WO2005087762A1 - Ｄｎａの特定塩基配列をアルキル化する新規インドール誘導体ならびにそれを用いたアルキル化剤および薬剤 - Google Patents

Ｄｎａの特定塩基配列をアルキル化する新規インドール誘導体ならびにそれを用いたアルキル化剤および薬剤 Download PDF

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Hiroshi Sugiyama
Toshikazu Bando
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    • C07D487/04—Ortho-condensed systems

Definitions

  • Novel indole derivatives that alkylate specific base sequences of DNA, and alkylating agents and drugs using the same
  • the present invention relates to a novel indole derivative that alkylates a specific base sequence of DNA, and an alkylating agent and a drug using the same. More specifically, the present invention relates to the alkylation of a specific base sequence, particularly to the expression of a gene abnormality.
  • the present invention relates to a novel indole derivative having a high anticancer effect and a very high reactivity, and an alkylich agent and a drug using the same.
  • Non-Patent Document 1 Dervan et al. Have anti-parallel oriented “N_methylpyrrole (hereinafter, also simply referred to as“ pyrrole ”or“ Py ”)”-“N-methylimidazole (hereinafter, referred to as The authors report that they found that polyamides (also simply referred to as “imidazole” or “Im”) bind to the minor groove (minor group) of DNA in a nucleotide sequence-specific manner.
  • polyamides also simply referred to as “imidazole” or “Im”
  • general rules have been derived that Py—Im recognizes CG base pairs, Im—Py recognizes G_C base pairs, and Py—Py recognizes A—T base pairs or TA base pairs.
  • hairpins with ⁇ linker (-NHCH CH CH CO-)
  • Non-Patent Document 2 Recognizes ⁇ - ⁇ base pairs or ⁇ -base pairs.
  • the ⁇ linker similarly has the ability to recognize an AT base pair or a TT base pair.
  • the ⁇ linker forms a ⁇ - turn structure represented by a bent hairpin-shaped portion.
  • the present inventors have developed a hybrid molecule in which Py-Im polyamide is linked to the segment A (Du) of the alkylation site of the antibiotic duocarmycin A, and filed a patent application (eg, And Patent Document 1).
  • the hybrid molecule selectively alkylated one portion of a 450 base pair DNA fragment based on the sequence recognition ability of the Py-Im polyamide (for example, see Non-Patent Document 4).
  • Non-Patent Document 4 for example, see Non-Patent Document 4
  • the completion of the reaction required several days, and the efficiency of the reaction was as low as several percent.
  • Patent Document 1 WO 00/15641
  • Non-patent document 1 1 1.80.01 11 ⁇ 2111.30 1997, 119, 7636
  • Non-patent document 2 _1.81111.11 ⁇ 2111.30 1997, 119, 7909
  • Non-Patent Document 3 8 111 ⁇ ⁇ 111.50 2000, 122, 4856
  • Non-Patent Document 4 8 111 ⁇ ⁇ 111.50 1999, 121, 4961
  • Non-Patent Document 5 VIII111 ⁇ ⁇ 111.50 2000, 122, 1602
  • Non-Patent Document 5 has problems in synthesis difficulty, instability of a linker site, reactivity of an alkylation site, and the like.
  • an object of the present invention is to alkylate a specific base sequence of DNA that can be synthesized in a shorter reaction step than conventional hybrid molecules and that has both highly reactive DNA alkylating ability and sequence recognition ability.
  • An object of the present invention is to provide a novel pyrroylimidazole polyamide-based compound and an alkylating agent and a drug functional molecule using the same. Means for solving the problem
  • the present invention solves the above problems by using a compound having an alkylation reaction site at the terminal of pyro-imidazole polyamide via an indole linker. And completed the present invention.
  • the indole derivative of the present invention has the following general formula (1):
  • R 1 is a functional group that alkylates DNA
  • R 2 is a hydrogen atom, an alkyl group or an acyl group
  • X is the following formula
  • the structural unit at the terminal on the R 2 side is represented by the following formula:
  • the alkylating agent for DNA of the present invention is characterized by comprising the above-mentioned indole derivative of the present invention.
  • the drug of the present invention is characterized by suppressing or activating the expression of a gene using the alkylidling agent of the present invention.
  • the indole derivative of the present invention is a functional molecule that selectively alkylates a specific base sequence present on a gene, and is recognized by changing the arrangement of imidazole, pyrrole, and the like in the molecule. It is possible to change the base sequence.
  • the synthesis method is practical and highly applicable in supplying a wide variety of products. This will enable drug discovery at the gene level as a useful logical agent for important gene sequences on the human genome or genetic abnormalities derived from diseases such as cancer.
  • FIG. 1 shows the DNA sequence-specific alkylating ability of compounds (41) and (31) of the present invention on long-chain DNA (pUC-II and pUC-II ′) and recognition of its base sequence. Show the model.
  • FIG. 2 shows the DNA sequence-specific alkylating ability of the compounds (3-2) and (3-3) of the present invention on long-chain DNA (pUC-II and pUC) and a model for recognizing the nucleotide sequence thereof.
  • FIG. 3 shows a nucleotide sequence-specific DNA alkylation model of compound (3-2) of the present invention.
  • FIG. 4 shows the DNA sequence-specific alkylation ability of compounds (3_2), (3_4) and (315) of the present invention on long-chain DNA (; i-F10906) and its base sequence recognition model. .
  • FIG. 5 shows DNA sequence-specific anolequinoleide of compound (3-6) of the present invention on long-chain DNA (pQBI63).
  • FIG. 6 shows the stability of the compounds (4-1) and (3-1) of the present invention under acidic and alkaline conditions.
  • Fig. 7 shows that the compound (3_7) of the present invention alone or the compound (3
  • FIG. 8 shows telomere sequence-specific alkylation of compound (43) of the present invention to a DNA fragment (446 bp) having a telomere repeat sequence 24 times.
  • FIG. 9 shows a bar graph of the anticancer activity of the compound (3-2) of the present invention evaluated using 39 types of cultured human cancer cells such as breast cancer and prostate cancer.
  • the indole derivative of the present invention has the following general formula (1): X is represented by the following formula,
  • m or k is an integer of 0 10, preferably 1 to 6, more preferably 23.
  • the number of the constituent units is not particularly limited, and is a force that can be appropriately selected depending on the sequence of the DNA to be alkylated. Usually, it is preferably 120, more preferably 2-7.
  • the order of the constituent units is not particularly limited, and the polyamide is designed by selecting as appropriate according to the sequence of the DNA to be subjected to alkylation.
  • the sequence of the DNA recognized by the indole derivative of the present invention is, in principle, Py—Im for C—G base pairs, Im—Py for G—C base pairs, and Py—Py Recognizes A_T base pairs or T-A base pairs, and ⁇ _ ⁇ and ⁇ - ⁇ etc. recognize ⁇ - ⁇ base pairs or ⁇ -base pairs.
  • ⁇ _ ⁇ and ⁇ _ ⁇ constitute a bent-shaped portion with a bent shape that only recognizes base pairs.
  • a mismatch may be rarely observed depending on the sequence status before and after the target sequence of DNA. For example, when there are many AT rich sequences, Im-Py next to the ⁇ -turn structure in hairpin type molecules often recognizes mismatch.
  • the indole linker which is a feature of the compound of the present invention, is characterized in that, for each indole, two Im, Py, etc., which can be paired, are always in pairs. You don't need it, you can just have one. Indole itself tends to recognize Py as a general rule, and tends to recognize C or T. Further, the alkylation reaction site of the indole derivative of the present invention is alkylated at the N-3 position of the purine base, particularly at the N-3 position of adenine.
  • the alkylation reaction site represented by R 1 may be a group having both alkylating ability and sequence recognition ability with respect to a specific base sequence present on DNA. Any group may be used without any particular limitation.
  • R 1 for example, the following formulas,
  • a preferred example is an alkylidene reaction site represented by In the above formulas (2) to (5), as long as the alkylidation reaction is not inhibited, a substituent may be introduced or the structure may be simplified.
  • formulas (2) and (5) are CPIs derived from Duocarmycin A.
  • formula (2) is referred to as DU86
  • formula (5) is referred to as Du.
  • l, 2,9,9a_tetrahydrocyclopropa [c] benzo [ e ] indol-4-one represented by the formula (3) is referred to as CBI.
  • Equation (3) includes the following (3-S) and (3-R),
  • R 3 represents a hydrogen atom, a peptide chain, a sugar chain, a polyethylene glycol group, as specific examples, a peptide chain, proteins, monosaccharides, disaccharides, polysaccharides, polyethylene Dali call And the like.
  • E represents a highly removable substituent such as a halogen atom, a mesinole group, and a tosyl group. Specific examples of halogen include bromine, fluorine and iodine, and preferably chlorine.
  • the three-membered ring has the same configuration as the natural Du represented by the above formula (5), and R 1 is represented by the formula (3
  • the indole derivative represented by the formula (1) which is 3-S) has an alkylating activity.
  • the indole derivative represented by the formula (1) in which R 1 is R-CBI represented by the formula (3-R) has an extremely weak alkylidani activity and is an inactive type.
  • R 2 is a hydrogen atom, an alkyl group or an acyl group.
  • the alkyl or acyl group (excluding CO) usually has a carbon number of 120, preferably 110, and more preferably a linear or branched lower alkyl group of 116. Specific examples include a methyl group, an ethyl group, an n-propyl group, an isopropyl group, an n-butyl group, an isobutyl group, a t-butyl group, a pentyl group, and a hexinole group. In addition, those in which R 2 is an acetyl group can be suitably used. Further, the alkyl group or the acyl group may have a substituent.
  • indole derivative represented by the general formula (1) for example, the following compound wherein R 1 is the above formula (3) and R 2 is an acyl group,
  • R 1 is the above compound of the formula (4-A)
  • R 2 is an acyl group
  • Carboxylic acid (3-1-4) can be obtained by subjecting compound (3-1-3) to alkaline hydrolysis conditions. Next, the obtained carboxylic acid (3_1_4) is coupled with seco_CBI (3-1-5), which can be synthesized from a commercially available 1,3-naphthalene diol, to obtain the compound of the present invention.
  • the ring (4-1) can be obtained. Furthermore, the ring-opened product (4-1) was converted to a weak alkaline condition in water (NaHCO)
  • the compound of the present invention can be converted to the cyclized form (3_1).
  • the compound (3_2_4) was coupled with seco_CBI (3-1-5), which can be synthesized from commercially available 1,3-naphthalene diol, to obtain the ring-opened product (4-2) which is an indole derivative of the present invention. ) Can be synthesized. Furthermore, the ring-opened product (4-2) is treated under weak alkaline conditions (NaHCO 3) in water.
  • NaHCO weak alkaline conditions
  • cyclized product (3-2) which is the indole derivative of the present invention.
  • cyclized forms (3-3), (3-4) and (3-5), which are indole derivatives of the present invention can also be synthesized according to a similar method.
  • the DNA alkylating agent of the present invention is characterized by comprising the indole derivative of the present invention represented by the general formula (1).
  • the indole derivative of the present invention may recognize DNA by forming a hairpin-type structure, or may form a dimer.
  • n is an integer of 0-10) as a structural unit, and a divalent group consisting of one of the structural units, or a divalent group consisting of two or more structural units which may be the same or different from each other.
  • Compound having a valent group (provided that the structural unit at the N-terminal end of the structural unit is represented by the following formula:
  • DNA may be recognized by the addition of (). That is, a base pair can be recognized by forming a pair with a different kind of the indole derivative (1) of the present invention, and a base pair can be recognized and recognized by forming a pair with a known minor gnolev binder. You can also.
  • the drug of the present invention is characterized by suppressing or activating the expression of a gene using the above-mentioned alkylating agent of the present invention.
  • genes that suppress or regulate expression include abnormal genes, single nucleotide polymorphisms (SNPs), and oncogenes.
  • the indole derivative of the present invention used as an active ingredient compound of the drug of the present invention may be a pharmacologically acceptable salt thereof. Examples thereof include salts with acids such as salts, phosphates, citrates and sulfonates, and salts with bases such as organic salts such as methinoleamine and ethylenediamine.
  • the indole derivative of the present invention or a pharmacologically acceptable salt thereof has the following characteristics.
  • the drug of the present invention is expected to have therapeutic effects on various diseases by controlling gene expression, but is particularly useful for treating and preventing cancer, and is useful for deep cancer.
  • Can be used for When used as an anticancer agent it is formulated into a commonly used dosage form such as an injection, a tablet, a powder, or a capsule.
  • commonly used pharmaceutically acceptable carriers such as a binder, a lubricant, a disintegrant, a solvent, a dispersant, a stabilizing agent, a dye, a fragrance and the like can be used.
  • the amount of indole derivative in the formulation depends on the indole derivative Force varies depending on body type and dosage form Usually 0.2 to 50% by weight.
  • the dosage varies depending on age, body weight, disease state, therapeutic effect, administration method, administration timing, administration days, and administration period.
  • One 400 mg dose is administered for 1, 2 or 3 weeks, and the drug is suspended for 1 week as a single course, and is administered repeatedly.
  • imidazole, pyrrole, and / 3 linker it is possible to adapt to various types of cancer.
  • it is used for cancers expressing more gene abnormalities, particularly for cancer gene abnormalities where conventional anticancer drugs are less effective.
  • Compound (3-1-1-1) was prepared according to the method described in the literature [(a) Tao, Z.-F .; Fujiwara, ⁇ ⁇ ; Saito, I .; Sugiyama, HJ Am. Chem. Soc. 1999, 121, 4961. . (b) Tao, Z.-F .; Saito, I .;
  • the compound (3-11-2) was synthesized by catalytic reduction under a hydrogen atmosphere with Pd-C using commercially available ethyl 5-nitroindole-2-carboxylate as a starting material. It was used as a raw material for purification (3-1_3).
  • Compound (3-1-5) was prepared according to the method described in the literature [(a) Boger, D .; Yun, W.. ⁇ ;
  • Compound (3_2_1) was synthesized by Fmoc solid phase synthesizer. Purification was performed under HPLC conditions using a Chemcobond 5-ODS-H column (0-50% 0.1% acetic acid-acetonitrile linear gradient, 40 min, 254 nm) and used as a raw material for synthesis.
  • the compound (3_2_3) is a two-step reaction using commercially available 5-ethyl-2-indole_2_carboxylate as a starting material ((i) alkaline hydrolysis with 1N NaOH, (ii) Pd-C (Catalytic reduction under a hydrogen atmosphere).
  • AdmlmPyPy- ⁇ -ImPy-Indole-seco-CBI (4-2) the solvent is distilled off after the reaction without 5% NaHCO treatment, and the residue is subjected to silica gel column chromatography.
  • Compound (4_3) was synthesized by applying the previously reported liquid phase synthesis method of Py-Im polyamide. Purification was performed under HPLC conditions using a Chemcobond 5-ODS-H column (0_100% The reaction was performed with an acid-acetonitrile linear gradient (20 min, 254 nm), and a DNA alkylation reaction was used.
  • Compound (6) was synthesized using a fmoc solid phase synthesizer, and heated with dimethylaminopropylamine to cut out the solid phase carrier. Purification was performed under HPLC conditions (0-100% 0.1% acetate-acetonitrile linear gradient, 20 min, 254 nm) using a Chemcobond 5-ODS-H column.
  • HATU (7-azabenzotriazole-l-yl) -l, l, 3,3-tetramethyluronium
  • solvents [DMF ( ⁇ , ⁇ -dimethylformamide)] were purchased mainly from reagent companies such as Aldrich. Used without purification. The follow-up of the reaction was monitored by high performance liquid chromatography (HPLC) under 254 nm UV conditions unless otherwise indicated.
  • HPLC high performance liquid chromatography
  • JEOL JNM-A500 500 MHz
  • TMS tetramethylsilane
  • Electrospray ionization mass spectra used PE SCIEX API 165.
  • Electrospray ionization time-of-flight mass Spectrometry includes BioTOFII (Bruker
  • load dye dimethylformamide with fushin
  • the DNA fragment labeled with 5, -Texas Red (pUC-: SEQ ID NO: 1) is a 20 base pair primer labeled with 5, -texa thread: 5 '
  • Type ⁇ ⁇ was synthesized by the PCR method (450 bp). The DNA fragment is in a double-stranded state including a complementary strand (hereinafter the same).
  • the 5'-Texas Red-labeled DNA fragment (pUC-II: SEQ ID NO: 4) is a 5'-texathread-labeled 21 base pair primer: 5 '
  • the DNA fragment labeled with 5, -Texas Red (pUC-II, SEQ ID NO: 7) is a 19 base pair primer labeled with 5, -texa red (pUC18 forward, 328-345: SEQ ID NO: 6) And a 21 base pair primer (pUC18 reverse, 1861-1881: SEQ ID NO: 5), and synthesized by PCR using pucl8 as type II (450 bp).
  • the DNA fragment labeled with 5'-Texas Red ( ⁇ -F10906: SEQ ID NO: 8) is a 23 base pair primer labeled with 5'-texa red: 5 '
  • the DNA fragment labeled with 5'-Texas Red (pQBI63: SEQ ID NO: 11) is a 20 base pair primer: 5'-GGTGATGTCGGCGATATAGG-3 '(SEQ ID NO: 12) and 20 bases labeled with 5'-Texas Red Pair primer: 5 '
  • the pQBI63 plasmid was synthesized using -TexRed-CCCCAAGGGGTTATGCTAGT-3 '(SEQ ID NO: 13) by PCR (994 bp).
  • a DNA fragment (SEQ ID NO: 17) labeled with 5'-Texas Red having a telomere repetition sequence of 24 times was obtained by combining a pCR2.1 plasmid into which an oligomer containing the telomere repetition sequence was inserted from the EcoRI cleavage site.
  • the DNA was synthesized by PCR (446 bp). Each of the obtained DNA fragments was purified by filtration through Suprec_02, and the UV absorption was measured to determine the concentration.
  • a total of 10 ⁇ L of 5 mM sodium phosphate buffer ( ⁇ 7.0) containing 10 nM of a DNA fragment labeled with Texas Red at the 5 ′ end, containing 10% DMF (v / v) and the drug at the concentration indicated above.
  • the standard reaction solution was placed in a microcentrifuge tube (Eppendorf) and allowed to stand at 23 ° C for 8 hours. After completion of the reaction, add calf thymus DNA (lmM, 1 ⁇ L), perform quench, and shake at 90 ° C for 5 minutes. 8 ⁇ L of a loading dye (Fusin Red DMF solution) was dissolved in the obtained DNA under centrifugal vacuum, and the mixture was shaken at 94 ° C. for 20 minutes.
  • a loading dye Fusin Red DMF solution
  • the indole linker may play a Py-like role and adjust the distance between the cyclopropane ring of CBI and the N-3 position of adenine so that alkylation occurs (Fig. 3).
  • FIG. 4 shows the results of evaluating the DNA alkylating ability. Sequence-specific DNA alkylation with ⁇ -Dai-dani (3-2) (site 2, 3: 5'-TGACCA-3 ', site 4: 5, -AGACCA-3, site5: 5, -TGTCCA-3, ) Were observed at the nM concentration in the same manner as the results in FIG. The sequence-specific DNA alkylation (site 6: 5'-AATCCA-3 ', site 7: 5'-TAACCA-3') by the conjugate (3-4) was also observed at the nM concentration.
  • alkylation site 2 due to lbp mis-match recognition was observed
  • alkylation to AT-rich base system iKsite 1,3 was also observed. Maintaining high specificity is an important issue for Py-Im polyamides having a long recognition ability such as compound (3_6).
  • practical alkylation with excellent versatility and a sequence recognition capability of 10 base pairs or more will be possible.
  • the Fmoc solid-phase synthesis method of Py-Im polyamide can supply Py-Im carboxylic acid and Minor gnobe binder having sequence recognition ability. Therefore, as shown in Synthesis Examples 8 and 10, the compound (3-7 ) And (6) can also be synthesized.
  • a study of the DNA alkylation of compound (3-7) against the 727 bp DNA fragment (SEQ ID NO: 14) showed that alkylation (site 1, 2) and alkylation by site recognition (site 3) could be confirmed (Fig. 7).
  • heterodimer formation was observed in the presence of the compound (6) (500 nM), which is a minor blue binder, and accurate alkylation (site 4) by 10 base pair recognition was observed.
  • the fact that two molecules such as compounds (3-7) and (6) work together to confirm the long base pair recognition ability is important in considering the extension of Py-Im polyamide recognition. It is an important finding.
  • HCT_116 human colon cancer-derived cells
  • HeLa human cervical cancer-derived cells
  • HLC_2 human lung cancer-derived cells
  • SH-SY-5Y human neuroblast-derived cells
  • the anticancer activity was evaluated by the following method. To 96 well flat bottom plate
  • HCT_116, HeLa, HLC_2, SH-SY-5Y cells were cultured in complete medium (RPI 1640 containing 10% fetal calf serum (HCT_116, SH-SY-5Y; Sigma-Aldrich) and Dulbecco's modified minimal medium (HeLa, HLC_2, 293T, WI-38; in sigma-Aldrich)], respectively 4.0 X 10 3, 3.6 X 10 3, 1.6 X 10 3, 7.0 X
  • the cells were seeded at a cell density of 8.0 ⁇ 10 2 cells / well, and pre-cultured in a CO incubator for 24 hours. Next, a 0.1% DMF medium 10 5 - 10
  • Compound (42) is dissolved in ethanol, diluted in physiological saline, and once a day, every three days.
  • Tumor volume (mm 3 ) L (mm) XW 2 (mm 2 ) / 2
  • Table 1 shows the results of comparison of the tumor volumes between the compound (42) administration group and the control group.
  • the values in the table are relative evaluations of each group when the tumor volume after 1 day in each group was set to 1.0, and (tumor volume of compound (4-2) administration group: T) / (control Group tumor volume: C) represents the relative assessment between groups expressed as 100%.

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Description

明 細 書
DNAの特定塩基配列をアルキル化する新規インドール誘導体ならびにそ れを用いたアルキル化剤および薬剤
技術分野
[0001] 本発明は DNAの特定塩基配列をアルキル化する新規インドール誘導体ならびにそ れを用いたアルキル化剤および薬剤に関し、詳しくは、特定塩基配列をアルキル化 することにより、特には遺伝子異常の発現を抑制し、高い抗癌作用を有し、極めて反 応性の高い新規インドール誘導体ならびにそれを用いたアルキルィヒ剤および薬剤に 関する。
背景技術
[0002] ヒトの遺伝子配列の解明がほぼ完了した現在、ある特定の塩基配列に対して特異 的な結合能を有する分子に多くの研究者の注目が集まっている。非特許文献 1等に おいて、 Dervanらは逆平行に配向した「N_メチルピロール（以下、単に「ピロール」ま たは「Py」ともレ、う）」 -「N-メチルイミダゾール（以下、単に「イミダゾール」または「Im」と もいう）」ポリアミドが塩基配列特異的に DNAの副溝 (マイナーグループ）に結合するこ とを見出したことを報告している。その他、 Py— Imは C G塩基対を、 Im— Pyは G_C塩 基対を、 Py— Pyは A— T塩基対または T A塩基対を認識するとの一般則が導き出され ている。
[0003] また、 Py— Imポリアミドに共有結合を導入して、結合におけるエントロピー損失を防 ぎ、より強い結合と認識能を得るため、様々なヘアピンや環状のポリアミドが合成され た。代表的なものとして βリンカ一 (-NHCH CH CO-)
2 2 、 γリンカ一（― NHCH CH CH
2 2
CO-)が知られている。中でも γリンカ一（-NHCH CH CH CO-)を持つヘアピンが
2 2 2 2
優れた結合能と認識能を持つことが示され、その DNAとの複合体の構造も決定され ている（非特許文献 2参照）。なお、 — は Α— Τ塩基対または Τ一 Α塩基対を認識す る。 γリンカ一も同様に A— T塩基対または T一 A塩基対を認識する力 γリンカ一は折 れ曲がりヘアピン型の鼎の部分に代表される Ίターン構造を形成する。
[0004] これらの分子は転写因子などに匹敵する結合定数および特異性を有しているが、 遺伝子の発現制御は転写因子の結合を阻害することによって行なわれているため、 標的とできる塩基配列は極端に限られている (例えば、非特許文献 3参照)。
[0005] 本発明者らは Py— Imポリアミドに抗生物質であるデュオカルマイシン Aのアルキルィ匕 部位のセグメント A (Du)を結合したハイブリッド分子を開発し、特許出願してレ、る (例え ば、特許文献 1参照)。そのハイブリッド分子は Py— Imポリアミドによる配列認識能に基 づいて 450塩基対の DNAのフラグメントの 1ケ所を選択的にアルキル化した (例えば、 非特許文献 4参照)。しかし、反応の完結には数日を必要とし、反応の効率も数％と 低かった。
[0006] これに対し、本発明者らは、 DNAをアルキルィヒする官能基（以下、「アルキル化反 応部位」ともいう）と Py— Imポリアミドとの間にビエルリンカ一（L)を挿入した ImPyLDu86 が二量体となって選択的に 5 '— YG(A/T)CR— 3 ' (ここで Yはピリミジン塩基を、 Rはプリ ン塩基を示す)という配列において 5塩基対離れた両方の鎖に低濃度で反応し、 70 %の高い効率でアルキルィ匕を引き起こした。即ち、リンカ一部の導入により反応性お よび効率が劇的に向上することを見出した (例えば、非特許文献 5参照)。
特許文献 1：国際公開第 00/15641号
非特許文献1 : 11.八01.じ1½111.30 1997，119，7636
非特許文献2 : _1.八111.じ1½111.30 1997，119，7909
非特許文献3 : 八111 }½111.50 2000，122，4856
非特許文献4 : 八111 }½111.50 1999，121，4961
非特許文献5 : 八111 }½111.50 2000，122，1602
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0007] し力 ながら、上述した非特許文献 5記載のハイブリッド分子は、合成の困難さ、リン カー部位の不安定性、アルキルィ匕部位の反応性等に問題点を有してレ、た。
[0008] そこで本発明の目的は、従来のハイブリッド分子よりも短い反応ステップで合成でき 、かつ、反応性の高い DNAアルキル化能と配列認識能を兼ね備えた DNAの特定塩 基配列をアルキル化するピロ一ルーイミダゾールポリアミド系の新規化合物ならびに それを用いたアルキル化剤および薬剤機能分子を提供することにある。 課題を解決するための手段
[0009] 本発明らは上記課題を解決すべく鋭意検討した結果、ピロ一ルーイミダゾールポリ アミドの末端にインドールリンカ一を介してアルキル化反応部位を有する化合物とす ることにより、上記課題を解決することを見出し、本発明を完成するに至った。
[0010] 即ち、本発明のインドール誘導体は、下記一般式（1)、
Figure imgf000006_0001
(1)
(式中、 R1は DNAをアルキル化する官能基、 R2は水素原子、アルキル基またはァシ ル基、 Xは下記式、
Figure imgf000006_0002
を構成単位 (mは 0— 10の整数）とし、該構成単位の 1つからなる 2価の基、または同 一でも異なっていてもよい 2つ以上の該構成単位からなる 2価の基である。但し、前 記構成単位のうち、上記 R2側末端の構成単位は下記式、
Figure imgf000006_0003
(kは 0— 10の整数）であってもよレ、。）で表わされることを特徴とするものである。
[0011] また、本発明の DNAのアルキル化剤は上記本発明のインドール誘導体からなること を特徴とするものである。
[0012] 更に、本発明の薬剤は、本発明のアルキルィ匕剤を使用した遺伝子の発現を抑制ま たは活性化することを特徴とするものである。
発明の効果 [0013] 本発明のインドール誘導体は遺伝子上に存在する特定の塩基配列に対して、選択 的にアルキルィ匕する機能分子であり、分子内のイミダゾール、ピロール等の配置を変 えることで、認識する塩基配列を変えることが可能である。また、その合成方法は多 品種供給を行う上でも実用的であり応用性が高レ、。このことは、ヒトゲノム上で、重要 な遺伝子配列、或いは癌などの病気に由来した遺伝子異常に対する有用な論理的 な薬剤として、遺伝子レベルでの創薬を実現するものである。
図面の簡単な説明
[0014] [図 1]図 1は長鎖 DNA(pUC— IIおよび pUC— II ' )に対する本発明の化合物 (4 1 )および (3 1)の DNA配列特異的アルキルィ匕能およびその塩基配列認識モデルを示す。
[図 2]図 2は長鎖 DNA(pUC— IIおよび pUC )に対する本発明の化合物 (3— 2)および ( 3 - 3)の DNA配列特異的アルキル化能およびその塩基配列認識モデルを示す。
[図 3]図 3は本発明の化合物 (3-2)の塩基配列特異的 DNAアルキル化モデルを示す
[図 4]図 4は長鎖 DNA ( ;i -F10906)に対する本発明の化合物 (3_2)、（3_4)および (3 一 5)の DNA配列特異的アルキル化能およびその塩基配列認識モデルを示す。
[図 5]図 5は長鎖 DNA(pQBI63)に対する本発明の化合物 (3— 6)の DNA配列特異的ァ ノレキノレイ匕を示す。
[図 6]図 6は本発明の化合物 (4—1)および (3-1)の酸性、アルカリ性条件下での安定 性を示す。
[図 7]図 7は長鎖 DNA(727bp)に対する本発明の化合物 (3_7)単体、または、化合物（
3— 7)と（6)との共存下における DNA配列特異的アルキルィヒを示す。
[図 8]図 8は 24回のテロメァ繰り替えし配列を持つ DNAフラグメント（446bp)に対する 本発明の化合物 (4 3)のテロメァ配列特異的アルキル化を示す。
[図 9]図 9は乳癌、前立腺癌等の 39種類のヒト培養癌細胞を用いて評価した本発明 の化合物 (3— 2)の抗癌活性のバーグラフを示す。
発明を実施するための最良の形態
[0015] 以下、本発明の実施の好適形態を具体的に説明する。
本発明のインドール誘導体は、下記一般式（1)、
Figure imgf000008_0001
で表され、 Xは下記式、
Figure imgf000008_0002
を構成単位とし、該構成単位の 1つからなる 2価の基、または同一でも異なっていても よい 2つ以上の該構成単位からなる 2価の基である。但し、前記構成単位のうち、上 記 R2側末端の構成単位は下記式、
Figure imgf000008_0003
であってもよレ、。ここで、 mまたは kは 0 10、好ましくは 1一 6、より好ましくは 2 3の 整数である。また、構成単位の数は特に制限されるものではな アルキル化の対象 となる DNAの配列により適宜選択することとなる力 通常、好ましくは 1一 20、より好 ましくは 2— 7である。なお、構成単位の順序は特に制限されるものではなぐアルキ ルイ匕の対象となる DNAの配列に応じ適宜選択しポリアミドを設計する。
本発明のインドール誘導体が認識する DNAの配列は従来知られている一般則と同 様に原則として Py— Imは C—G塩基対を、 Im— Pyは G—C塩基対を、 Py— Pyは A_T塩基 対または T一 A塩基対を、 β _ βおよび Ί— Ί等は Α— Τ塩基対または Τ一 Α塩基対を認 識する。また、 および γ _ γ等は塩基対を認識するだけでなぐ折れ曲がりへ ァピン型の鼎の部分をも構成する。なお、従来から知られているように DNAの標的配 列の前後周辺の配列状況によって稀にミスマッチが観察されることがある。例えば、 AT rich配列が多い場合、ヘアピン型の分子中の γターン構造の隣の Im— Py等はミス マッチ認識をすることが多レ、。 [0017] また、本発明の化合物の特徴となるインドールリンカ一は、インドール 1つにつき、 2 つの Im、 Py等がペアとなることが可能である力 常にペアとなる 2つの Im、 Py等を必要 とするものではなく 1つであってもよレ、。なお、インドール自身は原則として Pyと同様の 認識を行う傾向にあり、 Cまたは Tを認識する傾向にある。更に本発明のインドール誘 導体のアルキル化反応部位は、プリン塩基の N—3位、特にアデニンの N— 3位にァ ルキル化する。
[0018] 上記式（1)中、 R1で表されるアルキルィ匕反応部位としては、 DNA上に存在する特 定の塩基配列に対して、アルキル化能と配列認識能を兼ね備えた基であればどのよ うな基でもよく特に制限されるものではない。なお、 R1としては例えば、下記式、
Figure imgf000009_0001
で表わされるアルキルィ匕反応部位を好適例として挙げることができる。なお、上記式 ( 2)—（5)はアルキルィ匕反応を阻害しない範囲において、置換基を導入してもよぐま た、構造を簡便化してもよい。
上記式（2)および（5)はデュオカルマイシン A(DuocarmycinA)由来の CPIであり、 以下、式（2)は DU86と、式（5)は Duと称する。また、式（3)で示される l,2，9，9a_テトラ ヒドロシクロプロパ [c]ベンゾ [e]インドール- 4-オンは CBIと称する。なお、式（3)には下 記（3— S)および（3— R)、
Figure imgf000010_0001
(3-S) で表わされる光学異性体がある。
[0020] 上記式 (4)中、 R3は水素原子、ペプチド鎖、糖鎖、ポリエチレングリコール基を表し 、具体例としては、ペプチド鎖、タンパク、単糖類、二糖類、多糖類、ポリエチレンダリ コール類等が挙げられる。 Eはハロゲン原子、メシノレ基、トシル基などの脱離性の高 い置換基を示す。ハロゲンの具体例としては臭素、フッ素、ヨウ素が挙げられ、好まし くは塩素である。
[0021] 上記式 (4)の具体例として、下記式 (4 - A)、
Figure imgf000010_0002
(4-A)
で表わされる seco-CBI (l-クロロメチル -5-ヒドロキシ -1,2-ジヒドロ- 3H-ベンゾ [e]イン ドール）の残基を挙げることができる。なお、式 (4一 A)は下記式 (4_A_S)および (4 -A-R)、
Figure imgf000010_0003
(4-A-S) (4-A-R)
で表わされる光学異性体がある。
[0022] 上記式（3— S)および（3— R)は、下記反応式に示すように上記式（4一 A— S)および (4_A_R)を弱アルカリで処理することにより得ることができる。
Figure imgf000011_0001
(4-A-R)
[0023] ここで、式（3— S)で表わされる S-CBIは、三員環が上記式（5)で表わされる天然型 Duと同様の配置を有しており、 R1が式（3—S)である式（1)で表わされるインドール誘 導体はアルキル化活性を有している。一方、 R1が式（3— R)で表わされる R-CBIであ る式（1)で表わされるインドール誘導体はアルキルィ匕活性が非常に弱くなり不活性型 である。
[0024] 上記式（1)において、 R2は水素原子、アルキル基またはァシル基である。ここで、ァ ルキルまたはアシノレ基（COを除く部分）は、通常、炭素数 1一 20、好ましくは 1一 10 であり、より好ましくは 1一 6の直鎖状または分岐状の低級アルキル基が挙げられ、具 体例としては、例えばメチル基、ェチル基、 n-プロピル基、イソプロピル基、 n-ブチル 基、イソブチル基、 t-ブチル基、ペンチル基、へキシノレ基等が挙げられる。なお、 R2 がァセチル基のものを好適に使用することができる。また、アルキル基またはアシノレ 基は、置換基を有していてもよい。
[0025] 一般式（1)で表されるインドール誘導体としては、例えば、 R1が上記式（3)、 R2がァ シル基である下記化合物、
Figure imgf000012_0001
R1が上記式 (4 - A) R2がァシル基である下記化合物、
Figure imgf000013_0001
等が挙げられる。
[0026] 上記化合物（3— 1)を例にとり、本発明のインドール誘導体の合成方法の概略を下 記合成スキーム 1に従い説明する。まず、 AcImlmCO H (3_l_l)と、 5_ニトロインドー
2
ル -2-カルボン酸ェチルエステルを接触還元することにより得られるアミノ体（3— 1_2 )とをジメチルホルムアミド (DMF)に溶解させ、当該溶液に縮合剤 0-(7-ァザベンザトリ ァゾール -1-ィル) -1, 1,3,3-テトラメチルゥロニゥムへキサフルオロフォスフェート (HATL；)、ジイソプロピルェチルァミン ('Pr NEt)を加えることにより縮合反応を行レ、、 Py
2
一 Imインドールェチルエステル（3— 1一 3)へと変換する。化合物（3— 1一 3)をアルカリ 加水分解条件に付すことによって、カルボン酸（3— 1一 4)を得ることができる。次に、 得られたカルボン酸（3_1_4)と、市販品の 1，3-ナフタレンジオールより合成可能で ある seco_CBI (3—1—5)とをカップリングさせることにより、本発明の化合物である開環 体 (4—1)を得ることができる。更に、開環体 (4—1)を水中弱アルカリ条件 (NaHCO )
3 で処理することにより、本発明の化合物である環化体（3_1)へと変換することができ る。
[0027] (合成スキーム 1)
Figure imgf000014_0001
[0028] また、上記化合物（3— 2)を例にとり、本発明のインドール誘導体の他の合成方法の 概略を下記合成スキーム 2に従い説明する。まず、 oxime resinを用いる Py— Imポリアミ ドの Fmoc固相合成法を活用して、これまでのヘアピン型 Py— Imポリアミドに対応する カルボン酸（3—2—1)を合成する。次に、カルボン酸（3—2—1)と HATUを用いて反応 系中で活性 Atエステル（3—2—2)へと変換した後、そこにァミノインドールカルボン酸 ( 3—2—3)を加えることによって、一挙にインドールカルボン酸（3—2—4)を合成する。 化合物（3_2_4)と、市販の 1，3-ナフタレンジオールより合成可能である seco_CBI (3 -1-5)とのカップリングを行レ、、本発明のインドール誘導体である開環体 (4—2)を合 成することができる。更に、開環体 (4—2)を水中弱アルカリ条件 (NaHCO )で処理す
3 ることにより、本発明のインドール誘導体である環化体（3—2)へと変換することができ る。なお、本発明のインドール誘導体である環化体（3—3)、（3— 4)および（3—5)等も 同様の方法に従って合成することが可能である。
[0029] (反応スキーム 2) DMF;
Figure imgf000015_0001
[0030] また、本発明の DNAのアルキル化剤は一般式（1)で表される本発明のインドール 誘導体からなることを特徴とするものである。
[0031] なお、アルキルィ匕剤として使用する際に本発明のインドール誘導体はヘアピン型構 造を形成することにより DNAを認識させてもよぐまた、二量体を形成することにより
DNAを言忍識させてもょレヽ。
[0032] また、ヘアピン型構造または二量体形成のみならず、下記式、
Figure imgf000015_0002
(式中、 nは 0— 10の整数である）を構成単位とし、該構成単位の 1つからなる 2価の 基、または同一でも異なっていてもよい 2つ以上の該構成単位からなる 2価の基を有 する化合物（但し、前記構成単位のうち、 N端側末端の構成単位は下記式、
Figure imgf000016_0001
(qは 0— 10の整数）であってもよレ、）が添加されることにより DNAを認識させてもよレ、。 即ち、種類の異なる本発明のインドール誘導体（1)とペアを形成し塩基対を認識させ ることもでき、更には、既知のマイナーグノレーブバインダーとペアを形成し塩基対を 認、識させることもできる。
[0033] 本発明の薬剤は、上記本発明のアルキル化剤を使用した遺伝子の発現を抑制ま たは活性化することを特徴とするものである。
[0034] 発現を抑制または制御する遺伝子としては異常遺伝子、一塩基多型（SNPs)、癌 遺伝子等を挙げることができる。また、本発明の薬剤の有効成分化合物として使用す る本発明のインドール誘導体は、その薬理学的に許容しうる塩であってもよ 該塩と しては、通常用いられる塩、例えば、塩酸塩、リン酸塩、クェン酸塩、スルホン酸塩等 の酸との塩や、メチノレアミン、エチレンジァミン等の有機塩等の塩基との塩が挙げら れる。
[0035] 本発明のインドール誘導体またはその薬理学的に許容しうる塩は以下のような特徴 を有する。
(a)癌細胞内への取り込みが高ぐ少量で効果が期待できる。
(b)酸またはアルカリ性に安定で、経口吸収性が期待できる。
(c)特定遺伝子の発現を制御することが可能である。
(d)従来の DNAアルキルィヒ剤に比べて、正常細胞に対する障害がない。
[0036] 本発明の薬剤は、遺伝子の発現を制御することにより、各種疾患に対して治療効 果が期待されるが、特に、癌の治療、予防に対して有用であり、深部の癌に対して使 用できる。抗癌剤として使用する場合は、注射剤、錠剤、散剤、カプセル剤など通常 使用されている剤型で製剤化される。製剤化にあたっては、通常使用されている薬 学的に許容される担体、例えば、結合剤、滑沢剤、崩壊剤、溶剤、分散剤、安定化 剤、色素、香料等が使用できる。製剤中のインドール誘導体の量は、インドール誘導 体の種類や剤型により異なる力 通常 0. 2— 50重量％である。
[0037] また、本発明の薬剤を抗癌剤として使用する場合の投与量は年齢、体重、病態、治 療効果、投与方法、投与時期、投与日数、投与期間により異なるが、通常 1日 1回 10 一 400mgを 1、 2または 3週間投与し、 1週間休薬する方法を 1コースとし、繰り返し投 与する。更に、イミダゾール、ピロ一ノレ、 /3リンカ一等の配置を変更することにより、様 々な種類の癌に適応できる。更にまた、遺伝子の異常をより多く発現している癌に対 して使用され、特に、従来の抗癌剤が効果を発揮しづらい癌の遺伝子異常に対して 使用される。
実施例
[0038] 以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明はこれら実施例により何 ら限定されるものでない。
[0039] 合成例 1、 2
化合物 (4_1)および（3_1)の合成 (スキーム 1)
(l) AcImlmCO H (3_l_l)の合成
2
化合物（3—1—1)は、文献記載の方法 [(a)Tao, Z.-F.; Fujiwara, Τ·; Saito, I.; Sugiyama, H. J. Am. Chem. Soc. 1999, 121, 4961.(b)Tao, Z.-F.; Saito, I.;
Sugiyama, H. J. Am. Chem. Soc. 2000, 122, 1602.(c)Bando， T.; Narita, A.; Saito, I.; Sugiyama, H. Chem. Eur. J. 2002, 8， 4781.]に従って合成した。
^—NMR^OOMHz'DMSO—d ) δ : 10.37(S，1H;NH)，9.60(S，1H;NH)，7.63(S,1H;
6
CH),7.48(s，lH;CH),3.96(s，3H;NCH ),3.93(s
3 ，3H;NCH ),2.03(s,3H;COCH );
3 3
ESIMS m/e calcd for C H N O
12 15 6 4
[M++H]307.1, found307.3
[0040] (2) H N-Indole-CO Et (3-1-2)の合成
2 2
化合物（3— 1一 2)は、市販の 5-ニトロインドール- 2-カルボン酸ェチルエステルを出 発原料に用い、 Pd-Cにより水素雰囲気下での接触還元により合成した。精製するこ となぐ（3— 1_3)の合成原料として用いた。
[0041] (3) AcImlm-Indole-CO Et (3-1-3)の合成
2
ィ匕合物（3— 1一 1) (305mg,1.05mmol)と化合物（3— 1一 2) (215mg,1.05mmol)を DMF ( 2mL)に溶力し、 'Pr NEt(550 μ L,3.15mmol)、 HATU(480mg，1.26mmol)を加え、窒素雰 囲気下、室温で 15時間攪拌した。反応終了後、反応溶液の溶媒を減圧下留去し、得 られた残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（3-5%MeOH in CH CI , gradient elution)にて精製し、溶媒を留去することにより黄色粉体（3— 1—3)
(326mg,52%)を得た。
^—NMR^OOMHz'DMSO— d ) δ： 11.83(S,1H;NH),10.32(S,1H;NH),10.08(S,1H;
NH),9.40(s,lH;NH),8.16(s,lH;CH),7.60(s,lH;CH),7.56(d,lHJ=9.0Hz;CH),7.50 (s,lH;CH),7.40(d, lH,J=9.0Hz;CH),7.12(s,lH;CH),4.33(q,2H,J=7.0Hz;OCH ),
4.01(s,3H;NCH )，3.98(s,3H;NCH )，2.03(s，3H;COCH ), 1.33(t,3H,J=7.0Hz;CH );
ESIMS m/e calcd for C H N O
[M++H]493.2,found493.2
[0042] (4) AcImlm-Indole-CO H (3-1-4)の合成
化合物（3— 1一 3) (326mg,0.66mmol)に MeOH (8mL)と IN水酸化ナトリウム水溶液 (8mL)を加えた後、室温にて 30分間撹拌した。 MeOHを減圧下留去した後、 10%HC1 水溶液を 0°C下で加えて酸性 (pH = 2)にした。生じた沈殿物を桐山ろ取にて集めて、 水洗してから乾燥し、化合物（3-1— 4) (297mg,96%)を得た。
Figure imgf000018_0001
) δ： 11.71(S,1H;NH),10.35(S,1H;NH),10.08(S,1H;
NH)，9.49(s，lH;NH)，8.13(d，lH，J=1.0Hz;CH)，7.60(s,lH;CH)，7.54(dd, lH，J=2.0, 9.0Hz;CH),7.49(s,lH;CH),7.38(d,lH,J=9.0Hz;CH),7.06(d,lHJ=2.0Hz;CH),4.01 (s,3H;NCH )，3.97(s，3H;NCH ),2.03(s,3H;COCH );
ESIMS m/e calcd for C H N O
[M++H]465.2,found465.2
[0043] (5) seco_CBI (3_l_5)の合成
化合物（3—1—5)は、文献記載の方法 [(a) Boger, D.し； Yun, W. Υ·;
Teegarden, B. R. J. Org. Chem. 1992, 57， 2873. (b) Boger , D.し； McKie, J. A. J. Org. Chem. 1995， 60， 1271. (c) Boger, D.し； Ishizaki, T.; Kitos, P. A.;
Suntornwat, O. J. Org. Chem. 1990， 55, 5823.]に従って塩酸塩として合成を行った 。スペクトルデータは文献に報告されている。 [0044] (6) AcImIm-Indole-seco-CBI (4-l)の合成
化合物（3_1_4) (60.3mg,0.13mmol)の反応容器に seco-CBI (3-1-5) (32.7mg,0.13mmol)と EDCI(50.3mg,0.26mmol),NaHCO (41.9mg,0.52mmol)を加え、
DMF(700 z L)に溶かし、 8時間窒素雰囲気下、室温で攪拌した。反応終了を確認し た後、溶媒を留去し、残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (5-10% MeOH in CH CI gradient elution)にて精製した。得られた固体を CHC1にて洗浄、乾燥した後
、茶色粉体（4_1) (85.2mg，96%)を得た。
'H-NMRCSOOMHz^MSO-d ) δ： 11.71(S,1H;NH),10.43(S,1H;OH),10.34(S,1H;
NH),10.11(s,lH;NH),9.41(s,lH;NH),8.16(s,lH;CH),8.12(d,lHJ=8.0Hz;CH), 7.97(brs,lH;CH),7.85(d,lHJ=8.0Hz;CH),7.62(m,lH;CH),7.61(s,lH;Im-H),7.52 (t,lHJ=8.0Hz;CH),7.51(s, lH;Im-H),7.45(d, lH,J=9.0Hz;CH),7.36(t,lH,
J=8.0Hz;CH),7.19(s,lH;CH)4.81(t,lHJ=11.0Hz;NCHH),4.56(d,lHJ=11.0Hz; NCHH),4.23(brt,lH;CH),4.03(s,3H;NCH )，3.99(s,3H;NCH ),3.87(dd,2H,J=7.0, 一
11.0Hz;CH ),2.04(s,3H;COCH );
ESI-TOFMS m/e calcd forC H C1N O
[M++H]680.22,found680.23
[0045] (7) (：11111111- (1016-じ81 (3_1)の合成
化合物（4_l) (6·3mg，9.28mmol)のDMF(150 μ L)溶液中に、 5% aq.NaHCO (100 μ
L)を加え、 1時間窒素雰囲気下、室温で攪拌した。反応終了を確認した後、溶媒を留 去し、残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (5-15% MeOH in CH CI .gradient elution)にて精製した。溶媒を留去、乾燥した後、茶色粉体（3_l) (6.0mg,qUant.)を得 た。
Figure imgf000019_0001
δ： 11.85(s，lH;NH)，10.35(s,lH;NH),10.16(s， lH;NH),9.41(s,lH;NH),8.17(s,lH;CH),8.00(d,lHJ=8.0Hz;CH),7.94(s, lH;CH), 7.62(s,lH;Im-H),7.52(m,2H;CHx2),7.51(s,lH;Im-H),7.43(m,2H;CH),7.25(d,lH, J=8.0Hz;CH),6.95(s,lH;CH),4.64(m,lH;NCHH),4.49(d,lH,J=10.0Hz;NCHH), 4.02(s,3H;NCH )，3.98(s,3H;NCH ),3.27(brt,lH;CH),2.03(s,3H;COCH )，
1.75(m,lH;CHH),1.70(m,lH;CHH); ESI-TOFMS m/e calcd forC H N O
34 30 9 5
[M++H]644.23,found644.21
[0046] 合成例 3
化合物 (3—2)の合成反応 (スキーム 2)
(l) AcImlmPyPy- y -ImPyCO H(3_2_l)の合成
2
化合物 (3_2_1)は、 Fmoc固相合成機により合成した。精製は Chemcobond 5-ODS-Hカラムを用いた HPLC条件 (0-50% 0.1%酢酸 -ァセトニトリルリニアグラジェン ト， 40 min,254 nm)にて行い、合成原料として用いた。
'H-NMRCSOOMHz^MSO-d ) δ： 10.32(S,1H;NH),10.29(S,1H;NH),10.23(S,1H;
6
NH),10.00(S,1H;NH),9.91(S,1H;NH),9.32(S,1H;NH),8.02(S,1H;NH),7.56(S,1H; Im-H),7.50(s, lH;Im-H),7.45(s,lH;Py-H),7.44(s, lH Im-H),7.27(s,lH;Py-H), 7.16 (s, lH;Py-H),7.14(s,lH;Py-H),6.92(s,lH;Py-H),6.89(s,lH;Py-H),4.00(s, 3H;NCH ),3.97(s，3H;NCH ),3.93(s,3H;NCH ),3.84(s,3H;NCH ),3.81(s,3H;
3 3 3 3
NCH ),3.79(s,3H;NCH ),3.19(m,2H;CH ),2.34(m,2H;CH ),2.03(s,3H;COCH )，
3 3 2 2 3
1.78(m,2H;CH );
2
ESI-TOFMS m/e calcd forC H N O
39 45 16 9
[M++H]881.35,found881.36
[0047] (2) H N- Indole- CO H(3_2_3)の合成
2 2
ィ匕合物 (3_2_3)は、市販の 5—二トロインドール _2_カルボン酸ェチルエステルを出 発原料に用いた二工程反応（(i)lN NaOHによるアルカリ加水分解、（ii)Pd-Cを用いる 水素雰囲気下での接触還元）により合成した。
^—NMR^OOMHz'DMSO— d ) δ： 11.22(s,lH;NH),7.11(d,lH,J=8.5Hz;CH),
6
6.75(d，lH，J=2.0Hz;CH)，6.67(s,lH;CH)，6.65(dd, lH，J=2.0,8.5Hz;CH)，3.31(brs， 2H;NH ,H O)
2 2
[0048] (3) AcImlmPyPy- y -ImPy- Indole- CO H (3—2—4)の合成
2
固相合成により得た化合物 (3_2_l)(3.5mg，3.98mmol)を DMF (75 z L)に溶かし、 ' Pr NEt (1.4 μ L，8.04mmol)、 HATU(1.4mg,3.68mmol)を加え、窒素雰囲気下、室温で
2
4時間攪拌した。反応の終了を確認した後、化合物 (3-2-3)(1.3mg,7.38mmol)と r NEt(1.3 xL,7.46mmol)を添加し、窒素雰囲気下、室温で overnight攪拌した。反応後 、反応溶液の溶媒を留去して、桐山漏斗で濾取しながら、残留物を CH C1と H 0でそ
2 2 2 れぞれ洗浄した。その結果、化合物 (3—2— 4)の粗結晶 (3.0mg,73%)を得た。
^—NMR^OOMHz'DMSO— d ) δ： 11.33(brs，lH;NH)，10.34(s,lH;NH),10.33(s，
6
lH;NH),10.27(s,lH;NH),9.92(s,2H;NH),9.73(s,lH;NH),9.32(brs,lH;NH),8.01 (brt,lH;NH),7.94(s,lH;CH),7.56(s,lH;Im-H),7.50(s,lH;Im-H),7.46(s,lH;
Im-H),7.40(brd,lHJ=8.5Hz;CH),7.31(brd,lH,J=8.5Hz;CH),7.30(d,lHJ=1.5Hz; Py-H),7.26(d,lHJ=1.5Hz;Py-H),7.17(d,lH,J=1.5Hz;Py-H),7.16(s,2H;y-Hx2), 6.90(d,lH,J=1.5Hz;Py-H),6.85(brs,lH;CH),4.00(s,3H;NCH ),3.97(s,3H;NCH )，
3 3
3.95(s,3H;NCH )，3.85(s,3H;NCH ),3.84(s,3H;NCH ),3.80(s，3H;NCH ),3.20(dt,
3 3 3 3
2HJ=6.0,7.5Hz;CH ),2.36(t,2H,J=7.5Hz;CH ),2.04(s,3H;COCH ),1.79(qu,2H,
2 2 3
J=7.5Hz;CH );
2
ESI-TOFMS m/e calcd forC H N O
48 51 18 10
[M++H]1039.40,foundl039.39
(4) AcImlmPyPy- γ -ImPy-Indole-CBI (3—2)の合成
粗結晶 (3— 2_4)(3.00¾，2.8911111101)の入った反応容器に続けて3600-じ81 (3-1-5 )(1.4mg,6.01mmol)と EDCI(1.2mg，6.25mmol)， NaHCO (1.0mg,12.0mmol)を加え、
3
DMF (100 に溶かし、 2時間、窒素雰囲気下、室温で攪拌した。反応の終了を確 認した後、 5%NaHC〇を 300μ L， DMF (300 μ L)を添加し、 30分間、攪拌を行った。反
3
応後、溶媒を留去し、残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (5-15% MeOH in CHし 1 gradient
2 2
elution)にて精製し、溶媒を留去することにより粗結晶 (3—2) (1.33mg,27% for 2 steps) を得た。さらに、 HPLC(0_50% 0.1%酢酸-ァセトニトリルリニアグラジェント
,40π±ι，254ηΓη)にて精製を行い、減圧濃縮、凍結乾燥後、黄色結晶 (3 - 2)
(0.5mg,0.41 μ mol:ll% for 2 st印 s)を得た。
^—NMR^OOMHz'DMSO— d ) δ : 11.77(S,1H;NH),10.32(S,1H;NH),10.29(S,1H;
6
NH)，10.26(S，1H;NH)，9.95(S,1H;NH),9.92(S，1H;NH)，9.82(S，1H;NH)，9.33(S,1H;
NH),8.08(s,lH;CH),8.01(brs,lH;NH),8.00(d,J=7.5Hz,lH;CH),7.60(t,J=7.5Hz, lH;CH)，7.56(s，lH;CH)，7.53(d,J=8.5Hz，lH;CH)，7.50(s，lH;CH)，7.46(s，lH;CH)， 7.43(t J=7.5Hz,lH;CH),7.42(s,lH;CH),7.31(s,lH;CH),7.27(s,lH;CH),7.24(d, J=8.5Hz, lH;CH),7.22(s, lH;CH),7.19(s, lH;CH),7.16(d,J=7.5Hz,lH;CH),7.06(s, lH;CH)，6.95(s，lH;CH)，6.89(s,lH;CH)，4.62(dd,J=10.0,5.0Hz,lH;NCH ),4.48
2
(d,J=10.0Hz，lH;NCH ),4.00(s,3H;NCH ),3.97(s,3H;NCH )，3.95(s,3H;NCH )，
2 3 3 3
3.86(s,3H;NCH ),3.84(s,3H;NCH )，3.80(s，3H;NCH ),3.20(m,2H;CH ),2.90(m,
3 3 3 2
lH;CH),2.35(m,2H;CH ),2.03(s,3H;COCH ),1.79(m,2H;CH ),1.76(ddJ=7.5,
2 3 2
5.0Hz,lH;CH),1.70(t,J=5.0Hz, lH;CH);
ESI-TOFMS m/e calcd forC H N O
61 60 19 10
[M++H]1218.48,foundl218.48
なお、 AdmlmPyPy- γ -ImPy-Indole-seco- CBI (4—2)を得る場合は、反応後、 5%NaHCO処理せずに溶媒を留去し、残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー
3
(5-15% MeOH in CH CI , gradient elution)、 HPLC(0- 100%0·1%酢酸-ァセトニトリルリ
2 2
二アグラジェント, 20min，254nm)にて精製する。減圧濃縮、凍結乾燥後、黄色結晶 (4 一 2)を得ること力 Sできる。
ESI-TOFMS m/e calcd forC H C1N O
61 61 19 10
[M++H]1254.45,foundl254.50
[0050] 合成例 4
AcImlmPv- y -Im- Indole- CBI (3-3)の合成
化合物（3-3)は、合成例 3と同様の合成手順により合成した。精製は、 Chemcobond 5- ODS- Hカラムを用いた HPLC条件 (0—50% 0.1%酢酸-ァセトニトリルリ 二アグラジェント, 40min，254nm)にて行レ、、 DNAアルキル化反応に用いた。
ESI-TOFMS m/e calcd for C H N O
49 48 15 8
[M++H]974.37,found974.26
[0051] 合成例 5
AcImlmPvPv- y -PvPv- Indole- CBI (3-4)の合成
化合物（3-4)は、合成例 3と同様の合成手順により合成した。精製は、 Chemcobond 5-ODS-Hカラムを用いた HPLC条件 (0—50% 0.1%酢酸-ァセトニトリルリ 二アグラジェント, 40min，254nm)にて行レ、、 DNAアルキル化反応に用いた。 ESI MS m/e calcd for C H N O
62 61 18 10
[M++H]1217.5,foundl217.4
[0052] 合成例 6
AcImPvPvPv- y -ImPv— Indole— CBI (3— 5)の合成
化合物（3-5)は、合成例 3と同様の合成手順により合成した。精製は、 Chemcobond 5- ODS- Hカラムを用いた HPLC条件 (0—50% 0.1%酢酸-ァセトニトリルリ 二アグラジェント, 40min，254nm)にて行レ、、 DNAアルキル化反応に用いた。
ESI-TOFMS m/e calcd for C H N O
62 61 18 10
[M++H]1217.5,foundl217.4
[0053] 合成例 7
AcImlmPvPv β PvPy- y - ImPv β ImPv- Indole- CBI (3—6)の合成
化合物（3-6)は、合成例 3と同様の合成手順により合成した。精製は、 Chemcobond 5-ODS-Hカラムを用いた HPLC条件 (0—50% 0.1%酢酸-ァセトニトリルリ 二アグラジェント, 40min，254nm)にて行レ、、 DNAアルキル化反応に用いた。 ESI MS m/e calcd for C H N O
90 93 30 16
[M++H]1849.7,foundl850.1
[0054] 合成例 8
AcImlmPv- β -ImPv- Indole- CBI (3—7)の合成
化合物（3-7)は、合成例 3と同様の合成手順により合成した。精製は、 Chemcobond 5-ODS-Hカラムを用いた HPLC条件 (0—50% 0.1%酢酸-ァセトニトリルリ 二アグラジェント, 40min，254nm)にて行レ、、 DNAアルキル化反応に用いた。
ESI-TOFMS m/e calcd for C H N O
54 52 17 9
[M++H]1082.5,foundl082.4
[0055] 合成例 9
Aclmlmlm- _ -Pv_£y- Indole- seco_CBI (4_3)の合成
化合物 (4_3)は、既に報告されている Py— Imポリアミドの液相合成法を適用して合 成した。精製は、 Chemcobond 5-ODS-Hカラムを用いた HPLC条件 (0_100%0· 1%酢 酸-ァセトニトリルリニアグラジェント， 20min，254nm)にて行レ、、 DNAアルキル化反応 用いた。
ESI-TOFMS m/e calcd forC H C1N O
[M++H] 1132.5,foundll32.4
合成例 10
AcImlmPvPY -PvPvPy- B - DD(6)の合成
Figure imgf000024_0001
化合物（6)は、 fmoc固相合成機を用いて合成し、ジメチルァミノプロピルァミンによ り加熱し固相担体力ら切り出した。精製は、 Chemcobond 5-ODS-Hカラムを用いた HPLC条件 (0— 100%0.1%酢酸-ァセトニトリルリニアグラジェント， 20min，254nm)にて行つ た。
ESI-MS m/e calcd forC H N O
[M++H]l 143.9,foundl 143.5
上記合成例 1一 10において、試薬 ['ΡΓ NEt(N，N_diisopropylethylamine)、
HATU(0-(7-azabenzotriazole-l-yl)-l,l,3,3-tetramethyluronium)],溶媒 [DMF ( Ν,Ν-dimethylformamide) ]類は、主に Aldrichなどの試薬会社より購入したものを精製 なしに使用している。反応の追跡は、特に表記のない場合においては 254nm UV条 件下での high performance liquid chromatography(HPLC)によってモニターした。 H-NMRスペクトルは JEOL JNM-A 500(500MHz)を使用し、内部標準物質として TMS(tetramethylsilane)を用いた。また、表記中の multiplicityは s(singlet), d(doublet), t(triplet), q(quartet), qu、quintet)，mijnultiplet)，br(broad)と略した。 Electrospray ionization mass spectra (ESIMS)は PE SCIEX API 165を使用した。 Electrospray ionization time - of-flight mass spectrometry(ESI-TOFMS)には BioTOFII(Bruker
Daltonics) mass spectrometerを使用した。ポリアクリルアミドゲル電気泳動は
HITACHI 5500-S DNA Sequencerを使用し、その loading dye(dimethylformamide with fushin
red)は Amersham Co.Ltd.より購入した。 50% Long Ranger™ gel solutionは FMC Bioproducts力ら購入し、 Calf intestine alkaline phosphatase(AP，1000unit/mL)は Boehringer Mannheim力ら購入した。
[0058] 5' -テキサスレッドラベルした DNAフラグメントの合成
5，-テキサスレッドでラベルした DNAフラグメント (pUC- ：配列番号 1)は、 5，-テキサ スレッドでラベルした 20塩基対プライマー：5'
-TexRed-AGAATCAGGGGATAACGCAG-3' (pUC18 forward, 780-799：配列番号 2 )と 20塩基対プライマー： 5 ' - TTACCAGTGGCTGCTGCCAG- 3，（pUC 18 reverse, 1459-1478：配列番号 3)を用いて pucl8を铸型として PCR法によって合成した (450bp) 。 DNAフラグメントは相補鎖を含む二本鎖状態である（以下、同様)。
[0059] 5 ' -テキサスレッドでラベルした DNAフラグメント (pUC-Π：配列番号 4)は、 5， -テキサ スレッドでラベルした 21塩基対プライマー：5'
-TexRed-TGCTGGCCTTTTGCTCACATG-3' (pUC18 reverse, 1861-1881：配列番 号 5)と 19塩基対プライマー： 5- TGTAAAACGACGGCCAGTG- 3' (pUC18 forward,328_345：配列番号 6)を用いて pucl8を鎳型として PCR法によって合成した。 (450bp)。
[0060] 5，-テキサスレッドでラベルした DNAフラグメント (pUC-II，：配列番号 7)は、 5，-テキ サスレッドでラベルした 19塩基対プライマー (pUC18 forward, 328-345：配列番号 6)と 21塩基対プライマー (pUC18 reverse, 1861-1881 :配列番号 5)を用いて pucl8を铸型 として PCR法によって合成した（450bp)。
[0061] 5 ' -テキサスレッドでラベルした DNAフラグメント（ λ -F10906：配列番号 8)は、 5 ' -テ キサスレッドでラベルした 23塩基対プライマー：5'
-TexRed-ATCAGGGCAACTCAACCCTGTCC-3 ' ( λ -DNA forward, 10960- 10982： 配列番号 9)と 20塩基対プライマー： 5 ' -CAGGACGACCAATATCCAGC-3 ' ( λ -DNA reverse,37007- 37026 :配列番号 10)を用いて; l _DNAを铸型として PCR法によ つて合成した (537bp)。
[0062] 5 ' -テキサスレッドでラベルした DNAフラグメント (pQBI63：配列番号 11)は、 20塩基 対プライマー： 5 ' -GGTGATGTCGGCGATATAGG-3 ' (配列番号 12)と 5 ' -テキサス レッドでラベルした 20塩基対プライマー：5'
-TexRed-CCCCAAGGGGTTATGCTAGT-3 ' (配列番号 13)を用いて pQBI63 plasmidを铸型として PCR法によって合成した (994bp)。
[0063] 5 ' -テキサスレッドでラベルした 727bp DNAフラグメント（配列番号 14)は MLPに
Human β -globinのコード塩基配列を組み込んだ plasmidを铸型として 5' -テキサスレ ッドでラベルした 20塩基対プライマー：5'
-TexRed-CCCATTCTAAACTGTACCCT-3 ' (配列番号 15)と 21塩基対プライマー： 5 ' -GGCATCAAGGAAGGTGATTGG-3， (配列番号 16)を用レ、て PCR法によって合 成した。
[0064] 24回のテロメァ繰り替えし配列を持つ 5' -テキサスレッドでラベルした DNAフラグメン ト（配列番号 17)は、 EcoRI切断 siteよりテロメァ繰り替えし配列を含むオリゴマー組み 込んだ pCR2.1 plasmidを铸型として 5 ' -テキサスレッドでラベルした 20塩基対プライマ 一： 5 ' -TexRed-GGCCAGTGAATTGTAATACG-3 ' (配列番号 18)と 20塩基対プラ イマ一： 5 ' - CCAGGCTTTACACTTTATGC- 3 ' (配列番号 19)を用レ、て PCR法によ つて合成した（446bp)。得られたそれぞれの DNAフラグメントは Suprec_02にてろ過精 製した後、 UV吸収を測定してその濃度を決定した。
[0065] 直鎖 DNA(400bp—)に対するアルキル化能
上記合成例にて合成した化合物（3— 1)、 （4一 1)の DNAとの反応について長鎖
DNA (pUC-II'：配列番号 7)を用いて検討した。アルキルィ匕反応を 23°C下 8時間行 レ、、配列決定用ポリアクリルゲル電気泳動によりアルキル化配列を解析した結果を図 1に示す。その結果、開環体 (4一 1)、環化体（3— 1)は同じ配列特異性を持って、 site 1(5， -CGGCCA-3， )の Adenineを選択的に nM濃度下でアルキル化した。この配列特 異性は、 DNAマイナーグノレーブ内で二量化して塩基配列を認識しているモデルによ つて説明できる。 [0066] なお、ポリアクリルアミドゲル電気泳動を用いた解析は以下の方法で行った。全量 10 μ Lの 5mMリン酸ナトリウム緩衝液（ρΗ=7.0)中に 5'末端がテキサスレッドでラベル された DNAフラグメント 10 nM、 DMF10% (v/v)と先に表記した濃度の薬剤を含む標 準反応溶液を微量遠心分離管（Eppendorf)に入れて 23°Cで 8時間静置した。反応終 了後、 calf thymus DNA(lmM,l μ L)を加え quenchを行レ、、 90°Cにて 5分間振動させ る。遠心減圧下得られた DNAにローデイング色素（フューシンレッドの DMF溶液） 8 μ Lカロえ溶解させた後、 94°Cにて 20分間振動させた。直ちに 0°Cにて急冷した後、その 2 μ Lについて、 HITACHI 5500-S DNAシケンサーを用いた 6%変成ポリアクリルアミド ゲルでの電気泳動を行った。以下の試験も同様である。
[0067] 上記合成例にて合成した化合物（3— 2)、 （3— 3)の DNAとの反応について長鎖
DNA (pUC-II :配歹 IJ番号 4、 pUC-I'：配列番号 1)を用いて検討した。アルキル化反応 を 8時間行い、配列決定用ポリアクリルゲル電気泳動を用いて解析した結果を図 2に 示す。その結果、化合物（3— 2)、 （3— 3)共に、以前のビニルリンカ一を有する Py— Im ポリアミドと比較しても遜色のない効率的な DNAアルキル化を nM濃度で観察すること ができた。し力 ながら、配列認識能においては、違いが見られた。すなわち、化合 物（3_3)においては、マッチ配列である site 4(5，-AGCCA-3，）のアルキル化を観察 できたものの、一方で、 site 1(5，- AGCTA- 3，）、 site 2(5，- AGTCA- 3，）、 site 5(5， -TACCA-3' )等の一塩基対ミスマッチ配歹 1Jも観察された。対照的に、化合物（3-2) においては、 site 3(5，- TGACCA- 3，）， site 6(5，- AGTCCA- 3，）のマッチ配列のみに アルキル化を観察することができ、配列認識能においては化合物（3— 2)の分子設計 が優れていた。興味深いことに、 pUC-I' (配列番号 1)には化合物（3_3)のマッチ配 列にあたる site(5' -TGCCG-3' )も含まれている力 そのグァニンへのアルキル化は全 く観察することはできなかった。
[0068] 図 2の結果も考慮すると、このインドールリンカ一と CBIの組み合わせは、高い配列 特異性をもって、アデニンの N-3位をアルキルィ匕すると考えられる。配列認識におい て、インドールリンカ一は Py様の役割を果しながら、 CBIのシクロプロパン環とアデ二 ンの N-3位の距離をアルキル化が起きるように調節していると考えられる（図 3)。
[0069] 化合物（3— 2)、 (3-4) , (3— 5)の DNAとの反応について長鎖 DNA (え- F10906 :配 列番号 8)を用いて検討した。その DNAアルキルィ匕能を評価した結果を図 4に示す。 ィ匕合物（3—2)による配列特異的 DNAアルキル化 (site 2，3:5' -TGACCA-3' , site 4:5 ，- AGACCA- 3，， site5:5，-TGTCCA-3，）を nM濃度で図 2の結果と同様に観察した。 ィ匕合物（3—4)による配列特異的 DNAアルキル化 (site 6:5' -AATCCA-3'， site 7:5' -TAACCA-3' )も nM濃度で観察することができた。一方で、化合物（3—5)は、ミスマ ツチ配列 (site l:5' -TGCTCA-3' )に対するアルキル化のみが観察された。これらの 結果は、インドールリンカ一を含むヘアピン型 Py— Imポリアミドの分子設計において、 Py— Imの配置を変えるだけで、 自在に異なる配列認識能を持ったアルキル化剤にで きる可能性を示している。
[0070] また、インドールリンカ一を用いる合成経路の確立によって、これまでのビエルリン カーでは合成が不可能であつたより長い塩基配列認識能を持つアルキル化剤の合 成も可能になった。例えば、 oxime resinを用いる Py— Imポリアミドの Fmoc固相合成法 は、長い配列認識能を有する Py— Imカルボン酸を供給することができるので、合成例 7に示す化合物（3— 6)の合成が可能になった。 pQBI63由来の DNAフラグメント（配列 番号 11)に対してアルキルィヒの検討を行った結果、 nM濃度での化合物（3-6)による 1000塩基対 DNAに対する効率よいアルキル化を確認することができた（図 5)。一方 で、 lbp mis-match認識によるアルキル化（site 2)が観察されたものの、 AT-richな塩 基配歹 iKsite 1,3)に対するアルキル化も観察された。化合物（3_6)のような長い認識 能を有する Py— Imポリアミドにおいて、高い特異性を保持することは重要な課題であ る。今後、現在の分子設計の最適化を進めてレ、くことで、汎用性に優れた 10塩基対 以上の配列認識能を有する実用的なアルキル化が可能になると考えられる。
[0071] ヘアピン型ポリアミドの安定性
HPLCを用いた酸性、アルカリ性条件下での安定性の解析を以下の方法で行った 。全量 10 x Lの 5%HC1水溶液（pH=l,DMF:H 0=1:9)あるレ、は、 5%NaHCO水溶液（
2 3
pH=9,DMF:H 0=1:9)中に化合物 (3—1)または (4—1) (100 μ M)を含む反応溶液を微
2
量遠心分離管（Eppendorf)に入れて、 37°C下で静置した。静置を始めてから、 30分、 2時間、 24時間後にそれぞれ HPLC(0-100%50mMギ酸アンモニゥム -ァセトニトリルリ 二アグラジェント, 20min，流速： 1.0mL/min，254nm)にて化合物（4-1) (16.8min)、化合 物（3—1) (15.1min)の解析を行った。
[0072] 化合物（4—1)、（3—1)を用いてインドールリンカ一を含む Py_Imポリアミドの安定性 を HPLCによる product analysisによって評価した結果を図 6に示す。化合物（4—1)は 、 HC1酸性 (pH=l)水溶液（37°C、 24時間静置)条件に対して、全く加水分解されない ことが判明した。また、化合物（4—1)は、 NaHCOアルカリ性 (PH=9)水溶液（37°C、 24 時間静置)条件に対して、化合物（3_1)に変換されるが（30分間： 50%、 2時間： 78%)、 他の加水分解物は全く生成しなかった。一方、化合物（3—1)を HC1酸性 (pH=l)水溶 液 (37°C)条件に付すと、速やかに化合物 (4一 1)に変換された (30分間：96%)。すな わち、インドールリンカ一を含む Py— Imポリアミドは、酸性 (pH=l)においては化合物（ 4_1)のような seco-CBIの形で、アルカリ性（pH=9)においては化合物（3_1)のような CBIの形で、安定に存在していることが判明した。
[0073] ヘテロダイマー型ポリアミドによる DNA配列特異的アルキル化
Py— Imポリアミドの Fmoc固相合成法は、配列認識能を有する Py— Imカルボン酸やマ イナーグノレーブバインダーを供給することができるので、合成例 8および 10に示すよ うに化合物（3-7)、（6)の合成も可能である。 727bp DNAフラグメント（配列番号 14) に対して化合物（3— 7)の DNAアルキルィヒの検討を行った結果、 nM濃度での化合物 (3-7)による効率よいヘアピン型認識によるアルキル化（site 1,2)と直鎖型認識によ るアルキル化（site 3)を確認することができた（図 7)。興味深いことに、マイナーブル ーブバインダーである化合物（6) (500nM)共存下においてへテロダイマー形成し、 正確な 10塩基対認識によるアルキル化 (site 4)が観察された。化合物（3— 7)および ( 6)のような二分子が共同的に作用することによって長い塩基対認識能を確認できた ことは、 Py— Imポリアミドの認識を拡張することを考える上で重要な知見である。
[0074] テロメァ配列を標的にする DNAアルキル化
細胞内の DNAの末端には 5' _GGGTTA_3'からなる連続した塩基配列が存在して おり、細胞の増殖、複製に深く関連していることが示唆されている。化合物 (4—3)の 24回のテロメァ繰り替えし配列を持つ DNAフラグメント（446bp：配列番号 17)に対して アルキル化の検討を行った結果、 nM濃度での化合物（4一 3)による効率よいヘアピン 型認識によるテロメァ配列選択的なアルキル化（5' -ACCCTA-3' )を観察した（図 8) 。インドールリンカ一を含む Py— Imポリアミドによるアルキル化剤の分子設計は汎用性 に富み、様々な標的塩基配列認識を可能にすることができると考えられる。
[0075] ヘアピン型ポリアミドのインビトロ抗癌作用
最も良好な配列特異的アルキルィ匕を示したインドールリンカ一を含む Py— Imポリアミ ド（3— 2)の癌細胞への効果を調べるために，乳癌から前立腺癌までの 39種類のヒト 培養癌細胞を用いて評価した（図 9)。バーグラフの縦軸は 39種類のヒト培養癌細胞 の種類を示し、横軸の 0の値は IC の対数の平均値を示している。バーが右に伸びる とその癌種に対して効果が高ぐ左に伸びると効果が低いことを示している。化合物（ 3-2)はヒト培養癌細胞に対して比較的強い活性 [39種類の平坳 ogIC は約- 7 (
ΙΟΟηΜ) ]をもち，興味深い抗癌活性を示している。なお、乳癌から前立腺癌までの 39 種類のヒト培養癌細胞を用いた抗癌活性の評価はがん研究会において行なわれて レ、るスクリーニング試験によって評価した。
[0076] さらに、 HCT_116 (ヒト大腸癌由来細胞）、 HeLa (ヒト子宮頸癌由来細胞）、 HLC_2(ヒ ト肺癌由来細胞)、 SH-SY-5Y (ヒト神経芽由来細胞)を、 0. 1%の DMFを含む 10— 5— 10— 8 Mの AdmlmPyPy- γ -ImPy-Indole-CBI (3-2)で 48時間処理し、この化合物の抗癌 斉 IJとしての効果を評価した。その結果、 HCT_ 1 16、 HeLa, HLC_2、 SH-SY-5Yに対す る 50%細胞増殖阻害濃度 (IC )は、それぞれ 7.42 X 10— 8、 5.97 X 10— 8、 5.35 X 10— 8、
7.43 X 10— 9Mを示した。また、 293T (ヒト腎臓由来正常細胞）、 WI_38(ヒト正常繊維芽 細胞)に対しても同様の評価を行った結果、 IC はそれぞれ 6.99 X 10_8、 6.79 X 10_8
Mを示し、正常細胞と比べて癌細胞に対して約 10倍の高い抗癌作用を示した (IC 値 は 0. 1% DMFで 48時間処理した系をコントロールとして計算した)。
[0077] なお、抗癌活性の評価は以下の方法により行った。 96well平底プレートへ、
HCT_116、 HeLa, HLC_2、 SH-SY-5Y細胞を完全培地 [10%のゥシ胎児血清を含む RPMI 1640(HCT_116、 SH-SY- 5Y ;シグマアルドリッチ)および、ダルベッコ改変最小 培地 (HeLa、 HLC_2、 293T、 WI-38;シグマアルドリッチ)]中に、それぞれ 4.0 X 103、 3.6 X 103、 1.6 X 103、 7.0 X
Figure imgf000030_0001
8.0 X 102 cells/wellの細胞密度で播種し、 COインキュベータにて 24時間前培養を行った。次に、培地を 0.1%の DMFと 10— 5— 10
— 8 Mの AcImImPyPy- y -ImPy-Indole-CBI (3_2)を含む完全培地と交換し、 COイン キュベータ内で 48時間処理を行った。その後、 well当たり 10 μ Lの cell counting kit_8 試薬（同仁化学）をカ卩えて 2時間、 COインキュベータ内に放置し、マイクロプレートリ ーダー MPR-A4I (東ソー)で吸光度を測定した。
[0078] ヘアピン型ポリアミドのインビボ抗癌作用
ヌードマウス可移植性ヒト ER(+)乳癌 Br- 10に対する化合物 (4-2)の抗腫瘍効果を 検討した。 8週齢 BALBん A- nu/nuマウスの背側部皮下にヒト ER(+)乳癌 Br-10を、套 管針を用いて移植した。 Br_10を移植するマウスには同時に Ε·Ρ·ホルモンデポーを O.lmL筋肉内に投与した。腫瘍体積がおよそ 100mm3に達した時点で、 5匹/群に分け 、投与を開始した。
[0079] 化合物 (4 2)をエタノールで溶解し、生理食塩液に希釈して、 1日 1回、 3日間毎に
3回、腫瘍近傍の 3、 4箇所に分割して皮下投与した。化合物 (4-2)の投与量は
0.05mL/10gの容量で、 50mg/kg (およそ lmg/マウス)を投与した。また、対照群には、 生理食塩液を皮下投与した。 3日間毎に、腫瘍の長径 (L)および短径 (W)を測定し、 以下の式より、腫瘍体積を求めた。
腫瘍体積 (mm3) = L(mm) X W2(mm2)/2
化合物 (4 2)投与群と対照群との腫瘍体積の比較結果を下記表 1に示す。表中の 数値はそれぞれの群の 1日後の腫瘍体積を 1.0とした際のそれぞれの群のおける相 対的な評価、および (化合物 (4 - 2)投与群の腫瘍体積： T)/ (対照群の腫瘍体積： C) X 100%で表される群間の相対的な評価を表している。
[0080] [表 1]
Figure imgf000031_0001
[0081] 上記表 1より化合物（4一 2)を皮下投与した群では 1回目の投与より増殖の抑制が認 められ、以降の投与により、より顕著な増殖抑制効果を示した。なお、本実験では、マ ウスの体重減少等の毒性は認められなかった。

Claims

請求の範囲
下記一般式（1)、
Figure imgf000032_0001
(1)
(式中、 R1は DNAをアルキル化する官能基、 R2は水素原子、アルキル基またはァシ ル基、 Xは下記式、
Figure imgf000032_0002
を構成単位（mは 0— 10の整数）とし、該構成単位の 1つからなる 2価の基、または同 一でも異なっていてもよい 2つ以上の該構成単位からなる 2価の基である。但し、前 記構成単位のうち、上記 R2側末端の構成単位は下記式、
Figure imgf000032_0003
(kは 0— 10の整数）であってもよレ、。）で表わされることを特徴とするインドール誘導 体。
[2] ή 記 ITが下記式、 または
Figure imgf000033_0001
(5)
(式 (4)中、 R3は水素原子、ペプチド鎖、糖鎖またはポリエチレングリコール基、 Eは ハロゲン原子、メシル基およびトシノレ基からなる群から選択される脱離基である）で表 わされる請求項 1記載のインドール誘導体。
前記 R2がァセチル基である請求項 1記載のインドール誘導体。
下記式（3— 1)、
Figure imgf000033_0002
で表わされる請求項 3記載のインドール誘導体。
[5] 下記式（3— 2)、
Figure imgf000034_0001
で表わされる請求項 3記載のインドール誘導体。
[6] 下記式（3— 3)、
Figure imgf000034_0002
[7]
Figure imgf000034_0003
で表わされる請求項 3記載のインドール誘導体。 下記式（3— 5)、
Figure imgf000035_0001
で表わされる請求項 3記載のインドール誘導体。 下記式（3— 6)、
Figure imgf000035_0002
で表わされる請求項 3記載のインドール誘導体。 下記式 (3— 7)、
Figure imgf000036_0001
で表わされる請求項 3記載のインドール誘導体。 下記式 (4一 1)、
Figure imgf000036_0002
で表わされる請求項 3記載のインドール誘導体。 下記式 (4一 2)、
Figure imgf000036_0003
Figure imgf000037_0001
(4-3)
で表わされる請求項 3記載のインドール誘導体。
[14] 請求項 1記載のインドール誘導体からなることを特徴とする DNAのアルキル化剤。
[15] 前記インドール誘導体がヘアピン型構造を形成することにより DNAを認識する請求 項 14記載の DNAのアルキル化剤。
[16] 前記インドール誘導体が二量体を形成することにより DNAを認識する請求項 14記 載の DNAのアルキル化剤。
[17] 己^、
または
Figure imgf000037_0002
(式中、 nは 0— 10の整数である）を構成単位とし、該構成単位の 1つからなる 2価の 基、または同一でも異なっていてもよい 2つ以上の該構成単位からなる 2価の基を有 する化合物（但し、前記構成単位のうち、 N端側末端の構成単位は下記式、
Figure imgf000037_0003
(qは 0— 10の整数）であってもよレ、）が添加されてなる請求項 14記載の DNAのアル キル化剤 n [18] 請求項 14記載のアルキル化剤を使用した遺伝子の発現を抑制または活性化する ことを特徴とする薬剤。
[19] 前記遺伝子が異常遺伝子である請求項 18記載の薬剤。
[20] 前記遺伝子が一塩基多型（SNPs)である請求項 18記載の薬剤。
[21] 前記遺伝子が癌遺伝子である請求項 18記載の薬剤。
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