP非 改変株と比較して ACP活性が低下していることをいう。 ACP活性は、野生株又は ACP 非改変株と比べて低下していればよいが、 ACP非改変株と比較して、菌体当たり 50 %以下さらに望ましくは菌体あたり 10%以下に低減ィ匕されていることが好ましい。また 、 ACP活性は完全に欠損していてもよい。 ACP活性が低減ィ匕されたことは、上記 ACK 活性と同様の方法（Ramponi G., Meth. Enzymol. 42,409-426(1975))〖こより、 ACP活 性を測定することによって確認することができる。 ACH及び ACP活性が低下したコリネ 型細菌は、 ACH活性が低下したコリネ型細菌を構築し、さらに ACP活性が低下するよ うに改変すること〖こより得ることができる。ただし、 ACP活性低下のための改変と ACH 活性低下のための改変はいずれをを先に行ってもよい。
[0043] また、本反応にお!、ては、 POXBの活性の低下に加えて、ピルべートカルボキシラ ーゼ（以下 PCと呼ぶ）の活性が上昇するように改変された細菌を用いてもょ ヽ。 「ピル ベートカルボキシラーゼの活性が増強される」とは、 PCの活性が野生株又は親株等 の非改変株に対して上昇していることをいう。 PCの活性は Peters- Wendisch P.Gらの 方法（Peters- Wendisch P.G. et al. Microbiology 143, 1095-1103(1997))により測定 することができる。
[0044] 本発明の方法に使用される PCタンパク質をコードする pc遺伝子は、既にその塩基 配列が決定されている遺伝子、もしくは、下記に示すような方法により PC活性を有す るタンパク質をコードする DNA断片を微生物、動植物等の染色体より単離し、塩基配 列を決定したものを使用することができる。また、塩基配列が決定された後には、その 配列にしたがって合成した遺伝子を使用することもできる。例えばコリネバクテリウム' グルタミカム ATCC13032のピルべ一トカルボキシラーゼ遺伝子 GenBank Accession No. NCgl0659遺伝子（配列番号 60)を使用することが出来る。その他にも以下の生 物由来の PC遺伝子を使用することもできる。
ヒト [Biochem.Biophys.Res.Comm., 202, 1009—1014, (1994)]
マウス [Proc.Natl.Acad.Sci.USA., 90, 1766-1779, (1993)]
ラッド [GENE, 165, 331-332, (1995)]
酵母；サッカロマイセス .セレビシェ (Saccharomyces cerevisiae)
[Mol.Gen.Genet., 229, 307-315, (1991)]
シゾサッ 7ロマ セス ·ホンぺ (Schizosaccharomyces pombe)
[DDBJ Accession No.; D78170]
ノ チルス'ステア口サーモフィルス (Bacillus stearothermophilus) [GENE, 191, 47-50, (1997)]
リゾビゥム 'エトリ (Rhizobium etli)
[j.Bacteriol, 178, 5960-5970, (1996)]
[0045] pc遺伝子を含む DNA断片は、適当な発現プラスミド、例えば pUC118 (宝バイオ社 製)へ挿入し、適当な宿主微生物、例えばェシエリヒア'コリ JM109 (宝バイオ社製)へ 導入すること〖こより発現させることができる。発現した pc遺伝子産物であるピルビン酸 カルボキシラーゼの確認は、該形質転換体力も上記の公知の方法により PC活性を測 定し、非形質転赚力も抽出した粗酵素液の PC活性と比較することにより、確認する ことができる。 pc遺伝子を含む DNA断片を、適当なプラスミド、例えばコリネ型細菌内 でプラスミドの複製増殖機能を司る遺伝子を少なくとも含むプラスミドベクターに導入 することにより、コリネ型細菌内で pcの高発現可能な組換えプラスミドを得ることができ る。ここで、上記組み換えプラスミドにおいて、 pc遺伝子を発現させるためのプロモー ターはコリネ型細菌が保有するプロモーターであることができる力 それに限られるも のではなぐ pc遺伝子の転写を開始させるための塩基配列であれば 、かなるプロモ 一ターであっても良い。
[0046] pc遺伝子を導入することができるプラスミドベクターとしては、コリネ型細菌内での複 製増殖機能を司る遺伝子を少なくとも含むものであれば特に制限されない。その具 体例としては、例えば、特開平 3— 210184号公報に記載のプラスミド pCRY30 ;特 開平 2— 72876号公報及び米国特許 5, 185, 262号明細書公報に記載のプラスミ ド pCRY21、 pCRY2KE、 pCRY2KX、 pCRY31、 pCRY3KE及び pCRY3KX; 特開平 1― 191686号公報に記載のプラスミド 0^^2ぉょび 0^¾；特開昭 58— 67679号公報【こ記載の pAM330 ;特開日召 58— 77895号公報【こ記載の pHM1519 ；特開昭 58— 192900号公報に記載の pAJ655、 pAJ611及び pAJ1844；特開昭 5 7— 134500号公報に記載の pCGl ;特開昭 58— 35197号公報に記載の pCG2 ; 特開昭 57— 183799号公報に記載の pCG4および pCGl l等を挙げることができる
[0047] それらの中でもコリネ型細菌の宿主 ベクター系で用いられるプラスミドベクターと しては、コリネ型細菌内でプラスミドの複製増殖機能を司る遺伝子とコリネ型細菌内 でプラスミドの安定化機能を司る遺伝子とを有するものが好ましぐ例えば、プラスミド pCRY30、 pCRY21、 pCRY2KE、 pCRY2KX、 pCRY31、 pCRY3KEおよび pC RY3KX等が好適に使用される。
[0048] pc遺伝子を、上記したような好気性コリネ型細菌内で複製可能なプラスミドベクター の適当な部位に挿入して得られる組み換えベクターで、コリネ型細菌、例えばブレビ ノ クテリゥム.ラタトフアーメンタム (Brevibacterium lactofermentum)2256株 (
ATCC13869)を形質転換することにより、 pc遺伝子の発現が増強されたコリネ型細菌 が得られる。形質転換は、例えば、電気パルス法（Res. Microbiol, Vol.144, p.181-185, 1993)等によって行うことができる。なお、 PC活性の増強は、公知の相同 組換え法によって染色体上で pc遺伝子を導入、置換、増幅等によって高発現化させ ること〖こよっても行うことができる。このようにして得られる PC遺伝子高発現株におい て pox遺伝子を破壊することにより、 PC活性が増強され、且つピルべ一トォキシダー ゼ活性が低減ィ匕された細菌株を得ることが出来る。なお、ピルべートォキシダーゼ活 性の低減化と PC活性の増強はどちらを先に行っても良い。
[0049] さらに、本発明にお!/、ては、ピルべートォキシダーゼ活性、 ACH活性、 PTA活性、 及び ACK活性が低下するように改変され、さらに LDH活性が低下するように改変され 、さらに PC活性が増強するように改変された細菌を用いると、物質生産、特にコハク 酸の製造に特に有効である。
[0050] < 3 >本発明の微生物を用いたコハク酸の生産
上記のようにして得られるコリネ型細菌を培地で培養し、該培地中にコハク酸を生 成蓄積させ、該培地からコハク酸を採取することにより、コハク酸を効率よく製造する ことができる。
[0051] コハク酸の製造反応に上記細菌を用いるに当たっては、寒天培地等の固体培地で 斜面培養したものを直接反応に用いても良 ヽが、上記細菌を予め液体培地で培養 ( 種培養）したものを用いるのが好ましい。このように種培養した細菌を、有機原料を含 む培地で増殖させながら、有機原料と反応させることによって製造することができる。 また、増殖させて得られた菌体を回収し、該菌体を、有機原料を含む反応液中で有 機原料と反応させることによつても製造することができる。なお、好気性コリネ型細菌 を本発明の方法に用いるためには、細菌を通常の好気的な条件で培養した後、反応 に用いることが好ましい。培養に用いる培地は、通常微生物の培養に用いられる培 地を用いることができる。例えば、硫酸アンモ-ゥム、リン酸カリウム、硫酸マグネシゥ ム等の無機塩カゝらなる組成物に、肉エキス、酵母エキス、ペプトン等の天然栄養源を 添加した一般的な培地を用いることができる。培養後の菌体を回収して用いる場合、 菌体は遠心分離、膜分離等によって回収され、反応に用いられる。
[0052] 本発明では細菌の菌体の処理物を使用することもできる。菌体の処理物としては、 例えば、菌体をアクリルアミド、カラギーナン等で固定化した固定化菌体、菌体を破 砕した破砕物、その遠心分離上清、又はその上清を硫安処理等で部分精製した画 分等が挙げられる。
[0053] 本発明の製造方法に用いる有機原料としては、本微生物が資化してコハク酸を生 成させうる炭素源であれば特に限定されないが、通常、ガラクトース、ラタトース、ダル コース、フノレクトース、グリセローノレ、シユークロース、サッカロース、デンプン、セノレ口 ース等の炭水化物；グリセリン、マン-トール、キシリトール、リビトール等のポリアルコ ール類等の発酵性糖質が用いられ、このうちグルコース、フルクトース、グリセロール が好ましぐ特にグルコースが好ましい。
[0054] また、上記発酵性糖質を含有する澱粉糖化液、糖蜜なども使用される。これらの発 酵性糖質は、単独でも組み合わせても使用できる。上記有機原料の使用濃度は特 に限定されないが、コハク酸の生成を阻害しない範囲で可能な限り高くするのが有利 であり、通常、 5〜30% (1\^7 ）、好ましくは10〜20% (1^7 ）の範囲内で反応が 行われる。また、反応の進行に伴う上記有機原料の減少にあわせ、有機原料の追加 添加を行っても良い。
[0055] 上記有機原料を含む反応液としては特に限定されず、水、緩衝液、培地等が用い られる力 培地が最も好ましい。反応液は、窒素源や無機塩などを含む反応液である ことが好ましい。ここで、窒素源としては、本微生物が資化してコハク酸を生成させうる 窒素源であれば特に限定されないが、具体的には、アンモニゥム塩、硝酸塩、尿素、 大豆加水分解物、カゼイン分解物、ペプトン、酵母エキス、肉エキス、コーンスティー プリカ一などの各種の有機、無機の窒素化合物が挙げられる。無機塩としては各種リ ン酸塩、硫酸塩、マグネシウム、カリウム、マンガン、鉄、亜鉛等の金属塩が用いられ る。また、ピオチン、パントテン酸、イノシトール、ニコチン酸等のビタミン類、ヌクレオ チド、アミノ酸などの生育を促進する因子を必要に応じて添加する。また、反応時の 発泡を抑えるために、反応液には市販の消泡剤を適量添加しておくことが望ましい。
[0056] 反応液の pHは、炭酸ナトリウム、重炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、重炭酸カリウム、 炭酸マグネシウム、水酸化ナトリウム、水酸ィ匕カルシウム、水酸ィ匕マグネシウム等を添 加することによって調整することができる。本反応における pHは、通常、 pH5〜10、 好ましくは pH6〜9. 5であることが好ましいので、反応中も必要に応じて反応液の p Hはアルカリ性物質、炭酸塩、尿素などによって上記範囲内に調節する。
[0057] 培地には、炭酸イオン、重炭酸イオン又は炭酸ガス（二酸化炭素）を含有させること が好ましい。炭酸イオン又は重炭酸イオンは、中和剤としても用いることのできる炭酸 マグネシウム、炭酸ナトリウム、重炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、重炭酸カリウム力も供 給されるが、必要に応じて、炭酸若しくは重炭酸又はこれらの塩或いは炭酸ガスから 供給することもできる。炭酸又は重炭酸の塩の具体例としては、例えば炭酸マグネシ ゥム、炭酸アンモ-ゥム、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、重炭酸アンモ-ゥム、重炭酸 ナトリウム、重炭酸カリウム等が挙げられる。そして、炭酸イオン、重炭酸イオンは、 0. 001〜5M、好ましくは 0. 1〜3M、さらに好ましくは 1〜2Mの濃度で添加する。炭酸 ガスを含有させる場合は、溶液 1L当たり 50mg〜25g、好ましくは 100mg〜15g、さ らに好ましくは 150mg〜 10gの炭酸ガスを含有させる。
[0058] 本反応に用いる細菌の生育至適温度は、通常、 25°C〜35°Cである。反応時の温 度は、通常、 25°C〜40°C、好ましくは 30°C〜37°Cである。反応に用いる菌体の量 は、特に規定されないが、 l〜700gZL、好ましくは 10〜500gZL、さらに好ましく は 20〜400gZLが用いられる。反応時間は 1時間〜 168時間が好ましぐ 3時間〜 72時間がより好ましい。
[0059] 細菌の培養時は、通気、攪拌し酸素を供給することが必要である。一方、コハク酸 の生成反応は、通気、攪拌して行ってもよいが、通気せず、酸素を供給しない嫌気的 条件下で行ってもよい。ここで言う嫌気的条件とは、溶液中の溶存酸素濃度を低く抑 えて反応することを意味する。この場合、溶存酸素濃度として 0〜2ppm、好ましくは 0 〜lppm、さらに好ましくは 0〜0. 5ppmで反応させることが望ましい。そのための方 法としては、例えば容器を密閉して無通気で反応させる、亜硫酸塩を添加する、窒素 ガス等の不活性ガスを供給して反応させる、炭酸ガス含有の不活性ガスを通気する 等の方法を用いることができる。
[0060] 反応液 (培養液）中に蓄積したコハク酸は、常法に従って、反応液より分離'精製す ることができる。具体的には、遠心分離、ろ過等により菌体等の固形物を除去した後 、イオン交換榭脂等で脱塩し、その溶液力も結晶化あるいはカラムクロマトグラフィー によりコハク酸を分離 ·精製することができる。
[0061] さらに本発明においては、上記した本発明の方法によりコハク酸を製造した後に、 得られたコハク酸を原料として重合反応を行うことによりコハク酸含有ポリマーを製造 することができる。コハク酸含有ポリマーはホモポリマーであってもよいし、他のポリマ 一原料との共重合ポリマーであってもよい。近年、環境に配慮した工業製品が数を増 す中、植物由来の原料を用いたポリマーに注目が集まってきており、本発明におい て製造されるコハク酸は、ポリエステルやポリアミドといったポリマーに加工されて用い る事が出来る。コハク酸含有ポリマーとして具体的には、ブタンジオールやエチレン グリコールなどのジオールとコハク酸を重合させて得られるコハク酸ポリエステル、へ キサメチレンジァミンなどのジァミンとコハク酸を重合させて得られるコハク酸ポリアミド などが挙げられる。
また、本発明の製造法により得られるコハク酸または該コハク酸を含有する組成物 は食品添加物や医薬品、化粧品などに用いることができる。
[0062] [実施例]
以下に、実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明する.
実施例 1
[0063] < 1 >sacB搭載遺伝子破壊用ベクターの構築
(A) pBS3の構築
sacB遺伝子をバチルス ·ズブチリスの染色体 DNAを铸型として配列番号 1と 2をプラ イマ一として用いて、 PCRにより取得した。 PCR反応は、 LA taq(TaKaRa)を用い、 94 °Cで 5分保温を 1サイクル行った後、変性 94°C 30秒、会合 49°C 30秒、伸長 72°C 2分 力もなるサイクルを 25回繰り返した。生成した PCR産物を常法により精製後 Bglllと BamHIで消化し、平滑ィ匕した。この断片を pHSG299の Availで消化後、平滑化した部 位に挿入した。この DNAを用いて、ェシエリヒア'コリ JM109のコンビテントセル（宝バイ ォ社製)を用いて形質転換を行 ヽ、カナマイシン (以下、 Kmと略す) 25 μ g/mlを含む LB培地に塗布し、ー晚培養した。その後、出現したコロニーを釣り上げ、単コロニー を分離し形質転換体を得た。得られた形質転換体よりプラスミドを抽出し、目的の PCR産物が挿入されて!、たものを pBS3と命名した。 pBS3の構築過程を図 1に示す。
[0064] (B) pBS4Sの構築
PBS3上に存在するカナマイシン耐性遺伝子配列中の Smal部位をァミノ基置換を伴 わない塩基置換によりカナマイシン耐性遺伝子を破壊したプラスミドをクロスオーバ 一 PCRで取得した。まず、 pBS3を铸型として配列番号 3, 4の合成 DNAをプライマーと して PCRを行い、カナマイシン耐性遺伝子の N末端側の増幅産物を得る。一方 Km耐 性遺伝子の C末端側の増幅産物を得るために pBS3を铸型として配列番号 5, 6の合 成 DNAを铸型として PCRを行った。 PCR反応は Pyrobest DNA Polymerase (宝バイオ 社製)を用い、 98 °Cで 5分保温を 1サイクル行った後、変性 98°C 10秒、会合 57°C 30 秒、伸長 72°C 1分力もなるサイクルを 25回繰り返すことにより目的の PCR産物を得るこ とができる。配列番号 4と 5は部分的に相補的であり、またこの配列内に存在する Smal 部位はアミノ酸置換を伴わな 、塩基置換を施すことにより破壊されて 、る。次に Smal 部位が破壊された変異型カナマイシン耐性遺伝子断片を得るために、上記カナマイ シン耐性遺伝子 N末端側及び C末端側の遺伝子産物を、それぞれほぼ等モルとなる ように混合し、これを铸型として配列番号 3, 6の合成 DNAをプライマーとして PCRを行 い変異導入された Km耐性遺伝子増幅産物を得た。 PCR反応は Pyrobest DNA Polymerase (宝バイオ社)を用い、 98 °Cで 5分保温を 1サイクル行った後、変性 98°C 10 秒、会合 57°C 30秒、伸長 72°C 1.5分力もなるサイクルを 25回繰り返すことにより目的 の PCR産物を得ることができる。
[0065] PCR産物を常法により精製後 Banllで消化し、上記の pBS3の Banll部位に挿入した。
この DNAを用いて、ェシエリヒア 'コリ JM109のコンビテントセル（宝バイオ社製宝バイ ォ社製)を用いて形質転換を行 ヽ、カナマイシン 25 μ g/mlを含む LB培地に塗布し、 一晩培養した。その後、出現したコロニーを釣り上げ、単コロニー分離し、形質転換 体を得た。得られた形質転換体よりプラスミドを抽出し、 目的の PCR産物が挿入され て！、たものを pBS4Sと命名した。 pBS4Sの構築過程を図 2に示す。
実施例 2
[0066] く LDH遺伝子破壊株の構築 >
(A)ラタテートデヒドロゲナーゼ遺伝子破壊用断片のクローユング
ブレビバタテリゥム ·ラタトフアーメンタム 2256株由来のラタテートデヒドロゲナーゼ（ 以下、 ldh遺伝子と略す)の ORFを欠失した遺伝子断片は、既に公開されているコリネ バタテリゥム.グルタミカム ATCC13032の該遺伝子の塩基配列（GenBank Database Accession No.NC_003450の NCgl2810)を参考に設計した合成 DNAをプライマーとし て用いたクロスオーバー PCRで取得した。具体的にはブレビバタテリゥム'ラクトファー メンタム 2256株の染色体 DNAを铸型として、配列番号 7、 8の合成 DNAをプライマーと して常法により PCRを行い ldh遺伝子 N末端側の増幅産物を得た。一方、 ldh遺伝子 C 末端側の増幅産物を得るために、ブレビバタテリゥム 'ラタトフアーメンタム 2256株ゲノ ム DNAを铸型とし、配列番号 9、 10の合成 DNAをプライマーとして常法により PCRを行 つた。配列番号 8と 9は互いに相補的であり、 ldhの ORFの全配列を欠損させた構造と なっている。
なお、ブレビバタテリゥム 'ラタトフアーメンタム 2256株は、アメリカン 'タイプ ·カルチヤ 一'コレクション (ATCC)より分譲を受けることができる（住所 ATCC, P.O. Box 1549, Manassas, VA 20108, United States of America)。
[0067] 次に内部配列を欠失した ldh遺伝子断片を得るために、上記 ldhの N末側および C末 側の遺伝子産物をそれぞれほぼ等モルとなるように混合し、これを铸型として配列番 号 11と 12の合成 DNAをプライマーとして常法により PCRを行い変異導入された ldh遺 伝子増幅産物を得た。生成した PCR産物を常法により精製後 Sailで消化した後、上 記 PBS4Sの Sail部位に挿入した。この DNAを用いて、ェシエリヒア'コリ JM109のコンビ テントセル（宝バイオ社製）を用いて形質転換を行い、 IPTG 100 μ M、 X-Gal 40 μ g/mlおよび Km 25 g/mlを含む LB培地に塗布し、一晩培養した。その後、出現した 白色のコロニーを釣り上げ、単コロニー分離し、形質転換体を得た。得られた形質転 換体よりプラスミドを抽出し、 目的の PCR産物が挿入されていたものを p A ldh56- 1と命 名した。該プラスミドの構築図を図 3に示す。
[0068] (B) ldh遺伝子破壊株の作成
上記 (A)で得られた p Δ ldh56-lはコリネ型細菌の細胞内で自律複製可能とする領 域を含まないため、本プラスミドでコリネ型細菌を形質転換した場合、極めて低頻度 であるが本プラスミドが相同組換えにより染色体に組み込まれた株が形質転換体とし て出現する。ブレビバタテリゥム 'ラタトフアーメンタム 2256株を電気パルス法により高 濃度のプラスミド P Δ ldh56-lを用いて形質転換し、カナマイシン 25 μ g/mlを含む CM- Dex培地（グルコース 5g/L、ポリペプトン 10g/L、イーストエキストラタト 10g/L、 KH PO lg/Lゝ MgSO · 7Η O 0.4g/Lゝ FeSO · 7Η Ο 0.01g/L、 MnSO · 7Η Ο 0.01g/L
2 4 4 2 4 2 4 2
、尿素 3g/L、大豆加水分解物 1.2g/L、 pH7.5(KOH))に塗布し、 31.5°Cで約 30時間 培養した。この培地上に生育した株は該プラスミドの ldh遺伝子断片とブレビバタテリ ゥム ·ラタトフアーメンタム 2256株ゲノム上の同遺伝子との間で相同組み換えを起こし た結果、同ゲノムに該プラスミドに由来するカナマイシン耐性遺伝子および SacB遺伝 子が挿入されて ヽる株である。
[0069] 次にこれらの一回目の糸且換え体をカナマイシンを含まな!/ヽ CM-Dex液体培地にて 31.5°Cで一晩培養し、適当に希釈した後、カナマイシンを含まない 10%ショ糖含有 Dex- S10培地（ショ糖 10g/L、ポリペプトン 10g/L、イーストエキストラタト 10g/L、 KH
2
PO lg/Lゝ MgSO · 7Η O 0.4g/L、 FeSO - 7H O 0.01g/L、 MnSO -4H O O.Olg/Lゝ尿
4 4 2 4 2 4 2 素 3g/L、大豆加水分解物 1.2g/L、ピオチン 10 /z g/L、 pH7.5(KOH))に塗布にし、 31.5°Cにて約 30時間培養した。その結果、 2回目の相同組み換えにより SacB遺伝子 が脱落しシユークロース非感受性となったと考えられる株約 50個得た。
[0070] この様にして得られた株の中には、その ldh遺伝子が p A ldh56-lに由来する変異型 に置き換わったものと野生型に戻ったものが含まれる。 ldh遺伝子が変異型であるか 野生型であるかの確認は、 Dex-S10寒天培地にて培養して得られた菌体を直接 PCR 反応に供し、 ldh遺伝子の検出を行うことによって容易に確認できる。 ldh遺伝子を PCR増幅するためのプライマー (配列番号 7および配列番号 10)を用いて分析した際 、 2256株の染色体 DNAを铸型にしたものよりも PCR産物の大きさが小さいものを ldh破 壊株として以降の実験に使用した。上記方法にてショ糖非感受性となった菌株を分 祈した結果、変異型 ldh遺伝子のみを有する株を選抜し、該株を 2256 A (Wh)株と命名 した。この株を親株としてさらに以下の実施例に示すような改変を行った。
実施例 3
[0071] <ピルべートォキシダーゼ遺伝子破壊株の構築 >
(A)ピルべートォキシダーゼ遺伝子破壊用断片のクローユング
ブレビバタテリゥム 'ラタトフアーメンタム 2256株のピルべートォキシダーゼ遺伝子（ 以下、該遺伝子を poxBとする）の ORFを欠失した遺伝子断片の取得は、既に公開さ れているコリネバクテリウム'ダルタミカム ATCC13032の該遺伝子の塩基配列（ GenBank Accession No. NC003450の NCgl2521)を参考に設計した合成 DNAをプラ イマ一として用いたクロスオーバー PCRで取得した。具体的には、ブレビバタテリゥム •ラタトフアーメンタム 2256株ゲノム DNAを铸型とし、配列番号 29と 30の合成 DNAをプ ライマーとして PCRを行 、、 poxB遺伝子 N末端側の増幅産物を得た。
[0072] 一方、 poxB遺伝子 C末端側の増幅産物を得るために、ブレビバタテリゥム 'ラタトファ ーメンタム 2256株ゲノム DNAを铸型として、配列番号 31と 32の合成 DNAをプライマ 一として PCRを行う。配列番号 30と 31は互いに相補的である。 PCR反応は、 KOD - plus- (TOYOBO)を用い、 N末端側、 C末端側ともに、 94°Cで 2分保温を 1サイクル行 つた後、変性 94°C 10秒、会合 55°C 30秒、伸長 68°C 40秒力 なるサイクルを 30回繰 り返した。次に、内部配列を欠失した poxB遺伝子断片を得るために、上記 poxB N末 端側および C末端側の遺伝子産物をそれぞれほぼ等モルとなるように混合し、これを 铸型として配列番号 33と 34の合成 DNAをプライマーとして PCRを行い変異導入され た poxB遺伝子増幅産物を得た。 PCR反応は、 KOD -plus- (TOYOBO)を用い、 94°C で 2分保温を 1サイクル行った後、変性 94°C 10秒、会合 55°C 30秒、伸長 68°C 70秒か らなるサイクルを 30回繰り返し、 目的の変異導入された poxB遺伝子増幅産物を得た。
[0073] 生成した PCR産物を常法により精製後 Xbalで消化し、上記実施例 1 (B)で構築した PBS4Sの Xbal部位に挿入した。この DNAを用いて、ェシエリヒア'コリ JM109のコンビテ ントセル（宝バイオ社製）を用いて形質転換を行い、 IPTG 100 μ Μ、 X- Gal 40 μ g/ml およびカナマイシン 25 /z g/mlを含む LB培地に塗布し、一晩培養した。その後、出現 した白色のコロニーを釣り上げ、単コロニー分離し、形質転換体を得た。得られた形 質転換体よりプラスミドを抽出し、目的の PCR産物が挿入されていたものを pBS4S:: Δ poxBと命名した。 pBS4S:: Δ ροχΒの構築過程を図 4に示した。
[0074] (Β) ροχΒ破壊株の作成
上記 (Α)で得られた pBS4S:: Δ poxBはコリネ型細菌の細胞内で自律複製可能とする 領域を含まないため、本プラスミドでコリネ型細菌を形質転換した場合、極めて低頻 度であるが本プラスミドが相同組換えにより染色体に組み込まれた株が形質転換体と して出現する。実施例 2で構築された、ブレビバタテリゥム 'ラタトフアーメンタム 2256 Δ (Wh)株を電気パルス法により高濃度のプラスミド pBS4S:: Δ poxBを用いて形質転換し 、カナマイシン 25 μ g/mlを含む CM- Dex培地に塗布し、 31.5°Cで約 30時間培養した。 この培地上に生育した株は該プラスミドの poxB遺伝子断片とブレビバタテリゥム 'ラタ トフアーメンタム 2256 Δ (Wh)株のゲノム上の同遺伝子との間で相同組み換えを起こし た結果、同ゲノムに該プラスミドに由来するカナマイシン耐性遺伝子および SacB遺伝 子が挿入されている。
[0075] 次にこれらの一回目の糸且換え体をカナマイシンを含まな!/ヽ CM-Dex液体培地にて 31.5°Cで一晩培養し、適当に希釈した後、カナマイシンを含まない 10%ショ糖含有 Dex-S10培地に塗布にし、 31.5°Cにて約 30時間培養した。
結果、 2回目の相同組み換えにより SacB遺伝子が脱落しシユークロース糖非感受性 となったと考えられる株約 30個得た。
[0076] この様にして得られた株の中には、その poxB遺伝子が pBS4S:: A poxBに由来する 変異型に置き換わったものと野生型に戻ったものが含まれる。 poxB遺伝子が変異型 であるか野生型であるかの確認は、 Dex-S10寒天培地にて培養して得られた菌体を 直接 PCR反応に供し、 poxB遺伝子の検出を行うことによって容易に確認できる。 poxB 遺伝子を PCR増幅するためのプライマー（配列番号 29および配列番号 32)を用いて 分析すると、野生型では 2.4kb、欠失領域を持つ変異型では 1.2kbの DNA断片を認め るはずである。
上記方法にてショ糖非感受性となった菌株を分析した結果、変異型遺伝子のみを有 する株を選抜し、該株を 2256 A (Wh, poxB)株と命名した。なお、この株を poxB破壊株 とも呼ぶ。
実施例 4
[0077] < poxB破壊株によるコハク酸生産 >
(A) poxB破壊株の培養評価
ブレビバタテリゥム 'ラタトフアーメンタム 2256 Δ (Wh)株及び 2256 Δ (ldh, poxB)株を用 いてコハク酸生産のための培養を以下のように行った。 CM- Dexプレート培地にて培 養して得た 2256 Δ (Wh)株及び 2256 Δ (ldh, poxB)株の菌体をシード A培地 3ml (グル コース 20g/L、 Urea 4g/Lゝ (NH ) SO 14g/Lゝ KH PO 0.5g/Lゝ K HPO 0.5g/Lゝ
4 2 4 2 4 2 4
MgSO - 7H O 0.5g/L、 FeSO - 7H O 0.02g/L、 MnSO - 7H O 0.02g/L、ビォチン 200
4 2 4 2 4 2
μ g/L、 VB^ HCl g/L、イーストエキストラタト lg/L、カザミノ酸 lg/L、： pH無調 整、グルコースのみ別に殺菌したのち添加）に接種し、好気条件にて 31.5°Cにて試 験管で約 16時間振とう培養を行った。
[0078] その後、その試験管にメイン A培地 3ml (グルコース 100g/L、亜硫酸ナトリウム
15g/L、 MgCO 71.4g/L)を接種し、通気を防ぐため、シリコン栓で密栓してコハク酸
3
生産培養を行った。培養は 31.5°Cで約 48時間振とうして培地中の糖がなくなる前に 培養を終了した。
[0079] 培養終了後、培養液中のコハク酸や副生酢酸の蓄積量は、培養液を適当に希釈し た後、液体クロマトグラフィーにより分析した。カラムは Shim-pack SCR-102H (Simazu )を二本直列接続したものを用い、サンプルは 5mM p-トルエンスルホン酸を用いて 40 °Cで溶出した。溶出液を 5mM p-トルエンスルホン酸および 100 μ M EDTAを含む 20mM Bis-Tris水溶液を用いて中和し、 CDD- lOAD(Simazu)にて電気伝導度を測定 することによりコハク酸や酢酸を測定した。このときの結果を表 1、図 5に示した。
[0080] 2256 Δ (ldh, poxB)株では、その親株の 2256 Δ (Wh)株に比べて、コハク酸生産に関 しては親株である 2256 Δ (Wh)株と同等であった力 コハク酸あたりの酢酸は 2256 Δ (Wh,p0XB)株の約 1/3〜2/3となり大幅に酢酸が副生した。この結果より、嫌気条件下 における酢酸低減に関しては、 poxB活性の消失または低下が有効であることが示さ れた。
[0081] [表 1] 表 1. poxB破壊株のコハク酸と酢酸、 ピルビン酸生産
Figure imgf000029_0001
実施例 5
く poxB、 pta、 ack破壊株、 poxB、 pta、 ack、 ach破壊株の構築 >
(5- 1)
<アセテートキナーゼ遺伝子破壊株の構築 >
(A)アセテートキナーゼ遺伝子破壊用断片のクローユング
ブレビバタテリゥム 'ラタトフアーメンタム 2256株のアセテートキナーゼ遺伝子（以下、 該遺伝子を ackとする）の ORFを欠失した遺伝子断片の取得は、既に公開されている コリネバクテリウム.グルタミカム ATCC13032の該遺伝子の塩基配列（GenBank Database Accession No.NC_003450の NCgl2656 ;配列番号 45)を参考に設計した合 成 DNAをプライマーとして用いたクロスオーバー PCRで取得した。具体的には、ブレ ビバクテリウム 'ラタトフアーメンタム 2256株ゲノム DNAを铸型とし、配列番号 13と 14の 合成 DNAをプライマーとして PCRを行い、 ack遺伝子 N末端側の増幅産物を得た。一 方、 ack遺伝子 C末端側の増幅産物を得るために、ブレビバタテリゥム'ラクトファーメ ンタム 2256株ゲノム DNAを铸型として、配列番号 15と 16の合成 DNAをプライマーとし て PCRを行った。配列番号 14と 15は部分的に相補的である。 PCR反応は、 KOD - plus- (TOYOBO)を用い、 94°Cで 2分保温を 1サイクル行った後、 N末端側に関しては 、変性 94°C 10秒、会合 55°C 30秒、伸長 68°C 30秒力 なるサイクルを、 C末端側に関 しては変性 94°C 10秒、会合 55°C 30秒、伸長 68°C 2分力 なるサイクルをそれぞれ 30 回繰り返した。次に、内部配列を欠失した ack遺伝子断片を得るために、上記 ack N 末側および C末側の遺伝子産物をそれぞれほぼ等モルとなるように混合し、これを铸 型として配列番号 17と 18の合成 DNAをプライマーとして PCRを行い変異導入された ack遺伝子増幅産物を得た。 PCR反応は、 KOD -plus- (東洋紡社製)を用い、 94°Cで 2 分保温を 1サイクル行った後、変性 94°C 10秒、会合 55°C 30秒、伸長 68°C 2.5分から なるサイクルを 30回繰り返し、 目的の変異導入された ack遺伝子増幅産物を得た。
[0083] 生成した PCR産物を常法により精製後 Xbalで消化し、上記の実施例 1 (C)で構築し た PBS5Tの Xbal部位に挿入した。この DNAを用いて、ェシエリヒア'コリ JM109のコンビ テントセル（宝バイオ社製）を用いて形質転換を行い、 IPTG 100 μ M、 X-Gal 40 μ g/mlおよびカナマイシン 25 g/mlを含む LB培地に塗布し、ー晚培養した。その後、 出現した白色のコロニーを釣り上げ、単コロニー分離し、形質転換体を得た。得られ た形質転換体よりプラスミドを抽出し、 目的の PCR産物が挿入されていたものを pBS5T:: A ackと命名した。 pBS5T:: A ackの構築過程を図 6に示した。
[0084] (B) ack破壊株の作成
上記 (A)で得られた pBS5T:: Δ ackにおけるコリネ型細菌の複製起点は温度感受性 である。具体的には、該プラスミドは 25°Cではコリネ型細菌の細胞内で自律複製可能 であるが、 31.5°C (あるいは 34°C)では自律複製不可能となる。該プラスミドを用いて ブレビバタテリゥム 'ラタトフアーメンタム 2256 Δ (Wh)株を電気パルス法により形質転換 し、カナマイシン 25 μ g/mlを含む CM- Dex培地に塗布し、 25°Cにて 2晚培養し、出現 したコロニーを単離して形質転換体とした。この形質転換体は該プラスミドを保有して V、る。これらの形質転換体をカナマイシンを含まな 、上記 CM-Dex培地にて 34°Cで ー晚培養し、適当に希釈した後、カナマイシンを 25 μ g/ml含む CM-Dex培地に塗布 し、 34°Cで約 30時間培養した。この培地上に生育した株は該プラスミドの ack遺伝子 断片とブレビバタテリゥム ·ラタトフアーメンタム 2256 Δ (Wh)株ゲノム上の同遺伝子との 間で相同組み換えを起こした結果、同ゲノムに該プラスミドに由来するカナマイシン 耐性遺伝子および SacB遺伝子が挿入されている。
[0085] 次にこれらの一回目の糸且換え体をカナマイシンを含まな!/ヽ CM-Dex液体培地にて 31.5°Cで一晩培養し、適当に希釈した後、カナマイシンを含まない 10%ショ糖含有 Dex-SlO培地に塗布にし、 31.5°Cにて約 30時間培養した。その結果、 2回目の相同組 み換えにより SacB遺伝子が脱落しショ糖非感受性となったと考えられる株約 50個得た
[0086] この様にして得られた株の中には、その ack遺伝子が pBS5T:: A ackに由来する変異 型に置き換わったものと野生型に戻ったものが含まれる。 ack遺伝子が変異型である か野生型であるかの確認は、 Dex-S10寒天培地にて培養して得られた菌体を直接 PCR反応に供し、 ack遺伝子の検出を行うことによって容易に確認できる。 ack遺伝子 を PCR増幅するためのプライマー（配列番号 13および配列番号 16)を用いて分析す ると、野生型では 3.7kb、欠失領域を持つ変異型では 2.5kbの DNA断片を認めるはず である。上記方法にてショ糖非感受性となった菌株を分析した結果、変異型遺伝子 のみを有する株を選抜し、該株を 2256 A (Wh, ack)と命名した。
[0087] (5- 2)
<アセテートキナーゼ、ホスホトランスァセチラーゼ遺伝子破壊株の構築 >
(A)アセテートキナーゼ、ホスホトランスァセチラーゼ遺伝子破壊用断片のクローニン グ
ブレビバタテリゥム 'ラタトフアーメンタム 2256株のアセテートキナーゼ (ack)とホスホト ランスァセチラーゼ遺伝子（以下、該遺伝子を ptaとする）の ORFはオペロン構造をと つており、これらの ORFを同時に欠失させることが可能である。これらの遺伝子断片の 取得は、既に公開されているコリネバタテリゥム'ダルタミカム ATCC13032の該遺伝子 の塩基配列（GenBank Database Accession No. NC_003450の NCgl2656及び 2657 ; 配列番号 45)を参考に設計した合成 DNAをプライマーとして用いたクロスオーバー PCRで取得した。具体的には、ブレビバタテリゥム 'ラタトフアーメンタム 2256株ゲノム DNAを铸型とし、配列番号 19と 20の合成 DNAをプライマーとして PCRを行い、 pta遺 伝子 N末端側の増幅産物を得た。一方、 ack遺伝子 C末端側の増幅産物を得るため に、ブレビバタテリゥム 'ラタトフアーメンタム 2256株ゲノム DNAを铸型として、配列番号 21と 16の合成 DNAをプライマーとして PCRを行った。配列番号 20と 21は部分的に相 補的である。 PCR反応は、 KOD -plus-(TOYOBO)を用い、 94°Cで 2分保温を 1サイク ル行った後、 N末端側に関しては、変性 94°C 10秒、会合 55°C 30秒、伸長 68°C 30秒 力もなるサイクルを、 C末端側に関しては変性 94°C 10秒、会合 55°C 30秒、伸長 68°C 2分力もなるサイクルをそれぞれ 30回繰り返した。
[0088] 次に、 ptaと ackの内部配列を欠失した pta_ack遺伝子断片を得るために、上記 pta N 末側および ackC末側の遺伝子産物をそれぞれほぼ等モルとなるように混合し、これ を铸型として配列番号 22と 18の合成 DNAをプライマーとして PCRを行い変異導入さ れた pta-ack遺伝子増幅産物を得た。 PCR反応は、 KOD -plus-(TOYOBO)を用い、 94°Cで 2分保温を 1サイクル行った後、変性 94°C 10秒、会合 55°C 30秒、伸長 68°C 2.5分力もなるサイクルを 30回繰り返し、目的の変異導入された pta-ack遺伝子増幅産 物を得た。生成した PCR産物を常法により精製後 Xbalで消化し、 pBS5Tの Xbal部位 に挿入した。この DNAを用いて、ェシエリヒア'コリ JM109のコンビテントセル（宝バイオ 社製）を用いて形質転換を行い、 IPTG 100 M、 X- Gal 40 g/mlおよびカナマイシ ン 25 g/mlを含む LB培地に塗布し、一晩培養した。その後、出現した白色のコ口- 一を釣り上げ、単コロニー分離し、形質転換体を得た。得られた形質転換体よりブラ スミドを抽出し、目的の PCR産物が挿入されていたものを pBS5T:: A pta-ackと命名し た。 pBS5T:: Δ pta-ackの構築過程を図 7に示した。
[0089] (B) pta- ack破壊株の作成
上記 (A)で得られた pBS5T:: Δ pta-ackにおけるコリネ型細菌の複製起点は温度感 受性である。具体的には、該プラスミドは 25°Cではコリネ型細菌の細胞内で自律複製 可能であるが、 31.5°C (あるいは 34°C)では自律複製不可能となる。該プラスミドを用 いてブレビバタテリゥム 'ラタトフアーメンタム 2256 A (ldh)株を電気パルス法により形質 転換し、カナマイシン 25 μ g/mlを含む CM- Dex培地に塗布し、 25°Cにて 2晚培養し、 出現したコロニーを単離して形質転換体とした。この形質転換体は該プラスミドを保 有して 、る。これらの形質転換体をカナマイシンを含まな 、CM- Dex液体培地にて 34 °Cでー晚培養し、適当に希釈した後、カナマイシンを 25 μ g/ml含む CM-Dex培地に 塗布し、 34°Cで約 30時間培養した。この培地上に生育した株は該プラスミドの pta-ack遺伝子断片とブレビバタテリゥム 'ラタトフアーメンタム 2256 Δ (Wh)株ゲノム上 の同遺伝子との間で相同組み換えを起こした結果、同ゲノムに該プラスミドに由来す るカナマイシン耐性遺伝子および SacB遺伝子が挿入されている。
[0090] 次にこれらの一回目の糸且換え体をカナマイシンを含まな!/ヽ CM-Dex液体培地にて 31.5°Cでー晚培養し、適当に希釈した後、カナマイシンを含まない 10%シユークロース 含有 Dex-S10培地に塗布し、 31.5°Cにて約 30時間培養した。その結果、 2回目の相 同組み換えにより SacB遺伝子が脱落しシユークロース非感受性となったと考えられる 株約 50個得た。
[0091] この様にして得られた株の中には、その ptaと ack遺伝子力 ¾BS5T:: A pta-ackに由来 する変異型に置き換わったものと野生型に戻ったものが含まれる。 ack遺伝子が変異 型であるか野生型であるかの確認は、 Dex-S10寒天培地にて培養して得られた菌体 を直接 PCR反応に供し、 ptaと ack遺伝子の検出を行うことによって容易に確認できる 。 pta-ack遺伝子を PCR増幅するためのプライマー（配列番号 19および配列番号 16) を用いて分析すると、野生型では 5.0kb、欠失領域を持つ変異型では 2.7kbの DNA断 片を認めるはずである。
上記方法にてショ糖非感受性となった菌株を分析した結果、変異型遺伝子のみを有 する株を選抜し、該株を 2256 A (ldh, pta, ack)と命名した。
[0092] (5- 3)
<アセテートキナーゼ、ホスホトランスァセチラーゼ、ピルべートォキシダーゼ遺伝 子破壊株の構築〉
(A)ピルべートォキシダーゼ遺伝子破壊用断片のクローユング
ブレビバタテリゥム 'ラタトフアーメンタム 2256株のピルべートォキシダーゼ遺伝子（ 以下、該遺伝子を poxBとする）の ORFを欠失した遺伝子断片の取得は、既に公開さ れているコリネバクテリウム'ダルタミカム ATCC13032の該遺伝子の塩基配列（ GenBank Database Accession No. NC— 003450の NCgl2521；配列番号 48)を参考に 設計した合成 DNAをプライマーとして用いたクロスオーバー PCRで取得した。具体的 には、ブレビバタテリゥム 'ラタトフアーメンタム 2256株ゲノム DNAを铸型とし、配列番 号 23と 24の合成 DNAをプライマーとして PCRを行 、、 poxB遺伝子 N末端側の増幅産 物を得た。
[0093] 一方、 poxB遺伝子 C末端側の増幅産物を得るために、ブレビバタテリゥム 'ラタトファ ーメンタム 2256株ゲノム DNAを铸型として、配列番号 25と 26の合成 DNAをプライマー として PCRを行う。配列番号 24と 25は互いに相補的である。 PCR反応は、 KOD - plus- (TOYOBO)を用い、 N末端側、 C末端側ともに、 94°Cで 2分保温を 1サイクル行 つた後、変性 94°C 10秒、会合 55°C 30秒、伸長 68°C 40秒力 なるサイクルを 30回繰 り返した。次に、内部配列を欠失した poxB遺伝子断片を得るために、上記 poxB N末 端側および C末端側の遺伝子産物をそれぞれほぼ等モルとなるように混合し、これを 铸型として配列番号 27と 28の合成 DNAをプライマーとして PCRを行い変異導入され た poxB遺伝子増幅産物を得た。 PCR反応は、 KOD -plus- (TOYOBO)を用い、 94°C で 2分保温を 1サイクル行った後、変性 94°C 10秒、会合 55°C 30秒、伸長 68°C 70秒か らなるサイクルを 30回繰り返し、目的の変異導入された poxB遺伝子増幅産物を得た。
[0094] 生成した PCR産物を常法により精製後 Xbalで消化し、上記実施例 1 (C)で構築した PBS5Tの Xbal部位に挿入した。この DNAを用いて、ェシエリヒア'コリ JM109のコンビテ ントセル（宝バイオ社製）を用いて形質転換を行い、 IPTG 100 μ Μ、 X- Gal 40 μ g/ml およびカナマイシン 25 g/mlを含む LB培地に塗布し、一晩培養した。その後、出現 した白色のコロニーを釣り上げ、単コロニー分離し、形質転換体を得た。得られた形 質転換体よりプラスミドを抽出し、目的の PCR産物が挿入されていたものを pBS5T:: Δ poxBと命名した。 pBS5T:: Δ ροχΒの構築過程を図 8に示した。
[0095] (Β) ροχΒ破壊株の作成
上記 (Α)で得られた pBS5T:: Δ poxBにおけるコリネ型細菌の複製起点は温度感受 性である。具体的には、該プラスミドは 25°Cではコリネ型細菌の細胞内で自律複製可 能である力 31.5°C (あるいは 34°C)では自律複製不可能となる。該プラスミドを用い てブレビバタテリゥム 'ラタトフアーメンタム 2256 A (ldh, pta, ack)株を電気パルス法によ り形質転換し、カナマイシン 25 μ g/mlを含む CM- Dex培地に塗布し、 25°Cにて 2晚培 養し、出現したコロニーを単離して形質転換体とした。この形質転換体は該プラスミド を保有しているはずである。
[0096] これらの形質転換体をカナマイシンを含まな!/、CM- Dex液体培地にて 34°Cでー晚 培養し、適当に希釈した後、カナマイシンを 25 μ g/ml含む CM-Dex培地に塗布し、 34 °Cで約 30時間培養した。この培地上に生育した株は該プラスミドの poxB遺伝子断片 とブレビバタテリゥム 'ラタトフアーメンタム 2256 A (ldh, pta, ack)株株ゲノム上の同遺伝 子との間で相同組み換えを起こした結果、同ゲノムに該プラスミドに由来するカナマ イシン耐性遺伝子および SacB遺伝子が挿入されている。次にこれらの一回目の組換 え体をカナマイシンを含まない CM- Dex液体培地にて 31.5°Cでー晚培養し、適当に 希釈した後、カナマイシンを含まな!/ヽ 10%シユークロース含有 Dex-S 10培地に塗布に し、 31.5°Cにて約 30時間培養した。その結果、 2回目の相同組み換えにより SacB遺伝 子が脱落しショ糖非感受性となったと考えられる株約 50個得た。
[0097] この様にして得られた株の中には、その poxB遺伝子が pBS5T:: A poxBに由来する 変異型に置き換わったものと野生型に戻ったものが含まれる。アセテートキナーゼ遺 伝子が変異型であるか野生型であるかの確認は、 Dex-SlO寒天培地にて培養して得 られた菌体を直接 PCR反応に供し、 poxB遺伝子の検出を行うことによって容易に確 認できる。 poxB遺伝子を PCR増幅するためのプライマー（配列番号 23および配列番 号 26)を用いて分析すると、野生型では 2.4kb、欠失領域を持つ変異型では 1.2kbの DNA断片を検出出来る。上記方法にてショ糖非感受性となった菌株を分析した結果 、変異型遺伝子のみを有する株を選抜し、該株を 2256 A (Wh, pta, ack, poxB)と命名 した。なお、この株を pta,ack,poxB破壊株とも呼ぶ。
[0098] (5-4)
<poxB、 pta、 ack、 ach遺伝子破壊株の構築 >
(A)ァセチル CoAノヽイド口ラーゼ遺伝子破壊用断片のクローユング
ブレビバタテリゥム 'ラタトフアーメンタム 2256株のァセチル CoAノヽイド口ラーゼ遺伝 子（以下、該遺伝子を achとする）の ORFを欠失した遺伝子断片の取得は、既に公開 されているコリネバクテリウム'ダルタミカム ATCC13032の該遺伝子の塩基配列（ GenBank Database Accession No. NC_003450の NCgl2480 ;配列番号 50)を参考に 設計した合成 DNAをプライマーとして用いたクロスオーバー PCRで取得した。具体的 には、ブレビバタテリゥム 'ラタトフアーメンタム 2256株ゲノム DNAを铸型とし、配列番 号 35と 36の合成 DNAをプライマーとして PCRを行 、、 ach遺伝子 C末端側の増幅産物 を得る。一方、 ach遺伝子 N末端側の増幅産物を得るために、ブレビバタテリゥム 'ラタ トフアーメンタム 2256株ゲノム DNAを铸型として、配列番号 37と 38の合成 DNAをプライ マーとして PCRを行う。配列番号 36と 37は互いに相補的である。 PCR反応は、 KOD -plus- (東洋紡社製)を用い、 N末端側、 C末端側ともに、 94°Cで 2分保温を 1サイクル 行った後、変性 94°C 10秒、会合 55°C 30秒、伸長 68°C 50秒力 なるサイクルを 30回 繰り返した。次に、内部配列を欠失した ach遺伝子断片を得るために、上記 achの N末 側および C末側の遺伝子産物をそれぞれほぼ等モルとなるように混合し、これを铸型 として配列番号 39と 40の合成 DNAをプライマーとして PCRを行い変異導入された ach 遺伝子増幅産物を得た。 PCR反応は、 KOD - plus- (TOYOBO)を用い、 94°Cで 2分保 温を 1サイクル行った後、変性 94°C 10秒、会合 55°C 30秒、伸長 68°C 90秒力 なるサ イタルを 30回繰り返し、目的の変異導入された ach遺伝子増幅産物を得た。生成した PCR産物を常法により精製後 Xbalで消化し、上記実施例 1 (B)で構築した pBS4Sの Xbal部位に挿入した。この DNAを用いて、ェシエリヒア'コリ JM109のコンビテントセル（ 宝バイオ社製）を用いて形質転換を行い、 IPTG 100 μ Μ、 X- Gal 40 μ g/mlおよび力 ナマイシン 25 /z g/mlを含む LB培地に塗布し、一晩培養した。その後、出現した白色 のコロニーを釣り上げ、単コロニー分離し、形質転換体を得た。得られた形質転換体 よりプラスミドを抽出し、目的の PCR産物が挿入されていたものを pBS4S:: A achと命名 した。 pBS4S:: A achの構築過程を図 9に示した。
[0099] (B) ach破壊株の作成
上記 (A)で得られた pBS4S:: Δ achはコリネ型細菌の細胞内で自律複製可能とする 領域を含まないため、本プラスミドでコリネ型細菌を形質転換した場合、極めて低頻 度であるが本プラスミドが相同組換えにより染色体に組み込まれた株が形質転換体と して出現する。ブレビバタテリゥム 'ラタトフアーメンタム、 2256 A (Wh, pta, ack, poxB) 株、及び 2256株を電気パルス法により高濃度のプラスミド pBS4S:: Δ achを用いて形質 転換し、カナマイシン 25 μ g/mlを含む CM- Dex培地に塗布し、 31.5°Cで約 30時間培 養した。この培地上に生育した株は該プラスミドの ach遺伝子断片とブレビバクテリウ ム'ラタトフアーメンタム 2256 A (ldh)株、 2256 A (ldh, pta, ack)株、 2256 A (ldh, pta, ack, poxB)株、及び 2256 A (ldh, pta, ack, poxB, ach)株のそれぞれのゲノム上の同遺 伝子との間で相同組み換えを起こした結果、同ゲノムに該プラスミドに由来するカナ マイシン耐性遺伝子および SacB遺伝子が挿入されている。
[0100] 次にこれらの一回目の糸且換え体をカナマイシンを含まな!/ヽ CM-Dex液体培地にて 31.5°Cで一晩培養し、適当に希釈した後、カナマイシンを含まない 10%ショ糖含有 Dex-S10培地に塗布にし、 31.5°Cにて約 30時間培養した。その結果、 2回目の相同組 み換えにより SacB遺伝子が脱落しシユークロース糖非感受性となったと考えられる株 約 50個得た。
[0101] この様にして得られた株の中には、その ach遺伝子が pBS4S:: A achに由来する変異 型に置き換わったものと野生型に戻ったものが含まれる。 ach遺伝子が変異型である か野生型であるかの確認は、 Dex-SlO寒天培地にて培養して得られた菌体を直接 PCR反応に供し、 ach遺伝子の検出を行うことによって容易に確認できる。 ach遺伝子 を PCR増幅するためのプライマー（配列番号 35および配列番号 38)を用いて分析す ると、野生型では 2.9kb、欠失領域を持つ変異型では 1.4kbの DNA断片を認めるはず である。上記方法にてショ糖非感受性となった菌株を分析した結果、変異型遺伝子 のみを有する株を選抜し 2256 A (ldh, pta, ack, poxB)株から得られた該株を 2256 Δ (ldh, pta, ack, poxB, ach)株と名づけた。なお、この株を ach、 pta、 ack、 poxB破壊株と も呼ぶ。
実施例 6
[0102] くァシルホスファターゼ遺伝子破壊株の構築〉
(A)ァシルホスファターゼ遺伝子破壊用断片のクローユング
ブレビバタテリゥム 'ラタトフアーメンタム 2256株のァシルホスファターゼ遺伝子（以下 、該遺伝子を acpとする）の ORFを欠失した遺伝子断片の取得は、マイコバクテリウム' ッベルク口シスの acp遺伝子の配列と相同性の高い配列をゲノム解析により明らかに なったブレビバタテリゥム 'ラタトフアーメンタム ATCC13869株の配列から検索し、該 遺伝子の塩基配列 (配列番号 52)を基に設計した合成 DNAをプライマーとして用い たクロスオーバー PCRで取得した。具体的には、ブレビバタテリゥム 'ラタトフアーメンタ ム 2256株ゲノム DNAを铸型とし、配列番号 54と 55の合成 DNAをプライマーとして PCRを行い、 acp遺伝子 C末端側の増幅産物を得る。一方、 acp遺伝子 N末端側の増 幅産物を得るために、ブレビバタテリゥム 'ラタトフアーメンタム 2256株ゲノム DNAを铸 型として、配列番号 56と 57の合成 DNAをプライマーとして PCRを行う。配列番号 30と 31は互いに相補的である。 PCR反応は、 KOD -plus- (東洋紡社製)を用い、 N末端側 、 C末端側ともに、 94°Cで 2分保温を 1サイクル行った後、変性 94°C 10秒、会合 55°C 30秒、伸長 68°C 35秒力もなるサイクルを 30回繰り返した。次に、内部配列を欠失した acp遺伝子断片を得るために、上記 acp N末側および C末側の遺伝子産物をそれぞ れほぼ等モルとなるように混合し、これを铸型として配列番号 58と 59の合成 DNAをプ ライマーとして PCRを行 、変異導入された acp遺伝子増幅産物を得た。 PCR反応は、 KOD -plus-(TOYOBO)を用い、 94°Cで 2分保温を 1サイクル行った後、変性 94°C 10 秒、会合 55°C 30秒、伸長 68°C 60秒力 なるサイクルを 30回繰り返し、 目的の変異導 入された acp遺伝子増幅産物を得た。
[0103] 生成した PCR産物を常法により精製後 Xbalで消化し、上記実施例 1 (C)で構築した PBS5Tの Xbal部位に挿入した。この DNAを用いて、ェシエリヒア'コリ JM109のコンビテ ントセル（宝バイオ社製）を用いて形質転換を行い、 IPTG 100 μ Μ、 X- Gal 40 μ g/ml およびカナマイシン 25 /z g/mlを含む LB培地に塗布し、一晩培養した。その後、出現 した白色のコロニーを釣り上げ、単コロニー分離し、形質転換体を得た。得られた形 質転換体よりプラスミドを抽出し、 目的の PCR産物が挿入されていたものを pBS5T:: Δ acpと命名した。 pBS5T:: A acpの構築過程を図 10に示した。
[0104] (B) acp破壊株の作成
上記 (A)で得られた pBS5T:: Δ acpはコリネ型細菌の細胞内で自律複製可能とする 領域を含まないため、本プラスミドでコリネ型細菌を形質転換した場合、極めて低頻 度であるが本プラスミドが相同組換えにより染色体に組み込まれた株が形質転換体と して出現する。ブレビバタテリゥム 'ラタトフアーメンタム 2256 A (ldh, pta, ack, poxB)株 を電気パルス法により高濃度のプラスミド PBS5T:: Δ acpを用いて形質転換し、カナマ イシン 25 μ g/mlを含む CM- Dex培地に塗布し、 31.5°Cで約 30時間培養した。この培 地上に生育した株は該プラスミドの acp遺伝子断片とブレビバタテリゥム'ラクトファーメ ンタム 2256 A (ldh, pta, ack, poxB)株のそれぞれのゲノム上の同遺伝子との間で相同 組み換えを起こした結果、同ゲノムに該プラスミドに由来するカナマイシン耐性遺伝 子および SacB遺伝子が挿入されて!、る。
[0105] 次にこれらの一回目の糸且換え体をカナマイシンを含まな!/ヽ CM-Dex液体培地にて 31.5°Cでー晚培養し、適当に希釈した後、カナマイシンを含まない 10%シユークロース 含有 Dex-S10培地に塗布にし、 31.5°Cにて約 30時間培養した。その結果、 2回目の相 同組み換えにより SacB遺伝子が脱落しショ糖非感受性となったと考えられる株約 50 個得た。
[0106] この様にして得られた株の中には、その acp遺伝子が pBS5T:: A acpに由来する変異 型に置き換わったものと野生型に戻ったものが含まれる。 acp遺伝子が変異型である か野生型であるかの確認は、 Dex-S10寒天培地にて培養して得られた菌体を直接 PCR反応に供し、 acp遺伝子の検出を行うことによって容易に確認できる。 acp遺伝子 を PCR増幅するためのプライマー（配列番号 54および配列番号 57)を用いて分析す ると、野生型では 1.3kb、欠失領域を持つ変異型では l.Okbの DNA断片を認めるはず である。上記方法にてショ糖非感受性となった菌株を分析した結果、変異型遺伝子 のみを有する株を選抜し、該株を 2256 A (ldh, pta, ack, poxB, acp)株と命名した。 実施例 7
[0107] < 7- 1 >ach、 pta、 ack、 poxB破壊株、 pta,ack,poxB破壊株の培養評価
ブレビバタテリゥム'ラタトフアーメンタム 2256 A (ldh)株、 2256 A (ldh, pta-ack, poxB) 株、及び 2256 A (Wh, pta-ack, poxB, ach)株を用いてコハク酸生産のための培養を以 下のように行った。 CM- Dexプレート培地にて培養して得た 2256 A (Wh)株、 2256 Δ (ldh, pta-ack, poxB)株、 2256 Δ (ldh, pta-ack, poxB, ach)株の菌体をシード B培地（グ ルコース 10g/Lゝ (NH ) SO 2.5g/L、 KH PO 0.5g/L、 MgSO - 7H O 0.25g/L、尿素
4 2 4 2 4 4 2
2g/Lゝ FeSO - 7H O 0.01g/L、 MnSO - 7H O 0.01g/L、ビォチン 50 g/L、 VB1 -HC1
4 2 4 2
100 μ g/L、プロトカテク酸 15mg/L、 CuSO 0.02mg/L、 CaCl 10mg/L、 pH7.0(KOH))
4 2
3mlに接種し、好気条件にて 31.5°Cにて試験管で約 15時間振とう培養を行った。
[0108] その後、その試験管にメイン B培地 3ml (グルコース 70g/L、 (NH ) SO 5g/L、 KH
4 2 4 2
PO 2g/L、尿素 3g/L、 FeSO - 7H O O.Olg/Lゝ MnSO - 7H O O.Olg/Lゝピオチン 200
4 4 2 4 2
μ g/L、 VB1 -HC1 200 μ g/L、 MOPS 40g/L、 MgCO 50g/L、 pH6.8(NaOH))を接種し
3
、通気を防ぐため、シリコン栓で密栓してコハク酸生産培養を行った。培養は 31.5°C で約 24時間振とうして培地中の糖がなくなる前に培養を終了した。培養終了後、培養 液中のコハク酸や副生酢酸の蓄積量は、培養液を適当に希釈した後、液体クロマト グラフィ一により分析した。カラムは Shim-pack SCR-102H (Simazu)を二本直列接続 したものを用い、サンプルは 5mM p-トルエンスルホン酸を用いて 40°Cで溶出した。溶 出液を 5mM p-トルエンスルホン酸および 100 μ M EDTAを含む 20mM Bis-Tris水溶 液を用いて中和し、 CDD-lOAD(Simazu)にて電気伝導度を測定することによりコハク 酸や副生酢酸測定した。そのときの結果を表 2に示した。
[0109] 対照の 2256 Δ ldh株に比べ、 2256 Δ (ldh, pta-ack, poxB)株の酢酸低減は大幅に低 下し、 2256 Δ (ldh, pta, ack, ach, poxB)株の酢酸は更に低減し、 2256 Δ (ldh, pta, ack, ach)株の約 40%低減した。このことより、 poxBと、 pta-ack、 achの全てまたはいず れかの活性が同時に消失または低下することにより、酢酸低減に有効であることが示 された。
[0110] [表 2]
表 2 . ACIIと PTA, ACK, POXBを組み合わせて破壊した株のコハク酸と酢酸生産
菌株 OD620( X 51 ) 消费糖 (g/L) コハク酸収率 ft) 齚酸 (/コハク酸％)
2256 Δ ldh 0.342 31.8 57.3 1 1.9
2256 Δ (ldh,pta,ack,poxB) 0.382 36.6 56.2 8.4
2256 Δ (ldh,pta,ack,poxBtach) 0.372 39.8 56.1 3.6
[0111] く 7— 2 >pta、 ack、 poxB、 acp破壊株の培養評価
ブレビバタテリゥム'ラタトフアーメンタム 2256 Δ (ldh)株、 2256 Δ (ldh, pta, ack, poxB) 株、 2256 Δ (ldh, pta-ack, poxB, acp)株を用いてコハク酸生産のための培養を以下の ように行った。 CM- Dexプレート培地にて培養して得た 2256 Δ (ldh)株、 2256 Δ (ldh, pta, ack, poxB)株、 2256 Δ (ldh, pta-ack, poxB, acp)株の菌体を上述のシード B培地 3mlに接種し、好気条件にて 31.5°Cにて試験管で約 15時間振とう培養を行った。 その後、その試験管に上述のメイン B培地 3mlを接種し、通気を防ぐため、シリコン 栓で密栓してコハク酸生産培養を行った。培養は 31.5°Cで約 24時間振とうして培地 中の糖がなくなる前に培養を終了した。
培養終了後、培養液中のコハク酸や副生酢酸の蓄積量は、培養液を適当に希釈し た後、液体クロマトグラフィーにより分析した。カラムは Shim-pack SCR-102H (Simazu )を二本直列接続したものを用い、サンプルは 5mM p-トルエンスルホン酸を用いて 40 °Cで溶出した。溶出液を 5mM p-トルエンスルホン酸および 100 μ M EDTAを含む 20mM Bis-Tris水溶液を用いて中和し、 CDD- lOAD(Simazu)にて電気伝導度を測定 することによりコハク酸や副生酢酸測定した。そのときの結果を表 3に示した。
[0112] [表 3] 表 3 . pta, ack, oxB, acp を組み合わせて欠損した株のコハク酸、 酢酸生産
菌株 OD620nm( 51) 消費糖 (gじ コハク酸収率 (％) 麵 /コハク酸、％)
2256 A ldh 0.333 45.9 49.2 10.4
2256 A dh, pta, ack, poxB) 0.307 40.7 45.2 8.9
2256A (ldh, pta, ack, poxB, acp) 0.341 44.3 46.0 8.8
[0113] その結果、上記 (C)で述べたように ACH活性を低下あるいは消失させなくとも、
PTA, ACK, POXB活性全てを低下あるいは消失することにより、コハク酸あたりの酢 酸は若干低減するが、更に ACP活性の低下或は消失させることによる、酢酸あるいは コハク酸生産への影響はほとんど見られな力つた。
産業上の利用の可能性
[0114] 本発明は、コハク酸の発酵生産に有用である。コハク酸は生分解性ポリマーの原料 、または、食品、医薬品、及びィ匕粧品などの原料として有用である。

Claims

請求の範囲
[1] コハク酸生産能を有するコリネ型細菌であって、ピルべートォキシダーゼの活性が低 下するように改変されたコリネ型細菌。
[2] 前記ピルべートォキシダーゼが、下記 (A)又は (B)に記載のタンパク質である請求 項 1に記載のコリネ型細菌、
(A)配列番号 49に示すアミノ酸配列を有するタンパク質、又は
(B)配列番号 49に示すアミノ酸配列にお 、て、 1若しくは数個のアミノ酸の置換、 欠失、挿入、または付カ卩を含むアミノ酸配列を有し、かつ、ピルべートォキシダーゼ 活性を有するタンパク質。
[3] 染色体上のピルべートォキシダーゼ遺伝子が破壊されたことによりピルべートォキシ ダーゼ活性が低下した、請求項 1又は 2に記載のコリネ型細菌。
[4] 前記ピルべートォキシダーゼ遺伝子力 下記 (a)又は (b)に記載の DNAである請求 項 3に記載のコリネ型細菌、
(a)配列番号 48の塩基番号 996— 2732の塩基配列を含む DNA、又は
(b)配列番号 48の塩基番号 996— 2732の塩基配列又は同塩基配列から調製さ れ得るプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダィズし、かつ、ピルべ一トォキ シダーゼ活性を有するタンパク質をコードする DNA。
[5] さらに、ホスホトランスァセチラーゼ、アセテートキナーゼ及びァセチル CoAノヽイドロラ ーゼ力 なる群より選ばれる 1種又は 2種以上の酵素の活性が低下するように改変さ れた、請求項 1〜4のいずれか一項に記載のコリネ型細菌。
[6] さらに、ラタテートデヒドロゲナーゼ活性が低下するように改変された請求項 1〜5の
V、ずれか一項に記載のコリネ型細菌。
[7] さらに、ピルべ一トカルボキシラーゼ活性が上昇するように改変された請求項 1〜6の
V、ずれか一項に記載のコリネ型細菌。
[8] 請求項 1〜7のいずれか一項に記載のコリネ型細菌またはその処理物を、炭酸ィォ ン、重炭酸イオンまたは二酸ィ匕炭素を含有する反応液中で有機原料に作用させるこ とにより、該反応液中にコハク酸を生成蓄積させ、該反応液からコハク酸を採取する ことを特徴とするコハク酸の製造方法。
[9] 嫌気的条件下において、前記細菌又はその処理物を有機原料に作用させることを 特徴する請求項 8に記載の製造方法。
[10] 請求項 8又は 9に記載の方法によりコハク酸を製造する工程、及び得られたコハク酸 を重合させる工程を含む、コハク酸含有ポリマーの製造方法。
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